CN112063684A - 检测化妆品中非法添加抗生素的方法以及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了检测化妆品中非法添加抗生素的方法以及试剂盒，包括以下：步骤a，样品前处理；步骤b，目标菌液制备；步骤c，试剂盒培养；步骤d，判定标准；步骤e，定性判定。本发明的检测方法检测范围可覆盖全部抗生素种类，操作简便，检测用时少，只需两个小时即可得到检测结果，不需要大型的分析仪器，分析成本低，便于操作，灵敏度高，准确率高，特别适用于对化妆品中非法添加抗生素进行大批量快速筛查检测。

Description

检测化妆品中非法添加抗生素的方法以及试剂盒
技术领域
本发明涉及化妆品领域，特别是涉及检测化妆品中非法添加抗生素的方法以及试剂盒。
背景技术
抗生素是一类处方药，长期使用，可引起接触性皮炎等不良反应，表现为红斑、水肿、糜烂、脱屑、渗出、瘙痒、灼热等。我国《化妆品卫生规范》（2007年版）规定，抗生素类成分为化妆品禁用组分，欧盟对此也规定化妆品中不得添加抗生素。因此，在化妆品中添加抗生素属于违规行为。
但是国内化妆品中抗生素非法添加情况严重，滥用抗生素，容易产生耐药菌，照成抗生素的使用寿命大大缩短，催生了超级细菌，对广大群众的生命安全照成了极大威胁。
现有技术常用方法包括色谱分析法和微生物检测法。色谱分析法样品需要进行复杂的前处理，分析速度慢，仪器要求高，对检测人员要求高。微生物检测法是根据样品对微生物的抑制作用，来定性或定量检测样品中是否添加有的抗生素，现有的微生物检测方法需要使用特定的菌种对特定的某些抗生素进行检测，菌种不易获得并且检测耗时长，检测结果需肉眼判断，易产生误差。而且以上两类现有方法均为一次检测实验只能检测某些特定种类的抗生素，无法对全部抗生素进行覆盖检测，漏检率高，容易造成假阴性，检测意义大打折扣。
因此，需要开发一种检测范围可以覆盖全部抗生素种类、操作简便、耗时短，不需要大型的分析仪器，灵敏度高，检验结果正确率高，适用于检测化妆品中非法添加抗生素的方法以及使用的试剂盒。
发明内容
本发明的目的在于提供检测化妆品中非法添加抗生素的方法以及试剂盒。根据本发明的一个方面，提供了检测化妆品中非法添加抗生素的方法，包括以下：
步骤a，前处理：
待测样品前处理：随机抽取待检测样品，取一定量的所述样品置于试剂盒A中，振荡混匀，使样品充分分散，并过滤除菌，得到待测样液；
空白对照前处理：取一定量的灭菌水置于另一试剂盒A中，振荡混匀，使灭菌水充分分散，并过滤除菌，得到空白对照样液，所述试剂盒A包括五指毛桃醇提取物和纯化水，所述五指毛桃醇提取物是以醇溶液作为提取剂得到的五指毛桃醇溶液提取物，所述试剂盒A为无菌试剂盒；
步骤b，目标菌液制备：
根据所要求检测的抗生素种类，选择一种或多种目标菌并制备相应的目标菌液，所述目标菌液中含有一种细菌或真菌，所述目标菌液的初始活菌浓度为100-10000cfu/ml；
步骤c，试剂盒培养：
取相同体积的所述待测样液和所述空白对照样液分别加入试剂盒B中，振荡混匀，得到加样试剂盒和空白对照试剂盒，向所述加样试剂盒与所述空白对照试剂盒中分别加入相同且等量的所述目标菌液，在相同的培养条件下，在培养30min、60min、90min和120min时，分别测定所述加样试剂盒中各目标菌的活菌浓度，分别测定所述空白对照试剂盒中各目标菌的活菌浓度，得到各所述目标菌的样品活菌浓度与空白对照活菌浓度，根据以下公式计算得到在培养30min、60min、90min和120min时各所述目标菌的活菌生长率，所述试剂盒B包括水杨梅水提取物、蛋白胨、牛肉膏、氯化钠和纯化水，所述试剂盒B为无菌试剂盒，所述公式为：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
步骤d，判定标准：
以含0.3%氯霉素的样品作为加标样品，以大肠杆菌为目标菌按照所述步骤a~c在相同培养条件下，进行培养，以计算得到培养30min、60min、90min和120min时的活菌生长率为标准生长率，作为判定标准，所述判定标准为：培养30min的标准生长率为75%，培养60min的标准生长率为50%，培养90min的标准生长率为46%，培养120min的标准生长率为41%；
步骤e，定性判定：
当各所述目标菌的活菌生长率之一小于等于对应培养时间的所述标准生长率，判定为阳性，即所对应的待测样品中非法添加抗生素，当各所述目标菌的活菌生长率均大于对应培养时间的所述标准生长率，则可判定阴性，即所对应的待测样品中没有非法添加抗生素。
本发明的有益效果：本发明的试剂盒A和试剂盒B中的五指毛桃醇提取物和水杨梅水提取物可以去除化妆品中防腐剂对检测结果的干扰，使用两种试剂盒对样品进行二次稀释，可以去除化妆品中植物提取物对检测结果的干扰，保证检测结果的准确度更高；采用本发明的方法可以对全部种类的抗生素进行检测，使方法不受样品中添加对象的限制，解决了现有技术一次检测只能检测一种或几种特定抗生素的问题；本发明还提供了以0.3%氯霉素加标样品的大肠杆菌标准生长率这一固定值作为判定标准，定性判定时可以直接使用判定标准进行判定，简便快捷，减少工作量，同时缩短了检测时间，只需要两个小时的快速检测即可得到检测结果，适合对化妆品进行大批量快速检测和筛查。
本发明的检测方法检测范围可覆盖全部抗生素种类，操作简便，检测用时少，只需两个小时即可得到检测结果，不需要大型的分析仪器，分析成本低，便于操作，灵敏度高，准确率高，特别适用于对化妆品中非法添加抗生素进行大批量快速粗筛检测。
在一些实施方式中，检测化妆品中非法添加抗生素的方法，其特征在于，包括以下：
步骤a，前处理：
待测样品前处理：随机抽取待检测样品，取一定量的所述样品置于试剂盒A中，振荡混匀，使所述样品充分分散，并过滤除菌，得到待测样液；
空白对照前处理：取一定量的灭菌水置于另一试剂盒A中，振荡混匀，使所述灭菌水充分分散，并过滤除菌，得到空白对照样液，所述试剂盒A包括五指毛桃醇提取物和纯化水，所述五指毛桃醇提取物是以醇溶液作为提取剂得到的五指毛桃醇溶液提取物，所述试剂盒A为无菌试剂盒；
加标样品制备：向不含有抗生素的化妆品中分别添加氯霉素、甲硝唑、硝酸咪康唑和阿莫西林，制备得到含0.3%氯霉素加标样品、含0.05%甲硝唑加标样品、含0.03%硝酸咪康唑加标样品和含0.02%阿莫西林加标样品；
加标样品前处理：根据所要求检测的抗生素种类，取一定量的一种或多种所述加标样品，分别置于相应的试剂盒A中，振荡混匀，使所述加标样品充分分散，并过滤除菌，得到加标样液。
