KR940001379B1 - 생조직 등가물 - Google Patents

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KR940001379B1
KR940001379B1 KR1019900014547A KR900014547A KR940001379B1 KR 940001379 B1 KR940001379 B1 KR 940001379B1 KR 1019900014547 A KR1019900014547 A KR 1019900014547A KR 900014547 A KR900014547 A KR 900014547A KR 940001379 B1 KR940001379 B1 KR 940001379B1
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디. 켐프 폴
벨 유진
티. 카간 데이비드
메이슨 발레리
카발라로 죤
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오르가노제네시스, 인코포레이티드
벨 유진
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Abstract

내용 없음.

Description

생조직 등가물
제1도는 본 발명의 기기일부를 해체시킨 실측도이다.
제2도는 제1도의 기기로부터 해체된 부위의 분해실측도이다.
제3도는 제1도의 기기를 3-3 방향으로 절단한 단면도이다.
제4도는 본 발명의 또 다른 기기의 일부를 해체시킨 실측도이다.
제5도는 제4도의 기기로부터 해체된 부위의 상부 분해실측도이다.
제6도는 제4도의 기기를 6-6 방향으로 절단한 단면도이다.
본 발명은 수축제로 수축시킨 수화된 콜라겐 격자(lattice), 및 투과성 요소와 접하고 있는 콜라겐 겔을 함유하는 조직 등가물(equivalents)의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 조직 등가물을 도입한 시험시스템에 관한 것이다.
섬유 아세포 또는 혈소판과 같은 수축제로 수축시킨 수화된 콜라겐 격자를 함유하는 조직 등가물의 제조방법은 문헌[참조 : 미합중국 특허 제 4,485,096호 : 제 4,485,097호 : 제4,539,716호 ; 제4,546,500호: 제4,604,346호 : 및 제4,837,37
9, 및 계류중인 미합중국 특허원 제07/252,249호(1988. 9.30 출원)]에 나타나 있으며, 상기문헌은 참조로서 인용된다(이후에서“인용특허”라 칭함).
본원에서 사용된 조직은 하나 이상의 특정 기능을 수행하는 세포그룹 또는 세포층 어느것이라도 함유할 수 있다. 이러한 세포 등가물에는 상피조직, 결체조직, 연골조직, 뼈, 기관, 분비선 및 혈관의 등가물이 포함되며 이들로만 제한되는 것은 아니다. 세포 등가물은 생세포(living cell) 및 세포의 매트릭스분자, 특히 콜라겐을 함유하며, 정상조직에서 보편적으로 발견되지 않은 성분을 임의로 함유할 수 있다.
일반적으로, 이러한 생조직 등가물은 생조직으로 수축되는 수화된 콜라겐 격자를 형성시켜 수득된다. 수축제의 예로는 섬유아세포, 평활근세포, 및 혈소판이 포함된다. 피부-등가물은 생결체조직 등가물 기질상에 케라티노사이트(keratinocyt
e)세포를 도말하고 이들이 성장하도록 함으로써 수득할 수 있다.
상술한 조직 등가물에, 장기간 생존이 가능하며 생성된 단위체가 실질적으로 균질하고 정량으로 수득될 수 있는 세포를 도입한다. 이러한 조직 등가물중의 세포는 이들의 구조적 배열, 생합성 산출량, 및 투과성에 있어서 정상조직의 세포와 유사하다. 이들 조직 등가물이 인체에 사용되는 것이 아니라 목적하는 모든 동물의 필요에 따름을 인지하여야 한다.
본 발명의 기술에 따른 조직등가물은 연구 및 개발, 조직 및 기관이식 및 이의 시험에 적용할 수 있는등, 광범위한 적용범위를 지닌다.
사람의 피부 조직 등가물은 현재까지 일반적인 배양방법을 통하여서는 성취할 수 없었던 정상 사람 상피세포의 성장에 있어서 완전 분화를 허용하였다. 이러한 피부 조직 등가물은 동물실험에서 영구 피부 대체물로서 광범위하게 사용되고 있다. 이러한 피부 조직등가물의 외형은 정상이며, 구성세포는 유전마킹(marking)에서 나타나는 바와 같이 이식후에도 영속되고, 기능적 효능도 확인되었다[참조; Science, 211 : 1052-1054(1981) : J. Invest. Dermato11. 81 : 2s-10s(1983)].
