ES2827701T3 - Medios de cultivo celular - Google Patents
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Abstract
Medio de cultivo celular que comprende ácido (S)-2-amino-3-sulfosulfanil-propiónico o sales del mismo.
Description
DESCRIPCIÓN
Medios de cultivo celular
La presente invención se refiere a medios de cultivo celular que comprenden derivados de éster inorgánico de tirosina y/o cisteína. La escasa solubilidad de la tirosina y la estabilidad a menudo insuficiente de la cisteína en los medios de cultivo celular se superan sustituyéndolos por un derivado de éster inorgánico, por ejemplo con un derivado fosforilado. Los medios de cultivo celular soportan y mantienen el crecimiento de las células en un entorno artificial.
Dependiendo del tipo de organismo cuyo crecimiento va a soportarse, los medios de cultivo celular comprenden una mezcla compleja de componentes, en ocasiones más de cien componentes diferentes.
Los medios de cultivo celular requeridos para la propagación de células de mamífero, insecto o planta normalmente son mucho más complejos que los medios para soportar el crecimiento de bacterias y levaduras.
Los primeros medios de cultivo celular que se desarrollaron consistían en componentes indefinidos, tales como plasma, suero, extractos embrionarios u otros extractos biológicos no definidos o peptonas. Por tanto, se realizó un avance importante con el desarrollo de los medios químicamente definidos. Los medios químicamente definidos a menudo comprenden, pero no se limitan exclusivamente a, aminoácidos, vitaminas, sales de metales, antioxidantes, quelantes, factores de crecimiento, tampones, hormonas, y muchas más sustancias conocidas por los expertos en la técnica. Algunos medios de cultivo celular se ofrecen como líquidos acuosos estériles. La desventaja de los medios de cultivo celular líquidos es su semivida reducida y sus dificultades para transporte y almacenamiento. Como consecuencia, muchos medios de cultivo celular se ofrecen actualmente como mezclas en polvo seco finamente molido. Se fabrican con el fin de disolverse en agua y/o disoluciones acuosas y en el estado disuelto están diseñados, a menudo con otros complementos, para suministrar a las células una base nutritiva sustancial para el crecimiento y/o la producción de productos biofarmacéuticos a partir de dichas células.
La mayoría de las plataformas de producción biofarmacéutica se basan en protocolos de cultivo celular semicontinuos. El objetivo normalmente es desarrollar procedimientos de cultivo celular de alto título para satisfacer las demandas crecientes del mercado y reducir los costes de fabricación. Además del uso de líneas celulares recombinantes de alto rendimiento, se requieren mejoras en los medios de cultivo celular y los parámetros del procedimiento para alcanzar los máximos potenciales de producción
En un procedimiento semicontinuo, un medio basal soporta el crecimiento y la producción iniciales, y un medio de alimentación impide el agotamiento de nutrientes y mantiene la fase de producción. Los medios se eligen para adaptarse a las distintas necesidades metabólicas durante las diferentes fases de producción. Los ajustes de los parámetros del procedimiento, incluyendo la estrategia de alimentación y los parámetros de control, definen los entornos químicos y físicos adecuados para el crecimiento celular y la producción de proteínas.
La optimización del medio de alimentación es un aspecto importante en la optimización de un procedimiento semicontinuo.
Principalmente, el medio de alimentación está altamente concentrado para evitar la dilución del biorreactor. La adición controlada del nutriente afecta directamente a la tasa de crecimiento del cultivo.
Un factor limitante para la preparación de medios de cultivo celular a partir de polvo seco es la escasa solubilidad o estabilidad de algunos componentes, especialmente la escasa solubilidad o estabilidad de los aminoácidos L-tirosina y L-cisteína. Para la L-tirosina, la escasa solubilidad es el problema principal, mientras que para la L-cisteína, predominan los problemas de estabilidad.
Por consiguiente, sería favorable encontrar un modo de mejorar la solubilidad y/o la estabilidad de la L-tirosina y la L-cisteína.
TAKESHI NAKATANI ETAL : MICROBIAL CELL FACTORIES, Vol. 11, n.° 1, 18 de mayo de 2012 (18-05-2012), página 62 da a conocer que la S-sulfocisteína (SSC) aumenta la producción de L-cisteína en E. coli. También se da a conocer que la SSC no es tóxica para las células. FASTH A ET AL: BIOCHEMICAL PHARMACOLOGY, Vol. 22, n.° 11, 1 de junio de 1973 (01-06-1973), páginas 1337-1351 describen que el S-sulfonato de cisteína tiene un efecto protector cuando se administra a ratones frente a la mostaza nitrogenada.
Se ha encontrado que los derivados de éster inorgánico de L-tirosina y L-cisteína tienen una solubilidad y/o estabilidad mejoradas y pueden usarse en medios de cultivo celular en lugar de L-tirosina y L-cisteína respectivamente sin ningún efecto negativo y en ocasiones incluso un efecto positivo sobre el crecimiento celular.
Además se ha encontrado que tales derivados de éster inorgánico son especialmente adecuados para preparar disoluciones de alimentación que tienen un pH de no más de pH 8,5 y que tienen altas concentraciones de tirosina y cisteína que están en una forma adecuada como nutriente para las células.
La presente invención se refiere por tanto a medios de cultivo celular que comprenden ácido (S)-2-amino-3-sulfosulfanilpropanoico o sales del mismo.
En una realización preferida, el derivado sulfonado de cisteína es la sal sódica del ácido (S)-2-amino-3-sulfosulfanilpropanoico.
En una realización preferida, el medio de cultivo celular es un medio en polvo seco.
En otra realización preferida, el medio de cultivo celular es un medio de alimentación.
En otra realización preferida, el medio de cultivo celular es un medio líquido que tiene un pH de 8,5 o menos y que comprende ácido (S)-2-amino-3-sulfosulfanil-propanoico o sales del mismo en una concentración de entre 5 y 40 mmol/l, preferiblemente entre 10 y 30 mmol/l.
En una realización preferida, el pH del medio líquido es de entre 6,5 y 8,5, lo más preferido entre 6,8 y 7,8.
En una realización, el medio de cultivo celular comprende al menos uno o más componentes de sacárido, uno o más aminoácidos, una o más vitaminas o precursores de vitaminas, una o más sales, uno o más componentes tampón, uno o más cofactores y uno o más componentes de ácido nucleico.
La presente invención se refiere además a un procedimiento para cultivar células
a) proporcionando un biorreactor
b) mezclando las células que van a cultivarse con un medio de cultivo celular según la presente invención c) incubando la mezcla de la etapa b).
La presente invención también se refiere a un procedimiento semicontinuo para cultivar células en un biorreactor - llenando un biorreactor con células y un medio de cultivo celular acuoso
- incubando las células en el biorreactor
- de manera continua a lo largo de todo el tiempo de la incubación de las células en el biorreactor o una vez o varias veces dentro de dicho tiempo de incubación, añadiendo un medio de cultivo celular, que en este caso es un medio de alimentación, al biorreactor
mediante lo cual el medio de alimentación tiene un pH de menos de pH 8,5 y comprende ácido (S)-2-amino-3-sulfosulfanil-propanoico o sales del mismo.
