CN113192649A - 一种指导癫痫疾病个体化精准用药的系统 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种指导癫痫疾病个体化精准用药的系统，该系统采用药物基因组检测技术，获得个体药物相关基因组的基因型；然后根据发明人在大数据基础上建立的药物基因组数据库，结合已有的癫痫疾病临床用药指南或共识，预测疗效、预警副作用，制定初步的精准用药方案。然后在临床用药过程中，进行药物浓度监测，获得个体体内实际的药物浓度，结合临床症状改善情况、不良反应发生情况，优化调整药物的种类、剂量、频次、给药途径等，以在特定患者和特定疾病正确诊断的基础上，在正确的时间、给与正确的药物、使用正确的剂量，实现真正的个体化精准用药。

Description

一种指导癫痫疾病个体化精准用药的系统
技术领域
本申请涉及医疗数据处理技术领域，特别是涉及一种指导癫痫疾病个体化精准用药的系统。
背景技术
本部分的陈述仅仅是提到了与本申请相关的背景技术，并不必然构成现有技术。
癫痫是一种由多种病因引起的慢性脑部疾病，以脑神经元过度放电导致反复性、发作性和短暂性的中枢神经系统功能失常为特征。癫痫在任何年龄、地区和种族的人群中都有发病，但以儿童和青少年发病率较高。近年来随着我国人口老龄化，脑血管病、痴呆和神经系统退行性疾病的发病率增加，老年人群中癫痫发病率已出现上升的趋势。据世界卫生组织(WHO)估计，全球大约有五千万癫痫患者。国内流行病学资料显示，我国癫痫的患病率(Prevalence)在4‰到7‰之间。近年来，国内外学者更重视活动性癫痫的患病率，即在最近某段时间(1年或2年)内仍有发作的癫痫病例数与同期平均人口之比。我国活动性癫痫患病率为4.6‰，年发病率在30/10万左右。据此估算，我国约有600万左右的活动性癫痫患者，同时每年有40万左右新发癫痫患者。癫痫是神经内科最常见的疾病之一。癫痫患者的死亡危险性为一般人群的2-3倍。癫痫对于个人、家庭和社会带来严重的负面影响。癫痫发作给患者造成巨大的生理和心理上的痛苦，严重影响患者和家庭的生活质量；长期服用抗癫痫药物及其它诊治费用给家庭带来沉重的经济负担；WHO已将癫痫列为重点防治的神经、精神疾病之一。
各国临床研究表明，新诊断的癫痫病人，如果接受规范、合理的抗癫痫药物治疗，70％～80％患者的发作是可以控制的，其中60％～70％的病人经2～5年的治疗可以停药。然而在发展中国家，由于人们对癫痫缺乏正确认识以及医疗资源匮乏，大多数癫痫患者没有得到合理有效的正规治疗；我国大约有400万左右活动性癫痫患者没有得到合理的治疗。在服用抗癫痫药物的患者中，仍有部分患者存在诊断不明确或治疗不规范的现象；患者过于担心抗癫痫药物的副作用，服药依从性差，随意停药、减量或换药。部分非专科医生对癫痫的诊断、分类不准确，治疗不规范，选药不恰当，盲目地使用多药治疗。针对同一疾病、同一人群常采用相同的药物和剂量，由于药物反应的个体化差异，部分患者用药后可能疗效不佳，甚至发生严重的不良反应。导致药物反应个体化差异的原因有年龄、体重、性别、饮食、遵守医嘱的程度、同时患有其他疾病、同时服用其他药物、种族、遗传因素等，其中遗传因素是导致药物反应个体化差异的主要原因。
发明内容
由于药物的代谢、转运、药物疗效及毒副作用相关靶点存在个体化差异，在临床中需要个体化给药方案，包括药物种类、剂量、给药频次、给药途径等等，从而减少药效不佳或者严重毒副作用等情况。为了解决现有技术的不足，本申请提供了一种指导癫痫疾病个体化精准用药的系统；结合药物基因组检测技术、药物浓度监测技术和已有的癫痫疾病临床药物治疗指南或共识，设计一个合理的个体化用药详细方案，为临床医生合理化用药提供依据，从而解决个体化用药过程中优化药物种类、剂量、给药频次、给药途径的问题，以在特定患者和特定疾病正确诊断的基础上，在正确的时间、给与正确的药物、使用正确的剂量，实现真正的个体化精准用药。
第一方面，本申请提供了一种指导癫痫疾病个体化精准用药的系统；
一种指导癫痫疾病个体化精准用药的系统，包括：
患者基本信息获取模块，其被配置为：获取患者的基本信息；
药物基因组检测模块，其被配置为：采用PGx试剂盒，实施癫痫患者药物基因检测，获取患者的抗癫痫药物基因的多态性信息；
精准用药数据库，其被配置为：存储药物基因组学数据、药物代谢动力学数据及药物效应动力学数据；
初步给药方案制定模块，其被配置为：根据患者的基本信息、患者的抗癫痫药物基因的多态性信息和精准用药数据库存储的信息；基于输入信息与数据库匹配原则，结合定制方案的决策树方法，将初步给药方案生成报告。
第二方面，本申请提供了一种指导癫痫疾病个体化精准用药的系统；
一种指导癫痫疾病个体化精准用药的系统，包括：
治疗信息更新模块，其被配置为：获取初步给药方案和治疗后的复查结果数据；
药物浓度监测模块，其被配置为：实施癫痫患者血药浓度检测，获取并存储患者个体使用抗癫痫药物后的体内药物浓度水平和代谢能力信息数据；
给药方案优化模块，其被配置为：调用治疗信息更新模块中信息、药物浓度监测模块中结果信息，根据匹配原则，与精准用药数据库中的信息进行匹配；匹配结果使用优化给药决策树模型进行处理，得到优化的给药方案；
最终报告生成模块，其被配置为：调取优化后的给药方案信息，并将信息写入报告模板，输出生成报告。
第三方面，本申请提供了一种指导癫痫疾病个体化精准用药的系统；
一种指导癫痫疾病个体化精准用药的系统，包括：
患者基本信息获取模块，其被配置为：获取患者的基本信息；
药物基因组检测模块，其被配置为：采用PGx试剂盒，实施癫痫患者药物基因检测，获取患者的抗癫痫药物基因的多态性信息；
精准用药数据库，其被配置为：存储药物基因组学数据、药物代谢动力学数据及药物效应动力学数据；
初步给药方案制定模块，其被配置为：根据患者的基本信息、患者的抗癫痫药物基因的多态性信息和精准用药数据库存储的信息；基于输入信息与数据库匹配原则，结合定制方案的决策树方法，将初步给药方案生成报告；
治疗信息更新模块，其被配置为：获取初步给药方案和治疗后的复查结果数据；
药物浓度监测模块，其被配置为：实施癫痫患者血药浓度检测，获取并存储患者个体使用抗癫痫药物后的体内药物浓度水平和代谢能力信息数据；
给药方案优化模块，其被配置为：调用治疗信息更新模块中信息、药物浓度监测模块中结果信息，根据匹配原则，与精准用药数据库中的信息进行匹配；匹配结果使用优化给药决策树模型进行处理，得到优化的给药方案；
最终报告生成模块，其被配置为：调取优化后的给药方案信息，并将信息写入报告模板，输出生成报告。
与现有技术相比，本申请的有益效果是：
该系统采用药物基因组检测技术，获得个体基因组的基因型；然后根据发明人在现有药物基因组研究信息基础上建立的药物基因组数据库，结合已有的癫痫疾病临床用药指南或共识，预测疗效、预警副作用，制定初步的精准用药方案。在临床用药过程中，采用药物浓度监测技术，获得个体体内实际的药物浓度，结合临床症状改善情况、不良反应发生情况，优化调整药物的种类、剂量、频次、给药途径等，以在特定患者和特定疾病正确诊断的基础上，在正确的时间、给与正确的药物、使用正确的剂量，实现真正的个体化精准用药。
本发明附加方面的优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。
图1为本发明实施例一的初步给药方案制定流程图；
图2为本发明实施例二的给药方案优化流程图；
图3为本发明实施例三的初步给药方案制定和给药方案优化综合使用流程图；
图4为本发明实施例一的奥卡西平初步给药方案决策树模型；
图5为本发明实施例一的初步给药方案通用流程图；
图6为本发明实施例一的奥卡西平优化给药方案决策树模型；
图7为本发明实施例一的优化给药方案通用流程图；
图8为本发明实施例一的rs2832407检测结果；
图9为本发明实施例一的rs4986893检测结果；
图10为本发明实施例一的rs1800497检测结果；
图11为本发明实施例一的rs3087374检测结果；
图12为本发明实施例一的rs1799853检测结果；
图13为本发明实施例一的rs1057910检测结果；
图14为本发明实施例一的rs2298771检测结果；
图15为本发明实施例一的rs1045642检测结果；
图16为本发明实施例一的rs2011425检测结果；
图17为本发明实施例一的rs4244285检测结果；
图18为本发明实施例一的rs2304016检测结果；
图19为本发明实施例一的rs10484555检测结果；
图20为本发明实施例二中9种抗癫痫药物的结构式(A：卡马西平，B：10-羟卡马西平，C：奥卡西平，D：左乙拉西坦，E：托吡酯，F：丙戊酸，G：苯妥英钠，H：苯巴比妥，I：拉莫三嗪)；
图21为本发明实施例二中9种抗癫痫药物的质谱色谱图(卡马西平：1.6min，10羟卡马西平：2.2min，奥卡西平：1.5min，左乙拉西坦：2.5min，托吡酯：3.2min，丙戊酸：3.1min，苯妥英钠：3.5min，苯巴比妥：4.2min，拉莫三嗪：4.4min)；
图22为本发明实施例二中灌胃9种抗癫痫药物后的平均血浆浓度-时间曲线。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
实施例一
本实施例提供了一种指导癫痫疾病个体化精准用药的系统；
如图1所示，一种指导癫痫疾病个体化精准用药的系统，包括：
患者基本信息获取模块，其被配置为：获取患者的基本信息；
药物基因组检测模块，其被配置为：采用PGx试剂盒，实施癫痫患者药物基因检测，获取患者的抗癫痫药物基因的多态性信息；
精准用药数据库，其被配置为：存储药物基因组学数据、药物代谢动力学数据及药物效应动力学数据；
初步给药方案制定模块，其被配置为：根据患者的基本信息、患者的抗癫痫药物基因的多态性信息和精准用药数据库存储的信息；基于输入信息与数据库匹配原则，结合定制方案的决策树方法，将初步给药方案生成报告。
进一步地，所述获取患者的基本信息，具体包括：个体基本信息(如性别、年龄、体重等)、疾病状态指标(癫痫发作类型、发作频率、持续时间、伴随症状等)、和肝肾功能指标(如肝素酶水平、尿素水平)等、用药信息等；
进一步地，所述药物基因组检测模块，使用MALDI-TOF MS(基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱)、Sanger测序、荧光定量PCR方法中的至少一种实施检测。采集患者血浆样本，经过PGx试剂盒，实施检测后获得患者的抗癫痫药物基因多态性信息；
抗癫痫药物基因多态性信息，包括：涉及的药物信息(药物list)、需要检测的基因信息(基因list)、位点信息(位点list)、设计的引物信息(引物list)检测结果的基因型信息等。
进一步地，所述抗癫痫药物包括卡马西平、10-羟卡马西平、奥卡西平、左乙拉西坦、托吡酯、丙戊酸、苯妥英钠、苯巴比妥和拉莫三嗪种的任意一种或多种；
