KR102170858B1

KR102170858B1 - 세포 배양 배지

Info

Publication number: KR102170858B1
Application number: KR1020157015699A
Authority: KR
Inventors: 하겐 외르크 폰; 마르켈 안드레 브로이닝; 크리슈티안 야슈퍼
Original assignee: 메르크 파텐트 게엠베하
Priority date: 2012-11-14
Filing date: 2013-11-14
Publication date: 2020-10-28
Also published as: MX358095B; CN104812891A; AR117697A2; CA3112061A1; JP6433429B2; BR112015010948A2; DK2920296T3; US20180230422A1; CA2891279A1; JP2019030334A; ES2827701T3; EP2920296A1; AR093460A1; US10030225B2; BR112015010948B1; CA3112061C; WO2014075807A1; CN104812891B; EP2920296B1; CA2891279C

Abstract

본 발명은 티로신 및/또는 시스테인의 무기 에스테르 유도체를 포함하는 세포 배양 배지에 관한 것이다. 세포 배양 배지에서의 티로신의 불량한 용해도 및 종종 시스테인의 불충분한 안정성은 그들을 무기 에스테르 유도체, 예를 들어 인산화 유도체로 대체함으로써 극복된다.

Description

세포 배양 배지 {CELL CULTURE MEDIA}

세포 배양 배지는 인공 환경에서의 세포의 성장을 지지 및 유지한다.

성장이 지지되어야 하는 유기체의 유형에 따라, 세포 배양 배지는 성분들, 때때로 백 가지가 넘는 상이한 성분들의 복합 혼합물을 포함한다.

포유류, 곤충 또는 식물 세포의 증식에 요구되는 세포 배양 배지는 전형적으로 세균 및 효모의 성장을 지지하는 배지보다 훨씬 더 복합적이다.

개발된 첫번째 세포 배양 배지는 한정되지 않은 성분, 예컨대 혈장, 혈청, 배아 추출물, 또는 기타 한정되지 않은 생물 추출물 또는 펩톤으로 이루어졌다. 따라서 화학 한정 배지의 개발로 중요한 진전이 이루어졌다. 화학 한정 배지는 종종 아미노산, 비타민, 금속 염, 항산화제, 킬레이터, 성장 인자, 완충제, 호르몬, 및 당업자에게 알려진 더욱 많은 물질을 포함하나 그에 배타적으로 제한되지 않는다.

일부 세포 배양 배지는 멸균 수성 액체로서 제공된다. 액체 세포 배양 배지의 단점은 감소된 유통기한 및 운송 및 저장의 어려움이다. 그 결과, 많은 세포 배양 배지가 현재 미세하게 분쇄된 건성 분말 (dry powder) 혼합물로서 제공된다. 그들은 물 및/또는 수성 용액에 용해시킬 목적으로 제조되고, 용해된 상태에서, 종종 기타 보충제와 함께, 세포에 성장을 위한 실질적 영양소 베이스를 공급하고/거나 상기 세포로부터 생물약제를 생산하도록 디자인된다.

대부분의 생물약제 생산 플랫폼은 페드-뱃치 (fed-batch) 세포 배양 프로토콜에 기초한다. 그 목적은 전형적으로 증가하는 시장 수요를 만족시키고 제조 비용을 감소시키는 높은 역가 세포 배양 과정을 개발하는 것이다. 고성능 재조합 세포주의 사용 외에도, 세포 배양 배지 및 과정 파라미터의 개선이 최대 생산 잠재력을 실현하기 위해 요구된다.

페드-뱃치 과정에서, 기본 배지 (basal medium) 는 초기 성장 및 생산을 지지하고, 피드 배지 (feed medium) 는 영양소의 고갈을 방지하고 생산기를 지속시킨다. 배지는 상이한 생산기 동안 독특한 대사 요건을 수용하도록 선택된다. 과정 파라미터 설정 - 공급 전략 및 대조군 파라미터를 포함함 - 은 세포 성장 및 단백질 생산에 적합한 화학적 및 물리적 환경을 한정한다.

피드 배지의 최적화는 페드-뱃치 과정의 최적화에서 주된 양상이다.

대개 피드 배지는 생물반응기 (bioreactor) 의 희석을 회피하도록 고도로 농축된다. 영양소의 제어되는 첨가는 배양의 성장 속도에 직접 영향을 미친다.

건성 분말로부터의 세포 배양 배지의 제조에 대한 제한 인자는 일부 성분의 불량한 용해도 또는 안정성, 특히 아미노산 L-티로신 및 L-시스테인의 불량한 용해도 또는 안정성이다. L-티로신의 경우 불량한 용해도가 주된 문제이며, L-시스테인의 경우 안정성 문제가 지배한다.

따라서 L-티로신 및 L-시스테인의 용해도 및/또는 안정성을 개선하는 방법을 찾는 것이 바람직할 것이다.

L-티로신 및 L-시스테인의 무기 에스테르 유도체가 개선된 용해도 및/또는 안정성을 갖고, 세포 성장에 대한 임의의 음성 효과 및 때때로 심지어는 양성 효과 없이 세포 배양 배지에서 각각 L-티로신 및 L-시스테인 대신 사용될 수 있다는 것이 밝혀졌다.

그러한 무기 에스테르 유도체는 pH 8.5 이하의 pH 를 갖고 세포를 위한 영양소로서 적합한 형태인 고농도의 티로신 및 시스테인을 갖는 공급 용액을 제조하기에 특히 적합하다는 것이 추가로 밝혀졌다.

그러므로 본 발명은 티로신 및/또는 시스테인의 하나 이상의 무기 에스테르 유도체를 포함하는 세포 배양 배지에 관한 것이다.

바람직한 구현예에서, 무기 에스테르 유도체는 술페이트 에스테르 유도체 또는 포스페이트 에스테르 유도체이다.

바람직한 구현예에서 세포 배양 배지는 하기 화학식 I 및/또는 II 의 성분 중 하나 이상을 포함한다:

바람직한 구현예에서, 티로신의 무기 에스테르 유도체는 (S)-2-아미노-3-(4-포스포노옥시-페닐)-프로피온산 또는 그의 염이다.

또다른 바람직한 구현예에서, 시스테인의 유도체는 (S)-2-아미노-3-술포술파닐프로판산 또는 그의 염이다.

바람직한 구현예에서 티로신의 인산화 유도체는 (S)-2-아미노-3-(4-포스포노옥시-페닐)-프로피온산 이나트륨 염이다.

바람직한 구현예에서 시스테인의 술폰화 유도체는 (S)-2-아미노-3-술포술파닐프로판산 나트륨 염이다.

바람직한 구현예에서, 세포 배양 배지는 건성 분말 배지이다.

또다른 바람직한 구현예에서, 세포 배양 배지는 피드 배지이다.

또다른 바람직한 구현예에서 세포 배양 배지는 8.5 이하의 pH 를 갖고 티로신 및/또는 시스테인의 하나 이상의 무기 에스테르 유도체를 5 내지 40 mmol/ℓ, 바람직하게는 10 내지 30 mmol/ℓ 의 농도로 포함하는 액체 배지이다.

바람직한 구현예에서 액체 배지의 pH 는 6.5 내지 8.5, 가장 바람직하게는 6.8 내지 7.8 이다.

하나의 구현예에서, 세포 배양 배지는 하나 이상의 당류 성분, 하나 이상의 아미노산, 하나 이상의 비타민 또는 비타민 전구체, 하나 이상의 염, 하나 이상의 완충제 성분, 하나 이상의 보조인자 (co-factor) 및 하나 이상의 핵산 성분을 포함한다.

본 발명은 추가로 하기에 의한 본 발명에 따른 세포 배양 배지의 제조 방법에 관한 것이다:

a) L-티로신 및/또는 L-시스테인의 하나 이상의 무기 에스테르 유도체를 세포 배양 배지의 다른 성분들과 혼합하는 단계,

b) 단계 a) 의 혼합물을 분쇄 (milling) 에 적용하는 단계.

