CN114965750A - 一种乳制品中人乳寡糖的定性定量检测方法 - Google Patents

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CN114965750A CN202210477335.7A CN202210477335A CN114965750A CN 114965750 A CN114965750 A CN 114965750A CN 202210477335 A CN202210477335 A CN 202210477335A CN 114965750 A CN114965750 A CN 114965750A
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Abstract

本发明涉及乳制品中人乳寡糖的定性定量检测方法。本发明通过加热法去除蛋白质，如果需要，再利用有机溶剂进一步去除干扰成分或脂质，得乳制品供试液，采用高效液相色谱法进行乳制品供试液检测，根据标准曲线对乳制品中的人乳寡糖进行定性定量分析。本发明提供了一种乳制品中人乳寡糖的定性定量检测方法，该方法能够准确、快速的检测乳制品中的人乳寡糖。

Description

一种乳制品中人乳寡糖的定性定量检测方法
技术领域
本发明属于乳制品中人乳寡糖的检测领域，涉及乳制品中人乳寡糖的定性定量检测方法，具体涉及乳制品中乳糖-N-四糖和乳糖-N-三糖的定性定量检测方法。
背景技术
人乳寡糖又称母乳低聚糖(HMOs)，其被发现是一类存在于母乳中的独特低聚糖，母乳中未被消化的低聚糖部分刺激了结肠中双歧杆菌的生长，并且这些双歧杆菌对保护、预防肠道感染有益，因此，母乳低聚糖是先天免疫系统的主要成分。人乳寡糖含量的差别是导致母乳喂养较奶粉喂养更有优势的重要原因之一。其中，乳糖-N-四糖(Lacto-N-tetraose，LNT)和乳糖-N-三糖(Lacto-N-tetriaose II，LNTII)是母乳低聚糖(HMOs)中的主要成分，具有多种生理功能，可以减少感染的发生，促进肠道有益菌群的增殖和活性，间接抑制有害菌群生长，维持肠道微生态平衡，从而保护婴儿肠道免受致病菌侵袭。
值得注意的是，在山羊奶、绵羊奶以及牛奶等乳制品中几乎没有发现这些人乳寡糖，并且。目前，市售乳制品并不含有人乳寡糖，婴儿配方奶粉中添加的大都是低聚乳糖(Galactooligosaccharides，GOS) 和低聚果糖 (fructooligosaccharide，FOS)，以此来模拟人乳寡糖的部分功能。然而，低聚乳糖和低聚果糖对婴儿的健康生长作用远不及人乳寡糖。所以，向人造奶或乳制品中添加具有生理功能的人乳寡糖，具有明显的社会和经济效益。
人乳寡糖的种类超过200多种，结构复杂，不同种类人乳寡糖之间的检测方法差异较大。目前，人乳寡糖的检测方法耗时较长，操作复杂，如中国专利文献CN111239313A（申请号CN201811441066.9）公开了一种人乳寡糖的快速轮廓分析方法，该发明样品经过低温离心脱脂，加入有机溶剂沉淀除蛋白后，经亲水作用色谱柱分离，以质谱为检测器，得到人乳寡糖组成、结构和含量信息。但是此方法存在着分析仪器昂贵、分析工序耗时不低于3小时、对操作人员要求高等问题。
乳制品中人乳寡糖含量的测定尚没有成熟的分析方法，天然寡糖对人乳寡糖的检测也存在一定的干扰。中国专利文献CN107192771A（申请号CN201710308499.6）公开了一种母乳低聚糖快速定性定量的方法，主要包括以下步骤：步骤1、样品前处理：取150-250μL母乳，去除脂肪和蛋白质，得最终上清液，加超纯水稀释，得上样样品；步骤2、对标准品采用超高效液相色谱、质谱，建立标准曲线；步骤3、采用超高效液相色谱将所述上样样品内母乳低聚糖进行不同组分的分离，并利用质谱结合标准曲线，进行定量分析，即得母乳低聚糖含量。上述发明在94~106 min范围内可检测12种母乳低聚糖，并对12种母乳低聚糖进行了定量。
