CN108459095A - 一种同时检测八种神经递质的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种同时检测八种神经递质的检测方法。所述步骤包括：配制标准溶液及工作曲线；配制待测样品溶液；液相色谱分离：将标准溶液打入进样瓶中，再将待测样品溶液用液相色谱进行分离；质谱检测：将液相色谱分离后的样品进行质谱检测；所述八种神经递质为盐酸多巴胺，酒石酸去甲肾上腺素，5‑羟色胺，肾上腺素，5‑羟基‑3‑吲哚乙酸，乙酰胆碱，γ‑氨基丁酸和谷氨酸。本发明通过建立一种快速，简便，准确的高效液相色谱‑串联质谱方法，准确的替代基质法检测了脑组织四个脑区八种神经递质的含量，并确定各类神经递质在四个脑区的主要分布趋势，为临床精神神经类疾病的诊断，治疗提供理论依据。
Description
技术领域
本发明涉及一种同时检测八种神经递质的检测方法。
背景技术
神经递质是一类调节精神和活动的化学物质，在疾病的诊断，治疗过程中起到重要作用。根据理化性质的不同，可将神经递质分为单胺类，氨基酸类，肽类及其他类。单胺类主要包括多巴胺，去甲肾上腺素，肾上腺素等儿茶酚胺类，及由5-羟色胺和5-羟基-3-吲哚乙酸组成的吲哚胺类，它们与抑郁失眠等疾病密切相关。氨基酸类主要是抑制性递质γ-氨基丁酸和兴奋性递质谷氨酸，与帕金森病，阿尔兹海默症等密切相关。神经递质是一类苯环结构上带有羟基和氨基的含量极低的内源性化合物，缺乏空白基质，且极性较高不易在反相色谱柱上保留，使得神经递质的检测尤为困难。因此，有必要提出有效的技术方案，解决上述问题。
发明内容
本发明针对上述现有技术的不足，提供一种快速、简便、准确的同时检测八种神经递质的检测方法。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
一种同时检测八种神经递质的检测方法，所述检测方法包括如下步骤：
(1)配制标准溶液及工作曲线；
(2)配制待测样品溶液：SD大鼠经麻醉后，快速冰上取脑，用生理盐水冲洗脑组织表面，并用滤纸吸干表面的水，快速称重，以5倍体积的0.1％甲酸水匀浆，得到脑匀浆，再用0.1％甲酸乙腈溶液将所述脑匀浆进行沉淀蛋白，并涡旋混匀30s，于16000×g，4℃离心10min，取上清液于棕色液相瓶中，得到待测样品溶液；所述脑匀浆和所述0.1％甲酸乙腈溶液的体积比为1:4，所述0.1％甲酸乙腈溶液中含625ng/mL的3,4-二羟基苄胺；
(3)液相色谱分离：将标准溶液打入进样瓶中，再将待测样品溶液用液相色谱进行分离；
(4)质谱检测：将液相色谱分离后的样品进行质谱检测；
所述八种神经递质为盐酸多巴胺，酒石酸去甲肾上腺素，5-羟色胺，肾上腺素，5-羟基-3-吲哚乙酸，乙酰胆碱，γ-氨基丁酸和谷氨酸。
优选地，所述液相色谱分离的条件为：
色谱柱：Waters Acquity UPLC HSS PFP柱；
流动相：流动相A为0.1％甲酸水，流动相B为0.1％甲酸乙腈；采用梯度洗脱，流动相A的体积比为10-98％，流动相B的体积比为2-90％，流速0.3mL/min；
柱温：35℃；
进样体积：2μL。
优选地，所述质谱检测的条件为：电喷雾离子源，多通道反应监测，正离子模式，离子电压5500V，离子源温度570℃，气帘气压力12psi，雾化气压力55psi，辅助气压力55psi，射入电压10V。
优选地，所述梯度洗脱程序为：1～3min，2％流动相B→20％流动相B；3～6min，20％流动相B→90％流动相B；6～7.5min，90％流动相B；7.6～9min，2％流动相B。
优选地，所述配制标准溶液为：
(1)将盐酸多巴胺、酒石酸去甲肾上腺素、5-羟色胺、肾上腺素、5-羟基-3-吲哚乙酸、内标3,4-二羟基苄胺分别溶于二甲基亚砜，制备成5mg/mL的盐酸多巴胺母液、酒石酸去甲肾上腺素母液、5-羟色胺母液、肾上腺素母液、5-羟基-3-吲哚乙酸母液、内标3,4-二羟基苄胺母液，置于-20℃保存；
(2)乙酰胆碱、γ-氨基丁酸和谷氨酸分别溶于0.1％甲酸水，制备成5mg/mL的乙酰胆碱、γ-氨基丁酸母液和谷氨酸母液，置于-20℃保存；