바람직한 구현예에서 단계 b) 는 핀 밀 (pin mill), 휘츠 밀 (fitz mill) 또는 제트 밀 (jet mill) 에서 수행된다.

또다른 바람직한 구현예에서, 단계 a) 로부터의 혼합물은 분쇄에 앞서 0℃ 미만의 온도로 냉각된다.

본 발명은 또한 (S)-2-아미노-3-(4-포스포노옥시-페닐)-프로피온산의 이나트륨 염, 이칼륨 염, 일칼륨 염, 2:1 칼슘 염 및 마그네슘 염에 관한 것이다.

본 발명은 또한 하기에 의한 세포 배양 방법에 관한 것이다:

a) 생물반응기를 제공하는 단계,

b) 배양될 세포를 본 발명에 따른 세포 배양 배지와 혼합하는 단계,

c) 단계 b) 의 혼합물을 인큐베이션하는 단계.

본 발명은 또한 하기에 의한 생물반응기 내에서 세포를 배양하기 위한 페드-뱃치 방법이다:

- 생물반응기 내에 세포 및 수성 세포 배양 배지를 채우는 단계,

- 생물반응기 내에서 세포를 인큐베이션하는 단계

- 생물반응기 내에서의 세포의 전체 인큐베이션 시간에 걸쳐 연속적으로 또는 상기 인큐베이션 시간 내에 한 번 또는 여러 번 세포 배양 배지를, 이 경우에 피드 배지를, 생물반응기에 첨가하는 단계,

상기 피드 배지는 pH 8.5 미만의 pH 를 갖고, 티로신 및/또는 시스테인의 하나 이상의 무기 에스테르 유도체를 포함함.

바람직하게는 피드 배지는 티로신 및/또는 시스테인의 하나 이상의 무기 에스테르 유도체를 10 내지 50 mmol/ℓ, 바람직하게는 15 내지 30 mmol/ℓ 의 농도로 포함한다.

도 1 은 (S)-2-아미노-3-(4-포스포노옥시-페닐)-프로피온산의 생산에 관한 반응식을 보여준다. 추가의 세부사항을 실시예 1 에서 찾을 수 있다.
도 2 는 (S)-2-아미노-3-(4-술포노옥시-페닐)-프로피온산의 생산에 관한 반응식을 보여준다. 추가의 세부사항을 실시예 2 에서 찾을 수 있다.
도 3 및 4 는 본 발명에 따른 세포 배양 배지를 사용하는 뱃치식 세포 성장 실험을 보여준다. 추가의 세부사항을 실시예 5 및 6 에서 찾을 수 있다.
도 5 및 6 은 (S)-2-아미노-3-(4-술포노옥시-페닐)-프로피온산 염을 포함하는 본 발명에 따른 최적화된 페드-뱃치가 사용되는 페드-뱃치 세포 배양 실험의 결과를 보여준다. 세부사항을 실시예 7 에서 찾을 수 있다.
도 7 및 8 은 (S)-2-아미노-3-(4-술포노옥시-페닐)-프로피온산 염 및 (S)-2-아미노-3-술포술파닐-프로피온산 나트륨 염을 포함하는 본 발명에 따른 최적화된 페드-뱃치가 사용되는 페드-뱃치 세포 배양 실험의 결과를 보여준다. 세부사항을 실시예 8 에서 찾을 수 있다.

본 발명에 따른 무기 에스테르 유도체는 예를 들어 무기 옥소 산 및 티로신 또는 시스테인의 축합에 의해 수득가능한 생성물이다. 무기 옥소 산의 예는 예를 들어 인산, 황산, 질산 및 붕산이다. 황산 또는 인산에서 유도된 무기 에스테르 유도체가 바람직하다. 따라서 무기 에스테르 유도체는 무기 옥소 산 및 시스테인 또는 티로신의 에스테르 및 그의 염이다. 티로신의 적합한 무기 에스테르 유도체의 예는 (S)-2-아미노-3-(4-포스포노옥시-페닐)-프로피온산 뿐만 아니라 (S)-2-아미노-3-(4-포스포노옥시-페닐)-프로피온산의 일나트륨 염, 이나트륨 염, 일칼륨 염, 이칼륨 염, 칼슘 염 및 마그네슘 염이다.

바람직한 무기 에스테르 유도체는 또한 하기 화학식 I 및 II 에 의해 제시될 수 있다:

식 중, R 은

또는

이고,

X 및 Y 는 서로 독립적으로 H, Li, Na, K, ½Ca, ½Mg, 바람직하게는 H, Na, K 이다. 용어 프로판산은 또한 용어 프로피온산 대신 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 세포 배양 배지는 세포의 시험관내 (in vitro) 성장을 유지 및/또는 지지하는 성분의 임의의 혼합물이다. 본 발명에 따른 세포 배양 배지는 복합 배지 또는 화학 한정 배지일 수 있다. 세포 배양 배지는 세포의 시험관내 성장을 유지 및/또는 지지하는데 필수적인 모든 성분을 포함하거나, 오직 일부 성분을 포함하여 추가의 성분이 별도로 첨가될 수 있다. 본 발명에 따른 세포 배양 배지의 예는 세포의 시험관내 성장을 유지 및/또는 지지하는데 필수적인 모든 성분 뿐만 아니라 배지 보충제 또는 피드 (feed) 를 포함하는 완전 배지이다. 바람직한 구현예에서 세포 배양 배지는 완전 배지 또는 피드 배지이다. 기본 배지로도 호칭되는 완전 배지는 전형적으로 6.8 내지 7.8 의 pH 를 갖는다. 피드 배지는 바람직하게는 8.5 미만의 pH 를 갖는다.

전형적으로, 본 발명에 따른 세포 배양 배지는 생물반응기 내에서의 세포의 성장을 유지 및/또는 지지하는데 사용된다.

피드 또는 피드 배지는 세포 배양에서 초기 성장 및 생산을 지지하는 기본 배지가 아니라 더 늦은 시기에서 첨가되어 영양소의 고갈을 방지하고 생산기를 지속시키는 배지인 세포 배양 배지이다. 피드 배지는 기본 배양 배지에 비해 더 높은 농도의 일부 성분을 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 성분, 예컨대, 예를 들어, 아미노산 또는 탄수화물을 포함하는 영양소는 피드 배지에 기본 배지에서의 농도의 약 5X, 6X, 7X, 8X, 9X, 10X, 12X, 14X, 16X, 20X, 30X, 50X, 100X, 200X, 400X, 600X, 800X, 또는 심지어는 약 1000X 로 존재할 수 있다.

포유류 세포 배양 배지는 포유류 세포의 시험관내 성장을 유지 및/또는 지지하는 성분의 혼합물이다. 포유류 세포의 예는 인간 또는 동물 세포, 바람직하게는 CHO 세포, COS 세포, I VERO 세포, BHK 세포, AK-1 세포, SP2/0 세포, L5.1 세포, 하이브리도마 세포 또는 인간 세포이다.

화학 한정 세포 배양 배지는 임의의 화학적으로 한정되지 않은 물질을 포함하지 않는 세포 배양 배지이다. 이는 배지에서 사용되는 모든 화학물질의 화학 조성이 알려져 있음을 의미한다. 화학 한정 배지는 임의의 효모, 동물 또는 식물 조직을 포함하지 않고; 피더 세포, 혈청, 추출물 또는 소화물 또는 배지에 화학적으로 불량하게 한정된 단백질을 기여할 수 있는 기타 성분을 포함하지 않는다. 화학적으로 한정되지 않거나 불량하게 한정된 화학 성분은 그것의 화학 조성 및 구조가 알려지지 않은 것이고, 다양한 조성으로 존재하거나 오직 막대한 실험적 노력으로만 한정될 수 있다 - 단백질 예컨대 알부민 또는 카제인의 화학 조성 및 구조의 평가와 비슷함.

