BR112013015213A2 - meios de cultura de células granuladas a seco - Google Patents

Abstract

MEIOS DE CULTURA DE CÉLULAS GRANULADAS A SECO A presente invenção refere-se aos meios de cultura de células granuladas a seco que não compreendem as peptonas ou as triptonas, especialmente as formulações dos meios de cultura de células granuladas a seco que suportam o crecimento de mamíferos, e/ou insetos e/ou de células de planta. A presente invenção refere-se ainda a rodução desses meios de cultura de células granuladas a seco e a sua utilização.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MEIOS DE r * CULTURA DE CÉLULAS GRANULADAS A SECO". A presente invenção refere-se aos meios de cultura de células granuladas a seco que não incluam peptonas ou triptonas, especialmente no que dizrespeito às formulações de meios de cultura de células granuladas a seco que suportam o crescimento de mamíferos, e/ou insetos e/ou de célu- las de plantas. A presente invenção refere-se ainda a produção desses mei- os de cultura de células granuladas a seco e a sua utilização. . Antecedentes da Invenção Os meios de cultura de célula apóiam e mantêm o crescimento “ de células em um ambiente artificial.

Dependendo do tipo de organismo cujo crescimento deve ser suportado, os meios de cultura de células podem conter mais de 10, algu- mas vezes mais de uma centena de diferentes componentes.

Os meios de cultura necessários para a propagação de células de mamífero, inseto, ou planta são geralmente muito mais complexos do que os meios mínimos suficientes para suportar o crescimento de bactérias e leveduras.

Os primeiros estudos da cultura de células utilizaram os meios que consistem em componentes indefinidos, tais como plasma, soro, extra- tos de embriões, outros extratos biológicos não definidos ou peptonas. Um progresso importante foi, portanto, realizado no que diz respeito ao desen- volvimento de meios definidos quimicamente. Os meios definidos quimica- mente compreendem geralmente, mas não estão limitados exclusivamente a aminoácidos, vitaminas, íons metálicos, antioxidantes, quelantes, fatores de crescimento, hormônios, tampões, cloretos e muitas outras substâncias co- nhecidas por aquelas pessoas que são versadas na técnica.

Alguns meios de cultura de célula são oferecidos como líquidos aquosos estéreis. A desvantagem dos meios de cultura de células líquidos é asuavidade prateleira reduzida e as dificuldades para o transporte e arma- zenamento. Como consequência, muitos meios de cultura de células estão sendo atualmente oferecidos como misturas em pó a seco finamente moí-

das. Eles são fabricados com a finalidade de dissolver em soluções em água e/ou aquosas e no estado dissolvido são concebidos, frequentemente com outros suplementos, no que diz respeito ao fornecimento de células biológi- cas com uma base substancial de nutrientes para o crescimento e/ou para a produção de produtos biofarmacêuticos das mesmas referidas células.

A manipulação de pós finamente moídos tem desvantagens sig- nificativas. Por exemplo, eles são muito poeirentos para manipular, ainda mais em grandes quantidades, o que pode conduzir a problemas de saúde & dos trabalhadores que manuseiam os materiais especialmente se algumas t 10 das matérias-primas individuais forem perigosas para a saúde. Mesmo que - os componentes individuais não sejam diretamente tóxicos, pode haver pro- blemas de saúde causados aos trabalhadores por altos níveis de poeira no ar respirável por si só e as quantidades de poeira no ar são estritamente re- guladas em muitos países devido a este problema. Além disso, a poeira de materiais orgânicos, especialmente a poeira mais fina, pode facilmente resul- tar em explosões se as quantidades forem excessivas e as medidas adver- tência não são suficientes para evitar a ignição por meio da faísca.

Além disso, pode ocorrer mediante as condições desvantajosas de transporte, por exemplo, durante as condições de transporte de compri- mento, que um ou mais dos componentes individuais mais leves dos meios em pó a seco migram em direção à superfície ou um ou mais componentes mais pesados migram em direção à base da embalagem primária. O resulta- do desta concentração local mais elevada ou, no centro físico do material a granel, a depleção de determinado (s) componente (s) individual (is), pode ser negativa, em muitos aspectos sobre a qualidade do produto dos meios. Além disso, a desmistura pode ter efeitos muito além do esgotamento físico e da concentração de componentes individuais, por exemplo, nas quantida- des de produção da molécula biofarmacêutica alvo por lote ou mais sutil- mente na padronização de oligossacarideo em biofármacos por si mesmos fazendo a qualidade do meio absolutamente crítica para a qualidade biofar- macêutica certa até o paciente.

