DE69017324T2

DE69017324T2 - Lebendes Gewebeäquivalent.

Info

Publication number: DE69017324T2
Application number: DE69017324T
Authority: DE
Inventors: Eugene Bell; John Cavallaro; David T Kagan; Paul Kemp; Valerie Mason
Original assignee: Organogenesis Inc
Current assignee: Organogenesis Inc
Priority date: 1989-09-15
Filing date: 1990-09-11
Publication date: 1995-08-03
Anticipated expiration: 2010-09-12
Also published as: KR940001379B1; EP0418035A1; EP0418035B1; DE69017324D1; ATE119194T1; DK0418035T3; KR910005893A; IL95429A; CA2023968C; IE903340A1; JPH03151977A; CA2298856C; IL95429A0; CA2023968A1; ES2071778T3; JPH0553505B2; US5536656A; AU6215690A; CA2298856A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Diese Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung und Verwendung von Gewebeäquivalenten, umfassend (i) ein hydriertes Collagengitter, das durch ein kontraktiles Agens kontrahiert ist, und (ii) ein Collagengel, das mit einem permeablen Element in Kontakt steht. Diese Erfindung betrifft weiter Testsysteme, die derartige Gewebeäquivalente enthalten.
Gewebeäquivalente, die ein hydriertes Collagengitter enthalten, das durch ein kontraktiles Agens, wie z.B. Fibroblastenzellen oder Blutplättchen, zur Bildung des Gewebeäquivalents kontrahiert ist, sind in den U.S.-Patenten Nr. 4,485,096; 4,485,097; 4,539,716; 4,546,500; 4,604,346; und 4,837,379 sowie in der gleichzeitig anhängigen U.S.-Patentanmeldung Seriennummer 07/252,249, eingereicht am 30. September 1988 (EP-A- 89309972.1), aufgezeigt, die in ihrer Gesamtheit hierin durch Bezugnahme eingeschlossen sind (im folgenden kollektiv als "die Patente" bezeichnet). Gewebe in seiner Verwendung hierin umfaßt jede Gruppe oder Schicht von Zellen, die zusammen eine oder mehrere bestimmte Funktionen durchführen. Derartige Gewebeäquivalente enthalten, sind jedoch nicht beschränkt auf, Äquivalente von Epithelgewebe, Bindegewebe, Knorpel, Knochen, Organen, Drüsen und Blutgefäßen und umfassen lebende Zellen und extrazelluläre Matrixmoleküle, hauptsächlich Collagen, und können optional mit Komponenten versehen sein, die typischerweise nicht in normalen Geweben gefunden werden.
Im allgemeinen werden derartige lebende Gewebeäquivalente hergestellt, indem ein hydriertes Collagengitter gebildet wird, das zu einem lebenden Gewebe kontrahiert wird. Beispiele von kontraktilen Agentien schließen Fibroblastenzellen, glatte Muskelzellen und Blutplättchen ein. Ein Hautäquivalent kann aus dem lebenden Bindegewebeäquivalentsubstrat hergestellt werden, indem Keratinocytenzellen darauf plattiert werden und für ihr Wachstum gesorgt wird.
Die vorstehend genannten Gewebeäquivalente sind mit Zellen besiedelt, die für lange Zeiträume am Leben bleiben können, und können im größeren Maßstab hergestellt werden, wobei sichergestellt ist, daß die hergestellten Einheiten im wesentlichen gleichförmig sind. Zellen in derartigen Gewebeäquivalenten ähneln Zellen von normalem Gewebe in ihrer strukturellen Anordnung, in ihrer biosynthetischen Leistung und in ihrer Permeabilität. Es versteht sich, daß diese Gewebeäquivalente nicht vom Menschen stammen müssen, sondern nach Wunsch auch solche eines jeden Tieres sein können.
Gewebeäquivalente in Übereinstimmung mit den Lehren der vorliegenden Erfindung haben einen breiten Anwendungsbereich einschließlich Anwendungen in Forschung und Entwicklung, Gewebe- und Organersatz und Tests.
Menschliche Hautgewebeäquivalente erlauben das Wachstum von normalen menschlichen Epidermiszellen, die vollständig differenzieren, welche bisher nicht durch Routinekulturverfahren erhalten wurden. Derartige Hautgewebeäquivalente wurden im großen Umfang als dauerhafter Hautersatz in Tierversuchen verwendet. Das morphologische Erscheinungsbild derartiger Hautgewebeäquivalente ist normal, die die Bestandteile bildenden Zellen bleiben nach der Transplantation weiterhin bestehen, wie durch genetische Markierung gezeigt wurde, und die funktionelle Leistungsfähigkeit wurde bewiesen. Siehe z.B. Science, 211: 1052-1054 (1981); J. Invest. Dermatol. 81: 2s-10s (1983).
Hautgewebeäquivalente, die in vitro durch die in den Patenten aufgezeigten Verfahren hergestellt wurden, haben eine große Ähnlichkeit mit natürlicher Haut. Derartige Äquivalente umfassen eine mehrschichtige Epidermis mit gut entwickelten Basalzellen, die zu einer dermalen Schicht verbunden sind. Die dermale Schicht umfaßt eine Collagenmatrix, in der Hautfibroblasten verteilt sind. Zellen in der dreidimensionalen Collagenmatrix erreichen einen Zustand der Differenzierung, der in vielerlei Hinsicht ähnlich dem ist, der in vivo herrscht. Beispielsweise sind residente Fibroblasten synthetisch aktiv und reichern die Matrix in vitro sowohl mit Collagen als auch einer Anzahl von anderen molekularen Arten an und zeigen Permeabilitätseigenschaften, die für eine Zelle in vivo typisch sind. Siehe z.B. Collagen Rel. Res. 4: 351-364 (1984). Ferner können Hautgewebeäquivalente durch Einschluß von Melanocyten pigmentiert werden, die Pigment an Keratinocyten abgeben, und es wurde gezeigt, daß der Vorgang in vitro durch ultraviolette Strahlung beschleunigt wird (J. Invest. Dermatol. 87: 642-647, 1986).
Das U.S.-Patent Nr. 4,835,102 zeigt Systeme auf, die Gewebeäquivalente enthalten, die in vitro viele der physischen und biologischen Eigenschaften von natürlichem Gewebe reproduzieren und zum Studium beispielsweise der Gewebezellbiologie, Physiologie und Pathologie nützlich sind. Derartige Systeme schließen Geräte und Kits zur Bestimmung der Wechselwirkung von Gewebe und wenigstens einem Agens unter Verwendung von wenigstens einem Gewebeäquivalent ein. Das Agens schließt, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, verschiedene Substanzen ein, wie z.B. Chemikalien, Kosmetika, Pharmazeutika; Stimulantien, z.B. Licht oder physische Verletzung; und gewebeschützende Agentien.
Gewebeäquivalente können in jeder gewünschten Form gegossen werden. Hautgewebeäquivalente zur Verwendung in Hauttransplantaten und in Testsystemen werden allgemein als flache Platten gegossen, und Blutgefäßäquivalente werden allgemein als Hohlrohr oder als ein Netzwerk von Hohlrohren hergestellt. Die natürliche Geometrie oder Konfiguration des Gewebeäquivalents kann jedoch nach Wunsch verändert werden. Beispielsweise kann ein Hautgewebeäquivalent als ein Zylinder anstatt als eine Platte gegossen werden.
Wenn Fibroblasten oder glatte Muskelzellen als das kontraktile Agens bei der Herstellung von Gewebeäquivalenten verwendet werden, wird ein nicht rückgehaltenes Collagengitter typischerweise einer Kontraktion in allen Dimensionen unterzogen. Verschiedene Verfahren zur Unterstützung zur Bildung von lebendem Gewebe und Gewebeäquivalenten mit kontrollierbaren Konfigurationen und/oder Dimensionen sind in den Patenten aufgezeigt, z.B. U.S.-Patent Nr. 4,485,096. Beispielsweise kann ein Collagengitter auf einen Rahmen aus rostfreiem Stahl gegossen werden, um die Grenzen fixiert zu halten und somit die Kontraktion im wesentlichen nur in Richtung der Dicke durchzuführen. Andere Materialien, die zur Kontrolle der Konfiguration der Gewebeäquivalente verwendet werden können, schließen VELCRO , texturierte Kunststoffe und texturiertes TEFLON Obgleich diese Rückhalteeinrichtungen wirksam sind, ist es in vielen Fällen bevorzugt, sowohl im Hinblick auf die Kosten als auch die Einfachheit, Rückhalteeinrichtungen zu verwenden, die nicht einstückig mit der Gußkammer sind.
In Anbetracht der vielfältigen Anwendungen von Gewebeäquivalenten werden verbesserte Gewebeäquivalente und Verfahren zur Herstellung derartiger Gewebeäquivalente gesucht.

KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Figur 1 ist eine teilweise ausgebrochene isometrische Ansicht einer Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung.
Figur 2 ist eine auseindergezogene isometrische Ansicht der in Figur 1 gezeigten Vorrichtung.
Figur 3 ist eine Schnittdarstellung entlang 3-3 durch die in Figur 1 gezeigte Vorrichtung.
Figur 4 ist eine teilweise ausgebrochene isometrische Ansicht einer weiteren Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung.
Figur 5 ist eine auseinandergezogene Ansicht von oben der in Figur 4 gezeigten Vorrichtung.
Figur 6 ist eine auseinandergezogene Schnittansicht entlang 6-6 durch die in Figur 4 gezeigte Vorrichtung.

KURZBESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung schafft Gewebeäquivalente, die (i) ein hydriertes Collagengitter umfassen, das durch ein kontraktiles Agens kontrahiert ist, und (ii) ein Collagengel. Die vorliegende Erfindung schafft ferner Gewebeäquivalente, die verbesserte Eigenschaften haben, darunter eine gesteigerte Reproduzierbarkeit von Probe zu Probe hinsichtlich des Grades der Kontraktion und, im Falle von Hautgewebeäquivalenten, hinsichtlich des Grades der Differenzierung der Epidermis.
Bei einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind derartige Gewebeäquivalente einem oder mehreren absorbierenden Elementen benachbart, die Faserkissen und Gele, wie z.B. Agarose, einschließen.
Die vorliegende Erfindung schafft ferner Verfahren zur Herstellung und Verwendung derartiger verbesserter Gewebeäquivalente. Die hierin gelehrten Verfahren bieten auch Vorteile gegenüber denjenigen Verfahren, die in den Patenten aufgezeigt sind, im Hinblick auf die Einfachheit der Herstellung und die verringerten Herstellungskosten.
Ein Verfahren gemäß vorliegender Erfindung, durch welches ein Gewebeäquivalent gebildet wird, umfaßt:
(a) Bilden einer Mischung, die Collagen und wenigstens ein kontraktiles Agens umfaßt; und
(b) Auftragen der in Schritt (a) erhaltenen Mischung auf ein Collagengel und Halten der Mischung und des Gels unter Bedingungen, die die Bildung des Gewebeäquivalents erlauben.
Die vorliegende Erfindung schafft ferner eine Vorrichtung, die derartige Gewebeäquivalente enthält, zur Bestimmung der Wechselwirkung von Gewebe und einem oder mehreren Agentien.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt eine derartige Vorrichtung einen ersten und einen zweiten Bereich, der durch eine permeable Einrichtung gebildet ist, die mit einem Collagengel versehen ist, auf dem ein Gewebeäquivalent angeordnet ist, wobei das Gewebeäquivalent den ersten Bereich definiert und die permeable Einrichtung den zweiten Bereich definiert.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfaßt eine derartige Vorrichtung wenigstens ein Gewebeäquivalent und wenigstens einen Behälter für das Gewebeäquivalent, wobei der Behälter umfaßt:
(i) einen inneren Behälter, der eine permeable Einrichtung umfaßt, die mit einem Collagengel versehen ist, auf welchem das Gewebeäquivalent angeordnet ist, wobei die permeable Einrichtung den Boden des inneren Behälters bildet, und
(ii) einen äußeren Behälter, innerhalb dessen der innere Behälter angeordnet ist.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die Gewebeäquivalente gemäß vorliegender Erfindung umfassen, obgleich sie sowohl hinsichtlich der Herstellungsverfahren als auch der Verwendung denjenigen ähnlich sind, die, wie in den Patenten aufgezeigt, ein hydriertes Collagengitter enthalten, ferner eine Schicht Collagen.
Es wurde unerwartet festgestellt, daß ein Collagengitter, das auf ein Collagengel in Kontakt mit einem permeablen Element gegossen wird, keinen wesentlichen radialen oder lateralen Kontraktionen unterworfen ist, während es in Richtung der Dicke kontrahiert, wodurch die Notwendigkeit der Verankerung des Collagengitters auf beispielsweise einem Rahmen aus rostfreiem Stahl zur Kontrolle der radialen oder lateralen Kontraktion eliminiert wird. Beispielsweise würde ein Collagengitter mit 24 mm Durchmesser, das nach der Lehre der Patente gegossen wird, jedoch ohne eine Verankerungseinrichtung, radial auf einen Durchmesser von 5 mm oder weniger kontrahiert. Im Gegensatz dazu kontrahiert ein Collagengitter mit 24 mm Durchmesser, das auf ein Collagengel in Kontakt mit einem permeablen Element gegossen wird, typischerweise radial auf einen Durchmesser von etwa 15 mm. Die Eliminierung der Verankerungseinrichtung zur Kontrolle der lateralen/radialen Kontraktion bietet Vorteile hinsichtlich der Kostenverringerung und der Vereinfachung der Herstellung von Gewebeäquivalenten.
