CN107449841A - 一种基于衍生化测定单胺类神经递质的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种基于衍生化测定单胺类神经递质的检测方法，通过将单胺类神经递质与衍生试剂正丁醛等发生衍生反应，得到的衍生化产物利用超高相液相色谱‑质谱联用系统进行分析检测；所述单胺类神经递质包括多巴胺、去甲肾上腺素和5‑羟基色胺。本方法的衍生化反应条件简单、温和、快速、环境友好，可以进行样品批量化处理；分析速度快，分析方法定量下线低，具有良好的线性范围，精密度和准确度，实现了对微量的大鼠脑部微透析液中多巴胺、去甲肾上腺素、5‑羟基色胺的同时定量分析。

Description

一种基于衍生化测定单胺类神经递质的检测方法
技术领域
本发明涉及分析化学技术领域，具体涉及一种基于衍生化方法测定多种单胺类神经递质的检测方法，尤其是涉及一种利用正丁醛作为衍生试剂，联合微透析技术和超高效液相色谱-质谱法同时检测大鼠脑部微透析液中多种神经递质的分析方法。
背景技术
中枢神经系统(central nervous system,CNS)是神经系统中神经元集中的结构，是控制脊椎动物的意识、心理、思维活动及具体行为的指挥中心。神经元中的重要一类为单胺能神经元，其末梢释放去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)和5-羟色胺(5-HT)等单胺类神经递质,作用于下一个效应细胞。单胺类神经递质与CNS相关的多种疾病高度相关。例如，5-HT和NE含量减少，可导致抑郁症；DA的减少与帕金森氏病高度相关；DA的异常增多与精神分裂症高度相关，等等。因此，在脑脊液中测定单胺类神经递质的浓度是神经科学中极其重要的前沿领域。由于单胺类神经递质一般含量非常低，取样量受限制，而且基质复杂，干扰较大，导致定量测定的难度大，因而如何能够准确测定神经递质的含量是神经递质释放研究的重点和难点之一。
目前测定神经递质时，通常采用电化学、荧光、色谱-紫外可见光谱法或色谱-质谱联用检测。这些方法存在许多缺点，例如：电化学检测法重现性较差，难以同时测定透析液中多种单胺类神经递质；荧光检测需昂贵的试剂预先衍生化，样品预处理繁琐，分析时间长；色谱-紫外可见光谱法及色谱-质谱法检测的灵敏度低，难以准确定量。化学衍生化技术能够有效的提高色谱-质谱法检测灵敏度，其好处在于：通过衍生化在化合物上修饰易离子化的基团，从而提高单胺类神经递质在质谱上的响应；由于单胺类神经递质的极性偏大，在反向色谱上不易保留，而且易于和杂质共流出，通过衍生化可以改善单胺类神经递质的疏水性，从而改善其在反相色谱上的保留。在现有的衍生化技术中，对于神经递质的检测分析多采用邻苯二甲醛(OPA)、苯甲酰氯、4’-碳酰氯-罗丹明或氘代乙醛为衍生试剂。但是邻苯二甲醛衍生物具有不稳定、重复性较差、衍生过程时间长等缺点，一定程度上限制了它的广泛使用；苯甲酰氯和4’-碳酰氯-罗丹明易水解，且对皮肤、眼睛和呼吸道具有刺激作用；氘代乙醛价格较贵，不易获得，反应中操作不慎可能会产生剧毒的氰化氢，且可重复性较差。因此，针对现有技术中微透析样品的样品量低，大多数神经递质浓度低等困难以及现有分析技术存在的可重复性差、灵敏度低、基质干扰严重、衍生化过程复杂、需要用到昂贵且污染严重的衍生化试剂、不够安全环保等问题，开发一种衍生反应条件温和、简单、快速、高效、安全、环保、可重复性好、灵敏度高且能同时检测多种单胺类神经递质的分析方法将是一项极具实际意义的研究。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于，提供一种基于衍生化测定单胺类神经递质的检测方法，其采用新的衍生化试剂，能同时检测多种单胺类神经递质，且操作简单，快速，重现性好，检测限低，线性范围良好，具有较好的准确性和精密度。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：利用正丁醛和氰基硼氢化钠对单胺类神经递质进行衍生化，而后得到的衍生化产物利用超高效液相色谱-串联质谱法进行分析检测，具体步骤如下：