Outro aspecto quando utilizam-se os meios em pó a seco fina-

mente moídos é a dificuldade para dissolver o pó fino em soluções aquosas F para preparar o meio de cultura de célula aquosa final. É muito difícil molhar um pó finamente moído e dissolvê-lo em um líquido aquoso. Dessa maneira, o manuseamento dos meios em pó e a sua utilização é bastante complicado. Devido à limitação dos meios em pó a seco para a estabilidade, a mistura e a dissolução, os meios em formato seco são geralmente produ- zidos sem alguns complementos fundamentais, tais como o carbonato, hi- drolisados, fatores de crescimento e outros elementos vestigiais, os quais os E: utilizadores finais irão complementar quando eles preparam o líquido a partir E 10 domeioem pó a seco. A manipulação e a suplementação adicional vai au- . mentar o potencial de erros muitos custosos e de mão de obra. Sabe-se que os meios de cultura de células bacterianas em pó podem ser granulados por meio da prensagem do pó a grânulos pequenos. Os resultados são pequenas partículas com vantagens em termos de segu- —rança, manuseio e desempenho. Este procedimento pode ser facilmente rea- lizado por meio de cultura de células bacterianas uma vez que eles compre- endem as peptonas ou triptonas ou componentes peptídicos quimicamente mal definidas equivalentes que suportam a aderência dos componentes dos meios através de sua viscosidade inerente.

Os meios de cultura de células de mamífero, e/ou de insetos e/ou de plantas normalmente não contêm peptonas ou seus equivalentes e são, portanto, muito mais difícil de manusear desta maneira.

EUA 6.383.810 B2 por Invitrogen Corporation descreve um mé- todo de produção do meio de cultura em pó aglomerado da célula eucarióti- ca O método compreende molhar um meio de cultura de células em pó a seco com um solvente e depois a res-secagem do meio umedecido no que diz respeito à obtenção de um meio de cultura de células aglomeradas a se- co.

Uma grande desvantagem deste procedimento é o fato de os — componentes inteiros do meio terem de ser postos em contato com água e os mesmos precisam ser aquecidos com a finalidade de remover a água posteriormente. Isto pode causar efeitos secundários consideráveis das rea-

ções entre os componentes do meio ou a destruição ou a modificação dos ] componentes sensíveis, com um resultado imprevisível na qualidade do meio.

Consequentemente, existe uma clara necessidade para encon- trar uma nova forma de meios de cultura de células de mamífero, e/ou de insetos e/ou de plantas que sejam fácil de manusear e podem ser produzi- dos sem causar reações de destruição e/ou de efeito colateral entre os com- ponentes do meio.

. Breve Descrição da Invenção Verificou-se também que os meios de cultura de células de ma- - miífero, e/ou insetos e/ou de plantas, livres de peptona livre, quimicamente definidos podem ser produzidos em uma forma granulada por meio da com- pactação do pó finamente moído da mistura dos componentes do meio a seco. A compactação é alcançada por meio da aglomeração imprensa em prensas de papel. Nenhum aditivo deve ser usado para auxiliar o processo. Os meios de cultura de células granuladas a seco de acordo com a presente invenção têm uma vida útil longa, são fáceis de manusear e são produzidos sob condições muito suaves para que não ocorram as reações secundárias devido a molhar ou aquecer os componentes do meio durante o processo de fabricação.

Por conseguinte, a presente invenção refere-se a um método pa- ra produzir um meio de cultura de célula granulado a seco que não compre- ende as peptonas ou triptonas por meio de a) proporcionar um meio de cultura de célula sob a forma de um pómistodos componentes do meio, pelo que o pó misturado não compre- ende as peptonas ou triptonas b) compactação do referido pó misturado em uma prensa de rolo Em uma modalidade preferida, o meio de cultura de células que é fornecido na etapa a) é um meio de cultura de células de mamíferos.

Em uma modalidade preferida, o meio de cultura de células que é fornecido na etapa a) compreende um ou mais componentes de sacarí- deos, um ou mais aminoácidos, em uma ou mais vitaminas, um ou mais sais, um ou mais componentes tampão, e um ou mais cofatores e um ou mais componentes de ácido nucleico.

Em uma modalidade muito preferida, a etapa b) é realizada por meio de b1) compactar o referido pó misturado em uma prensa de rolo b2) reintroduzir todas as partes do meio de cultura de células compactadas obtidas na etapa b1) que têm um tamanho de partícula inferior a 0,2 mm para dentro do meio de cultura de célula sob a forma de um pó É misto dos componentes do meio para ser preenchido em uma prensa de ro- á 10 lo.

- Em uma modalidade preferida, a capacidade de pressão da prensa de rolo está entre 30 e 80 kN / cm de largura de rolo.