분말화된 세포 배양 배지 또는 건성 분말 배지는 전형적으로 분쇄 과정 또는 동결건조 과정으로부터 초래되는 세포 배양 배지이다. 그것은 분말화된 세포 배양 배지가 과립, 미립자 배지이고 - 액체 배지가 아님을 의미한다. 용어 "건성 분말" 은 용어 "분말" 과 호환되게 사용될 수 있다; 그러나, 본원에서 사용되는 "건성 분말" 은 단순히 과립화된 재료의 육안 외관을 언급하고, 다르게 명시되지 않으면 그 재료에 복합 또는 응집 용매가 완전히 없음을 의미하는 것이 의도되지 않는다.

본 발명에 따른 배지로 배양될 세포는 원핵 세포 예컨대 세균 세포 또는 진핵 세포 예컨대 식물 또는 동물 세포일 수 있다. 세포는 정상 세포, 불멸화 세포, 질병에 걸린 세포, 형질전환된 세포, 돌연변이 세포, 체세포, 생식 세포, 줄기 세포, 전구 세포 또는 배아 세포일 수 있으며, 이들 중 임의의 것은 확립된 또는 형질전환된 세포주이거나 또는 자연 공급원으로부터 수득될 수 있다.

입자의 크기는 입자의 평균 직경을 의미한다. 입자 직경은 실리콘유에서 레이저 광 산란에 의해 확인된다.

불활성 분위기는 각각의 용기 또는 장비를 불활성 기체로 채움으로써 생성된다. 적합한 불활성 기체는 비활성 기체 예컨대 아르곤 또는 바람직하게는 질소이다. 이들 불활성 기체는 비-반응성이고, 바람직하지 않은 화학 반응이 일어나는 것을 방지한다. 본 발명에 따른 방법에서, 불활성 분위기의 생성은 예를 들어 액체 질소 또는 질소 기체의 도입에 의해 산소의 농도가 10% (v/v) 절대값 미만으로 감소되는 것을 의미한다.

상이한 유형의 분쇄기가 당업자에게 알려져 있다.

원심 임팩트 밀 (centrifugal impact mill) 로도 호칭되는, 핀 밀은 고체를 가루로 만들며, 여기에서 고속 회전 원반 위의 돌출 핀이 파단 에너지를 제공한다. 핀 밀은 예를 들어 Munson Machinery (미국), Premium Pulman (인도) 또는 Sturtevant (미국) 에 의해 판매된다.

제트 밀은 압축된 기체를 사용하여 입자를 가속시켜, 공정 체임버 내에서 서로 충격을 가하도록 한다. 제트 밀은 예를 들어 Sturtevant (미국) 또는 PMT (오스트리아) 에 의해 판매된다.

Fitzpatrick (미국) 에 의해 상품화된 휘츠 밀은 분쇄를 위한 블레이드를 포함하는 회전자를 사용한다.

연속식으로 실행되는 과정은 뱃치식으로 실행되지 않는 과정이다. 분쇄 과정이 연속식으로 실행되는 경우, 그것은 배지 성분이 일정한 시간에 걸쳐 영구적으로 및 지속적으로 분쇄기에 공급되는 것을 의미한다.

본 발명에 따른 세포 배양 배지, 특히 완전 배지는 전형적으로 하나 이상의 당류 성분, 하나 이상의 아미노산, 하나 이상의 비타민 또는 비타민 전구체, 하나 이상의 염, 하나 이상의 완충제 성분, 하나 이상의 보조인자 및 하나 이상의 핵산 성분을 포함한다.

배지는 또한 나트륨 피루베이트, 인슐린, 식물성 단백질, 지방산 및/또는 지방산 유도체 및/또는 플루론산 및/또는 계면 활성 성분 예컨대 화학적으로 제조된 비-이온성 계면활성제를 포함한다. 적합한 비-이온성 계면활성제의 하나의 예는 예를 들어 BASF (독일) 로부터 상품명 플루로닉 (pluronic®) 으로 입수가능한 폴록사머로도 호칭되는 일차 히드록실 기로 끝나는 이관능성 블록 공중합체 계면활성제이다.

당류 성분은 모든 일- 또는 이-당류, 예컨대 글루코스, 갈락토스, 리보스 또는 프룩토스 (일당류의 예) 또는 수크로스, 락토스 또는 말토스 (이당류의 예) 이다.

본 발명에 따른 아미노산의 예는 티로신, 단백질생성 아미노산, 특히 필수 아미노산, 류신, 이소류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트레오닌, 트립토판 및 발린, 뿐만 아니라 비-단백질생성 아미노산 예컨대 D-아미노산이다.

티로신은 L- 또는 D- 티로신, 바람직하게는 L-티로신을 의미한다.

시스테인은 L- 또는 D-시스테인, 바람직하게는 L-시스테인을 의미한다.

비타민의 예는 비타민 (레티놀, 레티날, 다양한 레티노이드, 및 4 가지 카로테노이드), 비타민 B₁ (티아민), 비타민 B₂ (리보플라빈), 비타민 B₃ (니아신, 니아신아미드), 비타민 B₅ (판토텐산), 비타민 B₆ (피리독신, 피리독사민, 피리독살), 비타민 B₇ (비오틴), 비타민 B₉ (엽산, 폴린산), 비타민 B₁₂ (시아노코발라민, 히드록시코발라민, 메틸코발라민), 비타민 C (아스코르브산), 비타민 D (에르고칼시페롤, 콜레칼시페롤), 비타민 E (토코페롤, 토코트리에놀) 및 비타민 K (필로퀴논, 메나퀴논) 이다. 비타민 전구체도 또한 포함된다.

염의 예는 무기 이온 예컨대 바이카르보네이트, 칼슘, 클로리드, 마그네슘, 포스페이트, 칼륨 및 나트륨 또는 미량 원소 예컨대 Co, Cu, F, Fe, Mn, Mo, Ni, Se, Si, Ni, Bi, V 및 Zn 을 포함하는 성분이다. 예는 구리(II) 술페이트 펜타히드레이트 (CuSO₄·5H₂O), 나트륨 클로리드 (NaCl), 칼슘 클로리드 (CaCl₂·2H₂O), 칼륨 클로리드 (KCl), 철(II)술페이트, 나트륨 포스페이트 일염기 무수물 (NaH₂PO₄), 마그네슘 술페이트 무수물 (MgSO₄), 나트륨 포스페이트 이염기 무수물 (Na₂HPO₄), 마그네슘 클로리드 헥사히드레이트 (MgCl₂·6H₂O), 아연 술페이트 헵타히드레이트이다.

완충제의 예는 CO₂/HCO₃ (카르보네이트), 포스페이트, HEPES, PIPES, ACES, BES, TES, MOPS 및 TRIS 이다.

보조인자의 예는 티아민 유도체, 비오틴, 비타민 C, NAD/NADP, 코발라민, 플라빈 모노뉴클레오티드 및 유도체, 글루타티온, 헴 뉴클레오티드 포스페이트 및 유도체이다.

본 발명에 따른 핵산 성분은 핵염기, 예컨대 시토신, 구아닌, 아데닌, 티민 또는 우라실, 뉴클레오시드 예컨대 시티딘, 우리딘, 아데노신, 구아노신 및 티미딘, 및 뉴클레오티드 예컨대 아데노신 모노포스페이트 또는 또는 아데노신 디포스페이트 또는 아데노신 트리포스페이트이다.

피드 배지는 완전 배지에 비해 상이한 조성을 가질 수 있다. 피드 배지는 전형적으로 아미노산, 미량 원소 및 비타민을 포함한다. 피드 배지는 또한 당류 성분을 포함할 수 있으나 때때로 생산 이유로 당류 성분은 별도의 피드에 첨가된다.