a.衍生化方法：取10μL神经递质标准品溶液、神经递质质控样品或者待测样品于2mL玻璃进样瓶中，然后依次加入10μL内标混合液，25μL氰基硼氢化钠乙醇溶液和25μL 2％正丁醛乙醇溶液，摇匀之后分别在60℃水浴中孵育80分钟，得到单胺类神经递质衍生化产物溶液。
所述神经递质为单胺类神经递质，包括多巴胺(DA)、去甲肾上腺素(NE)、5-羟基色胺(5-HT)。
所述神经递质标准品溶液为：称适量盐酸多巴胺、去甲肾上腺素、5-羟基色胺盐酸盐，分别用25mM L-抗坏血酸水溶液:甲醇(v:v,80:20)溶解成1mg/mL的DA、NE以及5-HT标准品储备液；
将1mg/mL的DA、NE和5-HT用25mM L-抗坏血酸水溶液:甲醇(v:v,80:20)分别稀释到20μg/mL、2μg/mL和2μg/mL作为标准品储备液1；
然后继续用25mM L-抗坏血酸水溶液:甲醇(v:v,80:20)稀释100倍，分别得到200ng/mL、20ng/mL和20ng/mL的标准品储备液2；
将标准品储备液2，用人工脑脊液稀释成DA浓度范围为25-5000pg/mL，NE浓度范围为5-1000pg/mL和5-HT浓度范围为2.5-500pg/mL的校准曲线；
其中，DA的校准曲线的浓度设置由低到高分别是：25pg/mL、50pg/mL、100pg/mL、250pg/mL、500pg/mL、1000pg/mL、2500pg/mL、5000pg/mL；
NE的校准曲线的浓度设置由低到高分别是：5pg/mL、10pg/mL、20pg/mL、50pg/mL、100pg/mL、200pg/mL、500pg/mL、1000pg/mL；
5-HT的校准曲线的浓度设置由低到高分别是：2.5pg/mL、5pg/mL、10pg/mL、25pg/mL、50pg/mL、100pg/mL、250pg/mL、500pg/mL。
所述神经递质质控样品为：称适量盐酸多巴胺、去甲肾上腺素、5-羟基色胺盐酸盐，分别用25mM L-抗坏血酸水溶液:甲醇(v:v,80:20)溶解成1mg/mL的DA、NE以及5-HT标准品储备液；
将1mg/mL的DA、NE和5-HT用25mM L-抗坏血酸水溶液:甲醇(v:v,80:20)分别稀释到20μg/mL、2μg/mL和2μg/mL作为标准品储备液1；
然后继续用25mM L-抗坏血酸水溶液:甲醇(v:v,80:20)稀释100倍，分别得到200ng/mL、20ng/mL和20ng/mL的标准品储备液2；
将标准品储备液2，用人工脑脊液稀释成DA的质控样品的浓度分别为25.0pg/mL、75.0pg/mL、400pg/mL、4000pg/mL；NE的质控样品的浓度分别为5.0pg/mL、15.0pg/mL、80.0pg/mL、800pg/mL；5-HT的质控样品的浓度分别为2.50pg/mL、7.50pg/mL、40.0pg/mL、400pg/mL。
所述的内标混合液为：同位素内标为2-(3,4-Dihydroxyphenyl)ethyl-1,1,2,2-d4-amine hydrochloride、(±)-Norepinephrine-2,5,6,α,β,β-d6hydrochloride、Serotonin-α,α,β,β-d4Creatinine Sulfate Complex H2O(购自C/D/N Isotopes Inc.)。称量适量的上述三个同位素内标，分别用25mM L-抗坏血酸水溶液:甲醇(v:v,80:20)溶解成1mg/mL的d4-多巴胺(d4-DA)、d6-去甲肾上腺素(d6-NE)、d4-5-羟基色胺(d4-5-HT)同位素内标储备液，存放于-80℃冰箱备用。开始试验当日，用无水乙醇将同位素内标配制成含5ng/mL的d4-DA、0.5ng/mL的d6-NE和0.5ng/mL的d4-5-HT的混合液。
所述2％正丁醛乙醇溶液为：正丁醛按照体积比用无水乙醇配制成2％的溶液。
所述25mM L-抗坏血酸水溶液:甲醇(v:v,80:20)溶液为：称量L-抗坏血酸，将其配制成25mM的水溶液储备液，此溶液仅限标准品储备液配制当日使用；然后25mM L-抗坏血酸水溶液按照体积比用甲醇配制成含25mM L-抗坏血酸水溶液80％的甲醇溶液。