인용특허에 기술된 방법으로 시험관내에서 제조된 피부 조직 등가물은 천연피부와 상당히 유사하다. 이러한 등가물은 피부층에 연결된 발생상태가 양호한 기초세포(basal cell)를 지닌 다층상피를 함유한다. 피부층은 피부 섬유 아세포가 분포된 콜라겐 매트릭스를 함유한다. 입체 콜라겐내의 세포는 여러측면에서 생체내에서 진행되는 것과 유사한 분화상태를 나타낸다. 예를들어, 원래의 섬유 아세포는 시험관내에서 합성-활성이 있으며, 매트릭스내에 콜라겐 및 기타 분자종류의 수가 풍부하고, 생체내에서는 세포의 고유한 투과특성을 나타낸다[참조예 ; Collagen Rel. Res. 4 : 351-364(1984)]. 또한 피부조직 등가물은, 케라티노사이트에 색소를 제공하는 멜라노 사이트를 첨가시킴으로써 유색화되고, 이러한 과정은 시험관내에서 자외선 조사에 의해 신속히 수행되는 것으로 보고되었다[참조 : J.Invest. Derm
atol. 87 : 642-647, 1986].
미합중국 특허 제4,835,102호에는 시험관내에서 천연조직의 생리적, 생물학적 다수 특성을 재생함으로써 조직세포생물학, 생리학 및 병리학등과 같은 연구에 사용할 수 있는 조직 등가물 도입시스템이 기술되어 있다. 이러한 시스템에는 기기, 및 하나이상의 조직등가물을 사용함으로써 조직과 하나이상의 제제와의 상호작용을 측정하기 위한 키트(kit)가 포함된다. 제제에는 화학제, 화장품, 약제와 같은 각종 물질, 광선 또는 물리적 상해와 같은 자극 ; 및 피부보호제가 포함되며, 이들로만 한정되는 것은 아니다.
조직 등가물은 목적하는 어떠한 형태로라도 성형될 수 있다. 피부이식 및 시험시스템용 피부조직 등가물로 일반적으로 편평한 쉬트(sheets) 형태로 성형되고 혈관 등가물은 강관 또는 강관의 그물 형태로 제조된다. 그러나, 조직등가물의 천연의 형태 또는 구조는 목적하는 바에 따라 변경할 수 있다. 예를들어 피부조직 등가물은 쉬트가 아닌 실린더 형태로 성형할 수 있다.
섬유 아세포 또는 평활근 세포를 조직 등가물 제조시 수축제로 사용하는 경우, 다시 당겨지지 않은 콜라겐 격자는 모든 방향에서 수축하게 된다. 제어가능한 구조 및/또는 크기를 지니는 생조직 및 조직 등가물을 생성시키기 위한 각종 방법이 인용특허에 기술되어 있다(예 ; 미합중국 특허 제4,485,096호). 예를들어, 콜라겐 격자를 고정된 가장자리를 묶기 위한 강철 프레임상에서 성형시켜 두께에 있어서만 실질적인 수축이 일어나도록 한다. 조직등가물의 형태를 조절할 수 있는 기타 물질에는 VELCROR, 직조플라스틱, 및 직조 TEFLONR이 포함된다. 이러한 압박(constr
aining)물질이 효과적이긴 하나, 가격 및 용이성 측면을 고려한다면, 캐스팅 챔버내도 도입되지 않는 압박수단을 사용하는 것이 바람직하다.
조직등가물의 다양항 용도로 인하여 개선된 조직등가물 및 이의 제조방법이 요구된다.
본 발명은 수축제로 수축시킨 수화된 콜라겐 격자, 및 콜라겐 겔을 함유하는 조직 등가물을 제공한다. 본 발명은, 또한 수축정도, 피부조직 등가물인 경우엔, 상피의 분화정도에 있어서, 시료에서 시료로의 증가된 재생성을 포함하는 개선된 특성을 지닌 조직 등가물을 제공한다.
본 발명의 양태로서, 상기 조직 등가물은 섬유상 패드 및 아가로즈와 같은 겔을 포함하는 흡수요소 하나이상과 인접해있다.
또한, 본 발명은 상기 개선된 조직 등가물의 제조방법 및 용도를 제공한다. 본 발명의 방법은 제조의 용이성 및 제조단가의 절감이라는 면에서 인용특허의 방법보다 좋은점을 지닌다.
본 발명에 따른 조직 등가물의 제조방법은 (a) 콜라겐 및 하나 이상의 수축제를 함유하는 혼합물을 형성시키고 ; (b) 단계(a)에서 수득된 혼합물을 콜라겐 겔에 가한후, 혼합물 및 겔을 조직 등가물의 형성을 허용하는 조건하에서 유지시킴을 특징으로 한다.
본 발명은 조직과 하나 이상의 제제와의 상호작용을 측정하기 위한, 상기 조직 등가물이 도입된 기기를 제공한다.
