BR122020000038B1

BR122020000038B1 - Meio de cultura de células compreendendo o ácido (s)-2-amino-3 - sulfossulfanilpropanóico, processo para cultivar células e processo em batelada alimentada para a cultura de células em um biorreator

Info

Publication number: BR122020000038B1
Application number: BR122020000038-4A
Authority: BR
Inventors: Joerg Von Hagen; Marcel André Breuning; Christian Jasper
Original assignee: Merck Patent Gmbh
Priority date: 2012-11-14
Filing date: 2013-11-14
Publication date: 2021-11-03
Also published as: MX358095B; CN104812891A; AR117697A2; CA3112061A1; JP6433429B2; BR112015010948A2; DK2920296T3; US20180230422A1; CA2891279A1; JP2019030334A; ES2827701T3; EP2920296A1; AR093460A1; US10030225B2; BR112015010948B1; CA3112061C; WO2014075807A1; CN104812891B; EP2920296B1; CA2891279C

Abstract

a presente invenção refere-se a meios de cultura de células que compreendem derivados de ésteres inorgânicos de tirosina e/ou de cisteína. a fraca solubilidade da tirosina e a estabilidade frequentemente não suficiente da cisteína em meios de cultura de células são superadas através da substituição das mesmas por um derivado de éster inorgânico, por exemplo, por um derivado fosforilado.

Description

[001] A presente invenção refere-se a meios de cultura de células que compreendem derivados de ésteres inorgânicos de tirosina e/ou de cisteína. A fraca solubilidade da tirosina e a estabilidade frequentementenão suficiente da cisteína em meios de cultura de células são superadas pela substituição das mesmas por um derivado de éster inorgânico, por exemplo, por um derivado fosforilado.

[002] Os meios de cultura de células sustentam e mantêm o crescimento de células em um ambiente artificial.

[003] Dependendo do tipo de organismo cujo crescimento deve ser sustentado, os meios de cultura de células compreendem uma mistura complexa de componentes, algumas vezes mais de uma centena de componentes diferentes.

[004] Os meios de cultura de células requeridos para a propaga ção de células de mamíferos, insetos ou plantas são tipicamente muito mais complexos que os meios para sustentar o crescimento de bactérias e leveduras.

[005] Os primeiros meios de cultura de células que foram desen volvidos consistiam de componentes não definidos, tal como plasma, soro, extratos embrionários ou outros extratos biológicos não definidos ou peptonas. Foi assim feito um avanço importante com o desenvolvimento de meios quimicamente definidos. Os meios quimicamente definidos frequentemente compreendem, mas não estão exclusivamente limitados a aminoácidos, vitaminas, sais metálicos, antioxidantes, que- lantes, fatores de crescimento, tampões, hormônios e muitas mais substâncias conhecidas pelos peritos na arte.

[006] Alguns meios de cultura de células são oferecidos na forma de líquidos aquosos esterilizados. A desvantagem de meios de cultura de células líquidos é sua vida de prateleira reduzida e dificuldades para remessa e armazenamento. Como uma consequência, muitos meios de cultura de células são atualmente apresentados na forma de misturas de pós secos finamente triturados. Estes são manufaturados com a finalidade de dissolução em água e/ou soluções aquosas e no estado dissolvido são planejados, frequentemente com outros suplementos, para o suprimento das células com uma base de nutrientes substancial para o crescimento e/ou para a produção de agentes bio- farmacêuticos partindo das ditas células.

[007] A maioria das plataformas de produção de biofarmacêuticos se baseia em protocolos de cultura de células em batelada alimentada. A meta tipicamente é desenvolver processos de cultura de células em altos títulos para satisfazer as demandas de mercado crescentes e reduzir os custos de manufatura. Além do uso de linhagens de células recombinantes de alto desempenho, melhorias nos meios de cultura de células e nos parâmetros do processo são necessárias para resultar nos potenciais de produção máximos.

[008] Em um processo em batelada alimentada, um meio basal sustenta o crescimento e a produção iniciais e um meio de alimentação previne a eliminação de nutrientes e mantém a fase de produção. Os meios são escolhidos para fornecer as exigências metabólicas distintas durante fases de produção diferentes. Os ajustes de parâmetros do processo — incluindo estratégia de alimentação e parâmetros de controle — definem os ambientes químicos e físicos adequados para o crescimento das células e para a produção de proteínas.

[009] A otimização do meio de alimentação é o aspecto principal na otimização de um processo em batelada alimentada.

[0010] Na maioria das vezes o meio de alimentação é altamente concentrado para evitar a diluição do biorreator. A adição controlada do nutriente afeta diretamente a taxa de crescimento da cultura.

[0011] Um fator limitante para a preparação de meios de cultura de células partindo de pó seco é a fraca solubilidade ou estabilidade de alguns componentes, especialmente a fraca solubilidade ou estabilidade dos aminoácidos L-tirosina e L-cisteína. Para L-tirosina, a fraca solubilidadeé o problema principal, enquanto que para L-cisteína, problemas de estabilidade predominam.

[0012] Consequentemente seria favorável encontrar uma maneira de aprimorar a solubilidade e/ou a estabilidade da L-tirosina e da L- cisteína.

[0013] Foi observado que derivados de ésteres inorgânicos de L- tirosina e L-Cisteína possuem uma maior solubilidade e/ou estabilidade e podem ser utilizados em meios de cultura de células ao invés de L-tirosina e L-cisteína respectivamente sem qualquer efeito negativo e algumas vezes até mesmo efeito positivo sobre o crescimento das células.

[0014] Foi ainda descoberto que tais derivados de ésteres inorgâ nicossão especialmente adequados para a preparação de soluções para alimentação que possuem um pH de não mais que pH 8,5 e que possuem altas concentrações de tirosina e cisteína que estão em uma forma adequada como um nutriente para as células.

[0015] A presente invenção é, portanto, direcionada a meios de cultura de células que compreendem pelo menos um derivado de éster inorgânico de tirosina e/ou de cisteína.

[0016] Em uma modalidade preferida, o derivado de éster inorgâ nicoé um derivado de éster de sulfato ou um derivado de éster de fosfato.

[0017] Em uma modalidade preferida o meio de cultura de células compreende um ou mais dos componentes da fórmula I e/ou II:

[0018] Em uma modalidade preferida, o derivado de éster inorgâ nico de tirosina é o ácido (S)-2-Amino-3-(4-fosfonoóxi-fenil)-propiônico ou sais do mesmo.

[0019] Em outra modalidade preferida, o derivado de cisteína é o ácido (S)-2-amino-3-sulfossulfanilpropanóico ou sais do mesmo.

[0020] Em uma modalidade preferida o derivado fosforilado de ti- rosina é o sal dissódico do ácido (S)-2-Amino-3-(4-fosfonoóxi-fenil)- propiônico.

[0021] Em uma modalidade preferida o derivado sulfonado de cis- teína é o sal de sódio do ácido (S)-2-amino-3-sulfosulfanilpropanóico.

[0022] Em uma modalidade preferida, o meio de cultura de células é um meio em pó seco.

[0023] Em outra modalidade preferida, o meio de cultura de célu lasé um meio de alimentação.

[0024] Em outra modalidade preferida o meio de cultura de células é um meio líquido que possui um pH de 8,5 ou menor e que compreende pelo menos um derivado de éster inorgânico de tirosina e/ou de cisteína em uma concentração entre 5 e 40 mmols/L, preferencialmente entre 10 e 30 mmols/L.