Preferiblemente, el medio de alimentación comprende ácido (S)-2-amino-3-sulfosulfanil-propanoico o sales del mismo en una concentración de entre 10 y 50 mmol/l, preferiblemente entre 15 y 30 mmol/l.
La figura 1 muestra el esquema de reacción para producir ácido (S)-2-amino-3-(4-fosfonooxi-fenil)-propiónico. Pueden encontrarse detalles adicionales en el ejemplo 1.
La figura 2 muestra el esquema de reacción para producir ácido (S)-2-amino-3-(4-sulfonooxi-fenil)-propiónico. Pueden encontrarse detalles adicionales en el ejemplo 2.
Las figuras 3 y 4 muestran experimentos de crecimiento celular de modo discontinuo usando un medio de cultivo celular según la presente invención. Pueden encontrarse detalles adicionales en los ejemplos 5 y 6.
Las figuras 5 y 6 muestran los resultados de un experimento de cultivo celular semicontinuo en el que se usa el modo semicontinuo optimizado según la invención con sales del ácido (S)-2-amino-3-(4-sulfonooxi-fenil)-propiónico. Pueden encontrarse detalles en el ejemplo 7.
Las figuras 7 y 8 muestran los resultados de un experimento de cultivo celular semicontinuo en el que se usa el modo semicontinuo optimizado según la invención con sales del ácido (S)-2-amino-3-(4-sulfonooxi-fenil)-propiónico y la sal sódica del ácido (S)-2-amino-3-sulfosulfanil-propiónico. Pueden encontrarse detalles en el ejemplo 8.
Un derivado de éster inorgánico según la presente invención es un producto, por ejemplo, que puede obtenerse de la condensación de un oxoácido inorgánico y tirosina o cisteína. Ejemplos de oxoácidos inorgánicos son por ejemplo ácido fosfórico, ácido sulfúrico, ácido nítrico y ácido bórico. Se prefieren los derivados de éster inorgánico derivados de ácido sulfúrico o ácido fosfórico. Por tanto, los derivados de éster inorgánico son los ésteres de los oxoácidos inorgánicos y cisteína o tirosina y sus sales. Ejemplos de derivados de éster inorgánico de tirosina adecuados son ácido (S)-2-amino-3-(4-fosfonooxi-fenil)-propiónico así como la sal monosódica, la sal disódica, la sal monopotásica, la sal dipotásica, la sal de calcio y la sal de magnesio del ácido (S)-2-amino-3-(4-fosfonooxi-fenil)-propiónico.
Los derivados de éster inorgánico preferidos también pueden mostrarse mediante las siguientes formulas I y II:
siendo R
o 
y siendo X e Y independientemente entre sí H, Li, Na, K, % Ca, % Mg, preferiblemente H, Na, K. El término ácido propanoico también puede usarse en lugar del término ácido propiónico.
Un medio de cultivo celular según la presente invención es cualquier mezcla de componentes que mantiene y/o soporta el crecimiento de células in vitro. Podría ser un medio complejo o un medio químicamente definido. El medio de cultivo celular puede comprender todos los componentes necesarios para mantener y/o soportar el crecimiento de células in vitro o solo algunos componentes, de modo que los componentes adicionales se añaden por separado. Ejemplos de medios de cultivo celular según la presente invención son medios completos que comprenden todos los componentes necesarios para mantener y/o soportar el crecimiento de células in vitro así como complementos o alimentos de medios. En una realización preferida, el medio de cultivo celular es un medio completo o un medio de alimentación. Un medio completo, también denominado medio basal, normalmente tiene un pH de entre 6,8 y 7,8. Un medio de alimentación tiene preferiblemente un pH por debajo de 8,5.
Normalmente, los medios de cultivo celular según la invención se usan para mantener y/o soportar el crecimiento de células en un biorreactor.
Un alimento o medio de alimentación es un medio de cultivo celular que no es el medio basal que soporta el crecimiento y la producción iniciales en un cultivo celular, sino el medio que se añade en una fase posterior para impedir el agotamiento de nutrientes y que mantiene la fase de producción. Un medio de alimentación puede tener concentraciones superiores de algunos componentes en comparación con un medio de cultivo basal. Por ejemplo, algunos componentes, tales como, por ejemplo, nutrientes incluyendo aminoácidos o hidratos de carbono, pueden estar presentes en el medio de alimentación a aproximadamente 5X, 6X, 7X, 8X, 9X, 10X, 12X, 14X, 16X, 20X, 30X, 50X, 100X, 200X, 400X, 600X, 800X, o incluso aproximadamente 1000X de las concentraciones en un medio basal.
Un medio de cultivo celular de mamífero es una mezcla de componentes que mantienen y/o soportan el crecimiento in vitro de células de mamífero. Ejemplos de células de mamífero son células humanas o de animales, preferiblemente células CHO, células COS, células I VERO, células BHK, células AK-1, células SP2/0, células L5.1, células de hibridoma o células humanas.
Los medios de cultivo celular químicamente definidos son medios de cultivo celular que no comprenden ninguna sustancia indefinida químicamente. Esto significa que se conoce la composición química de todos los compuestos químicos usados en los medios. Los medios químicamente definidos no comprenden ningún tejido de levadura, animal o planta; no comprenden células alimentadoras, suero, extractos o digestos u otros componentes que pueden contribuir con proteínas químicamente poco definidas al medio. Los componentes químicamente indefinidos o componentes
químicos mal definidos son aquellos cuya estructura y composición química no se conocen, que están presentes en una composición variable o que solo podrían definirse con un enorme esfuerzo experimental (comparable con la evaluación de la estructura y composición química de una proteína como albúmina o caseína).
Un medio de cultivo celular en polvo o un medio en polvo seco es un medio de cultivo celular que normalmente resulta de un proceso de molienda o un proceso de liofilización. Esto significa que el medio de cultivo celular en polvo es un medio granular, particulado, no un medio líquido. El término “polvo seco” puede usarse indistintamente con el término “polvo”; sin embargo, “polvo seco” tal como se usa en el presente documento, se refiere simplemente al aspecto macroscópico del material granulado y no se pretende que signifique que el material esté completamente libre de disolvente complejado o aglomerado, a menos que se indique otra cosa.
Las células que van a cultivarse con los medios según la presente invención pueden ser células procariotas como células bacterianas o células eucariotas como células vegetales o animales. Las células pueden ser células normales, células inmortalizadas, células enfermas, células transformadas, células mutantes, células somáticas, células germinales, células madre, células precursoras o células embrionarias, pudiendo ser cualquiera de las cuales líneas celulares establecidas o transformadas u obtenidas de fuentes naturales.
El tamaño de una partícula significa el diámetro medio de la partícula. El diámetro de partícula se determina mediante dispersión de luz láser en aceite de silicona.