Es versteht sich, daß eine derartige Verankerungseinrichtung in Verbindung mit einem Collagengel in Kontakt mit einem permeablen Element verwendet werden kann, falls erwünscht. Ein Verfahren zum Erhalten der Gewebeäquivalente gemäß vorliegender Erfindung umfaßt:
(a) Bilden einer Mischung, die Collagen und wenigstens ein kontraktiles Agens umfaßt; und
(b) Auftragen der in Schritt (a) erhaltenen Mischung auf ein Collagengel in Kontakt mit einem permeablen Element und Halten der Mischung und des Gels unter Bedingungen, die die Bildung des Gewebeäquivalents erlauben.
Bei einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden eines oder mehrere absorbierende Elemente, darunter, jedoch ohne Einschränkung, Faserkissen, Baumwollkissen und Gele, Agarose, in Verbindung mit dem vorstehend beschriebenen Collagengel verwendet. Es wurde festgestellt, daß derartige absorbierende Elemente eine konsistente und ebene physische Auflage bilden und gleichförmigen Kontakt zwischen dem Gewebeäquivalent und dem Zellkulturmedium fördern. Typischerweise ist das absorbierende Element der Oberfläche des Collagengels gegenüber dem hydrierten Collagengitter benachbart. Wenn das absorbierende Element oder die absorbierenden Elemente selbst ein Gel ist bzw. sind, z.B. Agarose, kann das Gel zusammen mit einem Nährmedium vorgesehen sein, um das Gewebeäquivalent mit Nährstoffen zu versorgen.
Die folgenden experimentellen Endpunkte wurden bei Gewebeäquivalenten überwacht, die mit und ohne Collagengel und/oder dem absorbierenden Element während verschiedener Entwicklungsphasen eines Hautgewebeäquivalents gehalten wurden:
1. Glucoseverwertung;
2. Ausmaß und Qualität der epidermalen Stratifikation und Keratinisierung;
3. pH des Mediums.
Die beobachteten pH-Werte von Medien, die von Gewebeäquivalenten erhalten wurden, die mit dem bzw. den absorbierenden Element(en) gehalten wurden, waren konsistent höher und näher an dem physiologischen pH-Wert als Gewebeäquivalente, die in Abwesenheit dieser Elemente gehalten wurden. Zusätzlich wurde beobachtet, daß die Glucoseverwertung allgemein niedriger in Gewebeäquivalenten ist, die mit dem absorbierenden Element gehalten wurden.
Überraschenderweise wurde festgestellt, daß die reife Keratinisierung in Hautgewebeäquivalenten gefördert wird, die unter Verwendung des absorbierenden Elements bzw. der absorbierenden Elemente hergestellt wurden, im Vergleich zu Kontroll- Hautäquivalenten, die ohne derartige Elemente hergestellt wurden. Obgleich der Mechanismus, durch den diese absorbierenden Elemente die epidermale Differenzierung beeinflussen können, unbekannt ist, wird postuliert, daß derartige Elemente als Diffusionsbarrieren wirken können, z.B. eine Permeabilitätsbarriere, und das Medium filtern und/oder abgesonderte Zellprodukte in enger Nähe zu den Gewebeäquivalenten zurückhalten können.
Lebende Hautäquivalente gemäß vorliegender Erfindung werden wie in den Patenten beschrieben hergestellt, mit der Ausnahme, daß in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung das hydrierte Collagengitter auf ein Collagengel gegossen wird.
Ein Verfahren zur Herstellung eines Hautgewebeäquivalents in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung umfaßt:
(a) Bilden einer Mischung, die Collagen und wenigstens ein kontraktiles Agens umfaßt;
(b) Auftragen der in Schritt (a) erhaltenen Mischung auf ein Collagengel in Kontakt mit einem permeablen Element und Halten der Mischung und des Gels unter Bedingungen, die die Bildung des Gewebeäquivalents erlauben; und
(c) Impfen des in Schritt (b) erhaltenen Gewebeäquivalents mit Keratinocyten.
Als Hintergrundinformation sei ein gängiges Protokoll zum Gießen der Gewebeäquivalente gemäß vorliegender Erfindung genannt, welches das rasche Zusammenmischen einer sauren Collagenlösung mit einem pH von etwa 3 bis 4 mit Nährmedien, das Einstellen des pH-Wertes der erhaltenen Lösung, sofern erforderlich, auf etwa pH 6,6 bis pH 7,8, das Hinzufügen von Fibroblastenzellen, das Übertragen der erhaltenen Mischung ("die Gußmischung") in eine geeignete Form oder Gußeinrichtung, in welcher ein Collagengel angeordnet ist, und anschließend das Inkubieren bei einer Temperatur von etwa 35ºC bis 38ºC umfaßt. Eine äußerst praktische Vorgehensweise ist es, den pH-Wert einzustellen und gleichzeitig die Inhaltsstoffe der Gußmischung zu kombinieren. Diese Schritte können in jeder gewünschten Reihenfolge ausgeführt werden, vorausgesetzt, daß die Schritte vollendet werden, so daß die Gußmischung in eine Form zum ordnungsgemäßen Aushärten übertragen werden kann. Die Collagenfibrillen werden aus der Gußmischung als Ergebnis der Erwärmung der Lösung und der Erhöhung des pH-Wertes ausgefällt, um ein hydriertes Collagengel zu bilden, das durch ein kontraktiles Agens kontrahiert ist und auf einem Collagengel angeordnet ist.
