CN103926338B - 一种测定色胺含量的高效液相色谱方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种测定色胺含量的高效液相色谱法，流动相：甲醇-乙腈-乙酸铵溶液（5-30-65，体积比；乙酸铵为0.025mol/L）；流速：1.0ml/min；色谱柱：C18（4.6×250mm？5μm）；柱温：25℃；进样量：5μl；紫外检测器；检测波长：280nm。色胺在进样量0.05~5μg内与峰面积呈良好线性关系，线性相关系数r=1.0000。采用本发明的高效液相方法检测色胺含量，具有样品分析时间短；检测成本低；准确性和精确性高；稳定性好；检测有效范围广等优点。

Description

一种测定色胺含量的高效液相色谱方法
技术领域
本发明涉及一种测定色胺含量的高效液相色谱方法。
背景技术
色胺是一种重要的医药中间体。是一种见于植物、动物和真菌的单胺生物碱，它以痕量存在于哺乳动物脑中，有研究认为色胺起神经调质和神经递质的作用。色胺含有一个吲哚核，结构与色氨酸类似并因此得名。
色胺是由色氨酸脱羧形成或由胺氧化酶氧化形成，为哈尔满形成的前体。色胺是一种吲哚衍生物，吲哚以其独有的化学结构，使其衍生物在许多方面具有独有的生理活性，在医药方面许多天然药物中均有吲哚结构，许多生物碱中含有吲哚环系，吲哚及其衍生物可以合成解热镇痛剂、兴奋药、降压药、血管扩张药、抗阻胺药等。色胺类化合物是吲哚最重要的衍生产品，也是主要消费吲哚的领域，色胺类是以色胺为母结构的一类化合物，含许多具生物活性的物质，这类吲哚衍生物与人类的生命活动密切相关，其中5-羟基色胺是一种重要的神经介质，是维持人体精神的和思维正常活动的不可缺少的物质；褪黑素及其衍生物在睡眠、调节生理节奏，抗肿瘤等方面十分有效；5-甲氧基色胺盐酸盐则是一种镇定剂和防射线剂。
5-羟色胺是一种重要的色胺类化合物，是最受关注的一种神经递质。5-羟色胺最早是从血清中发现，又名血清素，广泛存在于哺乳动物组织中。5-羟色胺在大脑皮层质及神经突触内含量很高，是一种能产生愉悦情绪的信使，几乎影响到大脑活动的每一个方面：从调节情绪、精力、记忆力到塑造人生观等；在外周组织，5-羟色胺是一种强血管收缩剂和平滑肌收缩刺激剂。
发明内容
本发明的目的是提供一种简便、分离效果好、精密度和准确性高的色胺含量的检测方法。为达到上述目的，本方法采用了如下技术方案：
（1）色谱条件：
色谱柱是以十八烷基硅烷键合硅胶为填充物，分别选用ThermoC18柱(4.6×250mm5μm)、ThermoC18柱(4.6×150mm5μm)和ThermoC18柱(4.6×100mm5μm)进行试验，优选ThermoC18柱(4.6×250mm5μm)，具有更好的分离效果。
流动相为甲醇-乙腈-乙酸铵溶液，其中甲醇的体积分数为5%~30%，优选体积为5%；乙腈为20~50%，优选体积为30%；乙酸铵溶液的浓度为0.01~0.05mol/L，优选浓度为0.025mol/L；流速0.6~1.5ml/min；柱温20~40℃，优选流速为1ml/min，柱温为25℃。
本发明使用Agilent-1260高效液相色谱仪，采用紫外检测器，检测波长280nm。
（2）样品处理：
精确称量标准品约50mg，放入50ml容量瓶中，加入色谱甲醇适量超声溶解后定容至刻度线，摇匀后用0.2μm有机滤头过滤。
精确称量相同质量的供试品，放入50ml容量瓶中，加入色谱甲醇适量超声溶解后定容至刻度线，摇匀后用0.2μm有机滤头过滤。
（3）测定法：
采用自动进样方法分别取5μl标准品与供试品溶液，按外标法以峰面积计算色胺的含量。
本发明经过精密度试验、线性关系实验、线性范围实验和加样回收实验等试验对方法进行验证，结果表明该方法准确可靠，检测迅速；成本低廉；检测范围大；灵敏度、精确性高。
附图说明
图1为色胺的结构式。
图2为色胺标准品的HPLC检测图谱。
图3为色胺的线性关系图与回归方程。
具体实施方式
下面具体实施例进一步说明本发明的详细分析方法，但本发明并不局限于权利要求所保护的范围的限定。
实施例1
精密称取标准品适量，置于50ml容量瓶中，加色谱甲醇超声使样品溶解后稀释定容至刻度线，用1ml注射器取溶液经0.2μm，13mm的一次性有机滤头过滤，得标准品溶液；精密称取相同重量的供试品，置于50ml容量瓶中，加色谱甲醇超声使样品溶解后稀释定容至刻度线，用1ml注射器取溶液经0.2μm，13mm的一次性有机滤头过滤，即得供试品溶液。标准品和供试品各配置5个
色谱条件：用Agilent-1260高效液相色谱仪，用C18反相色谱柱（ThermoC184.6x250mm5μm）；流动相：甲醇-乙腈-0.025mol/L乙酸铵溶液（5-30-65V/V/V）；流速：1ml/min；检测波长：280nm；检测器：紫外检测器；采集时间：40min；柱温：25℃。
按上述色谱条件，分别对5个标准品和供试品进样，所得峰面积值如表1.
表1标准品和供试品峰面积
标准品溶液5个样品分别进样所得峰面积平均值为8527.44102，RSD值为0.11%；供试品溶液5个样品分别进样所得峰面积平均值为8450.15629，RSD值为0.14%。
根据公式：
色胺含量（%）=（待测样品峰面积/标准峰面积）*（标准品浓度/待测样品浓度）*100%
采用外标法将标准品与供试品平均值代入即可色胺的含量为99.09%。
通过上述实例表明本发明稳定性好，精确度高，适用于色胺的含量测定。
本发明的方法学考察
(1)线性关系实验
根据发明所述方法，用50ml的容量瓶配置浓度为1mg/ml的储备液，加甲醇分别稀释成1μg/ml、2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、500μg/ml的标准溶液，按照本发明分析方法，对进样量（X）和峰面积（Y）进行数据回归分析（线性关系图见图3），回归方程为：Y=1708.9X-0.3994，r=1.0000。结果表明，色胺在0.05μg~5μg浓度范围内，峰面积和进样量呈良好的线性关系。
(2)精密度考察
称取同一色胺样品，进行6次重复试验，峰面积如表2：
表2色胺样品6次重复试验的峰面积
次数 1 2 3 4 5 6
峰面积 8534.06127 8530.13923 8538.99123 8529.12137 8533.65291 8525.74523
峰面积RSD值为0.05%。结果表明，本HPLC法检测色胺含量精密度很高，重现性很好。
（3）稳定性试验
取色胺样品，按本发明方法配置，室温下放置0、4、8、12、24、48h后，采用安捷伦高效液相色谱仪设置进样量5μl，依法测定，计算色胺峰面积的相对标准偏差，结果RSD为0.41%，结果表明色胺样品溶液在48h内稳定性较好。
（4）加样回收率试验
准确称取已知含量的色胺样品适量，再分别精密加入一定量的色胺样品80％、100％、120％，使供试品溶液中的色胺浓度分别在色胺标准曲线的高、中、低区域各2份，按本发明项下的操作，依法测定，计算回收率，结果平均回收率为99.49％，RSD为0.33％，表明该方法加样回收率好。

Claims (1)

1.一种色胺含量的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)色谱条件：
色谱柱是以十八烷基硅烷键合硅胶为填充物，选用规格为4.6×250mm5μm的ThermoC18柱进行试验；
流动相为甲醇‐乙腈‐0.025mol/L乙酸铵溶液，体积比5：30:65，流速为1ml/min，柱温为25℃，检测波长280nm；
(2)样品处理：
精确称量标准品50mg，放入50ml容量瓶中，加入色谱甲醇适量超声溶解后定容至刻度线，摇匀后用0.2μm有机滤头过滤；
精确称量相同质量的供试品，放入50ml容量瓶中，加入色谱甲醇适量超声溶解后定容至刻度线，摇匀后用0.2μm有机滤头过滤；
(3)测定法：
采用自动进样方法分别取5μl标准品与供试品溶液，按外标法以峰面积计算色胺的含量；计算公式如下：
色胺含量(％)＝(待测样品峰面积/标准峰面积)*(标准品浓度/待测样品浓度)*100％。
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