JP3493199B2 - 埋込型プロステーシス、キットおよびそれを製造するための装置 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は損傷した靭帯や腱などの結合組織を取り替え
たり修復したりするのに適する方法と、そのような方法
において使用するためのプロステーシスに関する。また
そのようなプロステーシス形成するための装置が、プロ
ステーシスを形成するもとのキットとともに開示されて
いる。

米国特許第5078744号により、前方十字靭帯（ACL）な
どの損傷した靭帯の一部を、架橋（cross−linked）し
整列した繊維群に形成した精製結合性動物腱あるいは靭
帯組織繊維からなる人工靭帯で置き換えることにより、
修復することが公知である。

ACLの修復あるいは再構築のための最も一般的な方法
は、自生の組織からなる人工移植片を植え込むことであ
る。従って、宿主から、例えば膝蓋腱などの自生の組織
を収集し植え込みのためのプロステーシスを形成するこ
とが一般的な外科処置として行われている。

幾つかの合成の生物同化可能でない素材が人工靭帯の
製造に用いられてきており、それら素材は、プロステー
シスの植え込み後の繊維芽細胞の進界成長を支持あるい
は促進するため、その親和性によって選ばれている。

本発明によれば、宿主に埋め込む前の形態において、
繊維芽細胞を接種した生物適合性で合成の実質的に生物
同化可能なマトリックス素材からなる埋込型プロステー
シスが提供される。

「合成」という用語は単に、哺乳類において結合組織
修復に天然では用いられない素材あるいはそのような素
材の化学的変形物でない素材を意味する。したがってこ
の用語からは、コラーゲンや人工的に架橋したコラーゲ
ンマトリックスは除外される。（ただしもし所望ならば
コラーゲンを合成素材に加えて用いることが可能である
が） 「繊維芽細胞」（fibroblast）という用語は、繊維芽
細胞、繊維細胞、腱細胞あるいは滑膜細胞という名称で
しばしば呼ばれる細胞を含んでいる。この用語はまたこ
れらの細胞に対する前駆体細胞もカバーしている。

「実質的に生物同化可能なマトリックス素材」は、繊
維芽細胞を支持するための（例えば足場メッシュあるい
は中実構造の形態の）３次元構造であって、埋込型（又
は植込型）プロステーシス（人工器具又は人工補装器、
prostheses）において、体成分の化学的／生物学的機能
により、哺乳類の体の中で時間とともに（プロステーシ
スへの物理的応力による単なる破損ではなく）実質的に
分解するものを意味する。プロステーシスが成人に埋め
込まれてから５年後（より望ましくは埋め込み１年後）
に、この生物同化可能な素材は、分解してプロステーシ
スの全体としての構造に実質的に寄与しない程度に分解
していることが望ましい。

マトリックスはさらに次の分子を１つ以上含有するこ
とが望ましい。それらは、プロテオグリカン、グリコサ
ミノグリカン、フィブロネクチンあるいはその活性結合
領域、あるいは１つ以上の成長因子、例えば骨形成タン
パク質（BMP）繊維芽細胞成長因子、血管形成因子ある
いはその他の刺激因子である。

本発明のさらに別の実施態様によれば、プロステーシ
スあるいはその１部分（すなわち植え込み後に骨と接触
するプロステーシス領域）は、細胞の浸潤を容易にする
ため、骨誘導的（osteoinductive）あるいは骨通導的
（osteoconductive）薬剤を含浸させることが望まし
い。浸潤しやすい好適な骨誘導的素材の例としては、ヒ
ドロキシアパタイト、冷凍乾燥したあるいは脱塩した
（demineralised）骨、成長因子（例えば骨形成タンパ
ク質）などがあげられる。含浸は、プロステーシスの埋
め込みの直前に行うことが好適である。そのような素材
はプロステーシスの両端に組み込まれることが好適であ
る。

本発明のさらに別の実施態様によれば、マトリックス
上あるいは中において繊維芽細胞の接種のための適切な
条件下で、適切な培地および繊維芽細胞の存在のもとで
生物適合性で合成の、実質的に生物同化可能なマトリッ
クス素材を培養することと、そののち接種したマトリッ
クスを宿主に埋め込むこととからなる、ヒトあるいはヒ
ト以外の動物における損傷した結合組織を修復あるいは
取り替える方法が提供される。

