CN103149317A

CN103149317A - 一种快速测定食品中生物胺的方法

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Publication number: CN103149317A
Application number: CN2012105610527A
Authority: CN
Inventors: 夏小乐; 张斌; 张无疾; 夏梅芳; 王武
Original assignee: NANTONG BAIPU GLUTINOUS RICE WINE CO Ltd; Jiangnan University
Current assignee: NANTONG BAIPU GLUTINOUS RICE WINE CO Ltd; Jiangnan University
Priority date: 2012-12-21
Filing date: 2012-12-21
Publication date: 2013-06-12

Abstract

一种快速测定食品中生物胺的方法，属于食品分析和安全技术领域。本发明包括以下步骤：（1）食品样品中生物胺的提取；（2）生物胺提取液净化；（3）生物胺提取液衍生化；（4）展开剂的优化和薄层层析分析。本发明所提供快速测定食品中生物胺的方法，可用于鱼类、肉类、奶酪、酒类和醋类等产品中生物胺含量的快速测定。与其它分析方法相比，本方法无需昂贵的分析仪器，费用低，操作简便、快捷，能有效降低食品生产流通中的监控成本。

Description

一种快速测定食品中生物胺的方法

技术领域

本发明涉及一种快速测定食品中生物胺的方法，属于食品分析和安全技术领域。

背景技术

生物胺是一类含氮的低分子量碱性有机化合物；含有蛋白质和氨基酸的食品，在一定条件下经过发酵或生化反应便可产生生物胺。目前已发现水产品、肉制品、乳制品、葡萄酒、啤酒、蔬菜、水果、干果和巧克力等食品中均含有多种生物胺。过量的生物胺被证明对人体会产生一些不良的生理反应，在食品保藏学中，生物胺往往是在食品腐烂或发酵过程中产生；食物中毒的发作和某些毒理学特性与组胺和酪胺有密切联系。

美国 FDA 通过对爆发组胺中毒大量数据的研究，确定组胺的危害作用水平为：500mg/kg 食品。欧美及我国已经对部分食品中组胺含量做了限量要求，美国 FDA 要求进口水产品组胺不得超过 50mg/kg；欧盟规定鲭科鱼类中组胺含量不得超过 100mg/kg；其它食品中组胺不得超过100mg/kg，酪胺不得超过 100~800 mg/kg。其它胺类的控制也逐步提上议事日程，我国2008年出台了相关标准对于食品中生物胺的限量提出了要求，主要涉及色胺、β-苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、亚精胺和精胺，液体样本中一般要求小于10 μg/kg，固体样本中一般要求小于50 μg/kg。

目前食品中生物胺的检测一般采用高效液相色谱（HPLC），毛细管电泳(CE)，生物传感器等方法。这些方法均有一定的应用，也各有优缺点；如最常用的RP-HPLC法，一般认为其具有检测灵敏度高、定量分析准确和柱效高等优点，且有多个标准方法基于该技术实施；但是该方法需要高效液相色谱，且仪器预热平衡和分析等过程时间较长，速度较慢，灵活性较差。CE因无需对样品进行衍生化处理，且具有灵敏度较高、分离速度快、成本较低、无环境污染等优点；但是相对而言对于一些中性物质较难分离，且检测限相对较高。生物传感器由于其具有在线监测的能力被推崇，但是现有技术仍不是非常成熟，市场较少有可靠的成套装备，且价格较昂贵。

因此在食品加工和流通等环节迫切需要一种无需昂贵的分析仪器，费用低，操作简便、快捷，检测限能够达到ng级别，能够满足现场快速检测的需要的方法，切实保障食品安全。

发明内容

本发明的目的是克服上述现有技术中的缺点，提供一种快速测定食品中生物胺的方法，本发明设计巧妙、易操作、成本低、速度快、适于大规模应用。

为了实现上述目的，本发明的技术方案：一种快速测定食品中生物胺的方法，包括以下步骤：

（1）食品样品中生物胺的提取：取2-50g食品样品，用水、酸性或有机相介质中提取食品样品中生物胺，提取两次；最终用5%的三氯乙酸稀释至100mL；

酸性介质选用HCl、HClO₄、TCA中的一种，酸性介质的浓度在0.1mol/L-1mol/L；有机相介质选用甲醇、丙酮、乙腈-高氯酸、二氯甲烷-高氯酸中的一种或几种复合；

根据不同的样品采取不同的介质提取，针对奶制品和豆制品较佳的采用0.1mol/L-1mol/L的盐酸提取或采用乙腈-高氯酸提取；针对肉类、水产等较佳的采用0.1mol/L-1mol/L高氯酸或三氯乙酸提取，也可采用二氯甲烷－高氯酸提取；最终用5%的三氯乙酸稀释至100mL。

