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Nährböden Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Sterilisierung
von N>hrböden zwecks Unterstützung des Wachstums von multizellularen animalen
Zellen und vorzugsweise von Säugetierzellen in Vitro.
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Durch das Verfahren nach der Erfindung werden stabile, trockene, aus
einem festen Medium bestehende Nährböden hergestellt.
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Bei den bekannten Verfahren zur Herstellung von Nährböden werden animale
bzw. tierische Zell- oder Gewebekulturen hergestellt, wodurch Zellen, Gewebe und
organische Fragmente außerhalb des animalen Körpers in einer künstlichen Umgebung
am
Leben gehalten werden können und unter kontrollierten Bedingungen am Leben bleiben
und funktionieren, und zwar über unbestimmte oder bestimmte Zeiträume. Die Massenkultur
von animalen Zellen, wie beispielsweise Säugetierzellen, wird im handelsüblichen
Ausmaße durchgeführt und die so hergesteinen Kulturen bzw. Nährböden werden auf
den verschiedensten experimentellen Gebieten verwendet, wie beispielsweise in der
Biologie, Medizin, Cytologie, Histologie, Ernbryologie, Immunologie und beim Studium
der Tumoren und Virusse.
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Der hier verwendete Begriff ??Zellen?1 bezieht sich sowohl auf das
benutzte Gewebe, von dem die Zellen herstammen, als auch auf die Zellen selbst.
Hierbei werden die Zellen von Vertebraten, wie beispielsweise Menschen, Geflügel
und Fischen, und von Invertebraten, wie beispielsweise Insekten und Schistosomen
verwendet. Insbesondere die Säugetierzellen werden im großen Ausmaße als achstums-irkmedia
für Virusse verwendet, und die Gewebekulturen von solchen Zellen dienen der Isolierung,
Identifizierung und Fortpflanzung dieser Mittel. Typische Säugetierzellen bestehen
aus gemischen Populationen von Zellen, die frisch aus normalen animalen Geweben
explantiert worden sind und in künstilichen Medien, die normalerweise Serum enthalten,
kultiviert worden sind. Solche sind beispielsweise Nierenzellen von Affen und embryonale
Zellen von Hühnern.
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Es gibt auch Zellarten und Pflanzenzucht-Zellarten- oder -stämme,
die sich von serienmäßigen Subkulturen der oben angegebenen Typen ableiten, wie
beispielsweise Hautepithelzellen von Menschen, Nierenepithelzellen von Affen und
Leberepithelzellen von Mäusen. Außerdem gibt es Zellarten, die sich aus Expantaten
von neoplastischen Geweben ableiten, wie beispielsweise die HeLa-Art, die aus einen
menschlichen öervixcarcinom herstammt. Die beiden letzteren Arten können unbegrenzt
in künstlichen Medien subkultiviert werden, die Serum oder eine andere Proteinzelle
enthalten. Die Subkulturen sind von einer
bestehenden Kultur gezüchtete
Bakterienkulturen.
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Bis etwa 1950 wurden die Nährböden, die für das in vitro-Zellenwachstum
verwendet wurden, normalerweise von den Organismen selbst hergeleitet und bestanden
aus Blutplasma, Blutserum, Blutexudaten und wäßrigen Extrakten von Geweben und Organen.
Obgleich man mit diesen natürlichen Nährböden einigen Erfolg hatte, erhielt man
ungleichmäßige und unzuverlässige experimentale Werte aufgrund ihrer Komplexizität
und Veränderlichkeit. Dadurch war man gezwungen, künstliche Nährböden zu entwickeln,
die Wachstumssubstanzen in kontrollierten Mengen und in kontrollierter Qualität
enthielten.
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Die hier verwendete Bezeichnung "Nährboden" bezieht sich auf Zusammensetzungen
und Mischungen, die im allgemeinen Nährstoffe, wie beispielsweise Aminosäuren, Vitamine,
Coenzyme, Lipidquellen, Nucleinsäurederivate, anorganische Salze und dergleichen
enthalten. Diese Nährböden können ebenfalls zusätzliche und ergänzende Materialien,
wie beispielsweise lyophilisierte animale Seren enthalten.
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Die erforderlichen Nährstoffe für das Wachstum von Säugetierzellen
unter in vitro-Bedingungen sind spezifisch, jedoch ziemlich ähnlich. Normalerweise
sind 13 Aminosäuren, 8 Vitamine, Glucose und bestimmte anorganische Ionen in einem
isotonischen Milieu notwendig und wesentlich. Einige Säugetierzellen erfordern Serin.
Das Weglassen einer einzelnen Aminosäure führt zum Absterben der Kultur bzw. des
Nährboden 5.
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Bisher waren zwei Arten von Nährböden im Handel erhaltlich, und zwar
sterile flüssige Nährböden und nichtsterile Pulver.