適切な実質的に生物同化可能な合成ポリマーの例とし
ては、ポリラクチド（PLA）、ポリグリコリド（PGA）、
ポリジオキサノン、ポリカプロラクトン（PCL）、ポリ
ヒドロキシブチレート（ICI BIOPOL、登録商標）、ポ
リヒドロキシブチレートコヒドロキシバレレート（ICI
BIOPOL、登録商標）、ポリアンヒドリド、ポリオルト
エステル、ポリオルトカーボネート、ポリアミノカーボ
ネート、ポリトリメチレンカーボネートおよび上記のポ
リマーが形成される単量体を混和したコポリマーがあげ
られる。

本発明によるプロステーシスがコポリマーからなると
き、そのコポリマーはヒドロキシバレレートおよびヒド
ロキシブチレート単量体を含有することができる。その
ようなコポリマーにおいて、含まれるヒドロキシバレレ
ートの量は１から47モル％である。その他の特に適切な
コポリマーはPLA/PGAおよびPLA/PCLコポリマーである。

上記の実質的に生物同化可能な素材を複数含む複合物
（composite）もまたマトリックス素材あるいはそ一部
分として好適である。

マトリックスは、時間とともに機械的性質の２つ以上
の相損失を与えるような異なった分解速度を有する（例
えば異なった繊維型の）２つ以上の異なった素材から作
られていてもよい。異なった繊維型は異なった機械的性
質をもっていてもよい。例えば、高度に伸長可能な繊維
を、より伸長性の低い繊維を組合してもよい。マトリッ
クスは、伸長性の低い繊維が伸長を妨げる前に、ある一
定の程度伸長するように設計できる。この設計は、ある
限度の制御された応力を細胞に与え、かつ形成中の組織
に対する損傷に対して防御するために有利である。例え
ば、ポリカプロラクトン繊維は、ポリラクチド繊維より
もヤング率が低い。

さらに１つのポリマー上に別のポリマーをコーティン
グしてもよい。これは、機械的性質に基づいて選ばれた
良い素材が、（改変しない限り）必ずしも細胞培地にと
って良い素材ではないとき有利である。ここでより生物
適合性の良いポリマーが、より生物適合性の低いベース
素材をコーティングするために用いられる。例えばポリ
ラクチドはポリカプロラクトンよりも繊維芽細胞増殖に
対して、より良い基質を提供する。繊維芽細胞との共存
性を改善するために、ポリカプロラクトン繊維にポリラ
クチドをコーティングしてもよい。

上に示したように共重合性素材を用いることができ
る。これはコポリマーが、それを構成するホモポリマー
の分解速度の中間の値の分解速度を有しているとき有利
になる。従ってコポリマーの組成を制御することによ
り、分解速度を制御することができる。また繊維紡ぎあ
るいは押し出しによるコポリマー繊維の製造は、ホモポ
リマーよりも機械的性質のすぐれた繊維を生み出す。ポ
リラクチドポリグリコリドコポリマーはこれら両方の点
の良い例である。

マトリックスに接種するために好適な繊維芽細胞は自
己原性繊維芽細胞、同種異系繊維芽細胞、あるいは異種
繊維芽細胞である。繊維芽細胞は自己原性のものである
ことが望ましい。繊維芽細胞は、例えば真皮、腱あるい
は靭帯から由来するものである。マトリックスに接種す
るための繊維芽細胞は１つ以上の上記の型の繊維芽細胞
の混合物を含有してもよい。繊維芽細胞が自己原性のも
のである時は、大がかりな侵襲的外科術の必要性を避け
るため、それらを真皮から分離培養することが望まし
い。

繊維芽細胞は好適な方法のいずれかによって得ること
ができる。望ましい方法は皮膚バイオプシーを行うこと
である。

マトリックス素材は、繊維芽細胞の存在下で適切な培
地（例えばDMEM）を含有する培養容器にマトリックスを
入れ、細胞培養条件下で培養することにより、繊維芽細
胞の接種をすることができる。繊維芽細胞を培地に懸濁
し、得られる懸濁液をマトリックスの添加の前あるいは
後に培養容器に加える。１ミリリットルの培地当たりの
繊維芽細胞の個数は、どの程度の接種を行いたいかによ
って変化させることができる。

本発明のプロステーシスは、損傷した靭帯、腱、角
膜、真皮、硬膜（あるいは結合組織を有する他の部分）
の全部あるいは一部と置き換えるため用いることができ
る。損傷がかなりのものであるときは損傷した靭帯ある
いは腱を全面的に外科的にプロステーシスで置き換える
ことができる。損傷がそれほどでもないときは、既存の
損傷靭帯あるいは腱に（例えば縫合によって）結合させ
るため、マトリックスを設計することができる。

