CN101793881B - 一种食品中生物胺的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种食品中生物胺的检测方法。本发明分别采用高效液相色谱法或超高效液相色谱法对食品中的生物胺进行检测。本发明确定了适用、于豆酱中生物胺检测的反相高效液相色谱色谱条件,明确了色谱柱、检测波长、流动相和柱温,分别利用二级管阵列检测器和荧光检测器对豆酱中生物胺进行检测。本发明还将超高效液相色谱方法用于豆酱中生物胺的检测,确定超高效液相色谱柱和流动相,构建了适用于豆酱中生物胺检测的超高效液相色谱条件,并分别用紫外检测器和荧光检测器两种检测器检测。两种方法检测范围内线性关系良好,满足当前生物胺残留检测的要求。试验表明,本发明方法可以准确、灵敏的检测出食品中生物胺的含量和种类。
Description
技术领域
本发明涉及一种食品中有害成分的检测方法,尤其涉及一种食品中生物胺的检测方法,属于生物胺的检测领域。
背景技术
生物胺是具有生物活性的低分子有机胺类化合物的总称,是一类含氮的脂肪族或杂环类的低分子有机碱。根据生物胺所含氨基数目可将其分为单胺和多胺两类,包括组胺、酪胺、腐胺、色胺、尸胺、β-苯乙胺、精胺和亚精胺等多种;根据其结构又可以把生物胺分成三类:脂肪族生物胺(腐胺、尸胺、精胺、亚精胺等)、芳香族生物胺(酪胺、苯乙胺等)和杂环族(组胺、色胺等)生物胺。这类化合物是在微生物、植物、动物等生体中代谢生成的,因此被称作生物胺。一般来说,生物胺通常是在食品腐烂或发酵过程中产生,由于微生物的作用,食品中的一些氨基酸通过氧化脱羧作用形成了生物胺类化合物。
目前,有关生物胺前体物质的研究已成为热点。据报道,有关专家已找到大多数生物胺的前体物质。如组胺、酪胺、色胺和苯乙胺分别是由组氨酸、酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸经酶解脱羧生成的。但也有报道说某些脂肪胺是由相应的醛在“活体”内胺化而生成的。各种动植物组织中均含有少量的生物胺,生物胺是机体内的正常活性成分,具有重要的生理作用。除存在于动植物组织中外,生物胺在食品中也普遍存在,尤其是在蛋白含量丰富的食品以及一些发酵食品(如啤酒、葡萄酒、发酵肉制品、干酪等)中。研究表明,人们从食品中摄入一定量的外源性生物胺,具有一定的生理活性和毒理活性。
早期多采用薄层层析方法检测食品中的生物胺,现在许多先进的分析技术已得到了发展,可以更好的分离多种生物胺,并且可以得到批量的可靠数据。目前应用于食品中生物胺检测的分析方法主要有高效液相色谱法、毛细管电泳法、离子色谱法、薄层色谱法和电化学生物传感器法等,氨基酸分析仪中的离子交换色谱法也可用于食品中生物胺的检测。
关于薄层色谱检测,Shalaby研究了一种同时分离测定食品中组胺、酪胺、色胺、尸胺、腐胺、β-苯乙胺、精胺、亚精胺等8种生物胺的半定量薄层色谱法。薄层板规格为20×20cm、表面涂有0.25mm厚硅胶的铝薄板,衍生试剂为丹磺酰氯。采用二次展开技术,展开系统:1.氯仿/苯/三乙胺(6∶4∶1,v/v/v);2.苯/丙酮/三乙胺(10∶2∶1,v/v/v),于360nm紫外条件下对色谱板进行观察,确定样品中是否存在目标物生物胺。然后采用色谱扫描仪在254nm条件下对色谱板进行扫描,根据每个斑点的吸光值进行定量计算。该方法可在两小时内同时测定14个样品,标准曲线线性良好,相对标准偏差为0.970~0.997。组胺、酪胺、尸胺、腐胺、亚精胺的定量限为5ng;色胺、精胺、苯乙胺的定量限为10ng。该方法可用于肉类、鱼类和奶酪样品中生物胺含量的前期筛选测定。