Obgleich die Verfahren zur Herstellung von lebendem Gewebe, die durch vorliegende Erfindung geschaffen werden, auf die Herstellung von Gewebeäquivalenten im allgemeinen anwendbar sind, werden diese Verfahren in Verbindung mit der Herstellung von Hautäquivalenten zur Verwendung in Hauttransplantationsanwendungen und in Testsystemen, die Hautäquivalente enthalten, erläutert.
Vorrichtungen, Verfahren und Kits zur Bestimmung der Wechselwirkung von Geweben und einem oder mehreren Agentien unter Verwendung von Gewebeäquivalenten einschließlich Hautgewebeäquivalenten sind in dem U.S.-Patent Nr. 4,835,102 beschrieben. Gewebeäquivalente für derartige Anwendungen können vorteilhafterweise auch des weiteren in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung ein Collagengel umfassen, das in Kontakt mit einem permeablen Element ist.
In den Figuren zeigen Figur 1-3 eine Ausführungsform einer Vorrichtung zur Bestimmung der Wechselwirkung von Haut und einem oder mehreren Agentien unter Verwendung von Hautgewebeäquivalenten in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung, wobei mehrfache Behälter 10, 22, in welchen Gewebeäquivalente gemäß vorliegender Erfindung angeordnet sind, in einer Basis oder einem Halter angeordnet sind. Die in Figur 1-3 gezeigte Vorrichtung ist ferner mit einer Abdeckungseinrichtung 2 versehen. Bei einigen Ausführungsformen ist für jeden Behälter 10, 20 eine Abdeckung (nicht dargestellt) vorgesehen. Die Abdeckung ist ausgewählt aus jedem biokompatiblen Material, welches den Behälter abdichtet. Geeignete Abdeckungsmaterialien schließen Folien und Sperrfilme ein, die mit der Vorrichtung mittels eines Klebstoffes oder mittels Wärme versiegelt werden können. Ein warm versiegelbarer Polyesterfilm ist bei der praktischen Anwendung der vorliegenden Erfindung besonders nützlich.
Die Behälter für die Gewebeäquivalente umfassen einen äußeren Behälter 10 und einen inneren Behälter 20. Der innere Behälter 20 ist mit einem Rand 50 versehen, um eine Einrichtung zum Positionieren des inneren Behälters 20 in dem äußeren Behälter 10 zu bilden, wodurch ein äußerer Bereich 14 und ein innerer Bereich 22 bestimmt werden. Der innere Behälter 20 ist mit einem Hautgewebeäquivalent 26, 28 versehen, das auf einem Collagengel 25 angeordnet ist, das wiederum unmittelbar benachbart zu einem permeablen Element 24 angeordnet ist. Das permeable Element ist abdichtend an dem inneren Behälter 20 befestigt und bildet die Bodenfläche desselben. Das Hautgewebeäquivalent umfaßt zwei Schichten 26, 28, wobei die Schicht 28 eine epidermale Schicht umfaßt und die Schicht 26 eine dermale Schicht. Bei einigen Ausführungsformen schafft ein Dichtelement 30 eine Abdichtung zwischen der inneren Wand des inneren Behälters 20 und dem Hautäquivalent 26, 28 und bedeckt den Umfang des Collagengels 25 in dem Fall, in dem der äußere Rand des Gewebeäquivalents 26, 28 innerhalb des Collagengels 25 angeordnet ist. Bei den in den Figuren abgebildeten Ausführungsformen ist der Behälter 10 mit einer Öffnung 21 versehen, die Zugang zu dem äußeren Bereich 14 bietet.
Die in Figur 3 dargestellte Vorrichtung ist ferner mit einem absorbierenden Element 32 versehen. In weiteren Ausführungsformen kann in der äußeren Kammer 14 ein nicht dargestelltes Gel angeordnet sein.
Figuren 4-6 stellen eine weitere Ausführungsform einer Vorrichtung zur Bestimmung der Wechselwirkung von Gewebe und einem oder mehreren Agentien unter Verwendung von Gewebeäquivalenten in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung dar. Elemente, die jenen in anderen beschriebenen Ausführungsformen ähnlich sind, sind durch dasselbe Bezugszeichen bezeichnet. Bei dieser Ausführungsform ist der äußere Behälter 10 rechteckig und mit erhöhten Abschnitten 60 in dem Boden versehen, auf welchen der innere Behälter 20 angeordnet werden kann. Der äußere Behälter 10 ragt nicht vom Boden der Vorrichtung nach oben, sondern ist vielmehr als eine Tasche von der Oberseite der Vorrichtung her ausgebildet.
Der äußere Behälter 10 ist mit Nährmedium für das Gewebeäquivalent versehen. Derartige Medien sind nach dem Stand der Technik bekannt. Bevorzugte serumfreie Nährmedien sind in der gleichzeitig anhängigen U.S.-Patentanmeldung Seriennummer 361,041 aufgezeigt. Das Volumen des Mediums muß so gewählt werden, daß es den äußeren Behälter 14 bis zu einem geeigneten Niveau füllt, um nicht eine Drucksäule aufzubauen, die das Medium durch das permeable Element 24, das Collagengel 25, das Gewebeäquivalent 26, 28 in den inneren Behälter 20 drängen würde.
In einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ist der äußere Behälter 10 mit einem absorbierenden Element 23 versehen, das in dem äußeren Behälter 10 angeordnet ist, so daß es mit der äußeren Oberfläche des permeablen Elements 24 in Kontakt ist. Das absorbierende Element 23 muß mit lebenden Gewebeäquivalenten kompatibel sein. Bevorzugte Materialien für das absorbierende Element schließen Baumwolle, Polyester und Rayon ein. Ein besonders bevorzugtes Material ist absorbierende Baumwolle. Allgemein ist es bevorzugt, daß das absorbierende Element frei von Additiven, wie etwa Detergentien, ist.
In anderen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ist der äußere Behälter 10 mit einem Gel (nicht dargestellt) versehen, wie etwa Agarose, welches zum Einschließen des Mediums dient. Da das Agarosegel bis unmittelbar unterhalb des Niveaus der Öffnungen 24 zugegeben werden kann, wird eine größere Menge Nährmedium dem Gewebeäquivalent verfügbar gemacht, und die Nahrungsversorgung für das Gewebeäquivalent 26, 28 ist nicht so rasch erschöpft. Die Verwendung derartiger Gele bietet Vorteile bei der Lagerung und dem Versand der Vorrichtung gemäß vorliegender Erfindung hinsichtlich der Minimierung des Austritts der Medien und der daraus resultierenden möglichen Kontamination des Gewebeäquivalents.
Der äußere Behälter 10 und der innere Behälter 20 können aus jedem gewünschten Material hergestellt sein, das nicht mit den Versuchskomponenten reagiert oder einen unerwünschten Effekt auf diese einschließlich dem Gewebeäquivalent hat. Beispielsweise darf die Gußmischung für das lebende Gewebeäquivalent nicht an den Wänden des inneren Behälters während der Kontraktion anhaften, so daß die Bildung des Gewebeäquivalents gestört wird.
Es wurde festgestellt, daß Verfahren, die zum Sterilisieren des inneren Behälters 20 verwendet werden, Einfluß auf das Anhaftvermögen des Gewebeäquivalents haben können. Beispielsweise haftet das sich bildende Gewebe an Polystyrol, ein bevorzugtes Material für den inneren Behälter, wenn dieses durch Elektronenstrahl sterilisiert ist, jedoch nicht, wenn es mit Ethylenoxid sterilisiert ist. Im Gegensatz dazu kann K-resin, eine Legierung aus Polystyrol und Butadien und ein besonders bevorzugtes Material für den Behälter, durch Elektronenstrahl sterilisiert werden, ohne daß das Anhaften des sich bildenden Gewebes verursacht wird (K-resin ist ein Warenzeichen von Phillips Petroleum). In einigen Ausführungsformen ist es erwünscht, daß die Behälter so hergestellt werden, daß das Gewebeäquivalent durch den Behälter sichtbar ist, z.B. durch die Wände des Behälters oder durch ein Fenster in dem Behälter. Bevorzugte Materialien für den Behälter 10 umfassen Polystyrol und PETG.
Der innere Behälter 20 kann in jeder Form und in jedem Volumen hergestellt sein, das die Größe und Form des gewünschten Gewebeäquivalents aufnimmt. Die Dimensionen des Behälters sind wiederum abhängig von der Größe und Form des gewünschten Gewebeäquivalents und den gewünschten Untersuchungsvolumina. Beispielsweise ist ein Behälter mit einem äußeren Durchmesser von etwa 25 mm und einem Volumen von etwa 5 ml bei der praktischen Ausführung der vorliegenden Erfindung nützlich. Bei der in Figur 1-3 gezeigten Ausführungsform sind mehrere Behälter in einer Basis oder einem Halter vorgesehen.
Das permeable Element 24 muß eine ausreichende Festigkeit haben, um das Collagengel 25 und das Gewebeäquivalent 26, 28 zu tragen. Poröse Membranen sind bei der praktischen Ausführung der vorliegenden Erfindung nützlich. Die Porengröße derartiger Membranen wird so gewählt, daß eine Befestigung für das Collagengel 25 geschaffen wird. Bevorzugte Membranen sind hydrophil, haben eine Dicke von etwa 1 bis 10 mm und Porendurchmesser im Bereich von etwa 1 bis 10u. Zu den bevorzugten Materialien für das permeable Element 24 zählt Polycarbonat. Ein besonders bevorzugtes permeables Element ist eine Polycarbonatmembran, vorzugsweise frei von Netzmitteln, die im Handel von Nuclepore erhältlich ist und eine Porengröße von etwa 3 bis 10u hat.