（2）生物胺提取液的净化，首先用等比例的正己烷萃取脱去脂肪，然后进行液-液萃取；基本步骤：样品液或样品提取液先用盐饱和，较佳的采用NaCl、Na₂CO₃、Na₂SO₄中的一种或几种，然后调 pH 至碱性。最后用有机溶剂萃取，较佳的有机溶剂指的是正丁醇、氯仿、异丁醇、异戊醇和乙醚中的一种或几种。最后氮气吹干并加入0.1mol/L的盐酸溶解残留物。有机溶剂的选择和配比必需按照产品的特性进行。

（3）生物胺提取液衍生化：将净化后的提取液用衍生剂进行衍生以利于紫外检测，将衍生剂加入到1mL净化后的提取液中，衍生剂与提取液的体积比在1︰20－1︰3之间，然后在40-70℃下反应30min，然后加入2ml超纯水，40℃氮气除去配制衍生剂所带入的丙酮。加入6ml乙醚进行萃取，获得的有机相用氮气吹干，加入1mL甲醇，过滤后待用。

较佳的衍生剂为丹磺酰氯、邻苯二甲醛、苯甲酰氯、9-芴基甲基-氯甲酸酯和苯基异硫氰酸盐中的一种；

（4）展开剂的优化和薄层层析分析：将待测液点在表面涂有 0.25mm 厚硅胶板上；采用二次展开技术，两种展开系统，所述两种不同展开系统，第一种是氯仿-苯-三乙胺、氯仿-乙醚-三乙胺，氯仿-三乙胺中的一种；第二种系统是苯-丙酮-三乙胺、氯仿-三乙胺、乙醚-丙酮-三乙胺中的一种；

展开显色应当遵循薄层层析一般操作程序，显色采用碘蒸汽或喷雾显色；也可不显色。

显色后于 360nm紫外条件下对色谱板进行观察，以确定样品中是否存在目标生物胺。然后，采用岛津色谱扫描仪在 254nm 条件下对色谱板进行扫描，根据每个斑点的吸光值进行定量计算。

所述的及涉及的化学品和标准品应当满足GB/T 5009.208-2008标准。

本发明的有益效果：

相较而言薄层色谱（TLC）是一种简便、快速的分析方法。该方法应用于测定鱼类、肉类和奶酪样品中生物胺含量的前期筛选简便快捷。与其它分析方法相比，TLC 法无需昂贵的分析仪器，费用低，操作简便、快捷，可对食品中生物胺的定性与半定量测定，检测限能够达到ng级别，方便可靠，完全能够满足现场快速检测的需要，可有效降低监控成本，提高我国食品中生物胺的监测水平，保障人民群众的身体健康。

具体实施方式

实施例1

鲱鱼50g用搅拌器打碎，并用5%的三氯醋酸(TCA)提取生物胺，然后4000g离心5min，取上清并定容至100mL提取液。取10mL提取液加入到10mL正己烷中，振荡5min除去油脂，重复两次；弃去有机相加入5mL饱和NaCl溶液，调pH值至11，加入5mL正丁醇-氯仿（1:1）萃取，振荡5min，4000 g离心10min，吸取上层有机相，重复三次，合并萃取液，40℃下氮气吹干，加入1.0 mL、1 mol/L盐酸制得净化液。

实施例2

奶酪50g用搅拌器打碎，并用0.5mol/L的盐酸提取生物胺，然后4000g离心5min，取上清并定容至100mL提取液。取10mL提取液加入到10mL正己烷中，振荡5min除去油脂，重复两次；弃去有机相加入5mL饱和Na₂SO₄溶液，调pH值至11，加入5mL乙醚萃取，振荡5min，4000 g离心10min，吸取上层有机相，重复三次，合并萃取液，40℃下氮气吹干，加入1.0mL、1 mol/L盐酸制得净化液。

实施例3

国产葡萄酒5mL，15℃超声波30min处理，加0.5mol/L的高氯酸定容到50mL；取10mL提取液加入到10mL正己烷中，振荡5min除去油脂，重复两次；弃去有机相加入5mL饱和Na₂CO₃溶液，调pH值至11，加入5mL异戊醇萃取，振荡5min，4000 g离心10min，吸取上层有机相，重复三次，合并萃取液，40℃下氮气吹干，加入1.0mL、1 mol/L盐酸制得净化液。

实施例4

将制得的净化液0.5mL加入1.5mL碳酸氢钠溶液，1.0mL丹磺酰氯衍生液（0.1mol/L），混匀40℃下反应30min，取出加入100μL的50 g/L饱和碳酸氢钠溶液，振荡混匀，保温15min，加入1mL超纯水。加入3mL乙醚振荡2min，吸取有机相，重复萃取两次，合并乙醚萃取液，氮气吹干。加入1.0mL甲醇使残留物溶解，振荡混匀，0.22μm过滤待用。