电化学生物传感器分析生物胺方法中,其原理为:生物胺在单胺氧化酶或二胺氧化酶的催化作用下脱去氨基生成醛、氨和过氧化氢,通过测定反应生成的H2O2的量确定样品中生物胺的含量。Draisci等研究了一种测定生物胺的电化学生物传感器,可以检测8种生物胺,该方法的线性范围1×10-6~5×10-5mol/L,检测限5×10-7mol/L。酶生物传感器的关键在于酶源的选择和酶敏感层的制备两方面。酶的来源不同,制成的传感器的选择性、稳定性和灵敏度都会有所不同。Tombelli等利用二胺氧化酶研制了三种电化学生物传感器,他们分析测定组胺研究发现:应用电化学生物传感器测定生物胺时可以得到较低的检测限。采用同一种生物来源酶的不同传感器对生物胺的选择性一致,而同一传感器采用不同生物来源的酶时对生物胺的选择性发生改变。电化学生物传感器作为食品中生物胺含量的初步筛选方法,具有简便、快速的特点,但因所用的酶主要从自然界筛选而来,成本较高、难于保存,且不能反复使用。因此,该方法仍处于试验室研究阶段。
反相高效液相色谱法几乎可以分离所有的有机化合物,多数研究者选择RP-HPLC对食品中的生物胺进行分离和定性定量分析。生物胺类化合物既没有特异的紫外吸收基团,也没有荧光特性,所以在采用反相高效液相色谱法检测时,通常首先需要对生物胺进行衍生化处理。衍生方法分为柱前衍生和柱后衍生两种。柱后衍生是样品经过色谱柱分离后,先进入特殊的衍生设备中进行衍生,再通过检测器进行分析。柱后衍生的结果是色谱图干扰少、重复性好、耗时少,并且实现了操作的程序化、自动化;但所需的仪器设备昂贵,投资大。所以目前多采用柱前衍生法。
超高效液相色谱是分离分析学科的全新类别,其涵盖了小颗粒填料、超低系统体积及快速检测等新技术,在全面提升高效液相色谱的速度、灵敏度及分离度等诸多重要品质的同时,保留了高效液相色谱原有的实用性及原理。在检测生物胺方面,超高效液相色谱与高效液相色谱相比具有以下特点:超高效液相色谱所采用的小颗粒填料(1.7μm)色谱柱能在超乎寻常地提高分析速度同时而不降低分离度,从而显著增加样品的通量,提高工作效率,降低分析成本,大大缩短了以往耗时的方法开发和验证的时间,提高了方法开发和应用的效率。超高效液相色谱柱的小颗粒技术和整体化的仪器设计,使超高效液相色谱在改善分离度的同时提高了灵敏度,且具有更高的柱效和更窄的色谱峰,从而在得到超高分离度和超高分析速度的同时能够得到超高的灵敏度,灵敏度可比高效液相色谱增加3倍。超高效液相色谱采用的小颗粒填料技术的色谱柱,具有超强的分离能力和超低的扩散体积,为充分发挥小颗粒填料色谱柱的分离能力提供了条件。超高效液相色谱与高效液相色谱相比在色谱条件相同情况下,分离度可提高2倍。
高效液相色谱和超高效液相色谱两种方法均适用于豆酱中生物胺的检测。与高效液相色谱方法相比,超高效液相色谱方法分离度和灵敏度高,适用于痕量生物胺的检测,且在同等色谱条件下,超高效液相色谱方法可在更短的时间内实现生物胺的分离,适用于批量样品的检测。但高效液相色谱成本较超高效液相色谱低。因此,对豆酱中生物胺进行检测时,可以根据实际情况选择分析方法。
无论是采用高效液相色谱还是采用超高效液相色谱对食品中的生物胺进行分离时,都需要摸索和寻找的合适的色谱条件包括对色谱柱、检测波长、流动相和柱温等,此外,还需要确定一套与分离方法相匹配的检测方法,这些都直接关系到分离和检测方法的准确度和灵敏度。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足,提供一种生物胺的检测方法;
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的:
一种检测食品中生物胺的方法,包括:(1)标准曲线方程式的制备:将生物胺标准样品衍生处理;将衍生处理后的生物胺标准采用高效液相色谱法得到标准曲线方程式;(2)将待测的含有生物胺的食品样品衍生处理后采用高效液相色谱法得到生物胺的吸收峰值,再按照标准曲线得到食品样品中生物胺的含量。
其中所述的高效液相色谱法包括以下条件:进样量20μL;色谱柱采用XDB-C18柱(4.6mm×250mm,5μm);流动相用pH 3.5的0.01mol/LKH2PO4溶液和甲醇进行梯度洗脱,流速1.0mL/min,梯度洗脱;分别采用二级管阵列检测器和荧光检测器进行测定:紫外检测波长为254nm、荧光检测激发波长330nm、发射波长465nm;柱温30℃。
又一种检测食品中生物胺的方法,包括:(1)标准曲线方程式的制备:将生物胺标准样品衍生处理;将衍生处理后的生物胺标准采用超高效液相色谱法得到标准曲线方程式;(2)将待测的含有生物胺的食品样品衍生处理后采用超高效液相色谱法得到生物胺的吸收峰值,再按照标准曲线得到食品样品中生物胺的含量。
其中所述的超高效液相色谱法包括以下条件:进样量5μL;采用BEH-C18(50mm×2.1mm,1.7μm)为超高效液相色谱柱;流动相用pH 3.5的0.005mol/L乙酸铵溶液和甲醇进行等度洗脱,乙酸铵和甲醇的体积比为70∶30;分别采用紫外检测器和荧光检测器测定:紫外检测波长254nm、荧光激发波长330nm、发射波长465nm;流速0.250mL/min;柱温30℃。
所述的生物胺标准样品衍生处理可参考以下方法进行:将浓度为0.5g/L的生物胺各单标标准物溶于0.1mol/L盐酸溶液中,得到单标储备液;每个生物胺的单标储备液中各取10mL定容至100mL;得生物胺混标储备液;将10mg的丹磺酰氯溶于1mL的丙酮中,备用;将200μL 2mol/L的NaOH溶液加入至1mL标准溶液中,然后加300μL的饱和NaHCO3溶液缓冲再加入1.5mL的丹磺酰氯溶液,将混合后的溶液放入40℃恒温箱保温处理40min之后,加入100μL的氨水去除丹磺酰氯终止反应,最后用乙腈定容至5mL;用有机滤膜过滤,即得。
本发明确定了适用于豆酱中生物胺检测的反相高效液相色谱色谱条件,明确了色谱柱、检测波长、流动相和柱温。分别利用二级管阵列检测器和荧光检测器两种检测器对豆酱中生物胺进行检测。生物胺在检测范围内线性关系良好,相对标准偏差均小于10%;二级管阵列检测器和荧光检测器两种检测器的检测限分别为3~31μg/kg和10~160μg/kg,满足当前生物胺残留检测的要求。
本发明还将目前分离分析方面的超高效液相色谱方法用于豆酱中生物胺的检测,确定超高效液相色谱柱和流动相,构建了适用于豆酱中生物胺检测的超高效液相色谱条件,并分别用紫外检测器和荧光检测器两种检测器检测。试验表明,7种生物胺在检测范围内线性关系良好,相对标准偏差均小于10%;紫外检测器和荧光检测器两种检测器的检测限分别为1.3~15.0μg/kg和4~54μg/kg,满足当前生物胺残留检测的要求。
总之,本发明方法可以准确、灵敏的检测出食品中生物胺的含量和种类。
附图说明
图1空白豆酱样品(a)和加标豆酱样品(b)的HPLC-FLD色谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明,本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的,并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是,在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换,但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1