본 발명의 바람직한 양태로서, 이러한 기기는 콜라겐 겔(그위에 조직 등가물이 형성된다)과 인접한 투과성 요소에 의해 분리된 제1및 2영역을 포함한다. 즉, 조직 등가물은 제1영역, 투과성 요소는 제2영역을 한정한다.
본 발명의 또다른 양태로서, 상기 기기는 하나 이상의 조직 등가물 및 조직 등가물용의 하나 이상의 용기로 이루어지는데, 이 용기는 (i)콜라겐 겔(이위에 조직 등가물이 형성된다)과 인접한 투과성 요소(이때 투과성 요소는 내벽의 바닥을 이룬다)를 지니는 내벽, 및 (ii) 외벽(이안으로 내벽이 내재되어 있다)으로 구성된다.
본 발명의 조직 등가물은 인용특허에서 기술된 바와 같이 수화된 콜라겐 격자를 함유하는 조직 등가물의 제조방법 및 용도는 유사하나, 콜라겐 층을 추가로 함유하고 있다.
투과성 요소와 접한 콜라겐 겔상의 콜라겐 격자 캐스트는 두께에 있어서만 수축을 일으키고 방사상 또는 측방향으로 거의 수축되지 않으므로, 방사상 또는 측방향의 수축을 억제하기 위한 강철 프레임과 같은 콜라겐 격자 고정기구가 필요치 않다는 의외의 사실을 밝혀냈다. 예를들어, 인용특허에서의 직경 24mm 콜라겐 격자 캐스트는 고정기구 없이는 직경 5mm 이하로 방사상으로 수축한다. 반면, 투과성 요소와 접한 콜라겐 겔사의 직경 24mm 콜라겐 격자 캐스트는 직경 약 15mm까지 방사상으로 수축할 것이다. 측/방사상 수축의 제어를 위한 고정기구의 생략은 비용절감 및 조직등가물 제조 용이성 면에서 유리하다. 그러나, 상기 고정기구는 필요에 따라 투과성 요소와 접한 콜라겐 겔과 병용하여 사용할 수 있음도 인지하여야 한다.
본 발명의 조직 등가물의 제조방법은, (a) 콜라겐 및 하나 이상의 수축제를 함유하는 혼합물을 형성시키고, (b) 단계 (a)에서 수득한 혼합물을 투과성 요소와 접하고 있는 콜라겐 겔에 가한후, 조직 등가물의 생성을 허용하는 조건하에서 혼합물 및 겔을 유지시킴을 특징으로 한다.
본 발명의 몇몇의 양태에서, 하나 이상의 흡수요소에는 섬유상 패드, 목면패드 및 겔, 아가로우즈가 포함되나 이들로 한정되는 것은 아니며, 이들은 상술한 콜라겐 겔과 함께 사용된다. 이러한 흡수요소는 지속적이고 균등한 물리적 지지체로서 작용하여 조직 등가물과 세포 배양 배지 사이의 균등한 접촉을 도모하는 것으로 밝혀졌다. 흡수요소는 전형적으로 수화된 콜라겐 격자와 반대방향의 콜라겐 겔 표면과 인접한다. 흡수요소(들)가 겔(예 ; 아가로즈) 그자체인 경우, 겔은 영양 배지와 함께 제공되어 조직 등가물에 영양분을 공급할 수 있다.
피부조직 등가물의 각 발생기간 동안, 콜라겐 겔 및/또는 흡수요소가 도입된 및 도입되지 않은 조직 등가물에 대하여 실험결과를 하기 사항을 기준으로 측정한다 :
1. 당 이용성
2. 상피층화 및 각화의 정도 및 양
3. 배지의 pH
흡수요소(들)과 함께 유지시킨 조직 등가물에서 수득한 배지의 pH 측정치는 이들 요소가 없이 유지시킨 조직 등가물에서 보다 일괄적으로 높으며, 생리적 pH와 더욱 밀접한 것으로 나타났다. 또한 당 이용성은 흡수요소가 없는 조직 등가물에서 보다 일반적으로 낮았다.
완숙 각질화는 흡수요소가 없이 제조된 대조근 피부 등가물과 비교하여 이들 요소를 사용하여 제조한 피부조직 등가물에서 더욱 촉진된다는 놀라운 사실이 밝혀졌다. 이들 흡수요소가 상피분화에 미치는 영향에 대한 기작은 아직 밝혀지지 않았으나, 이들 요소가 확산장벽(예 : 투과장벽)으로 작용하고, 배지를 여과시키고/거나 조직 등가물에 밀접하게 분비된 세포성 생성물을 보유하는 것으로 추론된다.
