MX2015006099A - Medios de cultivo celular. - Google Patents

Abstract

La presente invención se relaciona con medios de cultivo celular que comprenden derivados de éster inorgánico de tirosina y/o cisteína. La pobre solubilidad de la tirosina y la estabilidad con frecuencia no suficiente de la cisteína en medios de cultivo celular es superada sustituyéndola con un derivado de éster inorgánico, por ejemplo con un derivado fosforilado.

Description

MEDIOS DE CULTIVO CELULAR CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con medios de cultivo celular que comprenden derivados de áster inorgánico de tirosina y/o cisteína. La pobre solubilidad de la tirosina y la estabilidad con frecuencia no suficiente de la cisteína en medios de cultivo celular es superada sustituyéndola con un derivado de áster inorgánico, por ejemplo con un derivado fosforilado.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los medios de cultivo celular soportan y mantienen el crecimiento de células en un ambiente artificial.

Dependiendo del tipo de organismo cuyo crecimiento vaya a ser soportado, los medios de cultivo celular comprenden una mezcla compleja de componentes, algunas veces más de cien componentes diferentes.

Los medios de cultivo celular requeridos para la propagación de células de mamífero, insecto o planta, son típicamente mucho más complejos que los medios para soportar el crecimiento de bacterias y levaduras.

Los primeros medios de cultivo celular que fueron desarrollados consistían de componentes indefinidos como plasma, suero, extractos embrionarios, y otros extractos biológicos no identificados o peptonas. De este modo ocurrió REF.: 255570 un avance mayor con el desarrollo de medios definidos químicamente. Los medios definidos químicamente con frecuencia comprenden pero no se limitan exclusivamente a aminoácidos, vitaminas, sales de metal, antioxidantes, quelantes, factores del crecimiento, amortiguadores, hormonas y muchas más sustancias conocidas por aquellos expertos en la téenica.

Algunos medios de cultivo celular se ofrecían como líquidos acuosos estériles. La desventaja de los medios de cultivo celular líquidos es su vida de anaquel reducida y las dificultades de embarque y almacenamiento. Como consecuencia, muchos medios de cultivo celular son actualmente ofrecidos como mezclas en polvo secas finamente molidas. Ellas son preparadas para el propósito de disolverlas en agua y/o soluciones acuosas y en el estado disuelto son diseñadas, frecuentemente con otros suplementos para suministrar a las células una base de nutrientes sustancial para el crecimiento y/o producción de biofármacos a partir de las células.

La mayoría de las plataformas de producción biofarmacéutica se basan en protocolos de cultivo celular alimentados por lotes. Típicamente el propósito es desarrollar procesos de cultivo celular de título alto para satisfacer las demandas crecientes del mercado y reducir los costos de fabricación. Además del uso de líneas celulares recombinantes de alto desempeño, se requieren mejoras en los medios de cultivo celular y parámetros de proceso para hacer una realidad los potenciales de producción máximos.

En un proceso alimentado por lotes, un medio basal soporta el crecimiento y producción iniciales, y un medio de alimentación evita el agotamiento de nutrientes y sostiene la fase de producción. Los medios son elegidos para acomodarse a los distintos requerimientos metabólicos durante las fases de producción. Los ajustes de los parámetros de proceso - incluyendo la estrategia de alimentación y parámetros de control - definen los ambientes químicos y físicos adecuados para el crecimiento celular y la producción de proteína.

La optimización del medio de alimentación es un aspecto principal en la optimización de un proceso de alimentación por lotes.

Muy frecuentemente el medio de alimentación está altamente concentrado para evitar la dilución del birreactor. La adición controlada del nutriente directamente afecta la velocidad de crecimiento del cultivo.

Un factor limitante para la preparación de medios de cultivo celular a partir de polvo seco es la baja solubilidad o pobre estabilidad de algunos componentes, especialmente la baja solubilidad o pobre estabilidad de los aminoácidos L-tirosina y L-cisteína. Para L-tirosina, la baja solubilidad es el problema principal, mientras que para la L-cisteína dominan los problemas de estabilidad.

En consecuencia, sería favorable encontrar una forma de mejorar la solubilidad y/o estabilidad de la L-tirosina y la L-cisteína.

Se ha encontrado que los derivados de éster inorgánico de L-tirosina y L-cisteína tienen mejor solubilidad y/o estabilidad y pueden ser usados en medios de cultivo celular en lugar de L-tirosina y L-cisteína respectivamente sin ningún efecto negativo y algunas veces un efecto positivo aún sobre el crecimiento celular.

Además se ha encontrado que sus derivados de éster inorgánico son especialmente adecuados para preparar soluciones de alimentación que tengan un pH de no más de 8.5 y que tengan altas concentraciones de tirosina y cisteína, las cuales se encuentran en una forma adecuada como un nutriente para las células.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención está dirigida por lo tanto a un medio de cultivo celular que comprende al menos un derivado de éster inorgánico de tirosina y/o cisteína.

En una modalidad preferida, el derivado de éster inorgánico es derivado de éster de fosfato.

En una modalidad preferida el medio de cultivo celular comprende uno o más de otros componentes de fórmula I y/o II: En una modalidad preferida, el derivado de éster inorgánico de tirosina es ácido (S)-2-amino-3-(4-fosfononooxifenil)propiónico o sales del mismo.

En otra modalidad preferida, el derivado de cisteína es ácido (S)-2-amino-3-sulfosulfanilpropanoico o sales del mismo.

En una modalidad preferida, el derivado fosforilado de tirosina es la sal disódica del ácido (S)-2-Amino-3-(4-fosfononooxifenil)propiónico.

En otra modalidad preferida, el derivado sulfonado de cisteína es la sal sódica del ácido (S)-2-amino-3-sulfosulfanilpropiónico.

En una modalidad preferida, el medio de cultivo celular es un medio en polvo seco.

En otra modalidad preferida el medio de cultivo celular es un medio de alimentación.

En otra modalidad preferida, el medio de cultivo celular es un medio líquido que tiene un pH de 8.5 o menos y que comprende al menos un derivado de áster inorgánico de tirosina y/o cisteína en una concentración entre 5 y 40 mmol/L, preferiblemente entre 10 y 30 mmol/L.

En una modalidad preferida el pH del medio líquido es entre 6.5 y 8.5, de manera más preferible entre 6.8 y 7.8.

En una modalidad, el medio de cultivo celular comprende al menos uno o más componentes sacáridos, uno o más aminoácidos, una o más vitaminas o precursores de vitamina, una o más sales, uno o más componentes amortiguadores, uno o más cofactores y uno o más componentes ácido nucleico.

La presente invención está dirigida además a un método para producir un medio de cultivo celular de acuerdo con la presente invención a) mezclando uno o más derivados de áster inorgánico de L-tirosina y/o L-cisteína con otros componentes del medio de cultivo celular b) sometiendo la mezcla del paso a) a molienda En una modalidad preferida el paso b) es efectuado en un molino de perno, molino de martillos fitz o un molino de chorro.

En otra modalidad preferida, la mezcla del paso a) es enfriada a una temperatura inferior a 0°C antes de la molienda.

La presente invención está dirigida además a la sal disódica, la sal dipotásica, la sal monopotásica, la sal de calcio 2:1 y las sales de magnesio de ácido (S)-2-amino-3- (4-fosfonooxifenil)propiónico.