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Der sterile flüssige Nährboden ist eine Lösung, die durch
Filtrierung
sterilisiert worden ist, wie beispielsweise durch Ultrafiltrierung. Dieser Nährboden
wird in sterile Behälter abgepackt und als eine sterile gebrauchsfertige Flüssigkeit
verteilt. Die zweite Art war eine nichtsterile gepulverte Mischung, die so zusammengesetzt
war, daß ein gegebenes Gewicht zunächst in einem gegebenen Volumen Wasser aufgelöst
werden mußte und die Mischung dann durch den Endverbraucher sterilisiert werden
mußte, wobei eine ausgedehnte Qualitätskontrolle notwendig war. Man kann ein steriles
Pulver auch durch Lyophilisierung herstellen, jedoch muß zu diesem Zwecke der Nährboden
erst sterilisiert werden, während er sich im flüssigen Zustand befindet. Lyophilisierte
Nährböden stellen daher sehr teuere Produkte dar, da zwei Herstellungsstufen notwendig
sind. Die für die lyophilisierten trockenen Nährböden verwendeten Behälter basieren
auf dem Volumen der ursprünglichen Nährlösung, so daß ein gewisses Ersparen im Gewicht
beim Versenden ermöglicht wird, jedoch nicht in Hinsicht auf den Umfang bzw. der
Größe.
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Der Erfindung lag daher die Aufgabe zugrunde, einen sterilen, pulverartigen
Nährboden zu entwickeln, der sich für Zell-und Gewebekulturen eignet und insbesondere
für das Wachstum von Säugetierzellen und gegenüber den bisher bekannten flüssigen
und pulverartigen Formen Vorteile zeigt.
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Die Erfindung betrifft einen neuartigen, sterilen, im wesentlichen
trockenen, festen Nährboden, der sich für Zell- und Gewebekulturen eignet und insbesondere
einen sterilen, trockenen, festen multizellularen Nährboden aus animalen Zellen
und insbesondere aus Säugetierzellen, der sich insbesondere we für in vitro-Kulturen
eignet, in denen die Aktivität und die Nähreigenschaften der individuellen Bestandteile
im wesentlichen stabil bleiben. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur
Herstellung eines stabilen, sterilisierten, trockenen Nährbodens, der sich für das
in vitro-5Vachstum von
Zellen aus multizellularen Tieren eignet,
das dadurch gekennzeichnet ist, daß der Nährboden in trockener fester Form einer
energiereichen Strahlung unterworfen wird,und £war in einer Dosis zwischen etwa
o,8 und etwa 10 Magarad, um den Nährboden ohne Abbau bzw. Zerstörung zu sterilisieren.
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Wie bereits oben erwähnt, sind die Ernährungserfordernisse der Säugetierzellen
und ebenfalls der Insektenzellen hoch spezifisch und sehr streng. Wesentlich sind
13 Aminosäuren, 8 Vitamine, Glukose und bestimmte anorganische Ionen. Diese Aminosäuren
schließen die linksdrehenden Formen von Arginin, Cystin, Glutamin, Histidin, Isoleucin,
Leucin, Lysin, Methionin, Phenylalanin, Threonin, Tryptophan, Tyrosin und Valin
ein.
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Es ist bekannt, daß viele dieser Aminosäuren gegenüber Wärme und anderen
Einflüssen unstabil sind. Diese Unstabilität ist eine besondere Eigenschaft des
L-Glutamins, der hauptsächlich verwendeten Aminosäure, die bis zu 55 Gew.% der verwendeten
Gesamtaminosäuren ausmachen kann. Aus dem biologischen Wertebuch (1964) der Federation
of American Societies of Experimental Biology, Seite 392, ist zu ersehen, daß das
Glutamin einen Schmelzpunkt von 1850 C besitzt. Außerdem ist angegeben, daß sich
die meisten Aminosäuren beim Schmelzen zersetzen.
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In Gegenwart von Wasser sind die Aminosäuren gegenüber Wärme noch
weniger stabil.
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Dies bedeutet, daß thermische Stabilisierungamethoden mit Vorsicht
verwendet werden müssen, wenn überhaupt, und daß ein Kochen im Autoklaven bzw. Schnelldruckkochen
nicht durchgeführt werden kann, sondern daß trockene Wärme bzw.
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Hitze verwendet werden muß, für die die Temperaturen noch höher und
die Zeiträume länger sind. Unter diesen Bedingungen würde das Glutamin, dessen Schmelztemperatur
innerhalb d es St des zu si Sterilisierungsbereichs liegt, gestört werden und verlorengehen.
Aufgrund der Instabilität des Glutamins
selbst bei Raumtemperaturen
wird das L-Glutamin normal er weise aus den im Handel betroffenen Mischungen weggelassen
und separat verpackt, um dem Nährboden als ein gefrorenes Konzentrat kurz vor der
Benutzung zugesetzt zu werden.
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Ebenfalls werden die 8 oder mehr notwendigen Vitamine, wie beispielsweise
Biotin, Calciumpantothenat, Cholinchlorid, Folsäure, Inositol, Nicotinsäureamid,
Riboflavin, Thiamin und Pyridoxalhydrochlorid (Vitamin B-6) in nachteiliger Weise
von Hitze beeinflußt. Aufgrund der oben angegebenen Literaturstelle (Biology Data
Book, S. 396) kann das Pyridoxalhydrochlorid auf 1200 C erhitzt werden, zersetzt
sich jedoch oberhalb dieser Temperatur, wodurch eine Hitzesterilisierung nicht verwendbar
wird.