[0025] Em uma modalidade preferida o pH do meio líquido fica en- tre 6,5 e 8,5, mais preferido entre 6,8 e 7,8.

[0026] Em uma modalidade, o meio de cultura de células compre ende pelo menos um ou mais componentes sacarídicos, um ou mais aminoácidos, uma ou mais vitaminas ou precursores de vitaminas, um ou mais sais, um ou mais componentes tamponadores, um ou mais cofatores e um ou mais componentes de ácidos nucleicos.

[0027] A presente invenção é adicionalmente direcionada a um método para a produção de um meio de cultura de células de acordo com a presente invenção através da a) mistura de um ou mais derivados de ésteres inorgânicos de L- tirosina e/ou L- cisteína com os outros componentes do meio de cultura de células b) submissão da mistura da etapa a) à moagem

[0028] Em uma modalidade preferida a etapa b) é realizada em um moinho de pino, um moinho Fitz ou um moinho de jato.

[0029] Em outra modalidade preferida, a mistura da etapa a) é res friadaaté uma temperatura abaixo de 0°C antes da moagem.

[0030] A presente invenção é adicionalmente direcionada ao sal dissódico, ao sal dipotássico, ao sal monopotássico, ao sal de cálcio 2:1 e aos sais de magnésio do ácido (S)-2-Amino-3-(4-fosfonoóxi- fenil)-propiônico.

[0031] A presente invenção é adicionalmente direcionada a um processo para a cultura de células através de a) fornecimento de um biorreator b) mistura das células que serão cultivadas com um meio de cultura de células de acordo com a presente invenção. c) incubação da mistura da etapa b).

[0032] A presente invenção também é direcionada a um processo em batelada alimentada para a cultura de células em um biorreator através de - Enchimento em um biorreator de células e um meio de cul tura de células aquoso - Incubação das células no biorreator - Continuamente ao longo de todo o tempo da incubação das células no biorreator ou uma ou várias vezes dentro do dito tempo de incubação adição de meio de cultura de células, que é neste caso um meio de alimentação, ao biorreator em que o meio de alimentação possui um pH menor que pH 8,5 e compreende pelo menos um derivado de éster inorgânico de tirosina e/ou de cisteína.

[0033] Preferencialmente o meio de alimentação compreende pelo menos um derivado de éster inorgânico de tirosina e/ou de cisteína em uma concentração entre 10 e 50 mmols/L, preferencialmente entre 15 e 30 mmols/L.

[0034] A Figura 1 mostra o esquema de reação para a produção do ácido (S)-2-Amino-3-(4-fosfonoóxi-fenil)-propiônico. Detalhes adicionais podem ser encontrados no Exemplo 1.

[0035] A Figura 2 mostra o esquema de reação para a produção do ácido (S)-2-Amino-3-(4-sulfonoóxi-fenil)-propiônico. Detalhes adicionais podem ser encontrados no Exemplo 2.

[0036] As Figuras 3 e 4 mostram experimentos de crescimento das células em batelada utilizando um meio de cultura de células de acordo com a presente invenção. Detalhes adicionais podem ser encontrados nos Exemplos 5 e 6.

[0037] As Figuras 5 e 6 mostram os resultados de um experimento de cultura de células em batelada alimentada em que a batelada alimentada otimizada de acordo com a invenção com sais do ácido (S)-2- Amino-3-(4-sulfonoóxi-fenil)-propiônico é utilizada. Detalhes podem ser encontrados no Exemplo 7.

[0038] As Figuras 7 e 8 mostram os resultados de um experimento de cultura de células em batelada alimentada em que a batelada alimentada otimizada de acordo com a invenção com sais do ácido (S)-2- Amino-3-(4-sulfonoóxi-fenil)-propiônico e o sal de sódio do ácido (S)-2- Amino-3-sulfosulfanil-propiônico é utilizada. Detalhes podem ser encontrados no Exemplo 8.

[0039] Um derivado de éster inorgânico de acordo com a presente invenção é um produto, por exemplo, que pode ser obtido através da condensação de um oxo ácido inorgânico e tirosina ou cisteína. Os exemplos de oxo ácidos inorgânicos são, por exemplo, ácido fosfórico, ácido sulfúrico, ácido nítrico e ácido bórico. São preferidos os derivados de ésteres inorgânicos derivados de ácido sulfúrico ou ácido fosfórico. Os derivados de ésteres inorgânicos são assim os ésteres dos oxo ácidos inorgânicos e cisteína ou tirosina e seus sais. Os exemplos de derivados de ésteres inorgânicos de tirosina adequados são o ácido (S)-2-Amino-3-(4-fosfonoóxi-fenil)-propiônico bem como o sal monos- sódico, o sal dissódico, o sal monopotássico, o sal dipotássico, o sal de cálcio e o sal de magnésio do ácido (S)-2-Amino-3-(4-fosfonoóxi- fenil)-propiônico.

[0040] Os derivados preferidos de ésteres inorgânicos também podem ser mostrados pelas fórmulas I e II a seguir:

com R sendo

e X e Y sendo independentemente um do outro H, Li, Na, K, ^ Ca, ^ Mg, preferencialmente H, Na, K. O termo ácido propanóico também pode ser utilizado ao invés do termo ácido propiônico.

[0041] Um meio de cultura de células de acordo com a presente invenção é qualquer mistura de componentes que mantém e/ou sustentar o crescimento das células in vitro. Este poderia ser um meio complexo ou um meio quimicamente definido. O meio de cultura de células pode compreender todos os componentes necessários para manter e/ou sustentar o crescimento das células in vitro ou apenas alguns componentes de forma que componentes adicionais são adicionados separadamente. Os exemplos de meios de cultura de células de acordo com a presente invenção são meios completos que compreendem todos os componentes necessários para manter e/ou sustentar o crescimento das células in vitro bem como suplementos ou alimentações de meios. Em uma modalidade preferida o meio de cultura de células é um meio completo ou um meio de alimentação. Um meio completo também chamado de meio basal tipicamente possui um pH entre 6,8 e 7,8. Um meio de alimentação preferencialmente possui um pH abaixo de 8,5.

[0042] Tipicamente, os meios de cultura de células de acordo com a invenção são utilizados para manter e/ou sustentar o crescimento de células em um biorreator.

[0043] Uma alimentação ou meio de alimentação é um meio de cultura de células que não é o meio basal que sustenta o crescimento e a produção iniciais em uma cultura de células, mas o meio que é adicionado em um estágio tardio para prevenir a eliminação de nutrientes e sustenta a fase de produção. Um meio de alimentação pode ter concentrações mais altas de alguns componentes quando comparado com um meio de cultura basal. Por exemplo, alguns componentes, tais como, por exemplo, nutrientes que incluem aminoácidos ou carboidratos, podem estar presentes no meio de alimentação a aproximadamente 5X, 6X, 7X, 8X, 9X, 10X, 12X, 14X, 16X, 20X, 30X, 50X, 100x, 200X, 400X, 600X, 800X ou ainda aproximadamente 1000X das concentrações em um meio basal.

[0044] Um meio de cultura de células de mamífero é uma mistura de componentes que mantêm e/ou sustentam o crescimento in vitro de células de mamífero. Os exemplos de células de mamífero são células humanas ou de animais, preferencialmente células CHO, células COS, células I VERO, células BHK, células AK-1, células SP2/0, células L5.1, células de hibridoma ou células humanas.