Das Dichtelement 30 kann aus jedem Material hergestellt sein, das gegenüber den verwendeten Versuchsbedingungen und Gewebeäquivalenten inert ist und eine gute Abdichtung zwischen dem inneren Behälter 20 und dem Gewebeäquivalent schafft. Zu den bevorzugten Materialien zählen Polyethylen, TEFLON , Polycarbonat und Nylon. Das Dichtelement ist besonders nützlich, wenn es erwünscht ist, den Inhalt des äußeren Behälters von jeder Lösung oder Substanz getrennt zu halten, die auf die Epidermis 25 aufgetragen wird, beispielsweise wenn die Messung der Diffusion oder Permeation einer Substanz durch ein Gewebeäquivalent vorgenommen wird.
Sowohl die Gewebeäquivalente als auch das Collagengel in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung können unter Verwendung von Collagen hergestellt werden, das aus Haut und Sehnen erhalten ist, darunter Rattenschwanzsehnen, Kalbshautcollagen und Kalbsstreckersehne. Andere Collagenquellen wären geeignet. Eine besonders bevorzugte Collagenzusammensetzung, die aus der gemeinsamen Fingerstreckersehne vom Kalb erhalten ist, und Verfahren zum Erhalt derartiger Collagenzusammensetzungen sind in der gleichzeitig anhängigen U.S.-Patentanmeldung Seriennummer 07/407,465 aufgezeigt, die mit dem gleichen Datum wie diese Anmeldung eingereicht wurde und deren Offenbarung hierin durch Bezugnahme eingeschlossen ist.
Bei einem Verfahren gemäß vorliegender Erfindung wird das Collagengel 25 aus einer Collagenzusammmensetzung hergestellt, die Collagen zu etwa 0,5 bis 2,0 mg/ml enthält, vorzugsweise etwa 0,9 bis 1,1 mg/ml, sowie Nährmedien. Diese Collagenzusammensetzung wird zu dem inneren Behälter 20 hinzugegeben und unter Bedingungen gehalten, die das Aushärten der Collagenzusammensetzung erlauben und das Bilden eines Collagengels von geeigneten Abmessungen, typischerweise etwa 1 bis 5 mm dick, wobei ein bevorzugter Dickenbereich etwa 2 bis etwa 3 mm ist. Das Collagengel 25 ist vorzugsweise dick genug, daß ein Abschnitt zellenfrei bleibt, wenn Zellen von dem Gewebeäquivalent in das Collagengel wandern, und dünn genug, daß das Gewebeäquivalent nicht in unerwünschter Weise von der Nährquelle entfernt ist, die in dem äußeren Behälter 10 vorgesehen ist.
Ein dermales Äquivalent wird nachfolgend auf das Collagengel unter Verwendung der Vorgehensweisen in Übereinstimmung mit den Patenten und wie nachfolgend beschrieben gegossen. Eine Gußmischung, die Collagen und Fibroblasten enthält, wird zu dem inneren Behälter 20 über dem Collagengel 25 zugegeben und unter Bedingungen gehalten, die die Bildung des Gewebeäquivalents ermöglichen. Während sich das Gewebeäquivalent auf dem Collagengel 25 bildet, kontrahiert es sich radial. Das Collagengel 25 verhindert jedoch eine übermäßige radiale Kontraktion des Gewebeäquivalents, ohne daß mechanische Rückhalteeinrichtungen erforderlich wären, wie z.B. texturierte Metalle und Kunststoffe oder VELCRO .
Typischerweise sind die Seiten des Gewebeäquivalents 26 zum äußeren Umfang des Collagengels 25 hin geneigt und bilden ein Plateau, wie in Figur 3 und 6 bei 52 gezeigt. Das Gewebeäquivalent 26 wird nun mit Epithelzellen geimpft, um die epidermale Schicht 28 zu bilden. Die Epidermiszellen werden in das Kulturmedium mit einer Konzentration von etwa 0,3 x 10&sup6; bis 30 x 10&sup6; Zellen/ml geimpft. Das Volumen der geimpften Epidermiszellen ist von der Größe des Plateaus abhängig.
Die Konzentration von Collagen, die Anzahl der Zellen und das Volumen der Gußmischung können kontrolliert werden, um den Durchmesser und die Dicke des lebenden Gewebeäquivalents zu optimieren. Die Gußmischung umfaßt Zellen mit einer Konzentration von etwa 1,25 bis 5 x 10&sup4; Zellen/ml und Collagen mit etwa 0,5 bis 2,0 mg/ml in einem Nährmedium. Eine bevorzugte Zellkonzentration ist etwa 2,5 x 10&sup4; Zellen/ml. Es wurde festgestellt, daß das Verhältnis des Volumens der Gußmischung für das Gewebeäquivalent zu dem Volumen der Gußmischung für das Collagengel einen Effekt auf die Lebensfähigkeit und Differenzierung der Zellen hat. Nützliche Verhältnisse v/v von Gewebeäquivalentgußmischung zu Collagengelgußmischung sind etwa 3:1 bis 1:3. Ein bevorzugtes Verhältnis, bei welchem die Zellkonzentration in dem Collagengitter etwa 2,5 x 10&sup4; Zellen/ml ist, ist 3:1.
Die Erfindung ist unter Bezug auf die folgenden Beispiele besser verständlich, die rein beispielhafter Natur sind und nicht als den Schutzbereich der Erfindung einschränkend verwendet werden sollen.
Die in den folgendem Beispiel verwendeten Materialien wurden von den in den Beispielen angegebenen Quellen erhalten oder in Übereinstimmung mit den angegebenen Veröffentlichungen hergestellt. Sterile Verfahrensweisen wurden in allen Beispielen verwendet. Die Gewebeäquivalente wurden unter 10% CO&sub2; in dem Inkubator gehalten, und sterile Vorgehensweisen wurden durchgehend angewendet.

