ES2838693T3 - Método para aumentar el nivel de glutatión en células - Google Patents
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Abstract
Un metodo para aumentar el nivel de glutation (GSH) en celulas de mamiferos que comprende anadir a dichas celulas S-sulfocisteina y/o una sal de S-sulfocisteina en una cantidad eficaz para aumentar el nivel de glutation intracelular por lo que el nivel de glutation aumenta en al menos un 10% durante mas de la mitad del tiempo del cultivo celular en comparacion con un cultivo celular en condiciones equivalentes pero sin la adicion de S-sulfocisteina y/o sus sales.
Description
DESCRIPCIÓN
Método para aumentar el nivel de glutatión en células
La presente invención se refiere al uso de sulfocisteína y derivados de la misma para aumentar la reserva de glutatión en las células.
El glutatión, una molécula tripeptídica que consta de los aminoácidos L-glicina, L-cisteína y ácido L-glutámico (también conocido como L-glutamato), es uno de los principales antioxidantes intracelulares en mamíferos.
El glutatión existe en estados reducido (GSH) y oxidado (GSSG), predominando la forma reducida (GSH). Un aumento de la proporción de GSSG con respecto a GSH se considera indicativo de estrés oxidativo.
Aunque el glutatión se produce en la mayoría de las células, muchas enfermedades y otras patologías están asociadas con niveles reducidos de glutatión intracelular. El glutatión es un constituyente intracelular estrictamente regulado, y su producción está limitada por la inhibición por retroalimentación negativa de su propia síntesis a través de la enzima gamma-glutamilcisteína sintetasa, minimizando así en gran medida cualquier posibilidad de sobredosis. El aumento de glutatión utilizando precursores de la síntesis de glutatión es una estrategia desarrollada para abordar estados de deficiencia de glutatión, alto estrés oxidativo, inmunodeficiencia y sobrecarga xenobiótica en la que el glutatión juega un papel en la desintoxicación del xenobiótico en cuestión. Los estados de deficiencia de glutatión en humanos incluyen, entre otros, VIH/SIDA, hepatitis química e infecciosa, encefalomielitis miálgica, síndrome de fatiga crónica, cánceres de próstata y otros, cataratas, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, asma, intoxicación por radiación, estados de desnutrición, estrés físico arduo y envejecimiento, y se ha asociado con una respuesta inmune subóptima. Muchas patologías clínicas están asociadas con el estrés oxidativo y se desarrollan en numerosas referencias médicas.
Además, se reconoce generalmente que las deficiencias en el sistema de glutatión conducen a un envejecimiento celular significativo y, en última instancia, a una morbilidad celular. La concentración de glutatión celular tiene un efecto significativo sobre la función antioxidante; y la limitación de nutrientes, el ejercicio y el estrés oxidativo tienen efectos significativos sobre las concentraciones de glutatión celular.
El glutatión se sintetiza en una serie de reacciones bioquímicas que utilizan ATP, magnesio y los tres aminoácidos glicina, glutamato y cisteína. En general, la tasa de síntesis de gamma-glutamilcisteína determina la tasa de síntesis del glutatión, y el grupo sulfhidrilo de la cisteína proporciona al glutatión su potencia biológica. Por lo tanto, la disponibilidad de cisteína es esencial para la disponibilidad de glutatión y su función antioxidante.
La disponibilidad de glutatión puede ser relevante para aplicaciones terapéuticas y cosméticas, pero también para aplicaciones de cultivo celular. Un aumento de la reserva total de GSH en las células cultivadas conduce a una disminución de la reactividad oxidativa en el compartimiento intracelular y, por lo tanto, a una duración del cultivo prolongada y, a menudo, también a un aumento del título.
Por lo tanto, el objetivo de la presente invención era encontrar una forma de aumentar el contenido de GSH de las células. Se conocen en la técnica varios enfoques para esto, principalmente en el área terapéutica.
El documento US 2014/0100283 divulga el uso del derivado de GSH S-acetil-glutatión.
El documento US 2011/0077303 divulga el suministro de glicina y N-acetilcisteína.
El documento US 2013/0338165 sugiere el uso de ciertos profármacos de cisteína/cisteína o profármacos de N-acetilcisteína.
El documento AU 652 988 B2 divulga un método para aumentar el nivel de glutatión en pacientes mediante la administración de una proteína hidrolizada enriquecida en cisteína.
El documento US 5208249 describe que la concentración de glutatión depende del suministro de cisteína y nombra varios compuestos para aumentarlo, tales como ésteres de N-acetil-L-cisteína y glutatión.
Para aplicaciones de cultivo celular, tales enfoques tienen solo una viabilidad limitada ya que los precursores de glutatión a menudo no son absorbidos por las células debido al requerimiento de un sistema transportador específico. Para el cultivo celular, sería favorable un enfoque más eficaz y universal.