步骤b，目标菌液制备：
根据所述步骤a中选择的加标样品，选择与所述加标样品对应的目标菌并制备相应的目标菌液，所述目标菌液中含有一种细菌或真菌，所述目标菌液的活菌浓度为100-10000cfu/ml；
步骤c，试剂盒培养：
取相同体积的所述待测样液、所述空白对照样液和所述加标样液分别加入试剂盒B中，振荡混匀，得到加样试剂盒、空白对照试剂盒和加标试剂盒，向所述加样试剂盒、所述空白对照试剂盒中分别加入相同体积的所述目标菌液，向所述加标试剂盒中加入相同体积的与所述加标样品相对应的所述目标菌液，在相同的培养条件下，培养相同时间后，分别测定所述加样试剂盒、所述空白对照试剂盒和所述加标试剂盒中各目标菌的活菌浓度，根据以下公式计算得到，所述待测样品与所述加标样品的各所述目标菌的活菌生长率，所述试剂盒B包括水杨梅水提取物、蛋白胨、牛肉膏、氯化钠和纯化水，所述试剂盒B为无菌试剂盒，所述公式为：
Figure 724206DEST_PATH_IMAGE001
步骤d，校正后判定标准：
以所述加标样品的目标菌的活菌生长率为该所述目标菌的标准生长率，并以所述标准生长率作为校正后判定标准；
步骤e，定性判定：
当待测样品的各所述目标菌的活菌生长率之一小于等于对应目标菌的所述标准生长率，即可判定为阳性，即所对应的待测样品中非法添加抗生素，当待测样品的各所述目标菌的活菌生长率均大于对应目标菌的所述标准生长率时，则可判定阴性，即所对应的待测样品中没有非法添加抗生素。本方法根据0.3%氯霉素的加标样品，以大肠杆菌在培养时间30min的活菌生长率数值为标准生长率，测算出甲硝唑、硝酸咪康唑和阿莫西林常用抗生素的加标浓度，并制备相应加标样品，将加标样品与待测样品同时进行培养检测，用加标样品目标菌的实测活菌生长率作为标准生长率，对判定标准进行动态校正，校正后的判定标准，使定性判定更加精确，减少因检测过程中外界因素造成的误差，避免假阳性或者假阴性情况的出现，适用于对化妆品中是否添加抗生素的大批量精确检测。
在一些实施方式中，培养时间为30min、60min、90min和120min中的任一种。在检测过程中，操作人员可以根据具体实验安排和单位时间内测定能力的限制，合理选择和安排每批样品的培养时间，从而实现大批量快速筛查和检测。
在一些实施方式中，目标菌是革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、厌氧菌和真菌中的一种或多种。本发明的方法中使用的目标菌不受菌种的限制，目标菌的选择范围涵盖全部真菌和细菌，目标菌可以检测的抗生素的范围相应地为全部种类的抗生素。用户可以根据实际情况和检测需要选择任何一种菌作为目标菌，保证了本发明方法有极高的适用性，限制因素少。
在一些实施方式中，厌氧菌以痤疮丙酸杆菌为代表菌，真菌以念珠菌为代表菌，革兰氏阳性菌以葡萄球菌为代表菌，革兰氏阴性菌以大肠杆菌为代表菌，目标菌是葡萄球菌、大肠杆菌、痤疮丙酸杆菌和念珠菌中的一种或多种。本发明的方法在使用时，可以根据具体检测对象和检测要求，选择合适的目标菌，目标菌可以是一种也可以是多种，目标菌所对应的抗生素种类要能涵盖所需要检测的抗生素的种类。用户可以根据实际情况和检测需要选择目标菌，使本方法在实际使用中有很强的灵活性，检测范围广，可以一次对抗生素全族进行残留检测。
在一些实施方式中，痤疮丙酸杆菌制备得到痤疮丙酸杆菌菌液，痤疮丙酸杆菌菌液用于对应检测甲硝唑类抗生素，念珠菌制备得到念珠菌菌液，所述念珠菌菌液用于对应检测抗真菌类抗生素，葡萄球菌制备得到葡萄球菌菌液，葡萄球菌菌液用于对应检测除甲硝类抗生素和抗真菌类抗生素以外的抗生素，大肠杆菌制备得到大肠杆菌菌液，大肠杆菌菌液用于对应检测除甲硝类抗生素和抗真菌类抗生素以外的抗生素。相应的目标菌对应相应的抗生素种类，便于用户在使用中选择合适的目标菌。
在一些实施方式中，试剂盒A中五指毛桃醇提取物的质量体积百分比为0.1%~1%，其余部分由所述纯化水补足。五指毛桃醇提取物以醇溶液作为提取剂得到的五指毛桃醇溶液提取物，其中含有的抗氧化物质，可以吸收待测化妆品中含有的防腐剂释放出的甲醛，减少防腐剂对培养过程的干扰。
在一些实施方式中，五指毛桃醇溶液提取物是以体积浓度为40%的醇溶液作为提取剂得到的五指毛桃40%醇溶液提取物，40%醇溶液为40%甲醇溶液或40%乙醇溶液中的一种。使用体积浓度为40%的醇溶液作为提取剂，得到的五指毛桃40%醇溶液提取物中含有的抗氧化物质，可以吸收待测化妆品中含有的防腐剂释放出的甲醛，减少防腐剂对培养过程的干扰。
在一些实施方式中，试剂盒B中各组分的质量体积百分比为：水杨梅水提取物0.1%~1%，蛋白胨0.1%~1%，牛肉膏粉0.1%~1%，氯化钠0.1%~1%，，其余部分由所述纯化水补足。水杨梅水提取物可以可以吸收待测化妆品中含有的防腐剂释放出的甲醛，减少防腐剂对培养过程的干扰。试剂盒B中的其他组分为目标菌培养提供必需的营养供给。
在一些实施方式中，检测化妆品中非法添加抗生素的试剂盒包括试剂盒A和试剂盒B，试剂盒A按照质量体积百分比计包括以下组分：五指毛桃40%醇溶液提取物0.1%~1%，其余部分由所述纯化水补足，试剂盒B按照质量分数计包括以下组分：水杨梅水提取物0.1%~1%，蛋白胨0.1%~1%，牛肉膏粉0.1%~1%，氯化钠0.1%~1%，其余部分由所述纯化水补足，所述五指毛桃40%醇溶液提取物是以体积浓度为40%的醇溶液作为提取剂得到的提取物，所述40%醇溶液为40%甲醇溶液或40%乙醇溶液中的一种。待测样液经过试剂盒A和试剂盒B的二次稀释，稀释倍数达到400~500倍，可以去除化妆品中植物提取物对细菌或真菌培养的干扰影响，以体积浓度为40%的醇溶液作为提取剂进行提取，得到五指毛桃40%醇溶液提取物，其中含有抗氧化物质。五指毛桃40%醇溶液提取物和试剂盒B中水杨梅水提取物可以去除化妆品中防腐剂对目标菌培养的干扰影响。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明作进一步详细的说明。
实施例1
本实施例中的五指毛桃40%甲醇溶液提取物和五指毛桃40%乙醇溶液提取物选择陕西斯诺特生物技术有限公司供应的泥鳅提取物，水杨梅水提取物选择西安瑞尔丽生物工程有限公司供应的水杨梅水提取物，蛋白胨选择国药集团化学试剂有限公司供应的生物试剂（BR级）蛋白胨，牛肉膏粉选择上海一研生物科技有限公司供应的生物试剂（BR级）牛肉膏粉，氯化钠选择国药集团化学试剂有限公司供应的分析纯氯化钠；