Se genera una atmósfera inerte mediante el llenado del recipiente o aparato respectivo con un gas inerte. Los gases inertes adecuados son gases nobles como argón o preferiblemente nitrógeno. Estos gases inertes no son reactivos e impiden que se produzcan reacciones químicas indeseables. En el procedimiento según la presente invención, generar una atmósfera inerte significa que la concentración de oxígeno se reduce por debajo del 10% (v/v) absoluto, por ejemplo mediante la introducción de nitrógeno líquido o gas nitrógeno.
Un experto en la técnica conoce diferentes tipos de molinos.
Un molino de púas, también denominado molino de impacto centrífugo, pulveriza sólidos mediante lo cual las púas que sobresalen en discos rotatorios a alta velocidad proporcionan la energía de rotura. Los molinos de púas se venden por ejemplo en Munson Machinery (EE. UU.), Premium Pulman (India) o Sturtevant (EE. UU.).
Un molino de chorro usa gas comprimido para acelerar las partículas, haciendo que impacten unas contra otras en la cámara de proceso. Los molinos de chorro los venden por ejemplo Sturtevant (EE. UU.) o PMT (Austria).
Un molino tipo Fitzmill comercializado por Fitzpatrick (EE. UU.), usa un rotor con cuchillas para la molienda.
Un procedimiento que se ejecuta de manera continua es un procedimiento que no se ejecuta de manera discontinua. Si un procedimiento de molienda se ejecuta de manera continua significa que los componentes de los medios se alimentan de manera permanente y constante en el molino a lo largo de un tiempo determinado.
Los medios de cultivo celular, especialmente los medios completos, según la presente invención normalmente comprenden al menos uno o más componentes de sacárido, uno o más aminoácidos, una o más vitaminas o precursores de vitaminas, una o más sales, uno o más componentes tampón, uno o más cofactores y uno o más componentes de ácido nucleico.
Los medios también pueden comprender piruvato de sodio, insulina, proteínas vegetales, ácidos grasos y/o derivados de ácidos grasos y/o ácido plurónico y/o componentes tensioactivos como surfactantes no iónicos preparados químicamente. Un ejemplo de un surfactante no iónico adecuado son surfactantes de copolímero de bloque difuncional que terminan en grupos hidroxilo primarios también denominados poloxámeros, por ejemplo disponibles con el nombre comercial Pluronic® de BASF, Alemania.
Los componentes de sacárido son todos mono o disacáridos, como glucosa, galactosa, ribosa o fructosa (ejemplos de monosacáridos) o sacarosa, lactosa o maltosa (ejemplos de disacáridos).
Ejemplos de aminoácidos según la invención son tirosina, los aminoácidos proteinogénicos, especialmente los aminoácidos esenciales, leucina, isoleucina, lisina, metionina, fenilalanina, treonina, triptófano y valina, así como los aminoácidos no proteinogénicos como D-aminoácidos.
Tirosina significa L- o D-tirosina, preferiblemente L-tirosina.
Cisteína significa L- o D-cisteína, preferiblemente L-cisteína.
Ejemplos de vitaminas son vitamina A (retinol, retinal, diversos retinoides y cuatro carotenoides), vitamina B1 (tiamina), vitamina B2 (riboflavina), vitamina B3 (niacina, niacinamida), vitamina B5 (ácido pantoténico), vitamina B6 (piridoxina, piridoxamina, piridoxal), vitamina B7 (biotina), vitamina B9 (ácido fólico, ácido folínico), vitamina B12 (cianocobalamina, hidroxicobalamina, metilcobalamina), vitamina C (ácido ascórbico), vitamina D (ergocalciferol, colecalciferol), vitamina E (tocoferoles, tocotrienoles) y vitamina K (filoquinona, menaquinonas). También se incluyen precursores de vitaminas.
Ejemplos de sales son componentes que comprenden iones inorgánicos tales como bicarbonato, calcio, cloruro, magnesio, fosfato, potasio y sodio u oligoelementos tales como Co, Cu, F, Fe, Mn, Mo, Ni, Se, Si, Ni, Bi, V y Zn. Ejemplos son sulfato de cobre (II) pentahidratado (CuSO45H2O), cloruro de sodio (NaCI), cloruro de calcio (CaCl2 -2H2O), cloruro de potasio (KCI), sulfato de hierro (II), fosfato de sodio monobásico anhidro (NaH2PO4), sulfato de magnesio anhidro (MgSO4), fosfato de sodio dibásico anhidro (Na2HPO4), cloruro de magnesio hexahidratado (MgCl2 -6H2O), sulfato de cinc heptahidratado.
Ejemplos de tampones son CO2/HCO3 (carbonato), fosfato, HEPES, PIPES, ACES, BES, TES, MOPS y TRIS.
Ejemplos de cofactores son derivados de tiamina, biotina, vitamina C, NAD/NADP, cobalamina, mononucleótidos y derivados de flavina, glutatión, grupo hemo, fosfatos de nucleótidos y derivados.
Los componentes de ácido nucleico, según la presente invención, son las bases nitrogenadas, como citosina, guanina, adenina, timina o uracilo, los nucleósidos como citidina, uridina, adenosina, guanosina y timidina, y los nucleótidos como adenosina monofosfato o adenosina difosfato o adenosina trifosfato.
Los medios de alimentación pueden tener una composición diferente en comparación con los medios completos. Normalmente comprenden aminoácidos, oligoelementos y vitaminas. También podrían comprender componentes de sacárido, pero en ocasiones, por motivos de producción, los componentes de sacárido se añaden en una alimentación independiente.
Un medio de alimentación adecuado podría comprender, por ejemplo, uno o más de los compuestos siguientes:
L-ASPARAGINA MONOHIDRATADA
L-ISOLEUCINA
L-FENILALANINA
L-GLUTAMATO DE SODIO MONOHIDRATADO
L-LEUCINA
L-TREONINA
MONOCLORHIDRATO DE L-LISINA
L-PROLINA
L-SERINA
MONOCLORHIDRATO DE L-ARGININA
MONOCLORHIDRATO DE L-HISTIDINA MONOHIDRATADO
L-METIONINA
L-VALINA
L-ASPARTATO DE MONOSODIO MONOHIDRATADO
L-TRIPTÓFANO
CLORURO DE COLINA MIOINOSITOL NICOTINAMIDA
D(+)-PANTOTENATO DE CALCIO
CLORHIDRATO DE PIRIDOXINA CLORHIDRATO DE CLORURO DE TIAMINA VITAMINA B12 (CIANOCOBALAMINA) MICRONIZADA
BIOTINA ÁCIDO FÓLICO
RIBOFLAVINA
SULFATO DE MAGNESIO ANHIDRO SULFATO DE COBRE (II) PENTAHIDRATADO
SULFATO DE CINC HEPTAHIDRATADO DICLORHIDRATO DE 1,4-DIAMINOBUTANO
HEPTAMOLIBDATO DE AMONIO TETRAHIDRATADO SULFATO DE CADMIO HIDRATADO CLORURO DE MANGANESO (II) TETRAHIDRATADO
CLORURO DE NÍQUEL (II) HEXAHIDRATADO
METASILICATO DE SODIO METAVANADATO DE SODIO CLORURO DE ESTAÑO (II) DIHIDRATADO
SELENITO DE SODIO (APROXIMADAMENTE EL 45% DE SE)
DIHIDROGENOFOSFATO DE SODIO MONOHIDRATADO CITRATO DE AMONIO Y HIERRO (III) (APROXIMADAMENTE EL 18% DE FE)
Congelar, según la presente invención, significa enfriar hasta una temperatura por debajo de 0°C.
