DE2220065A1 - Naehrboeden - Google Patents

Naehrboeden

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DE2220065A1
DE2220065A1 DE19722220065 DE2220065A DE2220065A1 DE 2220065 A1 DE2220065 A1 DE 2220065A1 DE 19722220065 DE19722220065 DE 19722220065 DE 2220065 A DE2220065 A DE 2220065A DE 2220065 A1 DE2220065 A1 DE 2220065A1
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Aaron E Dr Freeman
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Microbiological Associates Inc
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Microbiological Associates Inc
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    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61LMETHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2/00Methods or apparatus for disinfecting or sterilising materials or objects other than foodstuffs or contact lenses; Accessories therefor
    • A61L2/02Methods or apparatus for disinfecting or sterilising materials or objects other than foodstuffs or contact lenses; Accessories therefor using physical phenomena
    • A61L2/08Radiation

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Description

  • Nährböden Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Sterilisierung von N>hrböden zwecks Unterstützung des Wachstums von multizellularen animalen Zellen und vorzugsweise von Säugetierzellen in Vitro.
  • Durch das Verfahren nach der Erfindung werden stabile, trockene, aus einem festen Medium bestehende Nährböden hergestellt.
  • Bei den bekannten Verfahren zur Herstellung von Nährböden werden animale bzw. tierische Zell- oder Gewebekulturen hergestellt, wodurch Zellen, Gewebe und organische Fragmente außerhalb des animalen Körpers in einer künstlichen Umgebung am Leben gehalten werden können und unter kontrollierten Bedingungen am Leben bleiben und funktionieren, und zwar über unbestimmte oder bestimmte Zeiträume. Die Massenkultur von animalen Zellen, wie beispielsweise Säugetierzellen, wird im handelsüblichen Ausmaße durchgeführt und die so hergesteinen Kulturen bzw. Nährböden werden auf den verschiedensten experimentellen Gebieten verwendet, wie beispielsweise in der Biologie, Medizin, Cytologie, Histologie, Ernbryologie, Immunologie und beim Studium der Tumoren und Virusse.
  • Der hier verwendete Begriff ??Zellen?1 bezieht sich sowohl auf das benutzte Gewebe, von dem die Zellen herstammen, als auch auf die Zellen selbst. Hierbei werden die Zellen von Vertebraten, wie beispielsweise Menschen, Geflügel und Fischen, und von Invertebraten, wie beispielsweise Insekten und Schistosomen verwendet. Insbesondere die Säugetierzellen werden im großen Ausmaße als achstums-irkmedia für Virusse verwendet, und die Gewebekulturen von solchen Zellen dienen der Isolierung, Identifizierung und Fortpflanzung dieser Mittel. Typische Säugetierzellen bestehen aus gemischen Populationen von Zellen, die frisch aus normalen animalen Geweben explantiert worden sind und in künstilichen Medien, die normalerweise Serum enthalten, kultiviert worden sind. Solche sind beispielsweise Nierenzellen von Affen und embryonale Zellen von Hühnern.
  • Es gibt auch Zellarten und Pflanzenzucht-Zellarten- oder -stämme, die sich von serienmäßigen Subkulturen der oben angegebenen Typen ableiten, wie beispielsweise Hautepithelzellen von Menschen, Nierenepithelzellen von Affen und Leberepithelzellen von Mäusen. Außerdem gibt es Zellarten, die sich aus Expantaten von neoplastischen Geweben ableiten, wie beispielsweise die HeLa-Art, die aus einen menschlichen öervixcarcinom herstammt. Die beiden letzteren Arten können unbegrenzt in künstlichen Medien subkultiviert werden, die Serum oder eine andere Proteinzelle enthalten. Die Subkulturen sind von einer bestehenden Kultur gezüchtete Bakterienkulturen.
  • Bis etwa 1950 wurden die Nährböden, die für das in vitro-Zellenwachstum verwendet wurden, normalerweise von den Organismen selbst hergeleitet und bestanden aus Blutplasma, Blutserum, Blutexudaten und wäßrigen Extrakten von Geweben und Organen. Obgleich man mit diesen natürlichen Nährböden einigen Erfolg hatte, erhielt man ungleichmäßige und unzuverlässige experimentale Werte aufgrund ihrer Komplexizität und Veränderlichkeit. Dadurch war man gezwungen, künstliche Nährböden zu entwickeln, die Wachstumssubstanzen in kontrollierten Mengen und in kontrollierter Qualität enthielten.
  • Die hier verwendete Bezeichnung "Nährboden" bezieht sich auf Zusammensetzungen und Mischungen, die im allgemeinen Nährstoffe, wie beispielsweise Aminosäuren, Vitamine, Coenzyme, Lipidquellen, Nucleinsäurederivate, anorganische Salze und dergleichen enthalten. Diese Nährböden können ebenfalls zusätzliche und ergänzende Materialien, wie beispielsweise lyophilisierte animale Seren enthalten.
  • Die erforderlichen Nährstoffe für das Wachstum von Säugetierzellen unter in vitro-Bedingungen sind spezifisch, jedoch ziemlich ähnlich. Normalerweise sind 13 Aminosäuren, 8 Vitamine, Glucose und bestimmte anorganische Ionen in einem isotonischen Milieu notwendig und wesentlich. Einige Säugetierzellen erfordern Serin. Das Weglassen einer einzelnen Aminosäure führt zum Absterben der Kultur bzw. des Nährboden 5.
  • Bisher waren zwei Arten von Nährböden im Handel erhaltlich, und zwar sterile flüssige Nährböden und nichtsterile Pulver.