本实施例中离心机选择湘仪离心机仪器有限公司供应的HT175R台式高速冷冻离心机，0.45的微孔滤膜选择上海艾研生物科技有限公司供应的美国Millipore0.45μm的一次性针头滤器，显微镜选择奥林巴斯（北京）销售服务有限公司供应的CX43生物显微镜；
本实施例中需要配制的试剂及加标样品：
目标菌液：按菌液活化要求对目标菌进行传代2-3代，然后加水稀释，使得菌液浓度为100-10000 cfu/ml之间，制备得到目标菌液；
营养肉汤液体培养基：取蛋白胨10.0g、氯化钠5.0g、牛肉浸出粉3.0g，加蒸馏水1000ml，溶解后煮沸、过滤，调节pH值7.0~7.4，分装，灭菌；
含0.3%氯霉素加标样品：称取0.3g氯霉素用5ml乙醇溶解，置于100ml容量瓶中，用水稀释并定容；
含0.05%甲硝唑加标样品：称取0.5g甲硝唑用5ml乙醇溶解，置于100ml容量瓶中，用水稀释并定容；
含0.03%硝酸咪康唑加标样品：称取0.03g硝酸咪康唑用5ml乙醇溶解，置于100ml容量瓶中，用水稀释并定容；
含0.02%阿莫西林加标样品：称取0.03g阿莫西林用5ml乙醇溶解，置于100ml容量瓶中，用水稀释并定容。
以下实施例2-11均采用本实施例1中的试剂、仪器、配制的试剂及加标样品。
实施例2
本发明的检测化妆品中非法添加抗生素的方法，包括以下：
步骤a，前处理：
试剂盒A为无菌试剂盒，由以下组分组成：五指毛桃40%甲醇溶液提取物0.02g，纯化水20ml。
待测样品前处理：随机抽取待检测的祛痘产品作为样品，取1.0g样品置于无菌试剂盒A中，振荡混匀，使样品充分分散，用已灭菌的0.45μl的微孔滤膜过滤除菌，得到待测样液。
空白对照前处理：取1.0g的灭菌水置于另一无菌试剂盒A中，振荡混匀，使灭菌水充分分散，用已灭菌的0.45μl的微孔滤膜过滤除菌，得到空白对照样液；
步骤b，目标菌液制备：
根据所要求检测的抗生素种类，选择痤疮丙酸杆菌为目标菌并制备相应的痤疮丙酸杆菌菌液，痤疮丙酸杆菌菌液的初始活菌浓度为100cfu/ml；
步骤c，试剂盒培养：
试剂盒B为无菌试剂盒，包括以下组分：水杨梅水提取物0.02g，蛋白胨0.02g，牛肉膏粉0.02g，氯化钠0.02g，纯化水20ml。
取1.0ml的待测样液和1.0ml的空白对照样液分别加入到无菌试剂盒B中，振荡混匀，得到加样试剂盒和空白对照试剂盒。向加样试剂盒与空白对照试剂盒中分别加入1.0ml痤疮丙酸杆菌菌液，在相同的培养条件下，在培养30min时，使用显微镜分别对加样试剂盒和空白对照试剂盒中的培养液进行痤疮丙酸杆菌计数，分别测定加样试剂盒与空白对照试剂盒中痤疮丙酸杆菌的活菌浓度，得到痤疮丙酸杆菌的样品活菌浓度与空白对照活菌浓度，根据以下公式计算得到在培养30min时痤疮丙酸杆菌的活菌生长率为5%，计算公式为：
Figure 102098DEST_PATH_IMAGE001
步骤d，判定标准：
判定标准为：培养30min的标准生长率为75%，培养60min的标准生长率为50%，培养90min的标准生长率为46%，培养120min的标准生长率为41%；
步骤e，定性判定：
培养30min的痤疮丙酸杆菌的活菌生长率为5%，小于培养30min的标准生长率，判定为阳性，即所对应的待测祛痘产品样品中非法添加抗生素。
实施例3
本发明的检测化妆品中非法添加抗生素的方法，包括以下：
步骤a，前处理：
试剂盒A为无菌试剂盒，由以下组分组成：五指毛桃40%甲醇溶液提取物0.2g，纯化水20ml。
待测样品前处理：随机抽取待检测的去屑洗发水作为样品，取1.0g样品置于无菌试剂盒A中，振荡混匀，使样品充分分散，用已灭菌的0.45μl的微孔滤膜过滤除菌，得到待测样液。
空白对照前处理：取1.0g的灭菌水置于另一无菌试剂盒A中，振荡混匀，使灭菌水充分分散，用已灭菌的0.45μl的微孔滤膜过滤除菌，得到空白对照样液；
步骤b，目标菌液制备：
根据所要求检测的抗生素种类，选择念珠菌为目标菌并制备相应的念珠菌菌液，念珠菌菌液的初始活菌浓度为1000cfu/ml；
步骤c，试剂盒培养：
试剂盒B为无菌试剂盒，包括以下组分：水杨梅水提取物0.2g，蛋白胨0.2g，牛肉膏粉0.2g，氯化钠0.2g，纯化水20ml。
取1.0ml的待测样液和1.0ml的空白对照样液分别加入到无菌试剂盒B中，振荡混匀，得到加样试剂盒和空白对照试剂盒。向加样试剂盒与空白对照试剂盒中分别加入1.0ml念珠菌菌液，在相同的培养条件下，在培养60min时，使用显微镜分别对加样试剂盒和空白对照试剂盒中的培养液进行念珠菌计数，分别测定加样试剂盒与空白对照试剂盒中念珠菌的活菌浓度，得到念珠菌的样品活菌浓度与空白对照活菌浓度，根据以下公式计算得到在培养60min时念珠菌的活菌生长率为3%，计算公式为：
Figure 171685DEST_PATH_IMAGE001
步骤d，判定标准：
判定标准为：培养30min的标准生长率为75%，培养60min的标准生长率为50%，培养90min的标准生长率为46%，培养120min的标准生长率为41%；
步骤e，定性判定：
培养60min的念珠菌的活菌生长率为3%，小于培养60min的标准生长率，判定为阳性，即所对应的去屑洗发水样品中非法添加有抗生素。
实施例4
本发明的检测化妆品中非法添加抗生素的方法，包括以下：
步骤a，前处理：
试剂盒A为无菌试剂盒，由以下组分组成：五指毛桃40%乙醇溶液提取物0.01g，纯化水10ml。
待测样品前处理：随机抽取待检测的祛痘洗面奶产品作为样品，取0.5g样品置于无菌试剂盒A中，振荡混匀，并在50℃条件下进行水浴5min，使样品充分分散，用已灭菌的0.45μl的微孔滤膜过滤除菌，得到待测样液。
空白对照前处理：取0.5g的灭菌水置于另一无菌试剂盒A中，振荡混匀，并在50℃条件下进行水浴5min，使灭菌水充分分散，用已灭菌的0.45μl的微孔滤膜过滤除菌，得到空白对照样液；
步骤b，目标菌液制备：
根据所要求检测的抗生素种类，选择痤疮丙酸杆菌和大肠杆菌这两种菌作为目标菌，制备痤疮丙酸杆菌菌液和大肠杆菌菌液，痤疮丙酸杆菌菌液和含有大肠杆菌菌液的初始活菌浓度均为5000cfu/ml；
步骤c，试剂盒培养：
试剂盒B为无菌试剂盒，包括以下组分：水杨梅水提取物0.01g，蛋白胨0.01g，牛肉膏粉0.01g，氯化钠0.01g，纯化水10ml。