La esencia de la presente invención es proporcionar medios de cultivo celular en polvo que puedan disolverse fácilmente en un disolvente adecuado simplemente mezclando el polvo y el disolvente de manera que el polvo se disuelva y produzca un medio de cultivo celular líquido tal como un medio completo, un complemento de medio, un subgrupo de medio o una alimentación con una concentración deseada y homogénea de los componentes de los medios.
La disolución sencilla de un medio de cultivo celular en polvo a menudo se complica por sustancias como la tirosina o la cisteína que tienen una escasa solubilidad y/o estabilidad en disolventes acuosos. La L-tirosina, por ejemplo, tiene una solubilidad de 0,4 g/l en agua a una temperatura de 25°C. Esto significa que aproximadamente 0,4 g de L-tirosina son solubles en 1 litro de agua. Pero la concentración requerida de tirosina en los medios de cultivo celular a menudo es mayor. La cisteína tiende a formar dímeros en condiciones aeróbicas. Esos dímeros se denominan cistina. Además, se sabe que la cisteína forma productos secundarios tóxicos con metales como el cobre o el hierro que a menudo están presentes en los medios de cultivo celular. La cisteína o la cistina presentes en los medios de cultivo celular pueden sustituirse por derivados de éster inorgánico según la presente invención que no forman dímeros ni productos secundarios tóxicos.
Se ha encontrado que los derivados fosforilados y/o sulfonados de tirosina y/o cisteína, por un lado normalmente tiene una mayor solubilidad en disoluciones acuosas y por otro lado pueden usarse como sustitutos para tirosina y/o cisteína/cistina y son igualmente adecuados como componente de medios de cultivo celular que los aminoácidos naturales tirosina y cisteína. Esto significa que, por ejemplo, los medios de cultivo celular en los que la L-tirosina se ha sustituido por uno o más derivados de éster inorgánico de L-tirosina, muestran un rendimiento comparable en cultivo celular que los medios que solo comprenden L-tirosina.
En la técnica se conocen algunos derivados de éster inorgánico de tirosina y cisteína. En péptidos y proteínas, la fosforilación de tirosina desempeña un papel significativo en una amplia variedad de procesos celulares y activa y desactiva muchas enzimas proteicas, alterando de ese modo su función y actividad.
La sal monosódica del ácido (S)-2-amino-3-(4-fosfonooxi-fenil)-propiónico tiene el número CAS 146900-49-4. R.H. Plimmer Biochemical Journal (1941), 35, páginas 461-469, da a conocer la síntesis del ácido (S)-2-amino-3-(4-fosfonooxi-fenil)-propiónico así como de su sal de calcio 1:1.
En el presente documento se dan a conocer la síntesis y las características de nuevos derivados adicionales del ácido (S)-2-amino-3-(4-fosfonooxi-fenil)-propiónico, como la sal disódica, la sal dipotásica, la sal monopotásica, la sal de calcio 2:1 y las sales de magnesio del ácido (S)-2-amino-3-(4-fosfonooxi-fenil)-propiónico.
Derivados fosforilados de tirosina son aquellos que se han fosforilado en el grupo OH fenólico, como el ácido (S)-2-amino-3-(4-fosfonooxi-fenil)-propiónico o sales del mismo. En una realización especialmente preferida, el derivado fosforilado de tirosina es una sal del ácido (S)-2-amino-3-(4-fosfonooxi-fenil)-propiónico.
Los derivados sulfonados de tirosina son aquellos que se han sulfonado en el grupo OH fenólico, como el ácido (S)-2-amino-3-(4-sulfonooxi-fenil)-propiónico o sales del mismo.
En una realización especialmente preferida, el derivado sulfonado de tirosina es una sal del ácido (S)-2-amino-3-(4-sulfonooxi-fenil)-propiónico.
Los derivados fosforilados de cisteína son aquellos que se han fosforilado en el grupo SH de la cisteína, como el ácido (S)-2-amino-3-fosfonosulfanil-propiónico o sales del mismo.
Los derivados sulfonados de cisteína adecuados según la presente invención son aquellos que se han sulfonado en el grupo SH de la cisteína, como el ácido (S)-2-amino-3-sulfosulfanil-propiónico o sales del mismo. La síntesis del ácido 2-amino-3-sulfosulfanil-propiónico, también denominado ácido (S)-2-amino-3-sulfosulfanil-propanoico, S-sulfo-cisteína o S-sulfato de cisteína, y sus sales se da a conocer por ejemplo en I. H. Segel y M. J. Johnson, Analytical Biochemistry 5, 330-337 y J. S. Church, D.J. Evans, Spectrochimica Acta Part A 69 (2008) 256-262. La sal sódica está además disponible comercialmente de Bachem, Suiza.
Las sales adecuadas son sales de metales alcalinos o metales alcalinotérreos, por ejemplo las sales de litio, las sales de sodio, las sales de potasio, las sales de calcio o las sales de magnesio, se prefieren las sales de sodio, potasio y el ácido libre, siendo las más preferidas las sales de sodio.
En el caso de derivados de éster inorgánico de tirosina, la sal disódica del ácido (S)-2-amino-3-(4-fosfonooxi-fenil)-propiónico muestra muy buena solubilidad.
Los derivados de éster inorgánico de tirosina y cisteína pueden producirse mediante cualquier método, por ejemplo enzimáticamente o mediante síntesis química. Preferiblemente, los derivados fosforilados de tirosina se producen haciendo reaccionar tirosina con ácido fosfórico en presencia de pentóxido de fósforo. El ácido (S)-2-amino-3-(4-fosfonooxi-fenil)-propiónico resultante puede hacerse reaccionar entonces con una base adecuada como hidróxido de sodio, etilato de sodio, hidróxido de potasio, etc. para dar la sal correspondiente. Un esquema de reacción de esta síntesis se muestra en la figura 1.
La solubilidad del ácido (S)-2-amino-3-(4-fosfonooxi-fenil)-propiónico es mayor que la de la tirosina (véase la tabla 1 en el ejemplo 3).
Para aumentar incluso más la solubilidad del derivado de tirosina o cisteína, puede formarse una sal haciendo reaccionar el derivado con una base adecuada tal como se describió anteriormente. La sal sódica del ácido (S)-2-amino-3-(4-fosfonooxi-fenil)-propiónico, por ejemplo, tiene una solubilidad mayor (véase la tabla 1 en el ejemplo 3).