[0045] Os meios de cultura de células quimicamente definidos são meios de cultura de células que não compreendem quaisquer substâncias não definidas quimicamente. Isto significa que a composição química de todos os reagentes químicos no meio é conhecida. Os meios quimicamente definidos não compreendem qualquer levedura, tecidos de animais ou de plantas; não compreendem células alimenta- doras, soro, extratos ou produtos de digestão ou outros componentes que podem contribuir com proteínas insuficientemente definidas quimicamente para o meio. Os componentes não definidos quimicamente ou químicos insuficientemente definidos são aqueles cujas composição e estrutura químicas não são conhecidas, estão presentes em composição variável e poderiam apenas ser definidos com enorme esforço experimental - comparável com a avaliação da composição e a estrutura químicas de uma proteína como a albumina ou a caseína.

[0046] Um meio de cultura de células em pó ou um meio em pó seco é um meio de cultura de células tipicamente resultante de um processo de moagem ou de um processo de liofilização. Isto significa que o meio de cultura de células em pó é um meio particulado granular - não um meio líquido. O termo "pó seco" pode ser utilizado de forma intercambiável com o termo "pó"; entretanto, "pó seco" como é utilizado aqui simplesmente refere-se à aparência grosseira do material granulado e não é pretendido que signifique que o material está completamente livre de solvente complexado ou aglomerado a não ser que seja indicado de outra forma.

[0047] As células que serão cultivadas com os meios de acordo com a presente invenção podem ser células procarióticas como células bacterianas ou células eucarióticas como células de plantas ou de animais. As células podem ser células normais, células imortalizadas, células doentes, células transformadas, células mutantes, células somáticas, células germinativas, células tronco, células precursoras ou células embrionárias, das quais qualquer uma pode ser linhagens de células estabelecidas ou transformadas ou obtidas de fontes naturais.

[0048] O tamanho de uma partícula significa o diâmetro médio da partícula. O diâmetro da particular é determinado por dispersão de luz a laser em óleo de silicone.

[0049] Uma atmosfera inerte é gerada através do preenchimento do respectivo recipiente ou equipamento com um gás inerte. Os gases inertes adequados são gases nobres como argônio ou preferencialmentenitrogênio. Estes gases inertes não são reativos e previnem que reações químicas indesejáveis ocorram. No processo de acordo com a presente invenção, a geração de uma atmosfera inerte significa que a concentração de oxigênio é reduzida abaixo de 10% (v/v) absoluto, por exemplo, através da introdução de nitrogênio líquido ou gás nitrogênio.

[0050] Tipos diferentes de moinhos são conhecidos por um perito na arte.

[0051] Um moinho de pino, também chamado de moinho de im pactocentrífugo, pulveriza sólidos em que os pinos projetados sobre discos de rotação em alta velocidade fornecem a energia de rompimento. Os moinhos de pino são, por exemplo, vendidos por Munson Machinery (EUA), Premium Pulman (Índia) ou Sturtevant (EUA).

[0052] Um moinho de jato utiliza gás comprimido para acelerar as partículas, fazendo com que tenham impacto contra cada outro na câmara de processo. Os moinhos de jato são, por exemplo, vendidos por Sturtevant (EUA) ou PMT (Áustria).

[0053] Um moinho Fitz comercializado pela Fitzpatrick (EUA), utili za um rotor com lâminas para moagem.

[0054] Um processo que é executado continuamente é um proces so que não é executado em bateladas. Se um processo de moagem for executado continuamente, isto significa que os ingredientes do meio são permanentemente e constantemente alimentados para dentro do moinho ao longo de certo tempo.

[0055] Os meios de cultura de células, especialmente os meios completos, de acordo com a presente invenção tipicamente compreendem pelo menos um ou mais componentes sacarídicos, um ou mais aminoácidos, uma ou mais vitaminas ou precursores de vitaminas, um ou mais sais, um ou mais componentes tamponadores, um ou mais cofatores e um ou mais componentes de ácidos nucleicos.

[0056] Os meios também podem compreender piruvato de sódio, insulina, proteínas vegetais, ácidos graxos e/ou derivados de ácidos graxos e/ou ácido plurônico e/ou componentes tensoativos como ten- soativos não iônicos preparados quimicamente. Um exemplo de um tensoativo não iônico adequado é tensoativos de copolímeros em blocos bifuncionais que terminam em grupos hidroxila primários também chamados de poloxâmeros, por exemplo, disponíveis sob a marca re- gistrada Pluronic ® da BASF, Alemanha.

[0057] Os componentes sacarídicos são todos mono ou dissacarí- deos, como glicose, galactose, ribose ou frutose (exemplos de monos- sacarídeos) ou sacarose, lactose ou maltose (exemplos de dissacarí- deos).

[0058] Os exemplos de aminoácidos de acordo com a invenção são tirosina, os aminoácidos proteinogênicos, especialmente os ami- noácidos essenciais, leucina, isoleucina, lisina, metionina, fenilalanina, treonina, triptofano e valina, bem como os aminoácidos não proteino- gênicos como D-aminoácidos.

[0059] Tirosina significa L- ou D- tirosina, preferencialmente L- tirosina.

[0060] Cisteína significa L- ou D-cisteína, preferencialmente L- cisteína.

[0061] Os exemplos de vitaminas são Vitamina A (Retinol, retinal, vários retinoides e quatro carotenoides), Vitamina B1 (Tiamina), Vitamina B2 (Riboflavina), Vitamina B3 (Niacina, niacinamida), Vitamina B5 (ácido Pantotênico), Vitamina B6 (Piridoxina, piridoxamina, pirido- xal), Vitamina B7 (Biotina), Vitamina B9 (Ácido fólico, ácido folínico), Vitamina B12 (Cianocobalamina, hidroxicobalamina, metilcobalamina), Vitamina C (Ácido ascórbico), Vitamina D (Ergocalciferol, colecalciferol), Vitamina E (Tocoferóis, tocotrienóis) e Vitamina K (filoquinona, menaquinonas). Os precursores de vitaminas também são incluídos.

[0062] Os exemplos de sais são componentes que compreendem íons inorgânicos tais como bicarbonato, cálcio, cloreto, magnésio, fosfato, potássio e sódio ou elementos traços tais como Co, Cu, F, Fe, Mn, Mo, Ni, Se, Si, Ni, Bi, V e Zn. Os exemplos são Sulfato de cobre(ll) penta-hidratado (CuSO4.5H2O), Cloreto de Sódio (NaCI), Cloreto de cálcio (CaCI2.2H2O), Cloreto de potássio (KCI), Sulfato de ferro(ll), fosfato de sódio monobásico anidro (NaH2PO4), Sulfato de magnésio ani- dro (MgSO4), fosfato de sódio dibásico anidro (Na2HPO4), Cloreto de magnésio hexahidratado (MgCI2.6H2O), sulfato de zinco hepta- hidratado.

[0063] Os exemplos de tampões são CO2/HCO3 (carbonato), fosfa to, HEPES, PIPES, ACES, BES, TES, MOPS e TRIS.

[0064] Os exemplos de cofatores são derivados de tiamina, bioti na, vitamina C, NAD/NADP, cobalamina, mononucleotídeo de flavina e derivados, glutationa, fosfatos de heme nucleotídeos e derivados.

[0065] Os componentes de ácidos nucleicos, de acordo com a presente invenção, são as nucleobases, como citosina, guanina, ade- nina, timina ou uracil, os nucleosídeos como citidina, uridina, adenosi- na, guanosina e timidina e os nucleotídeos como monofosfato de ade- nosina ou difosfato de adenosina ou trifosfato de adenosina.