  • Der sterile flüssige Nährboden ist eine Lösung, die durch Filtrierung sterilisiert worden ist, wie beispielsweise durch Ultrafiltrierung. Dieser Nährboden wird in sterile Behälter abgepackt und als eine sterile gebrauchsfertige Flüssigkeit verteilt. Die zweite Art war eine nichtsterile gepulverte Mischung, die so zusammengesetzt war, daß ein gegebenes Gewicht zunächst in einem gegebenen Volumen Wasser aufgelöst werden mußte und die Mischung dann durch den Endverbraucher sterilisiert werden mußte, wobei eine ausgedehnte Qualitätskontrolle notwendig war. Man kann ein steriles Pulver auch durch Lyophilisierung herstellen, jedoch muß zu diesem Zwecke der Nährboden erst sterilisiert werden, während er sich im flüssigen Zustand befindet. Lyophilisierte Nährböden stellen daher sehr teuere Produkte dar, da zwei Herstellungsstufen notwendig sind. Die für die lyophilisierten trockenen Nährböden verwendeten Behälter basieren auf dem Volumen der ursprünglichen Nährlösung, so daß ein gewisses Ersparen im Gewicht beim Versenden ermöglicht wird, jedoch nicht in Hinsicht auf den Umfang bzw. der Größe.
  • Der Erfindung lag daher die Aufgabe zugrunde, einen sterilen, pulverartigen Nährboden zu entwickeln, der sich für Zell-und Gewebekulturen eignet und insbesondere für das Wachstum von Säugetierzellen und gegenüber den bisher bekannten flüssigen und pulverartigen Formen Vorteile zeigt.
  • Die Erfindung betrifft einen neuartigen, sterilen, im wesentlichen trockenen, festen Nährboden, der sich für Zell- und Gewebekulturen eignet und insbesondere einen sterilen, trockenen, festen multizellularen Nährboden aus animalen Zellen und insbesondere aus Säugetierzellen, der sich insbesondere we für in vitro-Kulturen eignet, in denen die Aktivität und die Nähreigenschaften der individuellen Bestandteile im wesentlichen stabil bleiben. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines stabilen, sterilisierten, trockenen Nährbodens, der sich für das in vitro-5Vachstum von Zellen aus multizellularen Tieren eignet, das dadurch gekennzeichnet ist, daß der Nährboden in trockener fester Form einer energiereichen Strahlung unterworfen wird,und £war in einer Dosis zwischen etwa o,8 und etwa 10 Magarad, um den Nährboden ohne Abbau bzw. Zerstörung zu sterilisieren.
  • Wie bereits oben erwähnt, sind die Ernährungserfordernisse der Säugetierzellen und ebenfalls der Insektenzellen hoch spezifisch und sehr streng. Wesentlich sind 13 Aminosäuren, 8 Vitamine, Glukose und bestimmte anorganische Ionen. Diese Aminosäuren schließen die linksdrehenden Formen von Arginin, Cystin, Glutamin, Histidin, Isoleucin, Leucin, Lysin, Methionin, Phenylalanin, Threonin, Tryptophan, Tyrosin und Valin ein.
  • Es ist bekannt, daß viele dieser Aminosäuren gegenüber Wärme und anderen Einflüssen unstabil sind. Diese Unstabilität ist eine besondere Eigenschaft des L-Glutamins, der hauptsächlich verwendeten Aminosäure, die bis zu 55 Gew.% der verwendeten Gesamtaminosäuren ausmachen kann. Aus dem biologischen Wertebuch (1964) der Federation of American Societies of Experimental Biology, Seite 392, ist zu ersehen, daß das Glutamin einen Schmelzpunkt von 1850 C besitzt. Außerdem ist angegeben, daß sich die meisten Aminosäuren beim Schmelzen zersetzen.
  • In Gegenwart von Wasser sind die Aminosäuren gegenüber Wärme noch weniger stabil.
  • Dies bedeutet, daß thermische Stabilisierungamethoden mit Vorsicht verwendet werden müssen, wenn überhaupt, und daß ein Kochen im Autoklaven bzw. Schnelldruckkochen nicht durchgeführt werden kann, sondern daß trockene Wärme bzw.
  • Hitze verwendet werden muß, für die die Temperaturen noch höher und die Zeiträume länger sind. Unter diesen Bedingungen würde das Glutamin, dessen Schmelztemperatur innerhalb d es St des zu si Sterilisierungsbereichs liegt, gestört werden und verlorengehen. Aufgrund der Instabilität des Glutamins selbst bei Raumtemperaturen wird das L-Glutamin normal er weise aus den im Handel betroffenen Mischungen weggelassen und separat verpackt, um dem Nährboden als ein gefrorenes Konzentrat kurz vor der Benutzung zugesetzt zu werden.
  • Ebenfalls werden die 8 oder mehr notwendigen Vitamine, wie beispielsweise Biotin, Calciumpantothenat, Cholinchlorid, Folsäure, Inositol, Nicotinsäureamid, Riboflavin, Thiamin und Pyridoxalhydrochlorid (Vitamin B-6) in nachteiliger Weise von Hitze beeinflußt. Aufgrund der oben angegebenen Literaturstelle (Biology Data Book, S. 396) kann das Pyridoxalhydrochlorid auf 1200 C erhitzt werden, zersetzt sich jedoch oberhalb dieser Temperatur, wodurch eine Hitzesterilisierung nicht verwendbar wird.
  • Ein anderes Haupternährungsmittelifjei den Nährböden aus animalen Zellen ist die Glucose (Dextrose), die bei 1460 C oder unter der herkömmlichen thermischen Sterilisierungstemperatur von 2300 C schmilzt und die beim Kochen im Autoklaven dazu neigt, zu karamelisieren.