マトリックスの設計はいくつかの可能性のいずれかに
よることができる。マトリックスは繊維状構造であるこ
とが好適である。骨への固着を助けるため両端にループ
やその他の構造を有していてもよい（例えば「２トンネ
ル（two tunnel）」あるいは「オーバーザトップ（ove
r the top）」技術のどちらかを用いて）。それは例
えば編むこと、ニッティング、織ること、かぎ針編みな
どの適切な技術のいずれかにより形成することができ
る。マトリックスは伸長した形態であることが好まし
く、可撓性であることが望ましい。

この装置は、靭帯あるいは腱の自然の構造と固定を密
接に模倣するのがよい。例えばACL再構築のためには装
置は大腿骨から脛骨へ直接通ずるかあるいは装置の軸の
まわりに螺旋を描く繊維束からなる（fasicular）ユニ
ットに分かれて一緒に束ねた繊維の階層構造（hierarch
y）によって構成されていてもよい。固定は靭帯あるい
は腱の自然の固定領域に対してなされる。適切な固定手
段のいずれか（例えば、ネジ、くぎ、ステープルあるい
はスチン（sutine）など）を用いることができる。固定
手段はそれ自身生物同化可能であり、例えばポリヒドロ
キシブチレートから形成されている。

本発明は、合成の生物適合マトリックス素材と繊維芽
細胞の素材源とからなる本発明のプロステーシスを形成
するためのキットをさらに提供する。

適当な条件下での培養により、繊維芽細胞はマトリッ
クスの上及び／又は中で成長し、繊維芽細胞により接種
したマトリックスを生成する。

キットはさらに繊維芽細胞の増殖用の好適な培地から
なることができる。

理想的にはキットは無菌包装により提供される。ある
いはまた、キットの部分（parts）は使用直前に殺菌さ
れる。埋め込み前に、繊維芽細胞がプロステーシス中で
種となるように上記のような適切な培養条件下で、キッ
トの成分を一緒に保存することができる。

繊維芽細胞はすぐ使用できるような適切な形態のいず
れかを有する。したがって繊維芽細胞が低温保存するこ
とが好適である。

マトリックスあるいはその成分／前駆体は、凍結乾燥
した形態で提供できる。

好ましい実施態様においては、本発明は、埋め込み前
の形態において、密接に接触するポリマーゲルを有し、
ゲルがその中に分散した繊維芽細胞をもつような、生物
適合性で合成の実質的に生物同化可能なマトリックス素
材を含有する埋込型プロステーシスからなる。これは、
ゲルが、素材表面の単一層をただ支持するのではなく、
細胞を真に３次元の配置で支持することができるという
点において利点を有する。環境は細胞の自然の生理学的
環境を密接に模倣する。またゲル中への細胞の組み込み
は、均一な細胞分布を実現し、組み込まないときには重
力の影響により起こるかも知れない細胞の貯り（poolin
g）を防ぐことができる。

本発明は、繊維芽細胞を分散させたポリマーゲルに接
触するマトリックスを含有するプロステーシスを形成す
るため、適切な条件下でゲル形成組成物および繊維芽細
胞の存在のもとで生物適合性のマトリックス素材を培養
することと、その後にプロステーシスを宿主に埋め込む
こととからなる、ヒトあるいはヒト以外の動物における
結合組織を修復あるいは取り替える方法が提供される。

好ましいゲル形成組成物には、コラーゲンゲル形成組
成物と繊維素ゲル形成組成物が含まれる。

コラーゲンゲル中の繊維芽細胞はコラーゲンを利用し
それを再編成する能力を持っている。適切な機械的刺激
の下でそれらは、靭帯や腱の自然の超構造に似た非ラン
ダムに方向付けられた組織化された構造に、原繊維（fi
brils）を再編成する能力を有する。機械的刺激は、も
しそれを与えなければ２点でゲルを固定することにより
時間とともに起きるゲル収縮の防止でもよい。マトリッ
クスはこれを達成するために設計される。あるいはまた
マトリックスの上または中のゲルは、繊維芽細胞の整列
を刺激するために機械的応力装置を用いてかけられる応
力にさらされる。

この方法はゲル中の繊維芽細胞増殖のための適切な条
件の下でゲル接触マトリックスを培養し、その後そのマ
トリックスを宿主に埋め込む工程をさらに有していても
よい。

本発明の望ましい実施態様によれば、適切な培地と、
ゲル形成組成物と、種としていれる繊維芽細胞の存在の
もとでマトリックスを培養することにより、マトリック
スの接種をすることができる。もし必要ならばゲル形成
組成物のゲル化を引き起こす適切な薬剤を用いてもよ
い。