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Ein anderes Haupternährungsmittelifjei den Nährböden aus animalen
Zellen ist die Glucose (Dextrose), die bei 1460 C oder unter der herkömmlichen thermischen
Sterilisierungstemperatur von 2300 C schmilzt und die beim Kochen im Autoklaven
dazu neigt, zu karamelisieren.
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Andere falultative Bestandteile, wie beispielsweise Coenzym A und
verschiedene Nucleotide sind in einem noch größeren Ausmaße wärme- bzw. hitze empfindlich.
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Aufgrund der Empfindlichkeit solcher Nährböden aus animalen Zellen
und Geweben gegenüber der thermischen Sterilisation wurde klar, daß die Herstellung
eines trockenen, sterilen festen Nährbodens nicht durchführbar war. Außerdem würde
eine Sterilisierung durch chemische Mittel und Methoden zu chemischen Reaktionen
zwischen dem Nährboden und den sterilisierenden Chemikalien führen. Das genaue Gleichgewicht
der Nährstoffe Nfrde in nachteiliger Weise beeinflußt werden und einige, wie beispielsweise
Glutamin und Cystin, würden zusammen
inaktiviert werden und der
pH-Wert der Mischung würde drastisch verändert werden. Die Hitzesterilisierung wurde
bestimmte Nährstoffe inaktivieren einschließlich bestimmter Aminosäuren, der Glukose,
der Vitamine und der Bikarbonationen.
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Eine Sterilisierung durch Bestrahlung wurde bisher als nicht praktisch
und nachteilig angesehen, da erwartet wurde, daß die Bestrahlung aktive Ionen toxischer
Natur erzeugen würde. In der Literatur wird angegeben, daß die Bestrahlung von Zucker
zu der Erzeugung von toxischen Substanzen führt, die sich von Peroxyden ableiten
(Hydroxylated Peroxides and the Toxicity of Irradiated Sucrose, Schubert et al.,
International Journal of Radiation Biology, 13, 485-9 (1967)).
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Außerdem führt die Bestahlung von Proteinen und freien Aminosäuren
zu der Zerstörung der Peptidbindung. Gegenüber Strahlung besonders empfindliche
Aminosäuren sind Cystin, Methionin, Phenylalanin, Histidin, Threonin und Tyrosin,
von denen jede wesentlich ist für das in vitro-Wachstum von Säugetierzellen (siehe
After Effects of Amino Acids, E. Hussman, Strahlentherapie, Band 135, 489-492, 1968).
Aus diesem Grunde gibt es keine wissenschaftlichen Berichte bezüglich eines sterilen
trockenen festen Nährbodens mit den beschriebenen Ei gen schaften.
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Überraschenderweise konnte festgestellt werden, daß ein trockener
Zellboden aus festen Zellen und Gewebe und insbesondere ein bolcher Nährboden, der
für das in vitro-Wachstum von Säugetierzellen geeignet ist, in kleinen Einheiten
abgepackt und sterilisiert werden kann, indem der Nährboden in trockener fester
Form einer energiereichen Strahlung unterworfen wird, wobei kontrollierte und regulierte
Strahlungsintensitäten in einem beschränkten und kritischen Bereich
verwendet
werden. Bei den beim Verfahren nach der Erfindung verwendeten Bedingungen wird der
Nährboden im vollständig trockenen festen Zustand und vorzugsweise unter einer Decke
aus einem inerten Gas bestrahlt. Solche inerte Gase sind beispielsweise Stickstoff
oder Helium. Eine vollständige Sterilisierung wird dabei erreicht ohne ein Verlust
an biologischer Aktivität und Nährstoffaktivität eines der Bestandteile, und zwar
einschließlich der Bestandteile, die besonders hitze- und wärmeempfindlich sind.
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Mit dem Verfahren nach der Erfindung ist es zum ersten Mal möglich,
einen festen Nährboden herzustellen, der vollständig stabil, steril, leicht und
kompakt ist und nur einen geringen Raum zum Versenden und zum Aufbewahren benötigt.
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Aufgrund der Stabilität des bestrahlten Nährbodens ist es zusätzlich
möglich, labile Bestandteile, wie beispielsweise Glutamin und Pyridoxalhydrochlorid
in der ursprünglichen Mischung einzubeziehen.
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Die energiereiche Strahlungsintensität (high energy radiation intensity),
die ein kritischer Faktor bei der Aufrechterhaltung der Stabilität der empfindlichen
Bestandteile des Nährbodens ist, wird vorteilhafterweise in einem Bereich von etwa
0,8 bis etwa 10 Megarad und vorzugsweise zwischen etwa 2,4 und etwa 5,6 Megarad,
um Sterilität zu erreichen. Die bevorzugte spezifische Intensität liegt beim praktischen
Durchführen des Verfahrens bei 4 t 1,6 Megarad.
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Das Verfahren nach der Erfindung soll in keiner Weise auf irgendein
Bestrahlungsverfahren beschränkt werden, da die Sterilisationseffekte die gleichen
sind ohne Berücksichtigung der Strahlungsquelle. Es können ionisierende Strahlungen
erhalten werden, indem beispielsweise Radioisotopen, nucleare Reaktoren, oder Hochenergie-Teilchenbeschleuniger
verwendet
werden. Als Radioisotop kann beispielsweise Kobalt 60
für ein Gammastrahlung und Strontiom 90 eine Betastrahlung verwendet werden. Kernreaktoren
können als Quelle für Gammastrahlen oder Neutronen oder beides verwendet werden.