Se ha encontrado que la S-sulfocisteína y sus sales aumentan el contenido de GSH de las células de mamífero. Además, se ha encontrado que si las células reciben cantidades equivalentes de cisteína o S-sulfocisteína, las células que han recibido s-sulfocisteína muestran una mayor cantidad de GSH en comparación con las células con cisteína. En consecuencia, esta invención está dirigida a un método para aumentar el nivel de glutatión en células de mamíferos
que comprende añadir a dichas células S-sulfocisteína y/o una sal de S-sulfocisteína en una cantidad eficaz para aumentar el nivel de glutatión intracelular por lo que el nivel de el glutatión aumenta en al menos un 10% durante más de la mitad del tiempo del cultivo celular en comparación con un cultivo celular en condiciones equivalentes pero sin la adición de S-sulfocisteína y/o sus sales.
En una realización preferida, el método se realiza cultivando dichas células en un medio de cultivo celular líquido y añadiendo al medio de cultivo celular en uno o más puntos de tiempo en el transcurso del cultivo S-sulfocisteína y/o una sal de S-sulfocisteína en una cantidad eficaz para aumentar el nivel de glutatión intracelular de las células en cultivo.
En una realización preferida se añade sal sódica del ácido (S)-2-amino-3-sulfosulfanilpropanoico.
En otra realización preferida, el medio de cultivo celular tiene un pH entre 6,8 y 7,5.
En otra realización preferida, se añaden S-sulfocisteína y/o una sal de S-sulfocisteína en una cantidad tal que su concentración en el cultivo celular esté entre 0,4 y 50 mM.
En una realización, las células se cultivan en un medio de cultivo celular que comprende al menos uno o más componentes sacáridos, uno o más aminoácidos, una o más vitaminas o precursores de vitaminas, una o más sales, uno o más componentes tampón, uno o más cofactores y uno o más componentes de ácido nucleico.
En una realización, el método de la presente invención se realiza mediante
a) la provisión de un biorreactor
b) la mezcla de las células que se van cultivar con un medio de cultivo celular que comprende S-sulfocisteína y/o una sal de S-sulfocisteína
c) la incubación de la mezcla de la etapa b).
En otra realización preferida, el método de la invención se realiza mediante
- la carga de células en un biorreactor y un medio de cultivo celular líquido
- la incubación de las células en el biorreactor
- la adición de un medio de cultivo celular continuamente durante todo el tiempo de incubación de las células en el biorreactor o una o varias veces dentro de dicho tiempo de incubación, que en este caso es un medio de alimentación, al biorreactor
en el que el medio de alimentación comprende S-sulfocisteína y/o una sal de S-sulfocisteína.
Preferiblemente, el medio de alimentación comprende S-sulfocisteína y/o una sal de S-sulfocisteína en una concentración entre 1 y 100 mmol/L, preferiblemente entre 5 y 20 mmol/L.
La presente invención se dirige además al uso de S-sulfocisteína y/o una sal de S-sulfocisteína para aumentar la cantidad intracelular de glutatión.
La Figura 1 muestra una comparación de las concentraciones de IgG logradas con células CHO cultivadas en un experimento de alimentación por lotes al biorreactor con cisteína o S-sulfocisteína. Se pueden encontrar más detalles en los Ejemplos.
La Figura 2 muestra una comparación de las especies reactivas intracelulares de células CHO cultivadas en un experimento de alimentación por lotes al biorreactor con cisteína o S-sulfocisteína. Se pueden encontrar más detalles en los Ejemplos.
La Figura 3 muestra una comparación de los niveles de glutatión de células CHO cultivadas en un experimento de alimentación por lotes al biorreactor con cisteína o S-sulfocisteína. Se pueden encontrar más detalles en los Ejemplos. La S-sulfocisteína, también denominada ácido (S)-2-amino-3-sulfosulfanilpropanoico es un producto, por ejemplo, que puede ser obtenido por la condensación de ácido sulfúrico y cisteína. Las sales adecuadas son sales de metales alcalinos o de metales alcalinotérreos, por ejemplo, las sales de litio, las sales de sodio, las sales de potasio, las sales de calcio o las sales de magnesio o mezclas de las mismas. Se prefieren la sal de sodio, la sal de potasio, la sal de calcio y la sal de magnesio, la más preferida es la sal de sodio.
La S-sulfocisteína y sus sales también se pueden mostrar mediante las siguientes fórmulas I y II:
siendo R
y siendo X: H, Li, Na, K, 1/2 Ca, 12 Mg, preferiblemente H, Na, K. El término ácido propanoico también puede usarse en lugar del término ácido propiónico.