[0066] Os meios de alimentação podem ter uma composição dife rente comparada à dos meios completos. Estes tipicamente compre-endemaminoácidos, elementos traços e vitaminas. Também poderiam compreender componentes sacarídicos, mas algumas vezes por razões de produção os componentes sacarídicos são adicionados em uma alimentação separada.

[0067] Um meio de alimentação adequado poderia, por exemplo, compreender um ou mais dos compostos a seguir: L-ASPARAGINA MONO-HIDRATADA L-ISOLEUCINA L-FENILALANINA L-GLUTAMATO DE SÓDIO MONO-HIDRATADO L-LEUCINA L-TREONINA MONOCLORIDRATO DE L-LISINA L-PROLINA L-SERINA MONOCLORIDRATO DE L-ARGININA MONOCLORIDRATO DE L-HISTIDINA MONO-HIDRATADO L-METIONINA L- VALINA MONO-SÓDIO-L-ASPARTATO-MONO-HIDRATADO L-TRIPTOFANO CLORETO DE COLINA MIO-INOSITOL NICOTINAMIDA PANTOTENATO DE CÁLCIO-D(+) CLORIDRATO DE PIRIDOXINA CLORIDRATO DE CLORETO DE TIAMINA VITAMINA B12 (CIANOCOBALAMINA) MICRONIZADA BIOTINA ÁCIDO FÓLICO RIBOFLAVINA SULFATO DE MAGNÉSIO ANIDRO SULFATO DE COBRE(II) PENTA-HIDRATADO SULFATO DE ZINCO HEPTA-HIDRATADO DICLORIDRATO DE 1,4-DIAMINOBUTANO HEPTAMOLIBDATO DE AMÔNIO TETRA-HIDRATADO SULFATO DE CÁDMIO HIDRATADO CLORETO DE MANGANÊS(II) TETRA-HIDRATADO CLORETO DE NÍQUEL(II) HEXAHIDRATADO META SILICATO DE SÓDIO METAVANADATO DE SÓDIO CLORETO DE ESTANHO(II) DI-HIDRATADO SELENITO DE SÓDIO (APROXIMADAMENTE 45% DE SE) BIFOSFATO DE SÓDIO MONO-HIDRATADO CITRATO DE FERRO(II) AMÔNIO (APROXIMADAMENTE 18% DE FE)

[0068] Congelamento de acordo com a presente invenção significa resfriamento a uma temperatura abaixo de 0°C.

[0069] O ponto principal da presente invenção é fornecer meios de cultura de células em pó que possam ser facilmente dissolvidos em um solvente adequado apenas misturando o pó e o solvente de forma que o pó se dissolva e produza um meio de cultura de células líquido tal como um meio completo, um suplemento de meio, um subgrupo de meio ou uma alimentação com uma concentração desejada e homogênea dos componentes do meio.

[0070] A dissolução simples de um meio de cultura de células em pó é frequentemente complicada por substâncias como tirosina ou cis- teína que possuem uma fraca solubilidade e/ou estabilidade em solventes aquosos. A L-tirosina, por exemplo, possui uma solubilidade de 0,4 g/L em água a uma temperatura de 25°C. Isto significa que aproximadamente 0,4 g de L-tirosina é solúvel em 1 litro de água. Porém, a concentração requerida de tirosina nos meios de cultura de células é frequentemente mais alta. A cisteína tende a formar dímeros sob condições aeróbicas. Tais dímeros são chamados de cistina. Em adição, é sabido que a cisteína forma subprodutos tóxicos com metais como cobre ou ferro que estão frequentemente presentes nos meios de cultura de células. A cisteína ou a cistina presente nos meios de cultura de células pode ser substituída por derivados de ésteres inorgânicos de acordo com a presente invenção que não formam dímeros ou subprodutostóxicos.

[0071] Foi observado que derivados de tirosina e/ou de cisteína fosforilados e/ou sulfonados por um lado tipicamente possuem uma maior solubilidade em soluções aquosas e por outro lado podem ser utilizados como substitutos para tirosina e/ou cisteína/cistina e são igualmente adequados como componente de meios de cultura de célu- las como os aminoácidos nativos tirosina e cisteína. Isto significa que, por exemplo, os meios de cultura de células em que a L-tirosina foi substituída por um ou mais derivados de ésteres inorgânicos de L- tirosina exibem desempenho comparável na cultura de células ao dos meios que compreendem apenas L-tirosina.

[0072] Alguns derivados de ésteres inorgânicos de tirosina e ciste- ína são conhecidos na arte. Nos peptídeos e nas proteínas a fosforila- ção da tirosina desempenha um papel significativo em uma faixa ampla de processos celulares e "liga e desliga" muitas enzimas de proteínas, alterando assim sua função e atividade.

[0073] O sal monossódico do ácido (S)-2-Amino-3-(4-fosfonoóxi- fenil)-propiônico possui número de CAS 146900-49-4. R.H. Plimmer Biochemical Journal (1941), 35, páginas 461-469, divulga a síntese do ácido (S)-2-Amino-3-(4-fosfonoóxi-fenil)-propiônico bem como de seu sal de cálcio 1:1.

[0074] A síntese e as características de novos derivados adicio nais do ácido (S)-2-Amino-3-(4-fosfonoóxi-fenil)-propiônico, como o sal dissódico, o sal dipotássico, o sal monopotássico, o sal de cálcio 2:1 e os sais de magnésio do ácido (S)-2-Amino-3-(4-fosfonoóxi-fenil)- propiônico, são divulgadas aqui.

[0075] Os derivados fosforilados de tirosina adequados de acordo com a presente invenção são aqueles que foram fosforilados no grupo OH fenólico, como o ácido (S)-2-Amino-3-(4-fosfonoóxi-fenil)- propiônico ou sais do mesmo. Em uma modalidade especialmente preferida, o derivado fosforilado de tirosina é um sal do ácido (S)-2- Amino-3-(4-fosfonoóxi-fenil)-propiônico.

[0076] Os derivados sulfonados de tirosina adequados de acordo com a presente invenção são aqueles que foram sulfonados no grupo OH fenólico, como o ácido (S)-2-Amino-3-(4-sulfonoóxi-fenil)- propiônico ou sais do mesmo. Em uma modalidade especialmente pre- ferida, o derivado sulfonado de tirosina é um sal do ácido (S)-2-Amino- 3-(4-sulfonoóxi-fenil)-propiônico.

[0077] Os derivados fosforilados de cisteína adequados de acordo com a presente invenção são aqueles que foram fosforilados no grupo SH da cisteína, como o ácido (S)-2-Amino-3-fosfonosulfanil-propiônico ou sais do mesmo.

[0078] Os derivados sulfonados de cisteína adequados de acordo com a presente invenção são aqueles que foram sulfonados no grupo SH da cisteína, como o ácido (S)-2-Amino-3-sulfosulfanil-propiônico ou sais do mesmo. A síntese do ácido 2-Amino-3-sulfosulfanil-propiônico, também chamado de ácido (S)-2-Amino-3-sulfosulfanil-propanóico, S- sulfo-cisteína ou cisteína-S-sulfato e seus sais é divulgada, por exemplo, em I.H.Segel e M.J.Johnson, Analytical Biochemistry 5, 330-337 e J.S. Church, D.J. Evans, Spectrochimica Acta Parte A 69 (2008) 256262. O sal de sódio também está disponível comercialmente na Ba- chem, Suíça.

