CN110596279A - 一种干酪中生物胺的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种干酪中生物胺的检测方法。本发明采用DCI衍生－固相萃取－高效液相色谱法对干酪中的生物胺进行检测，属于食品分析和安全技术领域。本发明本发明包括以下步骤(1)干酪样品中生物胺的提取(2)生物胺提取液的衍生化(3)衍生物固相萃取条件的确定。本发明所提供快速测定干酪中生物胺的方法，可以准确、灵敏的检测出干酪中生物胺的含量和种类，与其它分析方法相比，本方法无需昂贵的分析仪器，费用低，操作简便、快捷，能有效降低食品生产流通中的监控成本。
Description
技术领域
本发明涉及检测技术领域，具体涉及一种干酪中生物胺的快速检测方法。
背景技术
干酪中的蛋白质不仅含量丰富，而且还具有较高的营养价值。伴随着干酪的成熟，干酪中会发生一系列的蛋白质预消化反应，形成胨、肽、氨基酸等，因此干酪中蛋白质的实际消化率要高于全职牛奶并且更易于人体吸收。除此之外，干酪蛋白质中必需氨基酸的利用率为也要高于牛奶。由于干酪营养价值丰富且易于人体吸收以及消费者健康饮食理念的不断发展，因此近年来我国干酪食品人均消费量呈逐年上升的趋势。
干酪是由原料乳经过凝乳发酵形成的发酵食品。因其中含有生物胺形成所需要的蛋白质、游离氨基酸，具有脱羧酶活性的微生物以及氨基酸发生脱羧反应的适宜条件。从而导致干酪中较易产生危害人体健康的生物胺。
生物胺是一类广泛存在于蔬菜、水果、动物细胞、发酵食品中的含氮化合物。适量的适合人体种类的生物胺对于维持人体的正常生理功能是必不可少的，但是过量的摄入生物胺会给人体带来极大的毒害作用。生物胺的生成需要大量的蛋白质或者游离氨基酸以及适宜的微生物发生作用所需要的环境。而干酪加工成熟过程中恰恰具备这些要素。另外检测干酪中的生物胺不仅是考察干酪食品是否对人体健康具有毒害作用，还可以作为干酪生产工艺流程中，衡量各个工艺步骤是否合格的重要参照指标。
目前国内外形成了很多针对生物胺的检测技术，主要有薄层色谱法(TLC),气相色谱法，液相色谱串联质谱法(HPLC-MS)，毛细管电泳法(CE)，离子色谱法(IC)，高效液相色谱法(HPLC)，超高液相色谱法(UPLC)等。生物胺的定性和定量分析方法虽然能在准确度、精密度等方面已经随着分析仪器的进步达到了一定水平，但是这些方法都不同程度的存在检测灵敏度低，耗时长，成本高，对检测仪器设备硬件要求过高等问题。因此研究快速、简便、低廉的分析方法十分必要。本发明从干酪样品前处理，柱前衍生化处理，液相色谱检测条件几个方面着手，针对干酪中生物胺的检测建立方法，以解决这些问题。
发明内容
有鉴于此，通过对生物胺的提取、净化、衍生等步骤进行优化，以达到快速、准确检测干酪中生物胺的目的。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种干酪中6种生物胺的快速检测方法：包括以下步骤：
(1)标准曲线方程式的制备：将生物胺标准样品衍生处理将衍生处理后的生物胺标准采用高效液相色谱法得到标准曲线方程式。
(2)将待测的含有生物胺的食品样品衍生处理后采用高效液相色谱法得到生物胺的吸收峰值，再按照标准曲线得到食品样品中生物胺的含量。
其中所述的高效液相色谱法包括以下条件：色谱柱：大连依利特Hypersil ODS2(5μm，250mm×4.6mm)。柱温为30℃；流动相为乙腈-水；流速为1mL/min梯度洗脱，在25min内乙腈质量分数从30％升到100％。进样量为10μL；荧光检测器波长为Ex＝340nm，Em＝505nm。
(3)干酪中生物胺的提取：称取5～30g干酪样品于匀浆杯中，分别选用三氯乙酸、高氯酸、盐酸、无水乙醇，无水甲醇种提取干酪样品中的生物胺，选用正己烷提取样品种的脂肪。
优选的，步骤(1)中选用浓度为0.1mol/L的盐酸0.1mol/L三氯乙酸和作为生物胺的提取溶剂。
(4)生物胺提取液衍生化：在提取后的样液中先后加入1mL衍生剂和3mL的氢氧化钠-饱和碳酸氢钠缓冲溶液，在涡流混合器上混匀1min后置于35～65℃水浴锅中避光衍生15min，衍生后取出冷却至室温等待萃取。
优选的，步骤(2)中氢氧化钠-饱和碳酸氢钠缓冲溶液pH值为11.5。
(5)将衍生后的产物于40℃水浴条件下用氮气吹干仪将其中的有机溶剂吹干，并加入NaOH溶液，将衍生产物溶液的pH值调整为11.5。先用6mL乙腈淋洗固相萃取柱再用10mL水洗柱。将上述样液上柱萃取，待样液全部萃取完毕，用10mL质量分数为15％的丙酮-水溶液对固相萃取小柱进行淋洗，待淋洗液全部过柱之后，用5mL乙腈将生物胺衍生物洗脱，将乙腈洗脱液收集，在40℃水浴条件下氮气吹干。吸取1mL乙腈溶解残留物，用0.22μm有机膜过滤，以备进行色谱分析。优选的，步骤(4)中的柱子还可以采用免疫亲和柱。