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Teilchenbeschleuniger, wie beispielsweise einCYclotron, ein Bevatron,
ein Synchrotron, Van de Graaf'sche oder Röntgenstrahlvorrichtungen können ebenfalls
verwendet werden.
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Die bei-dem Verfahren nach der Erfindung verwendete energiereiche
Strahlung kann aus Alphastrahlen, Betastrahlen, Gammastrahlen, weichen und harten
Röntgenstrahlen, Kathodenstrahlen, Protonen, Neutronen, Positronen und kosmischen
Strahlen bestehen. Vorzugsweise wird eine Gammastrahlung benutzt.
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Obgleich der Nährboden zwischen dem Bestrahlungsverfahren nach der
Erfindung in jeder geeigneten physikalischen Form, wie in Form von Lösungen, trockenen
Pulvern, Granulaten, Pellets und dergleichen behandelt werden kann, wird der Nährboden
vorzugsweise der Bestrahlung in Tablettenform unterworfen. Jede Tablette enthält
daher eine vorbestimmte und genau abgemessene Menge der festen Bestandteile des
Nährbodens. Demgemäß kann jede erwünschte Menge an flüssigem Nährboden aus den Tabletten
hergestellt werden,'indem diese in einem Lösungsmittel aufgelöst werden, und zwar
eine oder mehrere Tabletten. Typische Gewichte der Tabletten liegen im Bereich von
23 Gramm als Standardmaß bis zu jedem erwünschten Gewicht, um 100 ml einer Kulturl-ösung
herzustellen.
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Jedoch können die gleichen Gewichtseinheiten auch von trockenem Pulver
oder Körnern bzw. Granulat hergestellt werden. Das feste Nährmedium wird entweder
in destilliertem oder entionisiertem Wasser aufgelöst. Eine typische Tablette hat
einen Durchmesser von etwa 1,2 cm und eine Dicke von etwa 0,6 cm.
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Ein besonders geeigneter Nährboden für eine Säugetierzellenkultur
ist das "Minimum Essential Medium (Eagle)", das in der Literaturstelle "Science",
Band 130, Seite 432 (1959) (H. Eagle) beschrieben wird. Dieser Nährboden hat folgende
Zusammensetzung: Bestandteile mg/Liter Bestandteile mg/Liter Aminosäuren Anorganische
Salze und andere Bestandteile L-Arginin HCl 126,4 EARLE'S BSS L-Cystin 24,0 CaCl2.2H20
265,0 L-Glutamin 292,0 KCl 400,0 L-Histidin HCl.H20 41,9 MgS04.7H20 200,0 L-Isoleucin
52,5 NaCl 6.800,0 Leucin 52,4 NaHCÖ3 2.200,0 L-Lysin HCl 73,1 NaH2P04.H20 140,0
L-Methionin 14,9 Dextrose 1.000,0 L-Phenylalanin 33,0 Phenol(rot) 10,0 Threonin
47,6 HANKS' BSS L-Tryptophan 10,2 CaCl2.2H20 186,0 L-Tyrosin 36,2 HCl 400,0 L-Valin
46,8 KH2PO4 60,0 VITAMINE MgCl2.6H20 100,0 D-Ca-Pantothenat 1,0 MgS04.7H20 100,0
Cholin-Chlorid 1,0 NaCl 8.000,0 Folsäure 1,0 NaHC03 350,0 i-Inositol 2,0 Na2HP04.7H20
90,0 Nicotinamid 1,0 Dextrose 1.000,0 Pyridoxal HCl 1,0 Phenol(rot) 20,0 Riboflavin
0,1 Für SUSPENSIONS-Nährböden Thiamin-HCl 1,0 ECl 400,0 NaCl 6.800,0 NaHC03 2.200,0
NaH2P04.H20 1,500,0 MgCl2.6H20 200,0
Ein anderer Zellen-Nährboden,
der für die besonderen Medien dieser Art repräsentativ ist, ist der Nährboden NCTC-109,
der von V.J. Evans et al in Cancer Res., 16, 77-86 (1956) und W.T. McQuilkin et
al in J.Natl. Cancer Inst. 19, 885-896 (1957) beschrieben wird. Dieser Nährboden
hat folgende Zusammensetzung: Bestandteile mg/liter AMINOSÄUREN L-Alanin 31,5 L-Alpha
Aminobutyrsäure 5,5 L-Arginin HCl 3,12 L-Asparagin 8,0 L-Asparaginsäure 9,9 L-Cystein
HCl 259,9 L-Cystin 10,5 L-Glutaminsäure 8,3 L-Glutamin- 136,0 L-Glycin 13,5 L-Histidin
. HCl . H20 26,7 L-Hydroxyprolin 4,1 L-Isoleucin 18,0 L-Leucin 20,4 L-Lysin HOl
38,4 L-Methionin 4,4 T-Ornithin 7,4 L-Phenylalanin 16,5 L-Prolin 6,1 L-Serin 10,8
T-Taurin 4,2 Threonin 18,9 Ti-Tryptophan 17,5
Bestandteile mg/Liter
AMINOSAUREN L-Tyrosin 16,4 L-Valin 25,0 VITAMINE P-Aminobenzoesäure 0,125 Ascorbinsäure