La síntesis del ácido 2-amino-3-sulfosulfanil-propiónico, también llamado ácido (S)-2-amino-3-sulfosulfanil-propanoico, S-sulfo-cisteína o cisteína-S-sulfato, y sus sales se divulga por ejemplo en IH Segel y MJ Johnson, Analytical Biochemistry 5 (1963), 330-337 y JS Church, D.J. Evans, Spectrochimica Acta Part A 69 (2008) 256-262. La sal de sodio también está disponible comercialmente a través de Bachem, Suiza.
Un medio de cultivo celular es cualquier mezcla de componentes que mantiene y/o apoya el crecimiento celular in vitro. Puede ser un medio complejo o un medio químicamente definido. El medio de cultivo celular puede comprender todos los componentes necesarios para mantener y/o soportar el crecimiento in vitro de las células o solo algunos componentes de modo que los componentes adicionales se añadan por separado. Ejemplos de medios de cultivo celular son medios completos que comprenden todos los componentes necesarios para mantener y/o soportar el crecimiento in vitro de células, así como suplementos o alimentación de medios. Un medio completo, también llamado medio base, normalmente tiene un pH entre 6,8 y 7,8. Un medio de alimentación tiene preferiblemente un pH por debajo de 8,5.
Típicamente, los medios de cultivo celular de acuerdo con la invención se utilizan para mantener y/o soportar el crecimiento de células en un biorreactor y para soportar la producción de IgG de dichas células.
Algunos medios de cultivo celular se ofrecen como líquidos acuosos estériles. La desventaja de los medios de cultivo celular líquidos es su vida útil reducida y las dificultades de transporte y almacenamiento. Como consecuencia, muchos medios de cultivo celular se ofrecen actualmente como mezclas de polvo seco finamente molidas. Se fabrican con el propósito de disolverse en agua y/o soluciones acuosas y en estado disuelto están diseñados, a menudo con otros suplementos, para suministrar a las células una base nutritiva sustancial para el crecimiento y/o producción de biofarmacéuticos a partir de dichas células.
La mayoría de las plataformas de producción biofarmacéutica se basan en protocolos de cultivo celular de alimentación por lotes. Normalmente, el objetivo es desarrollar procesos de cultivo celular con títulos elevados para satisfacer las crecientes demandas del mercado y reducir los costes de fabricación. Además del uso de líneas celulares recombinantes de alto rendimiento, se requieren mejoras en los medios de cultivo celular y los parámetros de proceso para alcanzar el máximo potencial de producción.
En un proceso de alimentación por lotes, un medio base soporta el crecimiento y la producción iniciales, y un medio de alimentación previene el agotamiento de nutrientes y sostiene la fase de producción. Los medios se eligen para adaptarse a los distintos requisitos metabólicos durante las diferentes fases de producción. La configuración de los parámetros del proceso, incluida la estrategia de alimentación y los parámetros de control, definen los entornos químicos y físicos adecuados para el crecimiento celular y la producción de proteínas.
Un alimento o medio de alimentación es un medio de cultivo celular que no es el medio basal que soporta el crecimiento y la producción iniciales en un cultivo celular, sino el medio que se agrega en una etapa posterior para evitar el agotamiento de nutrientes y sostener la fase de producción. Un medio de alimentación puede tener concentraciones más altas de algunos componentes en comparación con un medio de cultivo basal. Por ejemplo, algunos componentes, tales como, por ejemplo, nutrientes que incluyen aminoácidos o carbohidratos, pueden estar presentes en el medio de alimentación a aproximadamente 5X, 6X, 7X, 8X, 9X, 10X, 12X, 14X, 16X, 20X, 30X, 50X, 100x, 200X, 400X, 600X, 800X o incluso aproximadamente 1000X de las concentraciones en un medio basal.
Un medio de cultivo de células de mamífero es una mezcla de componentes que mantienen y/o soportan el crecimiento in vitro de células de mamífero. Ejemplos de células de mamífero son células humanas o animales, preferiblemente células CHO, células COS, células I VERO, células BHK, células AK-1, células SP2/0, células L5.1, células de hibridoma o células humanas.
Los medios de cultivo celular químicamente definidos son medios de cultivo celular que no comprenden ninguna sustancia químicamente indefinida. Esto significa que se conoce la composición química de todos los productos químicos utilizados en los medios. Los medios químicamente definidos no comprenden levaduras, tejidos animales o
vegetales; no comprenden células alimentadoras, suero, extractos o digestiones u otros componentes que puedan aportar proteínas químicamente mal definidas al medio. Los componentes químicos químicamente indefinidos o mal definidos son aquellos cuya composición química y estructura se desconoce, están presentes en una composición variable o solo podrían definirse con un enorme esfuerzo experimental, comparable a la evaluación de la composición química y la estructura de una proteína como la albúmina o la caseína.