La presente invención está dirigida además a un proceso para cultivar células a) proporcionando un biorreactor b) mezclando las células hasta ser cultivadas con un medio de cultivo celular de acuerdo con la presente invención. c) incubando la mezcla del paso b).

La presente invención también está dirigida a un proceso de alimentación por lotes para cultivar células en un biorreactor - Llenando en un biorreactor células en un medio de cultivo celular acuoso - Incubando las células en el biorreactor - Continuamente durante todo el tiempo de incubación de las células en el biorreactor o una vez o varias veces dentro del tiempo de incubación agregando un medio de cultivo celular, el cual en este caso es un medio de alimentación, al biorreactor por lo gue el medio de alimentación tiene un pH de menos de 8.5 y comprende al menos un derivado de éster inorgánico de tirosina y/o cisterna.

Preferiblemente, el medio de alimentación comprende al menos un derivado de éster inorgánico de tirosina y/o cisteína en una concentración entre 10 y 50 mmol/L, preferiblemente entre 5 y 30 mmol/L.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra el esquema de reacción para producir ácido (S)-2-amino-3-(4-fosfonooxifenil)propiónico. Los detalles adicionales pueden encontrarse en el Ejemplo 1.

La Figura 2 muestra el esquema de reacción para producir ácido (S)-2-amino-3-(4-sulfonooxifenil)propiónico. Los detalles adicionales pueden encontrarse en el Ejemplo 2.

Las Figuras 3 y 4 muestran experimentos de crecimiento celular en lote usando un medio de cultivo celular de acuerdo con la presente invención. Los detalles adicionales pueden encontrarse en los Ejemplos 5 y 6.

Las Figuras 5 y 6 muestran los resultados de un experimento de cultivo celular alimentado por lotes en el cual es usada la alimentación por lotes optimizada de acuerdo a la invención con sales de ácido (S)-2-amino-3-(4-sulfonooxifenil) propiónico. Los detalles pueden encontrarse en el Ejemplo 7.

Las Figuras 7 y 8 muestran los resultados de un experimento de cultivo celular alimentado por lotes en el cual es usada la alimentación por lotes optimizada de acuerdo con la invención con sales de ácido (S)-2-amino-3-(4-sulfonooxifenil)propiónico y sal sódica de ácido (S)-2-amino-3-sulfosulfanilpropiónico. Los detalles pueden encontrarse en el Ejemplo 8.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Un derivado de áster inorgánico de acuerdo con la presente invención es un producto obtenible por ejemplo de la condensación de un oxoácido inorgánico y tirosina o cisteína. Los ejemplos de oxoácidos inorgánicos son por ejemplo, ácido fosfórico, ácido sulfúrico, ácido nítrico y ácido bórico. Se prefieren derivados de áster inorgánicos derivados de ácido sulfúrico o ácido fosfórico. Los derivados de áster inorgánicos son de este modo los ásteres de los oxoácidos inorgánicos y cisteína o tirosina y sus sales. Los ejemplos de derivados de áster inorgánico adecuados de tirosina son ácido (S)-2-amino-3-(4-fosfonooxifenil)propiónico, así como la sal monosódica, la sal disódica, la sal monopotásica, la sal dipotásica, la sal de calcio y la sal de magnesio de ácido (S)-2-amino-3-(4-fosfonooxifenil)propiónico.

Los derivados de áster inorgánico preferidos también pueden ser mostrados por las siguientes Fórmulas I y II : II con R siendo siendo X y Y independientemente entre sí H, Li, Na, K, ½ Ca, ½ Mg, preferiblemente H, Na, K. El término ácido propanoico también puede ser usado en lugar del término ácido propiónico.

Un medio de cultivo celular de acuerdo con la presente invención es cualquier mezcla de los componentes que mantenga y/o soporte el crecimiento in vitro de células. Éste puede ser un medio complejo o un medio definido químicamente. El medio de cultivo celular puede comprender todos los componentes necesarios para mantener y/o soportar el crecimiento in vitro de células o únicamente algunos componentes, de modo que los componentes adicionales sean agregados por separado. Los ejemplos de medios de cultivo celular de acuerdo con la presente invención son medios completos los cuales comprenden todos los componentes necesarios para mantener y/o soportar el crecimiento in vitro de células, así como suplementos o alimentos de medios. En una modalidad preferida, el medio de cultivo celular es un medio completo o un medio de alimentación. Un medio completo también llamado medio basal típicamente tiene un pH entre 6.8 y 7.8. Un medio de alimentación preferiblemente tiene un pH inferior a 8.5.

Típicamente, los medios de cultivo celular de acuerdo con la invención son usados para mantener y/o soportar el crecimiento de células en un biorreactor.

Un alimento o medio de alimentación es un medio de cultivo celular el cual no es el medio basal que soporta el crecimiento y producción iniciales en un cultivo celular, sino el medio que es agregado en una etapa posterior para evitar el agotamiento de nutrientes y sostener la fase de producción. Un medio de alimentación puede tener concentraciones mayores de algunos componentes en comparación con un medio de cultivo basal. Por ejemplo, algunos componentes, como, por ejemplo, nutrientes, incluyendo aminoácidos o carbohidratos, pueden estar presentes en el medio de alimentación a aproximadamente 5X, 6X, 7X, 8X, 9X, 10X, 12X, 14X, 16X, 20X, 30X, 50X, 100X, 200X, 400X, 600X, 800X, o aún a aproximadamente 1000X de las concentraciones en un medio basal.

Un medio de cultivo celular para mamífero es una mezcla de componentes la cual mantienen y/o soporta el crecimiento in vi tro de células de mamífero. Los ejemplos de células de mamífero son células humanas o de animal, preferiblemente células CHO, células COS, células I VERO, células BHK, células AK-1, células SP2/0, células L5.1, células de hibridoma o células humanas.

Los medios de cultivo celular definidos químicamente son medios de cultivo celular que no comprenden ninguna sustancia no definida químicamente. Esto significa que la composición química de todos los productos químicos usados en los medios es conocida. Los medios definidos químicamente no comprenden ningún levadura, tejidos de animal o planta; no comprenden células alimentadoras, suero, extractos o digeridos u otros componentes que puedan contribuir a proteínas pobremente definidas desde el punto de vista químico a los medios. Los componentes definidos químicamente o pobremente definidos químicamente son aquellos cuya composición química y estructura no es conocida, están presentes en la composición variable, o podrían ser definidos únicamente con un esfuerzo experimental enorme - en comparación con la evaluación de la composición y estructura química de una proteína como la albúmina o caseína.

Un medio de cultivo celular pulverizado o un medio de polvo seco es un medio de cultivo celular que resulta típicamente de un proceso de molienda o un proceso de liofilización. Eso significa que el medio de cultivo celular pulverizado es un medio granular, particulado - no un medio líquido. El término "polvo seco" puede ser usado de manera intercambiable con el término "polvo"; sin embargo, "polvo seco" como es usado aquí simplemente se refiere a la apariencia del material granulado y no pretende significar que el material está completamente libre de solventes acomplejados o aglomerados a menos que se indique otra cosa.