取0.5ml的待测样液和0.5ml的空白对照样液分别加入到无菌试剂盒B中，振荡混匀，得到加样试剂盒和空白对照试剂盒。分别向加样试剂盒和空白对照试剂盒中加入0.5ml痤疮丙酸杆菌菌液和0.5ml大肠杆菌菌液。在相同的培养条件下，在培养90min时，使用显微镜分别对加样试剂盒和空白对照试剂盒中的培养液进行痤疮丙酸杆菌和大肠杆菌计数，分别测定加样试剂盒与空白对照试剂盒中痤疮丙酸杆菌与大肠杆菌的活菌浓度，得到痤疮丙酸杆菌的样品活菌浓度与空白对照活菌浓度，以及大肠杆菌的样品活菌浓度与空白对照活菌浓度，根据以下公式计算得到在培养90min时痤疮丙酸杆菌的活菌生长率为2%，大肠杆菌的活菌生长率为7%，计算公式为：
Figure 635027DEST_PATH_IMAGE001
步骤d，判定标准：
判定标准为：培养30min的标准生长率为75%，培养60min的标准生长率为50%，培养90min的标准生长率为46%，培养120min的标准生长率为41%；
步骤e，定性判定：
培养90min的痤疮丙酸杆菌的活菌生长率为4%，大肠杆菌的活菌生长率为7%，均小于培养90min的标准生长率，判定为阳性，即所对应的去屑洗发水样品中非法添加有抗生素。
实施例5
本发明的检测化妆品中非法添加抗生素的方法，包括以下：
步骤a，前处理：
试剂盒A为无菌试剂盒，由以下组分组成：五指毛桃40%甲醇溶液提取物0.1g，纯化水20ml。
待测样品前处理：随机抽取待检测的抑菌香皂产品作为样品，取0.8g样品置于无菌试剂盒A中，振荡混匀，并在50℃条件下进行水浴5min，使样品充分分散，用已灭菌的0.45μl的微孔滤膜过滤除菌，得到待测样液。
空白对照前处理：取0.8g的灭菌水置于另一无菌试剂盒A中，振荡混匀，并在50℃条件下进行水浴5min，使灭菌水充分分散，用已灭菌的0.45μl的微孔滤膜过滤除菌，得到空白对照样液；
步骤b，目标菌液制备：
根据所要求检测的抗生素种类，选择痤疮丙酸杆菌、大肠杆菌、念珠菌和葡萄球菌这四种作为目标菌，制备痤疮丙酸杆菌菌液、大肠杆菌菌液、念珠菌菌液和葡萄球菌菌液，痤疮丙酸杆菌菌液、大肠杆菌菌液、念珠菌菌液和葡萄球菌菌液的初始活菌浓度均为8000cfu/ml；
步骤c，试剂盒培养：
试剂盒B为无菌试剂盒，包括以下组分：水杨梅水提取物0.1g，蛋白胨0.1g，牛肉膏粉0.1g，氯化钠0.1g，纯化水20ml。
取1.0ml的待测样液和1.0ml的空白对照样液分别加入到无菌试剂盒B中，振荡混匀，得到加样试剂盒和空白对照试剂盒。分别向加样试剂盒和空白对照试剂盒中加入1.0ml痤疮丙酸杆菌菌液、1.0ml大肠杆菌菌液、1.0ml念珠菌菌液和1.0ml葡萄球菌菌液。在相同的培养条件下，培养120min时，使用显微镜分别对加样试剂盒和空白对照试剂盒中的培养液进行各目标菌计数，分别测定加样试剂盒与空白对照试剂盒中痤疮丙酸杆菌、大肠杆菌、念珠菌和葡萄球菌的活菌浓度，得到痤疮丙酸杆菌的样品活菌浓度与空白对照活菌浓度，大肠杆菌的样品活菌浓度与空白对照活菌浓度，念珠菌的样品活菌浓度与空白对照活菌浓度，葡萄球菌的样品活菌浓度与空白对照活菌浓度。根据以下公式计算得到在培养120min时痤疮丙酸杆菌的活菌生长率为52%，在培养120min时大肠杆菌的活菌生长率为57%，在培养120min时念珠菌的活菌生长率为50%，在培养120min时葡萄球菌的活菌生长率为48%，计算公式为：
Figure 713842DEST_PATH_IMAGE001
步骤d，判定标准：
判定标准为：培养30min的标准生长率为75%，培养60min的标准生长率为50%，培养90min的标准生长率为46%，培养120min的标准生长率为41%；
步骤e，定性判定：
培养120min时痤疮丙酸杆菌的活菌生长率为52%，大肠杆菌的活菌生长率为57%，念珠菌的活菌生长率为50%，葡萄球菌的活菌生长率为48%，均大于培养120min的标准生长率，判定为阴性，即所对应的抑菌香皂样品中没有非法添加抗生素。
实施例6
本发明的检测化妆品中非法添加抗生素的方法，包括以下：
步骤a，前处理：
试剂盒A为无菌试剂盒，由以下组分组成：五指毛桃40%甲醇溶液提取物0.1g，纯化水20ml。
待测样品前处理：随机抽取待检测祛痘洗面奶样品，取1.0g所述样品置于无菌试剂盒A中，振荡混匀，使样品充分分散，用已灭菌的0.45μl的微孔滤膜过滤除菌，得到待测样液。
空白对照前处理：取1.0g灭菌水置于另一无菌试剂盒A中，振荡混匀，使灭菌水充分分散，用已灭菌的0.45μl的微孔滤膜过滤除菌，得到空白对照样液；
加标样品制备：向不含有抗生素的化妆品中分别添加氯霉素、甲硝唑、硝酸咪康唑和阿莫西林，制备得到含0.3%氯霉素加标样品、含0.05%甲硝唑加标样品、含0.03%硝酸咪康唑加标样品和0.02%阿莫西林加标样品；
加标样品前处理：根据所要求检测的抗生素种类，取1.0g含0.05%甲硝唑加标样品与1.0g含0.3%氯霉素加标样品，分别置于相应的无菌试剂盒A中，振荡混匀，使含0.05%甲硝唑加标样品与含0.3%氯霉素加标样品充分分散，用已灭菌的0.45μl的微孔滤膜过滤除菌，得到甲硝唑加标样液和氯霉素加标样液。
步骤b，目标菌液制备：
根据步骤a中选择的含0.05%甲硝唑加标样品与含0.3%氯霉素加标样品，选择痤疮丙酸杆菌与大肠杆菌作为目标菌，并制备相应的痤疮丙酸杆菌菌液和大肠杆菌菌液，痤疮丙酸杆菌菌液和大肠杆菌菌液的初始活菌浓度均为5000cfu/ml；
步骤c，试剂盒培养：
试剂盒B为无菌试剂盒，包括以下组分：水杨梅水提取物0.1g，蛋白胨0.1g，牛肉膏粉0.1g，氯化钠0.1g，纯化水20ml。
取1.0ml待测样液、1.0ml甲硝唑加标样液和1.0ml氯霉素加标样液分别加入无菌试剂盒B中，振荡混匀，得到加样试剂盒、空白对照试剂盒、甲硝唑加标试剂盒和氯霉素加标试剂盒，分别向加样试剂盒和空白对照试剂盒中加入1.0ml痤疮丙酸杆菌菌液和1.0ml大肠杆菌菌液，向甲硝唑加标试剂盒中加入1.0ml痤疮丙酸杆菌菌液，向氯霉素加标试剂中加入1.0ml大肠杆菌菌液。在相同的培养条件下，培养30min后，使用显微镜分别对加样试剂盒、空白对照试剂盒、甲硝唑加标试剂盒和氯霉素加标试剂盒中的培养液进行各目标菌计数，分别测定加样试剂盒、空白对照试剂盒、甲硝唑加标试剂盒和氯霉素加标试剂盒中痤疮丙酸杆菌和大肠杆菌的活菌浓度，根据以下公式计算得到培养30min后，待测样品、含0.05%甲硝唑加标样品与0.3%氯霉素加标样品的痤疮丙酸杆菌和大肠杆菌的活菌生长率，其中，待测样品的痤疮丙酸杆菌的活菌生长率为10%，待测样品的大肠杆菌的活菌生长率为23%，含0.05%甲硝唑加标样品的痤疮丙酸杆菌的活菌生长率为76%，含0.3%氯霉素加标样品的大肠杆菌的活菌生长率为75%，计算公式为：