Un medio de cultivo celular en polvo o un medio en polvo seco es un medio de cultivo celular que resulta típicamente de un proceso de molienda o un proceso de liofilización. Eso significa que el medio de cultivo celular en polvo es un medio granulado y particulado, no un medio líquido. El término "polvo seco" puede usarse indistintamente con el término "polvo"; sin embargo, "polvo seco" como se usa en este documento simplemente se refiere al aspecto grueso del material granulado y no pretende significar que el material esté completamente libre de solvente complejado o aglomerado a menos que se indique lo contrario. Un medio de cultivo celular en polvo también puede ser un medio de cultivo celular granulado, por ejemplo, granulado en seco por compactación con rodillo.
Los medios de cultivo celular en polvo se producen preferiblemente mezclando todos los componentes y moliéndolos. La mezcla de los componentes es conocida por un experto en la técnica para la producción de medios de cultivo celular en polvo seco mediante molienda. Preferiblemente, todos los componentes se mezclan a fondo para que todas las partes de la mezcla tengan casi la misma composición. Cuanto mayor sea la uniformidad de la composición, mejor será la calidad del medio resultante con respecto al crecimiento celular homogéneo.
La molienda se puede realizar con cualquier tipo de molino adecuado para producir medios de cultivo celular en polvo. Los ejemplos típicos son molinos de bolas, molinos de púas, molinos fitz o molinos de chorro. Se prefiere un molino de púas, un molinos fitz o un molino de chorro, más preferiblemente es un molino de púas.
Una persona experta en la técnica sabe cómo hacer funcionar tales molinos.
Para el uso de los medios molidos en polvo, se añade un disolvente, preferiblemente agua (más particularmente agua destilada y/o desionizada o agua purificada o agua para inyección) o un tampón acuoso al medio y los componentes se mezclan hasta que el medio esté totalmente disuelto en el disolvente.
El disolvente también puede comprender solución salina, iones ácidos o básicos solubles que proporcionen un intervalo de pH adecuado (normalmente en el intervalo entre pH 1,0 y pH 10,0), estabilizadores, tensioactivos, conservantes y alcoholes u otros disolventes orgánicos polares.
También es posible añadir otras sustancias como sustancias tampón para el ajuste del pH, suero fetal de ternero, azúcares, etc., a la mezcla del medio de cultivo celular y el disolvente. A continuación, el medio de cultivo celular líquido resultante se pone en contacto con las células que se van a cultivar o mantener.
Las células a tratar con el método de acuerdo con la presente invención pueden ser células normales, células inmortalizadas, células enfermas, células transformadas, células mutantes, células somáticas, células germinales, células madre, células precursoras o células embrionarias, cualquiera de las cuales se pueden ser líneas celulares establecidas o transformadas u obtenidas de fuentes naturales. Preferiblemente, las células son células de mamífero, más preferidas células BHK, VERO, HEK o CHO, las más preferidas son células CHO-S, CHO dhfr-(DG44 y Duxb11), CHO-M y CHOK1.
Los medios de cultivo celular, especialmente los medios completos, típicamente comprenden al menos uno o más componentes sacáridos, uno o más aminoácidos, una o más vitaminas o precursores de vitaminas, una o más sales, uno o más componentes tampón, uno o más cofactores y uno o más componentes de ácido nucleico.
Los medios también pueden comprender piruvato de sodio, insulina, proteínas vegetales, ácidos grasos y/o derivados de ácidos grasos y/o ácido plurónico y/o componentes tensioactivos tales como tensioactivos no iónicos preparados químicamente. Un ejemplo de un tensioactivo no iónico adecuado son los tensioactivos de copolímeros de bloques bifuncionales que terminan en grupos hidroxilo primarios también denominados poloxámeros, por ejemplo, disponible con el nombre comercial Pluronic® de BASF, Alemania.
Los componentes sacáridos son todos monosacáridos o disacáridos, tales como glucosa, galactosa, ribosa o fructosa (ejemplos de monosacáridos) o sacarosa, lactosa o maltosa (ejemplos de disacáridos).
Ejemplos de aminoácidos de acuerdo con la invención son tirosina, los aminoácidos proteinogénicos, especialmente los aminoácidos esenciales, leucina, isoleucina, lisina, metionina, fenilalanina, treonina, triptófano y valina, así como los aminoácidos no proteinogénicos como los D-aminoácidos.
Tirosina significa L-tirosina o D-tirosina, preferiblemente L-tirosina.
Cisteína significa L-cisteína o D-cisteína, preferiblemente L-cisteína.