ゲル形成組成物、繊維芽細胞（および必要ならばゲル
化剤）の存在下でのマトリックスの接種により、ゲル中
に繊維芽細胞が分散した、ゲルでコーティングあるいは
充填したマトリックスが得られる。ゲルはゲル化剤とゲ
ル形成組成物の相互作用により形成することができる。
望ましいゲルはコラーゲンゲルである。適切なコラーゲ
ン源を用いて、Ｉ型、II型、あるいはIII型コラーゲン
溶液を調製することができる。例えばＩ型のコラーゲン
溶液は上記のように真皮から調製することができる（Ｉ
型のコラーゲンは皮膚において見られる細胞外タンパク
質の70％までを形成する）。あるいはまたＩ型コラーゲ
ン溶液は、例えばラットあるいはウシの腱のような、ほ
とんど排他的にＩ型コラーゲンを含む腱から調製するこ
とができる。コラーゲンは当業者に公知の何れかの標準
方法によって抽出することができる。

マトリックスの中あるいは上にゲルを組み込む好適な
方法がいくつかある。例えば、ゲル形成溶液（繊維芽細
胞を含有していてもよい）がマトリックスを完全に取り
囲むようのやり方で、マトリックスを懸濁することがで
きる。マトリックスを取り囲む型枠（mould）を用いる
ことができる。ゲルをマトリックスに導くために遠心分
離や吸引を代替的に用いることができる。

望ましい実施態様のプロステーシスを形成するために
用いられるキットは、生物適合性のマトリックスと、ゲ
ル形成組成物と、繊維芽細胞の源を含むことができる。

あるいはまた、キットはポリマーゲルを含むコーティ
ングを有する及び／又は中に組み込んだポリマーゲルを
有する生物適合性マトリックスと、繊維芽細胞の源を含
む。適切な条件の下での培養により、繊維芽細胞はゲル
に侵入し、中に繊維芽細胞をもつゲルを含むマトリック
スを生成することができる。

本発明のプロステーシスは、埋め込み前に繊維芽細胞
を有するので、埋め込み後に繊維芽細胞の進界成長を高
め、繊維芽細胞が生育して新しい靭帯を形成する骨組と
なるように設計された、従来の公知のプロステーシスに
対し利点を有する。このように損傷した組織は、自己複
製する生育可能な繊維芽細胞を含むプロステーシスによ
って置き換えることができる。繊維芽細胞は既に埋め込
み時に実質的に整列しているか、あるいは少なくとも非
ランダムに方向付けられている。この過程は、埋め込み
後の繊維芽細胞によるプロステーシスの浸潤（infiltra
tion）に依存する従来の公知の方法に比較して速い。繊
維芽細胞によるプロステーシスの接種をするために時間
調整した初期の予め決められた培養期間後に、プロステ
ーシスを埋め込むことができるということが明らかにな
るであろう。あるいはまた、プロステーシスが埋め込ま
れたとき繊維芽細胞が自己増殖し既にコラーゲン原繊維
を分泌し始めるように、初期培養期間より長い培養期間
にわたってプロステーシスを培養することができる。

本発明のプロステーシスと方法は、腱を収集するため
大がかりな外科手術を実行する必要性を避けられるとい
う点において、通常の外科処置あるいは宿主膝蓋腱を収
集することに対して別の利点を有する。単純な皮膚生検
（実質的に傷跡を残さない標準手順）を用い、繊維芽細
胞を得て、培地で増殖させることができる。さらにこの
プロステーシスは、繊維芽細胞方向を最適化するよう設
計することもできる。これらの利点の累積効果により病
院滞在の期間を短縮することができる。

コラーゲンゲルがマトリックスに接触する、本発明の望
ましい１つの実施態様によれば、本発明のプロステーシ
スは、繊維芽細胞によって利用できるなコラーゲン源を
提供する。ゲル中のコラーゲンは非架橋形態（non−cro
ss−linked）であることが望ましい。

さらにもう１つ別の本発明の望ましい実施態様によれ
ば、繊維素ゲルが用いられる。

本発明のさらに別の態様によれば、繊維芽細胞を生育
可能な条件に維持するチャンバーを備え、チャンバーが
マトリックス素材を離脱可能に保持する手段と、単一の
軸だけに沿ってマトリックス素材に応力を印加するよう
にした手段とを備える、本発明によるプロステーシスを
形成するため用いられる細胞培養用の装置が提供され
る。そのような装置は上に述べたようにキットの中に含
めることができる。