  • Andere falultative Bestandteile, wie beispielsweise Coenzym A und verschiedene Nucleotide sind in einem noch größeren Ausmaße wärme- bzw. hitze empfindlich.
  • Aufgrund der Empfindlichkeit solcher Nährböden aus animalen Zellen und Geweben gegenüber der thermischen Sterilisation wurde klar, daß die Herstellung eines trockenen, sterilen festen Nährbodens nicht durchführbar war. Außerdem würde eine Sterilisierung durch chemische Mittel und Methoden zu chemischen Reaktionen zwischen dem Nährboden und den sterilisierenden Chemikalien führen. Das genaue Gleichgewicht der Nährstoffe Nfrde in nachteiliger Weise beeinflußt werden und einige, wie beispielsweise Glutamin und Cystin, würden zusammen inaktiviert werden und der pH-Wert der Mischung würde drastisch verändert werden. Die Hitzesterilisierung wurde bestimmte Nährstoffe inaktivieren einschließlich bestimmter Aminosäuren, der Glukose, der Vitamine und der Bikarbonationen.
  • Eine Sterilisierung durch Bestrahlung wurde bisher als nicht praktisch und nachteilig angesehen, da erwartet wurde, daß die Bestrahlung aktive Ionen toxischer Natur erzeugen würde. In der Literatur wird angegeben, daß die Bestrahlung von Zucker zu der Erzeugung von toxischen Substanzen führt, die sich von Peroxyden ableiten (Hydroxylated Peroxides and the Toxicity of Irradiated Sucrose, Schubert et al., International Journal of Radiation Biology, 13, 485-9 (1967)).
  • Außerdem führt die Bestahlung von Proteinen und freien Aminosäuren zu der Zerstörung der Peptidbindung. Gegenüber Strahlung besonders empfindliche Aminosäuren sind Cystin, Methionin, Phenylalanin, Histidin, Threonin und Tyrosin, von denen jede wesentlich ist für das in vitro-Wachstum von Säugetierzellen (siehe After Effects of Amino Acids, E. Hussman, Strahlentherapie, Band 135, 489-492, 1968). Aus diesem Grunde gibt es keine wissenschaftlichen Berichte bezüglich eines sterilen trockenen festen Nährbodens mit den beschriebenen Ei gen schaften.
  • Überraschenderweise konnte festgestellt werden, daß ein trockener Zellboden aus festen Zellen und Gewebe und insbesondere ein bolcher Nährboden, der für das in vitro-Wachstum von Säugetierzellen geeignet ist, in kleinen Einheiten abgepackt und sterilisiert werden kann, indem der Nährboden in trockener fester Form einer energiereichen Strahlung unterworfen wird, wobei kontrollierte und regulierte Strahlungsintensitäten in einem beschränkten und kritischen Bereich verwendet werden. Bei den beim Verfahren nach der Erfindung verwendeten Bedingungen wird der Nährboden im vollständig trockenen festen Zustand und vorzugsweise unter einer Decke aus einem inerten Gas bestrahlt. Solche inerte Gase sind beispielsweise Stickstoff oder Helium. Eine vollständige Sterilisierung wird dabei erreicht ohne ein Verlust an biologischer Aktivität und Nährstoffaktivität eines der Bestandteile, und zwar einschließlich der Bestandteile, die besonders hitze- und wärmeempfindlich sind.
  • Mit dem Verfahren nach der Erfindung ist es zum ersten Mal möglich, einen festen Nährboden herzustellen, der vollständig stabil, steril, leicht und kompakt ist und nur einen geringen Raum zum Versenden und zum Aufbewahren benötigt.
  • Aufgrund der Stabilität des bestrahlten Nährbodens ist es zusätzlich möglich, labile Bestandteile, wie beispielsweise Glutamin und Pyridoxalhydrochlorid in der ursprünglichen Mischung einzubeziehen.
  • Die energiereiche Strahlungsintensität (high energy radiation intensity), die ein kritischer Faktor bei der Aufrechterhaltung der Stabilität der empfindlichen Bestandteile des Nährbodens ist, wird vorteilhafterweise in einem Bereich von etwa 0,8 bis etwa 10 Megarad und vorzugsweise zwischen etwa 2,4 und etwa 5,6 Megarad, um Sterilität zu erreichen. Die bevorzugte spezifische Intensität liegt beim praktischen Durchführen des Verfahrens bei 4 t 1,6 Megarad.
  • Das Verfahren nach der Erfindung soll in keiner Weise auf irgendein Bestrahlungsverfahren beschränkt werden, da die Sterilisationseffekte die gleichen sind ohne Berücksichtigung der Strahlungsquelle. Es können ionisierende Strahlungen erhalten werden, indem beispielsweise Radioisotopen, nucleare Reaktoren, oder Hochenergie-Teilchenbeschleuniger verwendet werden. Als Radioisotop kann beispielsweise Kobalt 60 für ein Gammastrahlung und Strontiom 90 eine Betastrahlung verwendet werden. Kernreaktoren können als Quelle für Gammastrahlen oder Neutronen oder beides verwendet werden.
  • Teilchenbeschleuniger, wie beispielsweise einCYclotron, ein Bevatron, ein Synchrotron, Van de Graaf'sche oder Röntgenstrahlvorrichtungen können ebenfalls verwendet werden.
  • Die bei-dem Verfahren nach der Erfindung verwendete energiereiche Strahlung kann aus Alphastrahlen, Betastrahlen, Gammastrahlen, weichen und harten Röntgenstrahlen, Kathodenstrahlen, Protonen, Neutronen, Positronen und kosmischen Strahlen bestehen. Vorzugsweise wird eine Gammastrahlung benutzt.