Ejemplos de vitaminas son vitamina A (retinol, retinal, varios retinoides y cuatro carotenoides), vitamina B1 (tiamina),
vitamina B2 (riboflavina), vitamina B3 (niacina, niacinamida), vitamina B5 (ácido pantoténico), vitamina B6 (piridoxina, piridoxamina, piridoxal), vitamina B7 (biotina), vitamina B9 (ácido fólico, ácido folínico), vitamina B12 (cianocobalamina, hidroxicobalamina, metilcobalamina), vitamina C (ácido ascórbico), vitamina D (ergocalciferol, colecalciferol), vitamina E (tocoferoles, tocotrienoles) y vitamina K (filoquinona, menaquinonas). También se incluyen precursores de vitaminas.
Ejemplos de sales son componentes que comprenden iones inorgánicos tales como bicarbonato, calcio, cloruro, magnesio, fosfato, potasio y sodio u oligoelementos tales como Co, Cu, F, Fe, Mn, Mo, Ni, Se, Si, Ni, Bi, V y Zn. Algunos ejemplos son el sulfato de cobre (II) pentahidratado (CuSO4 ■ 5H2O), el cloruro de sodio (NaCl), el cloruro de calcio (CaCl2 ■ 2 H2O), el cloruro de potasio (KCl), el sulfato de hierro (II), el fosfato de sodio monobásico anhidro (NaH2PO4), el sulfato de magnesio anhidro (MgSO4), fosfato de sodio dibásico anhidro (Na2HPO4), cloruro de magnesio hexahidratado (MgCh ■ 6H2O), sulfato de zinc heptahidratado.
Los ejemplos de tampones son CO2/HCO3 (carbonato), fosfato, HEPES, PIPES, ACES, BES, TES, MOPS y TRIS.
Los ejemplos de cofactores son derivados de tiamina, biotina, vitamina C, NAD/NADP, cobalamina, mononucleótido de flavina y derivados, glutatión, fosfatos de nucleótido hemo y derivados.
Los componentes de ácido nucleico, de acuerdo con la presente invención, son las nucleobases, tales como citosina, guanina, adenina, timina o uracilo, los nucleósidos como citidina, uridina, adenosina, guanosina y timidina, y los nucleótidos como monofosfato de adenosina o difosfato de adenosina o trifosfato de adenosina.
Los medios de alimentación pueden tener una composición diferente en comparación con los medios completos. Por lo general, comprenden aminoácidos, oligoelementos y vitaminas. También pueden comprender componentes sacáridos, pero a veces, por razones de producción, los componentes sacáridos se añaden en una alimentación separada.
Un medio de alimentación adecuado podría comprender, por ejemplo, uno o más de los siguientes compuestos:
MONOHIDRATO DE L-ASPARAGINA
L-ISOLEUCINA
L-FENILALANINA
MONOHIDRATO DE L-GLUTAMATO SÓDICO
L-LEUCINA
L-TREONINA
MONOCLORHIDRATO DE L-LISINA
L-PROLINA
L-SERINA
MONOCLORHIDRATO DE L-ARGININA
MONOHIDRATO DE MONOCLORHIDRATO DE L-HISTIDINA
L-METIONINA
L-VALINA
MONOHIDRATO DE L-ASPARTATO MONOSÓDICO
L-TRIPTÓFANO
CLORURO DE COLINA MYO-INOSITOL
NICOTINAMIDA
D(+)-PANTOTENATO DE CALCIO
CLORHIDRATO DE PIRIDOXINA CLORHIDRATO DE CLORURO DE TIAMINA VITAMINA B12 (CIANOCOBALAMINA) MICRONIZADA
BIOTINA ÁCIDO FÓLICO RIBOFLAVINA SULFATO DE MAGNESIO ANHIDRO SULFATO DE COBRE (II) PENTAHIDRATADO
SULFATO DE ZINC HEPTAHIDRATADO DICLOROHIDRATO DE 1,4-DIAMINOBUTANO
HEPTAMOLIBDATO DE AMONIO TETRAHIDRATADO SULFATO DE CADMIO HIDRATADO CLORURO DE MANGANESO (II) TETRAHIDRATADO
CLORURO DE NÍQUEL (II) HEXAHIDRATADO
META SILICATO DE SODIO METAVANADATO DE SODIO CLORURO DE ESTAÑO (II) DIHIDRATADO
SELENITO DE SODIO (APROXIMADAMENTE 45% DE SE)
DIHIDRÓGENO FOSFATO DE SODIO MONOHIDRATADO
CITRATO DE AMONIO Y HIERRO (III) (APROXIMADAMENTE 18% DE FE)
La esencia de la presente invención es aumentar la reserva total de glutatión en las células. Se ha descubierto que al aumentar la cantidad de glutatión en las células mediante la adición de S-sulfocisteína y/o sus sales, normalmente se logran uno o más de los siguientes efectos positivos:
- Mayor duración del cultivo
- Título más alto (concentración del IgG producido)
- Mayor productividad específica
- Menor potencial oxidativo intracelular
Estos efectos son muy beneficiosos para el cultivo celular, ya que un título alto, una alta productividad y también una mayor duración del cultivo aumentan la eficacia del cultivo celular.