本发明的优点是：
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明采用高效液相色谱仪对干酪中的酪胺、组胺、腐胺、尸胺、色胺、苯乙胺等6种生物胺进行分析。通过对生物胺的提取、净化、衍生等步骤进行优化，以达到快速、准确检测干酪中生物胺的目的。
具体实施方式
下面将结合具体实施例来进一步清楚、完整地描述本发明，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实例1
称取10g干酪样品于匀浆杯中，加入20mL浓度为0.1mol/L盐酸，置于匀浆机中，匀浆2min，收集水相，离心(4℃，12 000r/min，20min)，收集上清液，残渣重新提取。上清液合并，用滤纸过滤到烧杯中。取5mL样品提取液，加入5mL正己烷，漩涡混合器上混匀1min后静止分层，弃去正己烷层，重复2次，弃去有机相，在提取后的样液中先后加入1mL盐酸和3mL(pH值为11.5)的氢氧化钠-饱和碳酸氢钠缓冲溶液，在涡流混合器上混匀1min后置于65℃水浴锅中避光衍生15min，衍生后取出冷却至室温等待萃取。
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实例2
称取10g干酪样品于匀浆杯中，加入20mL浓度为0.1mol/L盐酸，置于匀浆机中，匀浆2min，收集水相，离心(4℃，12 000r/min，20min)，收集上清液，残渣重新提取。上清液合并，用滤纸过滤到烧杯中。取5mL样品提取液，加入5mL正己烷，漩涡混合器上混匀1min后静止分层，弃去正己烷层，重复2次，弃去有机相，在提取后的样液中先后加入1mL三氯乙酸和3mL(pH值为11.5)的氢氧化钠-饱和碳酸氢钠缓冲溶液，在涡流混合器上混匀1min后置于65℃水浴锅中避光衍生15min，衍生后取出冷却至室温等待萃取。
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实例3
称取10g干酪样品于匀浆杯中，加入20mL浓度为0.1mol/L盐酸，置于匀浆机中，匀浆2min，收集水相，离心(4℃，12000r/min，20min)，收集上清液，残渣重新提取。上清液合并，用滤纸过滤到烧杯中。取5mL样品提取液，加入5mL正己烷，漩涡混合器上混匀1min后静止分层，弃去正己烷层，重复2次，弃去有机相，在提取后的样液中先后加入2mL盐酸和3mL(pH值为11.5)的氢氧化钠-饱和碳酸氢钠缓冲溶液，在涡流混合器上混匀1min后置于50℃水浴锅中避光衍生20min，衍生后取出冷却至室温等待萃取。
将衍生后的产物于40℃水浴条件下用氮气吹干仪将其中的有机溶剂吹干，并加入NaOH溶液，将衍生产物溶液的pH值调整为11.5。先用6mL乙腈淋洗固相萃取柱再用10mL水洗柱。将上述样液上柱萃取，待样液全部萃取完毕，用10mL质量分数为15％的丙酮-水溶液对固相萃取小柱进行淋洗，待淋洗液全部过柱之后，用6mL乙腈将生物胺衍生物洗脱，将乙腈洗脱液收集，在40℃水浴条件下氮气吹干。吸取1mL乙腈溶解残留物，用0.22μm有机膜过滤，进行色谱分析。
实例4
称取10g干酪样品于匀浆杯中，加入20mL浓度为0.1mol/L盐酸，置于匀浆机中，匀浆2min，收集水相，离心(4℃，12000r/min，20min)，收集上清液，残渣重新提取。上清液合并，用滤纸过滤到烧杯中。取5mL样品提取液，加入5mL正己烷，漩涡混合器上混匀1min后静止分层，弃去正己烷层，重复2次，弃去有机相，在提取后的样液中先后加入1mL三氯乙酸和3mL(pH值为11.5)的氢氧化钠-饱和碳酸氢钠缓冲溶液，在涡流混合器上混匀1min后置于50℃水浴锅中避光衍生20min，衍生后取出冷却至室温等待萃取。
将衍生后的产物于40℃水浴条件下用氮气吹干仪将其中的有机溶剂吹干，并加入NaOH溶液，将衍生产物溶液的pH值调整为11.5。先用6mL乙腈淋洗固相萃取柱再用10mL水洗柱。将上述样液上柱萃取，待样液全部萃取完毕，用10mL质量分数为25％的丙酮-水溶液对固相萃取小柱进行淋洗，待淋洗液全部过柱之后，用5mL乙腈将生物胺衍生物洗脱，将乙腈洗脱液收集，在40℃水浴条件下氮气吹干。吸取1mL乙腈溶解残留物，用0.22μm有机膜过滤，进行色谱分析。