中国专利文献CN107621399A（申请号CN201610556457.X）公开了一种检测母乳中低聚糖的方法，包括对母乳样品进行前处理的步骤，所述前处理具体为：取母乳样品，离心除去上层脂肪，取下层液体并加入醇类溶剂，于﹣40℃～﹣100℃冷冻5-15min后，离心，取上清液即得；采用液质法对前处理后的母乳中的低聚糖进行定性和定量检测。检测时间为70~145 min。
综上，现有技术中，对母乳及动物乳的前处理方法，脱除蛋白质的方法主要有两种，分别是乙醇沉淀法和乙腈沉淀法，脱除脂质的方法主要为离心沉淀法，上述前处理方法对于乳制品中人乳寡糖的检测效果不佳，不能快速准确地对乳制品中的人乳寡糖进行定性定量分析，相对于乳制品中的天然寡糖，乳制品中添加的人乳寡糖含量相对较少，检测其含量时，需避免天然寡糖的干扰，以提高检测准确率。对于人乳及动物乳的后处理检测方法，多采用液质联用法，但是该检测方法存在分析仪器昂贵、分析耗时长、对操作人员要求高等问题。到目前为止还没有报道快速地对乳制品中人乳寡糖进行定性定量的检测方法。
发明内容
发明目的：针对现有技术的不足，本发明提供了一种乳制品中人乳寡糖的定性定量检测方法，为乳制品的质量控制提供准确、快速的检测方法。
术语说明：室温：具有本技术领域公知的含义，一般是指25±2℃。
本发明的技术方案：
一种乳制品中人乳寡糖检测的预处理方法，首先通过加热法去除乳制品中的蛋白质，对于含有多重复杂成分的乳制品，可以再用与水互溶的有机溶剂进一步除蛋白，或再利用有机溶剂提取法去除脂质，得乳制品供试液，具体如下：
一种乳制品中人乳寡糖检测的预处理方法，包括：步骤A. 取乳制品样品，加入 1-10 倍体积的超纯水混匀，加热至 80-100℃热处理10-30 min 后，降至室温，在0-10℃范围内，2000-20000×g 离心 5-50 min，收集清液作为供试液。
优选的，步骤A加入超纯水后，加热至85-100℃热处理 20-30 min；更优选加热至90-100℃。
优选的，步骤A离心条件为 0-5℃范围内，5000-15000×g 离心 5-30 min；更优选为 4℃，10000-15000×g 离心 10-20 min。
优选的，如果乳制品成分复杂，本发明所述乳制品中人乳寡糖检测的预处理方法，还包括：步骤B.向步骤A所述供试液中，加入有机溶剂，振荡或涡旋混匀，于 0-10℃范围内离心，2000-20000×g 离心 5-50 min 除去沉淀，收集清液作为供试液，所述有机溶剂与水互溶，选自甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、乙腈中的一种或多种；优选的，所述有机溶剂的加入量为步骤A超纯水体积的0.5-1倍。
优选的，所述离心条件为 0-5℃，5000-15000×g 离心 5-30 min；更优选为 4℃，10000-15000×g 离心 10-20 min。
优选的，如果乳制品成分复杂，本发明所述乳制品中人乳寡糖检测的预处理方法，还包括：步骤C. 向步骤A或步骤B所得供试液中，加入有机溶剂，振荡或涡旋混匀，于 0-10℃范围内离心，2000-20000×g 离心 5-50 min，收集水相作为供试液；所述有机溶剂选自丁醇、二氯甲烷、氯仿或乙酸乙酯中的一种或多种；优选的，所述有机溶剂的加入量为步骤A超纯水体积的0.7-1.5倍。
本发明所述人乳寡糖包括但不限于乳糖-N-四糖和乳糖-N-三糖。
一种乳制品中人乳寡糖的定性和/或定量检测方法，包括上述预处理方法，还包括：
步骤D.通过高效液相色谱法对供试液中的人乳寡糖进行定性和/或定量分析，即对步骤C所得供试液进行定性和/或定量分析。
优选的，所述高效液相色谱法，色谱柱选自亲水性色谱柱或疏水性色谱柱。
进一步优选的，所述亲水性色谱柱填料为硅胶、极性基团键合相硅胶或葡聚糖；所述极性基团键合相硅胶中的极性基团为酰胺基、脲基、氰基、氨基、羧基、糖基和两性离子中的一种或多种；
进一步优选的，所述色谱柱填料为氨丙基键合硅胶。
优选的，所述高效液相色谱法，色谱柱为氨丙基键合硅胶色谱柱，简称氨丙基色谱柱或者氨基色谱柱，选自Nacalai公司的Cosmosil Sugar-D和/或Shodex公司的AsahipakNH2P-504E。
优选的，所述高效液相色谱法采用的检测器为示差折光检测器、紫外检测器或二极管阵列检测器；优选紫外检测器或二极管阵列检测器，检测波长为180-280 nm。