A presente invenção é ainda dirigida a um meio de cultura de cé- lulas de granulado a seco que não compreendem as triptonas ou as pepto- nas que podem ser preparadas de acordo com o método de acordo com a presente invenção.Em uma modalidade preferida, mais de 80 % das partícu- las do meio de cultura de células granuladas tem um tamanho maior do que 0,5 mm.

Em uma modalidade muito preferida, mais de 90 % das partícu- lasdomeio de cultura de células granuladas tem um tamanho maior do que 0,5 mm.

Em uma outra modalidade preferida, o meio de cultura de célula granulada a seco que não compreende as peptonas ou as triptonas é um meio de cultura de células de mamífero quimicamente definido.

Em uma outra modalidade preferida, o meio de cultura de célula granulada a seco que não compreende as peptonas ou as triptonas compre- ende um ou mais componentes de sacarídeos, um ou mais aminoácidos, em uma ou mais vitaminas, um ou mais sais, um ou mais componentes tampão, e um ou mais cofatores e um ou mais componentes de ácido nucleico.

A presente invenção é ainda dirigida à utilização de um meio de cultura de células granuladas a seco que não compreende as peptonas ou as triptonas para a cultura de células de acordo com a presente invenção por meio de:

o a) dissolver o meio de cultura de célula granulada a seco, que não compreende as peptonas ou as triptonas em um solvente com a finali- dade de formar um meio líquido de cultura de células b) contactar o referido meio de cultura de células líquido com as referidas células a serem cultivadas Em uma modalidade preferida as referidas células a serem culti- vadas são células de mamífero. : Em uma modalidade preferida, o solvente na etapa a) é água. : 10 Além das modalidades e aspectos da presente invenção indivi- * duais referidos acima, a presente invenção também pode ser realizada e posta em prática, em cada combinação de duas ou mais das modalidades ou aspectos descritos.

Descrição da Invenção A Figura 1 mostra uma vista esquemática de um equipamento de compactação a seco adequado para a presente invenção.

A granulação a seco de acordo com a presente invenção cria grânulos ou partículas por meio da compactação dos pós sob pressão - sem a adição de água ou outros solventes.

Normalmente, a prensa de rolo, que é usada de acordo com a presente invenção gera também os compactos ou flocos maiores.

Estes compactos formados dessa maneira são tipicamente divididos gentilmente, por exemplo, por um crivo vibratório, com a finalidade de produzir as partículas granuladas ((aglomeradas).De acordo com a pre- sente invenção, um pó ou um pó finamente moído é uma composição de partículas, das quais mais de 80 % têm um tamanho de partícula ((Diâme- tro)) de menos de 0,2 mm.

De preferência, o pó é seco e de fluxo livre.

Com a expressão "pó de fluxo livre" entende-se um pó ((feito por meio da fresa- gem, micropeletização ou técnica semelhante)), ao qual as partículas não aderirem umas às outras.

Todos os pós que apresentam um ângulo de re- pouso de cerca de 50 graus abaixo mostram tipicamente as propriedades de fluxo adequadas, mas, tal como utilizados na presente invenção, os termos a seco e de fluxo livre, também devem referir-se a aparência bruta do pó - o que significa que o pó parece seco e de fluxo livre .

Um meio de cultura de célula de acordo com a presente inven- ção é qualquer mistura de componentes, que mantém e/ou suportam o cres- cimento in vitro de células. O meio de cultura de célula pode compreender todos os componentes necessários com a finalidade de manter e/ou apoiar o crescimento in vitro de células ou apenas alguns componentes de modo a que outros componentes são adicionados de uma maneira separada. Exem- plos de meios de cultura de células de acordo com a presente invenção são . os meios completos que compreendem todos os componentes necessários ã 10 coma finalidade de manter e/ou apoiar o crescimento in vitro de células, ou . os meios de alimentações ou de suplementos. Em uma modalidade preferi- da, o meio de cultura de células é um meio completo. É Tipicamente, os meios de cultura de células de acordo com a presente invenção são utilizados com a finalidade de manter e/ou apoiar o crescimento de células em um biorreator.

Um meio de cultura de células de mamífero é uma mistura de componentes que mantêm e/ou apoiam o crescimento in vitro de células de mamíferos. Exemplos de células de mamífero são as células de origem hu- mana ou animal, de preferência as células de CHO, células COS, células VERO |, as células BHK, AK-1, as células SP2 / O, as células de L5.1, as células de hibridoma ou as células humanas.