  • Obgleich der Nährboden zwischen dem Bestrahlungsverfahren nach der Erfindung in jeder geeigneten physikalischen Form, wie in Form von Lösungen, trockenen Pulvern, Granulaten, Pellets und dergleichen behandelt werden kann, wird der Nährboden vorzugsweise der Bestrahlung in Tablettenform unterworfen. Jede Tablette enthält daher eine vorbestimmte und genau abgemessene Menge der festen Bestandteile des Nährbodens. Demgemäß kann jede erwünschte Menge an flüssigem Nährboden aus den Tabletten hergestellt werden,'indem diese in einem Lösungsmittel aufgelöst werden, und zwar eine oder mehrere Tabletten. Typische Gewichte der Tabletten liegen im Bereich von 23 Gramm als Standardmaß bis zu jedem erwünschten Gewicht, um 100 ml einer Kulturl-ösung herzustellen.
  • Jedoch können die gleichen Gewichtseinheiten auch von trockenem Pulver oder Körnern bzw. Granulat hergestellt werden. Das feste Nährmedium wird entweder in destilliertem oder entionisiertem Wasser aufgelöst. Eine typische Tablette hat einen Durchmesser von etwa 1,2 cm und eine Dicke von etwa 0,6 cm.
  • Ein besonders geeigneter Nährboden für eine Säugetierzellenkultur ist das "Minimum Essential Medium (Eagle)", das in der Literaturstelle "Science", Band 130, Seite 432 (1959) (H. Eagle) beschrieben wird. Dieser Nährboden hat folgende Zusammensetzung: Bestandteile mg/Liter Bestandteile mg/Liter Aminosäuren Anorganische Salze und andere Bestandteile L-Arginin HCl 126,4 EARLE'S BSS L-Cystin 24,0 CaCl2.2H20 265,0 L-Glutamin 292,0 KCl 400,0 L-Histidin HCl.H20 41,9 MgS04.7H20 200,0 L-Isoleucin 52,5 NaCl 6.800,0 Leucin 52,4 NaHCÖ3 2.200,0 L-Lysin HCl 73,1 NaH2P04.H20 140,0 L-Methionin 14,9 Dextrose 1.000,0 L-Phenylalanin 33,0 Phenol(rot) 10,0 Threonin 47,6 HANKS' BSS L-Tryptophan 10,2 CaCl2.2H20 186,0 L-Tyrosin 36,2 HCl 400,0 L-Valin 46,8 KH2PO4 60,0 VITAMINE MgCl2.6H20 100,0 D-Ca-Pantothenat 1,0 MgS04.7H20 100,0 Cholin-Chlorid 1,0 NaCl 8.000,0 Folsäure 1,0 NaHC03 350,0 i-Inositol 2,0 Na2HP04.7H20 90,0 Nicotinamid 1,0 Dextrose 1.000,0 Pyridoxal HCl 1,0 Phenol(rot) 20,0 Riboflavin 0,1 Für SUSPENSIONS-Nährböden Thiamin-HCl 1,0 ECl 400,0 NaCl 6.800,0 NaHC03 2.200,0 NaH2P04.H20 1,500,0 MgCl2.6H20 200,0 Ein anderer Zellen-Nährboden, der für die besonderen Medien dieser Art repräsentativ ist, ist der Nährboden NCTC-109, der von V.J. Evans et al in Cancer Res., 16, 77-86 (1956) und W.T. McQuilkin et al in J.Natl. Cancer Inst. 19, 885-896 (1957) beschrieben wird. Dieser Nährboden hat folgende Zusammensetzung: Bestandteile mg/liter AMINOSÄUREN L-Alanin 31,5 L-Alpha Aminobutyrsäure 5,5 L-Arginin HCl 3,12 L-Asparagin 8,0 L-Asparaginsäure 9,9 L-Cystein HCl 259,9 L-Cystin 10,5 L-Glutaminsäure 8,3 L-Glutamin- 136,0 L-Glycin 13,5 L-Histidin . HCl . H20 26,7 L-Hydroxyprolin 4,1 L-Isoleucin 18,0 L-Leucin 20,4 L-Lysin HOl 38,4 L-Methionin 4,4 T-Ornithin 7,4 L-Phenylalanin 16,5 L-Prolin 6,1 L-Serin 10,8 T-Taurin 4,2 Threonin 18,9 Ti-Tryptophan 17,5 Bestandteile mg/Liter AMINOSAUREN L-Tyrosin 16,4 L-Valin 25,0 VITAMINE P-Aminobenzoesäure 0,125 Ascorbinsäure 49,900 D-Biotin 0,025 Calciferol 0,250 D-Ca-Pantothenat 0,025 Cholin-Chlorid 1,250 Cocarboxylase i,000 Folsäure 0,025 i-Inositol 0,125 Menadion 0,025 Nicotinamid 0,063 Nicotinsäure 0,063 Pyridoxal HCl 0,063 Pyridoxin HCl 0,063 DL-Alpha-Tocopherolphosphat (Na2) 0,025 Thiamin HCl 0,025 Tween 80 12,500 Riboflavin 0,025 Vitamin A 0,250 Vitamin B12 10,000 ANDERE BESTANDTEILE Coenzym A 2,5 Deoxyadenosin 10,0 Deoxycytidin HCl 10,0 Deoxyguanosin 10,0 Dextrose 1.000,0 Bestandteile mg/Diter ANDERE BESTANDTEILE Diphosphopyridin-Nucleotidtetrahydrat (DPN.4H20) 7,0 Flavin-Adenin-Dinucleotid (FAD) 1,0 D-Glucosamin 3,2 D-Glucuronolacton 1,8 L-Glutathion 10,1 5-Methylcytosin 0,1 Phenol (rot) 20,0 Natriumacetat . 3H20 83,0 Natriumglucuronat 1 8 Thymidin 10,0 Triphosphopyridinnucleotid-mononatriumsalz (TPN) 1,0 Uridin-5' -triphosphat, tetranatrium , tetrahydrat (UTP) 1,0 ANORGANISCHE SALZE CaCl2. 2H20 265,0 KCl 400,0 MgS04 . 7H20 200,0 NaCl 6.800,0 NaHC03 2.200,0 NaH2P04 . H20 140,0 Die animalen Zellen der Vertebraten oder Invertebraten erfordern in bezug auf die gaewek4n Ernährung die gleichen wesentlichen Bestandteile. Das sind beispielsweise die Aminosäuren und die Vitamine. Jedoch ist bei den Säugetierzellen eine spezielle Isotonizität erforderlich, die 0,85 % Gesamt-NaCl in Lösung äquivalent ist. Zellen, die nicht von Säugetieren abstammen, - diese können beispielsweise von Vertebraten herstammen - erfordern eine unterschiedliche Isotonizität für jede Spezies, so z. B. sind bei Froschzellen insgesamt 0,40 % NaCl erforderlich.