Figure 572339DEST_PATH_IMAGE001
步骤d，校正后判定标准：
以含0.05%甲硝唑加标样品的痤疮丙酸杆菌的活菌生长率76%为本实施例的痤疮丙酸杆菌的标准生长率，含0.3%氯霉素加标样品的大肠杆菌的活菌生长率75%为本实施例的大肠杆菌的标准生长率，以上述痤疮丙酸杆菌和大肠杆菌的标准生长率共同作为校正后的判定标准；
步骤e，定性判定：
待测样品的痤疮丙酸杆菌的活菌生长率为10%，小于痤疮丙酸杆菌的标准生长率，待测样品中的大肠杆菌的活菌生长率为23%，小于大肠杆菌的标准生长率，判定为阳性，即所对应的待测样品中非法添加抗生素。
实施例7
本发明的检测化妆品中非法添加抗生素的方法，包括以下：
步骤a，前处理：
试剂盒A为无菌试剂盒，由以下组分组成：五指毛桃40%乙醇溶液提取物0.02g，纯化水20ml。
待测样品前处理：随机抽取待检测去屑洗发水样品，取0.1g样品置于无菌试剂盒A中，振荡混匀，使样品充分分散，用已灭菌的0.45μl的微孔滤膜过滤除菌，得到待测样液。
空白对照前处理：取0.1g灭菌水置于另一无菌试剂盒A中，振荡混匀，使灭菌水充分分散，用已灭菌的0.45μl的微孔滤膜过滤除菌，得到空白对照样液；
加标样品制备：向不含有抗生素的化妆品中分别添加氯霉素、甲硝唑、硝酸咪康唑和阿莫西林，制备得到含0.3%氯霉素加标样品、含0.05%甲硝唑加标样品、含0.03%硝酸咪康唑加标样品和0.02%阿莫西林加标样品；
加标样品前处理：根据所要求检测的抗生素种类，取0.1g含0.03%硝酸咪康唑加标样品和0.1g含0.02%阿莫西林加标样品，分别置于相应的无菌试剂盒A中，振荡混匀，使含0.03%硝酸咪康唑加标样品与含0.02%阿莫西林加标样品充分分散，用已灭菌的0.45μl的微孔滤膜过滤除菌，得到硝酸咪康唑加标样液和阿莫西林加标样液。
步骤b，目标菌液制备：
根据所述步骤a中选择的含0.03%硝酸咪康唑加标样品与含0.02%阿莫西林加标样品，选择念珠菌与葡萄球菌作为目标菌，并制备念珠菌菌液与葡萄球菌菌液，念珠菌菌液与葡萄球菌菌液的初始活菌浓度均为3000cfu/ml；
步骤c，试剂盒培养：
试剂盒B为无菌试剂盒，包括以下组分：水杨梅水提取物0.02g，蛋白胨0.02g，牛肉膏粉0.02g，氯化钠0.02g，纯化水20ml。
取0.8ml待测样液、0.8ml空白对照样液、0.8ml硝酸咪康唑加标样液和0.8ml阿莫西林加标样液分别加入无菌试剂盒B中，振荡混匀，得到加样试剂盒、空白对照试剂盒、硝酸咪康唑加标试剂盒和阿莫西林加标试剂盒，分别向加样试剂盒和空白对照试剂盒中加入1.0ml念珠菌菌液和1.0ml葡萄球菌菌液，向硝酸咪康唑加标试剂盒中加入1.0ml念珠菌菌液，向阿莫西林加标试剂盒中加入1.0ml葡萄球菌菌液。在相同的培养条件下，培养90min时，使用显微镜分别对加样试剂盒、空白对照试剂盒、硝酸咪康唑加标试剂盒和阿莫西林加标试剂盒中的培养液进行各目标菌计数，分别测定加样试剂盒、空白对照试剂盒、硝酸咪康唑加标试剂盒和阿莫西林加标试剂盒中念珠菌和葡萄球菌的活菌浓度，根据以下公式计算得到培养90min时，待测样品、含0.03%硝酸咪康唑加标样品与含0.02%阿莫西林加标样品的念珠菌和葡萄球菌的活菌生长率，其中，待测样品的念珠菌的活菌生长率为5%，待测样品的葡萄球菌的活菌生长率为82%，含0.03%硝酸咪康唑加标样品的念珠菌的活菌生长率为78%，含0.02%阿莫西林加标样品的葡萄球菌的活菌生长率为74%，计算公式为：
Figure 78406DEST_PATH_IMAGE001
步骤d，校正后判定标准：
以含0.03%硝酸咪康唑加标样品的念珠菌的活菌生长率78%为本实施例中念珠菌的标准生长率，以含 0.02%阿莫西林加标样品的葡萄球菌的活菌生长率74%为本实施例中葡萄球菌的标准生长率，并以上述念珠菌和葡萄球菌的标准生长率共同作为作为校正后的判定标准；
步骤e，定性判定：
待测样品的念珠菌的活菌生长率为5%小于念珠菌的标准生长率，待测样品中的葡萄球菌的活菌生长率为82%大于葡萄球菌的标准生长率，说明该待测样品中非法添加有抗真菌类抗生素，没有非法添加抗细菌类抗生素，仍判定为阳性，即所对应的待测样品中非法添加抗生素。
实施例8
本发明的检测化妆品中非法添加抗生素的方法，包括以下：
步骤a，前处理：
试剂盒A为无菌试剂盒，由以下组分组成：五指毛桃40%甲醇溶液提取物0.2g，纯化水20ml。
待测样品前处理：随机抽取待检测牙膏样品，取0.5g样品置于无菌试剂盒A中，振荡混匀，使样品充分分散，用已灭菌的0.45μl的微孔滤膜过滤除菌，得到待测样液。
空白对照前处理：取0.5g灭菌水置于另一无菌试剂盒A中，振荡混匀，使灭菌水充分分散，用已灭菌的0.45μl的微孔滤膜过滤除菌，得到空白对照样液；
加标样品制备：向不含有抗生素的化妆品中分别添加氯霉素、甲硝唑、硝酸咪康唑和阿莫西林，制备得到含0.3%氯霉素加标样品、含0.05%甲硝唑加标样品、含0.03%硝酸咪康唑加标样品和0.02%阿莫西林加标样品；
加标样品前处理：根据所要求检测的抗生素种类，分别取0.5g含0.3%氯霉素加标样品、含0.05%甲硝唑加标样品、0.5g含0.03%硝酸咪康唑加标样品和0.5g含0.02%阿莫西林加标样品，分别置于相应的无菌试剂盒A中，振荡混匀，使含0.3%氯霉素加标样品、含0.05%甲硝唑加标样品、含0.03%硝酸咪康唑加标样品与含0.02%阿莫西林加标样品充分分散，用已灭菌的0.45μl的微孔滤膜过滤除菌，得到氯霉素加标样液、甲硝唑加标样液、硝酸咪康唑加标样液和阿莫西林加标样液。
步骤b，目标菌液制备：
根据步骤a中选择的含0.3%氯霉素加标样品、含0.05%甲硝唑加标样品、含0.03%硝酸咪康唑加标样品与含0.02%阿莫西林加标样品，选择大肠杆菌、痤疮丙酸杆菌、念珠菌与葡萄球菌作为目标菌并制备相应的目标菌液，其中，大肠杆菌菌液、痤疮丙酸杆菌菌液、念珠菌菌液和葡萄球菌菌液的初始活菌浓度均为8000cfu/ml；
步骤c，试剂盒培养：
试剂盒B为无菌试剂盒，包括以下组分：水杨梅水提取物0.2g，蛋白胨0.2g，牛肉膏粉0.2g，氯化钠0.2g，纯化水20ml。