As células a serem cultivadas com os meios de comunicação de acordo com a presente invenção podem ser as células normais, as células doentes, as células transformadas, as células mutantes, as células somáti- cas,as células germinais, as células estaminais, as células precursoras ou as células embrionárias, qualquer uma das quais as linhagens de célula po- dem ser estabelecidas transformadas obtidas a partir de fontes naturais.

Um meio de cultura de células que não compreende as peptonas ou as triptonas é um meio de cultura de células que não contêm quaisquer —peptonas ou triptonas ou outros peptídeos produzidos por meio da hidrólise parcial de proteínas.

Em uma modalidade preferida, o meio de cultura de células que não compreendem as peptonas ou as triptonas também não compreendem ] quaisquer proteínas ou outros polímeros derivados naturalmente como ágar. Em uma modalidade muito preferida, o meio de cultura de células que não compreende as peptonas ou as triptonas é um meio de cultura de células definido quimicamente.

Os meios de cultura de células definidos quimicamente são os meios de cultura de células que não compreendem quaisquer substâncias quimicamente indefinidas. Isso significa que a composição química e a estru- : tura de todos os produtos químicos utilizados nos meios quimicamente defi- E 10 nidos são conhecidos. Os meios quimicamente definidos não contemplam - qualquer tecido levedura, animal ou planta, pois eles não compreendem as células alimentadoras, soro, extratos ou digestivos ou outros componentes que possam contribuir as proteínas quimicamente mal definidas para o meio. As estruturas químicas quimicamente indefinidas ou mal definidas,são aque- las cuja composição e estrutura química não é conhecida ou apenas poderi- am ser definidas com um enorme esforço experimental - comparável à avali- ação da composição química e estrutura de proteínas, como albumina ou caseína.

Em uma modalidade, o meio de cultura de células que não com- preende as peptonas ou as triptonas de acordo com a presente invenção contém apenas um ou mais componentes de sacarídeos, um ou mais ami- noácidos, em uma ou mais vitaminas, um ou mais sais, de um ou mais com- ponentes tampão, um ou mais cofatores e um ou mais componentes de áci- do nucleico.

O tamanho de uma partícula significa o diâmetro do meio da par- tícula. O diâmetro das partículas é determinado por meio da dispersão de luz a laser em óleo de silicone.

Os componentes de sacarídeo são todos os mono- ou dissacarí- deos, como a glicose, a galactose, a ribose ou frutose (exemplos de monos- — sacarídeos) ou sacarose, lactose ou maltose (exemplos de dissacarídeos).

Exemplos de aminoácidos de acordo com a presente invenção são os aminoácidos proteinogênicos, especialmente os aminoácidos essen-

ciais, leucina, isoleucina, lisina, metionina, fenilalanina, treonina, triptofano e " valina, bem como os aminoácidos não proteinogênicos como os D- aminoácidos.

Exemplos de vitaminas são a vitamina A ((retinol, retinal, vários retinóides, e quatro carotenóides)), vitamina B1 ((tiamina)), vitamina B2 ((ri- boflavina)), vitamina B3 ((niacina, niacinamida)), vitamina B5 (ácido pantotê- nico), vitamina B6 (Piridoxina, piridoxamina, piridoxal), Vitamina B7 (biotina), Vitamina B9 (ácido fólico, ácido folínico), vitamina B12 (cianocobalamina, . hidroxicobalamina, metilcobalamina), Vitamina C (ácido ascórbico), vitamina tr 10 D (ergocalciíferol, colecalciferol), vitamina E (tocoferóis, tocotrienóis) e vita- - mina K (filloquinona, menaquinonas). Os precursores de vitamina também estão incluídos.

Exemplos de sais são os componentes que compreendem os íons inorgânicos, tais como bicarbonato, cálcio, cloreto de magnésio, fosfato de potássio e de sódio ou de elementos vestigiais tais como Co, Cu, C, Fe, Mn, Mo, Ni, Se, Si, Ni, Bi, Ve Zn.

Exemplos de tampões são C02 / HC03, HEPES, PIPES, ACES, BES, TES, MOPS e TRIS.

Exemplos de cofatores são os derivados de tiamina, biotina, vi- taminaC, NAD/NADP, cobalamina, mononucleótido de flavin e derivados, glutationa, nucleotídeos fosfatos de heme e derivados.

Os componentes dos ácidos nucleicos, de acordo com a presen- te invenção, são as nucleobases, como citosina, guanina, adenina, timina ou uracila, tais como os nucleosídeos de citidina, uridina, adenosina, timidina e — guanosina, e os nucleotídeos, como monofosfato de adenosina ou difosfato de adenosina ou trifosfato de adenosina .