实施例5

制备混标，含有八种胺，分别为色胺、腐胺、尸胺、亚精胺、组胺、精胺、酪胺和β-苯乙胺，浓度梯度为 (0.50 mg/L，1.00 mg/L，2.50 mg/L，5.00 mg/L，10.0 mg/L，15.0 mg/L，25.0mg/L，50.0 mg/L)。取10μL样液点在30×30cm表面涂有 0.25mm 厚硅胶板上，吹干后，用氯仿-苯-三乙胺(6:4:1)，展开15cm后，第二种系统是苯-丙酮-三乙胺(6:4:1)中的一种，再展开15cm；室温下干燥20min再用吹风机吹干；360nm下定性检测，在岛津色谱扫描仪254nm下检测并半定量。所得到的混标的线性方程如表1所示：

表1 混标的线性方程

胺	线性范围	相关系数(r²)	回归方程
				色胺	0-50 mg/L	0.970	Y=0.037+0.047X
腐胺	0-50 mg/L	0.982	Y=0.827+0.176X
				尸胺	0-50 mg/L	0.993	Y=0.821+0.711X
亚精胺	0-50 mg/L	0.971	Y=-0.252+0.099X
				组胺	0-50 mg/L	0.986	Y＝-0.344+0.132X
精胺	0-50 mg/L	0.993	Y=-0.080+0.088X
				酪胺	0-50 mg/L	0.997	Y=-0.523+0.515
β-苯乙胺	0-1000 μg/L	0.991	Y=-0.011+0.061X

实施例6

将鲤鱼、奶酪和葡萄酒经过净化制得的待测液，用0.5mL加入1.5mL碳酸氢钠溶液，1.0mL苯甲酰氯衍生液（0.1mol/L），混匀50℃下反应30min，取出加入100μL的50 g/L饱和碳酸氢钠溶液，振荡混匀，保温15min，加入1mL超纯水。加入3mL乙醚振荡2min，吸取有机相，重复萃取两次，合并乙醚萃取液，氮气吹干。加入1.0mL甲醇使残留物溶解，振荡混匀，0.22μm过滤待用。取10μL样液点在30×30cm表面涂有 0.25mm 厚硅胶板上，吹干后，用氯仿-乙醚-三乙胺(6:4:1)，展开15cm后，第二种系统是乙醚-丙酮-三乙胺(6:4:1)，再展开15cm；室温下干燥20min再用吹风机吹干；碘蒸汽30min显色，在岛津色谱扫描仪 254nm下检测并半定量。结果与RP-HPLC相比较具体结果如表2所示：

表2 不同种类食品生物胺TLC和HPLC检测比较

注：含量均为mg/L

在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以做出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书应被认为是说明性的而非限制性的。

Claims

1.一种快速测定食品中生物胺的方法，其特征在于步骤为：

（1）食品样品中生物胺的提取：取2-50g食品样品，用水、酸性或有机相介质提取食品样品中生物胺，提取两次，最终用5%的三氯乙酸稀释至100mL；

（2）生物胺提取液净化：首先用与提取液等比例的正己烷萃取脱去脂肪，然后进行液-液萃取；基本步骤：样品液或样品提取液先用盐饱和，然后调 pH 至碱性，最后用有机溶剂萃取，氮气吹干并加入0.1mol/L的盐酸溶解残留物；

所述的饱和盐选用NaCl、Na₂CO₃、Na₂SO₄中的一种；有机溶剂选用正丁醇、氯仿、异丁醇、异戊醇、乙醚中的一种或几种的复合，有机溶剂的选择和配比必需按照产品的特性进行；

（3）生物胺提取液衍生化：将净化后的提取液用衍生剂进行衍生以利于紫外检测，将衍生剂加入到1mL净化后的提取液中，衍生剂与提取液的体积比在1︰20－1︰3之间，在40-70℃下反应30min，然后加入2mL超纯水，40℃氮气除去配制衍生剂所带入的丙酮，加入6mL乙醚进行萃取，获得的有机相用氮气吹干，加入1mL甲醇，过滤后待用；

所述衍生剂选用丹磺酰氯、邻苯二甲醛、苯甲酰氯、9-芴基甲基-氯甲酸酯、苯基异硫氰酸盐中的一种；

（4）展开剂的优化和薄层层析分析：将待测液点在表面涂有 0.25mm 厚硅胶板上；采用二次展开技术，两种展开系统，

所述两种不同展开系统，第一种是氯仿-苯-三乙胺、氯仿-乙醚-三乙胺、氯仿-三乙胺中的一种；第二种系统是苯-丙酮-三乙胺、氯仿-三乙胺、乙醚-丙酮-三乙胺中的一种；展开显色应当遵循薄层层析一般操作程序，显色采用碘蒸汽或喷雾显色；也可不显色；

显色后于 360nm紫外条件下对色谱板进行观察，以确定样品中是否存在目标生物胺；然后，采用岛津色谱扫描仪在 254nm 条件下对色谱板进行扫描，根据每个斑点的吸光值进行定量计算；

所述的涉及的化学品和标准品应当满足GB/T 5009.208-2008标准。