[0079] Os sais adequados são sais de metais alcalinos ou de me tais alcalinos terrosos, por exemplo, os sais de lítio, os sais de sódio, os sais de potássio, os sais de cálcio ou os sais de magnésio, são preferidos os sais de sódio, de potássio e o ácido livre, são mais preferidos os sais de sódio.

[0080] No caso de derivados de ésteres inorgânicos de tirosina, o sal dissódico do ácido (S)-2-Amino-3-(4-fosfonoóxi-fenil)-propiônico exibe boa solubilidade.

[0081] Os derivados de ésteres inorgânicos de tirosina e cisteína podem ser produzidos através de qualquer método, por exemplo, en- zimaticamente ou através de síntese química. Preferencialmente os derivados fosforilados de tirosina são produzidos através da reação da tirosina com ácido fosfórico na presença de pentóxido de fósforo. O ácido (S)-2-Amino-3-(4-fosfonoóxi-fenil)-propiônico resultante pode en- tão ser reagido com uma base adequada como hidróxido de sódio, eti- lato de sódio, hidróxido de potássio etc. para fornecer o sal reloperado. Um esquema de reação desta síntese é mostrado na Figura 1.

[0082] A solubilidade do ácido (S)-2-Amino-3-(4-fosfonoóxi-fenil)- propiônico é maior que a da tirosina (ver a tabela 1 no Exemplo 3).

[0083] Para aumentar a solubilidade do derivado de tirosina ou de cisteína ainda mais, um sal pode ser formado através da reação do derivado com uma base adequada como é descrito anteriormente. O sal de sódio do ácido (S)-2-Amino-3-(4-fosfonoóxi-fenil)-propiônico, por exemplo, possui uma solubilidade maior (ver a tabela 1 no Exemplo 3).

[0084] Um meio de cultura de células de acordo com a presente invenção pode compreender um ou mais dos derivados de ésteres inorgânicos de tirosina e/ou de cisteína, por exemplo, uma mistura do sal mono- e dissódico do ácido (S)-2-Amino-3-(4-fosfonoóxi-fenil)- propiônico.

[0085] Foi observado que no caso de serem utilizados derivados de ésteres inorgânicos de tirosina em meios completos é favorável adicionar à composição do meio uma pequena quantidade de tirosina. Isto poderia ser devido ao fato de que algumas células não mostram captação dos derivados de ésteres inorgânicos de tirosina. Os derivados de ésteres inorgânicos de tirosina precisam ser convertidos extra- celularmente na tirosina livre por fosfatases. Tipicamente a quantidade suficiente de fosfatases fica disponível após 2 até 5 dias a partir do início da cultura de células.

[0086] Quando são utilizados derivados de ésteres inorgânicos de tirosina em meios de alimentação recém-adicionados, isto significa que na cultura de células em que as células já foram crescidas durante mais de 2-5 dias em um meio que compreende tirosina, não há necessidade de adicionar tirosina ao meio de alimentação recém-adicionado.

[0087] Consequentemente, em uma modalidade preferida, um meio completo de acordo com a presente invenção compreende pelo menos um derivado de éster inorgânico de tirosina e adicionalmente 5 até 40% (p/p) de tirosina.

[0088] Este efeito não é observado quando são utilizados deriva dos de ésteres inorgânicos de cisteína. Para o uso de derivados de ésteres inorgânicos de cisteína a adição de cisteína não é necessária. Os derivados de ésteres inorgânicos de cisteína podem em cada caso ser utilizados como substituto completo de cisteína ou cistina.

[0089] Em adição, de forma inesperada, os derivados de ésteres inorgânicos de cisteína exibiam um efeito positivo sobre o crescimento e a produtividade das células. Tipicamente, as células crescidas como meios e alimentação que compreendem derivados de ésteres inorgânicos de cisteína exibem um crescimento estendido. Quando são utilizados derivados de ésteres inorgânicos de cisteína a viabilidade das células ao longo do tempo é maior comparada com a das culturas de células utilizando cisteína.

[0090] A produção da proteína recombinante é adicionalmente aumentada quando são utilizados derivados de ésteres inorgânicos de cisteína comparada com a da cultura de células utilizando cisteína.

[0091] Os efeitos positivos de derivados de ésteres inorgânicos de cisteína podem ser obtidos através da utilização de uma quantidade equivalente à quantidade de cisteína e/ou de cistina tipicamente utilizada em meios de cultura de células.

[0092] Os meios de cultura de células em pó da presente invenção são preferencialmente produzidos através da mistura de todos os componentes e da moagem dos mesmos. A mistura dos componentes é conhecida por um perito na arte de produção de meios de cultura de células em pó seco através de moagem. Preferencialmente, todos os componentes são vigorosamente misturados de forma que todas as partes da mistura possuem quase a mesma composição. Quanto mai- or a uniformidade da composição, melhora a qualidade do meio resultante em relação ao crescimento das células homogêneo.

[0093] A trituração pode ser realizada com qualquer tipo de moi nho adequado para a produção de meios de cultura de células em pó. Exemplos típicos são moinhos de bola, moinhos de pino, moinhos Fitz ou moinhos de jato. É preferido um moinho de pino, um moinho Fitz ou um moinho de jato, é muito preferido um moinho de pino.

[0094] Um perito na arte sabe como acionar tais moinhos.

[0095] Um moinho de equipamento em grande escala com um di âmetro de disco de aproximadamente 40 cm é, por exemplo, tipicamente operado em 1-6500 revoluções por minuto no caso de um moinho de pino, são preferidas 1-3000 revoluções por minuto.

[0096] A moagem pode ser realizada sob condições de moagem padronizadas resultando em pós com tamanhos de partícula entre 10 e 300 μm, mais preferencialmente entre 25 e 100 μm.

[0097] Preferencialmente, todos os componentes da mistura que é submetida à moagem são secos. Isto significa, se estes compreenderemágua, estes apenas compreendem água de cristalização, mas não mais que 10%, preferencialmente não mais que 5% mais preferido não mais que 2% em peso de moléculas de água não ligadas ou não coordenadas.

[0098] Em uma modalidade preferida, a moagem é realizada em uma atmosfera inerte. O gás protetor inerte preferido é nitrogênio.

[0099] Em outra modalidade preferida, todos os componentes da mistura são congelados antes da moagem. O congelamento dos ingredientes antes da moagem pode ser realizado através de qualquer meio que garanta um resfriamento dos ingredientes até uma temperatura abaixo de 0°C e mais preferencialmente abaixo de - 20°C. Em uma modalidade preferida o congelamento é realizado com nitrogênio líquido. Isto significa que os ingredientes são tratados com nitrogênio líquido, por exemplo, vertendo nitrogênio líquido dentro do recipiente em que os ingredientes são armazenados antes da introdução no moinho. Em uma modalidade preferida, o recipiente é um alimentador. Se o recipiente for um alimentador o nitrogênio líquido é preferencialmente introduzido na lateral ou próximo ao local do alimentador em que os ingredientes são introduzidos.

[00100] Tipicamente os ingredientes são tratados com o nitrogênio líquido ao longo de 2 até 20 segundos.

[00101] Preferencialmente o resfriamento dos ingredientes é realizado de uma maneira que todos os ingredientes que entram no moinho estejam a uma temperatura abaixo de 0°C, mais preferido abaixo de - 20°C.