Um meio de cultura de célula estável é um meio que após arma- zenagem durante um certo período de tempo mostra pelo menos 80 %, de preferência pelo menos 90 %, de preferência pelo menos 97 %, ainda mais de preferência, a mesma atividade biológica e bioquímica quando compara- do com um meio fresco da mesma formulação.

A presente invenção baseia-se na constatação de que também os meios que não incluam as peptonas ou triptonas ou os componentes se- f melhantes, podem ser fornecidos sob uma forma de granulado a seco.

Isso foi muito inesperado, pois até agora o único meio de cultura de células com peptonas ou triptonas poderia ser granulado a seco.

Presumiu-se que as propriedades adesivas das peptonas ou das triptonas eram essenciais no que diz respeito à produção de suportes de granulados a seco.

Verificou-se que um procedimento de compactação especial também permite a produção de suportes de granulados a seco que não F compreendem as peptonas ou as triptonas.

Fr. 10 O processo de compactação de acordo com a presente invenção . é realizado em duas etapas principais. a) proporcionar um meio de cultura de célula sob a forma de um pó misto dos componentes do meio b) compactação do referido pó misturado em uma prensa de rolo Na etapa a), um pó a seco finamente moído dos componentes do meio é fornecido.

Todos os componentes são misturados de modo a que todas as partes da mistura em pó têm quase a mesma composição.

A mistu- ra deve ter a mesma qualidade no que diz respeito à sua uniformidade da composição como um meio de cultura de células de pó a seco comercial.

Quanto maior a uniformidade da composição, melhor será a qualidade do meio de granulado a seco resultante no que diz respeito ao crescimento de célula homogênea.

Os moídos que são adequados para a produção de pós- moídos finos são, por exemplo, moídos de bolas, moídos de pinho, moídos de jato ou moídos de peneira de lâmina rotativa.

O tamanho das partículas dospósé normalmente inferior a 500 pm, de preferência inferior a 200 pm.

Para se obter um pó misto dos componentes do meio os compo- nentes podem, por exemplo, ser primeiro misturados e depois finamente mo- ídos ou como uma mistura eles podem ser moidos individualmente ou em subgrupos e combinados e misturados depois.

De preferência, todos os componentes da mistura são secos. |s- so significa que, se eles compreendem água, eles só compreendem a água de cristalização, mas não mais do que 5 %, de preferência não mais do que

2 % mais preferido não mais do que 1 % em peso de moléculas de água não . à. ligada ou não coordenada.

Se um ou mais dos componentes da mistura é sensível à oxida- ção, a mistura e moagem podem ser realizadas sob um gás protetor inerte.

Na segunda etapa, a etapa b), a mistura em pó é compactada em uma prensa de rolo.

Uma prensa de rolo, também chamada rolo compactador, é co- nhecida de uma pessoa versada na técnica. Normalmente uma prensa de : rolo compreende dois rolos em contrarrotação, que estão localizados a uma . 10 pequena distância de cerca de 0,5 a 3 mm, de preferência 1 a 2 mm ao lado . do outro. As prensas de rolo adequadas normalmente têm rolos com uma largura entre 10 cm e 50 cm, resultando na abertura entre o cilindro que tem um comprimento entre 10 cm e 50 cm. No entanto, o tamanho dos cilindros e, portanto, o comprimento do intervalo entre os rolos podem variar depen- dendodo tamanho da prensa de rolo. Em uma modalidade preferida, a aber- tura tem um comprimento entre 10 e 5 cm.

O material em pó misturado é aspirado entre os rolos em con- trar- rotação e compactado no espaço entre os rolos. A distância entre os rolos e a sua estrutura de superfície tem uma influência sobre o tamanho finalea estrutura das partículas granuladas resultantes.

A superfície dos rolos é de preferência agitada. As agitações a- judam a fazer a vara em pó com o rolo e o puxe através da imprensa.

A capacidade de pressão da prensa de rolo é geralmente entre 20 e 150 kN / cm de largura do rolo, de preferência, os rolos são pressiona- dosem conjunto com uma força de entre 30 e 80 kN, mais preferido entre 40 e 60 kN.

Se os componentes do meio de cultura de células são muito sensíveis, o processo de compactação pode ser efetuado sob uma atmosfe- ra protetora de gás inerte. Além disso, os rolos da prensa de rolo são geral- mente resfriados com a finalidade de manter uma temperatura constante, uma vez que muitas vezes alguns componentes são sensíveis ao calor e não suportaria a temperatura ligeiramente aumentada, que pode ocorrer de-

vido à compactação.