본 발명의 생피부 등가물은, 수화된 콜라겐 격자를 콜라겐 겔상에서 성형시킴을 제외하고는 인용특허에 기술된 바와 같이 제조한다.
본 발명의 피부조직 등가물의 또다른 제조방법은, (a) 콜라겐 및 하나 이상의 수축제를 함유하는 혼합물을 생성시키고 ; (b) 단계 (a)에서 수득된 혼합물을 투과성 요소와 접하고 있는 콜라겐 겔에 가한후, 조직등가물의 생성을 허용하는 조건하에서 혼합물 및 겔을 유지시키고 ; (c) 단계 (b)에서 수득된 조직 등가물에 카라티노사이트를 접종시킴을 특징으로 한다.
본 발명의 조직 등가물을 캐스팅하는 편리한 방법은, pH 약 3 내지 4의 콜라겐 산성 용액과 영양배지를 함께 신속하게 혼합하고, 필요에 따라 생성된 용액의 pH를 약 6.6 내지 7.8로 조절한 후, 섬유 아세포를 가하고, 생성된 혼합물(“캐스팅 혼합물”)을 적절한 금형 또는 배치된 콜라겐 겔을 함유하는 캐스팅 기기로 옮긴 후, 바람직하게는 약 35° 내지 38℃의 온도에서 배양시키는 단계를 포함한다. pH를 조절하고 캐스팅 혼합물의 성분을 연속적으로 주합시키기에는 가장 편리한 방법이다. 그러나, 이러한 단계가 목적하는 순서에 따라 수행할 수 있기는 하나, 캐스팅 혼합물이 적절한 셋팅(setting)을 위한 금형에 옴겨질 수 있도록 단계를 완료해야 한다. 콜라겐 피브릴(fibril)은 용액을 가온하고 pH를 올림으로써 캐스팅 혼합물로부터 침출되어 수축제에 의해 수축되고 콜라겐 겔에 존재하는 수화된 콜라겐 겔을 형성한다.
본 발명의 생조직 제조방법은 조직 등가물의 제조에 일반적으로 사용할 수 있으나, 이들 방법은 조직 이식용도 및 피부 등가물이 도입된 시험 시스템용 피부 등가물의 제조와 관련하여 기술될 것이다.
피부조직 등가물을 포함한 조직 등가물을 사용하여 조직과 하나 이상의 제제와의 상호관계를 측정하기 위한 기기, 방법 및 키트는 미합중국 특허 제4,835,102호에 기술되어 있다. 이러한 용도의 조직 등가물은 본 발명에 따른, 투과성 요소와 접한 콜라겐 겔을 추가로 함유하는 것이 유리하다.
도면중, 제1 내지 3도는 본 발명에 따른 피부 조직 등가물을 이용하여 피부와 하나 이상의 제제와의 상호작용을 측정하기 위한 기기의 양태를 나타낸 것이며, 여기에서, 본 발명의 조직 등가물을 지니는 복합용기(10),(20)는 바닥 또는 고정기에 배치된다. 제1 내지 3도의 기기에는 덮개요소(2)도 나타나 있다. 또다른 양태로서, 덮개가 용기(10),(20) 각각에 제공된다(표시되지 않음). 덮개는 용기를 밀폐할 수 있는 생물-흔화성 물질중에서 선택된다. 허용되는 덮개 물질에는 접착제나 열에의해 기기를 밀폐시킬 수 있는 호일 및 장벽필름이 포함된다. 열-밀폐할 수 있는 폴리에스테르 필름은 본 발명의 실시에 특히 유용하다.
조직 등가물용 용기는 외용기 (10) 및 내용기(20)로 구성된다. 내용기 (20)에는 외용기(10)내에 내용기(20)을 내재하기 위한 림(50)이 존재하여, 이것으로 외영역 (14)과 내영역 (22)이 분리된다. 내용기 (20)에는 투과성 요소(24)와 접한 콜라겐 겔(25) 상에 형성되는 피부조직 등가물(26), (28)이 존재한다. 투과성 요소는 내용기(20)에 완전히 결합되어 있어서 이의 바닥면을 이루게된다. 피부조직 등가물은 2층(26), (28)으로 되어 있으며, 층(28)은 상피층이고, 층(26)은 피부층이다. 또 다른 양태로서, 밀봉요소(30)은 내용기(20)의 내벽과 피부 등가물(26)사이에 밀폐부를 제공하고, 조직 등가물(26), (28)의 가장자리가 콜라겐 겔(25)의 안쪽에 위치하는 경우 콜라겐 겔(25)의 가장자리를 덮게된다. 도면에 나타낸 양태중, 용기 (10)에는 외영역(14)와의 소통을 가능케하는 개방부(21)이 존재한다.