Las células a ser cultivadas con los medios de acuerdo con la presente invención pueden ser células procariotas como células bacterianas o células eucariotas como células de planta o animal. Las células pueden ser células normales, células inmortalizadas, células enfermas, células transformadas, células mutantes, células somáticas, células germinales, células no diferenciadas, células precursoras o células embrionarias, cualquiera de las cuales pueden ser líneas celulares establecidas o transformadas u obtenidas de fuentes naturales.

El tamaño de una partícula significa el diámetro medio de la partícula. El diámetro de partículas es determinado por difracción de luz láser en el aceite de Silicon.

Se genera una atmósfera inerte llenando el contenedor o aparato respectivo con un gas inerte. Los gases inertes adecuados son gases nobles como el argón o preferiblemente nitrógeno. Estos gases inertes no son reactivos y evitan que tomen lugar reacciones químicas indeseables. En el proceso de acuerdo con la presente invención, generar una atmósfera inerte significa que la concentración de oxígeno es reducida por debajo del 10 % (v/v) absoluto, por ejemplo, introduciendo nitrógeno líquido o gas nitrógeno.

Los diferentes tipos de molinos son conocidos por aquellos expertos en la téenica.

Un molino de perno, también llamado molino de impacto centrífugo, pulveriza sólidos por lo que los pernos que se proyectan sobre discos que giran a alta velocidad proporcionan la energía de rompimiento. Los molinos de perno son vendidos por ejemplo por Munson Machinery (EUA), Premium Pulman (India) o Sturtevant (EUA).

Un molino de chorro usa gas comprimido para acelerar las partículas, haciendo que choquen entre sí en la cámara de proceso. Los molinos de chorro son vendidos por ejemplo por Sturtevant (EUA) o PMT (Austria).

Un molino de fitz comercializado por Fitzpatrick (EUA), usa un rotor con cuchillas para moler.

Un proceso que es efectuado continuamente es un proceso que no es efectuado por lotes. Si un proceso de molienda es efectuado continuamente significa que los ingredientes del medio son alimentados de manera permanente y estable al molino durante un cierto tiempo.

Los medios de cultivo celular, especialmente los medios completos, de acuerdo con la presente invención, típicamente comprenden al menos uno o más componentes sacáridos, uno o más aminoácidos, una o más vitaminas o precursores de vitamina, una o más sales, uno o más componentes amortiguadores, uno o más cofactores y uno o más componentes de ácido nucleico.

Los medios también pueden comprender piruvato de sodio, insulina, proteínas, vegetales, ácidos grasos y/o derivados de ácido graso y/o ácido plurónico y/o componentes tensoactivos como tensoactivos no iónicos preparados químicamente. Un ejemplo de un tensoactivo no iónico adecuado son los tensoactivos copoliméricos de bloques disfuncionales que terminan en grupos hidroxilo primarios también llamados poloxámeros, por ejemplo disponibles bajo el nombre comercial de pluronic ® de BASF, Alemania.

Los componentes sacáridos son todos mono o disacáridos como la glucosa, glucosa, galactosa, ribosa o fructosa (ejemplos de monosacáridos) o sacarosa, lactosa o maltosa (ejemplos de disacáridos).

Los ejemplos de aminoácidos de acuerdo con la invención son tirosina, los aminoácidos proteinogénicos , especialmente los aminoácidos esenciales, leucina, isoleucina, U sina, metionina, fenilalanina, treonina, triptófano y valina, así como aminoácidos no proteinogénicos como los D-aminoácidos.

Tirosina significa L- o D- tirosina, preferiblemente L-tirosina.

Cisteína significa L- o D-cisteína, preferiblemente L-cistexna.

Los ejemplos de vitaminas son Vitamina A (Retinol, retinal, varios retinoides, y cuatro carotenoides), Vitamina Bi (Tiamina), Vitamina B2 (Riboflavina), Vitamina B3 (Niacina, niacinamida), Vitamina B5 (Ácido pantoténico), Vitamina Bb (Piridoxina, piridoxamina, piridoxal), Vitamina B7 (Biotina), Vitamina Bg (ácido fólico, ácido folínico), Vitamina B12 (Cianocobalamina, hidroxicobalamina, metilcobalamina), Vitamina C (Ácido ascórbico), Vitamina D (Ergocalciferol, colecalciferol), Vitamina E (Tocoferóles, tocotrienoles) y Vitamina K (filoquinona, menaquinonas). También están incluidos los precursores de Vitamina.

Los ejemplos de sales son componentes que comprenden iones inorgánicos como bicarbonato, calcio, cloruro, magnesio, fosfato, potasio y sodio o elementos en trazas como Co, Cu, F, Fe, Mn, Mo, Ni, Se, Si, Ni, Bi, V y Zn. Los ejemplos son sulfato de Cobre(II) pentahidratado (CuSC·5H2O), Cloruro de Sodio (NaCl), cloruro de Calcio (CaCl2-2H20), cloruro de Potasio (KCI), Sulfato de Hierro (II), fosfato de sodio monobásico anhidro (NaH2PC>4), sulfato de Magnesio anhidro (MgSO4), fosfato de sodio dibásico anhidro (Na2HP04), cloruro de magnesio hexahidratado (MgCl2-6H20), sulfato de zinc heptahidratado.

Los ejemplos de amortiguadores son CO2/HCO3 (carbonato), fosfato, HEPES, PIPES, ACES, BES, TES, MOPS y TRIS.

Los ejemplos de cofactores son derivados de tiamina, biotina, vitamina C, NAD/NADP, cobalamina, flavina mononucleótido y derivados, glutatión, fosfatos de heme nucleótido y derivados.

Los componentes de ácido nucleico, de acuerdo con la presente invención, son las nucleobases, como citosina, guanina, adenina, timina o uracilo, los nucleósidos como la citidina, uridina, adenosina, guanosina y timidina, y los nucleótidos como el monofosfato de adenosina o difosfato de adenosina o trifosfato de adenosina.

Los medios de alimentación pueden tener una composición diferente en comparación con los medios completos. Ellos típicamente comprenden aminoácidos, elementos en trazas y vitaminas. También pueden comprender componentes sacáridos pero algunas veces por razones de producción los componentes sacáridos son agregados en una alimentación por separado.

Un medio de alimentación adecuado puede comprender por ejemplo uno o más de los siguientes compuestos: L-ASPARAGINA MONOHIDRATADA L- ISOLEUCINA L-FENILALANINA L-GLUTAMATO DE SODIO MONOHIDRATADO L-LEUCINA L-TREONINA MONOCLORHIDRATO DE L-LISINA L-PROLINA L-SERINA MONOCLORHIDRATO DE L-ARGININA MONOCLORHIDRATO DE L-HISTIDINA MONOHIDRATADA L-METIONINA L-VALINA L-ASPARTATO MONOSÓDICO MONOHIDRATADO L-TRIPTÓFANO CLORURO DE COLINA MIO-INOSITOL NICOTINAMIDA D (+)-PANTOTENATO DE CALCIO CLORHIDRATO DE PIRIDOXINA CLORHIDRATO DE CLORURO DE TIAMINA VITAMINA B12 (CIANOCOBALAMINA) MICRONIZADA BIOTINA ÁCIDO FÓLICO RIBOFLAVINA SULFATO DE MAGNESIO ANHIDRO SULFATO DE COBRE(II) PENTAHIDRATADO SULFATO DE ZINC HEPTAHIDRATADO DICLORHIDRATO DE 1,4-DIAMINOBUTANO HEPTAMOLIBDATO DE AMONIO TETRAHIDRATADO SULFATO DE CADMIO HIDRATADO CLORURO DE MANGANESO(II) TETRAHIDRATADO CLORURO DE NÍQUEL(II) HEXAHIDRATADO METASILICATO DE SODIO METAVANADATO DE SODIO CLORURO DE ESTAÑO (II) DIHIDRATADO SELENIURO DE SODIO (APROXIMADAMENTE 45 % DE SE) FOSFATO ÁCIDO DE SODIO MONOHIDRATADO CITRATO DE AMONIO Y FIERRO (III) (APROXIMADAMENTE 18 % DE FE) Congelar de acuerdo con la presente invención significa enfriar a una temperatura inferior a 0 °C.