Se ha encontrado que en el caso de usar derivados de éster inorgánico de tirosina en medios completos, resulta favorable añadir a la composición del medio una pequeña cantidad de tirosina. Esto podría deberse al hecho de que algunas células no muestran captación de los derivados de éster inorgánico de tirosina. Los derivados de éster inorgánico de tirosina necesitan convertirse extracelularmente en la tirosina libre mediante fosfatasas. Normalmente, la cantidad suficiente de fosfatasas está disponible después de 2 a 5 días desde el inicio del cultivo celular.
Cuando se usan derivados de éster inorgánico de tirosina en medios de alimentación recién añadidos, esto significa que en el cultivo celular donde ya han crecido las células durante más de 2-5 días en un medio que comprende tirosina, no hay necesidad de añadir tirosina al medio de alimentación recién añadido.
Por consiguiente, en una realización preferida, un medio completo comprende al menos un derivado de éster inorgánico de tirosina y adicionalmente del 5 al 40% (p/p) de tirosina.
Este efecto no se encuentra cuando se usan derivados de éster inorgánico de cisteína. Para el uso de derivados de éster inorgánico de cisteína, no es necesaria la adición de cisteína. Los derivados de éster inorgánico de cisteína pueden usarse en cualquier caso como un sustituto completo de cisteína o cistina.
Además, de manera inesperada, los derivados de éster inorgánico de cisteína mostraron un efecto positivo sobre el crecimiento y la productividad celulares. Normalmente, el crecimiento celular con medios y alimentación que comprende derivados de éster inorgánico de cisteína muestran un crecimiento prolongado. Cuando se usan derivados de éster inorgánico de cisteína, la viabilidad de las células a lo largo del tiempo es mayor en comparación con los cultivos celulares que usan cisteína.
La producción de la proteína recombinante se aumenta adicionalmente cuando se usan derivados de éster inorgánico de cisteína en comparación con el cultivo celular que usa cisteína.
Los efectos positivos de los derivados de éster inorgánico de cisteína pueden obtenerse mediante el uso de una cantidad equivalente a la cantidad de cisteína y/o cistina usada normalmente en los medios de cultivo celular. Los medios de cultivo celular en polvo de la presente invención se producen preferiblemente mezclando todos los componentes y moliéndolos. El mezclado de los componentes lo conoce un experto en la técnica de producción de medios de cultivo celular en polvo seco mediante molienda. Preferiblemente, todos los componentes se mezclan
minuciosamente de modo que todas las partes de la mezcla tienen casi la misma composición. Cuanto mayor es la uniformidad de la composición, mejor es la calidad del medio resultante con respecto al crecimiento celular homogéneo. La molienda puede realizarse con cualquier tipo de molino adecuado para producir medios de cultivo celular en polvo. Los ejemplos típicos son molinos de bolas, molinos de púas, molinos de tipo Fitzmill o molinos de chorro. Se prefiere un molino de púas, un molino de tipo Fitzmill o un molino de chorro, siendo muy preferido un molino de púas.
Un experto en la técnica sabe cómo hacer funcionar tales molinos.
Un molino de equipo a gran escala con un diámetro de disco de aproximadamente 40 cm se hace funcionar por ejemplo normalmente a 1-6500 revoluciones por minuto en el caso de un molino de púas, prefiriéndose 1-3000 revoluciones por minuto.
La molienda puede realizarse en condiciones de molienda convencionales que dan como resultado polvos con tamaños de partícula de entre 10 y 300 |im, lo más preferiblemente entre 25 y 100 |im.
Preferiblemente, todos los componentes de la mezcla que se someten a molienda están secos. Esto significa que si comprenden agua, solo comprenden agua de cristalización, pero no más del 10%, preferiblemente no más del 5%, lo más preferido no más del 2% en peso de moléculas de agua no unidas o no coordinadas.
En una realización preferida, la molienda se realiza en una atmósfera inerte. El gas protector inerte preferido es nitrógeno.
En otra realización preferida, todos los componentes de la mezcla se congelan antes de la molienda. La congelación de los componentes antes de la molienda puede realizarse mediante cualquier medio que garantice un enfriamiento de los componentes hasta una temperatura por debajo de 0°C y lo más preferiblemente por debajo de -20°C. En una realización preferida, la congelación se realiza con nitrógeno líquido. Esto significa que los componentes se tratan con nitrógeno líquido, por ejemplo vertiendo nitrógeno líquido en el recipiente en el que se almacenan los componentes antes de su introducción en el molino. En una realización preferida, el recipiente es un alimentador. Si el recipiente es un alimentador, el nitrógeno líquido se introduce preferiblemente en el lado o cerca del lado del alimentador en el que se introducen los componentes.
Normalmente, los componentes se tratan con el nitrógeno líquido a lo largo de 2 a 20 segundos.
Preferiblemente, el enfriamiento de los componentes se realiza de modo que todos los componentes que entran en el molino estén a una temperatura por debajo de 0°C, lo más preferido por debajo de - 20°C.
En una realización preferida, todos los componentes se colocan en un recipiente del que se transfiere la mezcla a un alimentador, lo más preferido a un alimentador sin fin de dosificación. En el alimentador, los componentes en ocasiones se mezclan adicionalmente (dependiendo del tipo de alimentador) y se enfrían adicionalmente. La mezcla congelada se transfiere entonces desde el alimentador hasta el molino, de modo que la mezcla que se muele en el molino tiene todavía preferiblemente una temperatura por debajo de 0°C, lo más preferido por debajo de - 20°C.
Normalmente, el tiempo de combinación, que significa el tiempo de residencia de la mezcla de componentes en el alimentador, es de más de un minuto, preferiblemente entre 15 y 60 minutos.
Un alimentador sin fin de dosificación, también denominado espiral de dosificación, normalmente se hace funcionar a una velocidad de 10 a 200 revoluciones por minuto, preferiblemente se hace funcionar a de 40 a 60 revoluciones por minuto.
Normalmente, la temperatura del molino se mantiene a entre -50 y 30°C. En una realización preferida, la temperatura se mantiene a alrededor de 10°C.
El nivel de oxígeno durante la molienda preferiblemente está por debajo del 10% (v/v).
El procedimiento puede ejecutarse por ejemplo de manera discontinua o de manera continua. En una realización preferida, el procedimiento según la presente invención se realiza de manera continua llenando de manera permanente, durante un tiempo determinado, la mezcla de componentes en un alimentador para enfriar y llenar de manera permanente la mezcla enfriada desde el alimentador al interior del molino.
Para el uso de los medios en polvo molidos, se añade un disolvente, preferiblemente agua (lo más particularmente agua destilada y/o desionizada o agua purificada o agua para inyección) o un tampón acuoso a los medios y los componentes se mezclan hasta que el medio se disuelve totalmente en el disolvente.
El disolvente también puede comprender solución salina, iones básicos o ácidos solubles que proporcionan un intervalo de pH adecuado (normalmente en el intervalo de entre pH 1,0 y pH 10,0), estabilizadores, surfactantes, conservantes y alcoholes u otros disolventes orgánicos polares.
También es posible añadir sustancias adicionales como sustancias tampón para el ajuste del pH, suero bovino fetal, azúcares, etc., a la mezcla del medio de cultivo celular y el disolvente. El medio de cultivo celular líquido resultante se pone entonces en contacto con las células que han de hacerse crecer o mantenerse.