제3도의 기기는 흡수요소(32)도 지닐 수 있다. 다른 양태에서는 외영역 (14)에는 나타나지는 않았으나 여기에 함유되는 겔을 지닐 수 있다.
제4 내지 6도는 본 발명에 따른 조직 등가물을 사용하여 조직과 하나 이상의 제제와의 상호작용을 측정하기 위한 기기의 또다른 양태를 나타낸다. 상기 양태에서와 유사한 요소들이 같은 번호로 도시되어 있다. 여기에서 외벽(10)은 사각형이고, 내용기 (20)이 배치될 수 있도록 바닥에서 돌출된 부위(60)이 존재한다. 기기의 바닥에서 위로 돌출된 외벽 (10)은 기기의 상단으로부터는 주머니 모양을 형성한다.
외벽 (10)에는 조직 등가물에 필요한 영양배지가 공급된다. 이러한 배지는 본 분야에 공지된 것이다. 바람직한 혈청이 유리된 영양배지는 미합중국 특허원 제361,041호에 나타나있다. 배지의 양은 배지에 의해 투과성 요소(24), 콜라겐 겔(25), 조직 등가물(26), (28)을 통해 내용기(20)에 가해지는 압력이 형성되지 않도록 하는 적절한 수준까지 외용기(14)를 충전시키도록 선택되어야만 한다.
본 발명의 몇몇 양태에서, 외용기(10)은 투과성 요소(24)의 외표면과 접하게 되는 흡수요소(32)가 배치된다. 흡수요소(32)는 생조직 등가물과 혼화성을 지녀야만 한다. 흡수요소로서 바람직한 물질에는 목면, 폴리에스테르 및 레이욘이 포함된다. 특히 바람직한 것은 흡착면이다. 일반적으로, 흡수요소에는 세제와 같은 첨가제가 유리된 것이 바람직하다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 외벽 (10)에는 아가로즈와 같은 겔(표시되어 있지 않음)이 있으며, 이것은 배지를 트랩(trap)하기 위해 사용된다. 아가로즈 겔은 개방부(21) 바로 아래까지 첨가될 수 있으므로, 조직 등가물에 상당량의 영양배지가 공급되며, 조직 등가물(26), (28)에 공급되는 영양분은 쉽게 고갈되지 않는다. 이러한 겔을 사용하면 배지의 누출이 극소화되고 이로 인해 조직 등가물의 오염이 극소화된다는 측면에서, 본 발명의 기기에 저장성 및 적재능력의 장점을 부여한다.
외용기(10) 및 내용기(20)은 조직 등가물을 포함한 분석 구성성분과 반응을 일으키거나 목적하지 않는 영향을 미치지 않는 것이라면 어떠한 물질로도 제조할 수 있다. 예를들어, 생조직 등가물용 캐스팅 혼합물은 조직 등가물의 형성을 간섭하도록 수축기간동안 내용기벽에 들러붙지 않아야 한다.
내용기(20)을 멸균하는데 사용되는 방법은, 조직 등가물의 접착성에 영향을 끼치는 것으로 밝혀졌다. 예를들어, 생성된 조직은 산화에틸렌에 의해 멸균시킬때 말고 전자빔으로 멸균시킬때 내용기에 적합한 물질인, 폴리스티렌에 접착된다. K-수지, 폴리스티렌 및 부타디엔의 합성물질 및 내용기에 바람직한 물질은 조직 등가물을 점착시키지 않으면서 전자빔에 의해 멸균될 수 있다(K-수지는 Phillips Petroleum의 상품명이다). 또다른 양태로서, 용기의 벽 또는 창을 통하여 용기 내부의 조직 등가물을 관찰할 수 있도록 제조된 용기가 바람직하다. 용기 (10)에 바람직한 물질에는 폴리스티렌 및 PETG가 있다.
내용기 (20)은 조직 등가물의 목적하는 크기 및 형태를 만들 수 있는 형태 및 용적으로 제조될 수 있다. 용기의 크기는 또한 목적하는 조직 등가물의 크기 및 모양, 및 목적하는 분석량에도 좌우된다. 예를들어, 외부직경이 약 25mm, 용적이 약 5ml인 용기가 본 발명의 실시에 유용하다. 제1 내지 3도에 나타낸 양태중에서, 복합용기에는 바닥 및 고정기가 포함된다.