(3)按照一定比例制备八种神经递质的混合标准溶液，具体为：盐酸多巴胺，酒石酸去甲肾上腺素，5-羟色胺，肾上腺素，5-羟基-3-吲哚乙酸，乙酰胆碱为10，20，100，500，2000，4000ng/mL；γ-氨基丁酸和谷氨酸为20，100，500，2000，4000，10000ng/mL；
(4)用0.1％甲酸乙腈制备625ng/mL的内标3,4-二羟基苄胺溶液。
优选的，所述配制工作曲线为：
(1)取适量八种神经递质混合标准溶液添加至林格氏液中，经处理后制备标准曲线；
(2)盐酸多巴胺、酒石酸去甲肾上腺素、5-羟色胺、肾上腺素、5-羟基-3-吲哚乙酸、乙酰胆碱的标准曲线浓度设置由低到高分别为0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、25ng/mL、100ng/mL，200ng/mL，定量下限为0.5ng/mL，质控样品低、中、高浓度分别为：1.5ng/mL、50ng/mL、150ng/mL；
(3)γ-氨基丁酸和谷氨酸的标准曲线浓度设置由低到高分别为1ng/mL、5ng/mL、25ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL，定量下限为1ng/mL，质控样品低、中、高浓度分别为：1.5ng/mL、150ng/mL、375ng/mL。
优选的，所述林格氏液为148mM氯化钠，2.7mM氯化钾，1.2mM氯化钙和0.85mM氯化镁的混合液。
有益效果：本发明采用Waters Acquity UPLC HSS PFP柱(2.1×100mm,1.8μm)，以0.1％甲酸水-0.1％甲酸乙腈为流动相进行梯度洗脱，流速为0.3mL/min的液相色谱分离条件；采用离子源为ESI源，采用正离子检测方式，多反应监测(MRM)扫描方式进行检测，通过建立一种快速，简便，准确的高效液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)方法，准确的替代基质法检测了脑组织四个脑区及脑脊液中八种神经递质的含量，并确定各类神经递质在四个脑区的主要分布趋势，为临床精神神经类疾病的诊断，治疗提供理论依据。
具体实施方式
本发明提供一种同时检测八种神经递质的检测方法，所采用原料包括：盐酸多巴胺(以下简称DA)，酒石酸去甲肾上腺素(以下简称NE)，肾上腺素(以下简称E)，5-羟色胺(以下简称5-HT)，5-羟基-3-吲哚乙酸(以下简称5-HIAA)，谷氨酸(以下简称Glu)，γ-氨基丁酸(以下简称GABA)，乙酰胆碱(以下简称Ach)和内标3,4-二羟基苄胺(以下简称DHBA)。
上述八种神经递质及内标化合物的结构式如下。
本发明采用仪器包括：岛津Nexera X2超高压液相色谱系统，具LC-30AD二元梯度泵、在线真空脱气机、自动进样器、CTO-30A恒温柱箱，连接Triple Quad 4500型三重四级杆串联质谱仪(美国AB Secix系统公司)，十万分之一电子天平(MS105Du型，METTLERTOLEDO)，赛默飞Micro17R/离心机，匀质机，旋涡混合仪(上海精科实业有限公司)。
实施例1
一种同时检测八种神经递质的检测方法，步骤包括：
(1)标准溶液及工作曲线的配制
精密称取盐酸多巴胺，酒石酸去甲肾上腺素，5-羟色胺，肾上腺素，5-羟基-3-吲哚乙酸，乙酰胆碱，γ-氨基丁酸和谷氨酸对照品适量；将盐酸多巴胺，酒石酸去甲肾上腺素，5-羟色胺，肾上腺素，5-羟基-3-吲哚乙酸，3,4-二羟基苄胺(内标)溶于二甲基亚砜，乙酰胆碱，γ-氨基丁酸和谷氨酸溶于0.1％甲酸水制备成5mg/mL的储备母液，置于-20℃保存。
实验时，按照一定比例制备八种神经递质的混合标准溶液，盐酸多巴胺，酒石酸去甲肾上腺素，5-羟色胺，肾上腺素，5-羟基-3-吲哚乙酸，乙酰胆碱为10，20，100，500，2000，4000ng/mL，γ-氨基丁酸和谷氨酸为20，100，500，2000，4000，10000ng/mL。用0.1％甲酸乙腈制备625ng/mL的3,4-二羟基苄胺(内标)溶液。