取1.0ml待测样液、1.0ml空白对照样液、1.0ml氯霉素加标样液、1.0ml甲硝唑加标样液、1.0ml硝酸咪康唑加标样液和1.0ml阿莫西林加标样液分别加入对应的无菌试剂盒B中，振荡混匀，得到加样试剂盒、空白对照试剂盒、氯霉素加标试剂盒、甲硝唑加标试剂盒、硝酸咪康唑加标试剂盒和阿莫西林加标试剂盒。分别向加样试剂盒和空白对照试剂盒中加入1.0ml大肠杆菌菌液液、1.0ml痤疮丙酸杆菌菌液、1.0ml念珠菌菌液和1.0ml葡萄球菌菌液，向氯霉素加标试剂盒中加入1.0ml大肠杆菌菌液，向甲硝唑加标试剂盒中加入1.0ml痤疮丙酸杆菌菌液，向硝酸咪康唑加标试剂盒中加入1.0ml念珠菌菌液，向阿莫西林加标试剂盒中加入1.0ml葡萄球菌菌液。在相同的培养条件下，培养120min时，使用显微镜分别对加样试剂盒、空白对照试剂盒、氯霉素加标试剂盒、甲硝唑加标试剂盒、硝酸咪康唑加标试剂盒和阿莫西林加标试剂盒中的培养液进行各目标菌计数。分别测定加样试剂盒、空白对照试剂盒、氯霉素加标试剂盒、甲硝唑加标试剂盒、硝酸咪康唑加标试剂盒和阿莫西林加标试剂盒中大肠杆菌、痤疮丙酸杆菌、念珠菌和葡萄球菌的活菌浓度。根据以下公式计算得到培养120min时，待测样品、含0.3%氯霉素加标样品、含0.05%甲硝唑加标样品、含0.03%硝酸咪康唑加标样品与含0.02%阿莫西林加标样品的大肠杆菌、痤疮丙酸杆菌、念珠菌和葡萄球菌的活菌生长率。
其中，待测样品的大肠杆菌的活菌生长率为92%，痤疮丙酸杆菌的活菌生长率为97%，念珠菌的活菌生长率为87%，葡萄球菌的活菌生长率为91%。含0.3%氯霉素加标样品的大肠杆菌的活菌生长率为75%，含0.05%甲硝唑加标样品的痤疮丙酸杆菌的活菌生长率为73%，含0.03%硝酸咪康唑加标样品的念珠菌的活菌生长率为75%，含0.02%阿莫西林加标样品的葡萄球菌的活菌生长率为76%，计算公式为：
Figure 763465DEST_PATH_IMAGE001
步骤d，校正后判定标准：
以含0.3%氯霉素加标样品的大肠杆菌的活菌生长率75%为本实施例中大肠杆菌的标准生长率，以含0.05%甲硝唑加标样品的痤疮丙酸杆菌的活菌生长73%为本实施例中痤疮丙酸杆菌的标准生长率，以含0.03%硝酸咪康唑加标样品的念珠菌的活菌生长率75%为本实施例中念珠菌的标准生长率，以含 0.02%阿莫西林加标样品的葡萄球菌的活菌生长率76%为本实施例中葡萄球菌的标准生长率，以上述四个标准生长率共同作为作为校正后的判定标准；
步骤e，定性判定：
待测样品的大肠杆菌的活菌生长率为92%大于大肠杆菌的标准生长率，待测样品的痤疮丙酸杆菌的活菌生长率为97%大于痤疮丙酸杆菌的标准生长率，待测样品的念珠菌的活菌生长率为87%大于念珠菌的标准生长率，待测样品中的葡萄球菌的活菌生长率为91%大于葡萄球菌的标准生长率，待测样品中各目标菌的活菌生长率均大于相应各目标菌的标准生长率，判定为阴性，即所对应的待测样品中没有非法添加抗生素。
实施例9
本实施例以无抗生素添加的含有防腐剂和植物提取物的化妆品作为样品，以大肠杆菌为目标菌，分别采用以下两种培养方式进行培养：a方式：采用实施例2中的无菌试剂盒A和无菌试剂盒B进行培养；b方式：采用营养肉汤液体培养基培养，在相同培养条件下，分别在培养时间30min、60min、90min和120min对以上两种培养方式培养的培养液进行大肠杆菌的活菌生长率测定。经计算得到以下两种不同培养方式培养的大肠杆菌活菌生长率见表1：
表1 两种不同培养方式培养的大肠杆菌的活菌生长率
Figure 645971DEST_PATH_IMAGE002
化妆品中通常都会添加一定的防腐剂，来延长化妆品的保质期，避免化妆品短时间内变质。化妆品中还有可能添加各种植物提取物，以实现某些功效。防腐剂与植物提取物这两种添加成分都具有一定的抑菌效果，同时添加在化妆品中抑菌效果叠加对检测方法中细菌和真菌培养有强烈的干扰。
由上表可知，采用b方式使用营养肉汤液体培养基对不含有抗生素的样品进行培养时，活菌浓度远远低于空白对照的活菌浓度，活菌生长率远远低于100%，说明b方式不能排除防腐剂和植物提取物的抑菌作用的干扰。在化妆品中防腐剂和植物提取物的干扰影响下，通过b方式计算得到的活菌生长率偏低，不能正确反映目标菌是否受到化妆品中非法添加抗生素的影响，容易造成假阳性，导致检测结果错误。
采用a方式即采用本发明的无菌试剂盒A和无菌试剂盒B对不含抗生素的样品进行培养时，加样活菌浓度接近于空白对照的活菌浓度，活菌生长率与100%相比，仅仅降低了3%~6%。说明a方式可以排除化妆品中防腐剂和植物提取物的抑菌作用的干扰。无菌试剂盒A中的五指毛桃40%醇溶液提取物富含抗氧化物质，在样品分散过程能够中和样品中的防腐剂释放出的甲醛，拮抗防腐剂的抑菌作用。水杨梅水提取物在目标菌培养过程中，能够中和化妆品中防腐剂释放出的甲醛，排除防腐剂的抑菌作用。同时，五指毛桃40%醇溶液提取物和水杨梅水提取物对细菌和真菌的抑菌作用微弱，在培养过程中不影响目标菌的正常生长，对检测结果无影响。
本发明的方法经过步骤a和步骤c，将样品加入无菌试剂盒A，再从无菌试剂盒A中取样液加入无菌试剂盒B，对样品进行两次稀释，总稀释倍数达到400倍~500倍，从而使进入到无菌试剂盒B中的植物提取物含量极低，在培养过程中不影响目标菌的正常生长，对检测结果无影响。
因此，本发明的方法使用的试剂盒A和试剂盒B可以有效排除化妆品样品中的防腐剂和植物添加成分对目标菌生长的抑制作用，保证检测结果的准确。
实施例10
符合国家标准的化妆品中是不可能含有抗生素成分的，商家在化妆品中非法添加抗生素那就要能达到一个医学上的治疗目的，这样非法添加抗生素才有现实效果。抗生素以抑菌为最大特点，抑菌强弱与化妆品中添加抗生素的含量相关。要达到这样治疗目的和效果，抗生素的添加就要达到或者超过最低添加量。只要本发明的方法的最低检出限低于这个能达到医学治疗效果的最低添加量，就可以检测出化妆品中是否非法添加有抗生素。
本实施例中选择氯霉素、红霉素、妥布霉素和克林霉素四种常用的外用抗生素作为目标抗生素，分别按照其外用制剂中的有效成分含量，即：0.3%氯霉素溶液、0.5%红霉素眼膏、2.0%克林霉素凝胶和0.3%妥布霉素滴眼液，添加到不含有抗生素的阴性样品中，制备得到含0.3%氯霉素的加标样品、含0.5%红霉素的加标样品、含0.3%拖布霉素的加标样品、含2%克林霉素的加标样品。以大肠杆菌作为目标菌，按照实施例2的方法对以上加标样品进行培养，在相同培养条件下，分别在培养时间30min、60min、90min和120min对以上待测样品的培养液进行大肠杆菌的活菌生长率测定。经计算得到以下不同加标样品的大肠杆菌活菌生长率见表2：