투과성 요소(24)는 콜라겐 겔(25) 및 조직 등가물(26), (28)을 지지할 수 있는 충분한 강도를 지녀야 한다. 다공성 막은 본 발명의 실시에 유용하다. 이러한 막의 공극의 크기는 콜라겐 겔(25)에 점착력을 제공할 수 있는 것으로 선택된다. 막이 친수성이며, 두께가 약 1 내지 10mm, 공극의 직경이 약 1 내지 약 10μ인 것이 바람직하다. 투과성 요소(24)로서 바람직한 물질은 폴리카보네이트이다. 특히 바람직한 투과성 요소는 습윤제를 함유하지 않고 Nuclepore에서 시판되는 공극 크기 약 3 내지 10μ의 폴리카보네이트 막이다.
밀봉요소(30)은 분석조건에서 및 사용될 조직 등가물에 대해 불활성이며, 내용기 (20)과 조직 등가물 사이를 잘 밀폐시킬 수 있는 물질로 제조된다. 바람직한 물질은 폴리에틸렌, TEFLONR, 폴리카보네이트 및 나일론이 포함된다. 밀봉요소는 특히, 상피 (25)에 적용될 용액 또는 물질로 부터 외용기의 함유물을 격리시켜야 할 경우, 예를들면 조직 등가물을 통한 기질의 확산 또는 투과성을 측정할 때 유용하다.
본 발명에 따른 조직 등가물 및 콜라겐 겔 모두는 피부 및 건(예; 랫트 꼬리 건, 소 피부 콜라겐, 및 소의 신근건)에서 추출한 콜라겐을 사용하여 제조할 수 있다. 다른 콜라겐 공급처도 가능하다. 소의 전신지 신근건에서 추출된 콜라겐 조성물, 및 이러한 콜라겐 조성물을 수득하는 방법은 미합중국 특허원 제 호(본원과 동일자 출원)에 기술되어 있으며, 이들도 본원에서 참조로서 인용되었다.
본 발명의 방법으로서, 콜라겐 겔(25)은 약 0.5 내지 2.0mg/ml, 바람직하게는 약 0.9 내지 1.1mg/ml의 콜라겐 및 영양배지를 함유하는 콜라겐 조성물로부터 제조된다. 이러한 콜라겐 조성물은 내용기 (20)에 첨가되고, 콜라겐 조성물이 적당한 크기, 보편적으로 약 1 내지 5mm의 두께, 바람직하게는 약 2 내지 약 3mm의 두께의 크기로 콜라겐 겔을 성형하고 생성하도록 하는 조건하에서 유리시킨다. 콜라겐 겔(25)은 세포가 조직 등가물에서 콜라겐 겔로 이동하여 일부가 비세포 상태로 남아 있을 정도로 두껍고, 조직 등가물용으로 필요한 외용기(10)에서 공급되는 영양소가 공급될 수 있도록 얇은 것이 바람직하다.
상피 등가물은 인용문헌 및 하기의 설명에 따른 방법을 사용하여 콜라겐 겔상에서 성형된다. 콜라겐 및 섬유 아세포를 함유하는 캐스팅 혼합물을 콜라겐 겔(25)상의 내용기(20)에 가하고, 조직 등가물이 형성되도록 하는 조건하에서 유지시킨다. 조직 등가물은 콜라겐 겔(25)상에 형성되고 방사상으로 수축한다. 그러나, 콜라겐 겔(25)는 직조된 금속 및 플라스틱 또는 VELCROR과 같은 기계적 고정요소 없이도 과다한 방사상 수축을 억제한다.
조직 등가물(26)의 양측은 콜라겐 겔(25)의 외부 가장자리로 경사져서 제3 및 6도의 (52)가 나타내는 바와 같이 메사(mesa ; 봉우리가 편평한 언덕같은 모양)를 형성한다. 조직 등가물(26)에 상피세포를 접종하여 상피층(28)을 형성시킨다. 상피세포는 세포농도가 약 0.3×106내지 30×106세포수/ml일때 배지에 접종한다. 접종되는 상피세포의 용적은 메사의 크기에 좌우된다.
콜라겐의 농도, 세포수, 캐스팅 흔합물의 용적은 생조직 등가물의 직경 및 두께를 최적화하도록 조절할 수 있다. 캐스팅 혼합물은 약 1.25 내지 5×104세포수/ml의 세포, 영양배지 ml당 약 0.5 내지 2.0mg/ml의 콜라겐을 함유한다. 바람직한 세포농도는 약 2.5×104세포수/ml이다. 조직 등가물을 위한 캐스팅 혼합물의 용적 대 콜라겐 겔을 위한 캐스팅 혼합물의 용적비는 세포 생존성 및 분화에 영향을 받는다. 조직 등가물 캐스팅 혼합물대 콜라겐 겔 캐스팅 혼합물의 유용한 비 V/V는 약 3 : 1 내지 1 : 3이다. 콜라겐 격자중 세포의 농도가 약 2.5×104세포수/ml인 경우 3 : 1의 비율이 바람직하다.