取适量八种神经递质混合标准溶液添加至林格氏液(Ringer’s solution，148mM氯化钠，2.7mM氯化钾，1.2mM氯化钙，0.85mM氯化镁)中，经处理后制备标准曲线。盐酸多巴胺，酒石酸去甲肾上腺素，5-羟色胺，肾上腺素，5-羟基-3-吲哚乙酸，乙酰胆碱的标准曲线浓度设置为0.5，1，5，25，100，200ng/mL，定量下限为0.5ng/mL，质控样品低、中、高浓度分别为：1.5，50，150ng/mL。γ-氨基丁酸和谷氨酸的标准曲线浓度设置为1，5，25，100，200，500ng/mL，定量下限为1ng/mL，质控样品低、中、高浓度分别为：1.5，150，375ng/mL。
(2)样品采集及处理
SD大鼠经10％水合氯醛(0.3mL/kg)麻醉后，快速冰上取脑，用生理盐水冲洗脑组织表面，并用滤纸吸干表面的水，快速称重，以5倍体积的0.1％甲酸水匀浆(w/v)，用0.1％甲酸乙腈溶液(含625ng/mL内标)以1:4(v/v)的比例进行沉淀蛋白，并涡旋混匀30s，于16000×g，4℃离心10min，取上清液于棕色液相瓶中进行样品检测。
(3)液相色谱和质谱条件
色谱条件：Waters Acquity UPLC HSS PFP色谱柱(2.1×100mm，1.8μm)，流动相为0.1％甲酸水(A)和0.1％甲酸乙腈(B)，梯度洗脱(1～3min，2％B→20％B；3～6min，20％B→90％B；6～7.5min，90％B；7.6～9min，2％B，流速0.3mL/min)，柱温35℃，进样体积2μL。
质谱条件：电喷雾离子源(ESI)，多通道反应监测(MRM)，正离子模式，离子电压5500V，离子源温度570℃，气帘气压力(CUR)12psi，雾化气压力(GAS1)55psi，辅助气压力(GAS2)55psi，射入电压(EP)10V。8个化合物离子对及相关参数见表1。本实验所有数据采集及处理由美国AB Sciex公司提供的分析软件Analyst 1.6.2及SPSS 20.0软件完成。
表1神经递质及内标的质谱多反应监测参数
本发明中色谱柱的选择是重要的，Waters Acquity UPLC HSS PFP色谱柱(2.1×100mm,1.8μm)，能实现较好的分离，且不受溶剂效应影响，适用于神经递质的测定。神经递质为高极性化合物，较难在常规C18柱上保留，选择保留更强的PFP柱(五氟苯基)，其选择性是基于π-π，电荷转移，偶极等作用。但Agilent Poroshell 120PFP柱(2.1×100mm,2.7μm)虽为PFP柱，且有效的增强了极性神经递质在柱上的保留，实现了较好的分离，但该色谱柱溶剂效应较严重，使DA和5-HT在进样检测时出现双峰，影响测定。因此，本发明的WatersAcquity UPLC HSS PFP色谱柱(2.1×100mm,1.8μm)是最优选择。
本发明中流动相的选择是重要的，流动相的选择主要考虑以下几个因素：有机相种类，酸的种类及强度，盐的种类及浓度等。常用的有机相为甲醇和乙腈，两者相比，非质子溶剂乙腈显示尖锐对称的峰形，故选择乙腈作为有机相。另一方面，神经递质含有酚羟基，性质不稳定，易被氧化成对应的醌类化合物，需在流动相中加入稳定剂。甲酸作为离子对试剂，不仅可增加化合物的离子化效率改善峰形，还可防止化合物的氧化。本发明在流动相中加入不同比例甲酸以及氟化铵/甲酸铵后对峰形的影响。结果显示，流动相中仅添加0.1％甲酸时，色谱峰峰形较好，且流动相配制简便，可用于后续大量样品的检测。
本发明中样品前处理优化是重要的，脑组织中富含的高极性蛋白质是影响神经递质检测的主要物质，需经简单的样品前处理后进样检测。样品制备过程中的酸度，以及有机相的种类和比例都会影响化合物的检测。本发明分别考察了溶剂体系为水-乙腈(20:80,v/v)及水-甲醇(20:80,v/v)，酸度为0.1％，0.2％，0.4％，0.6％及1％条件下的峰形。结果显示，当溶剂比例为甲酸-水-乙腈(0.1:20:80,v/v/v)时，色谱峰形较为尖锐且对称。
神经递质为内源性化合物，缺乏不含化合物的空白基质。本发明建立了一种以林格氏液代替脑组织匀浆作为基质，对神经递质进行准确测定的替代基质法，并对该方法进行了方法学验证。
A：线性关系和检出限