Beispiel I:

Herstellung von Hautgewebeäquivalent- Testsystemen

A. Eine Vorrichtung ähnlich der in Figur 4 gezeigten wurde zur Durchführung der nachfolgend beschriebenen Arbeiten verwendet. Die Abdeckung wird zur Ausführung der Tätigkeit entfernt, ansonsten jedoch an ihrer Bestimmungsstelle gehalten, um die Sterilität aufrechtzuerhalten. Einschlägige Informationen bezüglich der Vorrichtung sind nachfolgend aufgelistet:
äußerer Behälter 10: Durchmesser 38 mm Kapazität 35 ml
innerer Behälter 20: Durchmesser 24 mm Kapazität 4 ml
permeables Element 24: Polycarbonatmembran von Nuclepore, Porengröße 3u, Dicke 5u.
B. Ein Collagengel wurde auf den permeablen Element 24 wie folgt gebildet:
(1) Vormischung:
10X MEM 16,2 ml
L-Glutamin (200 mM) 1,6 ml
Gentamycin (50 mg/ml) 0,2 ml
fetales Rinderserum 18,0 ml
Natriumbicarbonat (71,2 mg/ml) 5,0 ml
Die Ansatzlösungen wurden bei 37ºC gemischt und in der vorstehenden Reihenfolge kombiniert und bei 4ºC annähernd 30 Minuten in 50 ml Röhrchen (nicht gasbehandelt) gelagert.
(2) 27,8 g einer 1 mg/ml Collagenlösung (extrahiert durch Säure aus der gemeinsamen Fingerstreckersehne des Kalbes) in 0,05% v/v Essigsäure wurden in ein 50 ml Röhrchen ausgewogen und bei 4ºC 30 Minuten lang gelagert.
(3) 8,2 ml der vorstehend beschriebenen Vormischung und 4 ml DMEM-Vollösung (die 10% FBS, 4 mM L-Glutamin, 50 ug/ml Gentamycin enthält) wurde zugegeben (und l ml Aliquote in den inneren Behälter 20 pipettiert und in einem Deckel das Gelieren ermöglicht.
C. Gewebeäquivalente wurden mit menschlichen dermalen Fibroblasten gegossen und mit menschlichen epidermalen (epithelialen) Zellen wie nachfolgend beschrieben geimpft.
Eine allgemeine Beschreibung der Vorgehensweisen und Reagentien ist auch in den Patenten und der gleichzeitig anhängigen Anmeldung, Seriennummer 07/361,041, eingereicht am 5. Juni 1989 (EP-A-90306084.6) zu finden.

(1) Gußmischung:

8,2 ml der vorstehend beschriebenen Vormischung wurden zu 27,8 g einer 1 mg/ml Collagenlösung in 0,05% v/v Essigsäure zugegeben, wie in Schritt A (2) vorstehend beschrieben, und 4 ml menschlicher dermaler Fibroblasten (2,5 x 10&sup5; Zellen/ml) wurden kombiniert. 3 ml Aliquote wurden in den Behälter 20 über dem in Schritt B (2) vorstehend gebildeten Collagengel pipettiert und das Gelieren wurde ermöglicht. 4,5 ml DMEM- Vollösung wurden zu dem äußeren Behälter 20 zugegeben und anschließend bei 36ºC/10% CO&sub2; typischerweise 4-8 Tage lang inkubiert.
Das folgende Medium wurde verwendet: Komponente Hydrocortison Insulin Transferrin Trijodthyronin Ethanolamin O-Phosphorylethanolamin Adenin Progesteron Selen Rinderserum Epidermaler Wachstumsfaktor Calciumfreies DMEM Ham's
Zwei weitere verwendete Medien waren mit mSBM identisch, mit nachfolgend angegebenen Ausnahmen: cSBM Haupt-SBM Progesteron Rinderserum Epidermaler Wachstumsfaktor Calciumfreies DMEM Ham's
In einigen Fällen wurde Calciumchlorid zu den Medien mit 1,8 mM zugegeben. Dies ist als Medium plus Calcium angegeben, beispielsweise mSBM plus Calcium.
D. Die Epidermalisierung wurde 6 Tage nach dem Gießen des Gewebeäquivalents initiiert.

(1) Epidermalisierung

Das Medium aus vorstehendem Schritt C wurde sowohl aus dem inneren Behälter 20 als auch dem äußeren Behälter 10 entfernt. Eine 50 ul Suspension menschlicher epidermaler Zellen (3,33 x 10&sup6; Zellen/ml) wurde auf das oben in vorstehendem Schritt C gebildete Gewebeäquivalent plaziert. Der Behälter wurde anschließend bei 36ºC und 10% CO&sub2; 4 Stunden lang inkubiert. 12,0 ml mSBM wurde anschließend zu der äußeren Kammer zugegeben und 4 ml zu dem Behälter. Die Vorrichtung wurde anschließend in denselben Inkubator zurückgestellt.