  • Wenn der Nährboden mit energiereicher Strahlung in Tablettenform behandelt wird, dann wird der getrocknete und gepulverte Nährboden unter einer trockenen inerten Atmosphäre in die oben angegebene Tablettenart gepreßt und eine oder mehrere Tabletten werden unter einer trockenen, inerten Atmosphäre in eine Glasampulle mit einem flachen Boden gegeben, die mit einem plastischen Schraubverschluß versehen ist, der eine Gummiunterlage besitzt. Die Ampullen werden in eine Serie von oben offenen Behältern gegeben, und man läßt die Behälter unter einer energiereichen Strahlungsquelle durchgehen, wie beispielsweise einer Gammaquelle. Falls erwünscht, kann eine Ampulle innerhalb einer zweiten Glasampulle eingeschlossen werden. Dadurch wird eine eingekapselte Verpackungsart hergestellt, bei der der sterile Nährboden durch menschliche Hände gehen kann bis zu dem Augenblick, in dem er in Lösung gebracht wird, ohne daß Sterilitätsverluste auftreten.
  • Wenn der Nährboden in Form eines "bulk"-Pulvers sterilisiert werden soll, dann wird dieser mittels seines Schwergewichts auf ein kontinuierlich laufendes Band aufgegeben, das sich in einem verschlossenen Tunnel befindet, durch den ein Strom eines unter Druck stehenden trockenen inerten Gases, wie beispielsweise Stickstoff oder Helium, durchgeführt wird.
  • Das Pulver wird durch den Tunnel vorbei an einer Quelle einer energiereichen Strahlung geführt, die Energiestrahlen einer ausreichenden Energie und Breite liefert, den vorbeilaufenden Nährboden zu sterilisieren. Das Pulver kann ebenfalls in einzelne oder Doppelgelatinekapseln eingeschlossen sein.
  • Wenn die Strahlungsquelle Beta-Strahlen emittiert, kann die Strahlungsquelle ein Teilchenbeschleuniger der bekannten Art, wie beispielsweise ein Dynamatron mit 1,5 Millionen Volt sein, der eine positive Ionenquelle, wie in US-Patent 3 178 600 beschrieben, verwendet werden.
  • Als Gammastrahlungsquelle kann Kobalt 60 verwendet werden.
  • Andere geeignete Strahlungsquellen werden in der Literaturstelle "Radiation Preservation of Pool", US Army Quartermaster Corps., PB 151493, US-Government Printing Office, Washington D.C.5461 beschrieben . Es können dabei beispielsweise verwendet werden: a) das in der Fig. 30-5 auf Seite 361 gezeigte System, bei dem ein Arco Mark I Beschleuniger in Verbindung mit einer sterilisierten Konservenbüchsenherstellungsapparatur verwendet; b) das in der Fig. 30-7 auf Seite 363 gezeigte System, bei dem ein ARCO 12 mev., 30-kv Linearbeschleuniger verwendet wird und c) eine bewegliche Gamma-Bestrahlungsvor richtung, wie auf Seite 367 angegeben und bei L'E. Brownell et al. "Operation of the fisæion Products Labsratqrg, US-Atomic Energy Commission, Report No. AECU-3050 Con. No.
  • AT(11-1)-162, Mai 1955 beschrieben wird.
  • Um die Strahlungszone und den peripheren Bereich kann eine Schutzwand angeordnet werden, um die Arbeiter in diesem Bereich zu schützen Falls gepulverter Nährboden bestrahlt wird, wird der Nährboden auf einem Förderband zu einer Verteilerdüse geführt, von der das Material auf einen besonderen Behälter fällt, der eine Abpackungsmaschine füllt. Der gepulverte Nährboden kann alternativ in einen Tunnel geführt werden, in dem ein Gebläse einen ausreichend hohen Druck erzeugt, um das Pulver an einer Strahlungsquelle vorbeifließen zu lassen. Das Pulver verläßt dann den Tunnel durch eine Verteilerdüse.