优选的，所述高效液相色谱法的流动相为水和有机溶剂，其体积比为10/90~90/10，使用等度洗脱或梯度洗脱；所述有机溶剂选自甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、乙腈中的一种或多种。
进一步优选的，所述流动相为60-75% (v/v)的乙腈水溶液；优选65-70%(v/v)的乙腈水溶液。
优选的，所述高效液相色谱法的流速为0.2-1 mL/min，柱温为20-60℃，优选的，流动相流速为0.4-0.8 mL/min。
进样体积以10 μL为宜，柱温为20-60℃，色谱柱内径为2.0-6.0 mm。
优选的，本发明所述人乳寡糖为乳糖-N-四糖、乳糖-N-三糖中的一种。
一种乳制品中乳糖-N-四糖或乳糖-N-三糖的定性或定量检测方法，所述方法为高效液相色谱法；包括上述预处理方法，还包括如下步骤：
包括建立乳糖-N-四糖或乳糖-N-三糖标准曲线，并检测步骤C所得供试液，对供试液中的乳糖-N-四糖或乳糖-N-三糖进行定性或定量分析的步骤。
根据本发明优选的，所述高效液相色谱法采用的检测器为示差折光检测器、紫外检测器或二极管阵列检测器；进一步优选为紫外检测器或二极管阵列检测器；检测波长为180-280nm。
本发明所述高效液相色谱法的流动相为60-75% (v/v)的乙腈水溶液，使用等度洗脱或梯度洗脱。
本发明技术方案中，如果流动相乙腈水溶液浓度低于60%(v/v)或高于75% (v/v)，都会导致色谱峰干扰问题，不能正常检测乳制品中的人乳寡糖含量。
有益效果：
本发明提供了一种乳制品中所含有的人乳寡糖的定性和/或定量检测方法。本发明以加热法除蛋白等为主，如果成分复杂，可以选择步骤B和/或步骤C处理乳制品，本发明所述方法能够有效去除乳制品样品中的蛋白质、脂质等，以及其他成分，相对于常用的离心除脂质和乙醇/乙腈沉淀除蛋白的预处理方法，大大减少了干扰峰的存在，保证了检测结果的准确度和可靠性，并通过高效液相色谱法检测乳制品中人乳寡糖的含量。
本发明所述定性和/或定量检测方法采，用高效液相色谱对预处理液进行分离分析，所述高效液相色谱的优选方案采用Nacalai公司的Cosmosil Sugar-D和/或Shodex公司的Asahipak NH2P-504E，有利于人乳寡糖的分离与检测，所述高效液相色谱系统检测速度快、灵敏度高，可在1h即可得到检测结果，大大缩短了分析时间，相较于液质联用，大大降低了检测成本与检测难度。
本发明提供了一种乳制品中人乳寡糖的定性定量检测方法，该方法能够准确、快速的检测乳制品中的人乳寡糖。尤其是对乳糖-N-四糖和乳糖-N-三糖检测方法的提供，对乳制品的质量控制有着积极的意义，有利于人乳寡糖在乳制品行业中进行迅速的推广与运用。
附图说明
图1.为乳制品中人乳寡糖的定性定量检测分析流程示意图。
图2.实施例1酸奶样品中乳糖-N-四糖测定的HPLC色谱图。
图3.实施例2全脂牛奶样品中乳糖-N-三糖测定的HPLC色谱图。
图4.对比例1酸奶样品中乳糖-N-三糖、乳糖-N-四糖含量测定的HPLC色谱图。
图5.对比例2酸奶样品中乳糖-N-三糖、乳糖-N-四糖含量测定的HPLC色谱图。
图6.对比例3酸奶样品中乳糖-N-三糖、乳糖-N-四糖含量测定的HPLC色谱图。
图7.对比例4酸奶样品中乳糖-N-三糖、乳糖-N-四糖含量测定的HPLC色谱图。
具体实施方式
下面结合实施例和说明书附图对本发明的技术方案作进一步说明，但是本发明的保护范围并不仅限于此。实施例中涉及的样品及试剂，若无特殊说明，均为普通市售产品。
（1）标准品来源：
乳糖-N-四糖和乳糖-N-三糖标准品购买自上海甄准生物科技有限公司；其他市购标准品也可用于本发明。
（2）样品来源
实施例中使用的酸奶、牛奶、奶粉均为普通市售且不含人乳寡糖的乳制品商品。
（3）标准品梯度溶液制备：
取乳糖-N-四糖标准品0.1mg，溶于100 μL的超纯水中，混匀后得1mg/mL的初级标准品溶液，放置-20℃下储藏备用；取初级标准品溶液10 μL，加入90 μL超纯水，得浓度为100 mg/L标准品溶液，分别逐级稀释为20mg/L、40mg/L、60mg/L、80mg/L浓度，得到乳糖-N-四糖的标准品梯度溶液；