적합한 피드 배지는 예를 들어 하나 이상의 하기 화합물을 포함할 수 있다:

L-아스파라긴 모노히드레이트

L-이소류신

L-페닐알라닌

나트륨 L-글루타메이트 모노히드레이트

L-류신

L-트레오닌

L-리신 모노히드로클로리드

L-프롤린

L-세린

L-아르기닌 모노히드로클로리드

L-히스티딘 모노히드로클로리드 모노히드레이트

L-메티오닌

L-발린

일나트륨-L-아스파르테이트-모노히드레이트

L-트립토판

콜린 클로리드

MYO-이노시톨

니코틴아미드

칼슘-D(+) 판토테네이트

피리독신 히드로클로리드

티아민 클로리드 히드로클로리드

미분화된 비타민 B12 (시아노코발라민)

비오틴

엽산

리보플라빈

무수 마그네슘 술페이트

구리(II) 술페이트 펜타히드레이트

아연 술페이트 헵타히드레이트

1,4-디아미노부탄 디히드로클로리드

암모늄 헵타몰리브데이트 테트라히드레이트

카드뮴 술페이트 히드레이트

망간(II) 클로리드 테트라히드레이트

니켈(II) 클로리드 헥사히드레이트

나트륨 메타 실리케이트

나트륨 메타바나데이트

주석(II) 클로리드 디히드레이트

나트륨 셀레나이트 (약 45% SE)

나트륨 디히드로겐 포스페이트 모노히드레이트

암모늄 철(III) 시트레이트 (약 18% FE)

본 발명에 따른 동결은 0℃ 미만의 온도로 냉각시키는 것을 의미한다.

본 발명의 요약은 분말 및 용매의 단순 혼합에 의해 적합한 용매에 쉽게 용해될 수 있는 분말화된 세포 배양 배지를 제공하는 것이며, 상기 분말은 용해되어 액체 세포 배양 배지 예컨대 완전 배지, 배지 보충제, 배지 서브그룹 (medium subgroup) 또는 요망되는 균일한 농도의 배지 성분을 포함하는 피드를 생성한다.

분말화된 세포 배양 배지의 단순 용해는 종종 수성 용매 중 불량한 용해도 및/또는 안정성을 갖는 티로신 또는 시스테인과 같은 물질에 의해 복잡해진다. 예를 들어 L-티로신은 25℃ 의 온도에서 0.4 g/ℓ 의 물에서의 용해도를 갖는다. 이는 약 0.4 g 의 L-티로신이 1 리터의 물에 용해될 수 있음을 의미한다. 그러나 세포 배양 배지에서 요구되는 티로신의 농도는 종종 더 높다. 시스테인은 호기적 조건 하에 이량체를 형성하는 경향이 있다. 그러한 이량체는 시스틴으로 호칭된다. 또한, 시스테인은 세포 배양 배지에 흔히 존재하는 금속 예컨대 구리 또는 철과 독성 부산물을 형성하는 것으로 알려져 있다. 세포 배양 배지에 존재하는 시스테인 또는 시스틴은 이량체 또는 독성 부산물을 형성하지 않는 본 발명에 따른 무기 에스테르 유도체에 의해 대체될 수 있다.

티로신 및/또는 시스테인의 인산화 및/또는 술폰화 유도체는 한편으로는 전형적으로 수성 용액 중 더 높은 용해도를 갖고, 다른 한편으로는 티로신 및/또는 시스테인/시스틴의 대체물로서 사용될 수 있고, 세포 배양 배지 성분으로서 천연 아미노산 티로신 및 시스테인과 동등하게 적합한 것으로 밝혀졌다. 이는 예를 들어 L-티로신이 L-티로신의 하나 이상의 무기 에스테르 유도체로 대체된 세포 배양 배지가 세포 배양에서 오직 L-티로신만 포함하는 배지와 비슷한 성능을 보이는 것을 의미한다.

티로신 및 시스테인의 일부 무기 에스테르 유도체가 당업계에 알려져 있다. 펩티드 및 단백질에서 티로신의 인산화는 광범위한 세포 과정에서 중요한 역할을 수행하고, 많은 단백질 효소를 켜고 끄고, 그에 의해 단백질 효소의 기능 및 활성을 변경한다.

(S)-2-아미노-3-(4-포스포노옥시-페닐)-프로피온산 일나트륨 염은 CAS number 146900-49-4 를 갖는다. R.H. Plimmer Biochemical Journal (1941), 35, 페이지 461-469 는 (S)-2-아미노-3-(4-포스포노옥시-페닐)-프로피온산 뿐만 아니라 그의 1:1-칼슘 염의 합성을 개시한다.

(S)-2-아미노-3-(4-포스포노옥시-페닐)-프로피온산의 추가의 신규한 유도체, 예컨대 (S)-2-아미노-3-(4-포스포노옥시-페닐)-프로피온산의 이나트륨 염, 이칼륨 염, 일칼륨 염, 2:1 칼슘 염 및 마그네슘 염의 합성 및 특징이 본원에 개시되어 있다.

본 발명에 따른 티로신의 적합한 인산화 유도체는 페놀 OH 기에서 인산화된 것, 예컨대 (S)-2-아미노-3-(4-포스포노옥시-페닐)-프로피온산 또는 그의 염이다. 특히 바람직한 구현예에서, 티로신의 인산화 유도체는 (S)-2-아미노-3-(4-포스포노옥시-페닐)-프로피온산의 염이다.

본 발명에 따른 티로신의 적합한 술폰화 유도체는 페놀 OH 기에서 술폰화된 것, 예컨대 (S)-2-아미노-3-(4-술포노옥시-페닐)-프로피온산 또는 그의 염이다.

특히 바람직한 구현예에서, 티로신의 술폰화 유도체는 (S)-2-아미노-3-(4-술포노옥시-페닐)-프로피온산의 염이다.

본 발명에 따른 시스테인의 적합한 인산화 유도체는 시스테인의 SH-기에서 인산화된 것, 예컨대 (S)-2-아미노-3-포스포노술파닐-프로피온산 또는 그의 염이다.

본 발명에 따른 시스테인의 적합한 술폰화 유도체는 시스테인의 SH-기에서 술폰화된 것, 예컨대 (S)-2-아미노-3-술포술파닐-프로피온산 또는 그의 염이다.

(S)-2-아미노-3-술포술파닐-프로판산, S-술포-시스테인 또는 시스테인-S-술페이트로도 호칭되는, 2-아미노-3-술포술파닐-프로피온산, 및 그의 염은 예를 들어 I.H.Segel 및 M.J.Johnson, Analytical Biochemistry 5, 330-337 및 J.S. Church, D.J. Evans, Spectrochimica Acta Part 69 (2008) 256-262 에 개시되어 있다. 나트륨 염은 또한 Bachem (스위스) 으로부터 상업적으로 입수가능하다.

적합한 염은 알칼리금속 또는 알칼리토금속 염, 예를 들어 리튬 염, 나트륨 염, 칼륨 염, 칼슘 염 또는 마그네슘 염이고, 나트륨, 칼륨 염 및 자유 산이 바람직하고, 나트륨 염이 가장 바람직하다.

티로신의 무기 에스테르 유도체의 경우에, (S)-2-아미노-3-(4-포스포노옥시-페닐)-프로피온산-이나트륨 염은 매우 양호한 용해도를 보인다.

티로신 및 시스테인의 무기 에스테르 유도체는 임의의 방법에 의해, 예를 들어 효소적으로 또는 화학적 합성에 의해 생산될 수 있다. 바람직하게는 티로신의 인산화 유도체는 오산화인의 존재 하에 티로신을 인산과 반응시킴으로써 생성된다. 결과적인 (S)-2-아미노-3-(4-포스포노옥시-페닐)-프로피온산은 그 후 적합한 염기 예컨대 나트륨 히드록시드, 나트륨 에틸레이트, 칼륨 히드록시드 등과 반응되어 관련 염을 생성할 수 있다. 이러한 합성의 반응식이 도 1 에 제시되어 있다.

(S)-2-아미노-3-(4-포스포노옥시-페닐)-프로피온산의 용해도는 티로신의 용해도보다 더 높다 (실시예 3 의 표 1 참고).

