DE19709019A1 - Verfahren zur Bestimmung der Verträglichkeit, insbesondere auch der Toxizität von gasförmigen, flüssigen und/oder viskosen Stoffen für den menschlichen oder tierischen Organismus - Google Patents

Description

Insbesondere im medizinischen und pharmazeutischen Bereich, aber auch in anderen Bereichen, beispielsweise Ernährung usw., ist es vielfach notwendig, bestimmte Stoffe, auch gasförmige, flüssige und/oder viskose Stoffe auf ihre Toxizität hin zu bestimmen.

Die heute hierfür üblichen Verfahren sehen zunächst Zellkulturversuche vor, die durch anschließende Tierversuche ergänzt werden müssen, und zwar insbesondere dann, wenn bei den Zellkulturversuchen keine Toxizität festgestellt wird. Anschließend sind eventuell klinische Studien am Menschen erforderlich. Im einzelnen läßt sich der Stand der Technik, wie folgt darstellen:

Zellkulturversuche

Bisher eingesetzte Modellsysteme zur Bestimmung der akuten Toxizität von flüssigen oder partikulären Stoffen basieren auf der Verwendung von Zellkulturen. Adhärent wachsende Zellen sowie nicht-adhärent wachsende Zellen werden für unterschiedliche lange Zeiträume der zu testenden Substanz ausgesetzt, die entweder mit der Nährlösung angeboten wird, oder als Kultursubstrat von den Zellen besiedelt werden soll. Charakteristisch für diese Systeme ist, daß sie mit nur jeweils einen Zelltyp arbeiten. Häufig handelt es sich dabei um unbegrenzt teilungsfähige Zellen, also Zellen mit Tumorcharakteristik.

Sowohl epitheliale Zellinien als auch Zellinien mit Bindegewebscharakteristik werden für diese Versuche eingesetzt. Sie unterscheiden sich in ihren Eigenschaften jedoch deutlich von differenzierten Epithel- oder Bindegewebszellen in menschlichen oder tierischen Organen, da Tumorzellen dedifferenziert sind und nur noch in begrenztem Umfang die typischen zellulären Funktionen differenzierter Zellen ausführen können. Dies ist nach einer der Erfindung zugrunde liegenden Erkenntnis einer der Gründe für die mangelende Übertragbarkeit der in Zellkulturexperimenten gewonnenen Ergebnisse auf die Situation im Organismus. Chronisch toxische Wirkungen können in Zellkultursystemen ohnehin nur ungenügend untersucht werden.

Tierversuche

Haben sich Testsubstanzen in den Zellkultursystemen als nicht toxisch erwiesen, so müssen sie daher auf verschiedene Weise im tierischen Organismus auf ihre Wirkung hin untersucht werden. Doch sind auch Ergebnisse aus Tierexperimenten nur begrenzt übertragbar auf den Menschen. Zwischen dem menschlichem und dem tierischen Organismus gibt es entscheidende Unterschiede im Stoffwechselgeschehen. Einerseits werden Stoffe, die für bestimmte Spezies toxisch sind, vom Menschen ohne weitreichende negative Nebenwirkungen vertragen (Beispiel: Aspirin). Andererseits gibt es eine erhebliche Zahl von Testsubstanzen, die erst in klinischen Studien als für den Menschen toxisch erkannt werden.

Der Nachteil von Tierversuchen besteht somit u. a. darin, daß sie zeitaufwendig sind und ihr Aussagegehalt in Bezug auf den menschlichen Organismus oftmals gering ist. Klinische Versuche am Menschen sind ebenfalls aufwendig und teuer und vielfach nicht durchführbar.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren aufzuzeigen, welches diese Nachteile vermeidet und es ermöglicht, die Verträglichkeit oder Toxizität von gasförmigen, flüssigen und viskosen Stoffen im Labor aktuell für den tierischen oder menschlichen Organismus zu bestimmen.

Zur Lösung dieser Aufgabe sieht das erfindungsgemäße Verfahren vor, daß Organe oder Organteile, die ohne proteolytische Disintegration aus einen menschlichen oder tierischen Körper gewonnen wurden, in einer gradienten Perfusionskammer in Gegenwart einer zu testenden Substanz kultiviert werden, wobei die Gradientenkammer ein oberes und ein unteres Kompartiment bildet, die durch die Organ- oder Gewebeprobe voneinander getrennt sind, und daß das eine Kompartiment der Gradientenperfusionskammer mit einer Nährlösung durchspült wird, während die Organ- oder Gewebeprobe mit der zu testenden Substanz beaufschlagt wird, und zwar bevorzugt über das andere Kompartiment.

Die Auswertung der Testergebnisse erfolgt bei der Erfindung beispielsweise unter Verwendung von Antikörpern oder Antigenen zum Nachweis dafür, ob bestimmte Zellen in der getesteten Organ- oder Gewebeprobe nach dem Test (Kultivieren) noch vorhanden oder während der Behandlung abgestorben sind, und/oder durch mikroskopische Untersuchungen usw.

Bei den Organ- oder Gewebeproben handelt es sich nicht um einfach aufgebaute Zellkulturen, sondern um interaktive Gewebekultursysteme mit den nachfolgend angegebenen Vorteilen:

• 1. Interaktive Gewebekultursysteme setzen sich aus Zellen in organtypischen Differenzierungszustand zusammen. Je nach Gewebetyp besteht für einen Teil der Zellen Kontaktinhibition. Diese Zellen proliferieren nicht. Sie sind eingebettet in eine spezifische extrazelluläre Matrix und bilden strukturierte Zellverbände mit organtypischer Funktion.
• 2. Interaktive Gewebekultursysteme bestehend aus Zellverbänden, die sich aus gleich- und verschiedenartigen Zellen in organspezifischer Matrix zusammensetzen. Damit können interzelluläre Wechselbeziehungen bei der Wirkung toxischer Substanzen zwischen den verschiedenen Zellkomponenten erfaßt werden.
• 3. Teste von toxischen Substanzen in interaktiven Gewebekultursysteme können zur Reduktion der Versuchszahlen beitragen. Zwei wesentliche Vorteile der Erfindung kommen dabei zum Tragen, nämlich:
  Substanzen, die im Zellkultursystem keine toxische Wirkung zeigten, da diese erst durch interzelluläre Wechselwirkungen evident werden, können durch den Einsatz von Gewebekultursystemen frühzeitig von weiteren Tests ausgeschlossen werden. Das interaktive Gewebekulturmodell gemäß der Erfindung ermöglicht die Verwendung humanen Gewebematerials. Damit ist das erfindungsgemäße Verfahren besser als bisherige Verfahren geeignet, Daten, die im Kulturexperiment gewonnen wurden, auf die Situation im menschlichen Organismus zu übertragen. Dadurch wird ebenfalls zu einer Reduktion der Zahl der Experimente beigetragen.

Das interaktive Gewebekultursystem gemäß der Erfindung erfüllt auch folgende Forderungen:

• - Vermeidung von Nekrosebildung in kultiviertem Gewebe
• - Verzicht auf undefinierte Mediumzusätze
• - Erhaltung eines organspezifischen Differenzierungsgrades der Zellen
• - Erhalt der organtypischen Gewebezusammensetzung
• - Möglichkeit zur gezielten basale bzw. apikale Applikation von Testsubstanz.

Die Gewinnung der Organ- oder Gewebeteile erfolgt bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ohne proteolytische Präparation unter Erhalt der organtypischen Gewebezusammensetzung und unter Erhalt eines organspezifischen Differenzierungsgrades der Zellen. Die Gewinnung der Gewebe oder Organproben erfolgt beispielsweise als Gewebeschnitte, z. B. Vibratomschnitte, die grundsätzlich von allen Organen gewonnen werden können, als Zupfpräparate, z. B. Gewebeexplantate aus der Niere, Mucosa-Explantate des Magens. Weiterhin können als Gewebeproben auch ausreichend dünne Gewebeteile, z. B. Retina, Cornea, Haut usw. verwendet werden.

Erst durch die Verwendung der Gradientenperfusionskammer ist eine Aufrechterhaltung der Organstruktur und der Funktion, die an ein funktionierendes Gefäßsystem geknüpft sind, möglich, d. h. eine Desintegration des Gewebes wird vermieden. In einer normalen Kulturschale mit Nährlösung ließe sich das erfindungsgemäße Verfahren nicht durchführen, da eine ausreichende Versorgung mit Nährstoffen und insbesondere Sauerstoff nicht gewährleistet ist. Erst durch die Verwendung der Gradientenperfusionskammer wird vermeiden, daß sich im Gewebe Metabolite anreichern, die natürlicherweise durch das das Organ versorgende Gefäßsystem abgeführt werden. Die Kultivierung einer Gewebeprobe in einer herkömmlichen Kulturschale hat somit Gewebenekrosen zur Folge, wodurch die ursprüngliche Gewebestruktur zerstört wird. Eine Beurteilung, ob dies dann die Folge der Einwirkung einer toxischen Substanz oder die Folge der Kulturbedingungen ist, ist nicht mehr möglich. Diese Nachteile werden bei der Erfindung vermieden.

Von entscheidender Bedeutung für die Wirkung einer zu testenden Substanz kann bei dem erfindungsgemäßen Verfahren auch der Ort der Applikation sein. Epithelzellverbände sind beispielsweise plar organisiert. Die Zellen grenzen mit der apikalen Membran an ein Lumen an, welches je nach Organ sehr unterschiedliche Substanzen enthalten kann (z. B. Harnblase - Urin, Darm - Nahrungsbrei usw.). Die basale Membran der Zellen steht dagegen mit der blutähnlichen Gewebsflüssigkeit in Kontakt. In Abhängigkeit vom Ort der Applikation (basal oder apikal) können Testsubstanzen sehr unterschiedliche Wirkungen auf die Zellen haben, zumal Stoffgradienten in Gewebeteilen die interzellulären Wechselwirkungen wesentlich beeinflussen können.

Der Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, daß toxische Wirkungen nicht nur über den unmittelbaren Kontakt der Testsubstanz mit einem bestimmten Zelltyp ausgelöst werden, sondern vor allem auch über Wechselwirkungen zwischen den verschiedenen Zellen eines Organs vermittelt werden. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden also diese Wechselwirkungen durch die Verwendung von Organ- oder Gewebeproben, die ein interaktives Gewebesystem darstellen, voll berücksichtigt.

Organe sind komplex aufgebaut, sie setzen sich aus mehr als einem Zelltyp zusammen. Die Zellen liegen außerdem in unterschiedlichen Differenzierungsstadien vor. Neben sogenannten Reservezellen, die für den Ersatz abgestorbenen Gewebes benötigt werden, kommen terminal differenzierte Zellen vor, die nicht mehr profilieren, sondern spezifische Funktion erfüllen. In bezug auf die Proliferationsfähigkeit der differenzierten Zellen spricht man von einer Kontaktinhibition. Solange der Gewebeverband unverletzt ist, die spezifische extrazelluläre Matrix intakt ist und die Zellen untereinander in Verbindung stehen, verbleiben sie in ihrem hohen Differenzierungszustand. Nur zum Verschluß von Wunden oder zur Regeneration werden die Reservezellen aktiviert. Der Anteil der zur Proliferation befähigten Reservezellen und die Lebensdauer der terminal differenzierten Zellen ist organspezifisch. Während die Epithelzellen der Haut innerhalb kurzer Zeit ersetzt werden, wird für die Epithelzellen der Niere eine mehrjährige Lebens- und Funktionsdauer angenommen. Werden Gewebe in Gegenwart mitogener Nährmedien kultiviert, wirkt dies stimulierend auf die Reservezellen. Die Proliferation der Zellen wird angeregt, nicht jedoch ihre Differenzierung. Dadurch verändert sich das organtypische Verhältnis von proliferierenden zu differenzierten Zellen, und die typische Organfunktion wird eingeschränkt. Um organtypische Bedingungen in der Gewebekultur möglichst nahe zu kommen, muß nach der Erkenntnis der Erfindung Gewebematerial und Nährmedium verwendet werden, dessen zelluläre Zusammensetzung in bezug auf den Differenzierungsgrad den Verhältnissen im Organ entspricht.

Die Funktion des Organs wird sowohl durch dessen Einzelkomponenten als auch durch die Wechselbeziehung zwischen den verschiedenen Zelltypen bestimmt. Nicht nur Zellen gleichen Typs stehen miteinander in Kontakt, sondern auch die Zellen der verschiedenartigen Gewebekomponenten treten miteinander in Wechselwirkung. Von entscheidender Bedeutung für die organtypischen Wechselbeziehungen sind darüber hinaus nicht nur die zellulären Komponenten, sondern auch die organspezifischen extrazelluläre Matrix. Erst durch Zusammenwirken der verschiedenen Gewebekomponenten wird Organfunktion möglich. Diese Komplexität, die für die Bestimmung der Substanzwirkung von entscheidender Bedeutung sein kann, wird weder von einfachen Zellkultursystemen noch von Ko-Kultursystemen erreicht.

Die Erfindung trägt also dem Umstand Rechnung, daß im Organismus ein Stoff nicht nur auf einen einzelnen Zelltyp einwirkt, sondern prinzipiell alle Zellen des Körpers mit der Substanz oder mit deren Stoffwechselprodukten in Kontakt kommen können. Für die Toxizität eines Stoffes ist also nicht nur dessen akute Wirkung auf eine einzelne Zelle entscheidend. Vielmehr sind es die interzellulären Wechselwirkungen zwischen den verschiedenen Zelltypen, die beeinflußt von der Testsubstanz, für deren Wirkung im Organismus verantwortlich sind.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können durch Verwendung von Proben eines tierischen Gewebes oder von Proben eines menschlichen Gewebes Testbedingungen geschaffen werden, die eine unmittelbare Übertragbarkeit der Kultur- bzw. Testergebnisse auf die Verhältnisse im tierischem und menschlichem Organismus ermöglichen.

Die Erfindung wird nachstehend im Zusammenhang mit der Figur, die in vereinfachter Darstellung einen Schnitt durch eine Gradientenperfusionskammer 1 wiedergibt, näher erläutert.

Die in der Fig. 1 dargestellte Perfusionskammer 1 besteht im wesentlichen aus zwei Gehäuseteilen 2 und 3, die bei geschlossenem Gehäuse einen nach außen hin geschlossenen Gehäuseinnenraum bilden. Zwischen den beiden Gehäuseteilen 2 und 3 ist eine beispielsweise von einem Haltering 4 gebildete Halterung vorgesehen, an der die Gewebe- oder Organprobe 5 eingelegt und fixiert wird, insbesondere auch in der Form, daß ein Abkugeln der Organprobe 5 verhindert wird. Durch den Halter 4 und die Organ- oder Gewebeprobe 5 wird der Innenraum der Kammer 1 in zwei Teilräume 6 und 7 unterteilt, die jeweils einen Einlaß 8 zum Zuführen der Nährlösung oder der Testsubstanz (zu testenden Substanz) sowie einen Auslaß 9 zum Abführen der Nährlösung mit den Stoffwechselprodukten bzw. der Testsubstanz aufweisen. Für die Figur wurde angenommen, daß der obere Teilraum 6 mit der Testsubstanz beaufschlagt wird. Hierfür ist der Einlaß 8 dieses Teilraumes über eine Schlauchleitung 10 mit einer nicht dargestellten Aufgabe für die Testsubstanz verbunden. Der untere Teilraum 7 wird von der Nährlösung durchströmt. Der dortige Einlaß 8 ist daher über eine Schlauchleitung 11, eine Mehrfach-Schlauchpumpe 12 mit einem Vorrat 13 für die Nährlösung verbunden Der Auslaß 9 des unteren Teilraumes 7 ist über eine nicht dargestellte Schlauchleitung an einem Auffangbehälter zum Auffangen von verbrauchter Nährlösung angeschlossen. Bei jedem Test werden bevorzugt mehrere Gewebeproben 5 gleichzeitig kultiviert und teilweise mit der Testsubstanz beaufschlagt, teilweise zur Kontrolle aber auch mit einem neutralen Medium aus einem Vorratsbehälter 15. Die Schlauchleitungen 11 sämtlicher Kammern 1 sind dann beispielsweise über die gemeinsame Schlauchpumpe 12 geführt.

Dadurch, daß insbesondere der untere Teilraum 7 ständig von einem Mediumstrom durchströmt wird, werden Metabolite und parakrine Faktoren ständig entfernt. Weiterhin ist eine optimale Sauerstoffversorgung der jeweiligen Gewebeprobe 5 gewährleistet. Bei dem Kulturmedium (Nährstofflösung) ist auf das Testergebnis beeinflussende Zusätze, insbesondere auf fötale Seren (fötales Kälberserum), Gewebeextrakte usw. verzichtet, die bei Nährlösungen für Kulturen in Kulturschalen benötigt werden und die aus einer Vielzahl von Proteinen, Wachstumsfaktoren und anderen nicht genau definierten Komponenten bestehen, welche das Testergebnis beeinträchtigen oder aber zu nicht kontrollierbaren Interferenzen mit der jeweiligen Testsubstanz führen könnten. Durch die Verwendung der Perfusionskulturtechnik werden auch Nekrosen minimiert.

Die Verwendung der Perfusionskammer gestattet es weiterhin auf einfache Weise auch, die jeweilige Testsubstanz wahlweise basal oder apikal auf die Gewebeprobe 5 einwirken zu lassen. Als Testsubstanz sind gasförmige, flüssige oder viskose Substanzen möglich.

Als Beispiel wird nachfolgend für das erfindungsgemäße Verfahren der Nachweis der toxisischen Wirkung von Glaskörperersatzstoffen in der renalen Explantatkultur wiedergegeben.

Hintergrund

Glaskörperersatzstoffe werden, wie der Name sagt, zum Ersatz des verletzten oder geschädigten Glaskörpers in der Augenheilkunde eingesetzt. In dem vorliegenden Beispiel wurden zwei dieser Ersatzstoffe (Stoff Perfluorphenantren und Perfluordecalin) untersucht. Die Stoffe waren in einem Zellkultursystem getestet worden. Dieser Test gab keine Hinweise auf toxische Wirkungen der Glaskörperersatzstoffe. Ein Test des Stoffes Perfluorphenantren im Kaninchenauge resultierte jedoch in weitreichenden Veränderungen des Blutgefäßsystems im Bereich der Retina, sowie einer erhebliche Schädigung des Auges. Der Stoff Perfluordecalin zeigte eine gute Verträglichkeit im Tierversuch. Schädigungen der Retina oder anderer Teile des Auges wurden nicht beobachtet.

Zur Toxizitätstestung dieser Substanzen wurde ein interaktives Gewebekultursystem etabliert. Das Kultursystem sollte Auskunft darüber geben, ob die gefäßverändernde Wirkung des Stoffes Perfluorphenantren bereits in vitro feststellbar ist. Als Testgewebe wurden Explantate von neonatalen Kaninchennieren gewählt. Antikörper zum Nachweis von Gefäßen in Kaninchengeweben stehen in unserem Labor zur Verfügung. Außerdem weist das Gefäßsystem in diesem Gewebe einen außerordentlich hohen räumlichen Ordnungsgrad auf. Der Strukturerhalt des Gefäßsystems nach Applikation der Testsubstanz war ein Parameter zur Beurteilung der toxischen Wirkung in diesem Test.

Material und Methoden

Präparation des Gewebes: Ein bis drei Tage alte Kaninchen wurden durch zervikaler Dislokation getötet. Die Präparation von Organexplantaten erfolgte unmittelbar nach der Entnahme der Nieren.

Die Nieren neonataler Kaninchen ist noch nicht vollständig ausgereift. Im äußersten Bereich des Organs unmittelbar unter der Organkapsel gelegen, werden neben embryonalem Gewebe alle Nephron-Entwicklungsstadien vorgefunden. Aus diesem Bereich wurden mikrochirurgisch Organexplantate präpariert. Dazu wurden die Nieren der Länge nach halbiert. Mit einer feinen Pinzette konnte nun die dünne Organkapsel abgezogen werden. Mit der Organkapsel trennte man auch das noch in der Entwicklung befindliche Nierengewebe ab. Proteasen wurden bei dieser Präparationsmethode nicht eingesetzt, d. h. die organtypische extrazelluläre Matrix sowie die interzellulären Verbindungen blieben intakt. Die Organexplantate wurden dann auf ein Halteringsystem aufgespannt.

Kultur der Nierenexplantate: Durch die Verwendung eines Halteringsystems war es möglich Gewebexplantate für die Versuche zu verwenden, die nicht durch proteolyteische Desintegration gewonnen worden waren. Das Gewebestück wurde in der entsprechenden Größe präpariert und im Haltering fixiert. Eine proteolytische Desintegration des Gewebes, wie sie für die Kultur in herkömmlichen Kulturschaleneinsätzen notwendig sein kann, wurde nicht durchgeführt. Das im Haltering aufgespannte Gewebestück konnte mit der Gewebeoberseite oder der Gewebeunterseite mit der Testsubstanz in Kontakt gebracht werden. Als Gewebeoberseite wurde die Seite definiert, die von Organkapsel bedeckt war. Die Gewebeunterseite war die durch die Präparation freigelegte Seite des Gewebes. Die so vorbereiteten Gewebeexplantate wurden unter ständigem Mediumdurchstrom kultiviert. Die Verwendung der Perfusionskulturtechnik ermöglichte in diesem Fall den vollständigen Verzicht auf Zusätze von fötalem Kälberserum, adultem Serum oder Gewebeextrakten. Das Medium besteht aus einem kommerziell erhältlichen Grundmedium (Iscove's Modified Dulbecco's Medium, IMDM), dem die Hormone Aldosteron (10^-7 M) und 1.25-Dihydroxyvitamin D₃ (10^-9 M) zugegeben worden waren. In Gegenwart dieser Hormone bleibt die Struktur des renalen Gewebes vollständig erhalten. Nekrosen wurden auch nach Kulturzeiten von mehr als 10 Tagen nicht beobachtet.

Zur Perfusionskultur wurden die aufgespannten Explantate 5 (Organproben) in die Gradientenkammer eingesetzt, so daß ein oberes und ein unteres Kompartiment 6 bzw. 7 gebildet sind, die durch das Gewebe 5 voneinander getrennt sind. Das obere Kompartiment 6 wurde mit der jeweiligen Testsubstanz gefüllt und in diesem Experiment nicht durchströmt, da die Testsubstanz von viskoser Konsistenz war. Eine Durchströmung mit Testsubstanz wäre aber bei der Applikation von flüssigen oder gasförmigen Stoffen möglich.

Das untere Kompartiment 7 war mit Nährlösung gefüllt, die kontinuierlich durch dieses Kammerkompartiment gepumpt wurde. Die Mediumvorratsflasche 13 wurde über die Schlauchverbindung 11 mit dem Einlaß 8 der unteren Kammer 7 verbunden. Der Kammerausfluß 9 wurde an die Abfallflasche angeschlossen. Die Vorratsflasche 13 wurde während der gesamten Kulturzeit bei 4°C gelagert. Der zuführende Schlauch 11 wurde in die 12 eingelegt, die eine konstante Mediumdurchspülung der Kammer mit 1 ml/h gewährleistete. Diese Perfusionsrate hat sich für die Kultur renalen Gewebes als gut geeignet erwiesen. Es sind prinzipiell auch andere Flußraten möglich.

In das obere Kammerkompartiment 6 wurde die Testsubstanz (Stoff Perfluorphenantren, Stoff Perfluordecalin) gefüllt, so daß das Gewebestück 5 einseitig von der Nährlösung erreicht wurde, während die gegenüberliegende Gewebeseite mit der Testsubstanz in unmittelbarem Kontakt stand. Der Kontrollansatz bestand darin, daß dort das obere Kammerkompartiment 6 nicht mit der Testsubstanz, sondern mit Grundmedium gefüllt wurde.

Ein weiterer Experimentansatz wurde so ausgelegt, daß bei der dortigen Perfusionskammer 1 die Testsubstanz im unteren Kammerkompartiment 7 plaziert wurde, während die Nährlösung durch das obere Kompartiment 6 gepumpt wurde. Die Perfusionskammern 1 wurden dann auf einer 37°C warmen Heizplatte plaziert und das Gewebe für 24 Stunden unter kontinuierlichem Mediumdurchstrom kultiviert.

Nach der Kultur wurden die Explantate kurz in Pufferlösung gespült und in flüssigem Stickstoff eingefroren.

Lichtmikroskopisches Auswertungsverfahren: Als Kriterien zur Beurteilung der toxischen Wirkung der jeweiligen Testsubstanz wurden zwei Parameter herangezogen:

• 1. Die verschiedenen Zelltypen eines Organs sind gekennzeichnet durch die Expression typischer Moleküle, die mit Hilfe spezifischer Antikörper nachgewiesen werden können. Endothelzellen in der Kaninchenniere tragen ebenfalls solche Moleküle.
  Zum Nachweis von Endothelzellen wurde in unseren Experimenten der Antikörper EC1 eingesetzt. Das EC1-Antigen wird ausschließlich von Endothelzellen exprimiert. Sterben die Endothelzellen ab, kann das EC1-Antigen im Gewebe nicht mehr nachgewiesen werden.
• 2. Das sich entwickelnde Gefäßnetz der Niere ist von einem außergewöhnlich hohen räumlichen Ordnungsgrad gekennzeichnet. Diese charakterisitische Struktur wird nur in einem distinkten Differenzierungszustand des Gewebes beobachtet. Sie ist Ausdruck der koordinierten Entwicklung der verschiedenen Organkomponenten der Niere. Der Erhalt der dreidimensionalen Struktur des Gefäßnetzes im Explantat nach Applikation der Testsubstanz war ein weiteres Kriterium zur Beurteilung der Toxizität der Substanz.

Zum Nachweis endothelialer Antigene im histologischen Präparat wurde die indirekte Immunperoxidase-Markierung eingesetzt. Bei diesem Verfahren wurde der murine, monoklonale Antikörper EC1 als Primärantikörper zum Nachweis von Endothelzelle verwendet. Die Antikörperbindung wurde dann in einem zweiten Schritt durch markierte spezies-spezifische Sekundärantikörper nachgewiesen.

Kontrollen

Die Spezifität der Antikörperreaktion wurde durch verschiedene Kontrollansätze abgesichert. Zum einen wurden Kontrollschnitte mitgeführt, die nicht mit dem Primärantikörper, aber mit allen anderen verwendeten Fixantien, Puffern und Antikörperkonjugaten behandelt worden waren. Außerdem wurden in den Experimenten auch Schnitte mit irrelevanten Primärantikörpern der gleichen Klasse bzw. Subklasse des spezifischen Antikörpers inkubiert. Auch murine Präimmunseren wurden zur Kontrolle verwendet.

Ergebnis

Beispielhaft werden hier die Ergebnisse für die Applikation der Testsubstanzen im unteren Kammerkompartiment wiedergegeben. Renale Explantate, die mit dem Stoff Perfluordecalin für 24 Stunden kultiviert worden waren, zeigten ebenso wie die Kontrollexplantate einen optimalen Erhalt der räumlichen Organisation des Gefäßnetzwerkes. Im Gegensatz dazu war das Gefäßnetzwerk, das für 24 Stunden dem Stoff Perfluorphenantren ausgesetzt war, weitgehend aufgelöst. Einzelne Endothelzellen waren jedoch nachweisbar, d. h. die Expression des EC1-Antigens wurde durch die Inkubation des Gewebes mit dem Stoff Perfluorphenantren nicht beeinflußt. Die destruktive Wirkung des Stoffes Perfluorphenantren auf den Strukturerhalt des Gefäßnetzwerkes war jedoch eindeutig. Darüber hinaus zeigte das gesamte Gewebestück strukturelle Veränderungen. Die Ergebnisse der Versuche sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßt.

Nachweis der toxischen Wirkung von Glaskörperersatzstoffen in der renalen Explantatkultur

Nachweis der toxischen Wirkung von Glaskörperersatzstoffen in der renalen Explantatkultur

Diskussion

Der Test der Glaskörperersatzstoffe Perfluorphenantren und Perfluordecalin an renalen Explantaten in vitro bestätigte überzeugend die Ergebnisse, die nach Applikation dieser Substanzen in das Kaninchenauge gewonnen wurden. Während Perfluordecalin keine Schädigung der Retina und des Auges hervorrief, zeigte das Gefäßsystem der Retina nach Applikation von Perfluorphenantren wesentliche Veränderungen. Auch das Gefäßsystem in den renalen Explantaten war bereits nach 24-stündiger Inkubation mit Perfluorphenantren in Auflösung begriffen. Sowohl die Kontrollexplantate als auch Explantate die mit Perfluordecalin inkubiert wurden, wiesen nach 24 Stunden Kultur einen exzellenten Erhalt des Gefäßsystems auf. Dieses Ergebnis zeigt deutlich, daß interaktive Gewebekultursysteme erfolgreich zum Nachweis toxischer Wirkungen eingesetzt werden können.

Bei der Testung des Stoffes Perfluorphenantren an Tumorzellen waren keine toxischen Wirkungen der Substanz aufgefallen. Die Bedeutung der zellulären Interaktion für die Ausprägung der toxischen Wirkung einer Substanz wird durch diese Diskrepanz eindrucksvoll unterstrichen. Zellkultursysteme sind zum Nachweis akuter toxischer Wirkungen hervorragend geeignet. Sie erlauben eine schnelle Überprüfung der direkten toxischen Wirkung. Beruht die Toxizität eines Stoffes jedoch auf zellulären Wechselwirkungen müssen andere Systeme zur Analyse genutzt werden.

Die hier exemplarisch beschriebenen Kulturbedingungen können nach Bedarf variiert werden. Variation der Mediumflußraten, unterschiedliche ausgedehnte Kulturzeiträume, sowie eine andere Mediumzusammensetzung je nach Erfordernis des Gewebes sind möglich und auf einfache Weise anpaßbar. Neben den hier beschriebenen Zupfpräparaten können auch Gewebeschnitte oder Organteile in Kultur genommen werden.

Ebenso können andere Methoden zur Auswertung herangezogen werden. Neben transmissions- und rasterelektronenmikroskopischen Techniken sind auch in situ- Hybridisierung, sowie biochemische und histochemische Nachweise denkbar. Eine wesentliche Vereinfachung der Auswertung kann durch Messung von Molekülen im Kulturüberstand erreicht werden. Beispielsweise könnte der Nachweis der Zunahme apoptotischer Zellen nach Applikation einer Testsubstanz über die Untersuchung des Kulturüberstandes mit Hilfe von Apoptosemarkern und geeigneten Analysesystemen durchgeführt werden.

Für die hier beschriebenen Versuche wurden Explantate der neonatalen Kaninchenniere verwenden. Prinzipiell kann mit diesem System jedes Gewebe kultiviert werden. In unserem Labor zeigten erste Experimente mit Gewebe aus dem Kaninchenmagen, daß auch dieses Gewebe mit gutem Erfolg über lange Zeiträume kultiviert werden kann. Die hier beschriebene Verwendung einer Gradientenperfusionskammer zur gezielten apikalen bzw. basalen Applikation von toxischen Substanzen ist auch für andere Gewebe (z. B. Magen. Haut, Cornea, Retina) möglich.

Für die hier beschriebenen Experimente wurde eine Kulturdauer von 24 Stunden gewählt. Es sind auch kürzere oder längere Kulturzeiträume mit diesem System möglich.

Vorstehend wurde davon ausgegangen, daß die Gewebeprobe vor der Auswertung zur Verbesserung der Lagerung eingefroren wird. Grundsätzlich ist es auch möglich, die Gewebeprobe nach ihrer Kultivierung sofort auszuwerten.

Für das Auswertverfahren sind auch andere Techniken geeignet, beispielsweise automatisierbare Testsysteme, z. B. ein dem Fachmann unter ELISA bekanntes Testsystem. Anstelle des oben genannten EC1-Antigen können zur Auswertung auch andere Marker verwendet werden, und zwar zum Nachweis proliferierender und/oder apoptotischer Zellen.

Bezugszeichenliste

1

Perfusionskammer

2

,

3

Gehäuseteil

4

Halterung

5

Gewebe- oder Organprobe

6

,

7

Teilraum

8

Einlaß

9

Auslaß

10

,

11

Schlauchleitung

12

Schlauchpumpe

13

,

14

Vorratsbehälter

Claims (9)

1. Verfahren zur Bestimmung der Verträglichkeit, insbesondere auch der Toxizität von gasförmigen, flüssigen und/oder viskosen Stoffen für den menschlichen oder tierischen Organismus, dadurch gekennzeichnet, daß eine ohne proteolytische Disentegration gewonnene Organ- oder Gewebeprobe in eine Gradienten-Perfusionskammer (1) derart eingebracht wird, daß im Inneren der Kammer wenigstens zwei Teilräume (6, 7) gebildet sind, die durch die Gewebeprobe voneinander getrennt sind, daß die Gewebeprobe (5) über eine Kammer (7) mit einer Nährlösung versorgt wird, und daß die Gewebeprobe (5) über wenigstens eine der beiden Kammern (6, 7) mit dem zu testenden Stoff beaufschlagt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Gewebeprobe (5) über die eine Kammer (7) mit einer Nährlösung versorgt und über die andere Kammer (6) mit dem zu testenden Stoff beaufschlagt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Gewebeprobe als Gewebeschnitt oder als Zupfpräparat aus einem lebenden tierischen oder menschlichen Gewebe gewonnen wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Gewebeprobe ein dünnes Gewebeteil, z. B. Retina, Cornea, Haut verwendet wird

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Auswertung der Gewebeprobe nach dem Kultivieren unter Verwendung von Antigenen erfolgt, die jeweils ausschließlich von einem organtypischen, differenzierten Zelltyp exprimiert werden.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß nach dem Kultivieren ein mikroskopisches, vorzugsweise lichtmikroskopisches Aus- oder Bewerten der Organprobe erfolgt.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Gewebeprobe (5) nach einer Kultivier- oder Behandlungsdauer in einer Pufferlösung gespült und anschließend schockgefroren, vorzugsweise in flüssigem Stickstoff eingefroren wird.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zur Auswertung Marker zum Nachweis proliferierender und/oder apoptotischer Zellen verwendet werden.

9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zur Auswertung ein EC1-Antigen verwendet wird, welches ausschließlich von Endothelzellen exprimiert wird.