Las células que se van a tratar con S-sulfocisteína y/o sus sales de acuerdo con la invención son típicamente células que se cultivan en un biorreactor con fines de producción biofarmacéutica. Ejemplos de procesos de cultivo celular adecuados son procesos de alimentación por lotes o procesos de cultivo de células por perfusión.
Se puede añadir S-sulfocisteína y/o sus sales a las células en cualquier etapa del cultivo celular.
Se puede añadir al iniciar el cultivo celular. En este caso, la S-sulfocisteína y/o sus sales se mezclan y muelen preferiblemente con los demás ingredientes del medio base que se utiliza para iniciar el cultivo celular. Esta mezcla de polvo seco que comprende S-sulfocisteína y/o sus sales se disuelve luego en un disolvente adecuado mezclando el polvo y el disolvente de manera que el polvo se disuelva y produzca un medio de cultivo celular líquido con una concentración deseada y homogénea de los componentes del medio.
También se puede añadir S-sulfocisteína y/o sus sales una o más veces durante el cultivo de las células. Por lo general, se realiza un cultivo celular durante 1 a 3 semanas. Durante este tiempo, el medio de alimentación se añade de forma continua o una o más veces. La S-sulfocisteína y/o sus sales se pueden añadir en un medio de alimentación junto con otros ingredientes del medio de alimentación o se puede añadir en una alimentación separada que solo comprende S-sulfocisteína y/o sus sales. Además, la alimentación es típicamente un líquido de modo que todos los componentes de la alimentación se disuelven en un disolvente adecuado antes de la adición al cultivo celular.
En una realización preferida, se añaden S-sulfocisteína y/o sus sales como alimentación. Se añade preferiblemente al menos 4 veces durante el cultivo celular, preferiblemente entre 4 y 6 veces.
En una realización, se agrega S-sulfocisteína y/o sus sales entre cada segundo y cada cuarto día.
El pH de la alimentación que comprende S-sulfocisteína y/o sus sales está preferiblemente entre 6,8 y 7,5, lo más preferido entre 6,8 y 7,1.
Se ha descubierto que el nivel de glutatión puede aumentarse de forma más eficaz si la S-sulfocisteína y/o sus sales están presentes en el cultivo celular en concentraciones entre 0,4 y 50 mM, preferiblemente entre 1 y 10 mM. Normalmente, el volumen de alimentación que se añade al cultivo celular durante todo el proceso de cultivo es aproximadamente el 30% del volumen del medio de cultivo celular que ya está presente en el biorreactor. La concentración de S-sulfocisteína y/o sus sales en la alimentación está preferiblemente entre 1 y 100 mmol/L, preferiblemente entre 5 y 20 mmol/L.
Normalmente, un cultivo celular se realiza mediante
a) la provisión de un biorreactor
b) la mezcla de las células a cultivar con un medio de cultivo celular líquido en el biorreactor
c) la incubación de la mezcla de la etapa b) durante un tiempo determinado.
Un biorreactor es cualquier contenedor, bolsa, recipiente o tanque en el que se pueden cultivar células. El experto en la técnica conoce la realización de un cultivo celular. Esto se hace típicamente incubando las células en el biorreactor en condiciones adecuadas tal como pH, osmolalidad, temperatura, agitación, aireación (oxígeno/CO2), etc. y la adición opcional de medio de alimentación una o varias veces durante el cultivo celular. Preferiblemente, el cultivo celular se realiza como cultivo celular de alimentación por lotes.
El cultivo alimentado por lotes es un proceso de cultivo celular en el que uno o más nutrientes (sustratos) se alimentan (suministran) al biorreactor durante el cultivo de las células y en el que el producto o productos permanecen en el biorreactor hasta el final del proceso. Una descripción alternativa del método es la de un cultivo en el que un medio base soporta el cultivo celular inicial y se agrega un medio de alimentación para evitar el agotamiento de nutrientes. La ventaja del cultivo alimentado por lotes es que se puede controlar la concentración del sustrato alimentado en el
líquido de cultivo a niveles arbitrariamente deseados.