进一步地，所述PGx试剂盒可以包含如下检测专用引物，所述检测专用引物包括引物组1和引物组2，其中，所述引物组1由引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、引物对5、引物对6、引物对7、引物对8、引物对9、引物对10、引物对11和引物对12组成；
所述引物对1由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的单链DNA分子组成；
所述引物对2由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的单链DNA分子组成；
所述引物对3由SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的单链DNA分子组成；
所述引物对4由SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的单链DNA分子组成；
所述引物对5由SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的单链DNA分子组成；
所述引物对6由SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示的单链DNA分子组成；
所述引物对7由SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示的单链DNA分子组成；
所述引物对8由SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示的单链DNA分子组成；
所述引物对9由SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18所示的单链DNA分子组成；
所述引物对10由SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20所示的单链DNA分子组成；
所述引物对11由SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22所示的单链DNA分子组成；
所述引物对12由SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24所示的单链DNA分子组成；
所述引物组2由单链延伸引物1、单链延伸引物2、单链延伸引物3、单链延伸引物4、单链延伸引物5、单链延伸引物6、单链延伸引物7、单链延伸引物8、单链延伸引物9、单链延伸引物10、单链延伸引物11和单链延伸引物12组成；
所述单链延伸引物1的核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示；
所述单链延伸引物2的核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示；
所述单链延伸引物3的核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示；
所述单链延伸引物4的核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示；
所述单链延伸引物5的核苷酸序列如SEQ ID NO.29所示；
所述单链延伸引物6的核苷酸序列如SEQ ID NO.30所示；
所述单链延伸引物7的核苷酸序列如SEQ ID NO.31所示；
所述单链延伸引物8的核苷酸序列如SEQ ID NO.32所示；
所述单链延伸引物9的核苷酸序列如SEQ ID NO.33所示；
所述单链延伸引物10的核苷酸序列如SEQ ID NO.34所示；
所述单链延伸引物11的核苷酸序列如SEQ ID NO.35所示；
所述单链延伸引物12的核苷酸序列如SEQ ID NO.36所示。
上述的专用引物中，所述引物对1-引物对12中的各条引物的摩尔比为等摩尔比；
或，所述单链延伸引物1、单链延伸引物2、单链延伸引物3、单链延伸引物4、单链延伸引物5、单链延伸引物6、单链延伸引物7、单链延伸引物8、单链延伸引物9、单链延伸引物10、单链延伸引物11和单链延伸引物12的摩尔比为3.88：3.28：9.36：3.65：2.85：6.32：5.87：5.24：7.8：2.57：6.58：8.52。
上述专用引物设计思路如下：首先确定抗癫痫类药物相关驱动基因或靶向耐药基因，通过检索Pubmed数据库，结合国内外研究进展和中国人群抗癫痫基因谱特点，统计与中国人群抗癫痫药物作用机理、靶向耐药以及副作用机理相关传导通路基因，确定11个基因纳入分析：ABCB1(奥卡西平、苯巴比妥)、HLA-B(奥卡西平、苯巴比妥、苯妥英钠、卡马西平、10-羟卡马西平)、SCN2A(奥卡西平、苯妥英钠、卡马西平、托吡酯、10-羟卡马西平)、CYP2C9(苯妥英钠、丙戊酸)、HLA-A(卡马西平、左乙拉西坦、10-羟卡马西平)、CYP2C19(托吡酯)、ANKK1(丙戊酸)、POLG(丙戊酸)、SCN1A(卡马西平、苯妥英钠、10-羟卡马西平)、UGT1A4(拉莫三嗪)和GRIK1(托吡酯)。接下来筛选目的基因的热点突变位点。在Cosmic数据库中选择上述11个基因的Cosmic基因号分别为ABCB1(rs2832407、rs10484555)、HLA-B(rs4986893)、SCN2A(rs1800497)、CYP2C9(rs3087374)、HLA-A(rs1799853)、CYP2C19(rs1057910)、ANKK1(rs2298771)、POLG(rs1045642)、SCN1A(rs2011425)、UGT1A4(rs4244285)和GRIK1(rs2304016)。查询上述基因在癫痫病中的变异情况，确定12个与癫痫驱动及耐药相关的热点突变位点。通过AgenaCX引物设计网站运行上述含突变位点序列的文档，调整相关参数将11个基因的12个突变位点全部纳入设计试剂盒，正、反向扩增引物各12条和延伸引物12条，共设计36条引物。扩增目的条带，延伸引物设计位于突变位点前一个碱基，与扩增产物互补进行单碱基延伸反应。将12个突变位点设定为1个进样孔检测，软件根据引物设计原则(避免形成二聚体、错配等)随机将12个突变位点的检测合成在1个进样孔中。
进一步地，采集患者血浆样本，经过PGx试剂盒，实施检测后获得患者的抗癫痫药物基因多态性信息，可以包括如下步骤：
1)、设计表1所示的扩增引物即引物对1-12、表2所示的单链延伸引物以及表3所示的标准品核酸序列；用上述专用引物中的引物对1-12对待测样本进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
2)、将所述PCR扩增产物进行碱性磷酸酶消化，得到消化产物；
3)、将所述消化产物使用上述专用引物中的单链延伸引物1、单链延伸引物2、单链延伸引物3、单链延伸引物4、单链延伸引物5、单链延伸引物6、单链延伸引物7、单链延伸引物8、单链延伸引物9、单链延伸引物10、单链延伸引物11和单链延伸引物12进行单碱基延伸反应，得到单碱基延伸反应产物；
4)、将所述单碱基延伸反应产物经过纯化后，点样上机进行基质辅助激光解析电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱检测，得到待测样本中抗癫痫药物代谢及耐药相关SNP位点基因型。
表1目的基因序列的扩增引物
Figure BDA0003095488480000051
Figure BDA0003095488480000061
表2目的基因序列的延伸引物
Figure BDA0003095488480000062
表3核酸序列标准品
Figure BDA0003095488480000063
上述方法中，所述PCR扩增的模板为待测样本的基因组DNA。
上述方法中，所述PCR扩增的程序为：95℃2min，95℃30s、56℃30s、72℃60s进行45个循环，再72℃5min；
所述单碱基延伸反应的程序为：95℃30s，95℃10s、(52℃5s、80℃5s)3个循环，进行40个循环，再72℃3min；
所述纯化具体为：吸取纯乙腈，弃废液，重复2-3次；吸取0.1M的醋酸三乙胺缓冲液(TEAA)，弃废液，重复2-3次；将样品反复吸打8-10次，使样品充分结合在填料中；吸取0.1M的TEAA(用5％的甲醇配置)，弃废液，重复2-3次；用50％乙腈(含有0.1％的TEAA)中洗脱两次。
点样方法具体为：层析法点样，先点样品，再点基质。标准品浓度：10μM，基质浓度：20mg/ml，基质选择为20mg的3-羟基-2-吡啶甲酸(3-HPA)和5mg的柠檬酸氢铵溶解在1mL50％乙腈。
上述中，所述SNP位点为rs2832407(对应引物对1和单链延伸引物1)、rs4986893(对应引物对2和单链延伸引物2)、rs1800497(对应引物对3和单链延伸引物3)、rs3087374(对应引物对4和单链延伸引物4)、rs1799853(对应引物对5和单链延伸引物5)、rs1057910(对应引物对6和单链延伸引物6)、rs2298771(对应引物对7和单链延伸引物7)、rs1045642(对应引物对8和单链延伸引物8)、rs2011425(对应引物对9和单链延伸引物9)、rs4244285(对应引物对10和单链延伸引物10)、rs2304016(对应引物对11和单链延伸引物11)、rs10484555(对应引物对12和单链延伸引物12)。
具体的，通过AgenaCX网址的引物设计软件，调整相关参数，完成12个SNP位点的PCR扩增和延伸的引物设计，导出设计好的引物及各参数文件，并合成引物。按照引物配置比例配制扩增引物MIX和延伸引物MIX，并微调延伸引物MIX直至符合要求。然后进行引物测试和优化。具体步骤如下：
一、以患者A的加入EDTA抗凝剂的全血为模板，进行基因组提取；
首先向1mL全血加入200μL细胞裂解液，离心后倒出上清溶液；向沉淀物加入200μL异丙醇抽提核酸，离心后倒出上清溶液；向沉淀物加入200μL蛋白酶K沉淀蛋白，离心后倒出上清溶液；向沉淀物加入200μL乙醇替换异丙醇，离心后倒出上清溶液；向沉淀物加入100μL50％乙醇水溶液溶解；
二、以基因组为模板，用扩增引物进行PCR扩增，获得PCR产物；
首先等摩尔比混匀扩增引物，终浓度为1μM。分别加入10×PCR缓冲液(Mg2+plus)1.25μL、聚合酶0.1μl、dNTP(2.5mM)2μL、引物F/R(10μM)1μL、基因组(20ng/μl)1μL，用水补足总体积至10μL。将混合液放入PCR仪扩增，PCR条件为：95℃2min；95℃30s、56℃30s、72℃1min，45个循环；72℃5min。
三、将扩增产物进行虾碱性磷酸酶消化；
在10μL PCR产物加入SAP酶1μL、SAP缓冲液1.3μL，补足水至13μL。将混合液放入PCR仪，PCR条件为：37℃40min；65℃5min。
四、将消化产物用单碱基延伸引物进行单碱基延伸反应；
分别加入SAP消化后产物13μL、热测序酶0.06μL、酶缓冲液0.35μL、ddNTP 0.3μL、延伸引物混合物1.6μL(延伸引物按照以下摩尔比混匀：rs2832407：rs4986893：rs1800497：rs3087374：rs1799853：rs1057910：rs2298771：rs1045642：rs2011425：rs4244285：rs2304016：rs10484555＝3.88μM：3.28μM：9.36μM：3.65μM：2.85μM：6.32μM：5.87μM：5.24μM：7.8μM：2.57μM：6.58μM：8.52μM)；补足水至16μL。将混合液放入PCR仪，PCR条件为：95℃30sec；95℃10s、52℃10s、80℃30s、52℃10s、80℃30s、52℃10s、80℃30s，40个循环；72℃3min。
五、用Ziptip枪头对单碱基延伸产物纯化；
吸取10μL纯乙腈，弃废液，重复3次；吸取10μL 0.1M TEAA，弃废液，重复3次；将移液枪调至最大量程，将样品反复吸打10次，使样品充分结合在填料中；吸取10μL 0.1M的TEAA(用5％的甲醇配置)，弃废液，重复3次；用2μL 50％乙腈(含有0.1％的TEAA)中洗脱两次。
六、点样
配制标准品和样品浓度：10μM，基质浓度：20mg/ml(基质选择为20mg的3-HPA和5mg的柠檬酸氢铵溶解在1mL50％乙腈中)，点样方式：层析法点样到基质板，先点1μL样品，再点1μL基质。室温干燥待结晶。
七、上机以及数据分析。
将基质板放入MassARRAY基质解析激光辅助飞行时间质谱仪进行分析。
以PCR反应条件优化为例(PCR退火温度的调整)：
最初所采用的扩增条件中，退火温度为65℃，用该反应条件扩增后，发现体系出现不稳定的现象，多个位点扩增效率低，其中rs2032582、rs2242480和rs776746位点不能够稳定的报出基因型。经过对PCR反应条件的优化(更改退火温度为56℃)，并通过多轮测试后，发现新体系的位点扩增效率较好，所有位点都可以正确的稳定的报出基因型。
以rs4244285、rs2304016和rs10484555位点引物优化为例(靶向区域调整、延伸引物方向调整)：
rs4244285位点出现峰响应较低现象，其与PCR扩增及延伸引物的设计效率有关(更改前上游引物序列为：GAGCATAGTAAGCAGTAGGGAGT，更改前下游引物序列为：ACTCTTAGCAATTGTACCCATCA)和更改延伸引物方向(更改前延伸序列为：AGGACCCGGGTTCATAACTGT)；
rs2304016位点未见目标峰，其与PCR扩增及延伸引物的设计效率有关(更改前上游引物序列为：CCACCCAGCTTAACGAATGCT，更改前下游引物序列为：TTGTACGACACACAGCAACCT)和更改延伸引物方向(更改前延伸序列为：GCCTTCCTCACCTGATGATCT)；
rs10484555位点未见目标峰，其与PCR扩增及延伸引物的设计效率有关(更改前上游引物序列为：AGATGAACCAGAGCCAGCACGTT，更改前下游引物序列为：TGAACTGGCCACTCACCCTGAT)和更改延伸引物方向(更改前延伸序列为：GGTGTGAACCATGAGAAGTAT)。
经过重新设计PCR引物和更改UEP引物方向后，为了确定PCR反应中6个因素(rs4244285扩增引物、rs4244285延伸引物、rs2304016扩增引物、rs2304016延伸引物、rs10484555扩增引物、rs10484555延伸引物)的最佳水平，采用正交设计L10(26)在2个水平上进行实验。参加PCR反应的因素水平见表4，L10(26)设计方案见表5。将表5的10个处理重复2次，在PCR仪上进行扩增和延伸。
表4 PCR反应的因素水平
Figure BDA0003095488480000081
表5 PCR反应的因素水平L10(26)正交试验设计
Figure BDA0003095488480000082
按照上述步骤进行测试，rs4244285位点峰响应可达到1.7e5，根据正交试验结果选择上游引物序列为：ACGTTGGATGGCAATAATTTTCCCACTATC，下游引物序列为：ACGTTGGATGTCCATCGATTCTTGGTGTTC和延伸引物序列为：CCACTATCATTGATTATTTCCC)；
rs2304016位点峰响应可达到3.8e6，根据正交试验结果选择上游引物序列为：ACGTTGGATGGGGTGGCTGAAGTGTTTTAC，下游引物序列为：ACGTTGGATGAGCAGAGCATCATTTTGCCC和延伸引物序列为：TGAAGTGTTTTACAGGATTTTA)；
rs10484555位点峰响应可达到1.7e5，根据正交试验结果选择上游引物序列为：ACGTTGGATGATCCCAAGATAATCCACGGC，下游引物序列为：ACGTTGGATGCACTCCTGAAGTGAAAACTC和延伸引物序列为：GGCTTTATAATATGTCTCTCTAT)；
发现更改后的PCR引物和UEP引物测试效果更好，出峰较低现象改善。经过引物的多次更改和反复优化测试，筛选出最优PCR扩增引物及单碱基延伸引物，具体引物序列参见表1和1的引物序列。
以PCR反应体系优化为例(Taq酶、Mg2+、模板DNA、dNTPs、引物)：
PCR反应体系中除了引物可以影响目标基因扩增效率，Taq酶、Mg2+、模板DNA、dNTPs、引物的添加量也会对结果产生不同程度的影响。为使PCR扩增效率更高，防止阴性样本影响，本专利还对PCR反应体系中Taq酶、Mg2+、模板DNA、dNTPs、引物的添加量进行了优化。
利用正交试验设计L16(45)的方法，从Taq酶、Mg2+、模板DNA、dNTPs、引物5个因素4个水平对基因的PCR扩增反应体系进行优化分析。参加PCR反应的因素水平见表6，L16(45)设计方案见表7。将表2的16个处理重复2次，在PCR仪上进行扩增，反应体系为10μL，除表中所列因素外，每管还有PCR缓冲液。
表6 PCR反应的因素水平
Figure BDA0003095488480000091
表7 PCR反应的因素水平L16(45)正交试验设计
Figure BDA0003095488480000092
Figure BDA0003095488480000101
按照上述步骤进行测试，正交试验结果表明当PCR体系选择Taq聚合酶0.1μl、dNTP2μL、引物1μL、基因组1μL时，产物的响应可达最高。
提取50例离体外周血的基因组DNA，按上述优化后的实验方案进行PCR扩增和延伸以及进样MALDI-TOF分析。结果如图8-19所示，得到rs2832407、rs4986893、rs1800497、rs3087374、rs1799853、rs1057910、rs2298771、rs1045642、rs2011425、rs4244285、rs2304016、rs10484555位点的基因分型聚类图，可以看出，本发明的引物对和方法可以用于这些位点的基因分型。
实施例2：基于MALDI-TOF质谱平台分析的基因多态性对于抗癫痫药物给药方案的检测方法应用于临床案例
患者A，服用抗癫痫药物苯巴比妥后出现中枢神经系统的不良反应，基于MALDI-TOF核酸质谱平台进行抗癫痫药物代谢相关基因分型的检测方法，可以检测患者A的抗癫痫药物代谢相关的热点变异位点，利用位点变异信息指导患者合理用药，包括以下步骤：
一、设计表8所示的扩增引物、表9所示的延伸引物以及表10所示的标准品核酸序列；
表8目的基因序列的扩增引物
Figure BDA0003095488480000102
Figure BDA0003095488480000111
表9目的基因序列的延伸引物
Figure BDA0003095488480000112
表10核酸序列标准品
Figure BDA0003095488480000113
二、以患者A的加入EDTA抗凝剂的全血为模板，进行基因组提取；
首先向1mL全血加入200μL细胞裂解液，离心后倒出上清溶液；向沉淀物加入200μL异丙醇抽提核酸，离心后倒出上清溶液；向沉淀物加入200μL蛋白酶K沉淀蛋白，离心后倒出上清溶液；向沉淀物加入200μL乙醇替换异丙醇，离心后倒出上清溶液；向沉淀物加入100μL50％乙醇水溶液溶解；
三、以基因组为模板，用扩增引物进行PCR扩增，获得PCR产物；
首先等摩尔比混匀扩增引物，终浓度为1μM。分别加入10×PCR缓冲液(Mg2+plus)1.25μL、聚合酶0.1μl、dNTP(2.5mM)2μL、引物F/R(10μM)1μL、基因组(20ng/μl)1μL，用水补足总体积至10μL。将混合液放入PCR仪扩增，PCR条件为：95℃2min；95℃30s、56℃30s、72℃1min，45个循环；72℃5min。
四、将扩增产物进行虾碱性磷酸酶消化；
在10μL PCR产物加入SAP酶1μL、SAP缓冲液1.3μL，补足水至13μL。将混合液放入PCR仪，PCR条件为：37℃40min；65℃5min。
五、将消化产物用单碱基延伸引物进行单碱基延伸反应；
分别加入SAP消化后产物13μL、热测序酶0.06μL、酶缓冲液0.35μL、ddNTP 0.3μL、延伸引物混合物1.6μL(延伸引物按照以下摩尔比混匀：rs2832407：rs4986893：rs1800497：rs3087374：rs1799853：rs1057910：rs2298771：rs1045642：rs2011425：rs4244285：rs2304016：rs10484555＝3.88μM：3.28μM：9.36μM：3.65μM：2.85μM：6.32μM：5.87μM：5.24μM：7.8μM：2.57μM：6.58μM：8.52μM)；补足水至16μL。将混合液放入PCR仪，PCR条件为：95℃30sec；95℃10s、52℃10s、80℃30s、52℃10s、80℃30s、52℃10s、80℃30s，40个循环；72℃3min。
六、用Ziptip枪头对单碱基延伸产物纯化；
吸取10μL纯乙腈，弃废液，重复3次；吸取10μL 0.1M TEAA，弃废液，重复3次；将移液枪调至最大量程，将样品反复吸打10次，使样品充分结合在填料中；吸取10μL 0.1M的TEAA(用5％的甲醇配置)，弃废液，重复3次；用2μL 50％乙腈(含有0.1％的TEAA)中洗脱两次。
七、点样
配制标准品和样品浓度：10μM，基质浓度：20mg/ml(基质选择为20mg的3-HPA和5mg的柠檬酸氢铵溶解在1mL50％乙腈中)，点样方式：层析法点样到基质板，先点1μL样品，再点1μL基质。室温干燥待结晶。
八、上机以及数据分析。
将基质板放入MassARRAY基质解析激光辅助飞行时间质谱仪进行分析。参照基因多态性对抗癫痫药物疗效的影响表11，根据图谱显示的基因型数据4714.1Da，可以得到患者A的rs2832407基因SNP位点为非表达型CC型，根据SNP位点基因型可以得到用药解读为：正常剂量使用托吡酯；根据图谱显示的基因型数据5095.3Da，可以得到患者A的rs4986893基因SNP位点为非表达型GG型，根据SNP位点基因型可以得到用药解读为：接受苯妥英钠治疗的GG基因型患者的药物反应与嗜酸性粒细胞增多和全身症状(DRESS)的可能性降低；根据图谱显示的基因型数据5128.4Da，可以得到患者A的rs1800497基因SNP位点为表达型AA型，根据SNP位点基因型可以得到用药解读为：具有AA基因型和癫痫病的患者在接受丙戊酸治疗时可能体重减轻；根据图谱显示的基因型数据5219.5Da，可以得到患者A的rs3087374基因SNP位点为非表达型CC型，根据SNP位点基因型可以得到用药解读为：接受丙戊酸治疗的CC基因型患者的肝毒性风险降低；根据图谱显示的基因型数据5555.7Da，可以得到患者A的rs1799853基因SNP位点为非表达型CC型，根据SNP位点基因型可以得到用药解读为：正常剂量使用左乙拉西坦；根据图谱显示的基因型数据5764.8Da，可以得到患者A的rs1057910基因SNP位点为表达型CC型，根据SNP位点基因型可以得到用药解读为：接受单药或联合抗癫痫治疗(卡马西平，奥卡西平，拉莫三嗪，左乙拉西坦或丙戊酸)治疗的癫痫和CC基因型患者，其反应可能有所改善；根据图谱显示的基因型数据5975.9Da，可以得到患者A的rs2298771基因SNP位点为表达型CC型，根据SNP位点基因型可以得到用药解读为：接受单药或联合抗癫痫治疗(卡马西平，奥卡西平，拉莫三嗪，左乙拉西坦或丙戊酸)治疗的癫痫和CC基因型患者，其反应可能有所改善；根据图谱显示的基因型数据6211.1Da，可以得到患者A的rs1045642基因SNP位点为非表达型AA型，根据SNP位点基因型可以得到用药解读为：正常剂量使用苯巴比妥；根据图谱显示的基因型数据6341.1Da，可以得到患者A的rs2011425基因SNP位点为表达型GG型，根据SNP位点基因型可以得到用药解读为：接受拉莫三嗪治疗的GG基因型和癫痫患者的拉莫三嗪血清浓度降低，对拉莫三嗪的反应较差；根据图谱显示的基因型数据6842.5Da，可以得到患者A的rs4244285基因SNP位点为TT型，根据SNP位点基因型可以得到用药解读为：苯巴比妥治疗的史蒂文斯-约翰逊综合症的患病风险增加；根据图谱显示的基因型数据7065.6Da，可以得到患者A的rs2304016基因SNP位点为AA型，根据SNP位点基因型可以得到用药解读为：接受抗癫痫药物(如卡马西平，拉莫三嗪，奥卡西平，苯妥英钠，托吡酯)治疗的AA基因型和癫痫患者的耐药风险增加。；根据图谱显示的基因型数据6994.6Da，可以得到患者A的rs10484555基因SNP位点为非表达型TT型，根据SNP位点基因型可以得到用药解读为：正常使用；
表11参照基因多态性对抗癫痫药物疗效的影响
Figure BDA0003095488480000121
Figure BDA0003095488480000131
Figure BDA0003095488480000141
在体系优化过程中，每个检测位点都有2～3个样本经过Sanger测序的验证，经比对结果都一致，确认本实施例检测的结果准确无误。本实施例在确认最优反应体系后又进行了一系列的验证实验，包括准确性和精密度。具体的验证方案如下：
(1)准确性实验验证方案：12个SNP位点各选取一例样本进行Sanger测序，并比对Sanger测序与MassARRAY的结果，一致性大于95％则验证通过。
(2)精密度实验验证方案：挑取3例外周血样本和对应的3例口腔拭子样本，每个样本重复3次进行一个批次的检测，共检测3个批次，外周血和口腔拭子结果一致性100％，批间精密度和批内精密度的一致性大于95％则验证通过。
具体的验证过程如下：首先按照本发明优化的体系配制反应所需的的溶液。然后按照上述操作步骤，分别进行PCR扩增、虾碱性磷酸酶消耗、单碱基延伸、脱盐和MassARRAY点样分析等步骤后进行结果分析。准确性和精密度结果见下表。
表12准确性的验证结果
Figure BDA0003095488480000151
经10例样本的MassARRAY结果和Sanger结果的比对可知，本发明的体系验证实验的准确性为100％。
表13精密度的验证结果
Figure BDA0003095488480000152
进一步地，所述精准用药数据库模块包括：存储药物基因组学数据、癫痫疾病药物治疗共识指南信息、治疗癫痫类药物代谢动力学及药物效应动力学数据信息。
进一步地，所述精准用药数据库模块包括：药物基因组学相关数据库PHARMGKB中涉及癫痫疾病信息；《癫痫临床诊疗指南(2015修订版)》、《2017AGNP共识指南：神经精神药理学治疗药物监测》(下简称指南)中涉及的药物、基因、位点等信息；FDA(美国食品药品监督管理局)数据库中涉及的治疗癫痫类疾病药物、基因、位点等信息、CPIC(临床药物基因学实施联盟)数据库中涉及的癫痫药物与基因位点的作用信息及计量信息等；现有基于人群的药物基因组研究文献数据、研究成果数据等可用信息存储在本地数据库上。
进一步地，如图5所示，根据患者的基本信息、患者的抗癫痫药物基因的多态性信息和精准用药数据库存储的信息；基于输入信息与数据库匹配原则，结合定制方案的决策树方法，将初步给药方案生成报告；具体步骤包括：
以药物基因检测得到的基因型结果，遵循匹配原则与精准用药数据库中信息进行匹配，输出每一种药物对于当前患者的疗效等级和毒副作用等级；
针对每一种药物，判断其对当前患者是否有疗效，如果没有疗效，则直接将当前药物剔除；
如果有疗效，则进一步判断当前药物的毒副作用等级；如果毒副作用小于设定阈值，则当前药物作为推荐药物；如果毒副作用大于等于设定阈值，则直接将当前药物剔除；
采用上述步骤对所有的要求均进行疗效判断和毒副作用等级判断后，得出最终的初步给药方案。
某种基因型在精准用药数据库中根据匹配原则，匹配到具有毒副作用或疗效字段信息时，根据毒副作用和疗效的程度进行标记。据药物治疗方案中患者的预期药物疗效和毒副作用风险，进一步判断候选药物与患者个体匹配的合理性，并确定患者的初步给药方案。
实施例二，如图2所示，一种指导癫痫疾病个体化精准用药的系统，包括：
治疗信息更新模块，其被配置为：获取初步给药方案和治疗后的复查结果数据；
药物浓度监测模块，其被配置为：实施癫痫患者血药浓度检测，获取并存储患者个体使用抗癫痫药物后的体内药物浓度水平和代谢能力信息数据；
给药方案优化模块，其被配置为：调用治疗信息更新模块中信息、药物浓度监测模块中结果信息，根据匹配原则，与精准用药数据库中的信息进行匹配。匹配结果使用优化给药决策树模型进行处理，得到优化的给药方案；
最终报告生成模块，其被配置为：调取优化后的给药方案信息，并将信息写入报告模板，输出生成报告。
进一步地，所述治疗信息更新模块，获取患者初步给药方案中的信息，将患者实际用药信息数据进行更新。
进一步地，所述药物浓度监测模块，实施癫痫患者血药浓度检测，获取并存储患者个体使用抗癫痫药物后的体内药物浓度水平和代谢能力信息；具体包括：
采集患者血浆样本，监测患者个体对抗癫痫药物的体内浓度水平或代谢能力信息；采用液相色谱串联质谱法、液相色谱法、免疫法的至少一种。
进一步地，所述抗癫痫药物包括卡马西平、10-羟卡马西平、奥卡西平、左乙拉西坦、托吡酯、丙戊酸、苯妥英钠、苯巴比妥和拉莫三嗪种的任意一种或多种；
进一步地，所述药物浓度监测模块，实施癫痫患者血药浓度检测的步骤具体包括：以标准品制作标准曲线定量，同时采用质控品进行质控，以及基于HPLC-MS/MS对待测血液样品进行检测；
具体的，采用定量下限、低、中和高四个水平的质控品进行质控或采用低、中和高三个水平的质控品进行质控。
其中，上述抗癫痫药物质控品的定量下限、低、中和高浓度均分别为0.1、0.25、2.5和25ng/mL。
所述待测血液样品的配制方法为：将试验样品与同位素内标工作液混合，离心取上清制得。
所述试验样品为受试者血液样品，包括全血、血浆或血清，进一步优选为血浆。
所述同位素内标工作液可以为上述9种抗癫痫药物同位素内标工作液中的任意一种或多种的混合；
具体的，所述同位素内标工作液制备方法可以为：将抗癫痫药物的同位素内标原料药使用二甲基亚砜溶解，制成内标储备液，然后采用沉淀蛋白溶剂稀释得同位素内标工作液。
所述沉淀蛋白溶剂为含有甲酸的乙腈与甲醇的混合溶液，所述乙腈和甲醇的用量体积比为2～4:1～3，优选为3:2，所述甲酸含量为0.05～0.3％，优选为0.1％。
所述HPLC-MS/MS对待测样品进行检测具体方法为：
液相色谱条件包括：
采用梯度洗脱，流动相A相：水(2mM乙酸铵，0.1％乙酸)，流动相B相：乙腈(2mM乙酸铵，0.1％乙酸)；本发明为了获得满意的色谱行为和最大限度地提高分析物和内标化合物的电离响应，我们在流动相体系上进行了几次尝试。由于检测模式为正离子模式，故采用乙酸溶液作为流动相，以提高响应速度。考虑到流动相pH范围的稳定性和消除色谱峰的分裂，在流动相中加入了2mM乙酸铵。以不同比例的甲醇-水和乙腈-水对9种抗癫痫药物进行洗脱实验，发现乙腈比甲醇具有更低的背景噪声和更好的分辨率。根据峰形、保留时间、稳定性和灵敏度，乙腈(2mM乙酸铵，0.1％乙酸)-水(2mM乙酸铵，以0.1％乙酸为流动相。资生堂CAPCELL PAC-MGⅢC18柱对9种抗癫痫药物有较好的保留作用，2mM乙酸铵对9种抗癫痫药物的响应显著增强。在优化的高效液相色谱条件下，总运行时间是5.5分钟。
色谱柱为C18色谱柱；流动相流速为0.3～0.5ml/min(优选为0.4ml/min)；柱温为25～40℃(优选为35℃)；进样量1～10μL(优选为5μL)；本发明试验了四个流速(0.3mL/min,0.4mL/min和0.5mL/min)对检测结果的影响。结果表明：流速为0.4mL/min时，分离效果最佳，各色谱峰保留时间适宜，分离度好，基线平稳，峰形对称，因此选择流速为0.4mL/min。同时，本发明试验了四个不同柱温(如25℃，30℃，35℃和40℃)对质谱色谱检测结果的影响。结果显示柱温为35℃时，色谱峰保留时间适宜，基线平稳，各色谱峰分离度较好，峰形对称，因此选择柱温为35℃。
具体的，所述色谱柱为CAPCELL PAC-MGⅢC18色谱柱，经研究发现，其对上述9种抗癫痫药物均具有较好的保留作用。
梯度洗脱方式具体为：0-1.5min，流动相B 5-5％；1.5-1.9min，流动相B 5-70％；1.9-2.0min，流动相B 70-95％；2.0-3.8min，流动相B 95-95％；3.8-3.9min，流动相B 95-5％；3.9-5.5min，流动相B 5-5％。
本发明利用HPLC-MS/MS分析和MS参数优化正离子模式，提高了MRM测量对ESI源的响应。对于卡马西平，MRM的碎片化转变为m/z 237.1到194。对于10-羟卡马西平，MRM的碎片化转变为m/z 247.3到204.1。对于奥卡西平，MRM的碎片化转变为m/z 253.1到236。对于左乙拉西坦，MRM的碎片化转变为m/z 171.1到126.1。对于拉莫三嗪，MRM的碎片化转变为m/z256到210.9。对于丙戊酸，MRM的碎片化转变为m/z 143.2到143.2。对于苯巴比妥，MRM的碎片化转变为m/z 231.1到188.1。对于苯妥英钠，MRM的碎片化转变为m/z 250.9到102.1。对于托吡酯，MRM的碎片化转变为m/z 337.9到78.1。
在样品制备的优化方面，与乙酸乙酯液-液萃取法相比，蛋白质沉淀法具有精度高、回收率高、操作简单等优点。样品制备采用蛋白质沉淀法。9种抗癫痫药物的定量限值可用于血浆样品中药物动力学的定量分析。
最初，沉淀蛋白的溶剂是乙腈和甲醇，但这造成了左乙拉西坦和10-羟卡马西平含量的巨大损失，这可能是由于乙腈和甲醇不能有效地将分析物从蛋白质中解吸出来造成的。影响电荷态分布的因素包括溶剂pH值和药物溶解度。左乙拉西坦和10-羟卡马西平的pKa较低，当pH较高时易降解。因此，一种更易溶解的溶液：乙腈：甲醇：甲酸按3:2:0.1的体积比混合，成功地解决了这个问题。
质谱条件包括：
离子源：电喷雾(ESI)；扫描方式：多反应监测(MRM)；离子化方式：正离子；离子源电压：5000V；离子源温度：650℃；气帘气：15psi；雾化气：45psi；辅助气：55psi。
9种抗癫痫药物及其内标化合物的质谱参数见表13。
表13 9种抗癫痫药物及其内标化合物的质谱参数
Figure BDA0003095488480000171
Figure BDA0003095488480000181
本发明同时对质谱条件进行优化，采用API5500型三重四级杆质谱仪的多反应离子检测模式(MRM)优化9种抗癫痫药物及其内标化合物的质谱条件，保证每一对离子对高响应的出峰，检测结果如表1所示，9种抗癫痫药物及其内标化合物均找到特异性的母离子、子离子用于定量分析。
在分析时间的选择上，本发明在选择色谱图谱的洗脱时间时记录了10min的色谱图。结果表明5.5min以后基本没有明显的色谱峰出现，同时为了照顾批次样品的差异性，保证所有批次样品的特征峰都能够被检出，因此选择5.5min作为分析时间。
采用左乙拉西坦-d3、卡马西平-d10、10-羟卡马西平-d3、拉莫三嗪-c3d3、丙戊酸-d4、苯巴比妥-d5、苯妥英钠-d10、托吡酯-d12作为同位素内标化合物。
本实施例采用HPLC-MS/MS液质联用分析方法，实验过程中尝试选择离子检测(SIM)模式测定，结果各成分响应较低且基线高，基质影响较大，无法实现定量分析，然而通过多反应检测(MRM)法对母离子和特征碎片的子离子进行扫描时，发现离子峰的响应强度明显高于选择离子检测(SIM)模式，且基线低可实现定量分析。因此实验选用多反应检测(MRM)扫描模式用于定量9种抗癫痫药物，用常规液相方法检测存在耗时长，分离较难，检测限高等缺点，不利于试验的进行。
具体的，药物浓度监测模块可执行如下操作步骤：
第一步：
对照品溶液制备：9种抗癫痫药物的储备液用二甲基亚砜溶解精确称量的标准对照品，9种抗癫痫药物的最终浓度为1000μg/mL。将0.10mL精确体积的9种抗癫痫药物标准溶液移入10mL容量瓶中，并用乙腈定容，得到9种抗癫痫药物10μg/mL的工作液。用乙腈稀释，得到2、4、10、20、100、200、400和600ng/mL的工作液。同时，将9种抗癫痫药物的同位素内标原料药用一定体积二甲基亚砜溶解，制备1000μg/mL的内标储备液。9种抗癫痫药物的同位素内标的工作液浓度为50ng/mL，稀释溶剂为乙腈:甲醇＝3:2，含0.1％甲酸。所有药物的储备液在4℃的避光容器中储存至少60天，无变化。
在0.1、0.2、0.25、0.5、1.0、2.5、5.0、10、20、25、30ng/mL的9种抗癫痫药物在血浆中的药物浓度点中制备其标准曲线。根据FDA关于选择质量控制点(QCs)的指南，为了进行准确度和精密度研究，QCs在4个浓度水平下制备为6个重复品，包括定量下限(LLOQ)、低(L：定义为LLOQ的三倍)、中(M：定义为中范围)和高(H：定义为高范围)。而对于其他试验(在样品分析期间)，只使用了3种浓度水平(LQC、MQC和HQC)的样品。对于9种抗癫痫药物，分别在0.1、0.25、2.5和25ng/mL下制备LLOQ、LQC、MQC和HQC。
将45μL大鼠空白血浆置于2.0mL离心管中，加入精确体积5μL的9种抗癫痫药物2-600ng/mL工作溶液，以获得9种抗癫痫药物的0.1-30ng/mL血浆浓度。然后加入200μL 9种抗癫痫药物同位素内标的混合工作液(50ng/mL)(乙腈:甲醇＝3:2，0.1％甲酸，V/V)沉淀蛋白，振荡10min，提取分析物及其内标，在4℃下以14000rpm离心15min分离上部有机相和下部水相。将100μL上清液溶解于200μL水相中，并涡旋混合2分钟，得到对照品溶液；
第二步：
测定：将步骤(1)得到的对照品溶液进行HPLC-MS/MS分析，采用梯度洗脱，流动相A相：水(2mM乙酸铵，0.1％乙酸)，流动相B相：乙腈(2mM乙酸铵，0.1％乙酸)。
在本实施例中，色谱柱为CAPCELL PAK-MGⅢC18(2.0×150mm，5μm，日本SHISEIDO公司)；流动相流速为0.4ml/min；柱温为35℃；进样量5μL。各有效成分质谱参数见表1。梯度洗脱方式为：0-1.5min，流动相B 5-5％；1.5-1.9min，流动相B 5-70％；1.9-2.0min，流动相B 70-95％；2.0-3.8min，流动相B 95-95％；3.8-3.9min，流动相B 95-5％；3.9-5.5min，流动相B 5-5％。
质谱条件为：离子源：电喷雾(ESI)；扫描方式：多反应监测(MRM)；离子化方式：正离子；离子源电压：5000V；离子源温度：650℃；气帘气：15psi；雾化气：45psi；辅助气：55psi；
第三步：
对建立的高效液相串联质谱的方法可行性进行考察的方法包括对专属性、定量限、精密度、准确度、稳定性、基质效应及提取回收率。
专属性：通过比较六个人的空白血浆样品、在最后给药后0.5小时从其中一名受试者获得的临床血浆样品、以30ng/mL的浓度加入9种抗癫痫药物的血浆样品和以0.1ng/mL的浓度加入9种抗癫痫药物的血浆样品的色谱图来评估特异性和内源性干扰。通过比较50％乙腈和添加9种抗癫痫药物的三蒸馏水(0.1ng/mL)的最低定量限和9种抗癫痫药物内标(50ng/mL)的色谱图来评估特异性和外源性干扰。制备并分析所有空白血浆样品，以确保没有干扰峰。在所建立的色谱条件下，血浆中没有内源性干扰，表明该方法的选择性是可以接受的；
定量限：采用1/X2加权线性最小二乘回归模型，以9种抗癫痫药物/9种抗癫痫药物内标与血浆浓度的峰面积比构建校准曲线。最低定量限(LLOQ)表示线性范围内分析物的最低浓度，可以用可接受的精度和准确度进行测定。
精密度：在同一天对四种浓度(0.1、0.25、2.5和25ng/mL)的六个重复的LLOQ和QC样品进行分析，以评估日内精密度和准确度。通过连续三天分析LLOQ和QC样本来评估日间精密度和准确度。方法的精密度和准确度分别用相对标准偏差(RSD)和相对误差(RE)表示。RSD和RE均不得超过15％。然而，在LLOQ，RE和RSD<±20％是可以接受的。LLOQ和QC样品中9种抗癫痫药物的精密度和准确度结果见表14。9种抗癫痫药物各样品水平的精密度(RSD)均小于9.99％。对9种抗癫痫药物各样品水平的准确度在1.48％到8.31％之间。测定值均在可接受范围内。
表14血浆中测定9种抗癫痫药物含量方法的精密度和准确度
Figure BDA0003095488480000201
Figure BDA0003095488480000211
基质效应和提取回收率：提取回收率是通过比较在6个不同批次血浆中制备的三个水平的QC样品中提取的分析物与IS比的绝对峰面积与空白血浆、高溶血性血浆和高脂肪血浆提取后用相同浓度的分析物纯溶液进行强化LQC、MQC、HQC。通过比较六批样品在LQC、MQC、HQC水平下强化的空白血浆提取物与相同浓度水平分析物强化的空白水提取物中分析物绝对峰面积与IS比值的比较，来评估基质效应。在人空白血浆中，9种抗癫痫药物内标物均匀化的平均基质效应为98.2-108.0％，而高溶血性的平均基质效应为96.5-108.4％。在高脂血浆中，9种抗癫痫药物的基质效应为96.5-107.1％。如表15所示，所有相对标准偏差值在0.75％到9.17％之间，这表明血浆基质的影响对于分析来说是可以忽略的。9种抗癫痫药物内标物均匀化后的平均提取回收率为96.7-103.8％，不同浓度下9种抗癫痫药物的提取回收率结果准确、重现性好。
表15血浆中测定9种抗癫痫药物含量方法的提取回收率和基质效应(n＝6)
Figure BDA0003095488480000212
Figure BDA0003095488480000221
Figure BDA0003095488480000231
稳定性试验：对三种不同浓度的QC样品在不同条件下的稳定性进行了分析：(1)室温(23℃)制备前3h；(2)冰箱温度(4℃)制备后20小时，室温(23℃)制备后6小时；(3)自动进样器10℃制备后24小时；(4)冰箱温度(-20℃)制备前3、8、31天。通过比较储存的QC样品和新制备的样品的平均浓度来评估溶液的稳定性。样品被认为是稳定的，与标称浓度的偏差在±15.0％以内。所有稳定性试验样品在6个重复中进行分析，并根据新制备的样品确定偏差。9种抗癫痫药物在室温下放置至少3h后，9种抗癫痫药物的CV％(5.35％)的响应无显著差异(<15％)，表明9种抗癫痫药物在此条件下是稳定的。处理后的样品在自动进样器中稳定达24小时，在室温托盘中稳定达3小时，CV％值分别至少为6.57％和6.95％。结果见表16。
表16 9种抗癫痫药物的样品稳定性(n＝6，以Mean±R.E.％表示)
Figure BDA0003095488480000241
为进一步验证药物浓度监测模块，采用小鼠进行试验，执行如下操作：
对12只健康雄性大鼠进行了药物动力学研究。伦理委员会批准了实验方案。给药前禁食12小时，给药后禁食2小时。灌胃给药后，在给药前和0时从颈静脉抽取2mL的血样。后分别于0.083，0.167，0.5，0.75，1，2，5、8、12和24小时取血。实验期间，可以自由饮水。随后在14000×g转速下离心10分钟制备血浆，并在-80℃下立即冷冻。
将50μL大鼠血浆置于2.0mL离心管中，加入含9种抗癫痫药物内标的200μL沉淀蛋白溶剂振荡10min提取分析物和内标，在4℃下以14000rpm离心15min分离上部有机相和下部水相。将100μL上清液溶解于200μL水相中，并涡旋混合2分钟，得到供试品溶液；
第二步：
测定：将步骤(1)得到的供试品溶液进行HPLC-MS/MS分析，采用梯度洗脱，流动相A相：水(2mM乙酸铵，以0.1％乙酸)，流动相B相：乙腈(2mM乙酸铵，0.1％乙酸)。
药物动力学分析采用DAS2非房室模型软件程序(中国数学药理学专业委员会，中国上海)计算AUC、Cmax、Tmax、T1/2、Vz/F和CLz/F。数据以Mean±SD表示。
灌胃8种抗癫痫药物(10-羟卡马西平为奥卡西平的活性代谢物)后的平均血浆浓度-时间曲线如图22所示。药物动力学参数见表17。服用8种抗癫痫药物(1mg)后，1.90±0.384h(Tmax)的卡马西平最大观察血浆浓度(Cmax)为58.6±2.717ng/mL。从时间零点到最后可测浓度的血药浓度-时间曲线下面积(AUC0-t)和从时间零点到血药消除的血药浓度-时间曲线下面积预测值(AUC0-∞)分别为69.31±14.90ng/mL·h和71.84±16.29ng/mL·h。1.34±0.784h(Tmax)的奥卡西平Cmax为27.8±3.651ng/mL。AUC0-t和AUC0-∞分别为45.85±13.24ng/mL·h和51.77±11.32ng/mL·h。2.17±0.367h(Tmax)的10-羟卡马西平Cmax为28.6±3.257ng/mL。AUC0-t和AUC0-∞分别为29.53±4.85ng/mL·h和32.54±9.54ng/mL·h。1.84±0.671h(Tmax)的托吡酯Cmax为18.2±3.254ng/mL。AUC0-t和AUC0-∞分别为58.51±8.54ng/mL·h和60.74±13.25ng/mL·h。0.96±0.341h(Tmax)的拉莫三嗪Cmax为83.2±1.587ng/mL。AUC0-t和AUC0-∞分别为85.61±21.35ng/mL·h和90.88±14.28ng/mL·h。1.12±0.425h(Tmax)的丙戊酸Cmax为54.3±2.235ng/mL。AUC0-t和AUC0-∞分别为49.52±6.88ng/mL·h和51.44±8.61ng/mL·h。1.32±0.652h(Tmax)的苯巴比妥Cmax为52.6±6.523ng/mL。AUC0-t和AUC0-∞分别为74.25±10.36ng/mL·h和85.32±8.96ng/mL·h。1.68±0.658h(Tmax)的苯妥英钠Cmax为26.3±1.985ng/mL。AUC0-t和AUC0-∞分别为52.36±2.15ng/mL·h和61.25±3.27ng/mL·h。2.44±0.547h(Tmax)的左乙拉西坦Cmax为5.3±1.321ng/mL。AUC0-t和AUC0-∞分别为63.21±7.51ng/mL·h和71.96±5.85ng/mL·h。所得数据表明卡马西平、奥卡西平、10-羟卡马西平、托吡酯、左乙拉西坦、丙戊酸、苯巴比妥相较于苯妥英钠和拉莫三嗪可快速吸收，缓慢消除，实验结果可应用于临床治疗难治性癫痫病时联合用药的剂量-效应研究。
表17灌胃8种抗癫痫药物后的非房室药物动力学参数(平均值±标准差，n＝12)
Figure BDA0003095488480000251
Figure BDA0003095488480000261
进一步地，所述给药方案优化模块，根据复查结果、患者个体使用抗癫痫药物后的体内药物浓度水平、代谢能力信息和精准用药数据库中的数据；分析评估初步给药方案的治疗效果，对初步给药方案进行优化调整，得到优化的给药方案。
进一步地，如图7所示，所述给药方案优化模块，使用决策树模型优化给药方案，对血药浓度的结果进行优化；
当检测药物的血药浓度低于参考范围时，进行剂量增加；
当检测药物的血药浓度高于参考范围时，进行剂量减少；
当检测药物的浓度在血药浓度参考范围内时，判断临床症状是否有改善，如果有改善，则保持药物及剂量；如果没有改善，则设定目标血药浓度，增加药物剂量，如果增加药物剂量后依旧没有改善，则考虑联合用药；如果增加药物剂量后有改善，则保持药物及剂量。
进一步地，所述最终报告生成模块，包括：患者疾病信息、用药信息、药物基因检测信息、初步给药信息、调整后药物信息、调整后药物的剂量信息、调整后药物的给药频次和调整后药物的给药方式信息等写入疾病模板并输出。
本实施例系统可对基于背景数据建立的精准用药数据库模块不断更新，包括药物、基因、基因位点、药效或毒副作用相关信息，从而提高该系统的精准性。
实施例三，如图3所示，一种指导癫痫疾病个体化精准用药的系统，包括：
患者基本信息获取模块，其被配置为：获取患者的基本信息；
药物基因组检测模块，其被配置为：采用PGx试剂盒，实施癫痫患者药物基因检测，获取患者的抗癫痫药物基因的多态性信息；
精准用药数据库，其被配置为：存储药物基因组学数据、药物代谢动力学数据及药物效应动力学数据；
初步给药方案制定模块，其被配置为：根据患者的基本信息、患者的抗癫痫药物基因的多态性信息和精准用药数据库存储的信息；基于输入信息与数据库匹配原则，结合定制方案的决策树方法，将初步给药方案生成报告；
治疗信息更新模块，其被配置为：获取初步给药方案和治疗后的复查结果数据；
药物浓度监测模块，其被配置为：实施癫痫患者血药浓度检测，获取并存储患者个体使用抗癫痫药物后的体内药物浓度水平和代谢能力信息数据；
给药方案优化模块，其被配置为：调用治疗信息更新模块中信息、药物浓度监测模块中结果信息，根据匹配原则，与精准用药数据库中的信息进行匹配。匹配结果使用优化给药决策树模型进行处理，得到优化的给药方案；
最终报告生成模块，其被配置为：调取优化后的给药方案信息，并将信息写入报告模板，输出生成报告。
实施例三中患者基本信息获取模块、药物基因组检测模块、精准用药数据库、初步给药方案制定模块、治疗信息更新模块、药物浓度监测模块、给药方案优化模块和最终报告生成模块，各个模块的功能与实施例一和实施例二是对应一致的，此处不再赘述。
以下，是本发明实施例一的一个具体应用实例，具体过程为：
患者基本信息获取模块记录患儿，男，4y10m，体重30.5kg。不明原因抽搐发作近2个月余，表现为睁眼、四肢不规则抽搐，持续时间为5-10秒，睡眠时偶发作。V-EEG显示双侧额叶、顶叶较多棘波、棘慢波，睡眠期增多。头颅MRI提示额叶多个癫痫灶。临床诊断为癫痫(局灶性发作)。下一步需要制定初步给药方案。
将患者个体信息和临床检查结果全部导入到患者基本信息获取模块(表18)。此外EDTA抗凝管采集患者的全血样本，检测癫痫疾病临床诊疗指南推荐的8种候选的抗癫痫药物的基因多态性。此8种药物分别是丙戊酸、卡马西平、奥卡西平、拉莫三嗪、左乙拉西坦、托吡酯、苯巴比妥、苯妥英钠，药物基因组检测结果如下表19所示：
表18患者基本信息、临床诊断、用药指南等信息
Figure BDA0003095488480000271
表19患者药物基因组检测结果及精准用药报告解读
Figure BDA0003095488480000272
Figure BDA0003095488480000281
初步给药方案制定模块，利用精准用药数据库模块中药物基因组学数据与癫痫疾病临床药物治疗指南等信息相结合，关键数据包括临床症状及癫痫发作类型、药物相关基因信息、药物之间相互作用等。将患者的个体基本临床信息和药物基因组检测结果导入到不同药物的决策模型中，预测疗效、预警副作用。
下面以奥卡西平为例，采用决策树算法对其建立药物疗效和毒副作用风险预测模型。如图4为奥卡西平的药效决策树模型，其中关键节点依次为临床诊断(癫痫发作类型)、相关药物基因组检测信息、毒副作用预测、疗效预测。由于此患儿临床诊断为癫痫(局灶性发作)，药物基因组检测HLA-B*15:02为野生型，SCN2A基因位点rs2304016为WT/WT AA型，ABCB1基因位点rs1045642为WT/c.3435T>CAG型，采用决策树模型对此患儿服用奥卡西平治疗癫痫的药效及毒副作用进行预测分析。分析结果为该患儿服用奥卡西平时毒副作用Stevens-Johnson综合征风险减少；耐药的风险增加，药效降低，需要监测血药浓度以个体化增加剂量。
采用不同药物的模型预测方法按照以上流程得到该癫痫患儿8种药物的疗效和毒副作用预测结果，如下表20所示：
表20 8种药物的毒副作用及药物疗效对比
Figure BDA0003095488480000291
注释：基于药物基因组检测结果，
Figure BDA0003095488480000292
表示预测药物疗效较好，或者无毒副作用。
Figure BDA0003095488480000293
表示预测药物有一定疗效，或者毒副作用风险相对较低。
Figure BDA0003095488480000294
表示预测药物有一定疗效，同时有一定毒副作用，应谨慎使用。
Figure BDA0003095488480000295
表示预测药物疗效不大，或者有一定毒副作用风险。
Figure BDA0003095488480000296
表示预测药物无明显疗效，或者可能导致严重毒副作用。
Figure BDA0003095488480000297
表示剂量减少25％，
Figure BDA0003095488480000298
表示剂量减少50％，
Figure BDA0003095488480000299
表示剂量减少75％。
Figure BDA00030954884800002910
表示剂量增加25％，
Figure BDA00030954884800002911
表示剂量增加50％，
Figure BDA00030954884800002912
表示剂量增加75％。
根据初步给药方案制定模块得到最优药物方案为卡马西平、奥卡西平、拉莫三嗪。最后，将以上信息汇总导出到初步报告生成模块，根据初步报告生成模块生成初步给药方案报告，报告包括解读最佳治疗药物种类、剂量、给药频次、给药方式，以及预测的疗效和预警的毒副作用。连续用药4-5个半衰期即一般一周后达到稳态浓度，采血进行药物浓度监测，即进入优化给药方案阶段。
治疗信息更新模块，可收集患者的初步给药方案信息、和记录患者的复查结果，包括疾病症状改善情况、药物的不良反应状况指标、肝肾功能指标；
药物浓度监测模块，采集血浆等样本，采用液相色谱质谱联用法、液相色谱法或免疫法测定患者体内药物的浓度，并计算峰浓度、谷浓度、半衰期、AUC水平等指标，得到个体的浓度水平和代谢指标信息；
给药方案优化模块，利用从治疗信息更新模块、药物浓度监测模块、个体化用药数据库模块导入的信息，根据患者复查结果以及实际药物浓度水平或代谢指标，综合分析评估初步给药方案的治疗效果，并进一步对其优化调整，得到优化给药方案；
将以上结果导出到最终报告生成模块，最终报告生成模块可通过报告模板，导出生成优化给药方案报告，包括调整药物种类、剂量、给药频次、给药方式等。
给药方案优化模块，利用个体化用药数据库模块中抗癫痫药物的临床使用数据和药代动力学研究结果，建立给药方案优化的数学模型，将患者的治疗信息更新模块和药物浓度监测模块中的信息导入到该优化数学模型中，从而判断现有药物治疗方案是否达到预期疗效、不良反应情况、是否需要进行调整，并提供具体的调整方法。
本实施例系统可对数据库模块不断更新、添加药物临床应用信息和临床实际案例信息，同时，系统可以根据以上更新进一步更新优化方案优化调整模块的大数据分析模型，从而提高该个体化给药系统的精准性。
以下，是本发明一个具体应用实例，具体过程为：
患儿，男，4y10m，体重30.5kg。临床诊断为癫痫(局灶性发作)。经过实施例一及例二，制定了初步给药方案。OXC(奥卡西平)150mg，口服2次/天。连续服药1个月20天，现较前好转，但偶有轻微发作。采用治疗信息更新模块导入复查结果，如下表21所示：
表21患者基本信息和药物浓度监测结果
Figure BDA0003095488480000301
进一步开展药物浓度监测实验，在当天第一次给药前采集患者的血浆样本，通过药物监测模块采用液相色谱质谱联用法检测获得患者的药物谷浓度水平为5.98g/mL(见表21)。
给药方案优化模块利用个体化用药数据库关于奥卡西平的临床指导原则和剂量调整方法建立了奥卡西平的方案优化决策树模型，见图6，其中模型的关键节点包括临床症状改善情况、血药浓度值、肝肾功能等，将该患者的治疗信息和药物浓度监测结果导入到该模型中，采用优化决策树模型分别从毒副作用风险控制和药物疗效改善情况两个方面评估优化方法。
根据病史该患儿规则服用当前剂量的OXC 1个月20天，临床体征较前有好转，但未完全控制症状；同时TDM结果提示MHD血药浓度5.98ug/ml，在参考浓度范围(3-35ug/ml)的下限。在安全范围内药理效应与暴露剂量(血药浓度)正相关，可适当提高血药浓度最大程度发挥其抗癫痫疗效。因OXC及MHD均为肾型排泄物，前期规则服药已到稳态，可考虑按稳态一点法进行剂量调整。设定目标药物MHD暴露量(浓度)，参考有效浓度范围选中位值(C2＝12ug/ml)为第一次调整目标，根据稳态一点法计算，则调整剂量为603mg。为便于执行医嘱并增加患儿服药依从性，调整治疗方案目标血药浓度下的剂量为:300mg,口服,2次/天。在现有剂量下每周增加量：2.5mg/(kg.d),至第三周后调整到目标剂量，随访1个月。复查MHD血药浓度为10.92ug/ml(基本达到目标药物浓度)，肝肾功无特殊。随访当月未再复发(见表22)。
表22原初步给药方案的效果评估和优化给药方案的效果预测
Figure BDA0003095488480000302
本系统可对个体化用药数据库模块不断更新添加药物临床应用信息和临床实际案例信息，同时系统可以根据以上更新进一步更新优化给药方案制定模块的大数据分析模型，从而提高该系统的精准性。
下面通过具体实施例详细说明本发明抗癫痫个体化精准用药系统，具体过程为：
患者基本信息获取模块记录患儿，男，4y10m，体重30.5kg。不明原因抽搐发作近2个月余，表现为睁眼、四肢不规则抽搐，持续时间为5-10秒，睡眠时偶发作。V-EEG显示双侧额叶、顶叶较多棘波、棘慢波，睡眠期增多。头颅MRI提示额叶多个癫痫灶。临床诊断为癫痫(局灶性发作)。
(1)初步给药方案制定：
将患者个体信息和临床检查结果全部导入到患者基本信息获取模块(表23)。此外EDTA抗凝管采集患者的全血样本，检测癫痫疾病临床诊疗指南推荐的8种候选的抗癫痫药物的基因多态性。此8种药物分别是丙戊酸、卡马西平、奥卡西平、拉莫三嗪、左乙拉西坦、托吡酯、苯巴比妥、苯妥英钠，药物基因组检测结果如下表24所示：
表23患者基本信息、临床诊断、用药指南等信息
Figure BDA0003095488480000303
Figure BDA0003095488480000311
表24患者药物基因组检测结果及精准用药报告解读
Figure BDA0003095488480000312
Figure BDA0003095488480000321
初步给药方案制定模块利用数据库模块中临床用药信息，采用大数据算法建立了8种抗癫痫候选药物的药效和毒性的预测模型。该模型的关键属性包括临床症状及诊断、癫痫发作类型、药物相关基因组、药物之间相互作用等。将患者的个体基本临床信息和药物基因组检测结果导入到不同药物的预测模型中，预测疗效、预警副作用。
下面以奥卡西平为例，采用决策树算法对其建立药物疗效和毒副作用风险预测模型，说明该计算过程。如图3为奥卡西平的药效决策树模型，其中关键节点依次为临床诊断(癫痫发作类型)、相关药物基因组检测信息、毒副作用预测、疗效预测。由于此患儿临床诊断为癫痫(局灶性发作)，药物基因组检测HLA-B*15:02为野生型，SCN2A基因位点rs2304016为WT/WT AA型，ABCB1基因位点rs1045642为WT/c.3435T>C AG型，采用决策树模型对此患儿服用奥卡西平治疗癫痫的药效及毒副作用进行预测分析。分析结果为该患儿服用奥卡西平时毒副作用Stevens-Johnson综合征风险减少；耐药的风险增加，药效降低，需要监测血药浓度以个体化增加剂量。
采用不同药物的模型预测方法按照以上流程得到该癫痫患儿8种药物的疗效和毒副作用预测结果，如下表25所示：
表25 8种药物的毒副作用及药物疗效对比
Figure BDA0003095488480000322
Figure BDA0003095488480000331
注释：基于药物基因组检测结果，
Figure BDA0003095488480000332
表示预测药物疗效较好，或者无毒副作用。
Figure BDA0003095488480000333
表示预测药物有一定疗效，或者毒副作用风险相对较低。
Figure BDA0003095488480000334
表示预测药物有一定疗效，同时有一定毒副作用，应谨慎使用。
Figure BDA0003095488480000335
表示预测药物疗效不大，或者有一定毒副作用风险。
Figure BDA0003095488480000336
表示预测药物无明显疗效，或者可能导致严重毒副作用。
Figure BDA0003095488480000337
表示剂量减少25％，
Figure BDA0003095488480000338
表示剂量减少50％，
Figure BDA0003095488480000339
表示剂量减少75％。
Figure BDA00030954884800003310
表示剂量增加25％，
Figure BDA00030954884800003311
表示剂量增加50％，
Figure BDA00030954884800003312
表示剂量增加75％。
根据初步给药方案制定模块得到最优药物方案为卡马西平、奥卡西平、拉莫三嗪。最后，将以上信息汇总导出到报告模块，根据报告模板生成初步给药方案报告，报告包括解读最佳治疗药物种类、剂量、给药频次、给药方式，以及预测的疗效和预警的毒副作用。连续用药4-5个半衰期即一般一周后达到稳态浓度，采血进行药物浓度监测，即进入优化给药方案阶段。
(2)优化给药方案调整阶段：
患儿，男，4y10m，体重30.5kg。临床诊断为癫痫(局灶性发作)。经过实施例一及例二，制定了初步给药方案。OXC(奥卡西平)150mg，口服2次/天。连续服药1个月20天，现较前好转，但偶有轻微发作。采用治疗信息更新模块导入复查结果，如下表26所示：
表26患者基本信息和药物浓度监测结果
Figure BDA00030954884800003313
进一步开展药物浓度监测实验，在当天第一次给药前采集患者的血浆样本，通过药物监测模块采用液相色谱质谱联用法检测获得患者的药物谷浓度水平为5.98g/mL(见表4)。
方案优化调整模块利用数据库模块关于奥卡西平的临床指导原则和剂量调整方法建立了奥卡西平的方案优化决策树模型，见图6，其中模型的关键节点包括临床症状改善情况、血药浓度值、肝肾功能等，将该患者的治疗信息和药物浓度监测结果导入到该模型中，采用优化决策树模型分别从毒副作用风险控制和药物疗效改善情况两个方面评估优化方法。
根据病史该患儿规则服用当前剂量的OXC(奥卡西平)1个月20天，临床体征较前有好转，但未完全控制症状；同时药物浓度监测结果提示MHD(10-羟基卡马西平)血药浓度5.98ug/ml，在参考浓度范围(3-35ug/ml)的下限。在安全范围内药理效应与暴露剂量(血药浓度)正相关，可适当提高血药浓度最大程度发挥其抗癫痫疗效。因OXC及MHD均为肾型排泄物，前期规则服药已到稳态，可考虑按稳态一点法进行剂量调整。设定目标药物MHD暴露量(浓度)，参考有效浓度范围选中位值(12ug/ml)为第一次调整目标，根据稳态一点法计算，则调整剂量为603mg。为便于执行医嘱并增加患儿服药依从性，调整治疗方案目标血药浓度下的剂量为:300mg,口服,2次/天。在现有剂量下每周增加量：2.5mg/(kg.d),至第三周后调整到目标剂量，随访1个月。复查MHD血药浓度为10.92ug/ml(基本达到目标药物浓度)，肝肾功无特殊。随访当月未再复发(见表27)。
表27原初步给药方案的效果评估和优化给药方案的效果预测
Figure BDA00030954884800003314
Figure BDA0003095488480000341
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东英盛生物技术有限公司；首都医科大学附属北京天坛医院
<120> 一种指导癫痫疾病个体化精准用药的系统
<130>
<160> 39
<170> PatentIn version 3.3
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<400> 39
ggtgtgaacc atgagaagta t 21

Claims (10)

1.一种指导癫痫疾病个体化精准用药的系统，其特征是，包括：
患者基本信息获取模块，其被配置为：获取患者的基本信息；
药物基因组检测模块，其被配置为：采用PGx试剂盒，实施癫痫患者药物基因检测，获取患者的抗癫痫药物基因的多态性信息；
精准用药数据库，其被配置为：存储药物基因组学数据、药物代谢动力学数据及药物效应动力学数据；
初步给药方案制定模块，其被配置为：根据患者的基本信息、患者的抗癫痫药物基因的多态性信息和精准用药数据库存储的信息；基于输入信息与数据库匹配原则，结合定制方案的决策树方法，将初步给药方案生成报告。
2.如权利要求1所述的一种指导癫痫疾病个体化精准用药的系统，其特征是，所述获取患者的基本信息，具体包括：个体基本信息、疾病状态指标、肝肾功能指标和用药信息。
3.如权利要求1所述的一种指导癫痫疾病个体化精准用药的系统，其特征是，所述药物基因组检测模块，使用MALDI-TOF MS、Sanger测序、荧光定量PCR方法中的至少一种实施检测；采集患者血浆样本，经过PGx试剂盒，实施检测后获得患者的抗癫痫药物基因多态性信息；抗癫痫药物基因多态性信息，包括：涉及的药物信息、需要检测的基因信息、位点信息、设计的引物信息检测结果的基因型信息；
优选的，所述抗癫痫药物包括卡马西平、10-羟卡马西平、奥卡西平、左乙拉西坦、托吡酯、丙戊酸、苯妥英钠、苯巴比妥和拉莫三嗪种的任意一种或多种；
优选的，所述PGx试剂盒包含如下检测专用引物，所述检测专用引物包括引物组1和引物组2，其中，所述引物组1由引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、引物对5、引物对6、引物对7、引物对8、引物对9、引物对10、引物对11和引物对12组成；
所述引物对1由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的单链DNA分子组成；
所述引物对2由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的单链DNA分子组成；
所述引物对3由SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的单链DNA分子组成；
所述引物对4由SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的单链DNA分子组成；
所述引物对5由SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的单链DNA分子组成；
所述引物对6由SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示的单链DNA分子组成；
所述引物对7由SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示的单链DNA分子组成；
所述引物对8由SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示的单链DNA分子组成；
所述引物对9由SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18所示的单链DNA分子组成；
所述引物对10由SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20所示的单链DNA分子组成；
所述引物对11由SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22所示的单链DNA分子组成；
所述引物对12由SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24所示的单链DNA分子组成；
所述引物组2由单链延伸引物1、单链延伸引物2、单链延伸引物3、单链延伸引物4、单链延伸引物5、单链延伸引物6、单链延伸引物7、单链延伸引物8、单链延伸引物9、单链延伸引物10、单链延伸引物11和单链延伸引物12组成；
所述单链延伸引物1的核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示；
所述单链延伸引物2的核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示；
所述单链延伸引物3的核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示；
所述单链延伸引物4的核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示；
所述单链延伸引物5的核苷酸序列如SEQ ID NO.29所示；
所述单链延伸引物6的核苷酸序列如SEQ ID NO.30所示；
所述单链延伸引物7的核苷酸序列如SEQ ID NO.31所示；
所述单链延伸引物8的核苷酸序列如SEQ ID NO.32所示；
所述单链延伸引物9的核苷酸序列如SEQ ID NO.33所示；
所述单链延伸引物10的核苷酸序列如SEQ ID NO.34所示；
所述单链延伸引物11的核苷酸序列如SEQ ID NO.35所示；
所述单链延伸引物12的核苷酸序列如SEQ ID NO.36所示。
4.如权利要求1所述的一种指导癫痫疾病个体化精准用药的系统，其特征是，所述精准用药数据库模块包括：存储药物基因组学数据、癫痫疾病药物治疗共识指南信息、治疗癫痫类药物代谢动力学及药物效应动力学数据信息。
5.如权利要求1所述的一种指导癫痫疾病个体化精准用药的系统，其特征是，根据患者的基本信息、患者的抗癫痫药物基因的多态性信息和精准用药数据库存储的信息；基于输入信息与数据库匹配原则，结合定制方案的决策树方法，将初步给药方案生成报告；具体步骤包括：
以药物基因检测得到的基因型结果，遵循匹配原则与精准用药数据库中信息进行匹配，输出每一种药物对于当前患者的疗效等级和毒副作用等级；
针对每一种药物，判断其对当前患者是否有疗效，如果没有疗效，则直接将当前药物剔除；
如果有疗效，则进一步判断当前药物的毒副作用等级；如果毒副作用小于设定阈值，则当前药物作为推荐药物；如果毒副作用大于等于设定阈值，则直接将当前药物剔除；
采用上述步骤对所有的要求均进行疗效判断和毒副作用等级判断后，得出最终的初步给药方案。
6.一种指导癫痫疾病个体化精准用药的系统，其特征是，包括：
治疗信息更新模块，其被配置为：获取初步给药方案和治疗后的复查结果数据；
药物浓度监测模块，其被配置为：实施癫痫患者血药浓度检测，获取并存储患者个体使用抗癫痫药物后的体内药物浓度水平和代谢能力信息数据；
给药方案优化模块，其被配置为：调用治疗信息更新模块中信息、药物浓度监测模块中结果信息，根据匹配原则，与精准用药数据库中的信息进行匹配；匹配结果使用优化给药决策树模型进行处理，得到优化的给药方案；
最终报告生成模块，其被配置为：调取优化后的给药方案信息，并将信息写入报告模板，输出生成报告。
7.如权利要求6所述的一种指导癫痫疾病个体化精准用药的系统，其特征是，所述治疗信息更新模块，获取患者初步给药方案中的信息，将患者实际用药信息数据进行更新；
所述药物浓度监测模块，实施癫痫患者血药浓度检测，获取并存储患者个体使用抗癫痫药物后的体内药物浓度水平和代谢能力信息；具体包括：
采集患者血浆样本，监测患者个体对抗癫痫药物的体内浓度水平或代谢能力信息；采用液相色谱串联质谱法、液相色谱法、免疫法的至少一种；
优选的，所述抗癫痫药物包括卡马西平、10-羟卡马西平、奥卡西平、左乙拉西坦、托吡酯、丙戊酸、苯妥英钠、苯巴比妥和拉莫三嗪中的任意一种或多种；
优选的，所述药物浓度监测模块，实施癫痫患者血药浓度检测的步骤具体包括：以标准品制作标准曲线定量，同时采用质控品进行质控，以及基于HPLC-MS/MS对待测血液样品进行检测；
优选的，采用定量下限、低、中和高四个水平的质控品进行质控或采用低、中和高三个水平的质控品进行质控；
优选的，上述抗癫痫药物质控品的定量下限、低、中和高浓度均分别为0.1、0.25、2.5和25ng/mL；
优选的，所述待测血液样品的配制方法为：将试验样品与同位素内标工作液混合，离心取上清制得；
优选的，所述试验样品为受试者血液样品，包括全血、血浆或血清，进一步优选为血浆；
优选的，所述同位素内标工作液可以为上述9种抗癫痫药物同位素内标工作液中的任意一种或多种的混合；
优选的，所述同位素内标工作液制备方法可以为：将抗癫痫药物的同位素内标原料药使用二甲基亚砜溶解，制成内标储备液，然后采用沉淀蛋白溶剂稀释得同位素内标工作液；
优选的，所述沉淀蛋白溶剂为含有甲酸的乙腈与甲醇的混合溶液，所述乙腈和甲醇的用量体积比为2～4:1～3，优选为3:2，所述甲酸含量为0.05～0.3％，优选为0.1％；
优选的，所述HPLC-MS/MS对待测样品进行检测具体方法为：
液相色谱条件包括：
采用梯度洗脱，流动相A相：水(2mM乙酸铵，0.1％乙酸)，流动相B相：乙腈(2mM乙酸铵，0.1％乙酸)；
色谱柱为C18色谱柱；流动相流速为0.3～0.5ml/min(优选为0.4ml/min)；柱温为25～40℃(优选为35℃)；进样量1～10μL(优选为5μL)；
优选的，所述色谱柱为CAPCELL PAC-MGⅢC18色谱柱；
优选的，梯度洗脱方式具体为：0-1.5min，流动相B 5-5％；1.5-1.9min，流动相B 5-70％；1.9-2.0min，流动相B 70-95％；2.0-3.8min，流动相B 95-95％；3.8-3.9min，流动相B95-5％；3.9-5.5min，流动相B 5-5％；
质谱条件包括：
离子源：电喷雾(ESI)；扫描方式：多反应监测(MRM)；离子化方式：正离子；离子源电压：5000V；离子源温度：650℃；气帘气：15psi；雾化气：45psi；辅助气：55psi。
8.如权利要求6所述的一种指导癫痫疾病个体化精准用药的系统，其特征是，所述给药方案优化模块，根据复查结果、患者个体使用抗癫痫药物后的体内药物浓度水平、代谢能力信息和精准用药数据库中的数据；分析评估初步给药方案的治疗效果，对初步给药方案进行优化调整，得到优化的给药方案。
9.如权利要求6所述的一种指导癫痫疾病个体化精准用药的系统，其特征是，所述给药方案优化模块，使用决策树模型优化给药方案，对血药浓度的结果进行优化；
当检测药物的血药浓度低于参考范围时，进行剂量增加；
当检测药物的血药浓度高于参考范围时，进行剂量减少；
当检测药物的浓度在血药浓度参考范围内时，判断临床症状是否有改善，如果有改善，则保持药物及剂量；如果没有改善，则设定目标血药浓度，增加药物剂量，如果增加药物剂量后依旧没有改善，则考虑联合用药；如果增加药物剂量后有改善，则保持药物及剂量；
所述最终报告生成模块，包括：患者疾病信息、用药信息、药物基因检测信息、初步给药信息、调整后药物信息、调整后药物的剂量信息、调整后药物的给药频次和调整后药物的给药方式信息写入疾病模板并输出。
10.一种指导癫痫疾病个体化精准用药的系统，其特征是，包括：
患者基本信息获取模块，其被配置为：获取患者的基本信息；
药物基因组检测模块，其被配置为：采用PGx试剂盒，实施癫痫患者药物基因检测，获取患者的抗癫痫药物基因的多态性信息；
精准用药数据库，其被配置为：存储药物基因组学数据、药物代谢动力学数据及药物效应动力学数据；
初步给药方案制定模块，其被配置为：根据患者的基本信息、患者的抗癫痫药物基因的多态性信息和精准用药数据库存储的信息；基于输入信息与数据库匹配原则，结合定制方案的决策树方法，将初步给药方案生成报告；
治疗信息更新模块，其被配置为：获取初步给药方案和治疗后的复查结果数据；
药物浓度监测模块，其被配置为：实施癫痫患者血药浓度检测，获取并存储患者个体使用抗癫痫药物后的体内药物浓度水平和代谢能力信息数据；
给药方案优化模块，其被配置为：调用治疗信息更新模块中信息、药物浓度监测模块中结果信息，根据匹配原则，与精准用药数据库中的信息进行匹配；匹配结果使用优化给药决策树模型进行处理，得到优化的给药方案；
最终报告生成模块，其被配置为：调取优化后的给药方案信息，并将信息写入报告模板，输出生成报告。
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