取乳糖-N-三糖标准品0.1mg，溶于100 μL的超纯水中，混匀后得1mg/mL的初级标准品溶液，放置-20℃下储藏备用；取初级标准品溶液10 μL，加入90 μL超纯水，得浓度为100 mg/L标准品溶液，分别逐级稀释为20mg/L、40mg/L、60mg/L、80mg/L浓度，得到乳糖-N-三糖的标准品梯度溶液。
（4）上述标准品溶液经高效液相色谱分析后，建立的标准曲线如下：
乳糖-N-四糖：二极管阵列检测器线性方程y=4693150.00x-113708.75，R2=0.99，流动相65%(v/v)乙腈水溶液，柱温25℃，线性范围0.2-1 mg/mL，出峰时间为第14.907min；
紫外检测器线性方程y = 9676605.8571x - 94905.4286，R2 = 0.99，流动相65%(v/v)乙腈水溶液，柱温25℃，线性范围0.2-1 mg/mL，出峰时间为第14.623 min。
乳糖-N-三糖：二极管阵列检测器线性方程y = 8868477x-250735，R2=0.96，流动相75%(v/v)乙腈水溶液，柱温30℃，线性范围0.2-1 mg/mL，出峰时间为第13.327min；
二极管阵列检测器线性方程y = 37898702x - 6499662.9，R2=0.98，流动相65%(v/v)乙腈水溶液，柱温25℃，线性范围0.2-1 mg/mL，出峰时间为第12.240 min；
紫外检测器线性方程y = 37898702x - 6499662.9，R2 = 0.98，流动相65%(v/v)乙腈水溶液，柱温25℃，线性范围0.2-1 mg/mL，出峰时间为第12.573 min；
示差折光检测器线性方程y = 137467x +200，R2 = 1，流动相60%(v/v)乙腈水溶液，柱温30℃，线性范围0.2-1 mg/mL，出峰时间为第14.477min。
标准品溶液的高效液相色谱条件为：采用4.6×250 mm，5 μm的Cosmosil Sugar-D或AsahipakNH2P-504E氨基色谱柱，以60%-75% (v/v)的乙腈水溶液为流动相等度洗脱；流速为0.5 mL/min，柱温为25℃或30℃，进样体积为10μL，二极管阵列检测器，或紫外检测器，或示差折光检测器，检测波长195 nm。
本发明实施例及对照例中所用乳糖-N-三糖标准品溶液的浓度为0.6 mg/mL；乳糖-N-四糖标准品溶液的浓度为0.6mg/mL。分别取乳糖-N-三糖和乳糖-N-四糖标准品6 mg，溶于10 mL的超纯水中，混匀后得两种标准品溶液。
实施例1.酸奶样品中人乳寡糖的定性定量检测，流程示意图如图1所示，步骤如下：
（1）预处理：
步骤A. 取1 mL酸奶样品（样品中不含人乳寡糖），向其中加入1 mL乳糖-N-四糖标准品溶液，加入1ml的超纯水混匀，于100℃水浴中处理20 min后，降至室温，4℃条件下12000×g离心10 min，收集上清液;
步骤B. 向步骤A所得上清液中，加入0.5ml异丙醇，振荡混匀，于4℃条件下12000×g离心10 min进一步除蛋白，收集上清液；
步骤C. 向步骤B所得上清液中，加入1ml丁醇，振荡或涡旋混匀，于 5℃范围内离心，10000×g 离心 25 min，收集水相，得到除蛋白质和脂质的乳制品供试液；
（2）HPLC检测：将预处理步骤得到的乳制品供试液稀释后，经0.22μm滤膜过滤，采用高效液相色谱法进行样品检测，根据标准曲线对酸奶样品中的乳糖-N-四糖进行定性定量分析；
其中，高效液相色谱法的条件为：采用4.6×250 mm，5 μm的Cosmosil Sugar-D氨基色谱柱，以65% (v/v)的乙腈水溶液为流动相等度洗脱；流速为0.5 mL/min，柱温为25℃，进样体积为10μL，二极管阵列检测器，检测波长195 nm。
酸奶样品中乳糖-N-四糖含量检测的高效液相色谱图如图2所示，结合标准曲线，计算所述乳制品供试液中乳糖-N-四糖的含量为0.576mg，回收率96%。
实施例2
全脂牛奶样品中人乳寡糖的定性定量检测，步骤如下：
（1）预处理：