Aunque las composiciones de medios que comprenden una mayor concentración de tirosina, por ejemplo 10 g/I de L-tirosina, a un pH por debajo de 8,5 mostrarían turbidez cuando se mezclan con el disolvente debido a la tirosina no disuelta, los medios de cultivo celular según la presente invención que usan la misma concentración del derivado de éster inorgánico de tirosina dan disoluciones transparentes.
La presente invención se refiere además a un procedimiento para cultivar células
a) proporcionando un biorreactor
b) mezclando las células que van a cultivarse con un medio de cultivo celular según la presente invención c) incubando la mezcla de la etapa b)
Un biorreactor es cualquier depósito o tanque en el que pueden cultivarse células. La incubación normalmente se realiza en condiciones adecuadas como temperatura adecuada, etc. Un experto en la técnica conoce las condiciones de incubación adecuadas para soportar o mantener el crecimiento/cultivo de las células.
Se ha encontrado que la presente invención también es muy adecuada para la preparación de los medios de alimentación. Debido a las limitaciones en la disponibilidad de L-tirosina y L-cisteína (especialmente en las concentraciones necesarias para los medios de alimentación) estas dos moléculas normalmente se preparan como una disolución madre a pH básico de 11,0-11,5. Este pH tiene un efecto negativo sobre el procedimiento de bioproducción biofarmacéutico general. El tiempo de mezclado en los biorreactores a gran escala y el valor de pH básico afectan en suma negativamente al suministro de nutrición a las células y aceleran en cierta medida la muerte celular por exposición a valores de pH básicos extremos.
Esto da como resultado la liberación de proteínas intracelulares en el sobrenadante. Estas proteínas liberadas se adhieren a células intactas, que entonces se pegan entre sí y forman agregados. Estos agregados se destruyen por la inercia de masa aumentada y el procedimiento de bioproducción general comienza a omitirse. Disminuir la velocidad periférica no es una opción, ya que estos procedimientos están regulados de todos modos cerca de los límites de suministro de oxígeno.
Por consiguiente, en este caso existe la necesidad de medios de alimentación que comprendan todos los componentes necesarios en una alimentación y en altas concentraciones. Además, el pH de la alimentación no debe influir negativamente en el cultivo celular.
Se ha encontrado que los derivados de éster inorgánico de L-tirosina y L-cisteína tienen una solubilidad y/o estabilidad mejorada y pueden usarse en medios de alimentación altamente concentrados, en lugar de L-tirosina y L-cisteína respectivamente sin ningún efecto negativo y en ocasiones incluso con efecto positivo sobre el crecimiento y/o la productividad celulares a un pH por debajo de 8,5.
Por tanto, la presente invención también se refiere a un medio de alimentación o bien en forma de un medio en polvo o bien tras disolución en forma de un medio líquido.
El medio líquido resultante comprende ácido (S)-2-amino-3-sulfosulfanil-propanoico o sales del mismo en concentraciones de entre 5 y 40 mmol/l, preferiblemente entre 10 y 30 mmol/l y preferiblemente tiene un pH de 8,5 o menos.
En una realización preferida, el pH es de entre 6,8 y 8,4.
La presente invención también se refiere a un procedimiento semicontinuo para cultivar células en un biorreactor - Llenando un biorreactor con células y un medio de cultivo celular acuoso
- Incubando las células en el biorreactor
- De manera continua a lo largo de todo el tiempo de la incubación de las células en el biorreactor o una vez o varias veces dentro de dicho tiempo de incubación añadiendo un medio de cultivo celular, que en este caso es un medio de alimentación, al biorreactor
mediante lo cual el medio de alimentación tiene preferiblemente un pH de menos de pH 8,5 y comprende ácido (S)-2-amino-3-sulfosulfanil-propanoico o sales del mismo. Normalmente un medio de alimentación comprende entre 100 y 150 g/l de componentes sólidos que se disuelven en el disolvente.
Se ha encontrado que mediante el uso de derivados de éster inorgánico de tirosina y/o cisteína puede obtenerse un medio de alimentación que comprende todos los componentes de alimentación necesarios a altas concentraciones
(concentración total de entre 100 y 150 g/l). A diferencia del procedimiento conocido donde es necesario alimentar dos o más medios de alimentación diferentes al biorreactor, la presente invención proporciona un medio y un método que permite el uso de un medio de alimentación que comprende todos los componentes en altas concentraciones. Además, el pH del medio de alimentación según la presente invención normalmente está por debajo de 8,5. Debido a las limitaciones en la disponibilidad de L-tirosina y L-cisteína en medios de cultivo celular y alimentación, estas dos moléculas se preparan normalmente, según el estado de la técnica, como una disolución madre a pH básico de 11,0 11,5. Este pH tiene un impacto negativo sobre el procedimiento de bioproducción biofarmacéutica general. El tiempo de mezclado en los biorreactores a gran escala y el valor de pH básico afectan en suma negativamente al suministro de nutrición a las células y aceleran en cierta medida la muerte celular por exposición a valores de pH básicos extremos. Cuando se usan los derivados de éster inorgánico de tirosina y/o cisteína, el pH del medio de alimentación puede mantenerse por debajo de 8,5, mientras que no obstante está presente entre 10 y 13 mM de derivado de éster inorgánico de tirosina y/o cisteína en un medio de alimentación con una concentración general de entre 100 y 150 g/l. Por consiguiente, en una realización preferida, en el procedimiento de la presente invención, el medio de alimentación que se añade durante la incubación o bien de manera continua o bien una vez o varias veces dentro de dicho tiempo al biorreactor siempre tiene la misma composición.
La presente invención se ilustra adicionalmente mediante las siguientes figuras y ejemplos, sin restringirse sin embargo a los mismos.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos representan aplicaciones prácticas de la invención.
Ejemplo 1
Síntesis del ácido (S)-2-amino-3-(4-fosfonooxi-fenil)-propiónico y sus sales
Se sintetiza ácido (S)-2-amino-3-(4-fosfonooxi-fenil)-propiónico según la bibliografía (P. F. Alewood, R. B. Johns, R. M. Valerio, Synthesis 1983, 30.) con la posterior conversión en sus sales, partiendo de L-tirosina. La figura 1 muestra el esquema de reacción de la síntesis de la sal disódica.
Variar la estequiometría y/o el catión de la base permite producir las sales de ácido tirosina-fosfónico cargadas una, dos o tres veces o sales diferentes, respectivamente.
Ácido (S)-2-amino-3-(4-fosfonooxi-fenil)-propiónico
Estructura:
Síntesis: La reacción se lleva a cabo disolviendo 100 g (0,55 mol) de L-tirosina en 400 g (3,48 mol) de ácido ortofosfórico, seguido por la adición de 309 g (2,13 mol) de pentóxido de fósforo en cinco porciones con enfriamiento. Se agita la disolución viscosa durante 20 h a 80°C, luego se enfría hasta 40°C y se hidroliza mediante la adición de 400 ml de agua. Se agita la disolución durante una ahora adicional a 80°C antes de que se añadan lentamente 3,8 l de nbutanol a 60°C. Se continúa con el enfriamiento hasta aproximadamente 3°C y se filtra la suspensión resultante. Los cristales incoloros obtenidos se lavan consecutivamente con agua, etanol y terc-butil éter de metilo y entonces se secan a vacío a 50°C.