[00102] Em uma modalidade preferida, todos os ingredientes são colocados em um recipiente partindo do qual a mistura é transferida em um alimentador, mais preferido em um alimentador de rosca com medidor. No alimentador os ingredientes são algumas vezes adicionalmente misturados - dependendo do tipo de alimentador - e adicionalmente resfriados. A mistura congelada é então transferida do ali- mentador para o moinho de forma que a mistura que é moída no moinho preferencialmente tenha ainda uma temperatura abaixo de 0°C, mais preferido abaixo de - 20°C.

[00103] Tipicamente o tempo de mistura, que significa o tempo de residência da mistura de ingredientes no alimentador é mais de um minuto, preferencialmente entre 15 e 60 minutos.

[00104] Um alimentador de rosca com medidor, também chamado de caracol de dosagem , é tipicamente operado em uma velocidade de 10 até 200 revoluções por minuto, preferencialmente este é operado em 40 até 60 revoluções por minuto.

[00105] Tipicamente, a temperatura do moinho é mantida entre -50 e +30°C. Em uma modalidade preferida, a temperatura é mantida em torno de 10°C.

[00106] O nível de oxigênio durante a moagem preferencialmente fica abaixo de 10% (v/v).

[00107] O processo pode ser realizado, por exemplo, em bateladas ou continuamente. Em uma modalidade preferida o processo de acordo com a presente invenção é realizado continuamente, ao longo de certo tempo, através do enchimento permanentemente da mistura de ingredientes dentro de um alimentador para resfriamento e do enchimento permanentemente da mistura resfriada proveniente do alimen- tador dentro do moinho.

[00108] Para uso dos meios em pó moídos um solvente, preferenci-almenteágua (mais particularmente água destilada e/ou deionizada ou água purificada ou água para injeção) ou um tampão aquoso é adicionado aos meios e os componentes são misturados até que o meio seja totalmente dissolvido no solvente.

[00109] O solvente também pode compreender solução salina, íons ácidos ou básicos solúveis que fornecem uma faixa de pH adequada (tipicamente na faixa entre pH 1,0 e pH 10,0), estabilizantes, tensoati- vos, conservantes e alcoóis ou outros solventes orgânicos polares.

[00110] É também possível adicionar substâncias adicionais como substâncias tamponadoras para o ajuste do pH, soro fetal de bezerro, açúcares etc., à mistura do meio de cultura de células e o solvente. O meio de cultura de células líquido resultante é então colocado em contato com as células que serão crescidas ou mantidas.

[00111] Embora composições de meios que compreendem uma concentração mais alta de tirosina, por exemplo, 10 g/L de L-tirosina, em um pH abaixo de 8,5 exibam turbidez quando misturadas com o solvente devido à tirosina não dissolvida, os meios de cultura de células de acordo com a presente invenção utilizando a mesma concentração do derivado de éster inorgânico de tirosina fornecem soluções translúcidas.

[00112] A presente invenção é adicionalmente direcionada a um processo para a cultura de células através de a) fornecimento de um biorreator b) mistura das células que serão cultivadas com um meio de cultura de células de acordo com a presente invenção c) incubação da mistura da etapa b)

[00113] Um biorreator é qualquer recipiente ou tanque no qual as células podem ser cultivadas. A incubação é tipicamente realizada sob condições adequadas como temperatura adequada etc. Um perito na arte está a par das condições de incubação adequadas para sustentar ou manter o crescimento/cultura de células.

[00114] Foi observado que a presente invenção também é muito adequada para a preparação de meios de alimentação. Devido às limitações na disponibilidade de L-Tirosina e L-Cisteína - especialmente nas concentrações necessárias para os meios de alimentação - estas duas moléculas são tipicamente preparadas na forma de uma solução estoque em pH básico 1,0-11,5. Este pH possui um impacto negative sobre o processo de bioprodução de biofarmacêuticos de forma geral. O tempo de mistura em biorreatores em grande escala e o valor de pH básico em suma afetam negativamente o suprimento de nutrição às células e até alguma extensão aceleram a morte celular através da exposição a valores de pH básicos extremo.

[00115] Isto resulta na liberação de proteínas intracelulares dentro do sobrenadante. Estas proteínas liberadas se aderem à célula intacta, que então se grudam uma com as outras e formam agregados. Estes agregados são destruídos pela inércia da massa aumentada e o processo de bioprodução geral começa a falhar. A redução da velocidade da ponta não é opção uma vez que estes processos são de qualquer maneira regulados próximos a limites de suprimento de oxigênio.

[00116] Consequentemente há uma necessidade de meios de alimentação que compreendem todos os componentes necessários em uma alimentação e em altas concentrações. Em adição o pH da alimentação não deve influenciar negativamente a cultura de células.

[00117] Foi observado que os derivados de ésteres inorgânicos de L-tirosina e L-Cisteína possuem solubilidade e/ou estabilidade aprimorada e podem ser utilizados em meios de alimentação altamente concentrados ao invés de L-tirosina e L-cisteína respectivamente sem qualquer efeito negativo e algumas vezes até mesmo efeito positivo sobre o crescimento e/ou a produtividade das células em um pH abaixo de 8,5.

[00118] A presente invenção é assim direcionada também a um meio de alimentação na forma de um meio em pó ou após a dissolução na forma de um meio líquido.

[00119] O meio líquido resultante compreende derivados de ésteres inorgânicos de tirosina e/ou de cisteína em concentrações entre 5 e 40 mmols/L, preferencialmente entre 10 e 30 mmols/L e preferencialmente possui um pH de 8,5 ou menor.

[00120] Em uma modalidade preferida, o pH fica entre 6,8 e 8,4.

[00121] A presente invenção também é direcionada a um processo em batelada alimentada para a cultura de células em um biorreator através de - Enchimento em um biorreator de células e um meio de cultura de células aquoso - Incubação das células no biorreator - Continuamente ao longo de todo o tempo da incubação das células no biorreator ou uma ou várias vezes dentro do dito tempo de incubação de adição de meio de cultura de células, que é neste caso um meio de alimentação, ao biorreator em que o meio de alimentação preferencialmente possui um pH menor que pH 8,5 e compreende pelo menos um derivado de éster inorgânico de tirosina e/ou de cisteína. Tipicamente um meio de alimentação compreende entre 100 e 150 g/L de ingredientes sólidos que são dissolvidos no solvente.

[00122] Foi observado que através da utilização de derivados de ésteres inorgânicos de tirosina e/ou de cisteína pode ser obtido um meio de alimentação que compreende todos os componentes de alimentação necessários em altas concentrações (concentração total entre 100 e 150 g/L). Em contraste com um processo conhecido em que dois ou mais meios de alimentação diferentes precisam ser alimentados ao biorreator, a presente invenção fornece um meio e um método que possibilita o uso de um meio de alimentação que compreende todos os componentes em altas concentrações. Em adição o pH do meio de alimentação de acordo com a presente invenção tipicamente fica abaixo de 8,5. Devido às limitações na disponibilidade de L-Tirosina e L-Cisteína nos meios de cultura de células e alimentação estas duas moléculas são tipicamente, de acordo com o estado da arte, preparadas como uma solução estoque em pH básico 11,0-11,5. Este pH possui um impacto negative sobre o processo de bioprodução de biofar- macêuticos de forma geral. O tempo de mistura em biorreatores em grande escala e o valor de pH básico em suma afetam negativamente o suprimento de nutrição para as células e até alguma extensão aceleram a morte celular através da exposição a valores de pH básicos extremos. Quando é utilizado o derivado de éster inorgânico de tirosina e/ou de cisteína de acordo com a presente invenção, o pH do meio de alimentação pode ser mantido abaixo de 8,5 enquanto, todavia, entre 10 até 13 mM do derivado de éster inorgânico de tirosina e/ou de ciste- ína estão presentes em um meio de alimentação com uma concentração total entre 100 e 150 g/L.