步骤A.取1 mL全脂牛奶样品（不含人乳寡糖），向牛奶样品中加1mL乳糖-N-三糖标准品溶液，加入3ml超纯水混匀，于90℃水浴中处理30 min后，降至室温，4℃条件下10000×g离心20min，收集上清液；
步骤C.向步骤A所得上清液中加入4.5ml的乙酸乙酯，振荡混匀，于4℃条件下15000×g离心10 min，收集水相，得到去除蛋白质和脂质的乳制品供试液；
（2）HPLC检测：将预处理步骤得到的乳制品供试液稀释后，经0.22μm滤膜过滤，采用高效液相色谱法进行样品检测，根据标准曲线对牛奶样品中的乳糖-N-三糖进行定性定量分析；
其中，高效液相色谱法的条件为：采用4.6×250 mm、5 μm的Cosmosil Sugar-D氨基色谱柱，以70% (v/v)的乙腈水溶液为流动相等度洗脱；流速为0.5 mL/min，柱温为25℃，进样体积为10μL，二极管阵列检测器，检测波长195 nm。
全脂牛奶样品中乳糖-N-三糖含量检测的高效液相色谱图如图3所示，结合标准曲线，计算得到所述乳制品供试液中乳糖-N-三糖的含量为0.564mg，回收率94%。
实施例3：全脂奶粉样品中人乳寡糖的定性定量检测，步骤如下：
方案1：
（1）预处理：
步骤A. 取1 g奶粉样品（不含人乳寡糖），向奶粉样品中加1 mL乳糖-N-三糖标准品溶液，加入10ml超纯水混匀，于90℃水浴中处理30 min后，降至室温，4℃条件下10000×g离心10 min，收集上清液；
步骤B. 向步骤A所得上清液中加入5ml乙腈，振荡混匀，于4℃条件下15000×g离心10 min进一步除蛋白，收集上清液；
步骤C. 向步骤B所得上清液中加入10ml乙酸乙酯，振荡混匀，于4℃条件下15000×g离心10 min，收集水相，得到去除蛋白质和脂质的乳制品供试液；
（2）HPLC检测：将预处理步骤得到的乳制品供试液稀释后，经0.22 μm滤膜过滤，采用高效液相色谱法进行样品检测，根据标准曲线对奶粉样品中的乳糖-N-三糖进行定性定量分析；
其中，高效液相色谱法的条件为：采用4.6×250 mm、5μm的Cosmosil Sugar-D氨基色谱柱，以75% (v/v)的乙腈水溶液为流动相等度洗脱；流速为0.5mL/min，柱温为30℃，进样体积为10μL，二极管阵列检测器，检测波长195 nm。
结合本奶粉样品高效液相图谱和标准曲线，计算所述品供试液中乳糖-N-三糖的含量为0.598mg，回收率99.67%。
方案2：
没有预处理步骤B，其他操作相同，测得样品中乳糖-N-三糖的含量为0.567，回收率94.5%。
方案3：没有预处理步骤B和C，其他操作相同，测得样品中乳糖-N-三糖的含量为0.542，回收率90.3%。
实施例4：酸奶样品中人乳寡糖的定性定量检测，步骤如下：
方案1：
（1）预处理：
步骤A.取200 μL酸奶样品（不含人乳寡糖），向酸奶样品中加入200 μL乳糖-N-四糖标准品溶液、200 μL乳糖-N-三糖标准品溶液，加入1ml超纯水混匀，于100℃水浴中处理30 min后，降至室温，4℃条件下15000×g离心50 min，收集上清液；
步骤B. 向步骤A所得上清液中加入0.5ml异丙醇，振荡混匀，于4℃条件下15000×g离心50 min，收集上清液；
步骤C. 向步骤B所得上清液中加入1ml二氯甲烷，振荡混匀，于4℃条件下15000×g离心10 min，收集水相，得到去除蛋白质和脂质的乳制品供试液
（2）HPLC检测：将预处理步骤得到的乳制品供试液稀释后，经0.22μm滤膜过滤，采用高效液相色谱法进行样品检测，根据标准曲线对酸奶样品中的乳糖-N-四糖、乳糖-N-三糖进行定性定量分析；
其中，高效液相色谱法的条件为：采用4.6×250 mm、5 μm的Cosmosil Sugar-D氨基色谱柱，以65% (v/v)的乙腈水溶液为流动相等度洗脱；流速为0.5 mL/min，柱温为25℃，进样体积为10μL，二极管阵列检测器，检测波长195 nm。
结合本奶粉样品高效液相图谱（附图3所示）和标准曲线，计算所述乳制品供试液中乳糖-N-四糖的含量为0.120 mg，回收率为100%；乳糖-N-三糖的含量为0.117 mg，回收率为97.5%。
方案2：