Datos analíticos: 1H-RMN (D2O, 400 MHz): 6 = 2,94 (dd, 1 H), 3,13 (dd, 1 H), 3,79 (dd, 1 H), 7,08 - 7,18 (m, 4 H).
Sal monosódica del ácido (S)-2-amino-3-(4-fosfonooxi-fenil)-propiónico
Estructura:
Datos analíticos: 1H-RMN (D2O, 400 MHz): 8 = 3,03 (dd, 1 H), 3,21 (dd, 1 H), 3,91 (dd, 1 H), 7,11 - 7,16 (m, 2 H), 7,20 -7,25 (m, 2 H). ICP-OES (% en peso): hallado el 8,3%, calculado el 8,1%.
Sal disódica del ácido (S)-2-amino-3-(4-fosfonooxi-fenil)-propiónico
Estructura:
Síntesis: 50 g (191 mmol) de ácido (S)-2-amino-3-(4-fosfonooxi-fenil)-propiónico se llevan a 146 ml (402 mmol) de una disolución de NaOEt en EtOH (el 21% en peso), antes de añadir 12,5 ml de agua. La suspensión incolora se somete a reflujo durante una hora, se enfría hasta 0°C y se filtra. El producto incoloro se lava con etanol y entonces se seca a vacío a 50°C.
Datos analíticos: 1H-RMN (D2O, 400 MHz): 8 = 4,18 (dd, 1 H), 4,46 (dd, 1 H), 5,12 (dd, 1 H), 8,32 - 8,42 (m, 4 H). ICP-OES (% en peso): hallado el 14,1%, calculado el 15,1%.
Sal monopotásica del ácido (S)-2-amino-3-(4-fosfonooxi-fenil)-propiónico
Estructura:
Datos analíticos: 1 H-RMN (D2O, 400 MHz): 8 = 3,08 (dd, 1 H), 3,29 (dd, 1 H), 3,97 (dd, 1 H), 7,16 - 7,22 (m, 2 H), 7,25 -7,31 (m, 2 H). ICP-OES (% en peso): hallado el 12,6%, calculado el 13,1%.
Sal cálcica del ácido (S)-2-amino-3-(4-fosfonooxi-fenil)-propiónico, 2:1
Estructura:
Datos analíticos: 1 H-RMN (D2O, 400 MHz): 8 = 3,08 (dd, 1 H), 3,28 (dd, 1 H), 3,97 (dd, 1 H), 7,16 - 7,22 (m, 2 H), 7,25 -7,31 (m, 2 H). ICP-OES (% en peso): hallado el 7,2%, calculado el 7,2%.
Sal de magnesio del ácido (S)-2-amino-3-(4-fosfonooxi-fenil)-propiónico, 2:1
Estructura:
Datos analíticos: 1 H-RMN (D2O, 400 MHz): 8 = 3,07 (dd, 1 H), 3,29 (dd, 1 H), 3,97 (dd, 1 H), 7,16 - 7,22 (m, 2 H), 7,25 -7,31 (m, 2 H). ICP-OES (% en peso): hallado el 4,3%, calculado el 4,5%.
Debido a las similitudes espectrales en los espectros de 1 H-RMN entre las sales de tirosina-fosfato de igual carga, pero con disolventes independientes, se llevó a cabo espectrometría ICP-OES para determinar de manera inequívoca el catión correspondiente.
Ejemplo 2
Síntesis del ácido (S)-2-amino-3-(4-sulfonooxi-fenil)-propiónico y sus sales
El ácido (S)-2-amino-3-(4-sulfonooxi-fenil)-propiónico puede sintetizarse según la bibliografía (* S. Futaki, T. Taike, T. Yagami, T. Ogawa, T. Akita, K. Kitagawa, J: Chem. Soc. Perkin Trans. I 1990, 1739.) con la posible conversión posterior en sus sales, partiendo de L-tirosina. La figura 2 muestra el esquema de reacción de la síntesis de la sal sódica.
Variar la estequiometría y/o el catión de la base permite producir las sales del ácido tirosina-sulfónico cargadas una o dos veces o diferentes sales, respectivamente.
Ejemplo 3
Solubilidad en agua
Se sometió a prueba la solubilidad de L-tirosina (compuesto D1), ácido (S)-2-amino-3-(4-fosfonooxi-fenil)-propiónico (compuesto D2), sal sódica del ácido (S)-2-amino-3-(4-fosfonooxi-fenil)-propiónico (compuesto D3) y sal disódica del ácido (S)-2-amino-3-(4-fosfonooxi-fenil)-propiónico (compuesto D4) en agua a 20, 25 y 30°C. La tabla 1 muestra los resultados.
Ejemplo 4
Solubilidad en medio de cultivo celular complejo
El medio de Eagle modificado por Dulbecco, también conocido como DMEM, es un medio usado a menudo para hacer crecer células animales. Los componentes del DMEM son en mg/l:
Sales inorgánicas:
CaCl2 (anhidro): 200,00
Fe(NO3) ■ 9 H2O: 0,10
KCl: 400,00
MgSO4 (anhidro): 97,67
NaCl: 6400,00
NaH2PO4 ■ H2O: 125,00
Otros componentes:
D-Glucosa: 4500,00
Piruvato de sodio: 110,00
Pluronic 1000,00
Hepes 15 mM
Aminoácidos:
L-Arginina ■ HCl: 84.00
L-Cistina- 2HCl: 63.00
L-Glutamina: 584.00
Glicina: 30.00
L-Histidina HCl H2O: 42.00
L-Isoleucina: 105.00
L-Leucina: 105.00
L-Lisina HCl: 146.00
L-Metionina: 30.00
L-Fenilalanina: 66.00
L-Serina: 42.00
L-Treonina: 95.00
L-Triptófano: 16.00
L-Tirosina 2Na ■ 2H2O 248.00
L-Valina: 94.00
Vitaminas:
D-pantotenato de calcio: 4,00
Cloruro de colina: 4,00
Ácido fólico: 4,00
i-Inositol: 7,20
Niacinamida: 4,00
Riboflavina: 0,40
Tiamina ■ HCl: 4,00
Se obtiene la misma composición de medios pero se sustituye L-tirosina 2Na ■ 2H2O por la sal disódica del ácido (S)-2-amino-3-(4-fosfonooxi-fenil)-propiónico en la razón molar equivalente.
Para ambas composiciones de medios, se mezclan y se muelen todos los componentes según el método de la presente invención que comprende un espiral de dosificación y un molino de púas.
El medio de cultivo celular en polvo resultante se disuelve en agua desionizada a 25°C. La solubilidad se mide tras 10 minutos de mezclado (en un matraz con un agitador). Aunque la composición de los medios con el derivado de tirosina fosforilado es una disolución transparente, la composición que comprende L-tirosina no es transparente, sino que muestra turbidez.