El objetivo de la presente invención es proporcionar medios de cultivo celular pulverizados que puedan ser fácilmente disueltos en un solvente adecuado únicamente mezclando el polvo y el solvente, de modo que el polvo se disuelva y produzca un medio de cultivo celular líquido, u medio completo, un suplemento de medio, un subgrupo de medio o un alimento con una concentración deseada y homogénea de los componentes del medio.

La simple disolución de un medio de cultivo celular pulverizado es con frecuencia complicada por sustancias como la tirosina o cisteína las cuales tiene una solubilidad y/o estabilidad pobres en solventes acuosos. La L-tirosina por ejemplo tiene una solubilidad de 0.4 g/L en agua a una temperatura de 25 °C. Lo que significa que aproximadamente 0.4 g de L-tirosina son solubles en 1 litro de agua. Pero la concentración requerida de tirosina en los medios de cultivo celular es con frecuencia mayor. La cisteína tiende a formar dímeros bajo condiciones aeróbicas. Aquellos dímeros son llamados cisteína. Además, se sabe que la cisteína forma productos laterales tóxicos con metales como el cobre o hierro, los cuales con frecuencia están presentes en medios de cultivo celular. La cisteína o cistina presente en los medios de cultivo celular puede ser sustituida por derivados de áster inorgánico de acuerdo con la presente invención que no formen dímeros o productos laterales tóxicos.

Se ha encontrado que los derivados fosforilados y/o sulfonados de tirosina y/o cisteína por un lado típicamente tienen una solubilidad mayor en soluciones acuosas y por otro lado pueden ser usados como sustituyentes para la tirosina y/o cisteína/cistina y son igualmente adecuados como componentes de medios de cultivo celular como los aminoácidos nativos tirosina y cisteína. Eso significa que por ejemplo los medios de cultivo celular en los cuales la L-tirosina ha sido sustituida por uno o más derivados de áster inorgánico de L-tirosina muestran desempeño comparable en el cultivo celular como los medios que comprenden sólo L-tirosina.

Algunos derivados de áster inorgánico de tirosina y cisteína son conocidos en la téenica. En los péptidos y proteínas la fosforilación de la tirosina juega un papel significativo en la amplia gama de procesos celulares y activan y desactivan muchas enzimas proteicas, alterando por lo tanto su función y actividad.

La sal monosódica de ácido (S)-2-Amino-3-(4-fosfononooxifenil)propiónico tiene un número de CAS 146900-49-4. R.H. Plimmer Biochemical Journal (1941), 35, páginas 461-469, describe la síntesis de ácido (S)-2-Amino-3-(4-fosfononooxifenil)propiónico así como su sal de calcio 1:1.

La síntesis y características de los derivados novedosos adicionales de ácido (S)-2-Amino-3-(4-fosfononooxifenil)propiónico, como la sal disódica, la sal dipotásica, la sal monopotásica, la sal de calcio 2:1 y las sales de magnesio de ácido (S)-2-Amino-3-(4-fosfononooxifenil)propiónico son descritas aquí.

Los derivados fosforilados adecuados de tirosina de acuerdo con la presente invención son aquellos que han sido fosforilados en el grupo OH fenólico, como el ácido (S)-2-Amino-3-( -fosfononooxifenil)propiónico o sales del mismo. En una modalidad especialmente preferida, el derivado fosforilado de tirosina es una sal de ácido (S)-2-Amino-3-(4-fosfononooxifenil)propiónico.

Los derivados sulfonados adecuados de tirosina de acuerdo con la presente invención son aquellos que han sido sulfonados en el grupo OH fenólico, como el ácido (S)-2-Amino-3-(4-sulfonooxifenil)propiónico o sales del mismo. En una modalidad especialmente preferida, el derivado sulfonado de tirosina es una sal de ácido (S)-2-Amino-3-(4-sulfonooxifenil)propiónico.

Los derivados fosforilados adecuados de cisterna de acuerdo con la presente invención son aquellos que han sido fosforilados en el grupo SH de la cisteína, como el ácido (S)-2-Amino-3-fosfononosulfanilpropiónico o sales del mismo.

Los derivados sulfonados de cisteína de acuerdo con la presente invención son aquellos que han sido sulfonados en el grupo SH de la cisteína, como (S)-2-Amino-3-sulfosulfanilpropiónico o sales del mismo. La síntesis del ácido 2-Amino-3-sulfosulfanilpropiónico, también llamado ácido (S)-2-Amino-3-sulfosulfanilpropiónico, S-sulfocisteína o cisteína-S-sulfato, y sus sales se describe por ejemplo en I.H.Segel y M.J.Johnson, Analytical Biochemistry 5, 330-337 y J.S. Church, D.J. Evans, Spectrochimica Acta Part A 69 (2008) 256-262. La sal sódica se encuentra además comercialmente disponible de Bachem, Suiza.

Las sales adecuadas son sales de metal alcalino o metal alcalinotérreo, por ejemplo las sales de litio, las sales de sodio, las sales de potasio, las sales de calcio o las sales de magnesio, se prefieren las sales de sodio, potasio y el ácido libre, más preferidas son las sales de sodio .

En el caso de los derivados de esteres inorgánicos de tirosina, la sal disódica del ácido (S)-2-amino-3-(4-fosfonooxifenil)propiónico muestra una solubilidad muy buena.

Los derivados de áster inorgánico de tirosina y cisteína pueden ser producidos por cualguier método, por ejemplo, enzimáticamente o por síntesis química. Preferiblemente los derivados fosforilados de tirosina son producidos haciendo reaccionar tirosina con ácido fosfórico en presencia de pentóxido de fósforo. El ácido (S)-2-amino-3-(4-fosfonooxifenil)propiónico resultante puede entonces hacerse reaccionar con una base adecuada como el hidróxido de sodio, etilato de sodio, hidróxido de potasio, etc. para dar la sal relacionada. Un esquema de reacción de esta síntesis se muestra en la Figura 1.

La solubilidad del ácido (S)-2-amino-3-(4-fosfonooxifenil)propiónico es mayor que la de la tirosina (véase la tabla 1 en el Ejemplo 3).

Para aumentar la solubilidad de derivado de tirosina o cisteína aún más, puede formarse una sal haciendo reaccionar un derivado con una base adecuada como se describió anteriormente. La sal sódica de ácido (S)-2-amino-3- (4-fosfonooxifenil)propiónico, tiene una solubilidad mayor (véase la tabla 1 en el Ejemplo 3).

