CN106706834A - 一种高效薄层色谱和可调节的表面增强拉曼光谱联用快速检测奶制品中多种生物胺的方法 - Google Patents
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Abstract
一种高效薄层色谱和可调节的表面增强拉曼光谱联用快速检测奶制品中多种生物胺的方法，属于食品检测技术领域。本发明包括纳米银胶的制备、样品的制备、高效薄层色谱分离和HPTLC‑SERS检测等步骤。本发明建立了一种识别多种生物胺（酪胺、腐胺和尸胺）结构的HPTLC‑SERS检测方法，具有经济、快速、简便的优点；同时新型增效剂的选择性增强功能拓宽了HPTLC‑SERS检测的适用范围，为直接快速检测化学衍生化的色谱板开辟了新的视野。
Description
技术领域
本发明涉及一种高效薄层色谱和可调节的表面增强拉曼光谱联用快速检测奶制品中多种生物胺的方法，具体涉及一种荧光标记生物胺分子和使用增效剂抑制荧光衍生试剂引起的掩蔽效应，属于食品检测技术领域。
背景技术
生物胺（biogenic amines）是氨基酸脱羧的产物，是评价食品腐败程度的一个重要指标。食物中含有高水平的生物胺严重危及消费者，其潜在的毒性能造成消费者过敏。因此，研究一种快速检测食品中生物胺残留的方法，成为监管食品行业中生物胺毒性危害亟待解决的问题。
在过去的几年中，高效薄层色谱作为高效且简易的分离平台受到广泛关注。但因其难以区分色谱分离结果邻近物质的干扰，在定性方面还需配合其他检测方法使用。高效薄层色谱与先进的检测方法联用已成为分析化学中一种新的跨学科的前沿技术，如质谱、原子荧光光谱、传感器和拉曼光谱等联用。特别是，高效薄层色谱（HPTLC）和表面增强拉曼光谱（SERS）的联用因其良好的特异性和简便性而广受欢迎。SERS除了具有超高灵敏度（甚至单分子）外，其不仅保留了常规拉曼光谱的优点，而且蕴含目标化合物结构的精细指纹信息，因此在常规筛选任务中SERS检测甚至可以不用标准物质。这些优势最终使HPTLC-SERS的适用性大为提升，因此非常适合基于分子结构信息的鉴别。
因此，本发明利用薄层色谱和表面增强拉曼光谱高效联用的方法，根据生物胺自身日光和紫外均不可见的缺陷，引入荧光标记生物胺分子的印迹，并使用增效剂抑制荧光衍生试剂引起的掩蔽效应，建立一种简便快速的生物胺测定方法。
发明内容
本发明的目的在于克服上述不足之处，提供一种高效薄层色谱和可调节的表面增强拉曼光谱联用快速检测奶制品中多种生物胺的方法。
按照本发明提供的技术方案，一种高效薄层色谱和可调节的表面增强拉曼光谱联用快速检测奶制品中多种生物胺的方法，其直接将表面增强拉曼光谱应用于化学衍生后的高效薄层色谱板，通过滴加一种新型增效剂抑制过度的荧光胺对目标物散射信号的掩蔽效应，调平了荧光衍生后的基线，且明确了多种生物胺分子的特征拉曼指纹图谱。具体检测方法为：
（1）纳米银胶的制备：取5mL的市售纳米银颗粒悬浮液（阿拉丁试剂公司）以4000r/min离心10min后，弃去4.5mL上清液，将剩余0.5mL液体置于混匀器上充分振荡1min，使其重新悬浮，得到10倍浓缩的纳米银胶体；
（2）样品的制备：
a、生物胺的标准溶液的制备：用甲醇为溶剂制备浓度为0.05mg/mL样品；
b、奶酪/酸奶样品中生物胺的提取：称取10g奶制品，加入10mL质量浓度为10%的三氯乙酸水溶液，用匀浆器混成匀浆；在匀浆中加入0.1mL 0.25g/mL NaOH溶液充分振荡混匀，置于3000r/min的离心机上离心5min，取2mL上清液，用0.45μm纤维膜过滤后使用；
（3）高效薄层色谱分离：将每样各2-4μL步骤（2）制备的生物胺的标准溶液及奶酪/酸奶样品提取物用薄层色谱点样仪进行精确点样，点样完成后用展开液展开，上行展开50mm取出硅胶板；用0.1mg/mL的荧光胺的丙酮溶液浸渍衍生，取下硅胶板在80℃平板加热器上加热3min，置于366nm紫外灯的照射下获取硅胶板的图像；
（4）HPTLC-SERS检测：将经过步骤（3）高效薄层色谱分离后所得硅胶板在366nm紫外光的照射下用铅笔标记出可见的荧光条带；在标记区域，用毛细移液管依次滴加步骤（1）制备所得的3μL浓缩纳米银胶体和3μL增效剂，立即用拉曼光谱仪进行扫描，获得目标物质的特征指纹图谱。
步骤（3）所述展开液配置按体积比计为，甲醇︰丙酮︰质量浓度为25%的氨水=3︰7︰0.5。
步骤（4）所述增效剂具体为离子复配增效剂，具体复配配方按质量比如下：磷酸钠5%-10%、硫酸铵0.1%-1 %、α-环糊精10%-30%，其余均为超纯水。
本发明的有益效果：本发明建立了一种识别多种生物胺（酪胺、腐胺和尸胺）结构的HPTLC-SERS检测方法，具有经济、快速、简便的优点；同时新型增效剂的选择性增强功能拓宽了HPTLC-SERS检测的适用范围，为直接快速检测化学衍生化的色谱板开辟了新的视野。
附图说明
图1是实施例1生物胺标准溶液的展开图（上）和对应斑点处拉曼指纹图谱（下）。a、酪胺；b、尸胺；c、腐胺。
图2是实施例2奶酪样品的展开图（左）和多种生物胺对应Rf值处的拉曼指纹图谱（右）：a、奶酪样品中酪胺对应斑点SERS信号；b、奶酪样品中尸胺对应斑点SERS信号；c、奶酪样品中腐胺对应斑点SERS信号。
图3是实施例3酸奶样品的展开图（左）和多种生物胺对应Rf值处的拉曼指纹图谱（右）：a、酸奶样品中酪胺对应斑点SERS信号，b、酸奶样品中尸胺对应斑点SERS信号，c、酸奶样品中腐胺对应斑点SERS信号。
具体实施方式
以下实施例中奶酪和酸奶样品从当地超市购买。
实施例1
（1）纳米银胶的制备：取5mL的市售纳米银颗粒悬浮液（阿拉丁试剂公司）以4000r/min离心10min后，弃去4.5mL上清液，将剩余0.5mL液体置于混匀器上充分振荡1min，使其重新悬浮，得到10倍浓缩的纳米银胶体；
（2）生物胺的标准溶液的制备：用甲醇为溶剂制备浓度为0.05mg/mL的酪胺、尸胺及腐胺标准溶液；
（3）高效薄层色谱分离：将2-4μL步骤（2）制备的生物胺的标准溶液用薄层色谱点样仪进行精确点样，点样完成后用展开液展开，上行展开50mm取出硅胶板；用0.1mg/mL的荧光胺的丙酮溶液浸渍衍生，取下硅胶板在80℃平板加热器上加热3min，置于366nm紫外灯的照明下获取硅胶板的图像；
（4）HPTLC-SERS检测：将经过步骤（3）高效薄层色谱分离后所得硅胶板在366nm紫外光的照射下用铅笔标记出可见的荧光条带；在标记区域，用毛细移液管依次滴加步骤（1）制备所得的3μL浓缩纳米银胶体和3μL增效剂，立即用拉曼光谱仪进行扫描，获得目标物质的特征指纹图谱。
步骤（4）所述增效剂具体为离子复配增效剂，具体复配配方按质量比如下：磷酸钠5%、硫酸铵0.1%、α-环糊精10%，其余均为超纯水。
实施例2
称取10g奶酪样品，加入10mL10%三氯乙酸水溶液用匀浆器混成匀浆。在匀浆中加入0.1mL 0.25g/mL的NaOH溶液充分振荡混匀，置于3000r/min的离心机上离心5min，取2mL上清液，用0.45 μm纤维膜过滤，即可得到排除主要基质干扰的奶酪样品。
采用0.5 MPa氮气为载体，用100μL注射器(CAMAG)将每样各2-4μL的奶酪样品及生物胺标准品用Linomat 5进行精确点样于10×10cm的薄层板上，点样的条带长6mm，条带距离底部8mm，距离左端12mm，条带间距1.7mm。点样完成后用ADC-2 (CAMAG)展开仪展开，展开前，通过在另一槽注入10mL的流动相使缸内达到饱和状态。取10 mL优化后的展开液（甲醇/丙酮/氨水（25%）=3 / 7 / 0.5（v/v）），上行展开50mm取出。置于80℃平板加热器上充分干燥3 min。随后在薄层浸渍装置III(CAMAG)的浸渍缸内注入0.1mg/mL的荧光胺的丙酮溶液，将板以2cm/s垂直速度下降，浸泡2s取出。在80℃平板加热器上加热3min后，置于DD70成像系统(Biostep)上，在366 nm的紫外灯照明下获取硅胶板的图像，并根据生物胺标品展开的Rf值，用铅笔标记出可见的荧光条带和奶酪样品相应Rf处的条带。
在标记区域，用毛细移液管依次滴加3μL浓缩纳米银胶体和3μL增效剂，立即用拉曼光谱仪进行扫描，每个拉曼散射信号平均积分三次，各积分采集时间为10s。在奶酪样品中，酪胺（图2，线a）、尸胺（图2，线b）、腐胺（图2，线c）和它们的标准品（图1）相同Rf值处，结果显示它们有相同的拉曼指纹图谱。
所述增效剂具体为离子复配增效剂，具体复配配方按质量比如下：磷酸钠10%、硫酸铵1%、α-环糊精30%，其余均为超纯水。
实施例3
称取10g酸奶，加入10mL10%三氯乙酸水溶液用匀浆器混成匀浆。在匀浆中加入0.1mL0.25g/mL的NaOH溶液充分振荡混匀，置于3000r/min的离心机上离心5min，取2mL上清液，用0.45 μm纤维膜过滤，即可得到排除主要基质干扰的酸奶样品。
采用0.5 MPa氮气为载体，用100 μL注射器(CAMAG)将每样各2-4μL的酸奶样品及生物胺标准品用Linomat 5进行精确点样于10×10cm的薄层板上，点样的条带长6mm，条带距离底部8mm，距离左端12mm，条带间距1.7mm。点样完成后用ADC-2 (CAMAG)展开仪展开，展开前，通过在另一槽注入10mL的流动相使缸内达到饱和状态。取10 mL展开液（甲醇/丙酮/氨水（25%）=3 / 7 / 0.5（v/v）），上行展开50mm取出。置在80℃平板加热器上充分干燥3min。随后在薄层浸渍装置III(CAMAG)的浸渍缸内注入0.1mg/mL的荧光胺的丙酮溶液，将板以2cm/s垂直速度下降，浸泡2s取出。于80℃平板加热器上加热3min后，置于DD70成像系统(Biostep)上，在366 nm的紫外灯照明下获取硅胶板的图像，并根据生物胺标品展开的Rf值，用铅笔标记出可见的荧光条带和酸奶样品相应Rf处的条带。
在标记区域，用毛细移液管依次滴加3μL浓缩纳米银胶体和3μL增效剂，立即用拉曼光谱仪进行扫描，每个拉曼散射信号平均积分三次，各积分采集时间为10s。在酸奶样品中，酪胺（图3，线a）、尸胺（图3，线b）、腐胺（图3，线c）和它们的标准品（图1）相同Rf值处，结果显示它们有相同的拉曼指纹图谱。
所述增效剂具体为离子复配增效剂，具体复配配方按质量比如下：磷酸钠8%、硫酸铵0.8 %、α-环糊精20%，其余均为超纯水。
Claims (3)
1.一种高效薄层色谱和可调节的表面增强拉曼光谱联用快速检测奶制品中多种生物胺的方法，其特征在于具体步骤如下：
（1）纳米银胶的制备：取5mL的市售纳米银颗粒悬浮液以4000r/min离心10min后，弃去4.5mL上清液，将剩余0.5mL液体置于混匀器上充分振荡1min，使其重新悬浮，得到10倍浓缩的纳米银胶体；
（2）样品的制备：
a、生物胺的标准溶液的制备：用甲醇为溶剂制备浓度为0.05mg/mL样品；
b、奶酪/酸奶样品中生物胺的提取：称取10g奶制品，加入10mL质量浓度为10%的三氯乙酸水溶液，用匀浆器混成匀浆；在匀浆中加入0.1mL 0.25g/mL NaOH溶液充分振荡混匀，置于3000r/min的离心机上离心5min，取2mL上清液，用0.45μm纤维膜过滤后使用；
（3）高效薄层色谱分离：将每样各2-4μL步骤（2）制备的生物胺的标准溶液及奶酪/酸奶样品提取物用薄层色谱点样仪进行精确点样，点样完成后用展开液展开，上行展开50mm取出硅胶板；用0.1mg/mL的荧光胺的丙酮溶液浸渍衍生，取下硅胶板在80℃平板加热器上加热3min，置于366nm紫外灯的照射下获取硅胶板的图像；
（4）HPTLC-SERS检测：将经过步骤（3）高效薄层色谱分离后所得硅胶板在366nm紫外光的照射下用铅笔标记出可见的荧光条带；在标记区域，用毛细移液管依次滴加步骤（1）制备所得的3μL浓缩纳米银胶体和3μL增效剂，立即用拉曼光谱仪进行扫描，获得目标物质的特征指纹图谱。
2.如权利要求1所述一种高效薄层色谱和可调节的表面增强拉曼光谱联用快速检测奶制品中多种生物胺的方法，其特征在于步骤（3）所述展开液配置按体积比计为，甲醇︰丙酮︰质量浓度为25%的氨水=3︰7︰0.5。
3.如权利要求1所述一种高效薄层色谱和可调节的表面增强拉曼光谱联用快速检测奶制品中多种生物胺的方法，其特征在于：步骤（4）所述增效剂具体为离子复配增效剂，具体复配配方按质量比如下：磷酸钠5%-10%、硫酸铵0.1%-1 %、α-环糊精10%-30%，其余均为超纯水。
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| CN201611014152.2A CN106706834B (zh) | 2016-11-18 | 2016-11-18 | 一种高效薄层色谱和可调节的表面增强拉曼光谱联用快速检测奶制品中多种生物胺的方法 |
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Application publication date: 20170524 Assignee: Wuxi Boren Biotechnology Co.,Ltd. Assignor: Jiangnan University Contract record no.: X2023980053934 Denomination of invention: A method for rapid detection of multiple biogenic amines in dairy products using a combination of high-performance thin-layer chromatography and adjustable surface enhanced Raman spectroscopy Granted publication date: 20180424 License type: Common License Record date: 20231225 |
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