49,900 D-Biotin 0,025 Calciferol 0,250 D-Ca-Pantothenat 0,025 Cholin-Chlorid 1,250
Cocarboxylase i,000 Folsäure 0,025 i-Inositol 0,125 Menadion 0,025 Nicotinamid 0,063
Nicotinsäure 0,063 Pyridoxal HCl 0,063 Pyridoxin HCl 0,063 DL-Alpha-Tocopherolphosphat
(Na2) 0,025 Thiamin HCl 0,025 Tween 80 12,500 Riboflavin 0,025 Vitamin A 0,250 Vitamin
B12 10,000 ANDERE BESTANDTEILE Coenzym A 2,5 Deoxyadenosin 10,0 Deoxycytidin HCl
10,0 Deoxyguanosin 10,0 Dextrose 1.000,0
Bestandteile mg/Diter
ANDERE BESTANDTEILE Diphosphopyridin-Nucleotidtetrahydrat (DPN.4H20) 7,0 Flavin-Adenin-Dinucleotid
(FAD) 1,0 D-Glucosamin 3,2 D-Glucuronolacton 1,8 L-Glutathion 10,1 5-Methylcytosin
0,1 Phenol (rot) 20,0 Natriumacetat . 3H20 83,0 Natriumglucuronat 1 8 Thymidin 10,0
Triphosphopyridinnucleotid-mononatriumsalz (TPN) 1,0 Uridin-5' -triphosphat, tetranatrium
, tetrahydrat (UTP) 1,0 ANORGANISCHE SALZE CaCl2. 2H20 265,0 KCl 400,0 MgS04 . 7H20
200,0 NaCl 6.800,0 NaHC03 2.200,0 NaH2P04 . H20 140,0 Die animalen Zellen der Vertebraten
oder Invertebraten erfordern in bezug auf die gaewek4n Ernährung die gleichen wesentlichen
Bestandteile. Das sind beispielsweise die Aminosäuren und die Vitamine. Jedoch ist
bei den Säugetierzellen eine spezielle Isotonizität erforderlich, die
0,85
% Gesamt-NaCl in Lösung äquivalent ist. Zellen, die nicht von Säugetieren abstammen,
- diese können beispielsweise von Vertebraten herstammen - erfordern eine unterschiedliche
Isotonizität für jede Spezies, so z. B. sind bei Froschzellen insgesamt 0,40 % NaCl
erforderlich.
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Wenn der Nährboden mit energiereicher Strahlung in Tablettenform behandelt
wird, dann wird der getrocknete und gepulverte Nährboden unter einer trockenen inerten
Atmosphäre in die oben angegebene Tablettenart gepreßt und eine oder mehrere Tabletten
werden unter einer trockenen, inerten Atmosphäre in eine Glasampulle mit einem flachen
Boden gegeben, die mit einem plastischen Schraubverschluß versehen ist, der eine
Gummiunterlage besitzt. Die Ampullen werden in eine Serie von oben offenen Behältern
gegeben, und man läßt die Behälter unter einer energiereichen Strahlungsquelle durchgehen,
wie beispielsweise einer Gammaquelle. Falls erwünscht, kann eine Ampulle innerhalb
einer zweiten Glasampulle eingeschlossen werden. Dadurch wird eine eingekapselte
Verpackungsart hergestellt, bei der der sterile Nährboden durch menschliche Hände
gehen kann bis zu dem Augenblick, in dem er in Lösung gebracht wird, ohne daß Sterilitätsverluste
auftreten.
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Wenn der Nährboden in Form eines "bulk"-Pulvers sterilisiert werden
soll, dann wird dieser mittels seines Schwergewichts auf ein kontinuierlich laufendes
Band aufgegeben, das sich in einem verschlossenen Tunnel befindet, durch den ein
Strom eines unter Druck stehenden trockenen inerten Gases, wie beispielsweise Stickstoff
oder Helium, durchgeführt wird.
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Das Pulver wird durch den Tunnel vorbei an einer Quelle einer energiereichen
Strahlung geführt, die Energiestrahlen einer ausreichenden Energie und Breite liefert,
den vorbeilaufenden Nährboden zu sterilisieren. Das Pulver kann ebenfalls
in
einzelne oder Doppelgelatinekapseln eingeschlossen sein.
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Wenn die Strahlungsquelle Beta-Strahlen emittiert, kann die Strahlungsquelle
ein Teilchenbeschleuniger der bekannten Art, wie beispielsweise ein Dynamatron mit
1,5 Millionen Volt sein, der eine positive Ionenquelle, wie in US-Patent 3 178 600
beschrieben, verwendet werden.
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Als Gammastrahlungsquelle kann Kobalt 60 verwendet werden.