En términos generales, el cultivo alimentado por lotes es superior al cultivo convencional por lotes cuando el control de las concentraciones de un nutriente (o nutrientes) afecta el rendimiento o la productividad del metabolito deseado, como en este caso S-sulfocisteína y/o sus sales.
En consecuencia, preferiblemente, la presente invención se realiza mediante
- la carga en un biorreactor de células y medio de cultivo celular líquido
- la incubación de las células en el biorreactor
- la adición de un medio de cultivo celular continuamente durante todo el tiempo de incubación de las células en el biorreactor o una o varias veces dentro de dicho tiempo de incubación, que en este caso es un medio de alimentación, al biorreactor
por lo que el medio de alimentación preferiblemente tiene un pH entre 6,8 y 7,5 y comprende S-sulfocisteína y/o sus sales.
En otra realización, el cultivo celular se realiza como cultivo de perfusión. El cultivo de perfusión es un cultivo mediante el cual las células se restringen en el cultivo, por ejemplo, mediante filtración, encapsulación, anclaje a microportadores, etc., y el medio de cultivo se introduce y retira del biorreactor de forma continua o intermitente. En este caso, la S-sulfocisteína y/o sus sales se introducen preferiblemente como parte del medio de cultivo.
En el cultivo de perfusión, en el curso del cultivo celular, las células (biomasa) se separan del cultivo celular (suspensión celular) y, por un lado, el medio consumido se retira del proceso y, por otro lado, los nuevos nutrientes se ponen a disposición de las células a través de medio fresco. Si las células se retienen en el sistema de cultivo durante el proceso, esto se denomina "perfusión". Si las células se eliminan del sistema con el medio consumido durante el proceso, esto se denomina "método continuo". En los procesos de perfusión, las células también se pueden eliminar del sistema de cultivo a intervalos de tiempo definidos, para poder mantener una concentración celular máxima. Para un experto en la técnica, esta operación se conoce como "sangrado". La separación celular se lleva a cabo con diversas tecnologías, y algunas tecnologías promueven la separación celular indirectamente. Algunos ejemplos de posibles métodos de separación celular son la filtración, la encapsulación celular, la adherencia celular a los microportadores, la sedimentación celular o la centrifugación.
Se ha descubierto que con el método de la presente invención, el nivel de glutatión intracelular puede aumentarse de forma eficaz. Normalmente, el nivel puede duplicarse con creces al menos parte del tiempo del cultivo celular. Preferiblemente, el nivel de glutatión aumenta en al menos un 10%, preferiblemente más del 25% durante más de la mitad del tiempo del cultivo celular en comparación con un cultivo celular en condiciones equivalentes pero sin la adición de S-sulfocisteína y/o su sales.
La presente invención se ilustra adicionalmente mediante las siguientes figuras y ejemplos, sin embargo, sin limitarse a ellos.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos representan aplicaciones prácticas de la invención.
Experimento con biorreactor alimentado por lotes en medio Cellvento® CHO 220 y Feed-220 utilizando una línea celular CHO en suspensión en biorreactores de vidrio de 1,2 L.
Se integró S-sulfo-L-cisteína (SS) 15 mM en Feed-220 principal a pH neutro (n = 5). Feed se agregó al 3% (v/v) el día 3 y al 6% (v/v) los días 5, 7, 9 y 14. En la condición de control, la alimentación sin SS se agregó en las mismas proporciones mientras que L-cisteína 150 mM se añadió por separado en una alimentación alcalina y se añadió en las siguientes proporciones: 0,3% (v/v) el día 3 y 6 (v/v) los días 5, 7, 9, 14 (n = 2). El pH se controló en 6,95 /- 0,15. La concentración de oxígeno disuelto se controló al 50% de saturación de aire rociando con oxígeno puro y aire a través de un rociador de tubería abierta. La temperatura se fijó en 37 °C y se cambió de 37 °C a 33 °C el día 5 de cultivo. La agitación se mantuvo a 140 rpm. La concentración de IgG en el sobrenadante se midió usando Cedex BioHT con un método turbidimétrico. Los resultados se presentan en la Figura 1. Se puede observar que el título (concentración de IgG) es mayor con SS en comparación con el estándar.