Experimentos de cultivo celular
Ejemplo 5
Los datos para este experimento se muestran en la figura 3. El experimento discontinuo se realizó en medio químicamente definido donde la tirosina se reemplazó por sales de PTyr. PTyr significa sal del ácido (S)-2-amino-3-(4-fosfonooxi-fenil)-propiónico. Si la concentración de PTyr usada era igual que la concentración de tirosina en el medio, las células no crecían (no mostrado). Si se disolvían a una concentración de 4,5 mM en el CDM (frente a 1 mM en el control), las células podían crecer, lo que muestra una densidad de células viables máxima incluso superior que en el control y en general un crecimiento prolongado (2 días). El análisis posterior indicó que el crecimiento inicial era posible a través de la tirosina libre procedente de la síntesis de derivados de PTyr (impureza de síntesis del 5% (p/p)). El crecimiento prolongado podía atribuirse al efecto directo de PTyr tras su escisión metabólica en fosfato y tirosina libre.
Ejemplo 6
Los datos para este experimento se muestran en la figura 4. El experimento discontinuo se realizó en medio químicamente definido donde la cisteína se reemplazó por sal sódica de S-sulfocisteína (concentración equivalente). El polvo de CDM usado como base se agotó en cisteína y cistina y se complementó durante la reconstitución con cisteína para las condiciones de control (1,5 y 3 mM) o con sal sódica de S-sulfocisteína para las condiciones de prueba (1,5 y 3 mM). Las células mostraron un crecimiento comparable si se cultivaban en medio químicamente definido que contenía sal sódica de cisteína o S-sulfocisteína que muestra que puede usarse sal sódica de S-sulfocisteína como reemplazo de cisteína.
Ejemplo 7
Las figuras 5 y 6 muestran la densidad de células viables y la concentración de IgG a lo largo del tiempo en un procedimiento semicontinuo. Se hacen crecer células CHO recombinantes en medio basal químicamente definido y se
añade una alimentación que contiene sales de fosfo-Tyr a pH 7,0 en los días 3; 5, 7 y 9 (adición de % en v/v del 3%; el 6%, el 6%, el 6%). La condición 1 corresponde a la sal disódica de PTyr, la condición 2 corresponde a la sal de potasio de PTyr y la condición 3 corresponde a la sal de magnesio de PTyr solubilizada a una concentración de 30 mM en la alimentación de pH neutro. En estos casos, la cisteína todavía se añade como una alimentación independiente a pH 11. El procedimiento se realiza en tubos de centrifugación de 30 ml a 37°C, el 5% de CO2 , agitación de 320 rpm. Para el control, según el estado de la técnica, se solubilizan tirosina 2Na+ y cisteína a pH 11 en una alimentación independiente y se añaden en los días 3; 5; 7; 9 en % (v/v) del 0,3%, el 0,6%, el 0,6% y el 0,6%. Por consiguiente, la alimentación principal no contiene ni cisteína ni tirosina y se añade tal como se describió anteriormente. La concentración de glucosa se mide cada día y se ajusta en consecuencia para mantener una concentración > 2 g/l. Puede observarse que pueden usarse sales de 3 fosfoTyr (sodio, potasio, magnesio) en alimentaciones neutras altamente concentradas en procedimientos semicontinuos sin impacto negativo ni sobre el crecimiento ni sobre el título, simplificando de ese modo el procedimiento general
Ejemplo 8
Las figuras 7 y 8 muestran la densidad de células viables y la concentración de IgG a lo largo del tiempo en un procedimiento semicontinuo. Se hacen crecer células CHO recombinantes en medio basal químicamente definido de manera completa y una alimentación que contiene tanto S-sulfocisteína como PTyr 2Na+ a pH 7,0. Se añade alimentación en los días 3; 5, 7, 9 y 14 (adición de % en v/v del 3%; el 6% el 6% el 6%, el 3%). El procedimiento se realiza en biorreactores de 1,2 l a 37°C, pH 7,0, el 50% de oxígeno disuelto, agitación a 140 rpm. Para el control, según el estado de la técnica, se solubilizan 2Na+ y cisteína a pH 11 en una alimentación independiente y se añaden en los días 3; 5; 7; 9, 14 en % (v/v) del 0,3%, el 0,6%, el 0,6%, el 0,6%, el 0,3%. La concentración de glucosa se mide cada día y se ajusta en consecuencia para mantener una concentración > 2 g/l.
Puede observarse que el uso de S-sulfocisteína en la alimentación principal (en este caso en combinación con PTyr 2Na+) induce un crecimiento prolongado en comparación con el control y muestra un aumento significativo en el título.
Claims (11)
1. Medio de cultivo celular que comprende ácido (S)-2-amino-3-sulfosulfanil-propiónico o sales del mismo.
2. Medio de cultivo celular según la reivindicación 1, caracterizado porque el medio de cultivo celular comprende una sal sódica del ácido (S)-2-amino-3-sulfosulfanil-propiónico.
3. Medio de cultivo celular según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, caracterizado porque el medio de cultivo celular es un medio en polvo seco.
4. Medio de cultivo celular según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, caracterizado porque el medio de cultivo celular es un medio líquido que tiene un pH de 8,5 o menos.
5. Medio de cultivo celular según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, caracterizado porque el medio de cultivo celular es un medio de alimentación.
6. Medio de cultivo celular según la reivindicación 5, caracterizado porque el medio de cultivo celular comprende aminoácidos, oligoelementos, vitaminas y componentes de sacárido.
7. Medio de cultivo celular según la reivindicación 5 o la reivindicación 6, caracterizado porque el medio de cultivo celular comprende entre 100 y 150 g/l de componentes sólidos que se disuelven en un disolvente.
8. Procedimiento para cultivar células
a) proporcionando un biorreactor
b) mezclando las células que van a cultivarse con un medio de cultivo celular según una o más de las reivindicaciones 1 a 7.
c) incubando la mezcla de la etapa b)
9. Procedimiento semicontinuo para cultivar células en un biorreactor
- llenando un biorreactor con células y un medio de cultivo celular acuoso
- incubando las células en el biorreactor
- de manera continua a lo largo de todo el tiempo de la incubación de las células en el biorreactor o una vez o varias veces dentro de dicho tiempo de incubación, añadiendo un medio de cultivo celular, que en este caso es un medio de alimentación, al biorreactor
mediante lo cual, el medio de alimentación tiene un pH de menos de pH 8,5 y comprende ácido (S)-2-amino-3-sulfosulfanil-propiónico o sales del mismo.
10. Procedimiento semicontinuo según la reivindicación 9, caracterizado porque el medio de alimentación comprende ácido (S)-2-amino-3-sulfosulfanil-propiónico o sales del mismo en una concentración de entre 10 y 30 mmol/l.
11. Procedimiento semicontinuo según la reivindicación 9 o la reivindicación 10, caracterizado porque el medio de alimentación comprende entre 100 y 150 g/l de componentes sólidos que se disuelven en un disolvente.
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