[00123] Consequentemente, em uma modalidade preferida, no pro- cesso da presente invenção o meio de alimentação que é adicionado durante a incubação continuamente ou uma ou várias vezes dentro do dito período de tempo ao biorreator sempre possui a mesma composição.

[00124] A presente invenção é adicionalmente ilustrada pelas figuras e pelos exemplos a seguir, entretanto, sem ficar restrita aos mesmos.

[00125] A divulgação inteira de todos os pedidos de patentes, patentes e publicações citados acima e abaixo e do pedido de patente EP correspondente EP 12007711.0, depositado em 14 de novembro de 2012, é incorporada aqui como referência.

Exemplos

[00126] Os exemplos a seguir representam aplicações práticas da invenção.

Exemplo 1 Síntese de ácido (S)-2-Amino-3-(4-fosfonoóxi-fenil)-propiônico e seus sais

[00127] O ácido (S)-2-Amino-3-(4-fosfonoóxi-fenil)-propiônico é sintetizado de acordo com a literatura (P. F. Alewood, R. B. Johns, R. M. Valerio, Synthesis 1983, 30.) com conversão subsequente em seus sais, partindo de L-tirosina. A Figura 1 mostra o esquema de reação da síntese do sal dissódico.

[00128] A variação da estequiometria e/ou do cátion da base permite a produção de sais de ácido fosfônico com tirosina uma, duas ou três vezes carregada ou sais diferentes respectivamente. Ácido (S)-2-Amino-3-(4-fosfonoóxi-fenil)-propiônico Estrutura:

[00129] Síntese: A reação é realizada através da dissolução de 100 g (0,55 mol) de L-Tirosina em 400 g (3,48 mols) de ácido ortofosfórico, seguida pela adição de 309 g (2,13 mols) de pentóxido de fósforo em cinco porções sob resfriamento. O produto viscoso é agitado durante 20 h a 80 C, então resfriado até 40°C e hidrolisado através da adição de 400 mL de água. A solução é agitada durante uma hora adicional a 80°C antes de 3,8 L de n-butanol a 60°C serem adicionados lentamente. O resfriamento é mantido até ca. 3°C e a suspensão resultante é filtrada. Os cristais incolores obtidos são lavados consecutivamente com água, etanol e metil tert-butil éter e então secos em vácuo a 50°C. Dados analíticos: 1H-RMN (D2O, 400 MHz): δ = 2,94 (dd, 1 H), 3,13 (dd, 1 H), 3,79 (dd, 1 H), 7,08 - 7,18 (m, 4 H). Sal monossódico do ácido (S)-2-Amino-3-(4-fosfonoóxi-fenil)- propiônico Estrutura:

Dados analíticos: 1H-RMN (D2O, 400 MHz): δ = 3,03 (dd, 1 H), 3,21 (dd, 1 H), 3,91 (dd, 1 H), 7,11 - 7,16 (m, 2 H), 7,20 - 7,25 (m, 2 H). ICP- OES (% em peso): encontrado 8,3 %, calc. 8,1%. Sal dissódico do ácido (S)-2-Amino-3-(4-fosfonoóxi-fenil)-propiônico Estrutura:

[00130] Síntese: 50 g (191 mmols) de ácido (S)-2-Amino-3-(4- fosfonoóxi-fenil)-propiônico são coletados em 146 mL (402 mmols) de uma solução de NaOEt em EtOH (21 % em peso), antes de 12,5 mL de água serem adicionados. A suspensão incolor é submetida ao refluxo durante uma hora, resfriada a 0 °C e filtrada. O produto incolor é lavado com etanol e então seco em vácuo a 50 °C. Dados analíticos: 1H-RMN (D2O, 400 MHz): δ = 4,18 (dd, 1 H), 4,46 (dd, 1 H), 5,12 (dd, 1 H), 8,32 - 8,42 (m, 4 H). ICP-OES (% em peso): encontrado 14,1 %, calc. 15,1%. Sal monopotássico do ácido (S)-2-Amino-3-(4-fosfonoóxi-fenil)- propiônico Estrutura:

Dados analíticos: 1H-RMN (D2O, 400 MHz): δ = 3,08 (dd, 1 H), 3,29 (dd, 1 H), 3,97 (dd, 1 H), 7,16 - 7,22 (m, 2 H), 7,25 - 7,31 (m, 2 H). ICP- OES (% em peso): encontrado 12,6 %, calc. 13,1%. Sal de cálcio do ácido (S)-2-Amino-3-(4-fosfonoóxi-fenil)-propiônico 2:1 Estrutura:

Dados analíticos: 1H-RMN (D2O, 400 MHz): δ = 3,08 (dd, 1 H), 3,28 (dd, 1 H), 3,97 (dd, 1 H), 7,16 - 7,22 (m, 2 H), 7,25 - 7,31 (m, 2 H). ICP- OES (% em peso): encontrado 7,2 %, calc. 7,2 %. Sal de magnésio do ácido (S)-2-Amino-3-(4-fosfonoóxi-fenil)- propiônico 2:1 Estrutura:

Dados analíticos: 1H-RMN (D2O, 400 MHz): δ = 3,07 (dd, 1 H), 3,29 (dd, 1 H), 3,97 (dd, 1 H), 7,16 - 7,22 (m, 2 H), 7,25 - 7,31 (m, 2 H). ICP- OES (% em peso): encontrado 4,3 %, calc. 4,5%.

[00131] Devido às similaridades espectrais nos espectros de 1H- RMN entre sais de fosfato de tirosina igualmente carregados, mas separados por solventes, a espectrometria de ICP-OES foi realizada para determinar de forma não ambígua o cátion correspondente.

Exemplo 2 Síntese de ácido (S)-2-Amino-3-(4-sulfonoóxi-fenil)-propiônico e seus sais

[00132] O ácido (S)-2-Amino-3-(4-sulphonoóxi-fenil)-propiônico pode ser sintetizado de acordo com a literatura (* S. Futaki, T. Taike, T. Yagami, T. Ogawa, T. Akita, K. Kitagawa, J: Chem. Soc. Perkin Trans. I 1990, 1739.) com conversão possível subsequente em seus sais, partindo de L-tirosina.

[00133] A Figura 2 mostra o esquema de reação da síntese do sal de sódio.

[00134] A variação da estequiometria e/ou do cátion da base permite produzir os sais de ácido sulfônico com tirosina carregada uma ou duas vezes ou sais diferentes respectivamente.

Exemplo 3 Solubilidade em água

[00135] A solubilidade de L-Tirosina (composto D1), ácido (S)-2- Amino-3-(4-fosfonoóxi-fenil)-propiônico (composto D2), sal de sódio do ácido (S)-2-Amino-3-(4-fosfonoóxi-fenil)-propiônico (composto D3) e sal dissódico do ácido (S)-2-Amino-3-(4-fosfonoóxi-fenil)-propiônico (composto D4) em água é testada a 20, 25 e 30°C. A Tabela 1 mostra os resultados.

Exemplo 4 Solubilidade em meio de cultura de células complexo

[00136] O Meio de Eagle Modificado de Dulbecco, também conhecido como DMEM, é um meio frequentemente utilizado para o crescimento de células animais. Os ingredientes de DMEM estão em mg/L: sais inorgânicos:

[00137] A mesma composição de meio é feita, mas L-Tirosina 2Na . 2H2O é substituída pelo sal dissódico do ácido (S)-2-Amino-3-(4- fosfonoóxi-fenil)-propiônico na proporção molar equivalente.