称取0.05g生物胺标准物溶于0.1mol/L盐酸溶液中,于100mL棕色容量瓶定容至刻度,放于冰箱中4℃保存。个生物胺的单标储备液中各取10mL于100mL棕色容量瓶中定容至刻度得生物胺混标储备液,放于冰箱中4℃保存。将10mg的丹磺酰氯溶于1mL的丙酮中,新鲜制备并避光保存。将200μL、2mol/L的NaOH溶液加入至1mL标准溶液中,然后加300μL的饱和NaHCO3溶液缓冲。加入1.5mL的丹磺酰氯溶液,将混合后的溶液放入40℃恒温箱保温处理40min之后,加入100μL的氨水去除丹磺酰氯终止反应,最后用乙腈定容至5mL。衍生处理后用0.22μm的有机滤膜过滤用于分析检测。
高效液相色谱法使用XDB-C18柱(4.6mm×250mm,5μm);流动相用pH 3.5的0.01mol/L KH2PO4溶液和甲醇进行梯度洗脱,流速1.0mL/min,梯度洗脱;分别采用二级管阵列检测器和荧光检测器进行测定:紫外检测波长为254nm、荧光检测激发波长330nm、发射波长465nm;进样量20μL;柱温30℃。生物胺在检测范围内线性关系良好,相对标准偏差均小于10%;荧光检测器和二级管阵列检测器两种检测器的检测限分别为3~31μg/kg和10~160μg/kg,满足当前生物胺残留检测的要求。
实施例2
称取0.05g生物胺标准物溶于0.1mol/L盐酸溶液中,于100mL棕色容量瓶定容至刻度,放于冰箱中4℃保存。个生物胺的单标储备液中各取10mL于100mL棕色容量瓶中定容至刻度得生物胺混标储备液,放于冰箱中4℃保存。将10mg的丹磺酰氯溶于1mL的丙酮中,新鲜制备并避光保存。将200μL、2mol/L的NaOH溶液加入至1mL标准溶液中,然后加300μL的饱和NaHCO3溶液缓冲。加入1.5mL的丹磺酰氯溶液,将混合后的溶液放入40℃恒温箱保温处理40min之后,加入100μL的氨水去除丹磺酰氯终止反应,最后用乙腈定容至5mL。衍生处理后用0.22μm的有机滤膜过滤用于分析检测。
超高效液相色谱法使用BEH-C18(50mm×2.1mm,1.7μm)超高效液相色谱柱;流动相用pH 3.5的0.005mol/L乙酸铵溶液和甲醇进行等度洗脱,乙酸铵和甲醇的体积比为70∶30;分别采用紫外检测器和荧光检测器测定:紫外检测波长254nm、荧光激发波长330nm、发射波长465nm;进样量5μL;流速0.250mL/min;柱温30℃。生物胺在检测范围内线性关系良好,相对标准偏差均小于10%;荧光检测器和紫外检测器两种检测器的检测限分别为1.3~15.0μg/kg和4~54μg/kg,满足当前生物胺残留检测的要求。
试验例HPLC-FLD方法检测豆酱中生物胺的方法学验证及实例分析
HPLC-FLD方法检测生物胺的方法学验证
一、方法的线性范围
在0.1~50mg/kg浓度范围内分别添加7种生物胺的混合标准溶液,配制浓度为0.1、0.5、5、25、50mg/kg的系列标准溶液,按照方法上述方法进行衍生和检测。根据7种生物胺的平均峰面积(y,n=5)与相应生物胺的标准浓度(x,mg/kg)进行线性回归,绘制标准校正曲线,经Agilent工作站软件分析处理后,7种生物胺的线性回归方程见表1。
表17种生物胺的线性回归方程及相关系数(R2)
y:tne mean peak area of 7 BAs(n=5);
x:mass concentrations of 7 BAs(mg/kg).