表2 不同加标样品的大肠杆菌活菌生长率
Figure 732876DEST_PATH_IMAGE003
从上表可知，添加0.3%氯霉素的加标样品在培养30min时大肠杆菌活菌生长率最高，说明0.3%氯霉素的添加量是达到最低治疗效果的一种添加方式。可以理解为，0.3%氯霉素样品的活菌生长率75%是可以体现治疗效果的最高的活菌生长率，待测样品的活菌生长率如果等于或高于75%，那么待测样品在使用时基本不能体现出治疗效果，与非法添加抗生素的目的相违背，即可认为该待测样品中没有非法添加抗生素。
因此，本发明的方法以含0.3%氯霉素加标样品培养30min、60min、90min和120min的大肠杆菌活菌生长率为标准生长率，作为判定标准，用于判定是否非法添加抗生素。判定标准为：培养30min标准生长率为75%，培养60min标准生长率为50%，培养90min标准生长率为46%，培养120min标准生长率为41%，即待测样品的各目标菌的活菌生长率之一小于等于对应培养时间的标准生长率时，即可判定为阳性，即待测样品中非法添加抗生素。当各所述目标菌的活菌生长率均大于对应培养时间的活菌生长率时，则可判定阴性，即待测样品中没有非法添加抗生素。
根据上述判定标准，检测人员可以根据实验安排需要，在30min、60min、90min和120min的培养时间内，自由选择合适的培养时间，对待测样品进行分批次检测，便于检测人员合理安排实验，便于对大批量样品进行快速检测。
实施例11
实施例2~5、实施例10均采用以含0.3%氯霉素的加标样品，以大肠杆菌在培养时间30min、60min、90min和120min的活菌生长率数值为标准生长率并作为判定标准，进行检测判定。该判定标准是经过多次重复试验得出的活菌生长率的平均值。但是在具体检测过程中，根据待测样品的使用效果不同，待测样品内添加的抗生素种类有可能不同，尤其是一些样品中会添加抗真菌作用的抗生素，使用实施例2~5及实施例10中的判定标准，可能会出现误判，造成假阴性或者假阳性的情况。为解决这一问题，本发明通过增加新的加标样品与待测样品一同培养检测，用加标样品中目标菌的活菌生长率实测数值作为标准生长率，对判定标准进行校正，并使用校正后的判定标准进行检测判定，便于准确判定，避免假阳性或者假阴性情况的出现。
本实施例中选择甲硝唑、硝酸咪康唑和阿莫西林作为标准抗生素，并按照0.01%、0.02%、0.03%、0.05%、0.2%、0.3%、0.5%浓度梯度向不含抗生素的阴性样品中分别添加，制备得到添加不同浓度的甲硝唑样品、硝酸咪康唑样品和阿莫西林样品。选择痤疮丙酸杆菌作为甲硝唑样品的目标菌，选择念珠菌作为硝酸咪康唑样品的目标菌，选择葡萄球菌作为阿莫西林样品的目标菌，并制备得到应的目标菌液，各目标菌液中初始活菌浓度相同，均为1000 cfu/ml。按照实施例2的方法对以上甲硝唑样品、硝酸咪康唑样品和阿莫西林样品进行培养，在相同培养条件下，分别在培养时间30min、60min、90min和120min对以上样品的培养液进行各目标菌的活菌生长率测定，得到表3-表5：
表3 不同添加浓度的甲硝唑样品中痤疮丙酸杆菌的活菌生长率
Figure 534478DEST_PATH_IMAGE004
表4 不同添加浓度的硝酸咪康唑样品中念珠菌的活菌生长率
Figure 706834DEST_PATH_IMAGE005
表5 不同添加浓度的阿莫西林样品中葡萄球菌的活菌生长率
Figure 861871DEST_PATH_IMAGE006
由表3可知，添加量为0.05%的甲硝唑样品在培养时间30min 时的活菌生长率为78%与判定标准75%相接近，说明0.05%的甲硝唑添加量为甲硝唑体现治疗效果的最低添加量，由此确定0.05%含量作为甲硝唑加标样品的加标量。由表4和表5可知，添加量为0.03%的硝酸咪康唑样品与添加量为0.02%的阿莫西林样品在培养30min时的活菌生长率均为73%，与判定标准75%相接近。由此，确定0.03%含量为硝酸咪康唑加标样品的加标量，0.02%含量为阿莫西林加标样品的加标量。
本实施例中根据0.3%氯霉素的加标样品，以大肠杆菌在培养时间30min的活菌生长率数值为标准生长率，对甲硝唑、硝酸咪康唑和阿莫西林这三种常用抗生素进行不同梯度浓度添加，以75%的标准生长率为标准，分别确定甲硝唑、硝酸咪康唑和阿莫西林的加标浓度，向不含抗生素的阴性样品中分别添加甲硝唑、硝酸咪康唑、阿莫西林和氯霉素，制备得到含0.05%甲硝唑加标样品、含0.03%硝酸咪康唑加标样品、含0.02%硝酸咪康唑加标样品和含0.3%氯霉素加标样品，以痤疮丙酸杆菌、念珠菌、葡萄球菌和大肠杆菌作为相应的目标菌。
对待测样品进行检测时，根据检测需要，选择一种或者几种加标样品及其相应的目标菌按照实施例6的方法进行培养，在培养时间30min~120min内，在同样培养时间分别测定各加标样品和待测样品中目标菌的活菌生长率，以各加标样品的活菌生长率作为标准生长率，待测样品的各目标菌的活菌生长率小于之一等于相应目标菌的标准生长率，判定为阳性，即待测样品中非法添加有抗生素。待测样品的各目标菌的活菌生长率均大于相应目标菌的标准生长率，判定为阴性，即待测样品中没有非法添加抗生素。
以上所述的仅是本发明的一些实施方式，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.检测化妆品中非法添加抗生素的方法，其特征在于，包括以下：
步骤a，前处理：
待测样品前处理：随机抽取待检测样品，取一定量的所述样品置于试剂盒A中，振荡混匀，使样品充分分散，并过滤除菌，得到待测样液；
空白对照前处理：取一定量的灭菌水置于另一试剂盒A中，振荡混匀，使灭菌水充分分散，并过滤除菌，得到空白对照样液，所述试剂盒A包括五指毛桃醇提取物和纯化水，所述五指毛桃醇提取物是以醇溶液作为提取剂得到的五指毛桃醇溶液提取物，所述试剂盒A为无菌试剂盒；
步骤b，目标菌液制备：
根据所要求检测的抗生素种类，选择一种或多种目标菌并制备相应的目标菌液，所述目标菌液中含有一种细菌或真菌，所述目标菌液的初始活菌浓度为100-10000cfu/ml；
步骤c，试剂盒培养：