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Andere geeignete Strahlungsquellen werden in der Literaturstelle "Radiation
Preservation of Pool", US Army Quartermaster Corps., PB 151493, US-Government Printing
Office, Washington D.C.5461 beschrieben . Es können dabei beispielsweise verwendet
werden: a) das in der Fig. 30-5 auf Seite 361 gezeigte System, bei dem ein Arco
Mark I Beschleuniger in Verbindung mit einer sterilisierten Konservenbüchsenherstellungsapparatur
verwendet; b) das in der Fig. 30-7 auf Seite 363 gezeigte System, bei dem ein ARCO
12 mev., 30-kv Linearbeschleuniger verwendet wird und c) eine bewegliche Gamma-Bestrahlungsvor
richtung, wie auf Seite 367 angegeben und bei L'E. Brownell et al. "Operation of
the fisæion Products Labsratqrg, US-Atomic Energy Commission, Report No. AECU-3050
Con. No.
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AT(11-1)-162, Mai 1955 beschrieben wird.
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Um die Strahlungszone und den peripheren Bereich kann eine Schutzwand
angeordnet werden, um die Arbeiter in diesem Bereich zu schützen Falls gepulverter
Nährboden bestrahlt wird, wird der Nährboden auf einem Förderband zu einer Verteilerdüse
geführt, von der das Material auf einen besonderen Behälter fällt, der eine Abpackungsmaschine
füllt. Der gepulverte Nährboden kann alternativ in einen Tunnel geführt werden,
in dem ein Gebläse einen ausreichend hohen Druck erzeugt, um das Pulver an einer
Strahlungsquelle
vorbeifließen zu lassen. Das Pulver verläßt dann den Tunnel durch eine Verteilerdüse.
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Wenn man ein gleichmäßig dispergiertes Abtasten annimmt, ist die Energie
des Strahlungsbündels abhängig von solchen Variablen, wie beispielsweise die Natur
der Bestandteile des Nährbodens und die beteiligten oder erwünschten Verunreinigungen,
die eliminiert werden sollen. Bezüglich der letzteren hängt die Empfindlichkeit
der Bestrahlung der Mikroorganismen ab von der Spezies, der Konzentration, der Umgebungstemperatur,
des physikalischen Zustandes, des Alters und der Zusammensetzung des Nährbodens
als auch ton der Art der verwendeten Strahlung. Die Mindestdosis bei dem Verfahren
nach der Erfindung wird als die Menge einer Strahlungsdosis angegeben, die ausreicht,
um die kontaminierenden Organismen abzutöten. Vorzugsweise soll jedoch eine größere
Strahlungsdosis verwendet werden, die tatsächlich die am meisten resistenten kontaminierenden
Substanzen bis zu einer vernünftigen Sicherheitsgrenze desaktiviert und/oder zerstört.
Bei den in Frage kommenden Nährböden sollte die Dosis hoch genug sein, um in wirksamer
Weise den gepulverten Nährboden zu sterilisieren, der mit dem Sporenbildner Bacillus
subtilis oder mit anderen resistenteren kontaminierenden Substanzen verunreinigt
bzw. kontaminiert ist. Der Bacillus subtilis ist eine der resistenteiten Formen
von kontaminierenden Substanzen. Diese kontaminierenden Substanzen werden mittels
herkömmlicher Untersuchungsverfahren festgestellt, wie sich beispielsweise in Public
Health Service Regulations, Title 43, Teil 73, Abs. 73.73 beschrieben werden. Bei
dem zitierten Test werden bestrahlte Proben mit sterilem destillierten Wasser rekonstituiert
und auf Sterilität getestet, indem Subkulturen in einer Thioglycollatbrühe über
einen Zeitraum von mindestens 7 Tagen gezüchtet werden.
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Es konnte festgestellt werden, daß eine Dosis von 4 Megarad normalerweise
ausreicht für die Nährböden, und daß die Belichtungszeit nicht sehr wesentlich ist.
Solange die Dosis aufgenommen wird, kann der Nährboden in einem sehr kurzen Zeitraum
sterilisiertwerden und es wird keine wesentliche Verbesserung erreicht, wenn die
Bestrahlung verlängert wird.
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Die maximale Bestrahlungsdosierung wird vorzugsweise als die Strahlungsmenge
ausgedrückt, die in der Lage ist, die erwünschten sterilen Bedingungen zu schaffen,
jedoch nicht wesentlich die Fähigkeit des Nährbodens beeinträchtigt, das Wachstum
einzelner Zellen in einem kontrollierten Test zu unterstützen. Es sollen auch keine
toxischen Nebenprodukte erzeugt werden, die durch eine Überbestrahlung einer oder
mehrerer Bestandteile des Nährbodens entstehen können.
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In den folgenden Beispielen werden bevorzugte Ausführungsformen des
Verfahrens nach der Erfindung einzeln erläutert.
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Beispiel 1 100 Milliliter (0,929 Gramm) eines gepulverten Nährbodens
wurden in Gelatinedoppelkapseln hineingegeben, und mit 4 Megarad (Betastreuung)
über einen Zeitraum von 4 Sekunden bestrahlt unter Verwendung eines Radiation Dynamics
Teilchenbeschleunigers der oben beschriebenen Art. Proben wurden mit sterilem destilliertem
Wasser rekonstituiert und die Probe wurde auf biologische Aktivität getestet mittels
relativer Plattierungswirksamkeit von HeLa S-3.
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Es wurde festgestellt, daß die Proben steril waren und eine relative
Zuchtwirksamkeit (cloning efficiency) nach Bestrahlung von 104 % der Kontrolle besaßen.