  • Wenn man ein gleichmäßig dispergiertes Abtasten annimmt, ist die Energie des Strahlungsbündels abhängig von solchen Variablen, wie beispielsweise die Natur der Bestandteile des Nährbodens und die beteiligten oder erwünschten Verunreinigungen, die eliminiert werden sollen. Bezüglich der letzteren hängt die Empfindlichkeit der Bestrahlung der Mikroorganismen ab von der Spezies, der Konzentration, der Umgebungstemperatur, des physikalischen Zustandes, des Alters und der Zusammensetzung des Nährbodens als auch ton der Art der verwendeten Strahlung. Die Mindestdosis bei dem Verfahren nach der Erfindung wird als die Menge einer Strahlungsdosis angegeben, die ausreicht, um die kontaminierenden Organismen abzutöten. Vorzugsweise soll jedoch eine größere Strahlungsdosis verwendet werden, die tatsächlich die am meisten resistenten kontaminierenden Substanzen bis zu einer vernünftigen Sicherheitsgrenze desaktiviert und/oder zerstört. Bei den in Frage kommenden Nährböden sollte die Dosis hoch genug sein, um in wirksamer Weise den gepulverten Nährboden zu sterilisieren, der mit dem Sporenbildner Bacillus subtilis oder mit anderen resistenteren kontaminierenden Substanzen verunreinigt bzw. kontaminiert ist. Der Bacillus subtilis ist eine der resistenteiten Formen von kontaminierenden Substanzen. Diese kontaminierenden Substanzen werden mittels herkömmlicher Untersuchungsverfahren festgestellt, wie sich beispielsweise in Public Health Service Regulations, Title 43, Teil 73, Abs. 73.73 beschrieben werden. Bei dem zitierten Test werden bestrahlte Proben mit sterilem destillierten Wasser rekonstituiert und auf Sterilität getestet, indem Subkulturen in einer Thioglycollatbrühe über einen Zeitraum von mindestens 7 Tagen gezüchtet werden.
  • Es konnte festgestellt werden, daß eine Dosis von 4 Megarad normalerweise ausreicht für die Nährböden, und daß die Belichtungszeit nicht sehr wesentlich ist. Solange die Dosis aufgenommen wird, kann der Nährboden in einem sehr kurzen Zeitraum sterilisiertwerden und es wird keine wesentliche Verbesserung erreicht, wenn die Bestrahlung verlängert wird.
  • Die maximale Bestrahlungsdosierung wird vorzugsweise als die Strahlungsmenge ausgedrückt, die in der Lage ist, die erwünschten sterilen Bedingungen zu schaffen, jedoch nicht wesentlich die Fähigkeit des Nährbodens beeinträchtigt, das Wachstum einzelner Zellen in einem kontrollierten Test zu unterstützen. Es sollen auch keine toxischen Nebenprodukte erzeugt werden, die durch eine Überbestrahlung einer oder mehrerer Bestandteile des Nährbodens entstehen können.
  • In den folgenden Beispielen werden bevorzugte Ausführungsformen des Verfahrens nach der Erfindung einzeln erläutert.
  • Beispiel 1 100 Milliliter (0,929 Gramm) eines gepulverten Nährbodens wurden in Gelatinedoppelkapseln hineingegeben, und mit 4 Megarad (Betastreuung) über einen Zeitraum von 4 Sekunden bestrahlt unter Verwendung eines Radiation Dynamics Teilchenbeschleunigers der oben beschriebenen Art. Proben wurden mit sterilem destilliertem Wasser rekonstituiert und die Probe wurde auf biologische Aktivität getestet mittels relativer Plattierungswirksamkeit von HeLa S-3.
  • Es wurde festgestellt, daß die Proben steril waren und eine relative Zuchtwirksamkeit (cloning efficiency) nach Bestrahlung von 104 % der Kontrolle besaßen.
  • Der verwendete Nährboden bestand aus Basal Medium Eagle, wie er in der Literaturstelle H. Eagle "Journal Experimental Medicine, Band 102, Seite 595 (1955) beschrieben wird.
  • Beispiel 2 100 Milliliter äquivalente Mengen (0,965 Gramm) eines gepulverten Eagle's Minimum Essential Nährbodens, wie er in der Literaturstelle von H. Eagle "Science", Band 130, Seite 432 (1959) beschrieben wird, wurden in genau abgemessenen Tabletten unter einer Decke von Stickstoffgas in eine Glasampulle gegeben. Die Tabletten wurden anfänglich in 5 Gruppen aufgeteilt für verschiedene Bestrahlungsniveaus: 20, 10, 5, 2,5, und 0 Megarad für eine Bestrahlungsperiode von 4 Sekunden. Jede der fünf Hauptgruppen wurde aufgeteilt und die eine Hälfte wurde mit 10 % dialysiertem Kälberserum versetzt. Diese 10 Gruppen wurden wiederum aufgeteilt, und die eine Hälfte wurde mit Bacillus subtilis kontaminiert. Diese Tabletten wurden mit Kobalt 60 einer Gammabestrahlung unterworfen.
  • Alle Tabletten, die mit 5 Megarad oder mehr Gammastrahlen behandelt worden waren, waren steril und biologisch aktiv.
  • Eine Kontaminierung konnte bei 3 von 16 Proben, die mit 2,5 Megarad bestrahlt worden waren, festgestellt werden.
  • Die drei kontaminierten Proben repräsentierten die Hälfte der 6 Proben, die mit 2,5 Megarad oder weniger bestrahlt worden waren, und die sorgfältig mit Bacillus subtilis präkontaminiert worden waren. Die optimale Sterilisierungsdosis für 100 fo wirksame Ergebnisse liegt daher zwischen 2,5 und 5,0 Megarad und vorzugsweise bei etwa 4,0 Megarad unter Berücksichtigung der Ergebnisse aus Beispiel 1.