将八种神经递质的混合标准溶液添加至林格氏液，经处理后配制成一系列标准曲线浓度点进样分析。以添加的浓度(X)为横坐标，化合物与内标峰面积比(Y)为纵坐标进行最小二乘法(W＝1/X2)加权回归，以10倍信噪比计算定量限(LLOQ)，结果见表2。
表2八种神经递质的标准曲线及线性范围(n＝3)
B：准确度及精密度
取适量八种神经递质混合标准溶液，添加至林格氏液中，制备低，中，高三个浓度的质控样品(n＝5)，经处理后进样分析，结果见表3。日内准确度在91.7～113％范围内，精密度RSD在1.40～10.2％内。连续测定三天得到日间准确度为90.2～110％，精密度RSD为4.40～11.9％，均符合要求。
表3八种神经递质的日内，日间准确度及精密度测定结果(n＝5)
C：基质效应和提取回收率
取同一脑组织匀浆样品，制备空白样品(样品1，n＝5)，添加适量八种神经递质混合标准溶液至提取前样品(样品2)，提取后样品(样品3)及洁净溶液(样品4)中，各制备低，中，高三个浓度的质控样品(n＝5)，经处理后进样分析。脑组织匀浆中基质效应，提取回收率的计算公式为：
林格氏液样品无提取过程，故仅对基质效应进行验证，取适量八种神经递质混合标准溶液，添加至林格氏液中，按样品采集处理操作，涡旋混匀，进样检测，计算相同浓度下林格氏液样品峰面积与标准溶液峰面积的比值，即为林格氏液样品的基质效应。实验结果见表4，基质效应和提取回收率结果均在100±20％范围内，符合要求。
表4八种神经递质的基质效应及提取回收率测定结果(Mean±SD,n＝5)
D:稳定性
取同一脑组织匀浆/林格氏液，添加适量八种神经递质混合标准溶液，按样品采集处理操作后，制备低，中，高三个浓度的质控样品(n＝3)进样分析，检测0h，4℃下放置8h，室温下放置8h，室温及-80℃三次冻融循环的峰面积。结果(表4)显示，在室温条件下，某些神经递质在8h内峰面积降至70～80％，说明神经递质保存在4℃以下的条件内较稳定。
表5脑组织匀浆及林格氏液中八种神经递质的稳定性测定结果(n＝3)
试验例 大鼠脑内八种神经递质的含量测定
应用本发明检测方法对健康SD大鼠(n＝6)四个脑区中八种神经递质的含量进行分析，检测结果用“平均值±SD(标准差)”表示，如表6所示。各类神经递质在不同脑区间的含量存在差异，氨基酸类神经递质在脑内含量最高，达2000μg/g以上，抑制性神经递质GABA主要分布在下丘脑中(520μg/g)，而兴奋性神经递质Glu则在海马中含量最高(5000μg/g)。儿茶酚胺类神经递质E在各脑区中含量最低，均低于LLOQ；与药物奖赏制度密切相关的DA则在纹状体含量最高(3134ng/g)，高于其他脑区39-143倍，可作为相关疾病的主要诊断区域；与阿尔兹海默症，帕金森病相关的乙酰胆碱也在纹状体中有较高的分布(788ng/g)；而与抑郁相关的NE及吲哚胺类神经递质5-HT及其代谢物5-HIAA则主要分布在下丘脑中，NE的分布差异性较大，与纹状体中含量相差近10倍，而吲哚胺类神经递质在四个脑区的差异不大，但5-HIAA与5-HT的含量比值有较大差异，约为3-11，不仅可通过检测各神经递质的含量变化来确定疾病的进程，还可以通过检测其与代谢物比值的变化确定对疾病的诊断。
表6八种神经递质在四个脑区的含量(Mean±SD,n＝6)
本发明采集6只大鼠的四个脑区样品，经过简单的沉淀蛋白法预处理后，准确，精密的检测了样品中多巴胺，去甲肾上腺素，肾上腺素，5-羟色胺，5-羟基-3-吲哚乙酸，乙酰胆碱，γ-氨基丁酸及谷氨酸的含量。全面检测脑内不同脑区各类神经递质的含量，能够根据神经递质在脑内的含量变化，解析精神神经疾病的发病机制，有利于疾病的诊断和治疗。
本发明可用其他的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。因此，无论从哪一点来看，本发明的上述实施方案都只能认为是对本发明的说明而不能限制本发明，权利要求书指出了本发明的范围，而上述的说明并未指出本发明的范围，因此，在与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在本发明的权利要求书的范围内。
Claims (7)
1.一种同时检测八种神经递质的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：