티로신 또는 시스테인 유도체의 용해도를 더욱 증가시키기 위해, 유도체를 위에 기재된 적합한 염기와 반응시킴으로써 염이 형성될 수 있다. (S)-2-아미노-3-(4-포스포노옥시-페닐)-프로피온산의 나트륨 염은 예를 들어 더 높은 용해도를 갖는다 (실시예 3 의 표 1 참고).

본 발명에 따른 세포 배양 배지는 티로신 및/또는 시스테인의 하나 이상의 무기 에스테르 유도체, 예를 들어 (S)-2-아미노-3-(4-포스포노옥시-페닐)-프로피온산의 일- 및 이나트륨 염의 혼합물을 포함할 수 있다.

완전 배지에서 티로신의 무기 에스테르 유도체를 사용하는 경우에 배지 조성물에 소량의 티로신을 첨가하는 것이 바람직하다는 것이 밝혀졌다. 이는 일부 세포가 티로신의 무기 에스테르 유도체의 흡수를 보이지 않는다는 사실로 인한 것일 수 있다. 티로신의 무기 에스테르 유도체는 세포외에서 포스파타제에 의해 자유 티로신으로 전환될 필요가 있다. 전형적으로 충분한 양의 포스파타제가 세포 배양을 시작한지 2 내지 5 일 후에 이용가능하다.

새롭게 첨가되는 피드 배지에 티로신의 무기 에스테르 유도체를 사용할 때, 이는 티로신을 포함하는 배지에서 세포를 이미 2-5 일 이상 성장시킨 세포 배양에서, 새롭게 첨가되는 피드 배지에 티로신을 첨가할 필요가 없음을 의미한다.

결과적으로, 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 완전 배지는 티로신의 하나 이상의 무기 에스테르 유도체 및 부가적으로 5 내지 40% (w/w) 의 티로신을 포함한다.

이러한 효과는 시스테인의 무기 에스테르 유도체를 사용할 때에는 발견되지 않는다. 시스테인의 무기 에스테르 유도체를 사용하는 경우 시스테인의 첨가는 필수적이지 않다. 시스테인의 무기 에스테르 유도체는 어떤 경우에도 시스테인 또는 시스틴의 완전한 대체물로서 사용될 수 있다.

또한, 예상외로, 시스테인의 무기 에스테르 유도체는 세포 성장 및 생산성에 대해 양성 효과를 보였다. 전형적으로, 시스테인의 무기 에스테르 유도체를 포함하는 배지 및 피드로 성장시킨 세포는 연장된 성장을 보였다. 시스테인의 무기 에스테르 유도체를 사용할 때 시간의 흐름에 따른 세포의 생활력은 시스테인을 사용하는 세포 배양에 비해 더 높다.

재조합 단백질의 생산은 시스테인의 무기 에스테르 유도체를 사용할 때 시스테인을 사용하는 세포 배양에 비해 부가적으로 증가된다.

시스테인의 무기 에스테르 유도체의 양성 효과는 세포 배양 배지에서 전형적으로 사용되는 시스테인 및/또는 시스틴의 양과 동등한 양을 사용함으로써 수득될 수 있다.

본 발명의 분말화된 세포 배양 배지는 바람직하게는 모든 성분을 혼합하고 그들을 분쇄함으로써 생성된다. 성분의 혼합은 분쇄에 의한 건성 분말화된 세포 배양 배지의 생성 분야의 당업자에게 알려져 있다. 바람직하게는, 모든 성분은 완전히 혼합되어 혼합물의 모든 부분이 거의 동일한 조성을 갖게 된다. 조성물의 균일성이 높을수록, 결과적인 배지의 균일한 세포 성장에 관한 품질이 양호하다.

분쇄는 분말화된 세포 배양 배지의 생산에 적합한 임의의 유형의 분쇄기로 수행될 수 있다. 전형적 예는 볼 밀, 핀 밀, 휘츠 밀 또는 제트 밀이다. 핀 밀, 휘츠 밀 또는 제트 밀이 바람직하고, 핀 밀이 매우 바람직하다.

당업자는 그러한 분쇄기를 가동하는 방법을 안다.

원반 직경 약 40 cm 의 대규모 장비 분쇄기는 예를 들어 전형적으로 핀 밀의 경우에 1-6500 분당 회전수, 바람직하게는 1-3000 분당 회전수로 가동된다.

분쇄는 입자 크기 10 내지 300 ㎛, 가장 바람직하게는 25 내지 100 ㎛ 의 분말을 초래하는 표준 분쇄 조건 하에 실시될 수 있다.

바람직하게는, 분쇄에 적용되는 혼합물의 모든 성분은 건성이다. 이는, 그들의 물을 포함하는 경우, 그들이 결정수 및 10 중량% 이하, 바람직하게는 5 중량% 이하, 가장 바람직하게는 2 중량% 이하의 미결합 또는 미배위 물 분자를 포함하는 것을 의미한다.

바람직한 구현예에서, 분쇄는 불활성 분위기에서 수행된다. 바람직한 불활성 보호성 기체는 질소이다.

또다른 바람직한 구현예에서, 혼합물의 모든 성분은 분쇄에 앞서 동결된다. 분쇄 이전의 성분의 동결은 0℃ 미만, 가장 바람직하게는 - 20℃ 미만의 온도로 성분의 냉각을 보장하는 임의의 수단에 의해 실시될 수 있다. 바람직한 구현예에서 동결은 액체 질소로 실시된다. 이는, 예를 들어 성분이 분쇄기에 도입되기 전에 저장되는 용기 내로 액체 질소를 부음으로써, 성분이 액체 질소로 처리되는 것을 의미한다. 바람직한 구현예에서, 용기는 공급장치 (feeder) 이다. 용기가 공급장치인 경우에 액체 질소는 바람직하게는 공급장치에 성분이 도입되는 면에 또는 그 근처에 도입된다.

전형적으로 성분은 액체 질소로 2 내지 20 초에 걸쳐 처리된다.

바람직하게는 성분의 냉각은 분쇄기에 들어가는 모든 성분이 0℃ 미만, 가장 바람직하게는 -20℃ 미만의 온도가 되게 하는 방식으로 실시된다.

바람직한 구현예에서, 모든 성분은 용기에 놓여지고, 그 용기로부터 혼합물이 공급장치, 가장 바람직하게는 계량 스크류 공급장치 (metering screw feeder) 에 이송된다. 공급장치에서 성분은 때때로 추가로 혼합되고 - 공급장치의 유형에 따라 - 부가적으로 냉각된다. 동결된 혼합물은 그 후 공급장치로부터 분쇄기로 이송되며, 분쇄기에서 분쇄되는 혼합물은 바람직하게는 0℃ 미만, 더욱 바람직하게는 -20 ℃ 미만의 온도를 갖는다.

전형적으로 공급장치에서의 성분의 혼합물의 체류 시간을 의미하는 블렌딩 시간은 1 분 초과, 바람직하게는 15 내지 60 분이다.

도세지 스네일 (dosage snail) 로도 호칭되는, 계량 스크류 공급장치는 전형적으로 10 내지 200 분당 회전수의 속도로 가동되고, 바람직하게는 40 내지 60 분당 회전수로 가동된다.

전형적으로, 분쇄기의 온도는 -50 내지 +30℃ 로 유지된다. 바람직한 구현예에서, 온도는 10℃ 근처에서 유지된다.

분쇄 동안 산소 수준은 바람직하게는 10% (v/v) 미만이다.

공정은 예를 들어 뱃치식 또는 연속식으로 실시될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 일정한 시간에 걸쳐, 성분의 혼합물을 냉각을 위해 공급장치 내에 영구적으로 채우고 냉각된 혼합물을 공급장치로부터 분쇄기 내로 영구적으로 채움으로써 본 발명에 따른 방법은 연속식으로 실시된다.