  • Beispiel 3 1000 Gelatinekapseln von der Größe-"OO" wurden mit 100 Mllliliter äquivalente Mengen-von Earle's BSS Pulver abgefüllt (beschrieben in W.R. Earle "Journal-of National Cancer Institute", Band 4, Seiten 165-212 (1943)). Diese Kapseln wurden in Gelatinekapseln der Größe "000" eingesetzt und 500 Stück wurden 4 Sekunden lang auf einem Niveau von 5 Megarad mit Betastrahlen behandelt. Die bestrahlten Proben wurden auf Sterilität getestet, indem die äußere Kapsel entfernt wurde und die innere Kapsel in eine 100 ml-Flasche mit Thioglycollat hineingegeben wurde, die vorher auf Sterilität geprüft worden war. Die Flaschen wurden dann eine Woche lang bei 340 C inkubiert.
  • In einigen Hallen war die äußere Kapsel lose geworden, oder zeigte Brüche. Diese Proben wurden verworfen. Einige der anderen Proben wurden für andere Untersuchungen entfernt.
  • Von den Proben, die vor der Bestrahlung mit Bacillus subtilis unterminiert worden waren, zeigten sich alle steril und biologisch aktiv. 99,2 ffi der Proben in einer Kontrollgruppe, die unter den gleichen Bedingungen hergestellt, jedoch nicht bestrahlt worden war, wurden als kontaminiert und nicht verwendungsfähig festgestellt.
  • Beispiel 4 500 Milliliter äquivalente Mengen (4,64 Gramm) von gepulvertem Eagle's Basal Nährboden in einer Earle's Balanced Salz-Lösung wurde in mit Gummi verstöpselten Leighton-Röhren eingesetzt. zwecke Sechs der Proben wurden einer 30 Megarad Kobalt-60-Gammabestrahlung unterworfen. Sechs Proben wurden ein zweites Mal bestrahlt. Alle Proben wurden mit sterilem destilliertem Wasser rekonstituiert und auf Sterilität getestet, indem über einen Zeitraum von 3 Wochen in einer Thioglycollatbrühe Subkulturen gezüchtet wurden.
  • Eine der nicht bestrahlten Proben wurde steril gefiltert und mit einer nicht gefilterten bestrahlten Probe bezüglich der biologischen Aktivität verglichen. Die biologische Aktivität wurde durch einen Plattierungswirksamkeitstest von HeLa S-3-Zellen unter Züchtungsbedingungen untersucht, d. h. 200 Zellen/5 ml/35 m M Petrischalen in einem 7-Tage Wachstumstest bei 370 C mit 5 % Kohlendioxyd in Luft.
  • Alle 6 nicht bestrahlten Proben waren kontaminiert.
  • 5 der 6 bestrahlten Proben waren steril.
  • Die bestrahlten Proben hatten eine Plattierungswirksamkeit von 100 % im Vergleich mit Proben vor der Bestrahlung.
  • Bei dem Zusatz von Glutamin hatte die bestrahlte Probe eine Plattierungswirksamkeit von 100 ffi im Vergleich zu einer Probe vor der Bestrahlung.
  • Beispiel 5 Ein Gewebe-Nährboden, wie beispielsweise das Eagle's Minimum Essential Medium, wurde nach einem Standardverfahren als ein trockenes bulk-Pulver hergestellt. Dann wurde der Nährboden unter einer trockenen Stickstoffatmosphäre in Tabletten gepreßt, wobei jede ein Standardgewichtäquivalent zu 100 ml eines flüssigen Nährbodens enthielt. Diese Tabletten wurden in ein zylindrisches Glas oder in Plastikampullen abgefüllt, die eine trockene Stickstoffatmosphäre enthielten. Die Ampullen wurden mit 4 Megarad + 1,6 Megarad mittels einer Kobalt-60-Gammastrahlenquelle bestrahlt.
  • 10 ffi der Tabletten wurden für die Untersuchungen verwendet, und zwar 1. für die Feststellung von freien Bakterien, Mycoplasma und Pilze und 2. auf die Fähigkeit, einzelne Säugetierzellen in vitro wachsen zu lassen als auch ein kontinuierliches Wachstum von Massenkulturen zu unterhalten.
  • Der Rest der Ampullen wurde za verschiedenen Untersuchungsstellen zugesandt, um diese unter bestimmten nachteiligen-Bedingungen zu untersuchen: a) Ein-Teil der Ampullen wurde ohne Kühlung mit Schiff in die Sahara geschickt und ohne Kühlung mittels Kamelkarawane zu der Teststation transportiert. Dort wurde jede Tablette in dem örtlich zugänglichen destilliertem Quellwasser aufgelöst und den Sterilitäts- und Wachstumsuntersuchungen unterworfen. Es konnte festgestellt werden, daß die bestrahlten Nährböden unter diesen heißen und trockenen Bedingungen den bekannten im Handel erhältlichen flüssigen Nährböden vat überlegen waren. Die herkömmlichen Nährböden sind mitunter diesen Bedingungen ohne Kühlung nicht haltbar und verwendbar.