Un medio de cultivo celular de acuerdo con la presente invención puede comprender uno o más derivados de éster inorgánico de tirosina y/o cisteína, por ejemplo una mezcla de sal mono y disódica de ácido (S)-2-amino-3-(4-fosfonooxifenil)propiónico.

Se ha encontrado que en el caso de usar derivados de éster inorgánicos de tirosina en medios completos es favorable agregar a la composición del medio una pequeña cantidad de tirosina. Esto puede deberse al hecho de que algunas células no muestran absorción o captación de los derivados de éster inorgánicos de tirosina. Los derivados de ésteres inorgánicos de tirosina necesitan ser convertidos extracelularmente a la tirosina libre por fosfatasas. Típicamente, la cantidad suficiente de fosfatasas está disponible después de 2 a 5 días a partir del inicio del cultivo celular.

Cuando se usan derivados de éster inorgánicos de tirosina en medios de alimentación recién agregados, significa un cultivo celular donde las células ya han estado creciendo por más de 2-5 días en un medio que comprende tirosina, no existe necesidad de agregar tirosina al medio de alimentación recién agregado.

En consecuencia, en una modalidad preferida, un medio completo de acuerdo con la presente invención comprende al menos un derivado de éster inorgánico de tirosina y, adicionalmente de 5 a 40 % (p/p) de tirosina.

Este efecto no es encontrado cuando se usan derivados de éster inorgánicos de cisteína. Para el uso de derivados de éster inorgánico de cisteína no es necesaria la adición de cisteína. Los derivados de éster inorgánico de cisteína pueden en cualquier caso ser usados como un sustituto completo de la cisteína o cistina.

Además, de manera inesperada, los derivados de éster inorgánico de cisteína mostraron un efecto positivo sobre el crecimiento celular y la productividad. Típicamente, las células que crecieron con medios y alimentación que comprenden derivados de ésteres inorgánico de cisteína mostraron un crecimiento extendido. Cuando se usan derivados de éster inorgánico de cisteína la viabilidad de las células durante el tiempo es mayor en comparación con los cultivos celulares que utilizan cisteína.

La producción de la proteína recombinante se incrementa adicionalmente cuando se usan derivados de éster inorgánico de cisteína en comparación con el cultivo celular que usa cisteína.

Los efectos positivos de los derivados de éster inorgánico de cisteína pueden ser obtenidos usando una cantidad equivalente a la cantidad de cisteína y/o cistina típicamente usada en los medios de cultivo celular.

Los medios de cultivo celular pulverizado de la presente invención son producidos preferiblemente mezclando todos los componentes y moliéndolos. La mezcla de los componentes es conocida por un experto en la téenica de producción de medios de cultivo celular pulverizados secos por molienda. Preferiblemente, todos los componentes son mezclados perfectamente, de modo que todas las partes de la mezcla tengan casi la misma composición. A mayor uniformidad de la composición, mejor la calidad del medio resultante con respecto al crecimiento celular homogéneo.

La molienda puede ser efectuada por cualquier tipo de molino adecuado para producir medios de cultivo celular pulverizados. Los ejemplos típicos son los molinos de bolas, molinos de perno, molinos de fitz o molinos de chorro. El preferido es un molino de perno, un molino fitz o un molino de chorro, de manera muy preferida un molino de perno.

Un experto en la técnica sabe cómo hacer funcionar esos molinos.

Un equipo de molienda a escala con un diámetro de disco de aproximadamente 40 cm funciona por ejemplo típicamente a 1-6500 revoluciones por minuto en el caso de un molino de perno, se prefieren 1-3000 revoluciones por minuto.

La molienda puede ser efectuada bajo condiciones de molienda estándar que den como resultado polvos con tamaños de partícula entre 10 y 300 mm, de manera más preferible entre 25 y 100 mm.

Preferiblemente, todos los componentes de la mezcla que sean sometidos a molienda son secos. Esto significa que, si comprenden agua, no únicamente comprenden agua de cristalización, pero no más de 10 %, preferiblemente no más de 5 %, de manera más preferida no más de 2 % en peso de moléculas de agua no unidas o no coordinadas.

En una modalidad preferida, la molienda es efectuada en una atmósfera inerte. El gas protector inerte preferido es nitrógeno.

En otra modalidad preferida, todos los componentes de la mezcla son congelados antes de la molienda. La congelación de los ingredientes antes de la molienda puede ser efectuada por cualquier medio que asegure un enfriamiento de los ingredientes a una temperatura inferior a 0°C y de manera más preferible inferior a - 20°C. En una modalidad preferida, la congelación es efectuada con nitrógeno líquido. Esto significa que los ingredientes son tratados con nitrógeno líquido, por ejemplo vertiendo nitrógeno líquido en el recipiente en el cual los ingredientes estén almacenados antes de introducir al molino. En una modalidad preferida, el recipiente es un alimentador. Si el recipiente es un alimentador el nitrógeno líquido es introducido preferiblemente en el lado o cerca del lado del alimentador en el cual sean introducidos los ingredientes.

Típicamente los ingredientes son tratados con el nitrógeno líquido durante 2 a 20 segundos.

Preferiblemente, el enfriamiento de los ingredientes es efectuado de tal manera que todos los ingredientes que entren al molino estén a una temperatura inferior a 0°C, de manera más preferible inferior a -20°C.

En una modalidad preferida, todos los ingredientes son colocados en el recipiente del cual es transferida la mezcla en un alimentador, de manera más preferida en un alimentador de tornillo dosificador. En el alimentador de los ingredientes son a veces mezclados adicionalmente, dependiendo del tipo de alimentador - y enfriados adicionalmente. La mezcla congelada es entonces transferida del alimentador al molino de modo que la mezcla que sea molida en el molino preferiblemente tenga aún una temperatura inferior a 0°C, de manera más preferida inferior a -20°C.

Típicamente el tiempo de mezclado, es decir el tiempo de residencia de la mezcla de los ingredientes, en el alimentador no es mayor de un minuto, preferiblemente entre 15 y 60 minutos.

Un alimentador de tornillo dosificador, también llamado caracol de dosificación, típicamente funciona a una velocidad de 10 a 200 revoluciones por minuto, preferiblemente funciona de 40 a 60 revoluciones por minuto.

Típicamente, la temperatura del molino es mantenida entre -50 y +30°C. En una modalidad preferida, la temperatura es mantenida alrededor de 10 °C.

El nivel de oxígeno durante la molienda preferiblemente es inferior al 10 % (v/v).

El proceso puede ser efectuado por ejemplo por lotes o continuamente. En una modalidad preferida el proceso de acuerdo con la presente invención es efectuado continuamente, durante cierto tiempo, llenando permanentemente la mezcla de ingredientes en un alimentador para enfriar y llenar permanentemente la mezcla fría del alimentador al molino.

Para el uso de los medios pulverizados molidos es agregado un solvente, preferiblemente agua (de manera más particular agua destilada y/o desionizada o agua purificada o agua para inyección) o es agregado un amortiguador acuoso a los medios y los componentes son mezclados hasta que el medio esté totalmente disuelto en el solvente.

El solvente también puede comprender solución salina, ácido soluble o iones básicos que proporcionan un intervalo de pH adecuado (típicamente en el intervalo entre pH 1.0 y pH 10.0), estabilizadores, tensoactivos, preservativos, y alcoholes u otros solventes orgánicos polares.

También es posible agregar sustancias adicionales como sustancias amortiguadoras para ajustar el pH, suero de carnero fetal, azúcares, etc. a la mezcla del medio de cultivo celular y el solvente. El medio de cultivo celular líquido resultante es puesto entonces en contacto con las células que se harán crecer o serán mantenidas.

Mientras que las composiciones de medios que comprenden una concentración mayor de tirosina, por ejemplo lOg/L de L-tirosina, a un pH inferior a 8.5 podrían mostrar turbidez cuando se mezclen con el solvente debido a la tirosina no disuelta, los medios de cultivo celular de acuerdo con la presente invención que usan la misma concentración del derivado de áster inorgánico de tirosina dan soluciones claras.

La presente invención está dirigida además a un proceso para cultivar células a) proporcionando un biorreactor b) mezclando las células a ser cultivadas con un medio de cultivo celular de acuerdo con la presente invención c) incubando la mezcla del paso b) Un biorreactor es cualquier recipiente o tanque en el cual las células puedan ser cultivadas. La incubación es realizada típicamente bajo condiciones adecuadas como temperatura adecuada, etc. Un experto en la téenica está consiente de las condiciones de incubación adecuadas para soportar o mantener el crecimiento/cultivo de células.

Se ha encontrado que la presente invención también es muy adecuada para la preparación de medios de alimentación. Debido a la limitación en la disponibilidad de L-tirosina y L-cisteína - especialmente en las concentraciones necesarias para los medios de alimentación -esas dos moléculas son preparadas típicamente como una solución patrón a pH básico de 1.0-11.5. Este pH tiene un impacto negativo sobre el proceso de bioproducción biofarmaceútica total. El tiempo de mezclado en biorreactores a gran escala y el valor de pH básico en suma afectan negativamente el suministro de nutrientes a las células y en algún grado aceleran la muerte celular por exposición a valores de pH básicos extremos.

Esto da como resultado la liberación de proteínas intracelulares al sobrenadante. Esas proteínas liberadas se adhieren a las células intactas, las cuales se adhieren entonces entre sí y forman agregados. Esos agregados son destruidos por la inercia masiva aumentada y el proceso de bioproducción total comienza a saltar. La disminución de la velocidad punta no es opción, puesto que esos procesos son de cualquier forma regulados cerca de los límites de suministro de oxígeno.

En consecuencia existe la necesidad de medios de alimentación que comprendan todos los componentes necesarios en un alimento y a concentraciones altas. Además el pH del alimento no deberá influenciar negativamente el cultivo celular.

Se ha encontrado que los derivados de éster inorgánico de L-tirosina y L-cisteína tienen mejor solubilidad y/o estabilidad y que pueden ser usados en medios de alimentación altamente concentrados en lugar de L-tirosina y L-cisteína respectivamente sin ningún efecto negativo y algunas veces con un efecto positivo sobre el crecimiento celular y/o productividad a un pH inferior a 8.5.

La presente invención de este modo también está dirigida a un medio de alimentación ya sea en forma de un medio pulverizado o después de la disolución en forma de un medio líquido.

El medio líquido resultante comprende derivados de éster inorgánico de tirosina y/o cisteína en concentraciones de entre 5 y 40 mmol/L, preferiblemente entre 10 y 30 mmol/L y preferiblemente tiene un pH de 8.5 o menos.

En una modalidad preferida, el pH es de entre 6.8 y 8.4.

La presente invención también está dirigida a un proceso de alimentación por lotes para cultivar células en un biorreactor - Llenando en un biorreactor células y un medio de cultivo celular acuoso - Incubando las células en el biorreactor Continuamente durante todo el tiempo de incubación de las células en el biorreactor y una vez o varias veces dentro del tiempo de incubación agregando un medio de cultivo celular, el cual es en este caso un medio de alimentación, al biorreactor por lo que el medio de alimentación preferiblemente tiene un pH de menos de pH 8.5 y comprende al menos un derivado de éster inorgánico de tirosina y/o cisteína. Típicamente un medio de alimentación comprende entre 100 y 150 g/L de ingredientes sólidos que son disueltos en el solvente.

Se ha encontrado que mediante el uso de derivados de éster inorgánico de tirosina y/o cisteína puede ser obtenido un medio de alimentación que comprenda todos los componentes de alimentación necesarios a concentraciones altas (concentración total entre 100 y 150 g/L) . En contraste con procesos conocidos donde dos o más medios de alimentación diferentes necesitan ser alimentados al biorreactor, la presente invención proporciona un medio y un método que permite el uso de un medio de alimentación que comprende todos los componentes en altas concentraciones. Además el pH del medio de alimentación de acuerdo con la invención típicamente es inferior a 8.5. Debido a las limitaciones en la disponibilidad de L-tirosina y L-cisteína en medios de cultivo celular y alimentos esas dos moléculas son típicamente, de acuerdo al estado de la téenica, preparadas como una solución patrón a pH básico de 11.0-11.5. Este pH tiene un impacto negativo sobre el proceso de bioproducción biofarmacéutica total. El tiempo de mezclado en biorreactores a gran escala y el valor de pH básico en suma afectan negativamente el suministro de nutrientes a la célula y en un grado aceleran la muerte celular por exposición a valores de pH básicos extremos. Cuando se usa el derivado de éster inorgánico de tirosina y/o cisteína de acuerdo con la presente invención, el pH del medio de alimentación puede ser mantenidos por debajo de 8.5, aunque no obstante están presentes de 10 a 13 mM del derivado de éster inorgánico de tirosina y/o cisteína en el medio de alimentación con una concentración total entre 100 y 150 g/L.

En consecuencia, en una modalidad preferida, en el proceso de la presente invención el medio de alimentación que es agregado durante la incubación ya sea continuamente o una o varias veces dentro del mismo tiempo al biorreactor siempre tiene la misma composición.

La presente invención es ilustrada mejor por las siguientes Figuras y ejemplos, sin embargo, sin ser restringidos a estos.

Toda la descripción de todas las solicitudes, patentes, y publicaciones citadas anteriormente y más delante de la solicitud EP correspondiente EP 12007711.0, presentada el 14 de Noviembre de 2012, se incorporan por lo tanto como referencia.

Ejemplos Los siguientes ejemplos representan aplicaciones prácticas de la invención.

Ejemplo 1 Síntesis del ácido (S)-2-amino-3-(4-fosfonooxifenil)propiónico y sus sales El ácido (S)-2-amino-3-(4-fosfonooxifenil)propiónico es sintetizado de acuerdo a la literatura (P.F. Alewood, R.B. Johns, R.M. Valerio, Synthesis 1983, 30.) con la conversión subsecuente a sus sales, partiendo de L-tirosina. La Figura 1 muestra el esquema de reacción de la síntesis de la sal disódica.

La variación de la estequiometría y/o el catión de la base permite producir las sales de ácido tirosin fosfórico cargadas una, dos o tres veces o diferentes sales respectivamente. Ácido (S)-2-amino-3-(4-fosfonooxifenil)ropiónico Estructura.

Síntesis: La reacción es llevada a cabo disolviendo 100 g (0.55 mol) de L-tirosina en 400 g (3.48 mol) de ácido ortofosfórico, seguido por la adición de 309 g (2.13 mol) de pentóxido de fósforo en cinco porciones bajo enfriamiento. La solución viscosa es agitada durante 20 h a 80°C, entonces enfriada a 40°C e hidrolizada por adición de 400 mi de agua. La solución es agitada durante una hora adicional a 80°C antes de que sean agregados 3.8 L de n-butanol a 60 “C. Se continúa enfriando alrededor de 3°C y la suspensión resultante es filtrada. Los cristales incoloros obtenidos son lavados consecutivamente con agua, etanol y metil terc-butil éter y entonces secados al vacío a 50°C.

Datos analíticos: RMN-1!! (D2O, 400 MHz): d = 2.94 (dd, 1 H), 3.13 (dd, 1 H), 3.79 (dd, 1 H), 7.8 a 7.18 (m, 4 H).

Sal monosódica de ácido (S)-2-amino-3-(4-fosfonooxifenil) ropiónico Estructura: Datos analíticos R N-1!! (D20, 400 MHz): d = 3.03 (dd, 1 H), 3.21 (dd, 1 H), 3.91 (dd, 1 H), 7.11 - 7.16 (m, 2 H), 7.20 7.25 (m, 2 H). ICP-OES (% p): encontrado 8.3 %, calculado 8.1 %.

Sal disódica de ácido (S)-2-amino-3-(4-fosfonooxifenil)propiónico Estructura Síntesis: Son tomados 50 g (191 ol) de ácido (S)-2-amino-3-(4-fosfonooxifenil)propiónico en 146 mL (402 mmol) de una solución de NaOEt en EtOH (21 % p), antes de ser agregados 12.5 mL de agua. La suspensión incolora es sometida a reflujo durante una hora, enfriada a 0°C y filtrada. El producto incoloro es lavado con etanol y entonces secado al vacío a 50°C.

Datos analíticos: R N-1!! (D20, 400 MHz): d 4 .18 (dd, 1 H), 4.46 (dd, 1 H), 5.12 (dd, 1 H), 8.32 - 8.42 (m, 4 H). ICP-OES (% p): encontrado 14.1 %, calculado 15.1 %.

Sal monopotásica de ácido (S)-2-amino-3-(4-fosfonooxifenil)propiónico Estructura: Datos analíticos: RMN-1!! (D20, 400 MHz): d = 3.08 (dd, 1 H), 3.29 (dd, 1 H), 3.97 (dd, 1 H), 7.16 - 7.22 (m, 2 H), 7.25 - 7.31 (m, 2 H). ICP-OES (% p): encontrado 12.6 %, calculado 13.1 %.

Sal de calcio 2:1 de ácido (S)-2-amino-3-(4-fosfonooxifenil)propiónico Estructura: Datos analíticos: RMN-1H (D20, 400 MHz): d 3 .08 (dd, 1 H), 3.28 (dd, 1 H), 3.97 (dd, 1 H), 7.16 - 7.22 (m, 2 H), 7.25 - 7.31 (m, 2 H). ICP-OES (% p): encontrado 7.2 %, calculado 7.2 %.

Sal de magnesio 2:1 de ácido (S)-2-amino-3-(4-fosfonooxifenil)propiónico Estructura: Datos analíticos: RMN-!H (D20, 400 MHz): d 3 .07 (dd, 1 H), 3.29 (dd, 1 H), 3.97 (dd, 1 H), 7.16 - 7.22 (m, 2 H), 7.25 - 7.31 (m, 2 H). ICP-OES (% p): encontrado 4.3 %, calculado 4.5 %.

Debido a las similitudes espectrales en los espectros de HMN-^-H entre sales de fosfato de tirosina de carga igual, pero solventes separados, se llevó acabo la espectrometría ICP-OES para determinar de manera no ambigua el catión correspondiente.

Ejemplo 2 Síntesis de ácido (S)-2-amino-3-(4-sulfonooxifenil)propiónico y sus sales El ácido (S)-2-amino-3-(4-sulfonooxifenil)-propiónico puede ser sintetizado de acuerdo con la literatura (*S. Futaki, T. Taike, T. Yagami, T. Ogawa, T. Akita, K. Kitagawa, J: Chem. Soc. Perkin Trans/1990 , 1739.) con posible conversión subsecuente a sus sales, partiendo de L-tirosina.

La Figura 2 muestra el esquema de reacción de la síntesis de la sal sódica.

La variación de la estequiometría y/o el catión de la base permite producir las sales de ácido sulfónico de tirosina de una o dos cargas o diferentes sales, respectivamente.

Ejemplo 3 Solubilidad en agua La solubilidad de L-tirosina (compuesto DI), (S)-2- amino-3-(4-fosfonooxifenil)propiónico (compuesto D2), sal sódica del ácido (S)-2-amino-3-(4-fosfonooxifenil)propiónico (compuesto D3) y sal sódica del ácido (S)-2-amino-3-(4-fosfonooxifenil)propiónico (compuesto D4) en agua es probada a 20, 25 y 30°C. La Tabla 1 muestra los resultados. emi 4 Solubilidad en medio de cultivo celular complejo El Medio de Eagle Modificado de Dulbecco, también conocido como DMEM, es un medio con frecuencia usado para hacer crecer células de animal. Los ingredientes de DMEM son en mg/L: Sales inorgánicas: CaCl2 (Anhidro): 200.00 Fe(N03)· 9H2O: 0.10 KC1: 400.00 MgSC>4 (anhidro): 97.67 NaCl: 6400.00 NaH2P04 · H20: 125.00 Otros componentes D-Glucosa: 4500.00 Piruvato de sodio: 110.00 Pluronic® 1000.00 Hepes 15 mM aminoácidos: L-Arginina · HCl: 84.00 L-Cistina · 2HC1: 63.00 L-Glutamina: 584.00 Glicina: 30.00 L-Histidina · HCl H2 O: 42.00 L-Isoleucina: 105.00 L-Leucina: 105.00 L-Lisina HCl: 146.00 L-Metionina: 30.00 L-Fenilalanina: 66.00 L-Serina: 42.00 L-Treonina: 95.00 L-Triptófano: 16.00 L-Tirosina 2Na · 2H20: 248.00 L-Valina 94 00 Vitaminas: D-Pantotenato de calcio: 4.00 Cloruro de colina: 4:00 Ácido fólico: 4.00 i-Inositol: 7.20 Niacinamida: 4.00 Riboflavina: 0.40 Tiamina · HCl: 4.00 Es preparada la misma composición de medios pero la L-Tirosina 2Na · 2H20 es sustituida por la sal disódica de ácido (S)-2-amino-3-(4-fosfonooxifenil)propiónico en la relación molar equivalente.

Para ambas composiciones de medios, todos los ingredientes son mezclados y molidos de acuerdo al método de la presente invención que comprende un caracol de dosificación y un molino de perno.

El medio de cultivo celular pulverizado resultante es disuelto en agua desionizada a 25°C. La solubilidad es medida después de 10 minutos de mezclado (en un matraz con un agitador). Mientras que la composición de medios con derivado de tirosina fosforilada es una solución clara, la composición que comprende L-tirosina no es clara, sino que muestra turbidez.

Experimentos de cultivo celular Ejemplo 5 Los datos para este experimento se muestran en la Figura 3. Experimento en lotes en medio definido químicamente donde la tirosina fue reemplazada por sales de PTyr. PTyr significa sal de ácido (S)-2-Amino-3-(4- fosfononooxifenil)propiónico. Si la concentración de PTyr usada fue la misma que la concentración de Tirosina en el medio, las células no crecieron (no se muestra). Si se disolvió a una concentración de 4.5 mM en CDM (contra 1 mM en el control), las células pudieron crecer, mostrando una densidad de células viables máxima aún mayor que en el control y un crecimiento extendido total (2 días). El análisis posterior indicó que el crecimiento inicial fue posible a través de la tirosina libre proveniente de la síntesis del derivado de PTyr (impurezas de síntesis del 5 % (w/w)). El crecimiento extendido pudo ser atribuido al efecto directo de PTyr después de la escisión metabólica en tirosina libre y fosfato.

Ejemplo 6 Los datos de este experimento se muestran en la Figura 4. Experimento en lotes en medio definido químicamente donde la cisteína fue reemplazada por sal sódica de S-sulfocisteína (concentración equivalente). El polvo CDM usado como base era pobre en Cisteína y Cistina y suplementado durante la reconstitución con Cisteína para las condiciones control (1.5 y 3 mM) o con sal sódica de S-sulfocisteína para las condiciones de prueba (1.5 y 3 mM). Las células mostraron un crecimiento comparable si se cultivaron en medio definido químicamente que contenía Cisteína y sal sódica de S-sulfocisteína mostrando que la sal sódica de S-sulfocisteína puede ser usado como reemplazo de la cisteína.

Ejemplo 7 Las Figuras 5 y 6 muestran la densidad celular viable y la concentración de IgG durante el tiempo en un proceso de alimentación por lotes. Las células CHO recombinantes crecieron en medio basal completamente definido químicamente y una alimentación que contenía sales de fosfo-Tyr a pH 7.0 es agregada los días 3, 5, 7 y 9 (adición en % v/v de 3 %, 6 %, 6 %, 6 %). La condición 1 correspondiente a la sal disódica de PTyr, la condición 2 corresponde a la sal potásica de PTyr y la condición 3 corresponde a la sal de Magnesio de PTyr solubilizada a una concentración de 30 mM en el alimento a pH neutro. En esos casos, la Cisteína es aún agregada como un alimento separado a pH 11.

El proceso es efectuado en tubos de centrífuga de 30 mL a 37 °C, 5 % de CO2, agitación de 320 rpm. Para el control de acuerdo con el estado de la téenica, la tirosina 2Na+ y Cisteína son solubilizadas a pH 11 en una alimentación separada y agregadas los días 3, 5, 7, 9 en %(v/v) de 0.3 %, 0.6 %, 0.6 % y 0.6 %. En consecuencia, la alimentación principal no contiene ninguna de la cisteína y tirosina y es agregada como se describió anteriormente.

La concentración de glucosa es medida diariamente y ajustada en consecuencia para mantener una concentración de > 2 g/L.

Puede observarse que las 3 sales de fosfo-Tyr (sodio, potasio, magnesio) pueden ser usadas en alimentaciones neutras altamente concentradas en el proceso de alimentación por lotes sin impacto negativo sobre el crecimiento o título, simplificando de este modo el proceso total.

Ejemplo 8 Las Figuras 7 y 8 muestran la densidad celular viable y la concentración de IgG durante el tiempo en un proceso de alimentación por lotes. Las células CHO recombinantes se hacen crecer en medio basal completamente definido químicamente en una alimentación que contiene S-sulfocisteína y PTyr 2Na+ a pH 7.0. La alimentación es agregada el día 3, 5, 7, 9 y 14 (adición de % v/v de 3 %, 6 %, 6 %, 6 %, 3 %). El proceso es efectuado en biorreactores de 1.2 L a 37 °C, pH 7.0, 50 % de oxígeno disuelto, agitación de 140 rpm. Para el control, de acuerdo al estado de la téenica, la tirosina 2Na+ y Cisteína son solubilizadas a pH 11 en una alimentación separada y agregada hacia el día 3, 5, 7, 9, 14 en %(v/v) de 0.3 %, 0.6 %, 0.6 %, 0.6 %, 0.3 %. La concentración de glucosa es medida diariamente y ajustada en consecuencia para mantener una concentración de > 2 g/L Puede observarse que el uso de S-sulfocisteína en la alimentación principal (aquí en combinación con PTyr 2Na+) induce un crecimiento extendido en comparación con el control y muestra un incremento significativo en el título.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (15)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama, propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un medio de cultivo celular, caracterizado porque comprende un derivado de éster inorgánico de tirosina y/o cisteína.

2. El medio de cultivo celular de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el medio de cultivo celular comprende un derivado fosforilado y/o sulfonado de tirosina y/o cisteína.

3. El medio de cultivo celular de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque el medio de cultivo celular comprende uno o más de los componentes de fórmulas I y II: con R siendo fosfonatos o sulfonatos o sales de los mismos.

4. El medio de cultivo celular de conformidad con una o más de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el éster inorgánico de tirosina es ácido (S)-2-Amino-3-(4-fosfonooxifenil)propiónico o sales del mismo.

5. El medio de cultivo celular de conformidad con una o más de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el derivado de éster inorgánico de tirosina es sal disódica de ácido (S)-2-Amino-3-(4-fosfonooxifenil)propiónico.

6. El medio de cultivo celular de conformidad con una o más de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el medio de cultivo celular es un medio en polvo seco.

7. El medio de cultivo celular de conformidad con una o más de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el medio de cultivo celular es un medio de alimentación.

8. El medio de cultivo celular de conformidad con una o más de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el medio de cultivo celular es un medio líquido que tiene un pH de 8.5 o menos y que comprende al menos un derivado de éster inorgánico de tirosina y/o cisterna.

9. Un método para producir un medio de cultivo celular de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque comprende: a) mezclar uno o más derivados de éster inorgánico de L-tirosina y/o L-cisteína con los otros componentes del medio de cultivo celular b) someter la mezcla del paso a) a molienda.

10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el paso b) es efectuado con un molino de perno, molino de fitz o molino de chorro.

11. El método de conformidad con la reivindicación 9 o 10, caracterizado porque la mezcla del paso a) es enfriada a una temperatura inferior a 0 °C antes de la molienda.

12. La sal disódica, sal dipotásica, sal monopotásica, sal de calcio 2:1 y sales de magnesio de ácido (S)-2-Amino-3-(4-fosfonooxifenil)propiónico.

13. Un proceso para cultivar células, caracterizado porque comprende a) proporcionar un biorreactor b) mezclar las células a ser cultivadas con un medio de cultivo de conformidad con una o más de las reivindicaciones 1 a 8. c) incubar la mezcla del paso b)

14. Un proceso de alimentación por lotes para cultivar células en un biorreactor, caracterizado porque comprende - Llenar en un biorreactor células y un medio de cultivo celular acuoso - Incubar las células en el biorreactor Continuamente durante todo el tiempo de incubación de las células en el biorreactor o una vez o varias veces dentro del tiempo de incubación agregar un medio de cultivo celular, el cual es en este caso un medio de alimentación, al biorreactor, por lo que el medio de alimentación tiene un pH de menos de pH 8.5 y comprende al menos un derivado de éster inorgánico de tirosina y/o cisteína.

15. El proceso de alimentación por lotes de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el medio de alimentación comprende al menos un derivado de éster inorgánico de tirosina y/o cisteína en una concentración entre 10 y 30 mmol/L.