- Em uma modalidade preferida, o meio de cultura de célula com- pactada que é liberado a partir da prensa de rolo é dimensionado de uma maneira direta. Isto pode ser feito, por exemplo, por meio da peneiração, por exemplo, com uma ou mais peneiras vibratórias. O diâmetro dos furos da peneira depende do tamanho dos grânulos a serem recolhidos. Para o pro- cesso de acordo com a presente invenção, um diâmetro típico situa-se entre 0,5 a 5 mm, de preferência cerca de 1 para 3 mm. Especialmente se a gra- " nulação a seco na prensa de rolo resulta em flocos compactos ou maiores, sã 10 de preferência, um moinho de peneira é utilizado com a finalidade de granu- . lar os compactos ou os flocos, para os grânulos de tamanho adequado. Um moinho de peneira adequado é o moinho de peneira oscilante, tipo FC 200, Bepex GmbH, com uma dimensão de crivo entre 1 e 3 mm.

As prensas de rolo, que são adequadas para o processo de a- cordocom a presente invenção, podem, por exemplo, ser adquiridas a partir de Alexanderwerk, Sahut Coreur, Hosokawa ou Fitzpatrick Company.

Como já foi explicado, o tamanho das partículas do meio de cul- tura de células granuladas a seco depende da forma do meio compactado que sai da prensa de rolo que é tratada. Se o meio está diretamente coleta- doa partirda prensa de rolo, o mesmo normalmente compreende compac- tos ou flocos maiores. Se o meio é peneirado, o tamanho das partículas é determinado por meio do tamanho da peneira. Mas também o manuseamen- to de embalagens como tipicamente influencia o tamanho médio de partícula como algumas partículas do meio de cultura de células granuladas podem quebrarem pedaços.

Em uma modalidade preferida, após a compactação e a penei- ração, mais de 80% das partículas do meio de cultura de células granuladas tem um tamanho maior do que 0,5 mm.

Em uma modalidade muito preferida, mais de 90 % das partícu- lasdomeio de cultura de células granuladas tem um tamanho maior do que 0,5 mm.

Foi constatado que a qualidade do meio de cultura de células granuladas de acordo com a presente invenção pode ser ainda melhorada * se a fração do material compactado, que é liberado a partir da prensa de rolo, que tem dimensões de partículas menores que 0,5, de preferência me- nores que 0,2 mm é continuamente reintroduzido na alimentação da prensa derolomaisuma vez para voltar a ser misturado com a mistura em pó, e para ser repressionado. Isto reduz a fração em pó do meio de cultura de cé- lulas granuladas a seco final e, adicionalmente melhora a homogeneidade do produto. : A Figura 1 apresenta uma vista esquemática de uma montagem O 10 de produção possível. A prensa de rolo é mostrada como rolo R1 e rolo R2. . A mistura em pó P1 é alimentada a partir de um reservatório dentro da pren- sa de rolo. A mistura compactada, que é liberada a partir da prensa de rolo é dimensionada com a peneira S. A fração de produto é removida para poste- rior tratamento e de embalagem, a fração P2 em pó que tem um tamanho de partícula inferior a 0,2 mm é continuamente reintroduzida na alimentação da prensa de rolo.

Verificou-se que a granulação a seco de acordo com a presente invenção pode ser realizada sem a adição de substâncias para aumentar a viscosidade da mistura.

O meio de cultura de células granuladas a seco resultantes pode então ser ainda mais processado. O meio pode ser empacotado e/ou esteri- lizado. Os recipientes adequados são conhecidos por uma pessoa que seja versada na técnica. Exemplos são sacos, caixas, garrafas, caixas de pape- lão, formulários embalados a vácuo, etc. A embalagem pode ser realizada antes ou após a esterilização. Preferida é proporção-radiação após a sua embalagem adequada.

Os meios de cultura de células granuladas a seco de acordo com a presente invenção podem também ser utilizados favoravelmente para a produção de outros tipos de meios compactados como comprimidos ou flocos maiores. Para isso, os meios de cultura de células granuladas a seco de acordo com a presente invenção são submetidos à compactação em uma prensa adequada, por exemplo, uma prensa de comprimidos. O meio granu-

lado pode ser utilizado como sem a adição de outros componentes ou pode * ser misturado com outros componentes, como auxiliares de formação de comprimidos ou misturados ou, mais tarde, revestidos com componentes específicos para, por exemplo, retardar os comprimidos de liberação. Por outrolado, o meio de cultura de célula granulada a seco pode ser misturado com os componentes que suportam a rápida dissolução dos comprimidos, tal como bicarbonato de sódio.

Os meios de cultura de células granuladas a seco que são com- pactados ou de acordo com o método da presente invenção tipicamente " 10 compreendem pelo menos um ou mais componentes de sacarídeos, um ou - mais aminoácidos, uma ou mais vitaminas e precursores de vitamina, um ou mais sais, um ou mais os componentes do tampão, um ou mais cofatores e um ou mais componentes de ácido nucleico.