如没有步骤B，他操作相同，测得到所述酸奶样品中乳糖-N-四糖的含量为0.113mg，回收率为94.17；乳糖-N-三糖的含量为0.110 mg，回收率为91.67%。
实施例5：
酸奶样品中人乳寡糖的定性定量检测，步骤如下：
（1）预处理：
步骤A.取200 μL酸奶样品（不含人乳寡糖），向酸奶样品中加入200 μL乳糖-N-四糖标准品溶液、200 μL乳糖-N-三糖标准品溶液，加入1ml超纯水混匀，于80℃水浴中处理10min后，降至室温，4℃条件下5000×g离心5 min，收集上清液；
步骤B.向步骤A所得上清液中加入0.5ml的异丙醇，振荡混匀，于4℃条件下5000×g离心5 min，收集上清液；
步骤C.向步骤B所得上清液中加入1ml二氯甲烷，振荡混匀，于4℃条件下15000×g离心10 min，收集水相，得到去除蛋白质和脂质的乳制品供试液；
（2）HPLC检测：将预处理步骤得到的乳制品供试液稀释后，经0.22 μm滤膜过滤，采用高效液相色谱法进行样品检测，根据标准曲线对酸奶样品中的乳糖-N-四糖、乳糖-N-三糖进行定性定量分析；
其中，高效液相色谱法的条件为：采用4.6×250 mm、5 μm的Cosmosil Sugar-D氨基色谱柱，以65% (v/v)的乙腈水溶液为流动相等度洗脱；流速为0.5 mL/min，柱温为25℃，进样体积为10μL，紫外检测器，检测波长195 nm。
结合酸奶样品的高效液相色谱图和标准曲线，计算所述乳制品供试液中乳糖-N-四糖的含量为0.123mg，回收率102.5%；乳糖-N-三糖的含量为0.118mg，回收率98.3%。
实施例6：酸奶样品中人乳寡糖的定性定量检测，步骤如下：
（1）预处理：取1 mL酸奶样品（不含人乳寡糖），向其中加入1 mL乳糖-N-三糖标准品溶液，加入5ml超纯水混匀，于100℃水浴中处理20 min后，降至室温，4℃条件下12000×g离心10 min，收集上清液；向上述上清液中加入2.5ml异丙醇，振荡混匀，于4℃条件下12000×g离心10 min，收集上清液；向上清液中加入3.5ml氯仿，振荡混匀，于4℃条件下15000×g离心10 min，收集水相，得到去除蛋白质和脂质的乳制品供试液；
（2）HPLC检测：将预处理步骤得到的乳制品供试液稀释后，经0.22 μm滤膜过滤，采用高效液相色谱法进行样品检测，根据标准曲线对所述乳制品供试液中的乳糖-N-三糖进行定性定量分析；
其中，高效液相色谱法的条件为：采用4.6×250 mm、5 μm的Cosmosil Sugar-D氨基色谱柱，以60%乙腈溶液为流动相等度洗脱；流速为0.5mL/min，柱温为30℃，进样体积为10μL，示差折光检测器，检测波长195 nm。
对照乳糖-N-三糖标准品酸奶样品的高效液相色谱图，在14.477 min的出峰为乳糖-N-三糖。根据其线性方程计算得出酸奶样品中乳糖-N-三糖的含量为0.576 mg，回收率96%。
这说明当进行HPLC检测时，使用示差折光检测器也能比较灵敏地检测出乳糖-N-三糖。
实施例7.含奶饮料中人乳寡糖的定性定量检测，步骤如下：
（1）预处理：取2 mL含奶饮料样品（不含人乳寡糖），向其中加入1 mL乳糖-N-三糖标准品溶液，加入2ml超纯水混匀，于100℃水浴中处理20 min后，降至室温，4℃条件下12000×g离心10 min，收集上清液作为供试液；
（2）HPLC检测：供试液经0.22 μm滤膜过滤，采用高效液相色谱法检测其中的乳糖-N-三糖含量。
其中，高效液相色谱法的条件为：采用4.6×250 mm、5 μm的AsahipakNH2P-504E氨基色谱柱，以75%乙腈溶液为流动相等度洗脱；流速为0.7mL/min，柱温为30℃，进样体积为10μL，示差折光检测器，检测波长195 nm。在14.477 min的出峰为乳糖-N-三糖。根据其线性方程计算得出酸奶样品中乳糖-N-三糖的含量为0.583 mg，回收率97.17%。
对比例1：采用专利CN2017201710308499.6的方法对样品进行预处理
酸奶样品中人乳寡糖的定性定量检测，其中预处理方法采用离心除脂质和乙腈沉淀除蛋白的处理方式，步骤如下：