Especies reactivas intracelulares en células CHO en un proceso de alimentación por lotes utilizando S-sulfocisteína frente al control
Las especies reactivas intracelulares se cuantificaron usando tinción con diacetato de 6-carboxi-2',7'-diclorodihidrofluoresceína (Carboxy H2DCFDA, Life Technologies). El aumento de fluorescencia debido a reacciones oxidativas se determinó usando un lector de fluorescencia Perkin Elmer. Para estos experimentos, las mediciones se
realizaron durante experimentos de alimentación por lotes comparando la condición de control y la condición de SSC 15 mM. Se tomaron muestras todos los días y se analizaron de inmediato. Brevemente, se centrifugaron 3 x 105 células (1200 rpm, 5 min) y se resuspendieron en PBS (control negativo) o se cargaron con Carboxi-H2DCFDA 50 |jM y se incubaron durante 2o min a 37 °C y 1000 rpm. A continuación, las células se centrifugaron, se resuspendieron en PBS y se analizaron usando el lector de placas (n = 3 para ambas condiciones). La menor intensidad de fluorescencia cuando se usa S-sulfocisteína en la alimentación indica una menor reactividad en las células y, por lo tanto, un potencial antioxidante de la molécula. Los resultados se muestran en la Figura 2.
Glutatión total intracelular en células CHO durante un proceso alimentado por lotes usando S-sulfocisteína frente al control
Para cuantificar el glutatión total intracelular, las células se lavaron tres veces en PBS frío y se congelaron a -20 °C para un análisis adicional. Para inhibir la actividad de las posibles enzimas convertidoras de Cys, se lisaron 12 x 106 células en 100 j L de reactivo PhosphoSafe (Merck Millipore) que contenía cuatro inhibidores de la fosfatasa: fluoruro de sodio, vanadato de sodio, p-glicerofosfato y pirofosfato de sodio y se complemento con yodoacetamida 20 mM (alquilación de todas las enzimas que contienen una cisteína en el sitio activo). Las concentraciones de glutatión (GSH y GSSG) se determinaron mediante UPLC utilizando una derivatización precolumna que se basa en el kit de reactivos AccQ Tag Ultra®. La derivatización, cromatografía y análisis de datos se llevaron a cabo siguiendo las recomendaciones del proveedor (Waters, Milford, MA). El glutatión total se obtuvo mediante la adición de GSH y GSSG y se normalizó a la concentración obtenida en la condición de control cada día del proceso FB. Los resultados se muestran en la Figura 3.
Claims (10)
1. Un método para aumentar el nivel de glutatión (GSH) en células de mamíferos que comprende añadir a dichas células S-sulfocisteína y/o una sal de S-sulfocisteína en una cantidad eficaz para aumentar el nivel de glutatión intracelular por lo que el nivel de glutatión aumenta en al menos un 10% durante más de la mitad del tiempo del cultivo celular en comparación con un cultivo celular en condiciones equivalentes pero sin la adición de S-sulfocisteína y/o sus sales.
2. Método de acuerdo con la reivindicación 1 caracterizado porque el método se realiza cultivando dichas células en un medio de cultivo celular líquido y añadiendo al medio de cultivo celular en uno o más momentos en el transcurso del cultivo S-sulfocisteína y/o una sal de S-sulfocisteína en una cantidad eficaz para aumentar el nivel de glutatión intracelular de las células en cultivo.
3. Método de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, caracterizado porque se añade sal sódica del ácido (S)-2-amino-3-sulfosulfanilpropanoico.
4. Método de acuerdo con una o más de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el medio de cultivo celular tiene un pH comprendido entre 6,8 y 7,5.
5. Método de acuerdo con una o más de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque se añaden S-sulfocisteína y/o una sal de S-sulfocisteína en una cantidad tal que su concentración en el cultivo celular esté entre 0,4 y 50 mM.
6. Método de acuerdo con una o más de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque las células se cultivan en un medio de cultivo celular que comprende al menos uno o más componentes sacáridos, uno o más aminoácidos, una o más vitaminas o precursores de vitaminas, una o más sales, uno o más componentes tampón, uno o más cofactores y uno o más componentes de ácido nucleico.
7. Método de acuerdo con una o más de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el método se realiza mediante a) la provisión de un biorreactor
b) la mezcla de las células a cultivar con un medio de cultivo celular que comprende S-sulfocisteína y/o una sal de S-sulfocisteína
c) la incubación de la mezcla de la etapa b).
8. Método de acuerdo con una o más de las reivindicaciones 1 a 6 caracterizado porque el método se realiza mediante - la carga en un biorreactor de células y medio de cultivo celular líquido
- la incubación de las células en el biorreactor
- la adición de un medio de alimentación continuamente durante todo el tiempo de incubación de las células en el biorreactor o una o varias veces dentro de dicho tiempo de incubación,
en el que el medio de alimentación comprende S-sulfocisteína y/o una sal de S-sulfocisteína.
9. Método de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizado porque el medio de alimentación comprende S-sulfocisteína y/o una sal de S-sulfocisteína en una concentración entre 1 y 100 mmol/L.
10. Método de acuerdo con una o más de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque el nivel de glutatión es más del 25% más alto durante más de la mitad del tiempo del cultivo celular comparado con un cultivo celular sin la adición de S-sulfocisteína y/o sus sales.
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