분쇄된 분말화된 배지를 사용하는 경우에 용매, 바람직하게는 물 (가장 특히 증류 및/또는 탈염수 또는 정제수 또는 주사용수) 또는 수성 완충제가 배지에 첨가되고, 배지가 용매에 완전히 용해될 때까지 성분이 혼합된다.

용매는 또한 염류, 적합한 pH 범위 (전형적으로 pH 1.0 내지 pH 10.0 범위) 를 제공하는 가용성 산 또는 염기 이온, 안정화제, 계면활성제, 보존제, 및 알코올 또는 기타 극성 유기 용매를 포함할 수 있다.

추가의 물질 예컨대 pH 조정을 위한 완충 물질, 소 태아 혈청, 당 등을, 세포 배양 배지 및 용매의 혼합물에 첨가하는 것이 또한 가능하다. 결과적인 액체 세포 배양 배지는 그 후 성장 또는 유지될 세포와 접촉된다.

pH 8.5 미만의 더 높은 농도의 티로신, 예를 들어 10g/ℓ L-티로신을 포함하는 배지 조성물은 용매와 혼합될 때 용해되지 않은 티로신으로 인해 혼탁함을 보일 것이지만, 동일한 농도의 티로신의 무기 에스테르 유도체를 사용하는 본 발명에 따른 세포 배양 배지는 투명한 용액을 초래한다.

본 발명은 또한 하기에 의한 세포 배양 방법에 관한 것이다:

a) 생물반응기를 제공하는 단계,

c) 단계 b) 의 혼합물을 인큐베이션하는 단계.

생물반응기는 내부에서 세포가 배양될 수 있는 임의의 용기 또는 탱크이다. 인큐베이션은 전형적으로 적합한 조건 예컨대 적합한 온도 등 하에 실시된다. 당업자는 세포의 성장/배양을 지지 또는 유지하기에 적합한 인큐베이션 조건을 알고 있다.

본 발명은 또한 피드 배지의 제조에 매우 적합하다는 것이 밝혀졌다. 특히 피드 배지에 필수적인 농도의, L-티로신 및 L-시스테인의 이용가능성의 한계로 인해, 이들 2 가지 분자는 전형적으로 염기성 pH 11.0-11.5 의 저장 용액으로 제조된다. 이러한 pH 는 전반적 생물약제 생물생산 과정에 음성 영향을 미친다. 대규모 생물반응기에서의 혼합 시간 및 염기성 pH 값은 합해서 세포에 대한 영양소 공급에 음성 영향을 미치고 강염기 pH 값에의 노출에 의해 세포 사망을 어느 정도 가속시킨다.

이는 상청액 내로 세포내 단백질의 방출을 초래한다. 이들 방출된 단백질은 온전한 세포 (intact cell) 에 부착하고, 온전한 세포는 그 후 서로 달라 붙고 응집물을 형성한다. 이러한 응집물은 확대된 질량 관성에 의해 파괴되고, 전반적 생물생산 과정이 생략되기 시작한다. 이들 과정은 어쨌든 산소 공급 한계 근처에서 조절되므로 선단 속도 (tip speed) 저하는 옵션이 아니다.

결과적으로 모든 필요한 성분을 하나의 피드에 고농도로 포함하는 피드 배지에 대한 필요가 존재한다. 또한 피드의 pH 는 세포 배양에 음성 영향을 미치지 않아야 한다.

L-티로신 및 L-시스테인의 무기 에스테르 유도체가 개선된 용해도 및/또는 안정성을 갖고, 8.5 미만의 pH 에서 세포 성장 및/또는 생산성에 대한 임의의 음성 효과 및 때때로 심지어는 양성 효과 없이 각각 L-티로신 및 L-시스테인 대신 고도로 농축된 피드 배지에 사용될 수 있다는 것이 밝혀졌다.

따라서 본 발명은 또한 분말화된 배지 형태 또는 용해 후에 액체 배지 형태의 피드 배지에 관한 것이다.

결과적인 액체 배지는 티로신 및/또는 시스테인의 무기 에스테르 유도체를 5 내지 40 mmol/ℓ, 바람직하게는 10 내지 30 mmol/ℓ 의 농도로 포함하고, 바람직하게는 8.5 이하의 pH 를 갖는다.

바람직한 구현예에서, pH 는 6.8 내지 8.4 이다.

본 발명은 또한 하기에 의한 생물반응기 내에서 세포를 배양하기 위한 페드-뱃치 방법에 관한 것이다:

- 생물반응기 내에서 세포를 인큐베이션하는 단계,

상기 피드 배지는 바람직하게는 pH 8.5 미만의 pH 를 갖고, 티로신 및/또는 시스테인의 하나 이상의 무기 에스테르 유도체를 포함함. 전형적으로 피드 배지는 용매에 용해되어 있는 100 내지 150 g/ℓ 의 고체 성분을 포함한다.

티로신 및/또는 시스테인의 무기 에스테르 유도체를 사용함으로써 모든 필수적 피드 성분을 고농도 (전체 농도 100 내지 150 g/ℓ) 로 포함하는 피드 배지가 수득될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 둘 이상의 상이한 피드 배지가 생물반응기에 공급되어야 하는 알려진 과정과 대조적으로, 본 발명은 모든 성분을 고농도로 포함하는 하나의 피드 배지의 사용을 가능하게 하는 방법 및 배지를 제공한다. 또한 본 발명에 따른 피드 배지의 pH 는 전형적으로 8.5 미만이다. 세포 배양 배지 및 피드 중 L-티로신 및 L-시스테인의 이용가능성의 제한으로 인해 이들 2 가지 분자는 전형적으로, 최신 기술에 따라, 염기성 pH 11.0-11.5 의 저장 용액으로서 제조된다. 이러한 pH 는 전반적 생물약제 생물생산 과정에 음성 영향을 미친다. 대규모 생물반응기에서의 혼합 시간 및 염기성 pH 값은 합해서 세포에 대한 영양소 공급에 음성 영향을 미치고 강염기 pH 값에의 노출에 의해 세포 사망을 어느 정도 가속시킨다. 본 발명에 따른 티로신 및/또는 시스테인의 무기 에스테르 유도체를 사용할 때, 피드 배지의 pH 는 8.5 미만으로 유지될 수 있지만, 그럼에도 불구하고 10 내지 13 mM 의 티로신 및/또는 시스테인의 무기 에스테르 유도체가 전체 농도 100 내지 150 g/ℓ 로 피드 배지에 존재한다.

결과적으로, 바람직한 구현예에서, 본 발명의 방법에서 인큐베이션 동안 연속적으로 또는 상기 시간 내에 한 번 또는 여러 번 생물반응기에 첨가되는 피드 배지는 항상 동일한 조성을 갖는다.

본 발명은 하기 도면 및 실시예에 의해 추가로 설명되나, 그에 제한되지 않는다.

위에 및 아래 언급된 모든 출원, 특허, 및 문헌 및 2012 년 11 월 14 일에 제출된 대응 EP 출원 EP 12007711.0 의 전체 공개는 본원에 참조로 포함된다.

실시예

하기 실시예는 본 발명의 현실적 적용을 나타낸다.

실시예 1

(S)-2-아미노-3-(4-포스포노옥시-페닐)-프로피온산 및 그의 염의 합성

(S)-2-아미노-3-(4-포스포노옥시-페닐)-프로피온산을 문헌 (P. F. Alewood, R. B. Johns, R. M. Valerio, Synthesis 1983, 30.) 에 따라 L-티로신으로부터 출발하여 합성하고, 후속적으로 그의 염으로 전환시킨다. 도 1 은 이나트륨 염의 합성의 반응식을 보여준다.

화학량론 및/또는 염기의 양이온을 변화시키는 것은 단일, 2- 또는 3배 하전된 티로신 포스폰산 염 또는 상이한 염을 각각 생산하는 것을 허용한다.