预处理：取200μL酸奶样品（不含人乳寡糖），向酸奶样品中加入200μL乳糖-N-四糖标准品溶液、200μL乳糖-N-三糖标准品溶液，加入等体积的超纯水混匀，5000r/min，2℃离心8min后，去除上层脂肪，然后加入400μL的纯乙腈，涡旋混匀后超声8min，8000r/min，2℃离心12min后取上清，再将上清液离心，以8000r/min的速度在2℃下，将所述上清液离心12min后，收集最终上清液，得到去除蛋白质和脂质的乳制品供试液；
HPLC检测均按照实施例4所述的方法进行。
酸奶样品的高效液相色谱图如图4所示，结合标准曲线，计算得到所述乳制品供试液中乳糖-N-四糖的含量为0.057 mg，回收率47.5%；乳糖-N-三糖没有出峰，未被检测出。
对比例2：采用专利CN201610556457.X的方法对样品进行预处理
酸奶样品中人乳寡糖的定性定量检测，其中预处理方法采用离心除脂质和乙醇沉淀除蛋白的处理方式，步骤如下：
预处理：取200μL酸奶样品（不含人乳寡糖），向酸奶样品中加入200μL乳糖-N-四糖标准品溶液、200μL乳糖-N-三糖标准品溶液，加入等体积的超纯水混匀，经2000g、20min、2℃离心除去上层脂肪，取下层样液加入两倍体积66.7%乙醇，-80℃冷冻10min，取出后离心，离心条件为10000r/min、10min，离心后取上层清液，得到去除蛋白质和脂质的乳制品供试液；
HPLC检测均按照实施例4所述的方法进行。
酸奶样品的高效液相色谱图如图5所示，结合标准曲线，计算得到所述乳制品供试液中乳糖-N-四糖的含量为0.050 mg，回收率41.67%；乳糖-N-三糖的含量为0.052 mg，回收率43.33%。
对比例3：
酸奶样品中人乳寡糖的定性定量检测，其中预处理方法仅采用有机溶剂处理，步骤如下：
预处理：取200μL酸奶样品（不含人乳寡糖），向酸奶样品中加入200μL乳糖-N-四糖标准品溶液、200μL乳糖-N-三糖标准品溶液，加入等体积的超纯水混匀，加入等体积的异丙醇，振荡混匀，于4℃条件下5000×g离心5min，收集上清液，得到乳制品供试液；
HPLC检测均按照实施例5所述的方法进行。
酸奶样品的高效液相色谱图如图6所示，结合标准曲线，计算得到所述乳制品供试液中乳糖-N-四糖的含量为0.076mg，回收率63.33%；乳糖-N-三糖的含量为0.057 mg，回收率47.5%。
对比例4：
酸奶样品中人乳寡糖的定性定量检测，其中预处理方法仅采用加热处理，步骤如下：
预处理：取200μL酸奶样品（不含人乳寡糖），向酸奶样品中加入200μL乳糖-N-四糖标准品溶液、200μL乳糖-N-三糖标准品溶液，加入等体积的超纯水混匀，于80℃水浴中处理10min后，降至室温，4℃条件下5000×g离心5min，收集上清液，得到乳制品供试液；
HPLC检测均按照实施例5所述的方法进行。
酸奶样品的高效液相色谱图如图7所示，结合标准曲线，计算得到所述乳制品供试液中乳糖-N-四糖的含量为0.080 mg，回收率66.67%；乳糖-N-三糖含量为0.064 mg，回收率53.33%。
总之，本发明所述定性定量检测方法，可以有效检测乳制品中的乳糖-N-四糖或乳糖-N-三糖，或者同时检测乳制品中乳糖-N-四糖和乳糖-N-三糖，检测过程快速、准确。
对比例1和对比例2分别采用专利CN2017201710308499.6和CN201610556457.X的方法对酸奶样品中人乳寡糖进行定性定量检测，可能由于本发明中采用的是酸奶制品，相较于其发明专利中的母乳而言，蛋白质、脂质等的含量更多，只通过简单的离心预处理除杂，会导致干扰过多，影响检测效果。
综上，由上述检测分析结果可知，本发明的检测方法对于乳制品中乳糖-N-四糖和/或乳糖-N-三糖的定性定量检测检测具有结果准确、灵敏度高的特点，相较于液质联用法，大大降低了检测成本与检测难度，可实现对乳制品样品中人乳寡糖，尤其是乳糖-N-四糖和乳糖-N-三糖的快速定性定量检测。

Claims (10)

1.一种乳制品中人乳寡糖检测的预处理方法，其特征在于，通过加热法后离心的方法得供试液，包括：
步骤A. 取乳制品样品，加入 1-10 倍体积的超纯水混匀，加热至 80-100℃热处理10-30 min 后，降至室温，在0-10℃范围内，离心，收集清液作为供试液。