取相同体积的所述待测样液和所述空白对照样液分别加入试剂盒B中，振荡混匀，得到加样试剂盒和空白对照试剂盒，向所述加样试剂盒与所述空白对照试剂盒中分别加入相同且等量的所述目标菌液，在相同的培养条件下，在培养30min、60min、90min和120min时，分别测定所述加样试剂盒中各目标菌的活菌浓度，分别测定所述空白对照试剂盒中各目标菌的活菌浓度，得到各所述目标菌的样品活菌浓度与空白对照活菌浓度，根据以下公式计算得到在培养30min、60min、90min和120min时各所述目标菌的活菌生长率，所述试剂盒B包括水杨梅水提取物、蛋白胨、牛肉膏、氯化钠和纯化水，所述试剂盒B为无菌试剂盒，所述公式为：
Figure 293761DEST_PATH_IMAGE001
步骤d，判定标准：
以含0.3%氯霉素的样品作为加标样品，以大肠杆菌为目标菌按照所述步骤a~c在相同培养条件下，进行培养，以计算得到培养30min、60min、90min和120min时的活菌生长率为标准生长率，作为判定标准，所述判定标准为：培养30min的标准生长率为75%，培养60min的标准生长率为50%，培养90min的标准生长率为46%，培养120min的标准生长率为41%；
步骤e，定性判定：
当各所述目标菌的活菌生长率之一小于等于对应培养时间的所述标准生长率，判定为阳性，即所对应的待测样品中非法添加抗生素，当各所述目标菌的活菌生长率均大于对应培养时间的所述标准生长率，则可判定阴性，即所对应的待测样品中没有非法添加抗生素。
2.根据权利要求1所述的检测化妆品中非法添加抗生素的方法，其特征在于，包括以下：
步骤a，前处理：
待测样品前处理：随机抽取待检测样品，取一定量的所述样品置于试剂盒A中，振荡混匀，使所述样品充分分散，并过滤除菌，得到待测样液；
空白对照前处理：取一定量的灭菌水置于另一试剂盒A中，振荡混匀，使所述灭菌水充分分散，并过滤除菌，得到空白对照样液，所述试剂盒A包括五指毛桃醇提取物和纯化水，所述五指毛桃醇提取物是以醇溶液作为提取剂得到的五指毛桃醇溶液提取物，所述试剂盒A为无菌试剂盒；
加标样品制备：向不含有抗生素的化妆品中分别添加氯霉素、甲硝唑、硝酸咪康唑和阿莫西林，制备得到含0.3%氯霉素加标样品、含0.05%甲硝唑加标样品、含0.03%硝酸咪康唑加标样品和0.02%阿莫西林加标样品；
加标样品前处理：根据所要求检测的抗生素种类，取一定量的一种或多种所述加标样品，分别置于相应的试剂盒A中，振荡混匀，使所述加标样品充分分散，并过滤除菌，得到加标样液；
步骤b，目标菌液制备：
根据所述步骤a中选择的加标样品，选择与所述加标样品对应的目标菌并制备相应的目标菌液，所述目标菌液中含有一种细菌或真菌，所述目标菌液的初始活菌浓度为100-10000cfu/ml；
步骤c，试剂盒培养：
取相同体积的所述待测样液、所述空白对照样液和所述加标样液分别加入试剂盒B中，振荡混匀，得到加样试剂盒、空白对照试剂盒和加标试剂盒，向所述加样试剂盒、所述空白对照试剂盒中分别加入相同体积的所述目标菌液，向所述加标试剂盒中加入相同体积的与所述加标样品相对应的所述目标菌液，在相同的培养条件下，培养相同时间后，分别测定所述加样试剂盒、所述空白对照试剂盒和所述加标试剂盒中各目标菌的活菌浓度，根据以下公式计算得到一定培养时间下，所述待测样品与所述加标样品的各所述目标菌的活菌生长率，所述试剂盒B包括水杨梅水提取物、蛋白胨、牛肉膏、氯化钠和纯化水，所述试剂盒B为无菌试剂盒，所述公式为：
Figure 269807DEST_PATH_IMAGE002
步骤d，校正后判定标准：
以所述加标样品的所述目标菌的活菌生长率为该所述目标菌的标准生长率，并以所述标准生长率作为校正后判定标准；
步骤e，定性判定：
当待测样品的各所述目标菌的活菌生长率之一小于等于对应目标菌的所述标准生长率，即可判定为阳性，即所对应的待测样品中非法添加抗生素，当待测样品的各所述目标菌的活菌生长率均大于对应目标菌的所述标准生长率时，则可判定阴性，即所对应的待测样品中没有非法添加抗生素。
3.根据权利要求1-2中任一权利要求所述的检测化妆品中非法添加抗生素的方法，其特征在于，所述培养时间为30min、60min、90min和120min中的任一种。
4.根据权利要求3所述的检测化妆品中非法添加抗生素的方法，其特征在于，所述目标菌是革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、厌氧菌和真菌中的一种或多种。
5.根据权利要求4所述的检测化妆品中非法添加抗生素的方法，其特征在于，所述厌氧菌以痤疮丙酸杆菌为代表菌，所述真菌以念珠菌为代表菌，所述革兰氏阳性菌以葡萄球菌为代表菌，所述革兰氏阴性菌以大肠杆菌为代表菌，所述目标菌是葡萄球菌、大肠杆菌、痤疮丙酸杆菌和念珠菌中的一种或多种。
6.根据权利要求5所述的检测化妆品中非法添加抗生素的方法，其特征在于，所述痤疮丙酸杆菌制备得到痤疮丙酸杆菌菌液，所述痤疮丙酸杆菌菌液用于对应检测甲硝唑类抗生素，所述念珠菌制备得到念珠菌菌液，所述念珠菌菌液用于对应检测抗真菌类抗生素，所述葡萄球菌制备得到葡萄球菌菌液，所述葡萄球菌菌液用于对应检测除甲硝类抗生素和抗真菌类抗生素以外的抗生素，所述大肠杆菌制备得到大肠杆菌菌液，所述大肠杆菌菌液用于对应检测除甲硝类抗生素和抗真菌类抗生素以外的抗生素。
7.根据权利要求6所述的检测化妆品中非法添加抗生素的方法，其特征在于，所述试剂盒A中五指毛桃醇提取物的质量体积百分比为0.1%~1%，其余部分由所述纯化水补足。
8.根据权利要求7所述的检测化妆品中非法添加抗生素的方法，其特征在于，所述五指毛桃醇溶液提取物是以体积浓度为40%的醇溶液作为提取剂得到的五指毛桃40%醇溶液提取物，所述40%醇溶液为40%甲醇溶液或40%乙醇溶液中的一种。
9.根据权利要求8所述的检测化妆品中非法添加抗生素的方法，其特征在于，所述试剂盒B中各组分的质量体积百分比为：水杨梅水提取物0.1%~1%，蛋白胨0.1%~1%，牛肉膏粉0.1%~1%，氯化钠0.1%~1%，其余部分由所述纯化水补足。
10.检测化妆品中非法添加抗生素的试剂盒，其特征在于，包括试剂盒A和试剂盒B，所述试剂盒A按照质量体积百分比计包括以下组分：五指毛桃40%醇溶液提取物0.1%~1%，其余部分由纯化水补足，所述试剂盒B按照质量分数计包括以下组分：水杨梅水提取物0.1%~1%，蛋白胨0.1%~1%，牛肉膏粉0.1%~1%，氯化钠0.1%~1%，其余部分由纯化水补足，所述五指毛桃40%醇溶液提取物是以体积浓度为40%的醇溶液作为提取剂得到的提取物，所述40%醇溶液为40%甲醇溶液或40%乙醇溶液中的一种。
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