(1)配制标准溶液及工作曲线；
(2)配制待测样品溶液：SD大鼠经麻醉后，快速冰上取脑，用生理盐水冲洗脑组织表面，并用滤纸吸干表面的水，快速称重，以5倍体积的0.1％甲酸水匀浆，得到脑匀浆，再用0.1％甲酸乙腈溶液将所述脑匀浆进行沉淀蛋白，并涡旋混匀30s，于16000×g，4℃离心10min，取上清液于棕色液相瓶中，得到待测样品溶液；
(3)液相色谱分离：将标准溶液打入进样瓶中，再将待测样品溶液用液相色谱进行分离；
(4)质谱检测：将液相色谱分离后的样品进行质谱检测；
所述八种神经递质为盐酸多巴胺，酒石酸去甲肾上腺素，5-羟色胺，肾上腺素，5-羟基-3-吲哚乙酸，乙酰胆碱，γ-氨基丁酸和谷氨酸。
2.如权利要求1所述的同时检测八种神经递质的检测方法，其特征在于，所述液相色谱分离的条件为：
色谱柱：Waters Acquity UPLC HSS PFP柱；
流动相：流动相A为0.1％甲酸水，流动相B为0.1％甲酸乙腈；采用梯度洗脱，流动相A的体积比为10-98％，流动相B的体积比为2-90％，流速0.3mL/min；
柱温：35℃；
进样体积：2μL。
3.如权利要求1所述的同时检测八种神经递质的检测方法，其特征在于，所述质谱检测的条件为：电喷雾离子源，多通道反应监测，正离子模式，离子电压5500V，离子源温度570℃，气帘气压力12psi，雾化气压力55psi，辅助气压力55psi，射入电压10V。
4.如权利要求1所述的同时检测八种神经递质的检测方法，其特征在于，所述梯度洗脱程序为：1～3min，2％流动相B→20％流动相B；3～6min，20％流动相B→90％流动相B；6～7.5min，90％流动相B；7.6～9min，2％流动相B。
5.如权利要求1所述的同时检测八种神经递质的检测方法，其特征在于，所述配制标准溶液为：
(1)将盐酸多巴胺、酒石酸去甲肾上腺素、5-羟色胺、肾上腺素、5-羟基-3-吲哚乙酸、内标3,4-二羟基苄胺分别溶于二甲基亚砜，制备成5mg/mL的盐酸多巴胺母液、酒石酸去甲肾上腺素母液、5-羟色胺母液、肾上腺素母液、5-羟基-3-吲哚乙酸母液、内标3,4-二羟基苄胺母液，置于-20℃保存；
(2)乙酰胆碱、γ-氨基丁酸和谷氨酸分别溶于0.1％甲酸水，制备成5mg/mL的乙酰胆碱、γ-氨基丁酸母液、谷氨酸母液，置于-20℃保存；
(3)按照一定比例制备八种神经递质的混合标准溶液，具体为：盐酸多巴胺，酒石酸去甲肾上腺素，5-羟色胺，肾上腺素，5-羟基-3-吲哚乙酸，乙酰胆碱为10，20，100，500，2000，4000ng/mL；γ-氨基丁酸和谷氨酸为20，100，500，2000，4000，10000ng/mL；
(4)用0.1％甲酸乙腈制备625ng/mL的内标3,4-二羟基苄胺溶液。
6.如权利要求1所述的同时检测八种神经递质的检测方法，其特征在于，所述配制工作曲线为：
(1)取适量八种神经递质混合标准溶液添加至林格氏液中，经处理后制备标准曲线；
(2)盐酸多巴胺、酒石酸去甲肾上腺素、5-羟色胺、肾上腺素、5-羟基-3-吲哚乙酸、乙酰胆碱的标准曲线浓度设置由低到高分别为0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、25ng/mL、100ng/mL，200ng/mL，定量下限为0.5ng/mL，质控样品低、中、高浓度分别为：1.5ng/mL、50ng/mL、150ng/mL；
(3)γ-氨基丁酸和谷氨酸的标准曲线浓度设置由低到高分别为1ng/mL、5ng/mL、25ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL，定量下限为1ng/mL，质控样品低、中、高浓度分别为：1.5ng/mL、150ng/mL、375ng/mL。
7.如权利要求1所述的同时检测八种神经递质的检测方法，其特征在于，所述林格氏液为148mM氯化钠，2.7mM氯化钾，1.2mM氯化钙和0.85mM氯化镁的混合液。
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