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Der verwendete Nährboden bestand aus Basal Medium Eagle, wie er in
der Literaturstelle H. Eagle "Journal Experimental Medicine, Band 102, Seite 595
(1955) beschrieben wird.
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Beispiel 2 100 Milliliter äquivalente Mengen (0,965 Gramm) eines gepulverten
Eagle's Minimum Essential Nährbodens, wie er in der Literaturstelle von H. Eagle
"Science", Band 130, Seite 432 (1959) beschrieben wird, wurden in genau abgemessenen
Tabletten unter einer Decke von Stickstoffgas in eine Glasampulle gegeben. Die Tabletten
wurden anfänglich in 5 Gruppen aufgeteilt für verschiedene Bestrahlungsniveaus:
20, 10, 5, 2,5, und 0 Megarad für eine Bestrahlungsperiode von 4 Sekunden. Jede
der fünf Hauptgruppen wurde aufgeteilt und die eine Hälfte wurde mit 10 % dialysiertem
Kälberserum versetzt. Diese 10 Gruppen wurden wiederum aufgeteilt, und die eine
Hälfte wurde mit Bacillus subtilis kontaminiert. Diese Tabletten wurden mit Kobalt
60 einer Gammabestrahlung unterworfen.
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Alle Tabletten, die mit 5 Megarad oder mehr Gammastrahlen behandelt
worden waren, waren steril und biologisch aktiv.
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Eine Kontaminierung konnte bei 3 von 16 Proben, die mit 2,5 Megarad
bestrahlt worden waren, festgestellt werden.
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Die drei kontaminierten Proben repräsentierten die Hälfte der 6 Proben,
die mit 2,5 Megarad oder weniger bestrahlt worden waren, und die sorgfältig mit
Bacillus subtilis präkontaminiert worden waren. Die optimale Sterilisierungsdosis
für 100 fo wirksame Ergebnisse liegt daher zwischen 2,5 und 5,0 Megarad und vorzugsweise
bei etwa 4,0 Megarad unter Berücksichtigung der Ergebnisse aus Beispiel 1.
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Beispiel 3 1000 Gelatinekapseln von der Größe-"OO" wurden mit 100
Mllliliter äquivalente Mengen-von Earle's BSS Pulver abgefüllt (beschrieben in W.R.
Earle "Journal-of National Cancer Institute", Band 4, Seiten 165-212 (1943)). Diese
Kapseln wurden in Gelatinekapseln der Größe "000" eingesetzt und 500 Stück wurden
4 Sekunden lang auf einem Niveau von 5 Megarad mit Betastrahlen behandelt. Die bestrahlten
Proben wurden auf Sterilität getestet, indem die äußere Kapsel entfernt wurde und
die innere Kapsel in eine 100 ml-Flasche mit Thioglycollat hineingegeben wurde,
die vorher auf Sterilität geprüft worden war. Die Flaschen wurden dann eine Woche
lang bei 340 C inkubiert.
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In einigen Hallen war die äußere Kapsel lose geworden, oder zeigte
Brüche. Diese Proben wurden verworfen. Einige der anderen Proben wurden für andere
Untersuchungen entfernt.
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Von den Proben, die vor der Bestrahlung mit Bacillus subtilis unterminiert
worden waren, zeigten sich alle steril und biologisch aktiv. 99,2 ffi der Proben
in einer Kontrollgruppe, die unter den gleichen Bedingungen hergestellt, jedoch
nicht bestrahlt worden war, wurden als kontaminiert und nicht verwendungsfähig festgestellt.
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Beispiel 4 500 Milliliter äquivalente Mengen (4,64 Gramm) von gepulvertem
Eagle's Basal Nährboden in einer Earle's Balanced Salz-Lösung wurde in mit Gummi
verstöpselten Leighton-Röhren eingesetzt. zwecke Sechs der Proben wurden einer 30
Megarad Kobalt-60-Gammabestrahlung unterworfen. Sechs Proben wurden ein zweites
Mal bestrahlt. Alle Proben wurden mit sterilem destilliertem Wasser rekonstituiert
und auf Sterilität getestet, indem über einen Zeitraum von 3 Wochen
in
einer Thioglycollatbrühe Subkulturen gezüchtet wurden.
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Eine der nicht bestrahlten Proben wurde steril gefiltert und mit einer
nicht gefilterten bestrahlten Probe bezüglich der biologischen Aktivität verglichen.
Die biologische Aktivität wurde durch einen Plattierungswirksamkeitstest von HeLa
S-3-Zellen unter Züchtungsbedingungen untersucht, d. h. 200 Zellen/5 ml/35 m M Petrischalen
in einem 7-Tage Wachstumstest bei 370 C mit 5 % Kohlendioxyd in Luft.
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Alle 6 nicht bestrahlten Proben waren kontaminiert.
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5 der 6 bestrahlten Proben waren steril.
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Die bestrahlten Proben hatten eine Plattierungswirksamkeit von 100
% im Vergleich mit Proben vor der Bestrahlung.
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Bei dem Zusatz von Glutamin hatte die bestrahlte Probe eine Plattierungswirksamkeit
von 100 ffi im Vergleich zu einer Probe vor der Bestrahlung.