b.将上述单胺类神经递质衍生化产物溶液，利用超高效液相色谱-质谱联用系统进行分析检测。
所述的超高效液相色谱-质谱联用系统进行检测的分析色谱条件是：液相色谱分离使用Waters色谱柱ACQUITY UPLC BEH C18 2.1×50mm，1.7μm，进样体积6.5μL，柱温为45℃，采用洗脱梯度。
所述的梯度洗脱法，流速是0.6mL/min，流动相A为0.025％甲酸和1mmol/L乙酸铵在乙腈:水(v:v,5:95)溶液中，流动相B为0.025％甲酸和1mmol/L乙酸铵在乙腈:水(v:v,95:5)溶液中，液相洗脱梯度条件为：0min流动相组成为97％A+3％B，0.2min流动相组成为97％A+3％B，1.2min流动相组成为20％A+80％B，1.3min流动相组成为2％A+98％B，1.9min流动相组成为2％A+98％B，1.91min流动相组成为97％A+3％B，2.1min流动相组成为97％A+3％B，0.7min与1.0min的洗脱液引入质谱，0.7min之前与1.0min之后的洗脱液进入废液。
所述的超高效液相色谱-质谱联用系统进行检测中质谱条件以及参数设定为：电离模式是电喷雾离子化；离子源为涡轮喷雾；雾化气40psi；辅助加热气60psi；气帘气40psi；喷雾电压5500V；离子源温度600℃；扫描模式为正离子多反应离子监测。
本发明流动相百分比均指体积百分比。
本发明的有益效果在于：
1.本发明首次使用正丁醛和氰基硼氢化钠作为衍生化试剂对单胺类神经递质进行衍生，衍生化反应条件简单、温和、快速、环境友好，衍生步骤简单，所需微透析样品量少，可以进行样品批量化处理。
2.本发明所采用的超高相液相色谱-质谱联用的检测方法，分析速度快，定量下限低，同时具有良好的线性范围，准确性，精密度，完全满足微量的微透析样品检测需求。
3.本发明所提供的衍生化处理技术，联合超高效液相色谱-质谱联用检测手段，采用内标法定量，实现了可以同时对大鼠脑部微透析液中多巴胺、去甲肾上腺素、5-羟基色胺单胺类神经递质的定量分析。前处理方法稍加改变即可应用于其它生物基质的样品检测，方法适用性良好。
附图说明
图1.三种衍生化多巴胺产物结构及高效液相色谱图的对比图，其中，a为多聚甲醛衍生化多巴胺产物结构及高效液相色谱图，b为苯甲醛衍生化多巴胺产物结构及高效液相色谱图；c为正丁醛衍生化多巴胺产物结构及高效液相色谱图。
图2.正丁醛衍生化多巴胺、去甲肾上腺素以及5-羟基色胺的产物结构。
图3.在室温、37℃水浴以及60℃水浴条件下正丁醛衍生化多巴胺、去甲肾上腺素以及5-羟基色胺产物生成量与时间关系。
图4.不同进样体积下，正丁醛衍生化多巴胺产物的色谱图。
图5.多巴胺、去甲肾上腺素以及5-羟基色胺线性回归图。
图6.多巴胺、去甲肾上腺素以及5-羟基色胺的定量下限色谱图。
图7.给药2mg/kg安非他命(Amphetamine,AMPH)，大鼠脑微透析液中AMPH、多巴胺(DA)、去甲肾上腺素(NE)以及5-羟基色胺(5-HT)的浓度变化。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明是利用正丁醛和氰基硼氢化钠对大鼠脑部微透析液中的多巴胺(DA)、去甲肾上腺素(NE)、5-羟基色胺(5-HT)单胺类神经递质进行衍生化，而后利用超高效液相色谱-串联质谱法对单胺类神经递质衍生化产物进行分析检测。
本发明所用试剂及溶液配制如下：
乙腈、甲醇(色谱纯，Merck)；
人工脑脊液(Harvard apparatus)；
无水乙醇(国药)；
氰基硼氢化钠(Sigma-Aldrich)；
正丁醛(纯度99％，Sigma-Aldrich)；
甲酸(纯度～98％,Sigma-Aldrich)；
醋酸铵(纯度≥99％,HPLC级，Fluka Analytical)；
L-抗坏血酸(纯度≥98％，Sigma-Aldrich)；
25mM L-抗坏血酸水溶液：称取适量L-抗坏血酸，将其用水溶解稀释，配制成25mM的水溶液，仅限于储备液配制当日使用；
氰基硼氢化钠乙醇溶液：称取氰基硼氢化钠粉末，将其用无水乙醇配制成1.5mg/mL乙醇溶液备用；
2％正丁醛乙醇溶液：正丁醛按照体积比用无水乙醇配制成2％的溶液。
本发明所用标准品储备液配置如下：
三种单胺类神经递质标准品为盐酸多巴胺、去甲肾上腺素、5-羟基色胺盐酸盐(纯度分别99.9％，99％和99％，均购自Sigma Aldrich)；
称适量盐酸多巴胺、去甲肾上腺素、5-羟基色胺盐酸盐的标准品，用25mM L-抗坏血酸水溶液:甲醇(v:v,80:20)分别溶解成1mg/mL的多巴胺(DA)、去甲肾上腺素(NE)以及5-羟基色胺(5-HT)标准品储备液；
将1mg/mL的DA、NE和5-HT用25mM L-抗坏血酸水溶液:甲醇(v:v,80:20)混合溶液分别稀释到20μg/mL、2μg/mL和2μg/mL作为标准品储备液1；
然后继续用25mM L-抗坏血酸水溶液:甲醇(v:v,80:20)混合溶液稀释100倍，得到200ng/mL、20ng/mL和20ng/mL的标准品储备液2。
本发明所用内标溶液配置如下：
三种同位素内标分别为2-(3,4-Dihydroxyphenyl)ethyl-1,1,2,2-d4-aminehydrochloride、(±)-Norepinephrine-2,5,6,α,β,β-d6hydrochloride、Serotonin-α,α,β,β-d4Creatinine Sulfate Complex H2O(购自C/D/N Isotopes Inc.)。
称量适量的上述三个同位素内标，分别用25mM L-抗坏血酸水溶液:甲醇(v:v,80:20)混合溶液溶解成1mg/mL的d4-多巴胺(d4-DA)、d6-去甲肾上腺素(d6-NE)、d4-5-羟基色胺(d4-5-HT)同位素内标储备液，存放于-80℃冰箱备用。
开始试验当日，用无水乙醇分别将三种1mg/mL的同位素内标储备液配制成含5ng/mL的d4-DA、0.5ng/mL的d6-NE和0.5ng/mL的d4-5-HT的混合液，即得到内标溶液。
本发明所用实验仪器如下：
AB SCIEX5500质谱(AB SCIEX)；
ACQUITY UPLC超高压液相和自动进样器(Waters)；
Milli-Q超纯水净化器(Millipore)；
微型涡旋混合仪(上海汾西分析仪器厂)；
多管混匀仪(Fisher Scientific)；
1.5mL离心管(Eppendorf)；
96孔进样板(Corelle Life Science Co.,Ltd.)；
恒温水浴锅(国华，HH-42)。
下面通过对衍生化试剂的选定，衍生条件的优化、被测物检测的线性范围、分析方法的灵敏度、准确度和精密度以及运用本发明所述衍生化方法对生物样本进行分析的实例对本发明进行进一步的阐述。
1本发明所采用正丁醛衍生化单胺类神经递质的方法开发以及反应条件优化的具体实施方案如下：
1.1衍生试剂的选择：
本发明共选择三种醛：聚甲醛、苯甲醛和正丁醛来进行对单胺类神经递质的衍生化测试。
首先称量1-1.5mg的盐酸多巴胺、去甲肾上腺素、5-羟基色胺盐酸盐标准品，溶解在无水乙醇里，滴入一滴多聚甲醛、苯甲醛或正丁醛，加入过量氰基硼氢化钠，室温搅拌过夜，之后取适量反应产物用高效液相色谱进行分析。
用多聚甲醛做衍生化试剂，以多巴胺为例，反应产物是将氨基上的两个氢取代为甲基。图1a为多聚甲醛衍生化多巴胺的产物结构及高效液相色谱图。产物极性较大，和其它物质混合在一起，不易区分，分离效果很不理想。
用苯甲醛做衍生化试剂，反应产物是将氨基上的两个氢取代为苯甲基。图1b为苯甲醛衍生化多巴胺产物结构及高效液相色谱图。产物虽然极性有很好的改善，但是在产物出峰之前，保留时间0.6min处有一个来自于苯甲醛的干扰，此干扰峰在不同检测条件下，强弱还会发生变化，从而对衍生产物的观察和检测造成影响。
用正丁醛做衍生化试剂，反应产物是将氨基上的两个氢取代为丁基。图1c为正丁醛衍生化多巴胺产物结构及高效液相色谱图。将反应产物用高效液相色谱进行分析，得到较理想的效果：1、产物极性适中；2、与其他组分有很好的分离；3、无明显干扰物影响定量。
因此，本发明选取正丁醛作为单胺类神经递质的衍生化试剂。三种神经递质的衍生产物的结构如图2所示。
1.2衍生化反应温度的优化：
本发明将多巴胺、去甲肾上腺素、5-羟基色胺标准品溶液与正丁醛的衍生化反应分别在室温、37℃以及60℃水浴中进行测试。
具体实施方案如下：将标准品储备液2用人工脑脊液稀释成DA 5000pg/mL，NE2000pg/mL和5-HT 500pg/mL的溶液。分别取10μL浓度为5000pg/mL，2000pg/mL以及500pg/mL的DA、NE和5-HT置于三个2mL玻璃进样瓶中，依次加入10μL内标混合液，25μL氰基硼氢化钠乙醇溶液和25μL 2％正丁醛乙醇溶液，摇匀之后分别在室温、37℃水浴和60℃水浴中孵育，之后将样品用超高效液相色谱-质谱联用方法进行检测。
图3为室温、37℃以及60℃条件下正丁醛衍生化产物生成量与时间的关系。
在室温条件下，经过300分钟，三种神经递质都没有达到最大的产物生成量；将其放置过夜，约14小时之后再进行检测，三种神经递质达到最大产物生成量。
在37℃水浴条件下，经过约140分钟，NE就已经达到了最大产物生成量，在此之后，产物的生成不会增加；而经过约180分钟，DA也达到了最大产物生成量；5-HT则在200分钟左右才达到最大产物生成量。因此，如果将反应体系置于37℃水浴，需200分钟完成反应。
将反应温度调整至60℃，从图3中可以看出，NE在40分钟，DA在80分钟，5-HT在80分钟处即分别达到最大产物生成量。
根据上述实验结果可知，反应的速度与温度正相关，即温度越高，反应越快，最终，选择60℃，80分钟作为衍生化条件。
1.3进样体积的优化：
本发明将多巴胺、去甲肾上腺素、5-羟基色胺标准品溶液与正丁醛在60℃水浴中孵育80分钟的反应产物，依次进样10μL、9μL、8μL、7μL、6.5μL和6μL进行超高效液相色谱-质谱联用方法分析，以此来优化进样体积。
样品预处理方法为：取10μL浓度分别为5000pg/mL，2000pg/mL以及500pg/mL的DA、NE和5-HT置于三个2mL玻璃进样瓶中，然后依次加入10μL内标混合液，25μL氰基硼氢化钠乙醇溶液和25μL 2％正丁醛乙醇溶液，摇匀之后分别在60℃水浴中孵育80分钟，之后将样品用超高效液相色谱-质谱联用方法进行检测。
以DA与正丁醛衍生化为例，图4为进样体积分别为10μL、9μL、8μL、7μL、6.5μL和6μL的DA衍生化产物的谱图。当进样体积较大时，比如8-10μL，被检测物峰形会有分叉；7μL时，峰的信号强度降低了(峰高约为1.4E+6cps)，比6.5μL(峰高约为1.6E+6cps)时低；当进样体积为6.5μL时，被检测物信号强度最高，且峰形尖锐无分叉。因此，本发明进行超高效液相色谱-质谱联用方法进行检测时，进样体积为6.5μL。
1.4检测分析：
液相条件为：流动相A为0.025％甲酸和1mmol/L乙酸铵在乙腈:水(v:v,5:95)溶液中；流动相B为0.025％甲酸和1mmol/L乙酸铵在乙腈:水(v:v,95:5)溶液中；色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18 2.1×50mm，1.7μm(Waters)；柱温为45℃；流速是0.6mL/min；液相洗脱梯度见表1,0.7min与1.0min的洗脱液引入质谱，0.7min之前与1.0min之后的洗脱液进入废液。
表1.液相洗脱梯度
质谱条件以及参数设定为：电离模式是电喷雾离子化；离子源为涡轮喷雾；雾化气40psi；辅助加热气60psi；气帘气40psi；喷雾电压5500V；离子源温度600℃；扫描模式为正离子多反应离子监测；DA、NE、5-HT及同位素内标的母离子，子离子，碰撞能量和保留时间如表2所示。
表2.多巴胺、去甲肾上腺素、5-羟基色胺衍及同位素内标衍生化产物的母离子、子离子、碰撞能量和保留时间
2针对大鼠脑部微透析液中单胺类神经递质多巴胺(DA)、去甲肾上腺素(NE)以及5-羟基色胺(5-HT)标准品分析方法的线性范围、灵敏度、准确度和精密度的测定：
2.1线性范围的测定：
将标准品储备液2，用人工脑脊液稀释成DA浓度范围为25-5000pg/mL，NE浓度范围为5-1000pg/mL和5-HT浓度范围为2.5-500pg/mL的校准曲线。
DA的校准曲线的浓度设置由低到高分别是：25pg/mL、50pg/mL、100pg/mL、250pg/mL、500pg/mL、1000pg/mL、2500pg/mL、5000pg/mL；NE的校准曲线的浓度设置由低到高分别是：5pg/mL、10pg/mL、20pg/mL、50pg/mL、100pg/mL、200pg/mL、500pg/mL、1000pg/mL；5-HT的校准曲线的浓度设置由低到高分别是：2.5pg/mL、5pg/mL、10pg/mL、25pg/mL、50pg/mL、100pg/mL、250pg/mL、500pg/mL。样品预处理方法同1.3。
标准曲线采用线性回归，DA、NE、5-HT的校准曲线相关系数(R2)分别0.9960、0.9966和0.9928(图5)。DA、NE和5-HT的定量下限均具有良好的信噪比和灵敏度。在人工脑脊液中经验证的定量下限分别是25pg/mL、5pg/mL和2.5pg/mL，比现有技术中的定量下线更低。DA、NE和5-HT的定量下限色谱峰如图6所示。
2.2准确度和精密度：
本发明中检测方法的准确度和精密度通过对DA，NE以及5-HT的四个不同浓度的(定量下限、低、中、高)质控样品的六组测定值来进行评价。
DA、NE和5-HT的质控样品配置如下：将标准品储备液2，用人工脑脊液稀释为DA浓度分别为25.0pg/mL、75.0pg/mL、400pg/mL、4000pg/mL的质控样品；NE浓度分别为5.0pg/mL、15.0pg/mL、80.0pg/mL、800pg/mL的质控样品；5-HT浓度分别为2.50pg/mL、7.50pg/mL、40.0pg/mL、400pg/mL的质控样品。样品预处理方法同1.3。本实施例中的液相和质谱条件同1.4，进样体积为6.5μL。
经检测，DA的平均的准确度为95.1％-103.3％，变异系数为2％-13％；NE的平均的准确度为88.8％-102.9％，变异系数为3％-12％；5-HT的平均的准确度为95.5％-106.8％，变异系数为5％-8％(如表3-5所示)，说明本发明的方法用于检测以上三种神经递质均具有很好的准确度和精密度
表3.正丁醛衍生化多巴胺的准确度和精密度
表4.正丁醛衍生化去甲肾上腺素的准确度和精密度
表5.正丁醛衍生化5-羟基色胺的准确度和精密度
3针对大鼠脑部微透析液中单胺类神经递质DA、NE和5-HT的检测：
利用微透析技术采集SD大鼠脑部微透析液，每20min收集一次样品，在40min处大鼠给药2mg/kg安非他命(Amphetamine,AMPH)。在每个时间点，取10μL脑部微透析液进行分析。样品预处理方法与1.3相同。大鼠脑部微透析液中AMPH、DA、NE和5-HT随时间的浓度变化如图7所示。本实施例采用与1.4中相同的液相和质谱条件对样品进行单胺类神经递质衍生化产物的检测，进样体积为6.5μL。
对于AMPH的检测，样品预处理方式如下：在每个时间点，取3μL脑部微透析液于1.5mL离心管中，加入60μL含有内标100ng/mL拉贝洛尔的乙腈进行蛋白沉淀，充分涡旋1分钟后，以转速13000rpm在4℃离心15分钟。将25μL上清转移至另一个离心管，在N2下将溶剂吹干，之后用50μL水复溶待测物。将样品充分涡旋，以转速13000rpm在4℃离心15分钟后，取7μL上清进样至UPLC-MS/MS进行定量检测。液相条件为：色谱柱为ACE AQ column(2.1×100mm,3μm,ACE)；柱温为45℃；流速是0.45mL/min；流动相A为0.025％甲酸和1mmol/L乙酸铵在乙腈:水(v:v,5:95)溶液中；流动相B为0.025％甲酸和1mmol/L乙酸铵在乙腈:水(v:v,95:5)溶液中；液相洗脱梯度为：0-0.3min流动相组成为95％A+5％B,2min流动相组成为40％A+60％B,2.3min流动相组成为5％A+95％B，2.7min流动相组成为5％A+95％B，2.71min流动相组成为95％A+5％B，3.5min流动相组成为95％A+5％B。质谱条件以及参数设定为：电离模式是电喷雾离子化；离子源为涡轮喷雾；雾化气50psi；辅助加热气50psi；气帘气40psi；离子源温度550℃；扫描模式为正离子多反应离子监测；AMPH的母离子，子离子，碰撞能量和保留时间分别为：136.2Da,119.2Da,12eV和1.49min。
结果显示，本方法在给药2mg/kg AMPH情况下，使用微量(10μL)脑部微透析液样品，能够检测大鼠在给药前透析液中DA、NE和5-HT的基础水平，以及给药之后透析液中DA、NE和5-HT随时间的变化情况。由此说明，本方所用样品量少，灵敏度高，可满足微量的大鼠脑部微透析液样品的检测。
综上所述，上述各实施例及附图仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。

Claims (13)

1.一种基于衍生化测定单胺类神经递质的检测方法，其特征在于，所述单胺类神经递质与衍生试剂正丁醛发生衍生反应，得到的衍生化产物利用超高相液相色谱-质谱联用系统进行分析检测；所述单胺类神经递质包括多巴胺、去甲肾上腺素和5-羟基色胺。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
a.衍生方法：取神经递质标准品溶液、神经递质质控样品或者待测样品于进样瓶中，然后依次加入内标混合液，氰基硼氢化钠乙醇溶液和正丁醛乙醇溶液，摇匀之后分别在60℃水浴中孵育80分钟，得到单胺类神经递质衍生化产物溶液；
b.将上述单胺类神经递质衍生化产物溶液，利用超高效液相色谱-质谱联用系统进行定性定量分析检测。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，步骤a中所述神经递质标准品溶液按以下方法配制得到：
称适量盐酸多巴胺、去甲肾上腺素、5-羟基色胺盐酸盐，分别用25mM L-抗坏血酸水溶液:甲醇(v:v,80:20)溶解成1mg/mL的多巴胺(DA)、去甲肾上腺素(NE)、5-羟基色胺(5-HT)标准品储备液；
将1mg/mL的DA、NE和5-HT用25mM L-抗坏血酸水溶液:甲醇(v:v,80:20)分别稀释到20μg/mL、2μg/mL和2μg/mL作为标准品储备液1；
然后继续用25mM L-抗坏血酸水溶液:甲醇(v:v,80:20)稀释100倍，分别得到200ng/mL、20ng/mL和20ng/mL的标准品储备液2；
将标准品储备液2，用人工脑脊液稀释成DA浓度范围为25-5000pg/mL，NE浓度范围为5-1000pg/mL和5-HT浓度范围为2.5-500pg/mL的校准曲线。
4.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，步骤a中所述神经递质质控样品按以下方法配制得到：
称适量盐酸多巴胺、去甲肾上腺素、5-羟基色胺盐酸盐，分别用25mM L-抗坏血酸水溶液:甲醇(v:v,80:20)溶解成1mg/mL的多巴胺(DA)、去甲肾上腺素(NE)、5-羟基色胺(5-HT)标准品储备液；
将1mg/mL的DA、NE和5-HT用25mM L-抗坏血酸水溶液:甲醇(v:v,80:20)分别稀释到20μg/mL、2μg/mL和2μg/mL作为标准品储备液1；
然后继续用25mM L-抗坏血酸水溶液:甲醇(v:v,80:20)稀释100倍，分别得到200ng/mL、20ng/mL和20ng/mL的标准品储备液2；
将标准品储备液2，用人工脑脊液稀释成分别代表DA，NE和5-HT定量下限、低、中、高浓度的质控样品。
5.根据权利要求3或4所述的检测方法，其特征在于，DA的校准曲线的浓度设置由低到高分别是：25pg/mL、50pg/mL、100pg/mL、250pg/mL、500pg/mL、1000pg/mL、2500pg/mL、5000pg/mL；NE的校准曲线的浓度设置由低到高分别是：5pg/mL、10pg/mL、20pg/mL、50pg/mL、100pg/mL、200pg/mL、500pg/mL、1000pg/mL；5-HT的校准曲线的浓度设置由低到高分别是：2.5pg/mL、5pg/mL、10pg/mL、25pg/mL、50pg/mL、100pg/mL、250pg/mL、500pg/mL。
6.根据权利要求3或4所述的检测方法，其特征在于，DA的质控样品的浓度设置由低到高分别为25.0pg/mL、75.0pg/mL、400pg/mL、4000pg/mL；NE的质控样品的浓度设置由低到高分别为5.0pg/mL、15.0pg/mL、80.0pg/mL、800pg/mL；5-HT的质控样品的浓度设置由低到高分别为2.50pg/mL、7.50pg/mL、40.0pg/mL、400pg/mL。
7.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，步骤a中所述内标混合液按以下方法配制得到：所用同位素内标为2-(3,4-Dihydroxyphenyl)ethyl-1,1,2,2-d4-aminehydrochloride、(±)-Norepinephrine-2,5,6,α,β,β-d6hydrochloride、Serotonin-α,α,β,β-d4Creatinine Sulfate Complex H2O；称量适量的三个同位素内标，分别用25mM L-抗坏血酸水溶液:甲醇(v:v,80:20)溶解成1mg/mL的d4-多巴胺(d4-DA)、d6-去甲肾上腺素(d6-NE)、d4-5-羟基色胺(d4-5-HT)的同位素内标储备液，存放于-80℃冰箱备用；于使用前，用无水乙醇将同位素内标配制成含5ng/mL的d4-DA、0.5ng/mL的d6-NE和0.5ng/mL的d4-5-HT的混合液。
8.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，步骤a中所述氰基硼氢化钠乙醇溶液按以下方法配制得到：氰基硼氢化钠粉末称重后，配制成1.5mg/mL乙醇溶液备用。
9.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，步骤a中所述2％正丁醛乙醇溶液按以下方法配制得到：正丁醛按照体积比用无水乙醇配制成2％的溶液。
10.根据权利要求3或4所述的检测方法，其特征在于：步骤中所述25mM L-抗坏血酸水溶液:甲醇(v:v,80:20)按以下方法配制得到：称量L-抗坏血酸，将其配制成25mM的水溶液储备液；而后25mM L-抗坏血酸水溶液按照体积比用甲醇配制成含25mM L-抗坏血酸水溶液80％的甲醇溶液。
11.根据权利要求1-10任一项所述的检测方法，其特征在于：所述的超高效液相色谱-质谱联用系统进行检测中，液相色谱分离使用Waters色谱柱ACQUITY UPLC BEH C18 2.1×50mm，1.7μm，进样体积为6.5μL，柱温为45℃，采用梯度洗脱。
12.根据权利要求11所述检测方法，其特征在于：所述梯度洗脱为：流速是0.6mL/min；流动相A为0.025％甲酸和1mmol/L乙酸铵在乙腈:水(v:v,5:95)溶液中；流动相B为0.025％甲酸和1mmol/L乙酸铵在乙腈:水(v:v,95:5)溶液中；液相洗脱梯度条件为：0min流动相组成为97％A+3％B，0.2min流动相组成为97％A+3％B，1.2min流动相组成为20％A+80％B，1.3min流动相组成为2％A+98％B，1.9min流动相组成为2％A+98％B，1.91min流动相组成为97％A+3％B，2.1min流动相组成为97％A+3％B，0.7min与1.0min的洗脱液引入质谱，0.7min之前与1.0min之后的洗脱液进入废液。
13.根据权利要求11所述检测方法，其特征在于：所述的超高效液相色谱-质谱联用系统进行检测中质谱条件以及参数设定为：电离模式是电喷雾离子化；离子源为涡轮喷雾；雾化气40psi；辅助加热气60psi；气帘气40psi；喷雾电压5500V；离子源温度600℃；扫描模式为正离子多反应离子监测。
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