(2) Differenzierung

52 Tage nach der Epidermalisierung wurde das Medium entfernt und durch mSBM plus Calcium ersetzt.

(3) Airlifting

5 Tage nach der Epidermalisierung wurde der folgende Vorgang durchgeführt:
Das Medium wurde aus der inneren und der äußeren Kammer entfernt. Der innere Behälter 20 wurde entfernt und mit 2 Volumina cSBM plus Calcium getränkte Baumwollkissen wurden auf dem Boden der äußeren Kammer 10 positioniert, und 9,0 ml cSBM plus Calcium wurden zugegeben. Der innere Behälter 20 wurde anschließend zurückgesetzt und die Vorrichtung bei 35,5ºC und 10% CO&sub2; inkubiert.

(4) Unterhaltung

Alle 4 Tage wurde das Medium entfernt und durch frischen Haupt-SBM plus Calcium ersetzt.

Beispiel II:

Herstellung von Agarose enthaltenden Testsystemen

Eine 2% Agaroselösung in Wasser wurde durch Autoklavbehandlung sterilisiert, auf 40ºC gekühlt und mit einem gleichen Volumen von 2 konzentriertem Haupt-SBM gemischt. Die absorbierenden Baumwollkissen wurden entfernt und 13 ml der Mischung wurden in den äußeren Bereich 14 gegossen, das Aushärten wurde bei 368C (10% CO&sub2;) ermöglicht und die Vorrichtung wurde in den Inkubator zur Lagerung vor dem Versand zurückgegeben.
Es versteht sich, daß die Beispiele und Ausführungsformen, die hierin beschrieben wurden, nur zu Erläuterungszwecken dienen und daß verschiedene Modifikationen und Veränderungen in Anbetracht derselben, die dem Durchschnittsfachmann nahegelegt werden, in dem Gedanken und dem Umfang dieser Anmeldung sowie dem Schutzbereich der bestätigten Ansprüche einzuschließen sind.

Claims

1. Gewebeäquivalent, umfassend:

(a) ein hydriertes Collagen-Gitter, das durch ein kontraktiles Agens kontrahiert ist; und

(b) ein Collagen-Gel, das mit einem permeablen Element in Kontakt steht.

2. Verfahren zur Herstellung eines Gewebeäquivalents, welches Verfahren umfaßt:

(a) Bilden einer Mischung, die Collagen und wenigstens ein kontraktiles Agens umfaßt; und

(b) Auftragen der in Schritt (a) erhaltenen Mischung auf ein Collagen-Gel in Kontakt mit einem permeablen Element und Halten der Mischung und des Gels unter Bedingungen, die die Bildung des Gewebeäquivalents erlauben.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das kontraktile Agens Fibroblastenzellen umfaßt.

4. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Mischung aus Schritt (a) Fibroblastenzellen mit einer Konzentration von etwa 1,25 bis 4 x 10&sup4; Zellen/ml und Collagen mit etwa 0,5 bis 2,0 mg/ml enthält.

5. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Collagen-Gel durch Gießen einer Collagen-Lösung hergestellt wird, die Collagen mit einer Konzentration von etwa 0,5 bis 2,0 mg/ml enthält.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Mischung aus Schritt (a) und die Lösung aus Schritt (b) in einem Verhältnis von etwa 3 : 1 bis 1 : 3, Volumen:Volumen verwendet werden.

7. Verfahren nach Anspruch 2, wobei ein absorbierendes Element unmittelbar benachbart dem permeablen Element angeordnet ist.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei das absorbierende Element ein Faserkissen oder ein Gel umfaßt.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Faserkissen Baumwolle ist.

10. Verfahren nach Anspruch 2, wobei ein Agarose enthaltendes Gel dem permeablen Element benachbart angeordnet ist.

11. Vorrichtung zur Bestimmung der Wechselwirkung von Gewebe und wenigstens einem Agens unter Verwendung von wenigstens einem Gewebeäquivalent, welche Vorrichtung einen ersten und einen zweiten Bereich umfaßt, der durch eine permeable Einrichtung gebildet ist, die mit einem Collagen-Gel versehen ist, auf dem das Gewebeäquivalent angeordnet ist, wobei das Gewebeäquivalent den ersten Bereich bildet und das permeable Element den zweiten Bereich bildet.

12. Vorrichtung zur Bestimmung der Wechselwirkung von Gewebe und wenigstens einem Agens unter Verwendung von wenigstens einem Gewebeäquivalent, welche Vorrichtung das Gewebeäquivalent und wenigstens einen Behälter für das Gewebeäquivalent umfaßt, wobei der Behälter umfaßt:

(i) einen inneren Behälter, der eine permeable Einrichtung umfaßt, die mit einem Collagen-Gel versehen ist, auf dem das Gewebeäquivalent angeordnet ist, wobei die permeable Einrichtung den Boden des inneren Behälters bildet, und

(ii) einen äußeren Behälter, innerhalb dessen der innere Behälter angeordnet ist.

13. Vorrichtung nach Anspruch 12, wobei die Vorrichtung ferner eine Einrichtung zum Schließen des Behälters umfaßt, welche abnehmbar mit dem Behälter versiegelbar ist.

14. Vorrichtung nach Anspruch 12, wobei der innere Behälter mit zumindest einer Öffnung versehen ist, die mit dem äußeren Behälter in Verbindung steht.

15. Vorrichtung nach Anspruch 12, wobei der innere Behälter K-Harz enthält.

16. Vorrichtung nach Anspruch 12, wobei ein absorbierendes Element unter dem permeabelen Element liegt.

17. Vorrichtung nach Anspruch 14, wobei das absorbierende Element ein Faserkissen oder ein Gel umfaßt.

18. Vorrichtung nach Anspruch 17, wobei das Faserkissen Baumwolle ist.

19. Vorrichtung nach Anspruch 12, wobei ein Agarose enthaltendes Gel in dem äußeren Behälter angeordnet ist.