DE60126815T2 - Herstellung von geschichteten und nach zelltyp geordneten geweben in vitro - Google Patents
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Description
- Verwandte Anmeldungen
- Diese Erfindung beansprucht die Priorität der Anmeldung U.S. Provisional Application Nr. 60/254,781, die am 8. Dezember 2000 eingereicht wurde.
- Gebiet der Erfindung
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein geschichtetes Gewebe, das in vitro kultiviert wird, also eine Gewebekultur. Insbesondere betrifft die Erfindung ein geschichtetes Gewebe, das gebildet wird, indem Zellen eines homogenen Zellgemischs nach Zelltyp in einzelne Schichten geordnet werden, die durch eine Basalmembran verbunden sind. Verfahren zum Bilden und Verwenden des in vitro nach Zelltyp geordneten und geschichteten Gewebes werden ebenfalls beschrieben.
- Hintergrund der Erfindung
- Fortschritte der Gewebekulturtechnik haben zur Entwicklung von künstlichen Geweben und vielversprechender Forschung zur Entwicklung künstlicher Organe geführt. Künstliche Gewebe sind jedoch im allgemeinen in vivo ihrem natürlichen Gegenstück noch unterlegen. Die homöostatische Regulation und viele spezifische Zellwechselwirkungen, die die Zellproliferation und -organisation steuern, gehen zum Beispiel verloren, so dass in vielerlei struktureller Hinsicht das künstliche und das native Gewebe nicht gleichwertig sind. Der Zusatz verschiedener Hormone und Wachstumsfaktoren zu Kulturmedien hat darin geholfen, in vivo-Bedingungen näher zu simulieren, bleibt jedoch eine ungenügende Abhilfe.
- Das Kokultivieren von Keratinozyten und Fibroblasten ist beispielsweise in Leigh et al. (1994), The Keratinocyte Handbook, Cambridge University Press, Großbritannien, als "antagonistisch" dokumentiert worden, indem es in einem übermäßiges Wachstum von Fibroblasten resultiere. In einem Ansatz haben Forscher versucht, das Fibroblastenwachstum in Kultur durch die Verwendung von bestrahlten Fibroblasten in Fütterungsschichten (engl. „feeder layers") zu beschränken, eine wesentliche Verbesserung der Epithelstruktur und korrekte Expression von Differenzierungsmarkern wurde jedoch nicht gefunden. Gegenwärtig wird kultiviertes Epithel erzeugt, indem organtypische Kulturtechniken verwendet werden (Hansbrough et al., Z4M4 262: 2125–2130 (1989); Cooper et al., Surgery, 109: 198–207 (1991); und Boyce et al., Plast. Reconstr. Surg, 91: 632–641 (1993)), oder Verfahren, die eine getrennte Bildung von Epidermis- und Hautschichten und anschließendes übereinanderschichten verwenden, oder indem man sich beim Bilden der Keratinozyten- und/oder Fibroblastenschicht auf eine synthetische Auflage verlässt (Yannas et al., Science, 215: 174 (1982)). Bei all diesen Techniken werden die Epithelgewebe durch Verwenden einer vorgeformten Auflage gebildet.
- Des weiteren werden derzeit Produkte vermarktet, die künstliche Gewebe verwenden. Beispielsweise ist Dermagraft® (Advanced Tissue Sciences, La Jolla, CA) ein Polymilchsäure-, Polyglykol- oder Polygalaktosidmaterial, auf dem Fibroblasten kultiviert werden. Autologe Keratinozyten werden dann auf diese Materialien ausgesät.
- GraftSkin® (Organogenesis, Inc., Boston, MA) ist ein Produkt, bei dem Fibroblasten auf einem auf Kollagen basierenden Substrat kultiviert werden.
- AlloDerm® (Life Cell Corp., The Woodlands, TX) stellt eine humane oder Schweinehaut dar, in der die Basalmembran und die dermale Matrix intakt bleiben. Das Gewebe wird bei etwa –80°C gelagert, bis zur Verwendung bereit, dann vor Anwendung an einem Patienten mit autologen Fibroblasten und Keratinozyten besät.
- Diese und die meisten anderen in der Entwicklung befindlichen Produkte erlauben jedoch nicht die in vitro Rekonstruktion einer funktionalen epidermal-dermalen Kontaktstelle oder einer Basalmembran. Daher besteht eine Neigung zum Auftreten von Zergliederung oder „Blasenbildung" zwischen Keratinozyten- und Fibroblastenschichten.
- Ein weiteres Verfahren, das in der US Patentanmeldung der Veröffentlichungsnummer US 2001/0048917 beschrieben ist, betrifft die in vivo Bildung eines künstlichen geschichteten Gewebes, das durch Ordnen von Keratinozyten und Fibroblasten aus einem homogenen Gemisch von Zellen in einzelne epidermale, dermale und basale Keratinocytenschichten gebildet wird. Das auf diese Weise erzeugte Gewebe konnte jedoch nicht für Anwendungen eingesetzt werden, die Sterilität erfordern, wo also eine Kontamination durch Zellen oder Faktoren aus einem Zwischenwirt ein Problem für den Endwirt darstellt, der das Transplantat erhält.
- Daher werden neue künstliche Gewebe benötigt, die in einer sterilen Umgebung gebildet werden können. Des Weiteren wird ein künstliches Gewebe benötigt, das die native Gewebearchitektur bewahrt, insbesondere die Bildung einer ordnungsgemäßen epidermal-dermalen Kontaktstelle, inklusive einer Basalmembran.
- Zusammenfassung der Erfindung
- Die vorliegende Erfindung ist ein geschichtetes und nach Zelltyp geordnetes Gewebe, das eine erste eigenständige Zellschicht und eine zweite eigenständige Zellschicht aufweist, die in vitro durch spontanes Ordnen aus einem homogenen Zellgemisch gebildet werden. Die erste Zellschicht kann jeden Zelltyp aufweisen, weist aber bevorzugterweise Epithelzellen auf. In einer bevorzugten Ausführungsform weist die erste Zellschicht Keratinozyten auf. Die Keratinozyten werden bevorzugterweise in einer frühen Passagenummer gewonnen, wie Passage 2 oder 3. Andere Zelltypen, die in der ersten Zellschicht verwendet werden können, sind CaCo2-Zellen, A431-Zellen und HUC18-Zellen. Die zweite Zellschicht kann auch Zellen jeden Zelltyps aufweisen, weist aber bevorzugterweise Mesenchymzellen auf. In einer bevorzugten Ausführungsform weist die zweite Zellschicht Fibroblasten auf.
- Die Zellzahl, die im homogenen Zellgemisch verwendet wird, ist höher als im Stand der Technik gesehen und es wird angenommen, dass sie zum Prozess des in vitro-Sortierens beiträgt. Beispielsweise werden im allgemeinen 4 × 106 Zellen jeden Zelltyps eingesetzt. In einer bevorzugten Ausführungsform werden 4 × 106 Fibroblasten zum homogenen Zellgemisch zugegeben.
- Zusätzlich besitzt das nach Zelltyp geordnete Gewebe eine epidermal-dermale Kontaktstelle, die im Wesentlichen in Struktur und Funktion ihrem nativen Gegenstück ähnelt. Das heißt, das Gewebe exprimiert die notwendigen integralen Proteine wie Hemidesmosomen und Kollagen I, Kollagen IV und Kollagen VII, um die epidermalen und dermalen Schichten mit der ordnungsgemäßen Basalmembranmorphologie anzubringen. Der Begriff „Basalmembran" bezieht sich wenn hier verwendet auch auf die Basallamina und kann synonym mit dem Begriff „Basallamina" verwendet werden. Die Neigung des geschichteten und nach Zelltyp geordnetem Gewebes, sich abzugliedern oder „Blasen zu bilden" wird daher im Vergleich zu anderen Gewebeprototypen, die derzeit vermarktet werden, vermindert.
- Das geschichtete und nach Zelltyp geordnetem Gewebe kann gebildet werden, um zu jeder bestimmten Anordnung von Schichten zu passen, die gewünscht wird. In einer Ausführungsform wird eine epidermale Schicht als oberste Schicht des Gewebes gebildet. In einer anderen Ausführungsform ist die epidermale Schicht die unterste Schicht des Gewebes.
- Die Ausrichtung der Zellschichten wird beeinflusst, indem das homogene Zellgemisch während des Kultivierens mit einem Bindegewebsbestandteil in Kontakt gebracht wird. Bindegewebsbestandteile, die verwendet werden können, sind Fibronectin, Kollagen IV, Laminin und Gemische daraus. Fibronectin ist der bevorzugte Bindegewebsbestandteil. Das homogene Zellgemisch sortiert sich, um eine epidermale Schicht zu bilden, die mit dem Bindegewebsbestandteil in Kontakt steht.
- In einer Ausführungsform wird das homogene Zellgemisch zu einer Transwell-Membran gegeben, die mit Fibronectin beschichtet ist. Das Gewebe, das gebildet wird, ist auf dem Kopf stehend, d.h. die epidermale Schicht ist die untere Schicht. In einer anderen Ausführungsform wird eine Lösung von Fibronectin zu einem homogenen Zellgemisch gegeben. Das durch dieses Verfahren gebildete Gewebe hat eine epidermale Schicht, die sich oben befindet.
- In einer anderen Ausführungsform kann das geschichtete und nach Zelltyp geordnete Gewebe als ein Hauttransplantat eingesetzt werden, um traumatische Wunden, Verbrennungen, Dekubiti und andere Geschwürbildungen zu behandeln, die durch Leiden wie Diabetes mellitus und chronische venöse Stasis vorliegen. Wenn es als Hauttransplantat verwendet wird, kann das geschichtete und nach Zelltyp geordnete Gewebe direkt auf der Transplantatstelle platziert werden. In einer anderen Ausführungsform kann jedoch auf der Transplantatstelle auch eine homogene Mischung aus Keratinocyten und Fibroblasten platziert werden, die man sich spontan ordnen lässt in eine eigenständige Schicht, die Keratinocyten aufweist, und eine eigenständige Schicht, die Fibroblasten aufweist.
- In einer weiteren Ausführungsform kann das geschichtete und nach Zelltyp geordnete Gewebe in einem in vitro-Untersuchungsverfahren zum Nachweis von Gewebeantworten auf Chemikalien oder Arzneimittel verwendet werden. Beim Bereitstellen eines nach Zelltyp geordneten Gewebes wird das Gewebe mit der interessierenden Chemikalie oder dem interessierenden Arzneimittel in Kontakt gebracht. Die Antwort des Gewebes auf die Chemikalie oder das Arzneimittel wird bestimmt, indem die Wirkung der Chemikalie oder des Arzneimittels auf den Phänotyp, Genotyp oder beide zwischen dem Gewebe vor und nach in Kontakt bringen mit der Chemikalie oder dem Arzneimittel verglichen wird.
- In einer anderen Ausführungsform wird das geschichtete und nach Zelltyp geordnete Gewebe als ein in vitro-Untersuchungsverfahren zur Untersuchung von Tumormetastase, also Tumorzellinvasion eingesetzt. Beim Bereitstellen des geschichteten und nach Zelltyp geordneten Gewebes auf einer Licht abschirmenden Platte wie einer BD BioCoat FluorBlok-Platte (BD Bioscience, Bedford, MA) wird das Gewebe mit einer zu untersuchenden gegen Metastasenbildung gerichteten Verbindung in Kontakt gebracht.
- Fluoreszenzmarkierte zu untersuchende Tumorzellen werden ebenfalls zugegeben, um mit dem Gewebe in Kontakt zu kommen. Nach einer geeigneten Inkubationszeit wird dann die Wirkung der gegen Metastasenbildung gerichteten Verbindung auf die Tumorzellen bestimmt, indem die Fluoreszenz am Boden der Platte gemessen wird. Durch die Licht abschirmenden Eigenschaften der Platte werden nur solche Tumorzellen durch den Plattenleser detektiert, die durch alle Gewebeschichten gewandert sind.
- Kurze Beschreibung der Abbildungen
- Die Patentanmeldung enthält mindestens ein in Farbe angefertigtes Foto. Kopien dieses Patents mit Farbfoto(s) werden auf Anfrage vom Patent- und Markenamt gegen Zahlung der erforderlichen Gebühr bereitgestellt.
-
1 demonstriert ein in vivo-Verfahren zur Erzeugung eines geschichteten und nach Zelltyp geordneten Gewebes. -
2 zeigt ein in vitro-Verfahren zur Erzeugung eines geschichteten und nach Zelltyp geordneten Gewebes unter Verwendung einer Transwell-Membran, die mit Fibronectin beschichtet ist. -
3 zeigt ein in vitro-Verfahren zur Erzeugung eines geschichteten und nach Zelltyp geordneten Gewebes, indem Fibronectin oben auf dem Zellgemisch platziert wird. -
4A und4B sind Fotografien eines HE-gefärbten, in Paraffin eingelegten Querschnitts eines geschichteten und nach Zelltyp geordneten Gewebes, das nach dem in2 veranschaulichten Verfahren hergestellt wurde. -
5A –5F sind Fotografien eines immunhistochemisch gefärbten geschichteten und nach Zelltyp geordneten Gewebes, die eigenständige epidermale und dermale Schichten und eine kontinuierliche Basalmembran (epidermal-dermale Kontaktstelle) zeigen. -
6A –6D sind Fotografien von HE-gefärbten 6 μm-Schnitten verschiedener geschichteter und nach Zelltyp geordneter Gewebe. - Ausführliche Beschreibung der Erfindung
- Ein geschichtetes und nach Zelltyp geordnetes Gewebe und Verfahren zur in vivo-Bildung des Gewebes wurden zuvor in WO 99/45770 beschrieben. In Kürze wurde, wie in
1 gesehen, eine inerte Siliziumkammer100 auf dem Rücken einer SCID (engl. Severe Combined Immunodeficient, schwere kombinierte Immundefizienz)-Maus102 direkt auf dem Faszienmuskel implantiert und ein Zellgemisch104 , das Keratinozyten106 und Fibroblasten108 aufwies, wurde dann in der Kammer100 platziert. Als ein Ergebnis des Implantationsablaufs füllte sich die Kammer100 mit Wundflüssigkeit110 , die sich vor allem über dem homogenen Zellgemisch104 aus Keratinozyten106 und Fibroblasten108 sammelte. Nach einer Woche wurde die Oberseite der Kammer entfernt, um ein Trocknen der Zellen zu ermöglichen. Nach einer zweiten Woche wurde eine Biopsieprobe der Haut genommen und untersucht. Die Probe zeigte, dass das Zellgemisch104 sich spontan in eine einzelne epidermale Schicht112 , die Keratinozyten106 aufwies, und eine einzelne dermale Schicht114 , die Fibroblasten108 aufwies, geordnet. - An einer Wundstelle wird Bindegewebe unterbrochen und Flüssigkeit, also Wundflüssigkeit, beginnt sich zu sammeln. Wundflüssigkeit weist viele Substanzen auf, die den Heilungsprozess fördern. Es können in der Flüssigkeit beispielsweise solche Substanzen vorhanden sein wie Plättchenwachstumsfaktor (PDGF), Transformierender Wachstumsfaktor β (TGF-β) und Fibronectin. Die Gewebereparaturmechanismen des menschlichen Körpers, die die Wundheilung fördern, tragen auch zu dem Prozess bei, der Zellen in funktionelle Strukturen organisiert. Indem die spezifischen Faktoren identifiziert werden, die die Zellmigration und -organisation beeinflussen, können in vitro geschichtete Gewebe gebildet werden, die eine Struktur besitzen, die ihrem nativen Gegenstück entspricht. Durch die Fülle an Wachstumsfaktoren und anderen Proteinen und Zellbestandteilen, die beim Wundheilungsvorgang in vivo beteiligt sind, ist es jedoch nicht offensichtlich, welches spezifische Element/welche spezifischen Elemente das Ordnen der Zellen in vitro am besten beeinflussen würde(n).
- In vitro geschichtetes und nach Zelltyp geordnetes Gewebe
- Die hier beschriebenen geschichteten und nach Zelltyp geordneten Gewebe weisen eine eigenständige erste Zellschicht und eine eigenständige zweite Zellschicht auf, die in vitro durch spontanes Ordnen der Zellen aus einem homogenen Zellgemisch gebildet werden. Der Begriff „homogenes Zellgemisch" bezieht sich, wenn hier verwendet, auf eine Zusammensetzung von Einzelzellen, die verschiedene Zelltypen umfasst. Der Begriff „ordnen" und „geordnet" bezieht sich, wenn hier verwendet, auf die Trennung oder Anordnung von Zellen aus einer homogenen Zellmischung. Des Weiteren bezieht sich der Begriff „Gewebe", wenn hier verwendet, auf eine organisierte Absammlung von Zellen, die darauf spezialisiert sind, eine bestimmte Funktion auszuüben. Die Zellen können vom gleichen Typ oder von unterschiedlichen Typen sein. Das Gewebe kann strukturiert sein, um zwei oder mehr eigenständige Zellschichten aufzuweisen, die nach Zelltyp angeordnet sind, z.B. Haut. Der Begriff „eigenständig" bedeutet, wenn hier verwendet, genau umschrieben oder klar unterscheidbar. Das geschichtete Gewebe, das erzeugt wird, bildet auch eine Basalmembran, die die notwendigen integralen Protein hat, z.B. Hemidesmosomen und intakte Kollagen I- und Kollagen IV-Filamente und Kollagen VII, um eine Kontaktstelle zu erzeugen, die im Wesentlichen in Struktur und Funktion nativen epidermal-dermalen Kontaktstellen ähnelt. Zusätzlich. verstärken Zwischenfilamente, die aus Keratinen 5 und 14 bestehen, die Wechselwirkungen zwischen Basalzellen und Basalzellkeratinozyten. Somit ist es weniger wahrscheinlich, dass geschichtete und nach Zelltyp geordnete Gewebe dieser Erfindung Blasen bilden als Prototypen, die derzeit auf dem Markt sind.
- Die Zellen, die verwendet werden können, um in vitro ein geschichtetes und nach Zelltyp geordnetes Gewebe zu erzeugen, umfassen Epithelzellen wie Keratinocyten, es können aber auch CaCo2-Dickdarmkrebszellen, A431-Vaginalkrebszellen und HUC18-Urogenitalzellen verwendet werden. Im Allgemeinen sind Epithelzellen als eine Klasse kombiniert mit Mesenchymzellen als eine Klasse geeignet, um in vitro geschichtete und nach Zelltyp geordnete Gewebe zu erzeugen, wobei eine für jede Mannigfaltigkeit an Zelltypen für jede mögliche Klasse repräsentativ ist.
- In einer bevorzugten Ausführungsform hat das geschichtete und nach Zelltyp geordnete Gewebe eine zweite Zellschicht, die Fibroblasten aufweist, und eine erste Zellschicht, die aus Keratinozyten hergestellt ist. In einer anderen Ausführungsform bleiben Fibroblasten als die zweite Zellschicht, aber die erste Zellschicht kann entweder CaCo2, A431 oder HUC18-Epithelzellen aufweisen. In einigen Fällen kann es wünschens wert sein, die Zellen so zu ordnen, dass eine bestimmte Schicht oben ist. Der Begriff „oben" bedeutet, wenn hier verwendet, die Oberfläche, die gegenüber der Transwellmembran oder dem Boden der Zellkulturschale liegt. Entweder die erste oder zweite Schicht können so ausgebildet werden, dass sie oben liegt.
- Zellbestandteile eines in vitro geschichteten und nach Zelltyp geordneten Gewebes
- Die Zellen, die verwendet werden, um das geschichteten und nach Zelltyp geordnete Gewebe in vitro zu bilden, sind bevorzugterweise von der gleichen Spezies abgeleitet. Wenn als Hauttransplantat verwendet, wird bevorzugt, dass die Zellen vom gleichen Individuum der zu behandelnden Spezies abgeleitet sind. Es ist jedoch in einigen Fällen wünschenswert, ein heterologes geschichtetes und nach Zelltyp geordnetes Gewebe zu erzeugen, d.h. mit Zellen, die von verschiedenen Individuen abgeleitet sind oder mit Zellen, die von verschiedenen Spezies abgeleitet sind. Schweinegewebe kann beispielsweise ein potentiell universaler Donor für den Gebrauch in humanen Anwendungen sein.
- Im Allgemeinen werden die Zellen, die beim Erzeugen des geschichteten und nach Zelltyp geordneten Gewebes in vitro verwendet werden, aus primären Quellen erhalten, d.h. ein Individuum, oder aus einer Zelllinie, die in Gewebekultur gehalten wird. In einer Ausführungsform stammen die Zellen aus dem gleichen Individuum oder der gleichen Zelllinie. In einer anderen Ausführungsform stammen die Zellen aus verschiedenen Individuen oder Zelllinien und haben daher verschiedene Genotypen. Zur Verwendung als Hauttransplantat sind die Zellen im Allgemeinen autolog, können aber auch allogen, xenogen oder ein Gemisch davon sein. Die Fibroblasten sind bevorzugterweise autolog. Des Weiteren können die Zellen behandelt oder verändert sein, so dass sie resistent gegen eine Abstoßung durch den Wirt sind.
- Verfahren zur Isolierung von Zellen stehen dem Fachmann zur Verfügung. Hautzellen können beispielsweise aus intaktem Hautgewebe isoliert werden. Biopsien der Haut können eingesetzt werden, um primäre Keratinozyten und Fibroblasten zu isolieren. Die Quelle der Haut kann aus Quellen wie junge Haut, alte Haut, Vorhaut, Haut aus Brustplastiken oder Bauchstraffungen und Haut aus Gesichtslifting sein. Die Hautproben können auch von Patienten mit Hautkrankheiten entnommen sein und die resultierende in vitro gebildete Haut wird den Krankheitsphänotyp der Hautbiopsie wiedergeben.
- Wenn Keratinozyten verwendet werden, sollten sie im Allgemeinen bevorzugterweise aus Passage 3 stammen, bevorzugtererweise aus Passage 2, auf Grund der Erwünschtheit, die grundlegende Keratinozytenpopulation zu erhalten. Darüber hinaus ist die Zahl an Zellen, die kultiviert werden, um das geschichtete und nach Zelltyp geordnete Gewebes zu bilden, hoch, bevorzugterweise mindestens 4 × 106 Zellen jedes Zelltyps. Es wird angenommen, dass bei dieser Zellkonzentration die Faktoren, die für das Sortieren der Zellen verantwortlich sind, bei sehr hohen Konzentrationen gehalten werden. Dagegen verwenden organtypische Kulturen zum Beispiel nur 0,35 bis 0,75 × 106 Fibroblasten und 0,25 bis 0,5 × 106 Keratinozyten, die oben auf die Fibroblastenschicht ausgesät werden.
- Verfahren zur Bildung eines geschichteten und nach Zelltyp geordneten Gewebes in vitro
- Fibronectin, ein bekannter Bestandteil des Bindegewebes, wurde in dieser Erfindung auf seine Wirkung auf das in vitro Ordnen von Zellen untersucht. Die Rolle von Fibronectin beim Erleichtern des Ordnens der Zellen war zuvor unbekannt. Das Fibronectin wurde entweder als Beschichtung auf eine Transwell-Membran aufgetragen oder dem Medium über dem Zellgemisch zugesetzt. Andere Bindegewebsbestandteile können im Verfahren dieser Erfindung verwendet werden. Beispielsweise können Kollagen IV und Laminin oder komplexere Gemische wie Matrigel als Bindegewebsbestandteile verwendet werden.
- In einer Ausführungsform umfasst das in vitro-Verfahren zur Bildung eines geschichteten und nach Zelltyp geordneten Gewebes in Kontakt bringen des Zellgemischs mit einem Bindegewebsbestandteil, dann dem Gemisch erlauben, sich spontan in einzelne erste und zweite Schichten oder mehr zu sortieren, abhängig von der Zahl an Zelltypen. Der Begriff „Zellgemisch" bezieht sich wenn hier verwendet auf eine Zusammensetzung, die eine homogene Mischung von Zellen aufweist. Es wurde gefunden, dass die Zellschicht, die epidermale Zellen enthält, sich so bildet, dass sie mit dem Bindegewebsbestandteil in Kontakt steht.
- In
2 wurde das geschichtete und nach Zelltyp geordnete Gewebe in vitro aus einem Zellgemisch von Keratinozyten und Fibroblasten200 gebildet, das auf einen Transwell-Einsatz210 gegeben wurde. Die Transwell-Platte enthält eine poröse Membran220 , die eine Stütze für die Hautzellen bereitstellt, während sie es ermöglicht, dass diese aus dem Kulturmedium230 versorgt werden können, das in Kontakt mit der Membran steht, die in der darunter befindlichen Vertiefung240 enthalten ist. Wenn die Membran220 mit einem Bindegewebsbestandteil wie Fibronectin beschichtet ist, dann ist das geschichtete und nach Zelltyp geordnete Gewebe, das sich bildet, umgedreht in dem Sinne, dass die epidermalen Keratinozyten sich an die Membran220 anheften und die dermalen Fibroblasten über ihnen eine eigenständige Schicht250 bilden. Nach der anfänglichen Gewebebildung kann der Transwell-Einsatz umgedreht werden, um das Gewebe mit der richtigen Seite nach oben zu stellen, d.h. die Membran220 ist oben und die Epidermis260 ist daran angelagert, mit Dermis250 darunter angelagert. Das Kulturmedium230 kann dann das Gewebe von unten benetzen, während die Membran220 der Luft ausgesetzt sein kann, um die ausschlaggebende Luft-Flüssigkeitsgrenzfläche bereitzustellen, um eine Differenzierung der Epidermis auszulösen. - In
3 ist eine weitere Ausführungsform des in vitro-Verfahrens demonstriert, indem ein ähnliches System wie in2 gezeigt aufgebaut wird, jedoch ohne die Fibronectinbeschichtung auf der Membran. In diesem Fall wird das Zellgemisch300 auf die Transwell-Einsatz-Membran310 ohne die Fibronectinbeschichtung gegeben. Kulturmedium320 ernährt die Zellen von unten, während eine weitere Flüssigkeit, die Fibronectin enthält (analog zur Wundflüssigkeit)330 oberhalb des Zellgemischs sitzt. In diesem Fall bildet sich das das geschichtete und nach Zelltyp geordnete Gewebe richtig herum, mit Keratinozyten340 in Kontakt mit der Fibronectin enthaltenen Flüssigkeit330 , die darüber vorhanden ist. -
4A und4B sind Digitalfotos eines Leitz-Mikroskopbildes von einem HE gefärbten, in Paraffin eingebetteten Querschnitt der Transwell-Membran und dem anschließend mittels des in2 gezeigten Verfahrens gebildeten geschichteten und nach Zelltyp geordneten Gewebe. Oben ist ein Querschnitt der Membranstütze400 zu sehen. Es sind eine Schicht aus violett gefärbten Zellen410 angeheftet die Keratinozyten der restrukturierten Epidermis sind. Darunter sind rosa gefärbte Zellen420 , die die dermalen Fibroblasten sind. Bedeutenderweise sind die Zellen durch einen Prozess spontanen Zellordnens und Bildung einer Basalmembran in einzelne Schichten von epidermalen und dermalen Zellen getrennt. - Anwendungen des geschichteten und nach Zelltyp geordneten Gewebes
- Das hier beschriebene geschichtete und nach Zelltyp geordnete Gewebe kann als künstliches Gewebe für jedes Säugetier verwendet werden. Das bevorzugte Säugetier sind Menschen. Die Erfindung kann jedoch mit anderen Säugetieren wie nicht-humanen Primaten und Mitgliedern der Rinder-, Schaf-, Schwein-, Pferde-, Kaninchen- und Katzenspezies, sowie Nagetieren wie Mäuse, Ratten und Meerschweinchen und Mitgliedern der Familie der Lagomorphen (Hasenartigen) inklusive Kaninchen durchgeführt werden. Das jeweilige geschichtete und nach Zelltyp geordnete Gewebe, das gebildet wird, hängt im Allgemeinen von der Quelle der Zellen ab, muss dies jedoch nicht. Wenn beispielsweise humane Zellen eingesetzt werden, wird ein humanes geschichtetes und nach Zelltyp geordnetes Gewebe gebildet.
- Ein Nutzen des Kultivierens der geschichteten und nach Zelltyp geordneten Gewebe ist, dass sie unter sterilen Bedingungen hergestellt werden und sie nicht mit Zellen oder Faktoren kontaminiert werden, die von einem Wirtstier beigesteuert werden, in dem ein Transplantat herangezogen wird. In einer Ausführungsform kann die geschichtete und nach Zelltyp geordnete Gewebekultur somit als Transplantat verwendet werden, das auf Transplantatstellen wie traumatischen Wunden und Verbrennungen eingesetzt werden könnte. Die Hauttrans plantate können auch verwendet werden, um Dekubiti und Geschwürbildung abzudecken, die zu Diabets mellitus und venöse Stasis sekundär sind. Wenn es mit der dermalen Schicht oben kultiviert wird, kann das Transplantat umgedreht werden, um die epidermale Schicht während der Platzierung des Transplantates als obere Schicht des Transplantats auszurichten. In einer anderen Ausführungsform wird ein homogenes Gemisch aus Keratinozyten und Fibroblasten zur Transplantatstelle gegeben. Das Gemisch ordnet sich dann spontan in eigenständige Keratinozyten- und Fibroblastenschichten. Die Fibroblasten legen auch langsam Extrazellularmatrixmaterial ab und die Dermis wird daher azellulärer.
- In einer weiteren Ausführungsform kann das geschichtete und nach Zelltyp geordnete Gewebe dieser Erfindung in Untersuchungsverfahren eingesetzt werden, um Gewebeantworten auf Chemikalien und Arzneimittel zu prüfen, wie, jedoch nicht beschränkt auf, solche, die in der kosmetischen Industrie und in der Mineralölindustrie eingesetzt werden. Beim Bereitstellen des geschichteten und nach Zelltyp geordneten Gewebes, das wie oben beschrieben gebildet wird, wird das Gewebe mit der Chemikalie oder dem Arzneimittel von Interesse in Kontakt gebracht. Der Unterschied in Phänotyp, Genotyp oder beidem zwischen dem Gewebe vor und nach Kontakt mit der Chemikalie oder dem Arzneimittel wird dann verglichen, um die Antwort des Gewebes auf die Chemikalie oder das Arzneimittel zu bestimmen.
- In einer anderen Ausführungsform kann das geschichtete und nach Zelltyp geordnete Gewebe als ein in vitro-Modell oder Untersuchungsverfahren zur Tumorzellmetastase dienen. Derzeitige in vitro-Modelle zur Tumorzellmetastase verwenden einfache Zellschichten. Das Gewebe dieser Erfindung ahmt die Struktur nativen Gewebes nach, d.h. mehrere Schichten, und stellt somit ein überlegenes Untersuchungsverfahren bereit, durch das der Metastaseprozess untersucht werden kann wie er im menschlichen Körper vorkommt. Zellen wie mikrovaskuläre Endothelzellen oder Glattmuskelzellen können verwendet werden, um eine der Schichten im geschichteten und nach Zelltyp geordneten Gewebe zu bilden. In einem solchen Verfahren würde das geschichtete und nach Zelltyp geordnete Gewebe in einer Platte mit mehreren Vertiefungen platziert werden, die die Übertragung von Fluoreszenzlicht blockiert, wie eine BD BioCoat FluoroBlok-Platte (BD Biosciences, Bedford, MA). Das Gewebe würde dann mit einer gegen Metastesenbildung gerichteten Verbindung in Kontakt gebracht werden und mindestens einer fluoreszenzmarkierten oder gekennzeichneten Tumorzelle. Nach der angemessenen Inkubationszeitspanne würde das Untersuchungsverfahren bestimmen, ob die gegen Metastasen gerichtete Wirkung der fraglichen Verbindung eine gegen Metastasenbildung gerichtet Wirkung hatte, indem die Fluoreszenz am Boden der Platte vor und nach in Kontakt bringen des Gewebes mit der gegen Metastasen gerichteten Verbindung gemessen würde. Durch die lichtabschirmenden Eigenschaften der Platte werden nur solche markierten Zellen durch den Plattenleser detektiert werden, die durch alle Gewebeschichten gewandert sind.
- Beispiele
- Beispiel 1
- Präparation von Hautzellen
- In Kürze wurde neugeborene Vorhaut abgeschnitten, in kleine Stücke geschnitten und über Nacht bei 4°C in Dispase platziert. Die mit Dispase behandelte Vorhaut wurde in neue Petrischalen überführt und mit Phosphat gepufferter Saline gewaschen. Epidermis wurde physikalisch von der Dermis mit dem Forceps (Zange) getrennt und mit 0,3% Trypsin für 30 Minuten bei 37°C behandelt. Das Trypsin wurde dann mit Trypsininhibitor aus Sojabohne (Sigma, St. Louis, MO) neutralisiert. Die abgelösten Keratinozyten wurden mit Hilfe einer Klinikzentrifuge gesammelt. Der Keratinozytenniederschlag wurde in SFM-Medium (Gibco-BRL, Grand Island, NY) resuspendiert und auf mit Kollagen beschichteten Schalen ausplattiert. Nach 3–4 Tagen wurden mittlere bis große Kolonien primärer Keratinozyten sichtbar (10–20 Zellen groß) und die Platten wurden mit SFM neu beschickt. Nach 7 Tagen wurden die Platten mittels Standard-Trypsinierungsverfahren 1:3 umgesetzt. Die Keratinozyten wurden dann für zwei bis drei Passagen in einem 37°C-Inkubator mit 5% CO2 kultiviert und dann bei der Bildung einer geschichteten und nach Zelltyp geordneten Haut eingesetzt.
- Aus der verbliebenen Dermis wurden Primärfibroblastenkulturen erhalten, indem die abgetrennte Dermis in Gegenwart von DMEM (GIBCO-BRL) mit 10% Kälberserum in Platten mit sechs Vertiefungen für etwa 1 Woche ausplattiert wurde. Die Zellen, die von den dermalen Explantaten weg wuchsen, waren Fibroblasten. Fibroblasten wurden zur Verwendung bei der Bildung einer künstlichen geschichteten und nach Zelltyp geordneten Haut in DMEM mit 10% fötalem Kälberserum umgesetzt.
- Beispiel 2
- Zur Ernährung von Hautzellen verwendetes Medium
- Das Medium, das für das in vitro-Wachstum der geschichteten und nach Zelltyp geordneten Haut verwendet wird, ist auch eine wichtige Variable. Die Bestandteile des Mediums, das mit der Bildung dermaler und epidermaler Schichten kompatibel ist, ist unten aufgelistet:
- 500 ml DMEM (Gibco-BRL Kat.-Nr. 11965-092, Grand Island, NY)
- 10 ml Penizillin/Streptomyzin
- Fötales Kälberserum auf 10 Volumenprozent zugeben
- Beispiel 3
- Verfahren zur in vitro-Bildung einer geschichteten und nach Zelltyp geordneten Haut
- Transwells wurden zuerst vorbereitet, indem sie mit 5 μg/ml Fibronectin aus humanem Plasma (Sigma, St. Louis, MO) beschichtet wurden und für 30 Minuten bei 37°C inkubiert wurden. In einem Zentrifugenbecher wurden 4 × 106 Keratinozyten und 4 × 106 Fibroblasten vereint, sanft gemischt und dann zentrifugiert. Das Medium wurde dann entfernt ohne den Zellniederschlag durcheinander zu bringen und der Zellniederschlag wurde für 30 Minuten auf Eis inkubiert. Der Zellniederschlag wurde dann in einem etwa gleichen Volumen (50–100 μl) DMEM mit 10% fötalem Kälberserum resuspendiert, um ein Zellgemisch zu erhalten. Das resuspendierte Zellgemisch wurde auf der Transwell ausgesät und mit DMEM mit 10% fötalem Kälberserum ernährt. Wenn auf der Membran die epidermale Schicht gewünscht wurde, dann wurden sowohl die Kulturschale als auch der Transwell mit Nährmedium beschickt. Wenn jedoch die Epidermis oben gewünscht wurde, dann wurde nur der Transwell für 24 Stunden mit Nährmedium beschickt. Danach konnten beide Vertiefungen mit Nährmedium beschickt werden. Die Zellen wurden je nach Bedarf für die ersten 1 bis 3 Tage mit Nährmedium beschickt, danach von diesem Punkt an jeden zweiten Tag. Die Inkubationsbedingungen waren im Allgemeinen bei 37°C und 5% CO2 für 7 bis 14 Tage, je nach dem Untersuchungsverfahren, für das das Gewebe eingesetzt werden würde.
- Wie in
5A –5F zu sehen, identifizierte eine immunhistochemische Färbung einer geschichteten und nach Zelltyp geordneten Haut, die in vitro gebildet worden war, eigenständige epidermale und dermale Schichten und eine epidermal-dermale Kontaktstelle. In5A skizziert die Färbung des geschichteten und nach Zelltyp geordneten Gewebes eindeutig die dermale Schicht500 . In5B zeigt ein Antikörper gegen eine Reihe von Zytokeratinen eindeutig die epidermale Schicht510 . Färbung der Kontaktstelle (Basalmembran) mit einem Kollagen IV-Antikörper in5C demonstriert eine eigenständigen epidermal-dermalen Kontaktstelle520 , die in5F vergrößert ist. Eine Färbung mit einem humanem Lamininantikörper zeigt ebenfalls eine eigenständige epidermal-dermale Kontaktstelle530 in5D , die in5F vergrößert ist.6A zeigt ferner die eigenständigen epidermalen600 und dermalen610 Schichten der geschichteten und nach Zelltyp geordneten Haut. - Beispiel 4
- Fixierung und bildliche Aufnahme einer geschichteten und nach Zelltyp geordneten Haut
- Die Beurteilung der Schichtenbildung erfordert ein Fixieren der Proben und das Anfertigen von Querschnitten der Proben. Die Transwell-Einsätze, die die nach Zelltyp geordneten Haut enthielten, wurden auf einem Glassplättchen platziert. Nach Entfernen überschüssigen Mediums über den Zellen wurde eine gepufferte 10%ige Formalinlösung direkt auf die Zellproben in den Transwells geträufelt und für 10 Minuten inkubiert. Die Membranen wurden dann von den Transwell-Einsätzen mit einem Skalpell abgeschnitten und in Glasfläschchen platziert, die 1 ml gepufferten 10%igen Formalins enthielten. Die Proben wurden dann in Paraffin eingelegt, in dünne Segmente geschnit ten und mit Hämotoxylin-Eosin für eine Untersuchung unter einem Verbundmikroskop angefärbt, um das Ausmaß der Bildung zweier eigenständiger Zellschichten wahrzunehmen. Die mikroskopischen Bilder wurden durch Digitalfotografie mit einem Nikon Coolpix 990 festgehalten, wie in
4A und4B gezeigt. - Beispiel 5
- Geschichteten und nach CaCo2-Zellen geordnetes Gewebe
- CaCo2-Dickdarmkarzinomzellen wurden mittels der in Trainer et al., Int. J. Cancer 287–296 (1988) beschriebenen Technik kultiviert und unter Verwendung eines Standardtrypsinierungsverfahrens geerntet. Gleichermaßen wurden fötale Fibroblasten wie in Beispiel 1 beschrieben geerntet.
- Transwells wurden zuerst vorbereitet, indem die Transwell-Membran mit an Wachstumsfaktoren vermindertem Matrigel (MD Biosciences, Bedford, MA) beschichtet wurden und für 30 Minuten bei 37°C inkubiert wurden. Am Ende des Inkubationszeitraums wurde alles sichtbare Matrigel von der Membran entfernt und nur eine dünne Beschichtung aus Laminin und Kollagen IV belassen (alternativ kann auch beschichten mit individuellen Lösungen von Kollagen IV und Laminin durchgeführt werden). In einem Zentrifugenbecher wurden 4 × 106 CaCo2-Zellen und 4 × 106 Fibroblasten vereinigt, sanft gemischt und dann zentrifugiert. Das Medium wurde dann entfernt ohne den Zellniederschlag durcheinander zu bringen und der Zellniederschlag wurde für 30 Minuten auf Eis inkubiert. Der Zellniederschlag wurde dann in einem etwa gleichen Volumen (50–100 μl) DMEM mit 10% fötalem Kälberserum resuspendiert, um ein Zellgemisch zu erhalten. Das resuspendierte Zellgemisch wurde auf der Transwellmembran ausgesät und mit DMEM mit 10% fötalem Kälberserum ernährt. Sowohl der Transwell als auch die Kulturschale wurden mit Nährmedium beschickt. Die Zellen wurden nach Bedarf für die ersten drei Tage mit Nährmedium beschickt und von diesem Punkt an jeden zweiten Tag. Die Inkubationsbedingungen waren die gleichen wie in Beispiel 3.
-
6C demonstriert die eigenständigen epidermalen 600 und dermalen610 Schichten im geschichteten und nach CaCo2-Zellen geordnetes Gewebe. - Beispiel 6
- Geschichteten und nach A431-Zellen geordnetes Gewebe
- A431-Vaginalkarzinomzellen wurden mittels der in Faust et al., Cancer Res. 52: 2460–2463 (1992) beschriebenen Technik kultiviert und unter Verwendung eines Standardtrypsinierungsverfahrens geerntet. Gleichermaßen wurden fötale Fibroblasten wie in Beispiel 1 beschrieben geerntet.
- Transwells wurden zuerst vorbereitet, indem die Transwell-Membran mit an Wachstumsfaktoren vermindertem Matrigel (MD Biosciences, Bedford, MA) beschichtet wurden und für 30 Minuten bei 37°C inkubiert wurden. Am Ende des Inkubationszeitraums wurde alles sichtbare Matrigel von der Membran entfernt und nur eine dünne Beschichtung aus Laminin und Kollagen IV belassen. In einem Zentrifugenbecher wurden 4 × 106 A431-Zellen und 4 × 106 Fibroblasten vereinigt, sanft gemischt und dann zentrifugiert. Das Medium wurde dann entfernt ohne den Zellniederschlag durcheinander zu bringen und der Zellniederschlag wurde für 30 Minuten auf Eis inkubiert. Der Zellniederschlag wurde dann in einem etwa gleichen Volumen (50–100 μl) DMEM mit 10% fötalem Kälberserum resuspendiert, um ein Zellgemisch zu erhalten. Das resuspendierte Zellgemisch wurde auf der Transwellmembran ausgesät und mit DMEM mit 10% fötalem Kälberserum ernährt.
- Sowohl der Transwell als auch die Kulturschale wurden mit Nährmedium beschickt. Die Zellen wurden nach Bedarf für die ersten drei Tage mit Nährmedium beschickt und von diesem Punkt an jeden zweiten Tag. Die Inkubationsbedingungen waren die gleichen wie in Beispiel 3.
-
6D demonstriert die eigenständigen epidermalen600 und dermalen610 Schichten des geschichteten und nach A431-Zellen geordneten Gewebes. - Beispiel 7
- Geschichteten und nach HUC18-Zellen geordnetes Gewebe
- HUC18-Urogenitalzellen wurden mittels der in Meyers C., Methods in Cell Science 18: 201–210 (1996) beschriebenen Technik kultiviert und unter Verwendung eines Standardtrypsinierungsverfahrens geerntet. Keratinocyten und Fibroblasten wurden wie in Beispiel 1 beschrieben geerntet.
- Transwells wurden zuerst vorbereitet, indem sie mit 5 μg/ml Fibronectin (Sigma, St. Louis, MO) beschichtet wurden und für 30 Minuten bei 37°C inkubiert wurden. In einem Zentrifugenbecher wurden 1,2 × 106 Keratinozyten (30%), 2,8 × 106 HUC18-Zellen und 4 × 106 Fibroblasten vereint, sanft gemischt und dann zentrifugiert. Das Medium wurde dann entfernt ohne den Zellniederschlag durcheinander zu bringen und der Zellniederschlag wurde für 30 Minuten auf Eis inkubiert. Der Zellniederschlag wurde dann in einem etwa gleichen Volumen (50–100 μl) DMEM mit 10% fötalem Kälberserum resuspendiert, um ein Zellgemisch zu erhalten. Das resuspendierte Zellgemisch wurde auf der Transwell ausgesät und mit DMEM mit 10% fötalem Kälberserum ernährt. Sowohl der Transwell als auch die Kulturschale wurden mit Nährmedium beschickt. Die Zellen wurden nach Bedarf für die ersten drei Tage mit Nährmedium beschickt und von diesem Punkt an jeden zweiten Tag. Die Inkubationsbedingungen waren die gleichen wie in Beispiel 3.
-
6B demonstriert die eigenständigen epidermalen600 und dermalen610 Schichten des geschichteten und nach HUC18-Zellen geordneten Gewebes. - Beispiel 8
- In vitro-Modell für Tumormetastase
- Keratinozyten und Fibroblasten wurden mittels der Beispiel 1 beschriebenen Technik geerntet.
- Mit fibrillärem Kollagen beschichtete Platten mit einer Vielzahl von Vertiefungen (BioCoat FluorBlok Platten, BD Biosciences, Bedford, MA) wurden zuerst vorbereitet, indem sie mit 5 μg/ml Fibronectin beschichtet wurden und für 30 Minuten bei 37°C inkubiert wurden. In einem Zentrifugenbecher wurden 4 × 106 Keratinozyten und 4 × 106 Fibroblasten vereint, sanft gemischt und dann zentrifugiert. Das Medium wurde dann entfernt ohne den Zellniederschlag durcheinander zu bringen und der Zellniederschlag wurde für 30 Minuten auf Eis inkubiert. Der Zellniederschlag wurde dann in einem etwa gleichen Volumen (50–100 μl) DMEM mit 10% fötalem Kälberserum resuspendiert, um ein Zellgemisch zu erhalten. Das resuspendierte Zellgemisch wurde auf den FluorBlok Platten ausgesät und ernährt, indem sowohl in den Kulturschalen als auch in den eingesetzten Schalen DMEM mit 10% fötalem Kälberserum verwendet wurde. Die Zellen wurden nach Bedarf für die ersten 3 Tage mit Nährmedium beschickt und von diesem Punkt an jeden zweiten Tag. Wie in Beispiel 3 waren die Inkubationsbedingungen bei 37°C und 5% CO2 für 7 bis 14 Tage. Danach wurde die Serumkonzentration in den Vertiefungen allmählich für 7–10 Tage um täglich 50% reduziert. Vom zehnten Tag an wurden die Zellen dann in serumfreiem Medium kultiviert.
- Das Medium wurde dann entfernt und die auf gegen Metastasenbildung gerichtete Wirkungen hin zu untersuchende Verbindung wurde zusammen mit DMEM mit 10% fötalem Kälberserum zugegeben. 2,5 × 104 HT-1080-Zellen (humane Fibrosarcoma), die mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert waren, wurden dann in den Einsatzschalen mit dem geschichteten und nach Zelltyp geordneten Gewebe platziert. Es können andere geeignete metastasenbildende Zellen verwendet werden. Die Zellen wurden dann für 20–22 Stunden bei 37°C inkubiert. Danach wurde das Medium aus den Einsatzschalen entfernt und die Platte in eine zweite Platte mit 24 Vertiefungen überführt, die 0,5 ml/Vertiefung von 4 μg/ml Calcein AM in Hanks gepufferter Saline enthielt, und für 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Die Platte wurde dann mittels eines Fluoreszenzplattenlesers bei einer Anregung von 485 nm und einer Emission von 530 nm analysiert.
Claims (27)
- Ein geschichtetes nach Zellen geordnetes Gewebe, das eine erste eigenständige Zellschicht umfasst, die Epithelzellen umfasst, und eine zweite eigenständige Zellschicht, die Mesenchymzellen umfasst, wobei die Zeilen, die spontan aus einem homogenen Zellgemisch sortiert wurden, eine etwa gleiche Zahl an Epithelzellen und Mesenchymzellen mit einer Konzentration von mehr als etwa 4 × 107 Zellen/ml jeden Typs umfasst, um die eigenständigen ersten und zweiten Zellschichten bei Kontakt mit einem oder mehreren Bestandteilen, die im Serum vorhandenen sind, um das Sortieren der Zellen zu erleichtern, zu bilden und wobei das Gewebe in vitro gebildet wird.
- Gewebe nach Anspruch 1, wobei die erste Zellschicht Keratinocyten umfasst.
- Gewebe nach Anspruch 1, wobei die erste Zellschicht Dickdarmepithelzellen umfasst.
- Gewebe nach Anspruch 3, wobei die erste Zellschicht CaCo2 Zellen umfasst.
- Gewebe nach Anspruch 1, wobei die erste Zellschicht Vaginaepithelzellen umfasst.
- Gewebe nach Anspruch 5, wobei die erste Zellschicht A431 Zellen umfasst.
- Gewebe nach Anspruch 1, wobei die erste Zellschicht Urogenitalepithelzellen umfasst.
- Gewebe nach Anspruch 7, wobei die erste Zellschicht HUC18 Zellen umfasst.
- Gewebe nach Anspruch 1, wobei die zweite Zellschicht Fibroblasten umfasst.
- Gewebe nach Anspruch 1, wobei die erste Zellschicht eine epidermale Schicht ist, die Keratinocyten umfasst, und zweite Zellschicht eine dermale Schicht ist, die Fibroblasten umfasst.
- Gewebe nach Anspruch 10, das zusätzlich eine Vielzahl integraler Proteine umfasst, die die epidermalen und dermalen Schichten verbinden, um eine Basallamina zu bilden.
- Gewebe nach Anspruch 10, wobei die epidermale Schicht die oberste Schicht des Gewebes ist.
- Gewebe nach Anspruch 10, wobei die epidermale Schicht die unterste Schicht des Gewebes ist.
- In-vitro Verfahren zur Bildung eines geschichteten und nach Zellen geordneten Gewebes, das eine erste eigenständige Zellschicht, und eine zweite eigenständige Zellschicht umfasst, welches die Schritte umfasst: – Bereitstellen eines homogenen Gemisches von Zellen, wobei das Gemisch eine etwa gleiche Zahl an Epithelzellen und Mesenchymzellen mit einer Konzentration von mehr als etwa 4 × 107 Zellen/ml jeden Typs umfasst, und – in Kontakt bringen des Gemisches mit einem oder mehreren Serumbestandteilen unter Bedingungen, unter denen das Gemisch sich spontan in die ersten und zweiten eigenständigen Zellschichten ordnet, wobei die erste eigenständige Zellschicht Epithelzellen umfasst, und die zweite eigenständige Zellschicht Mesenchymzellen umfasst.
- In-vitro Verfahren nach Anspruch 14, wobei der Serumbestandteil Fibronectin ist.
- In-vitro Verfahren nach Anspruch 14, wobei der Serumbestandteil ein Gemisch aus Kollagen IV und Laminin ist.
- In-vitro Verfahren nach Anspruch 14, wobei in Kontakt bringen umfasst, den Bindegewebsbestandteils auf die Oberseite des Gemisches aufzubringen.
- In-vitro Verfahren nach Anspruch 14, wobei in Kontakt bringen umfasst, das Gemisch zu einer Membran hinzuzufügen, die mit dem Bindegewebsbestandteil beschichtet ist.
- Untersuchungsverfahren zur Prüfung einer Antwort auf eine Chemikalie oder ein Arzneimittel, welches umfasst: – Bereitstellen des geschichteten und nach Zellen geordneten Gewebes nach Anspruch 1; – in Kontakt bringen des Gewebes mit der Chemikalie oder dem Arzneimittel; – Bestimmen, ob die Chemikalie oder das Arzneimittel eine Wirkung auf das Gewebe hat, indem man einen Unterschied in Phänotyp, Genotyp oder beiden zwischen dem Gewebe vor und nach in Kontakt bringen mit der Chemikalie oder dem Arzneimittel vergleicht.
- In-vitro Untersuchungsverfahren zur Untersuchung von Tumorzellmetastase, das umfasst: – Bereitstellen des geschichteten nach Zellen geordneten Gewebes nach Anspruch 1 auf einer Licht abschirmenden Platte; – in Kontakt bringen des Gewebes mit einer gegen Metastasenbildung gerichteten Verbindung; in Kontakt bringen des Gewebes mit mindestens einer fluoreszenzmarkierten Tumorzelle; Bestimmen, ob die gegen Metastasenbildung gerichtete Verbindung eine gegen Metastasenbildung gerichtete Wirkung auf das Gewebe hat, indem man die Fluoreszenz am Boden der Platte vor und nach in Kontakt bringen des Gewebes mit der gegen Metastasenbildung gerichteten Verbindung misst.
- Verfahren nach Anspruch 20, wobei die fluoreszenzmarkierte Tumorzelle eine HT-1080 humane Fibrosarkoma Zelle ist.
- Hauttransplantation, die das geschichtete und nach Zellen geordnete Gewebe nach Anspruch 10 umfasst.
- Zusammensetzung von Zellen zur in vitro Bildung eines geschichteten und nach Zellen geordneten Gewebes, das ein homogenes Zellgemisch umfasst, das eine etwa gleiche Zahl an Fibroblasten und Epithelzellen mit einer Konzentration von mehr als etwa 4 × 107 Zellen/ml jeden Typs umfasst, und eine ausreichend hohe Konzentration mindestens eines Bestandteils, das im Serum vorhanden ist, um das Ordnen der Zellen zu erleichtern.
- Zusammensetzung nach Anspruch 23, wobei die Epithelzellen aus der Gruppe ausgewählt werden, welche aus Keratinozyten, CaCo2 Zellen, A431 Zellen und HUC18 Zellen besteht.
- Geschichtetes und nach Zellen geordnetes Gewebe nach Anspruch 1, wobei die Ausrichtung der geordneten Schichten durch Kontakt mit einer ausreichenden Menge eines Bindegewebsbestandteils beeinflusst wird.
- Verfahren nach Anspruch 14, das zusätzlich Beeinflussen der Orientierung des nach Zelltyp geordneten Gewebes durch in Kontakt bringen des Gewebes mit einem oder mehreren Bindegewebsbestandteilen umfasst.
- Zusammensetzung von Zellen nach Anspruch 23, wobei die Ausrichtung des geschichteten und nach Zelltyp geordneten Gewebes durch Kontakt mit einer ausreichenden Menge eines Bindegewebsbestandteils beeinflusst wird.
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