본 발명은 하기 실시예와 관련하여 더욱 상세히 설명되며, 이는 단순히 예시에 불과할 뿐 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 간주되어서는 안된다.
하기 실시예에서 사용된 재료는 각 실시예에 표시되어 있거나, 표시된 문헌에 따라 제조된 것들이다. 실시예 수행기간 동안 멸균상태를 유지시킨다. 조직 등가물은 배양기중에 10% CO2하에 유지시키며, 멸균상태로 유지시킨다.
[실시예 1]
피부조직 등가물 시험 시스템의 제작
A. 제4도에 나타낸 것과 유사한 기기를 하기 공정의 수행에 사용한다. 작동을 위해 덮개를 벗기고 멸균 상태는 계속 유지시킨다. 기기에 관한 정보는 하기와 같다.
외용기(10) : 직경 38mm
용량 35ml
내용기(20) : 직경 24mm
용량 4ml
투과성 요소(24) : 폴리카보네이트 막(Nuclepore)
공극의 크기 3μ
두께 5μ
B. 콜라겐 겔을 하기와 같이 투과성 요소에 생성시킨다.
(1) 예비혼합 :
10×MEM 16.2ml
L-글루타민(200mM) 1.6ml
겐타마이신(50mg/ml) 0.2ml
소의 태아 혈청 18.0ml
중탄산 나트륨(71.2mg/ml) 5.0ml
스톡용액을 37℃에서 상기 순서대로 혼합하고 50ml 튜브내에(가스없음) 4℃에서 약 30분 저장한다.
(2) 0.05% V/V 아세트산중의 1mg/ml 콜라겐 용액 27.8g(송아지의 전지신근건에서 산으로 추출)의 무게를 재어 50ml 튜브에 넣고 4℃에서 30분간 저장한다.
(3) 예비혼합물 8.2ml 및 DMEM 완전배지(10% FBS, 4mM L-글루타민, 50㎍/ml 겐타마이신) 4ml를 가한다(1ml의 분취량을 피팻팅하여 내용기(20)에 가하고 겔을 후드내에 방치시킨다).
C. 조직 등가물을 사람의 피부섬유 아세포와 함께 캐스팅하고 하기의 사람 상피세포를 접종한다. 방법 및 시약에 관한 설명은 인용특허 및 동시 계류중인 미합중국 특허원 제07/361,041호(1989. 6. 5. 출원)에 기술되어 있다.
(1) 캐스팅 혼합물
상술한 예비혼합물 8.2ml를 상기 단계(2)에서 기술된 0.05% V/V 아세트산중의 1mg/ml 콜라겐용액 27.8g에 가하고, 인체 피부 섬유아세포(2.5×105세포수/ml) 4ml를 합한다. 3ml의 분취량을 피펫팅하여 용기(20)의 콜라겐 겔(단계 B(2)에서 생성)상에 가하고, 겔화되도록 방치한다. DMEM 완전배지 4.5ml를 외용기(20)에 가하고 36℃의 10% CO2하에서 4 내지 8일간 배양한다.
하기의 배지를 사용한다 :
Figure kpo00001
하기 사항만을 제외하고는 mSBM과 동일한 두가지 배지를 사용한다 :
Figure kpo00002
즉, 염화칼슘을 배지에 1.8mM로 가한다. 배지에 칼슘(예 ; mSBM+칼슘)을 합한 것이다.
D. 상피화는 조직 등가물을 캐스팅한지 6일째 부터 시작된다.
(1) 상피화
단계 C의 배지를 내용기(20) 및 외용기(10)에서 제거한다. 인체 상피세포(3.
33×106세포수/ml) 현탁액 50ul를 상기 단계 C의 조직 등가물상에 가한다. 용기를 36℃의 10% CO2하에서 4시간동안 배양한다. mSBM 12.0ml를 외챔버에 4ml는 벽에 가한다. 기기를 동일한 배양기에 되돌려 놓는다.
(2) 분화
상피화된지 2일째에 배지를 제거하고 mSBM+칼슘으로 대치한다.