二、方法的回收率、精密度和检出限
选用不含7种待测组分的空白豆酱样品,分别添加0.5mg/kg、5mg/kg和50mg/kg三个浓度水平的7种生物胺的混合标准溶液,按建立的方法处理样品,分析检测并计算回收率和精密度,测得7种生物胺平均回收率(n=5)范围在74.7~105.1%之间,相对标准偏差为2.1~9.7%。加标豆酱样品如图1。
本试验在标准添加回收率试验的最低质量浓度点0.1mg/kg,各种生物胺的信噪比(S/N)均大于10,并且具有较好的回收率,故确定各生物胺的定量限为0.1mg/kg;以3倍信噪比(S/N)计算方法的检出限,7种生物胺的回收率、精密度及检出限见表2。
表27种生物胺的添加回收率、精密度和检出限(n=5)
a检出限:信噪比为3
三、实际样品分析
对10份豆酱样品进行分析,采用标准校正曲线进行定量,含量见表3。
表3豆酱样品中生物胺含量(mg/kg)
ND:not detectable
Claims (2)
1.一种检测豆酱中生物胺的方法,包括:(1)标准曲线方程式的制备:将生物胺标准样品衍生处理;将衍生处理后的生物胺标准样品采用高效液相色谱法得到标准曲线方程式;(2)将待测的含有生物胺的豆酱样品衍生处理后采用高效液相色谱法得到生物胺的吸收峰值,再按照标准曲线得到豆酱样品中生物胺的含量;
所述的高效液相色谱法包括以下条件:进样量20μL;采用XDB-C18柱为高效液相色谱柱;流动相用pH 3.5的0.01mol/L KH2PO4溶液和甲醇进行梯度洗脱,流速1.0mL/min,梯度洗脱;分别采用二级管阵列检测器和荧光检测器进行测定:紫外检测波长为254nm、荧光检测激发波长330nm、发射波长465nm;柱温30℃;
所述的生物胺标准样品衍生处理包括以下步骤:将浓度为0.5g/L的生物胺各单标标准物溶于0.1mol/L盐酸溶液中,得到单标储备液;每个生物胺的单标储备液中各取10mL定容至100mL;得生物胺混标储备液;将10mg的丹磺酰氯溶于1mL的丙酮中,备用;将200μL 2mol/L的NaOH溶液加入至1 mL标准溶液中,然后加300μL的饱和NaHCO3溶液缓冲再加入1.5mL的丹磺酰氯溶液,将混合后的溶液放入40℃恒温箱保温处理40min之后,加入100μL的氨水去除丹磺酰氯终止反应,最后用乙腈定容至5mL;用有机滤膜过滤,即得。
2.一种检测豆酱中生物胺的方法,包括:(1)标准曲线方程式的制备:将生物胺标准样品衍生处理;将衍生处理后的生物胺标准样品采用超高效液相色谱法得到标准曲线方程式;(2)将待测的含有生物胺的豆酱样品衍生处理后采用超高效液相色谱法得到生物胺的吸收峰值,再按照标准曲线得到豆酱样品中生物胺的含量;
其中所述的超高效液相色谱法包括以下条件:进样量5μL;采用BEH-C18柱为超高效液相色谱柱;流动相用pH 3.5的0.005mol/L乙酸铵溶液和甲醇进行等度洗脱,乙酸铵和甲醇的体积比为70:30;分别采用紫外检测器和荧光检测器测定:紫外检测波长254nm、荧光激发波长330nm、发射波长465nm;流速0.250mL/min;柱温30℃;
所述的生物胺标准样品衍生处理包括以下步骤:将浓度为0.5g/L的生物胺各单标标准物溶于0.1mol/L盐酸溶液中,得到单标储备液;每个生物胺的单标储备液中各取10mL定容至100mL;得生物胺混标储备液;将10mg的丹磺酰氯溶于1 mL的丙酮中,备用;将200μL 2mol/L的NaOH溶液加入至1 mL标准溶液中,然后加300μL的饱和NaHCO3溶液缓冲再加入1.5mL的丹磺酰氯溶液,将混合后的溶液放入40℃恒温箱保温处理40min之后,加入100μL的氨水去除丹磺酰氯终止反应,最后用乙腈定容至5mL;用有机滤膜过滤,即得。
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CN101464455A (zh) * | 2007-12-19 | 2009-06-24 | 上海水产大学 | 鱼露中章鱼胺及其前体化合物酪胺含量的检测方法 |
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2010
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Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CN101464455A (zh) * | 2007-12-19 | 2009-06-24 | 上海水产大学 | 鱼露中章鱼胺及其前体化合物酪胺含量的检测方法 |
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CN108414643A (zh) * | 2018-04-11 | 2018-08-17 | 江苏省家禽科学研究所 | 一种冷鲜鸡中生物胺的液相色谱-三重四级杆质谱检测方法 |
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