Os meios de comunicação podem também compreender os áci- dos graxos e/ou derivados de ácidos graxos e/ou ácido plurônico e/ou com- ponentes de superfície ativos do tipo tensoativos não iônicos quimicamente preparados. Um exemplo de um agente tensoativo não iônico adequado são os tensoativos de copolímeros em bloco difuncionais de terminação em gru- pos hidroxila primários, por exemplo, disponível sob o nome comercial de —Pluronicºda BASF, Alemanha.

Os meios de granulados a seco de acordo com a presente in- venção podem ser utilizados para os mesmos fins que os meios em pó ou meios líquidos conhecidos na técnica. Eles podem ser, preferencialmente, usados na produção biofarmacêutica como também grandes quantidades de meios granulados podem ser facilmente manipulados, sem as desvantagens discutidas para os meios em pó.

Para utilização em um solvente, de preferência água ((mais par- ticularmente destilada e/ou desionizada ou água para injeção ou água purifi- cada)), ou um tampão aquoso é adicionado aos meios granulados a seco e os componentes são misturados até que o meio seja totalmente dissolvido no solvente.

O solvente também pode compreender a solução salina, ácido solúvel ou os íons de base proporcionando uma proporção de pH de 1,0 a

10. O, estabilizadores, tensoativos, conservantes, e os álcoois ou outros sol- ventes orgânicos polares.

É também possível adicionar outras substâncias, tais como —substânciastampão para ajustamento do pH, o soro fetal de vitelo, açúcares, etc., para a mistura do meio de cultura de células e o solvente. O meio líqui- do de cultura de células resultante é então posto em contato com as células a serem cultivadas ou mantidas.

. Os meios de granulados a seco de acordo com a presente in- E 10 venção são fáceis de manusear. Em comparação com os meios de comuni- à. cação de pó, a quantidade de pó que se forma durante a manipulação dos meios de comunicação é significativamente reduzida.

Os meios de comunicação de acordo com a presente invenção podem ser facilmente dissolvidos em solventes. A reconstituição é rápida, de preferência menos de 30 minutos, mais preferencialmente menos de 15 mi- nutos.

A composição dos meios de granulados a seco de acordo com a presente invenção permanece homogênea, mesmo em caso de agitação ou de vibração durante o transporte.

Além disso, em contraste com os meios granulados úmidos, as condições mais amenas de granulação a seco para permitir o processamen- to fácil e direto dos meios compreendem ainda as substâncias sensíveis à calor e/ou à oxidação como por exemplo, vitaminas (vitamina B1), glicose, tiamina, sais de ferro ou componentes compreendendo as pontes dissulfeto.

A presente invenção é ainda ilustrada por meio das seguintes fi- guras e exemplos, no entanto, sem ser restrita aos mesmos.

As descrições completas de todas as aplicações, patentes e pu- blicações citadas acima e abaixo e do correspondente Pedido de Patente Provisório U. S. 61 / 423, 700, depositado em 16 de dezembro de 2010, são incorporados na presente invenção por meio da referência.

Exemplos Os exemplos seguintes representam as aplicações práticas da presente invenção. f 1. Compactação a seco do Meio Eagle Modificado de Dulbecco O Meio Eagle Modificado de Dulbecco também conhecido como DMEM, é um meio geralmente utilizado para o cultivo de células de animais.

Osingredientes de DMEM são em mg /|: Sais inorgânicos : CaCl, (sem água) : 200,00 Fe (NO3) + 9 HO : 0,10 . KCl : 400,00 . 10 MgSO, (sem água) : 97,67 . NaCl : 6400,00 NaH2PO, 1 HO : 125,00 Outros componentes : D-Glicose : 4500,00 Fenol : 15,00 Natriumpiruvato : 110,00 Aminoácidos : L-Arginina HCI : 84,00 L-cistina 2HCI : 63,00 L-Glutamina : 584,00 Glicina : 30,00 L-histidina HCI H2O : 42,00 L-Isoleucina : 105,00 L-Leucina : 105,00 L-lisina HCI : 146,00 L-metionina : 30,00 L-Fenilalanina : 66,00 L-Serina : 42,00 L-Treonina : 95,00 L-Triptofano : 16,00 L-Tirosina 2Na e 2H2O : 104,33 L-Valina : 94,00

Vitaminas : f D-Calciumpantotenato : 4,00 Cloreto de colina : 4,00 Ácido fólico : 4,00 i-Inositol : 7,20 Niacinamida : 4,00 Riboflavina : 0,40 Tiamina HCl : 4,00 . Todos os ingredientes do meio de DMEM são misturados e moi- = 10 dosem um moinho de pinos para se obter um pó seco, homogêneo. 30 kg s do pó são alimentados para uma prensa rolo com as seguintes característi- cas: - rolos planos côncavos - A distância entre os rolos: 1,5 milímetro - Duração do intervalo entre os rolos: 10 centímetros - Força da pressão: 50 kN O material obtido apresenta uma elevada percentagem de com- pactos maiores.