  • b) Ein zweiter Teil der Ampullen wurde ohne Kühlung und Trocknung in den Kongo transportiert. Dort wurden die gleichen Teste wie in a) durchgeführt. Unter diesen heißen und feuchten Bedingungen wurde ebenfalls festgestellt, daß der bestrahlte Nährboden nach der Erfindung den bekannten und herkömmlichen Nährböden weit überlegen ist. Es konnte ebenfalls festgestellt werden, daß der erfindungsgemäße Nährboden auch nichtsterilen gepulverten Nährböden von Vorteil ist, da die einzelnen vorgewogenen Tabletten bis zu einer schnellen Herstellung eines jeden Volumens des flüssigen Nährbodens eignen. Dadurch fallen die Probleme der kontinuierlichen Gewichtsveränderungen beim Abwägen eines trockenen zerfließenden bzw. zerschmelzenden Pulvers weg, das ununterbrochen- Wasser aufnimmt. Nicht verwendete Mengen des bekannten nichtsterilen trockenen Pulvers nehmen ununterbrochen Wasser auf, es kommt zu einem Bakterienwachstum und dieser Nährboden kann dann nicht mehr verwendet werden.
  • Die Überlegenheit der sterilen trockenen Nährböden nach der Erfindung wird auch durch die Tatsache bestätigt, daß das Zellenwachstum in einer gegebenen Zeit schneller abläuft als bei den herkömmlichen sterilen flüssigen Nährböden.
  • Die trockenen sterilen Nährböden nach der Erfindung sind gegenüber den herkömmlichen bekannten festen Nährböden bedeutend besser aufgrund der Sterilität und der leichten Handhabung. Es ist keine sterile Filtration notwendig, wenn das Produkt durch den Benutzer aufgelöst wird. Nachdem der Nährboden aufgelöst worden ist, und von Anfang an steril ist, braucht dieser nicht über einen Zeitraum von 21 Tagen für einen Inkubations-Sterilitätstest aufbewahrt zu werden, um festzustellen, ob sich eine Kontaminierung entwickelt. Dadurch wird Zeit gespart, und der Benutzer braucht keine Qualitätskontrollen durchzuführen. Bei der Herstellung der Nährbodenlösung sind keine komplizierten quantitativen Meßverfahren notwendig, da die genau abgewogenen Tabletten nach der Erfindung genaue Standardkonzentrationen liefern. Selbst in den Fallen, in denen die herkömmlichen Sterilitätsuntersuchungen durch den Benutzer nicht durchgeführt werden, riskiert der Benutzer nur ein Mindestrisiko einer Verunreinigung von nur 0,5 %. Diese liegt im Bereich der technischen Fehlergrenzen bei der Herstellung. Im Vergleich zu den sterilen Nährbodenlösungen, die sich zur Zeit auf dem Markt befinden, ist der trockene sterile Nährboden nach der Erfindung bedeutend billiger zu verschicken als die bekannten flüssigen Formen, und es besteht keine Gefahr, daß die Behälter zerbrechen und kontaminiert bzw. verunreinigt werden. Außerdem ist ein geringerer Verladungsraum notwendig als bei den bekannten flüssigen Nährböden, die außerdem unter Kühlung bei etwa 40 C gelagert und versandt werden müssen.
  • PatentansPrüche:

Claims (12)

  1. Patentansprüche: 1. Verfahren zur Herstellung eines stabilen, sterilisierten, trockenen Nährbodens für das in vitro-Wachstum von Zellen von multizellularen animalen Lebewesen, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , daß der Nährboden in einem trockenen festen Zustand einer energiereichen Strahlung in einer Dosierung zwischen etwa 0,8 und etwa 10 Megarad unterworfen wird, um den Nährboden ohne Abbau bzw. Zerfall zu sterilisieren.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e k e n n -z e i c h n e t , daß die Zellen Säugetierzellen sind und daß die energiereiche Strahlung eine Intensität zwischen etwa 2,4 und etwa 5,6 Megarad besitzt.
  3. 3. Verfahren nach Ansprüchen 1 und 2, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , daß die Zellen Säugetierzellen sind und daß die energiereiche Strahlung (high energy radiation) aus Gammastrahlung besteht.
  4. 4. Verfahren nach Ansprüchen 1 und 2, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , daß die Zellen Säugetierzellen sind, und die energiereiche Strahlung aus Betastrahlung besteht.
  5. 5. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 4, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , daß die Zellen Säugetiertellen sind und der Nährboden in Tablettenform einer energiereichen Strahlung unterworfen wird.
  6. 6. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 4, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , daß die Zellen Säugetierzellen sind und der Nährboden in Pulverform einer energiereichen Strahlung unterworfen -wird.
  7. 7. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 6, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , daß die Zellen Säugetierzellen sind und der Nährboden hitze-instabile Aminosäuren enthält einschließlich L-Glutamin.
  8. 8. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 7, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , daß die Zellen Säugetierzellen sind und der Nährboden hitze-instabile Vitamine enthält einschließlich Pyridoxalhydrochlorid.
  9. 9. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 5, und 7 oder 8, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , daß die Zellen Säugetierzellen sind und der Nährboden vor der Bestrahlung unter einer trockenen inerten Atmosphäre in Tabletten gepreßt wird.
  10. 10. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 4 und Ansprüchen 6 bis 8, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , daß die Zellen Säugetierzellen sind und der Nährboden in gepulverter Form der Bestrahlung unter einer trockenen inerten Atmosphäre unterworfen wird und hitzeempfindliches Coenzym A und karamelisierbare Glukose in dem Nährboden enthalten sind.
  11. 11. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 5, 7, 8 und 9, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , daß die Zellen Säugetierzellen sind und die Tabletten vor der Bestrahlung unter einer trockenen inerten Atmosphäre in Glasgefäße abgefüllt werden.
  12. 12. Stabile, sterilisierte, trockene Nährböden für das Wachstum von multizellularen animalen Zellen und vorzugsweise von Säugetierzellen, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , daß sie nach den Ansprüchen 1 bis 11 hergestellt werden.
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