(S)-2-아미노-3-(4-포스포노옥시-페닐)-프로피온산

구조:

합성: 100 g (0,55 mol) L-티로신을 400 g (3,48 mol) 오르토인산에 용해시키고, 그에 뒤이어 309 g (2,13 mol) 오산화인을 5 개의 분량 (portion) 으로 냉각 하에 첨가함으로써 반응을 수행한다. 점성 용액을 20 시간 동안 80 ℃ 에서 교반하고, 그 후 40 ℃ 로 냉각시키고, 400 ㎖ 물을 첨가하여 가수분해한다. 용액을 부가적 1 시간 동안 80 ℃ 에서 교반하고, 그 후 60 ℃ 에서 3,8 ℓ 의 n-부탄올을 서서히 첨가한다. 냉각을 약 3 ℃ 까지 지속하고, 결과적인 현탁액을 여과한다. 수득된 무색 결정을 물, 에탄올 및 메틸 tert-부틸 에테르로 연속 세정하고, 그 후 진공에서 50 ℃ 에서 건조시킨다.

분석 데이타: 1H-NMR (D₂O, 400 MHz): δ = 2.94 (dd, 1 H), 3.13 (dd, 1 H), 3.79 (dd, 1 H), 7.08 - 7.18 (m, 4 H).

(S)-2-아미노-3-(4-포스포노옥시-페닐)-프로피온산 일나트륨 염

구조:

분석 데이타: 1H-NMR (D₂O, 400 MHz): δ = 3.03 (dd, 1 H), 3.21 (dd, 1 H), 3.91 (dd, 1 H), 7.11 - 7.16 (m, 2 H), 7.20 - 7.25 (m, 2 H). ICP-OES (wt-%): 관측치 8,3 %, 계산치 8,1%.

(S)-2-아미노-3-(4-포스포노옥시-페닐)-프로피온산 이나트륨 염

구조:

합성: 50 g (191 mmol) (S)-2-아미노-3-(4-포스포노옥시-페닐)-프로피온산을 EtOH (21 wt-%) 중 146 ㎖ (402 mmol) 의 NaOEt 의 용액에 녹이고, 그 후 12,5 ㎖ 물을 첨가한다. 무색 슬러리를 1 시간 동안 환류시키고, 0 ℃ 로 냉각시키고, 여과한다. 무색 생성물을 에탄올로 세정하고, 그 후 진공 중에서 50 ℃ 에서 건조시킨다.

분석 데이타: 1H-NMR (D₂O, 400 MHz): δ = 4.18 (dd, 1 H), 4.46 (dd, 1 H), 5.12 (dd, 1 H), 8.32 - 8.42 (m, 4 H). ICP-OES (wt-%): 관측치 14,1 %, 계산치 15,1%.

(S)-2-아미노-3-(4-포스포노옥시-페닐)-프로피온산 일칼륨 염

구조:

분석 데이타: 1H-NMR (D₂O, 400 MHz): δ = 3.08 (dd, 1 H), 3.29 (dd, 1 H), 3.97 (dd, 1 H), 7.16 - 7.22 (m, 2 H), 7.25 - 7.31 (m, 2 H). ICP-OES (wt-%): 관측치 12,6 %, 계산치 13,1%.

(S)-2-아미노-3-(4-포스포노옥시-페닐)-프로피온산 2:1-칼슘 염

구조:

분석 데이타: 1H-NMR (D₂O, 400 MHz): δ = 3.08 (dd, 1 H), 3.28 (dd, 1 H), 3.97 (dd, 1 H), 7.16 - 7.22 (m, 2 H), 7.25 - 7.31 (m, 2 H). ICP-OES (wt-%): 관측치 7,2 %, 계산치 7,2 %.

(S)-2-아미노-3-(4-포스포노옥시-페닐)-프로피온산 2:1-마그네슘 염

구조:

분석 데이타: 1H-NMR (D₂O, 400 MHz): δ = 3.07 (dd, 1 H), 3.29 (dd, 1 H), 3.97 (dd, 1 H), 7.16 - 7.22 (m, 2 H), 7.25 - 7.31 (m, 2 H). ICP-OES (wt-%): 관측치 4,3 %, 계산치 4,5%.

동등하게 하전된, 그러나 솔벤스 (solvens) 분리된 티로신 포스페이트 염 사이의 ¹H-NMR 스펙트럼의 스펙트럼 유사성으로 인해, ICP-OES 분광분석을 수행하여 상응하는 양이온을 분명하게 확인했다.

실시예 2

(S)-2-아미노-3-(4-술포노옥시-페닐)-프로피온산 및 그의 염의 합성

(S)-2-아미노-3-(4-술포노옥시-페닐)-프로피온산을 문헌 (* S. Futaki, T. Taike, T. Yagami, T. Ogawa, T. Akita, K. Kitagawa, J: Chem. Soc. Perkin Trans. I 1990, 1739.) 에 따라 L-티로신으로부터 출발하여 합성하고, 가능하게는 후속적으로 그의 염으로 전환시킨다.

도 2 는 나트륨 염의 합성의 반응식을 보여준다.

화학량론 및/또는 염기의 양이온을 변화시키는 것은 단일 또는 2-배 하전된 티로신 술폰산 염 또는 상이한 염을 각각 생산하는 것을 허용한다.

실시예 3

물에서의 용해도

L-티로신 (화합물 D1), (S)-2-아미노-3-(4-포스포노옥시-페닐)-프로피온산 (화합물 D2), (S)-2-아미노-3-(4-포스포노옥시-페닐)-프로피온산 나트륨 염 (화합물 D3) 및 (S)-2-아미노-3-(4-포스포노옥시-페닐)-프로피온산 이나트륨 염 (화합물 D4) 의 물에서의 용해도를 20, 25 및 30℃ 에서 시험한다. 표 1 은 결과를 보여준다.

실시예 4

복합 세포 배양 배지에서의 용해도

DMEM 으로서도 알려진, 둘베코 변형 이글 배지는 동물 세포를 성장시키기 위해 흔히 사용되는 배지이다. DMEM 의 성분은 다음과 같다 (단위: ㎎/ℓ):

무기 염:

CaCl ₂ (무수): 200.00

Fe(NO₃)ㆍ9H₂O: 0.10

KCl: 400.00

MgSO₄ (무수): 97.67

NaCl: 6400.00

NaH₂PO₄ㆍH₂O: 125.00

기타 성분:

D-글루코스: 4500.00

나트륨 피루베이트: 110.00

플루로닉 (Pluronic) 1000,00

Hepes 15 mM

아미노산:

L-아르기닌ㆍHCl: 84.00

L-시스틴ㆍ2HCl: 63.00

L-글루타민: 584.00

글리신: 30.00

L-히스티딘 HCl H₂O: 42.00

L-이소류신: 105.00

L-류신: 105.00

L-리신 HCl: 146.00

L-메티오닌: 30.00

L-페닐알라닌: 66.00

L-세린: 42.00

L-트레오닌: 95.00

L-트립토판: 16.00

L-티로신 2Naㆍ2H₂O: 248.00

L-발린: 94.00

비타민:

D-칼슘판토테네이트: 4.00

콜린 클로리드: 4.00

엽산: 4.00

i-이노시톨: 7.20

니아신아미드: 4.00

리보플라빈: 0.40

티아민ㆍHCl: 4.00

동일한 배지 조성물을 그러나 L-티로신 2Naㆍ2H₂O 를 (S)-2-아미노-3-(4-포스포노옥시-페닐)-프로피온산 이나트륨 염으로 동등 몰비로 대체하여 제조한다.

2 가지 배지 조성물 모두에서, 모든 성분을 혼합하고 도세지 스네일 및 핀 밀을 포함하는 본 발명의 방법에 따라 분쇄한다.

결과적인 분말화된 세포 배양 배지를 25℃ 에서 탈염수에 용해시킨다. 10 분의 혼합 (교반기를 갖춘 플라스크에서) 후에 용해도를 측정한다. 인산화 티로신 유도체를 포함하는 배지 조성물은 투명한 용액이지만, L-티로신을 포함하는 조성물은 투명하지 않고 탁함을 보인다.