(3) 에어리프팅(Airlifting)
상피화된 지 5일째에 하기 과정을 수행한다. 내챔버 및 외챔버에 있는 배지를 제거한다. 내용기(20)을 제거하고 cSBM+칼슘의 2배 용적으로 적신 목면패드를 외챔버(10)의 바닥에 깔고 cSBM+칼슘 9.0ml를 가한다. 내용기(20)를 다시 제자리에 놓고 기기를 35.5℃의 10% CO2하에서 배양시킨다.
(4) 유지
4일 간격으로 배지를 신선한 메인 SBM+칼슘배지로 갈아준다.
[실시예 2]
아가로즈를 함유하는 시험 시스템의 제작
물중의 2% 아가로스 용액을 오토클래이브하여 멸균시키고, 40℃까지 냉각시킨 후, 이와 동일한 용적의 2배 농축된 메인 SBM과 혼합한다. 흡착 목면패드를 제거하고, 혼합물 13m1를 외영역 (14)에 부은후, 36℃(10% CO2)에서 성형되도록 방치하고 기기를 다시 배양기에 넣고 사용전까지 저장한다.
본 실시예 및 기술된 양태는 단지 설명을 목적으로 하는 것이며, 본 발명의 취지 및 범위, 및 청구범위의 범위내에서 본 분야의 기술자라면 이를 다양하게 변형 및 변화시킬 수 있음을 인지하여야 한다.

Claims (19)

  1. 수축제에 의해 수축된 수화된 콜라겐 격자, 및 투과성 요소와 접하고 있는 콜라겐 겔을 함유하는 조직 등가물.
  2. (a) 콜라겐 및 하나 이상의 수축제를 함유하는 혼합물을 생성시키고, (b) 단계(a)에서 수득된 혼합물을 투과성 요소와 접한 콜라겐 겔에 가한 후, 혼합물 및 겔을 조직 등가물이 형성되도록 하는 조건하에서 유지시킴을 특징으로 하여, 조직 등가물을 제조하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 수축제가 섬유 아세포를 함유하는 방법.
  4. 제2항에 있어서, 단계(a)의 혼합물이 약 1.25 내지 5×104세포수/ml 농도의 섬유 아세포 및 약 0.5 내지 2.0mg/ml의 콜라겐을 함유하는 방법.
  5. 제2항에 있어서, 콜라겐 겔을, 약 0.5 내지 2.0mg/ml 농도의 콜라겐을 함유하는 콜라겐 용액을 캐스팅(casting)시켜 제조하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 단계(a)의 혼합물 및 단계(b)의 용액을 약 3 : 1 내지 1 : 3 V/V의 비로 사용하는 방법.
  7. 제2항에 있어서, 흡수요소가 투과성 요소와 인접하여 존재하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 흡수요소가 섬유성 패드 또는 겔을 함유하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 섬유성 패드가 목면인 방법.
  10. 제2항에 있어서, 아가로즈를 함유하는 겔이 투과성 요소와 인접하여 존재하는 방법.
  11. 콜라겐 겔(이위에 조직 등가물이 형성된다)과 인접한 투과성 요소에 의해 분리되는 제1 및 제2영역(이때, 조직 등가물은 제 1영역을 한정하고, 투과성 요소는 제 2영역을 한정한다)을 지님을 특징으로 하는, 조직 등가물 하나 이상을 사용하여 조직 등가물과 하나 이상의 제제 사이의 상호작용을 측정하기 위한 기기.
  12. 조직등가물 및 이를 위한 하나 이상의 용기[이때, 용기는 (i) 콜라겐 겔(이위에 조직 등가물이 형성된다)과 인접한 투과성 요소(이때, 투과성 요소는 내벽의 바닥을 이룬다)를 지니는 내벽, 및 (ii) 내벽이 내재하는 외벽을 지닌다)를 포함함을 특징으로 하는, 하나 이상의 조직 등가물을 사용하여 조직과 하나 이상의 제제와의 상호작용을 측정하기 위한 기기.
  13. 제12항에 있어서, 기기가 용기를 가역적으로 밀폐할 수 있는 용기 밀폐용 요소를 추가로 포함하는 기기.
  14. 제12항에 있어서, 내벽에 외벽과의 소통을 위한 개방부 하나 이상이 존재하는 기기.
  15. 제12항에 있어서, 내벽이 K-수지를 함유하는 기기.
  16. 제12항에 있어서, 흡수요소가 투과성 요소와 인접하는 기기.
  17. 제16항에 있어서, 흡수요소가 섬유성 패드 또는 겔을 함유하는 기기.
  18. 제16항에 있어서, 섬유성 패드가 목면인 기기.
  19. 제12항에 있어서, 아가로즈 겔을 외용기에 함유하는 기기.
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