(1)对上述实施例1～4中六种生物胺的线性回归方程和相关系数
表1 6种生物胺的线性回归方程以及相关系数
由表1可知，六种生物胺的浓度和峰面积在本方法的条件下，线性关系良好，相关系数为0.9992～0.9998。此外，每种生物胺的检测限，根据三倍噪音的峰面积响应值来确定。色胺的最低检出限为0.0052mg/L；组胺为0.0037mg/L；酪胺为0.0158mg/L；β-苯乙胺为0.0063mg/L；尸胺为0.0072mg/L；腐胺为0.0182mg/L。
(2)对上述实施例1～4中干酪样品中生物胺的添加量的确定
在干酪样品中分别添加2mg/L、3mg/L、5mg/L 3个水平含量的6种生物胺。计算每种生物胺的平均回收率，以及相对标准偏差，试验结果如下表所示。
表2 6种生物胺的添加回收率试验结果(n＝5)
由表2，可知除β-苯乙胺回收率为78.2％～82.6％之外，其余五种生物胺的回收率均较高，相对标准偏差均小于6.7％。回收率和精密度符合检测要求。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (10)
1.一种检测干酪中生物胺的方法：具体包括以下步骤(1)标准曲线方程式的制备：将生物胺标准样品衍生处理，将衍生处理后的生物胺标准品采用高效液相色谱法得到标准曲线方程式；(2)将待测的含有生物胺的干酪样品衍生处理后采用高效液相色谱法得到生物胺的吸收峰值，再按照标准曲线得到食品样品中生物胺的含量；(3)用水、酸性或有机相介质中提取干酪中生物胺；(4)用衍生剂衍生化后带上发色基团，对生物胺衍生产物进行萃取，然后进行梯度洗脱后，利用荧光检测器进行检测。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱法包括以下条件：进样量10μL，采用大连依利特Hypersil ODS2(5μm，250mm×4.6mm)色谱柱；柱温为30℃；流动相为乙腈-水；在25min内乙腈质量分数从30％升到100％；荧光检测器波长为Ex＝340nm，Em＝505nm。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，乙腈-水用量为4.5～6mL。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物胺是色胺、组胺、酪胺、2-苯乙胺、尸胺、腐胺中的一种。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，衍生：在提取后的样液中先后加入衍生剂和3mL的氢氧化钠-饱和碳酸氢钠缓冲溶液，在涡流混合器上混匀1min后置于35～65℃水浴锅中避光衍生15min，衍生后取出冷却至室温等待萃取。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，氢氧化钠-饱和碳酸氢钠缓冲溶液pH为11.5。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述衍生剂为丹磺酞氯，衍生剂用量为1～1.5mL，浓度为5mg/mL。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酸性介质为三氯醋酸、盐酸中的一种，萃取方式方式为固相萃取，梯度洗脱流速为1mL/min。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将衍生后的产物水浴条件下用氮气吹干仪将其中的有机溶剂吹干，并加入NaOH溶液，将衍生产物溶液的pH值调整为11.5；先用乙腈淋洗固相萃取柱再用水洗柱。待样液全部萃取完毕，用丙酮-水溶液对固相萃取小柱进行淋洗，然后用乙腈将生物胺衍生物洗脱，将乙腈洗脱液收集，在水浴条件下氮气吹干；吸取1mL乙腈溶解残留物，用0.22μm有机膜过滤，以备进行色谱分析。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，水浴条件为40～50℃，丙酮-水溶液的质量分数为10～25％。
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| CN114441498A (zh) * | 2022-03-01 | 2022-05-06 | 中国海洋大学 | 基于固相萃取和比率荧光传感检测食品中组胺的方法 |
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