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Beispiel 5 Ein Gewebe-Nährboden, wie beispielsweise das Eagle's Minimum
Essential Medium, wurde nach einem Standardverfahren als ein trockenes bulk-Pulver
hergestellt. Dann wurde der Nährboden unter einer trockenen Stickstoffatmosphäre
in Tabletten gepreßt, wobei jede ein Standardgewichtäquivalent zu 100 ml eines flüssigen
Nährbodens enthielt. Diese Tabletten wurden in ein zylindrisches Glas oder in Plastikampullen
abgefüllt, die eine trockene Stickstoffatmosphäre enthielten. Die Ampullen wurden
mit 4 Megarad + 1,6 Megarad mittels einer Kobalt-60-Gammastrahlenquelle bestrahlt.
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10 ffi der Tabletten wurden für die Untersuchungen verwendet, und
zwar 1. für die Feststellung von freien Bakterien, Mycoplasma und Pilze und 2. auf
die Fähigkeit, einzelne Säugetierzellen in vitro wachsen zu lassen als auch ein
kontinuierliches
Wachstum von Massenkulturen zu unterhalten.
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Der Rest der Ampullen wurde za verschiedenen Untersuchungsstellen
zugesandt, um diese unter bestimmten nachteiligen-Bedingungen zu untersuchen: a)
Ein-Teil der Ampullen wurde ohne Kühlung mit Schiff in die Sahara geschickt und
ohne Kühlung mittels Kamelkarawane zu der Teststation transportiert. Dort wurde
jede Tablette in dem örtlich zugänglichen destilliertem Quellwasser aufgelöst und
den Sterilitäts- und Wachstumsuntersuchungen unterworfen. Es konnte festgestellt
werden, daß die bestrahlten Nährböden unter diesen heißen und trockenen Bedingungen
den bekannten im Handel erhältlichen flüssigen Nährböden vat überlegen waren. Die
herkömmlichen Nährböden sind mitunter diesen Bedingungen ohne Kühlung nicht haltbar
und verwendbar.
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b) Ein zweiter Teil der Ampullen wurde ohne Kühlung und Trocknung
in den Kongo transportiert. Dort wurden die gleichen Teste wie in a) durchgeführt.
Unter diesen heißen und feuchten Bedingungen wurde ebenfalls festgestellt, daß der
bestrahlte Nährboden nach der Erfindung den bekannten und herkömmlichen Nährböden
weit überlegen ist. Es konnte ebenfalls festgestellt werden, daß der erfindungsgemäße
Nährboden auch nichtsterilen gepulverten Nährböden von Vorteil ist, da die einzelnen
vorgewogenen Tabletten bis zu einer schnellen Herstellung eines jeden Volumens des
flüssigen Nährbodens eignen. Dadurch fallen die Probleme der kontinuierlichen Gewichtsveränderungen
beim Abwägen eines trockenen zerfließenden bzw. zerschmelzenden Pulvers weg, das
ununterbrochen- Wasser aufnimmt. Nicht verwendete Mengen des bekannten nichtsterilen
trockenen Pulvers nehmen
ununterbrochen Wasser auf, es kommt zu
einem Bakterienwachstum und dieser Nährboden kann dann nicht mehr verwendet werden.
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Die Überlegenheit der sterilen trockenen Nährböden nach der Erfindung
wird auch durch die Tatsache bestätigt, daß das Zellenwachstum in einer gegebenen
Zeit schneller abläuft als bei den herkömmlichen sterilen flüssigen Nährböden.
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Die trockenen sterilen Nährböden nach der Erfindung sind gegenüber
den herkömmlichen bekannten festen Nährböden bedeutend besser aufgrund der Sterilität
und der leichten Handhabung. Es ist keine sterile Filtration notwendig, wenn das
Produkt durch den Benutzer aufgelöst wird. Nachdem der Nährboden aufgelöst worden
ist, und von Anfang an steril ist, braucht dieser nicht über einen Zeitraum von
21 Tagen für einen Inkubations-Sterilitätstest aufbewahrt zu werden, um festzustellen,
ob sich eine Kontaminierung entwickelt. Dadurch wird Zeit gespart, und der Benutzer
braucht keine Qualitätskontrollen durchzuführen. Bei der Herstellung der Nährbodenlösung
sind keine komplizierten quantitativen Meßverfahren notwendig, da die genau abgewogenen
Tabletten nach der Erfindung genaue Standardkonzentrationen liefern. Selbst in den
Fallen, in denen die herkömmlichen Sterilitätsuntersuchungen durch den Benutzer
nicht durchgeführt werden, riskiert der Benutzer nur ein Mindestrisiko einer Verunreinigung
von nur 0,5 %. Diese liegt im Bereich der technischen Fehlergrenzen bei der Herstellung.
Im Vergleich zu den sterilen Nährbodenlösungen, die sich zur Zeit auf dem Markt
befinden, ist der trockene sterile Nährboden nach der Erfindung bedeutend billiger
zu verschicken als
die bekannten flüssigen Formen, und es besteht
keine Gefahr, daß die Behälter zerbrechen und kontaminiert bzw. verunreinigt werden.
Außerdem ist ein geringerer Verladungsraum notwendig als bei den bekannten flüssigen
Nährböden, die außerdem unter Kühlung bei etwa 40 C gelagert und versandt werden
müssen.
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PatentansPrüche: