CN111044642A - 一种同时测定五种神经递质含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种同时测定五种神经递质含量的方法，属于药物检测技术领域。本发明所述方法中，待测样品采用高效液相色谱‑电喷雾‑串联质谱方法进行测定；所述神经递质为谷氨酸、γ‑氨基丁酸、天门冬氨酸、缬氨酸和5‑羟色胺。通过对色谱条件和质谱条件进行具体限定，本发明采用HPLC‑MS/MS方法能够准确的同时测定五种神经递质的含量，为从神经递质的角度研究治疗脑缺血再灌注损伤药物的开发提供一定的技术支撑。

Description

一种同时测定五种神经递质含量的方法

技术领域

本发明涉及药物检测技术领域，具体涉及一种同时测定五种神经递质含量的方法。

背景技术

神经递质是在神经化学传递中充当“信使”的特定化学物质。脑内神经递质分为4类，即氨基酸类、单胺类、肽类和其它类，其中氨基酸类分为兴奋性氨基酸和抑制性氨基酸，在生理状态下可参与突触的传递，促进学习记忆，但在病理状态下，兴奋性神经递质如谷氨酸(Glu)、天门冬氨酸(Asp)等含量升高，触发中枢神经系统过度兴奋，抑制性神经递质γ-氨基丁酸(GABA)等含量降低，导致神经系统能量代谢失衡，产生神经毒性作用。单胺类神经递质改变，能够通过促进自由基产生、促进兴奋性神经递质释放和细胞内钙超载等多种途径，引发一系列病理生理效应，最终导致细胞凋亡或坏死。5-HT是一种单胺类神经递质，正常情况下，5-羟色胺(5-HT)从脑干中缝核和蓝斑核神经元发出神经纤维后，投射至脑组织中海马和皮质等部位，参与机体调节心脑血管疾病、饮食、睡眠等。缬氨酸是一种支链氨基酸，在大脑中参与星形胶质细胞和神经元间的谷氨酸及谷氨酸循环，且研究发现大鼠经MCAO(大脑中动脉阻塞)损伤手术后，体内代谢将会发生紊乱。

微透析是从神经化学领域发展起来的，可作用于靶器官、组织、细胞，并对特定靶点中内源性及外源性物质进行实时在线取样的一门新兴技术，且不破坏生物体的内环境，具有灵敏度高、准确度良好、时间分辨性准确、且无需预处理透析液等优点，并能节省时间及成本，且个体差异相对较小，是体内药物分析的重大突破。近年来，用于透析液中氨基酸分析的方法有高效液相电化学检测法、高效液相荧光检测法、高效液相色谱质谱法等，其中高效液相荧光检测法较为常用，但该法需进行衍生化处理，操作繁琐且影响结果的因素较多，而高液相色谱-电喷雾-串联质谱(HPLC-ESI-MS/MS)不需衍生试剂处理，进样量少，操作方便且灵敏度高，是目前普遍适用于与微透析结合进行分离、分析的技术。目前已报道的测定脑脊液中神经递质的HPLC-ESI-MS/MS方法仍然需对脑脊液进行一定的处理，而且尚未对同时测定缬氨酸进行报道。因此，开发一种不需要对脑脊液样品进行处理、能够直接准确测定脑脊液中包括缬氨酸在内的多种神经递质的测定方法至关重要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种同时测定五种神经递质含量的方法。本发明采用HPLC-MS/MS方法能够准确的同时测定五种神经递质的含量，为从神经递质的角度研究治疗脑缺需再灌注损伤药物的开发提供一定的技术支撑。

本发明提供了一种同时测定五种神经递质含量的方法，待测样品采用高效液相色谱-电喷雾-串联质谱方法进行测定；所述神经递质为谷氨酸、γ-氨基丁酸、天门冬氨酸、缬氨酸和5-羟色胺；所述测定的条件为：

色谱条件：色谱柱为Synergi^TM Hydro-RP C18，柱内径×长度为4.6mm×150mm，粒径为4μm；流动相A为0.1％甲酸水，流动相B为0.1％甲酸乙腈，所述0.1％甲酸水为含0.1％体积分数甲酸的水溶液，所述0.1％甲酸乙腈为含0.1％体积分数甲酸的乙腈溶液；

梯度洗脱：

0～1min，流动相A为95％，流动相B为5％；

1～2min，流动相A为95％～70％，流动相B为5％～30％；

2～5min，流动相A为70％～5％，流动相B为30％～95％；

5～6min，流动相A为5％，流动相B为95％；

6～7min，流动相A为5％～95％，流动相B为95％～5％；

7～10min，流动相A为95％，流动相B为5％；

流速为0.8mL/min；柱温：40℃；进样量：1μL；

质谱条件：采用电喷雾电离源电离模式；多反应检测采集方式；离子源温度550℃；电喷雾电压：4500V；雾化气：55psi；辅助加热器气：55psi，气帘气：35psi。

优选的是，所述测定为定量和/或定性测定。

本发明提供了一种同时测定五种神经递质含量的方法。本发明所述方法能够快速、高效、灵敏、准确的同时测定待测样品中五种神经递质含量。本发明的优势在于不需要对脑脊液样品进行处理、能够直接准确测定脑脊液中包括缬氨酸在内的五种神经递质的含量。试验结果表明，本发明所建立的HPLC-MS/MS方法能够准确测定正常大鼠和MCAO模型大鼠海马透析液中五种神经递质的含量。

附图说明

图1-A-1为本发明提供的人工脑脊液中γ-氨基丁酸的色谱图；

图1-B-1为本发明提供的混合对照品中γ-氨基丁酸的色谱图；

图1-C-1为本发明提供的大鼠脑脊液微透析样品中γ-氨基丁酸的色谱图；

图1-A-2为本发明提供的人工脑脊液中天门冬氨酸的色谱图；

图1-B-2为本发明提供的混合对照品中天门冬氨酸的色谱图；

图1-C-2为本发明提供的大鼠脑脊液微透析样品中天门冬氨酸的色谱图；

图1-A-3为本发明提供的人工脑脊液中谷氨酸的色谱图；

图1-B-3为本发明提供的混合对照品中谷氨酸的色谱图；

图1-C-3为本发明提供的大鼠脑脊液微透析样品中谷氨酸的色谱图；

图1-A-4为本发明提供的人工脑脊液中缬氨酸的色谱图；

图1-B-4为本发明提供的混合对照品中缬氨酸的色谱图；

图1-C-4为本发明提供的大鼠脑脊液微透析样品中缬氨酸的色谱图；

图1-A-5为本发明提供的人工脑脊液中5-羟氨酸的色谱图；

图1-B-5为本发明提供的混合对照品中5-羟氨酸的色谱图；

图1-C-5为本发明提供的大鼠脑脊液微透析样品中5-羟氨酸的色谱图。

具体实施方式

本发明提供了一种同时测定五种神经递质含量的方法，待测样品采用高效液相色谱-电喷雾-串联质谱方法进行测定；在本发明中，所述高效液相色谱-电喷雾-串联质谱方法优选使用API 5500/Q-TRAP型高效液相色谱-三重四极杆串联质谱联用仪(AcquityHPLC系统，Analyst，Multiquant工作站，包括二元高压梯度泵、自动进样器、电喷雾电离源等)。

所述神经递质为谷氨酸、γ-氨基丁酸、天门冬氨酸、缬氨酸和5-羟色胺；本发明对所述神经递质的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的常规谷氨酸、γ-氨基丁酸、天门冬氨酸、缬氨酸和5-羟色胺市售产品即可，如谷氨酸(Glu，批号：BCRW2718)，γ-氨基丁酸(GABA，批号：BCBX6886)、天冬氨酸(Asp，批号：BCBR3884)对照品、缬氨酸、5-羟色胺均购置于美国Sigma公司，纯度均>99％。本发明所建立的HPLC-MS/MS方法能够准确同时测定正常大鼠和MCAO模型大鼠海马透析液中五种神经递质的含量，将有利于从干预五种神经递质的角度筛选脑保护作用的药物。

所述测定的条件为：

色谱条件：色谱柱为Synergi^TM Hydro-RP C18，柱内径×长度为4.6mm×150mm，粒径为4μm；流动相A为0.1％甲酸水，流动相B为0.1％甲酸乙腈，所述0.1％甲酸水为含0.1％体积分数甲酸的水溶液，所述0.1％甲酸乙腈为含0.1％体积分数甲酸的乙腈溶液；

梯度洗脱：

0～1min，流动相A为95％，流动相B为5％；

1～2min，流动相A为95％～70％，流动相B为5％～30％；

2～5min，流动相A为70％～5％，流动相B为30％～95％；

5～6min，流动相A为5％，流动相B为95％；

6～7min，流动相A为5％～95％，流动相B为95％～5％；

7～10min，流动相A为95％，流动相B为5％；

流速为0.8mL/min；柱温：40℃；进样量：1μL；

本发明所建立的色谱条件能够较好的分离五种神经递质。本发明对测定用水没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的试验用水即可，如水为屈臣氏水(批号：20190829；广州屈臣氏食品饮料有限公司)。

质谱条件：采用电喷雾电离源电离模式；多反应检测采集方式；离子源温度550℃；电喷雾电压：4500V；雾化气：55psi；辅助加热器气：55psi，气帘气：35psi。

在本发明中，所述测定为定量和/或定性测定。

在本发明中，质谱条件中，用于定量的离子对条件如表1所示：

表1 5种氨基酸定量分析质谱条件

本发明建立同时测定大鼠脑脊液中谷氨酸(Glu)、γ-氨基丁酸(GABA)、天门冬氨酸(Asp)、缬氨酸(Val)、5-羟色胺(5-HT)的含量的HPLC-ESI-MS/MS方法，并对该方法进行验证，包括专属性考察、标准曲线的制备、准确度和精密度、提取回收率、基质效应、稳定性考察。所有的结果均符合生物样品含量测定方法学的要求，能够用于同时准确测定大鼠脑脊液中五种神经递质的含量。

下面结合具体实施例对本发明所述的一种同时测定五种神经递质含量的方法做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

仪器与材料

仪器

API 5500/Q-TRAP型高效液相色谱-三重四极杆串联质谱联用仪(Acquity HPLC系统，Analyst，Multiquant工作站，包括二元高压梯度泵、自动进样器、电喷雾电离源等)。

材料

谷氨酸(Glu，批号：BCRW2718)、γ-氨基丁酸(GABA，批号：BCBX6886)、天冬氨酸(Asp，批号：BCBR3884)对照品、缬氨酸、5-羟色胺均购置于美国Sigma公司，纯度均>99％)；人工脑脊液(ACSF)为复方氯化钠注射液(批号：20181002，江苏恒丰强生物技术有限公司，主要成分为0.85g/L氯化钠、0.03g/L氯化钾、0.033g/L氯化钙)；肝素钠(批号：409F021，北京索莱宝科技有限公司)，水为屈臣氏水(批号：20190829；广州屈臣氏食品饮料有限公司)，色普级甲醇、乙腈、甲酸购于德国默克公司，其他试剂均为分析。

健康SD雄性大鼠，体重280～300g，由长沙市天勤生物技有限公司提供，动物合格证号为SCXK(湘)2014-0011。本实验经贵州医科大学伦理委员会批准(批号：1503018)，实验动物符合中国伦理委员会指导原则。

采用SPSS 23.0对数据进行统计分析，独立样本t检验进行组间比较，实验数据结果表示为均值(mean)±标准差(SD)，P<0.05认为差异具有统计学意义。

1色谱条件

色谱柱为Synergi^TM Hydro-RP C18(4.6mm×150mm，4μm)；流动相为A相(0.1％甲酸水)，B相(0.1％甲酸乙腈)，梯度洗脱(0～1min，流动相A为95％，流动相B为5％；1～2min，流动相A为95％～70％，流动相B为5％～30％；2～5min，流动相A为70％～5％，流动相B为30％～95％；5～6min，流动相A为5％，流动相B为95％；6～7min，流动相A为5％～95％，流动相B为95％～5％；7～10min，流动相A为95％，流动相B为5％)，流速为0.8mL/min，柱温：40℃，进样量：1μL。

2质谱条件

采用电喷雾电离源ESI⁺电离模式，多反应检测采集方式(MRM)，离子源温度550℃；电喷雾电压：4500V；雾化气(GS1):55psi，辅助加热器气(GS2)：55psi，气帘气(CUR)：35psi，用于定量的离子对见表1。

3标准溶液的配制

分别精密称取适量的Glu、GABA、Val、ASP于10mL容量瓶中，用0.1％甲酸水溶解并定容至刻度，适量的5-HT用甲醇溶解并定容至刻度，得浓度分别为Glu 0.999mg/mL，GABA1.026mg/mL、Asp 1.216mg/mL，Val 1.051mg/mL，5-HT 1.052mg/mL的储备溶液。取各神经递质储备液适量于同一容量瓶中，用人工脑脊液定容至刻度，得混合对照品储备液。

4新探针的预处理

新探针使用前先将其浸泡于屈臣氏水中，用屈臣氏水以2ul/min的流速灌流2h，充分冲洗掉透析膜上的杂质，备用。实验前将探针透析膜浸泡于1mg/mL的肝素钠溶液中30min使膜内外充分饱和肝素钠。

5方法学考察

5.1专属性

取人工脑脊液、混合对照品、大鼠微透析脑脊液样品，在本发明的色谱条件和质谱条件下，进样分析，考察人工脑脊液对待测物是否有干扰。

结果如下，其中，图1-A-1为人工脑脊液中γ-氨基丁酸的色谱图，图1-A-2为人工脑脊液中天门冬氨酸的色谱图，图1-A-3为人工脑脊液中谷氨酸的色谱图，图1-A-4为人工脑脊液中缬氨酸的色谱图，图1-A-5为人工脑脊液中5-羟氨酸的色谱图，图1-B-1为混合对照品中γ-氨基丁酸的色谱图，图1-B-2为混合对照品中天门冬氨酸的色谱图，图1-B-3为混合对照品中谷氨酸的色谱图，图1-B-4为混合对照品中缬氨酸的色谱图，图1-B-5为混合对照品中5-羟氨酸的色谱图，图1-C-1为大鼠脑脊液微透析样品中γ-氨基丁酸的色谱图，图1-C-2为大鼠脑脊液微透析样品中天门冬氨酸的色谱图，图1-C-3为大鼠脑脊液微透析样品中谷氨酸的色谱图，图1-C-4为大鼠脑脊液微透析样品中缬氨酸的色谱图，图1-C-5为大鼠脑脊液微透析样品中5-羟氨酸的色谱图，由图看出，各成分间分离良好，且人工脑脊液不干扰脑脊液中待测物的测定。

5.2线性范围、定量限、检出限的考察

取“标准溶液的配制”项下混合对照品储备液适量，用人工脑脊液稀释成不同浓度的系列混合溶液，按本发明“色谱条件”和“质谱条件”项下条件进样分析，记录峰面积。以待测物峰面积为纵坐标(Y)、各待测物质量浓度为横坐标(X)进行线性回归，并考察定量下限(信噪比为10：1)和检出限(信噪比为3∶1)，QC样品在相同条件下配制。

结果见表2。由表2可见，5种神经递质的质量浓度在其线性范围内与峰面积的线性关系良好，R²均大于0.99。

表2 5种神经递质的线性方程

5.3精密度和准确度

按“5.2”项下方法配制低、中、高质量浓度的质控(QC)样品，每个浓度各5份，于1d连续测定，考察日内精密度；连续测定3d，考察日间精密度。将实测质量浓度与理论质量浓度进行比较，考察准确度。

在该检测条件下，Glu等5种待测物的日内和日间精密度高，准确度好，RSD值均小于8.90％，且准确度在85.15％～105.45％范围内，提示良好的精密度和回收率，结果见表3。

表3 5种神经递质的精密度和准确度结果

5.4稳定性

按“5.2”项下方法配制低、中、高质量浓度的质控(QC)样品，每个浓度各2组，每组5份，第1组样品于4℃放置8h，第2组样品于-80℃下放置72h，进样分析，考察样品收集以及-80℃冷冻放置的稳定性。

实验结果见表4，表明样品在4℃放置收集和-80℃冷冻放置对待侧样品的测定无显著性影响。

表4 5种神经递质的稳定性考察

6探针的回收率

分别采用增量法和减量法考察探针的体外回收率：

(1)增量法：将探针浸泡于含Glu 32.479ng/mL、GABA 3.336ng/mL、5-HT 0.645ng/mL、Val 20.554ng/mL、Asp 19.194ng/mL的混合对照品溶液中，以2.0μL/min的流速用人工脑脊液进行灌流，平衡1h后，20min/次收集样品，连续收集5管，灌流液(C_perf)和透析液(C_dial)同时进样分析，计算探针回收率。回收率(RR)＝C_dial/C_perf×100％。

(2)减量法：将探针浸泡于人工脑脊液中，以2.0μL/min的流速用含Glu 32.479ng/mL、GABA 3.336ng/mL、5-HT 0.645ng/mL、Val 20.554ng/mL、Asp 19.194ng/mL的混合对照品溶液进行灌流，平衡1h后，20min/次收集样品，连续收集5管，灌流液(C_perf)和透析液(C_dial)同时进样分析，计算探针回收率。回收率(RL)＝(C_perf-C_dial)/C_perf×100％。

各成分体外回收率分别为Glu22.96％、GABA 24.86％、5-HT 33.25％、Val30.07％、Asp 26.85％，增量法和减量法之间回收率无明显变化。

实施例2

建立大鼠MCAO模型，采用本发明测定方法对微透析样品采集并进行检测

脑缺血及再灌注期大鼠海马区神经递质含量变化的结果

1脑缺血及再灌注期大鼠海马区Glu浓度随时间变化的结果

与正常组相比，在缺血第20min至再灌注2h内，MCAO模型组脑脊液中Glu显著性升高，结果见表5。

表5脑缺血及再灌注损伤大鼠海马区Glu浓度随时间变化的结果(mean±SD，n＝6,ng/mL)

与正常组比较，^#p<0.05，^##p<0.01,^###p<0.001

2脑缺血大鼠海马区氨基酸类神经递质Val浓度随时间变化的结果

与正常组相比，MCAO模型组脑脊液中Val的含量随再灌注时间的延长，呈不断上升的趋势，且在第180min即再灌注2h时，MCAO模型增加较显著，提示延长再灌注的时间，可能会加重再灌注损伤，结果见表6。

表6脑缺血及再灌注损伤大鼠海马区Val浓度随时间变化的结果(mean±SD，n＝6,ng/mL)

与正常组比较，^#p<0.05

3脑缺血大鼠海马区氨基酸类神经递质5-HT浓度随时间变化的结果

与正常组相比，MCAO模型组中5-HT的含量在缺血及再灌注早期均无显著性差异，结果见表7。

表7脑缺血及再灌注损伤大鼠海马区5-HT浓度随时间变化的结果(mean±SD，n＝6,ng/mL)

4脑缺血大鼠海马区氨基酸类神经递质GABA浓度随时间变化的结果

与正常组相比，从再灌注20min至2h，MCAO模型组脑脊液中GABA的含量显著性降低。结果见表8。

表8脑缺血及再灌注损伤大鼠海马区GABA浓度随时间变化的结果(mean±SD，n＝6,ng/mL)

与正常组比较，^#p<0.05

5脑缺血大鼠海马区氨基酸类神经递质Asp浓度随时间变化的结果

与正常组相比，在再灌注段早期，MCAO模型组脑脊液中Asp的含量显著性升高，结果见表9。

表9脑缺血及再灌注损伤大鼠海马区Asp浓度随时间变化的结果(mean±SD，n＝6,ng/mL)

与正常组比较，^#p<0.05，^##p<0.01,^###p<0.001

讨论

目前，已有很多文献报道检测单胺类神经递质的方法，较常用的方法主要有高效液相色谱(HPLC)-荧光法、化学发光法、毛细管电泳法、放射酶学法等检测方法。而氨基酸类神经递质主要采用HPLC-荧光法，但氨基酸类递质在紫外无吸收，不能直接使用液相色谱法进行检测，而需要先对氨基酸样品进行柱前或柱后衍生处理。且样品衍生操作步骤较繁琐，费时费力，衍生程度重复性也不能保证，还可能生成不必要的衍生物，这些因素都会影响氨基酸测定的准确性。因此，建立一种快速、高效、灵敏、准确的同时测定生物样品中多种神经递质含量的测定方法至关重要。

本发明采用HPLC-MS/MS建立了同时检测大鼠脑海马内5种不同神经递质(Glu、Val、5-HT、GABA、Asp)的方法，提高了对脑组织中复杂生物样品的分离和检测能力，较快速地完成检测。实验采用MRM模式检测，通过母离子和子离子两次筛选，大大增加了专属性和灵敏度，建立了快速地分析复杂生物样品中化学成分的方法，充分合理地将液相色谱强大的分离能力和质谱的高分辨特点运用在复方的生物样品中化学成分的检测中。结果显示，在优化建立的HPLC-MS/MS方法下，在微透析脑脊液样品中，检测到Glu、Val、5-HT、GABA、Asp5种神经递质，与正常相比，MCAO组中Glu从缺血早期到再灌注2h内均明显升高，ASP从再灌注第1h～2h内显著增加，Val在再灌注的第2h时显著升高，5-HT在整个MCAO中无明显波动，提示MCAO模型中缺血段和再灌注早期均能显著的影响脑内兴奋性氨基酸和抑制性氨基酸的含量，且再灌注对多种氨基酸的含量变化影响较缺血段显著，再灌注可能引起多种神经递质的紊乱，进一步加重脑损伤，早期对单胺类神经递质含量变化无明显影响。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种同时测定五种神经递质含量的方法，待测样品采用高效液相色谱-电喷雾-串联质谱方法进行测定；所述神经递质为谷氨酸、γ-氨基丁酸、天门冬氨酸、缬氨酸和5-羟色胺；所述测定的条件为：

色谱条件：色谱柱为Synergi^TM Hydro-RP C18，柱内径×长度为4.6mm×150mm，粒径为4μm；流动相A为0.1％甲酸水，流动相B为0.1％甲酸乙腈，所述0.1％甲酸水为含0.1％体积分数甲酸的水溶液，所述0.1％甲酸乙腈为含0.1％体积分数甲酸的乙腈溶液；

梯度洗脱：

0～1min，流动相A为95％，流动相B为5％；

1～2min，流动相A为95％～70％，流动相B为5％～30％；

2～5min，流动相A为70％～5％，流动相B为30％～95％；

5～6min，流动相A为5％，流动相B为95％；

6～7min，流动相A为5％～95％，流动相B为95％～5％；

7～10min，流动相A为95％，流动相B为5％；

流速为0.8mL/min；柱温：40℃；进样量：1μL；

质谱条件：采用电喷雾电离源电离模式；多反应检测采集方式；离子源温度550℃；电喷雾电压：4500V；雾化气：55psi；辅助加热器气：55psi，气帘气：35psi。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述测定为定量和/或定性测定。

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