O material resultante é peneirado em um moinho de peneira oscilante, tipo FC 200, Bepex GmbH, com uma dimensão de peneira de 3 mm A fração de grânulos com um tamanho (diâmetro) inferior a 0,2 milímetro é reintroduzida na prensa de rolo.

Obtém-se um meio DMEM gra- nulado a seco com mais do que 75 % dos grânulos com dimensões compre- endidas entre 1 e 3 mm.

Claims (15)

1. REIVINDICAÇÕES a. 1. Método para produzir um meio de cultura de célula granulada a seco que não compreende as peptonas ou as triptonas por meio de a) proporcionar um meio de cultura de célula sob a forma de um pómistodos componentes do meio, pelo que o meio não compreendem as peptonas ou as triptonas b) compactação do referido pó misto em uma prensa de rolo
2. 2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo é fato de que o meio de cultura de células que é fornecido na etapa a) ser um r 10 meiode cultura de células de mamíferos.
3. « 3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura de células que é fornecido na etapa a) compreender um ou mais componentes de sacarídeos, um ou mais aminoá- cidos, uma ou mais vitaminas, um ou mais sais, um ou mais componentes dotampão, um ou mais cofatores e um ou mais componentes de ácido nu- cleico.
4. 4. Método de acordo com uma ou mais das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato da etapa b) ser realizada por meio de b1) compactar o referido pó misturado em uma prensa de rolo b2) reintroduzir todas as partes do meio de cultura de células compactadas obtidas na etapa b1) que têm um tamanho de partícula inferior a 0,5 mm para dentro do meio de cultura de célula sob a forma de um pó misto dos componentes do meio para ser preenchido no prensa de rolo.
5. 5. Método de acordo com uma ou mais das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de a capacidade de pressão da prensa de rolo estar entre 30 e 80 kN / cm de largura de rolo.
6. 6. Método de acordo com uma ou mais das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de o tamanho do espaço entre os rolos da prensa de rolo situar-se entre 0,5 e 3 mm.
7. 7. Método de acordo com uma ou mais das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de na etapa c), o material obtido a partir da etapa b) ser processado em um moinho de peneira.
8. 8. Meio de cultura de célula granulada a seco que não compre- so ende as peptonas ou as triptonas preparáveis de acordo com o método co- mo definido em uma ou mais das reivindicações 1 a 7.
9. 9. Meio de cultura de célula granulada a seco de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de mais de 80 % das partículas do meio de cultura de células granuladas ter um tamanho maior do que 0,5 mm.
10. 10. Meio de cultura de célula granulada a seco de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracterizado pelo fato de mais de 90 % das partículas do meio de cultura de células granuladas ter um tamanho maior do que 0,5 mm. “ 10
11. 11. Meio de cultura de célula granulada a seco de acordo com -. uma ou mais das reivindicações 8 a 10, caracterizado pelo fato de o meio de cultura de células granuladas a seco não compreendendo as peptonas ou as triptonas ser um meio de cultura de células de mamíferos.
12. 12. Meio de cultura de célula granulada a seco de acordo com uma ou mais das reivindicações 8 a 11, caracterizado pelo fato de o meio de cultura de células granuladas a seco não compreendendo as peptonas ou triptonas compreenderem um ou mais componentes de sacarídeos, um ou mais aminoácidos, uma ou mais vitaminas, um ou mais sais, um ou mais componentes tampão, e um ou mais cofatores e um ou mais componentes deácidonucleico.
13. 13. Uso de um meio de cultura de célula granulada a seco que não compreende as peptonas ou as triptonas como definidas em uma ou mais das reivindicações 8 a 12, para a cultura de células por meio de : a) dissolver o meio de cultura de célula granulada a seco que não compreende as peptonas ou as triptonas em um solvente com a finali- dade de formar um meio líquido de cultura de células b) contactar o referido meio líquido de cultura de células com as referidas células a serem cultivadas
14. 14. Uso de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fa- todeas referidas células a serem cultivadas serem células de mamífero.
15. 15. Uso de acordo com a reivindicação 13 ou 14, caracterizado pelo fato de o solvente na etapa a) ser água.