세포 배양 실험

실시예 5

이 실험에 대한 데이타가 도 3 에 제시되어 있다. 티로신이 PTyr 염으로 대체된 화학 한정 배지에서의 뱃치 실험. PTyr 은 (S)-2-아미노-3-(4-포스포노옥시-페닐)-프로피온산 염을 의미한다. 배지에서 사용된 PTyr 의 농도가 티로신의 농도와 동일한 경우, 세포는 성장하지 않았다 (제시되지 않음). CDM 에 4,5mM 의 농도 (대조군에서의 1mM 과 비교됨) 로 용해된 경우, 세포는 성장할 수 있었으며, 이는 대조군에서처럼 심지어는 더 높은 최대 생세포 (viable cell) 밀도 및 전반적으로 연장된 성장 (2 일) 을 보여준다. 이후의 분석은 PTyr 유도체 합성 (합성 불순물 5% (w/w)) 에서 나오는 자유 티로신을 통해 초기 성장이 가능했음을 시사했다. 연장된 성장은 자유 티로신 및 포스페이트에서의 그의 대사적 절단 후에 PTyr 의 직접 효과로 인한 것일 수 있다.

실시예 6

이 실험에 대한 데이타가 도 4 에 제시되어 있다. 시스테인이 S-술포시스테인 나트륨 염 (동등 농도) 으로 대체된 화학 한정 배지에서의 뱃치 실험. 기초로서 사용된 CDM 분말은 시스테인 및 시스틴이 고갈되었고, 재구성 동안 대조군 조건의 경우 시스테인 (1,5 및 3mM) 으로 또는 시험 조건의 경우 S-술포시스테인 나트륨 염 (1,5 및 3mM) 으로 보충되었다.

세포는 시스테인 또는 S-술포시스테인 나트륨 염을 함유하는 화학 한정 배지에서 배양된 경우 비슷한 성장을 보였으며, 이는 S-술포시스테인 나트륨 염이 시스테인의 대체물로서 사용될 수 있다는 것을 보여준다.

실시예 7

도 5 및 6 은 페드-뱃치 과정에서 시간의 흐름에 따른 생세포 밀도 및 IgG 농도를 보여준다. 재조합 CHO 세포를 완전 화학 한정 기본 배지에서 성장시키고, pH 7.0 의 포스포-Tyr 염을 함유하는 피드를 제 3 일, 제 5 일, 제 7 일 및 제 9 일에 첨가한다 (3%, 6%, 6%, 6% 의 % v/v 의 첨가). 조건 1 은 PTyr 이나트륨 염에 해당하고, 조건 2 는 PTyr 칼륨 염에 해당하고, 조건 3 은 PTyr 마그네슘 염에 해당한다 (중성 pH 피드에 30 mM 의 농도로 용해됨). 이들 경우에, 시스테인은 여전히 pH 11 의 별도의 피드로서 첨가된다.

과정을 30 ㎖ 스핀 튜브에서 37℃, 5% CO₂, 진탕 (agitation) 320rpm 에서 수행한다. 대조군의 경우, 최신 기술에 따라, 티로신 2Na+ 및 시스테인을 별도의 피드에 pH 11 로 용해시키고, 제 3 일, 제 5 일, 제 7 일 및 제 9 일에 0.3%, 0.6%, 0.6% 및 0.6% 의 %(V/V) 로 첨가한다. 결과적으로, 주된 피드는 시스테인 및 티로신을 전혀 함유하지 않고, 위에 기재된 바와 같이 첨가된다.

글루코스 농도를 매일 측정하고, 2 g/ℓ 초과의 농도를 유지하도록 조정한다.

3 포스포Tyr 염 (나트륨, 칼륨, 마그네슘) 은 페드-뱃치 과정에서 성장 또는 역가에 음성 영향을 미치지 않으면서 고도로 농축된 중성 피드에 사용될 수 있으며, 따라서 전체 과정을 단순화시킨다는 것을 알 수 있다.

실시예 8

도 7 및 8 은 페드-뱃치 과정에서 시간의 흐름에 따른 생세포 밀도 및 IgG 농도를 보여준다. 재조합 CHO 세포를 완전 화학 한정 기본 배지 및 pH 7.0 의 S-술포시스테인 및 PTyr 2Na+ 둘다를 함유하는 피드에서 성장시킨다. 피드를 제 3 일, 제 5 일, 제 7 일, 제 9 일 및 제 14 일에 첨가한다 (3%, 6%, 6%, 6%, 3% 의 % v/v 의 첨가). 과정을 1.2 ℓ 생물반응기에서 37℃, pH 7.0, 50% 용존 산소, 진탕 140rpm 에서 수행한다. 대조군의 경우, 최신 기술에 따라, 티로신 2Na+ 및 시스테인을 별도의 피드에 pH 11 로 용해시키고, 제 3 일, 제 5 일, 제 7 일, 제 9 일 및 제 14 일에 0.3%, 0.6%, 0.6%, 0.6%, 0.3% 의 %(V/V) 로 첨가한다. 글루코스 농도를 매일 측정하고, 2 g/ℓ 초과의 농도를 유지하도록 조정한다.

주된 피드에서 S-술포시스테인의 사용 (여기에서 PTyr 2Na+ 와의 조합으로) 이 대조군에 비해 연장된 성장 유도하고 역가의 유의한 증가를 보인다는 것을 알 수 있다.

Claims

하기에 의한, 생물반응기 내에서 포유류 세포를 배양하기 위한 페드-뱃치 방법 (fed batch process)으로서:
- 생물반응기 내에 포유류 세포 및 수성 세포 배양 배지를 채우는 단계,
- 생물반응기 내에서 포유류 세포를 인큐베이션하는 단계,
- 생물반응기 내에서의 포유류 세포의 전체 인큐베이션 시간에 걸쳐 연속적으로 또는 상기 인큐베이션 시간 내에 한 번 또는 여러 번 세포 배양 배지를, 이 경우에 피드 배지를, 생물반응기에 첨가하는 단계,
상기 피드 배지는 하나 이상의 티로신 또는 시스테인의 포스페이트 또는 술페이트 에스테르 유도체를 포함하고,
상기 티로신 또는 시스테인의 포스페이트 또는 술페이트 에스테르 유도체는 (S)-2-아미노-3-(4-포스포노옥시-페닐)-프로피온산 또는 그의 염, 및 (S)-2-아미노-3-술포술파닐-프로판산 또는 그의 염으로부터 선택되는 것인, 페드-뱃치 방법.
제 1 항에 있어서, 피드 배지가 하나 이상의 티로신 또는 시스테인의 포스페이트 또는 술페이트 에스테르 유도체를 10 내지 30 mmol/ℓ 의 농도로 포함하는 것을 특징으로 하는, 페드-뱃치 방법.
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제 1 항에 있어서, 피드 배지가 (S)-2-아미노-3-(4-포스포노옥시-페닐)-프로피온산 또는 그의 염을 포함하는 것을 특징으로 하는, 페드-뱃치 방법.
제 1 항에 있어서, 피드 배지가 (S)-2-아미노-3-(4-포스포노옥시-페닐)-프로피온산 이나트륨 염을 포함하는 것을 특징으로 하는, 페드-뱃치 방법.
제 1 항에 있어서, 피드 배지가 용매에 용해되어 있는 100 내지 150 g/ℓ의 고체 성분을 포함하는 것을 특징으로 하는, 페드-뱃치 방법.
제 1 항에 있어서, 피드 배지가 pH 8.5 미만의 pH 를 갖는 것을 특징으로 하는, 페드-뱃치 방법.
제 1 항에 있어서, 피드 배지의 pH 가 6.5 내지 8.5 인 것을 특징으로 하는, 페드-뱃치 방법.
제 1 항에 있어서, 피드 배지의 pH 가 6.8 내지 7.8 인 것을 특징으로 하는, 페드-뱃치 방법.
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