[00138] Para ambas as composições de meio, todos os ingredientessão misturados e moídos de acordo com o método da presente invenção que compreende um dosage snail e um moinho de pino.

[00139] O meio de cultura de células em pó resultante é dissolvido em água deionizada a 25°C. A solubilidade é medida após 10 minutos de mistura (em um frasco com um agitador). Enquanto que a composição do meio com o derivado de tirosina fosforilado é uma solução transparente, a composição que compreende L-tirosina não é transparente, mas exibe turbidez.

Experimentos de cultura de células Exemplo 5

[00140] Os dados para este experimento são mostrados na Figura 3. Experimento em batelada em meio quimicamente definido em que a tirosina foi substituída por sais de PTyr. PTyr significa o sal do ácido (S)-2-Amino-3-(4-fosfonoóxi-fenil)-propiônico. Se a concentração de PTyr utilizada fosse a mesma que a concentração de Tirosina no meio, as células não cresciam (não mostrado). Se dissolvido em uma concentração de 4,5 mM no CDM (versus 1 mM no controle), as células podiam crescer, exibindo uma densidade de células viáveis máxima ainda maior que no controle e de forma geral um crescimento estendido (2 dias). A análise posterior indicou que o crescimento inicial era possível através da tirosina livre proveniente da síntese do derivado de PTyr (impureza da síntese de 5% (p/p)). O crescimento estendido podia ser atribuído ao efeito direto do PTyr após sua clivagem metabólica em tirosina livre e fosfato.

Exemplo 6

[00141] Os dados para este experimento são mostrados na Figura 4. Experimento em batelada em meio definido quimicamente em que a Cisteína foi substituída pelo sal de sódio de S-sulfocisteína (concentração equivalente). O pó de CDM utilizado como base foi eliminado em Cisteína e Cistina e suplementado durante a reconstituição com Cisteína para as condições de controle (1,5 e 3 mM) ou com sal de sódio de S-sulfocisteína para as condições de teste (1,5 e 3 mM). As células exibiam um crescimento comparável se cultivadas em meio definido quimicamente contendo Cisteína ou sal de sódio de S- sulfocisteína mostrando que o sal de sódio de S-sulfocisteína pode ser utilizado como substituto da cisteína.

Exemplo 7

[00142] As Figuras 5 e 6 mostram a densidade de células viáveis e a concentração de IgG ao longo do tempo em um processo em batelada alimentada. As células CHO recombinantes são crescidas em meio basal definido quimicamente completo e uma alimentação contendo sais de fosfo-Tyr em pH 7,0 é adicionada no dia 3; 5, 7 e 9 (adição de % v/v de 3%; 6% 6% 6%). A Condição 1 corresponde ao sal dissódico de PTyr, a Condição 2 corresponde ao sal de Potássio de PTyr e a Condição 3 corresponde ao sal de Magnésio de PTyr solubilizado em uma concentração de 30 mM na alimentação com pH neutro. Nestes casos, a Cisteína ainda é adicionada como uma alimentação separada em pH 11.

[00143] O processo é realizado em tubos para centrifugação de 30 mL a 37°C, 5% de CO2, agitação a 320 rpm. Para o controle, de acordo com o estado da arte, a tirosina 2Na+ e a Cisteína são solubilizadas em pH 11 em uma alimentação separada e adicionadas no dia 3; 5; 7; 9 em %(V/V) de 0,3%, 0,6%, 0,6% e 0,6%. Consequentemente, a alimentação principal não contém qualquer Cisteína e tirosina e é adicionada como descrito anteriormente.

[00144] A concentração de glicose é medida todos os dias e ajusta- da consequentemente para manter uma concentração > 2 g/L.

[00145] Pode ser observado que os 3 sais de fosfoTyr (sódio, potássio, magnésio) podem ser utilizados em alimentações neutras altamente concentradas em processos em batelada alimentada sem impacto negativo sobre o crescimento ou o título, simplificando assim o processo geral.

Exemplo 8

[00146] As Figuras 7 e 8 mostram a densidade de células viáveis e a concentração de IgG ao longo do tempo em um processo em batelada alimentada. As células CHO recombinantes são crescidas em meio basal definido quimicamente completo e uma alimentação contendo tanto S-sulfocisteína quanto PTyr 2Na+ em pH 7,0. A alimentação é adicionada no dia 3; 5, 7, 9 e 14 (adição de % v/v de 3%; 6% 6% 6%, 3%). O processo é realizado em biorreatores de 1,2 L a 37°C, pH 7,0, oxigênio dissolvido a 50%, agitação a 140 rpm. Para o controle, de acordo com o estado da arte, a tirosina 2Na+ e a Cisteína são solubili- zadas em pH 11 em uma alimentação separada e adicionadas no dia 3; 5; 7; 9, 14 em %(V/V) de 0,3%, 0,6%, 0,6%, 0,6%, 0,3%. A concentração de glicose é medida todos os dias e ajustada consequentemente para manter uma concentração > 2 g/L.

[00147] Pode ser observado que o uso de S-sulfocisteína na alimentação principal (aqui em combinação com PTyr 2Na+) induz um crescimento estendido em comparação com o controle e mostra um aumento significativo no título.

Claims

1. Meio de cultura de células, caracterizado pelo fato de que compreende o ácido (S)-2-amino-3-sulfossulfanilpropanóico ou sais do mesmo.

2. Meio de cultura de células, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura de células compreende um sal de sódio do ácido (S)-2-amino-3- sulfossulfanilpropanóico.

3. Meio de cultura de células, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura de células é um meio em pó seco.

4. Meio de cultura de células, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura de células é um meio líquido tendo um pH de 8,5 ou menor.

5. Meio de cultura de células, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura de células é um meio de alimentação.

6. Meio de cultura de células, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura de células compreende aminoácidos, traços de elementos, vitaminas e componentessacarídicos.

7. Meio de cultura de células, de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura de células compreende entre 100 e 150 g/l de ingredientes sólidos que estão dissolvidos em um solvente.

8. Processo para cultivar células, caracterizado pelo fato de que compreende: a) fornecer um biorreator; b) misturar das células a serem cultivadas com um meio de cultura de células, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7; c) incubar a mistura da etapa b).

9. Processo em batelada alimentada para a cultura de células em um biorreator, caracterizado pelo fato de que compreende: - Enchimento de células em um biorreator e um meio de cultura de células aquoso; - Incubação das células no biorreator; - Continuamente ao longo de todo o tempo da incubação das células no biorreator ou uma ou várias vezes dentro do dito tempo de incubação, adição de meio de cultura de células, que é neste caso um meio de alimentação, ao biorreator; em que o meio de alimentação tem um pH menor que o pH 8,5 e compreende ácido (S)-2-amino-3-sulfossulfanilpropanóico ou sais do mesmo.

10. Processo em batelada alimentada, de acordo com a rei-vindicação 9, caracterizado pelo fato de que o meio de alimentação compreende ácido (S)-2-amino-3-sulfossulfanilpropanóico ou sais do mesmo em uma concentração entre 10 e 30 mmol/l.

11. Processo em batelada alimentada, de acordo com a rei-vindicação 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que o meio de alimentação compreende entre 100 e 150 g/l de ingredientes sólidos que são dissolvidos em um solvente.