2.如权利要求1所述乳制品中人乳寡糖检测的预处理方法，其特征在于，还包括步骤B：向步骤A所得供试液中，加入有机溶剂，振荡或涡旋混匀，于 0-10℃范围内离心，收集清液作为供试液，所述有机溶剂与水互溶；优选的，所述有机溶剂选自甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、乙腈中的一种或多种；优选的，所述有机溶剂的加入量为步骤A超纯水体积的0.5-1倍。
3.如权利要求1或2所述乳制品中人乳寡糖检测的预处理方法，其特征在于，还包括步骤C. 向所述供试液中，加入有机溶剂，振荡或涡旋混匀，于 0-10℃范围内离心，收集水相作为供试液；所述有机溶剂选自丁醇、二氯甲烷、氯仿或乙酸乙酯中的一种或多种；优选的，所述有机溶剂的加入量为步骤A超纯水体积的0.7-1.5倍。
4.如权利要求1-3任一项所述的预处理方法，其特征在于，满足以下条件之一项或多项：
i. 步骤A加入超纯水后，加热至85-100℃热处理20-30 min；
ii. 步骤A加入超纯水后，加热至90-100℃热处理20-30min；
iii.. 步骤B所述有机溶剂选自甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、乙腈中的一种或多种；
iv. 步骤A和步骤B所述离心条件为0-5℃，5000-15000×g 离心5-30 min；
v. 步骤A和步骤B所述离心条件为4℃，10000-15000×g 离心10-20 min；
vi. 步骤C所述有机溶剂选自丁醇、二氯甲烷、氯仿或乙酸乙酯中的一种或多种；
vii.所述人乳寡糖包括乳糖-N-四糖和/或乳糖-N-三糖。
5.一种乳制品中人乳寡糖的定性和/或定量检测方法，其特征在于，包括权利要求1和/或权利要求2和/或权利要求3和/或权利要求4所述预处理方法，还包括如下步骤：
步骤D.通过高效液相色谱法对供试液中的人乳寡糖进行定性和/或定量分析。
6.如权利要求5所述乳制品中人乳寡糖的定性和/或定量检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱法，色谱柱选自亲水性色谱柱或疏水性色谱柱；
所述亲水性色谱柱填料选自硅胶、极性基团键合相硅胶或葡聚糖；所述极性基团键合相硅胶中的极性基团选自酰胺基、脲基、氰基、氨基、羧基、糖基和两性离子中的一种或多种；
所述色谱柱填料选自氨丙基键合硅胶。
7.如权利要求5或6所述乳制品中人乳寡糖的定性和/或定量检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱法所用色谱柱选自氨丙基键合硅胶色谱柱，是指硅胶基质键合氨丙基，所述高效液相色谱法采用的检测器选自示差折光检测器、紫外检测器或二极管阵列检测器；检测波长为 180-280 nm。
8.如权利要求5-7任一项所述乳制品中人乳寡糖的定性和/或定量检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱法的流动相为水和有机溶剂，其体积比为 10/90~90/10，使用等度洗脱或梯度洗脱；所述有机溶剂选自甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、乙腈中的一种或多种；优选的，所述流动相为 60-75% (v/v)的乙腈水溶液；进一步优选的，所述流动为 65-70% (v/v)的乙腈水溶液。
9.如权利要求5-8任一项所述乳制品中人乳寡糖的定性和/或定量检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱法的流动相流速为 0.2-1 mL/min，柱温为20-60℃；优选的，流动相流速为 0.4-0.8 mL/min；进一步优选的，流动相流速为 0.5-0.6 mL/min。
10.如权利要求5所述乳制品中人乳寡糖的定性和/或定量检测方法，其特征在于，所述人乳寡糖为乳糖-N-四糖和/或乳糖-N-三糖。
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