いくつかの応力手段が存在するときは、本発明の装置
はある時間において複数の試料に応力を印加することが
できる。したがってこの装置は培地を保持するようにし
た１つ以上のチャンバーを有し、複数のマトリックス素
材を離脱可能に保持する手段を備えることができる。こ
れは同時に行うことができる。幾つかのチャンバーの各
々は、複数のマトリックス素材を離脱可能に保持する手
段を備えることができる。あるいはまた各チャンバーは
単一のマトリックス素材を離脱可能に保持する手段を備
えることができる。

チャンバーは装置の中に永久に固定することができ
る。あるいはまたチャンバーは、必要に応じて装置から
取り除くこと、例えばマトリックス素材の保持と離脱を
容易にするためチャンバーを取り除くことができるよ
う、離脱可能に固定されていても良い。

チャンバーは、例えばガンマ線照射、蒸気殺菌あるい
はエチレンオキシド（ETO）殺菌のような適切な殺菌方
法によって殺菌された素材の何れかから作ることができ
る。

チャンバーは所望の形状および大きさであってもよ
い。チャンバーは円柱、立方体あるいは球体の形状であ
ることが好適である。チャンバーの寸法は、マトリック
ス素材を保持し引き続き応力の印加によって伸長できる
ような寸法とするべきである。本発明の装置は（非伸長
形態の素材に対して）マトリックス素材の100％までの
伸長を引き起こす応力を印加するように形成することが
できる。しかしながら一般的に言えば、10％まであるい
は５％までの伸長で十分である。

このようにチャンバーの寸法は、マトリックス素材を
所望のレベルまで伸長できるような寸法とすることがで
きる。

チャンバーの寸法は、75cm³まで、例えば50cm³までの
容量を持つようにすることが望ましい。チャンバーは適
切な素材の何れか、例えばステンレススチールあるいは
パースペックス（Perspex:商標）素材から作ることがで
きる。殺菌を行い易くするため、素材はオートクレーブ
処理可能なものであることが望ましい チャンバーは、培養期間中にマトリックス素材を見る
ことができるように透明なあるいは半透明の窓を備えて
いることが望ましい。好適な素材の例としてはガラスお
よびポリメチルメタクリレート（PERSPEX）があげられ
る。

チャンバーは内部にアクセスできるよう、取り外し可
能にあるいは蝶番式に取り付けられた閉部分を備える。
従って例えばチャンバーはその少なくとも１つの端が取
り外しできるようなガラス円筒を備える。チャンバーは
折り畳み可能あるいは入れ子式のものであることが好適
である。

チャンバーは恒温的に制御することが望ましく、水ジ
ャケットあるいはその他の加熱手段によって加熱され
る。それは各種のセンサ、例えばチャンバーの頭部空間
の中のCO₂含有量のセンサを備えることが望ましい。CO₂
源も備えることができる。

マトリックス素材はチャンバー内の保持手段によって
取り外し可能に保持される。

応力を印加する手段は、エレメント間の間隔が変動し
うるようにチャンバー内で可動である２つのエレメント
から構成できる。あるいはまた、１つのエレメントを可
動とし、他の１つを固定することも可能である。

保持手段は、マトリックス試料を取り外し可能に保持
する適切な手段の何れかである。保持手段のデザインは
マトリックス素材の両端のデザインに依存する。したが
って例えばマトリックス素材がループ状の両端を有して
いるとき、保持手段は１対のクリップあるいはフックを
備える。保持手段は例えば、共にネジ留めするかバネで
支持できるチャックあるいはレイズあるいは顎部を備え
ることが好適である。保持手段は、マトリックス素材の
両端がその上にうまく乗るようにデザインされた、スロ
ットあるいはその他の開口部の形状であることが好適で
ある。したがって例えばマトリックス素材の両端は、ス
ロットの中に保持された樹脂の中に埋め込むことができ
る。マトリックス素材に開口部があり、保持手段がその
中にはまるような、逆配置を用いることも可能である。
マトリックス素材を取り外し可能に保持するさらに別の
方法は、マトリックス素材をまわりに巻き付けて摩擦で
位置を保持することができるように概ね円筒形のスプー
ル状の物を設けることである。スプール状の物は、把持
装置（gripping device）により支持される。そのよう
なスプールの物は２つ設け、２つの把持装置にそれぞれ
１つ支持させることができる。

本発明の装置により応力を印加するべきマトリックス
素材は、生育可能細胞を支持する適切な素材の何れかを
備える。細胞はマトリックス素材の中にあるいはその全
長にわたって存在する。あるいはまた、マトリックス素
材の１部分、例えばその両端に細胞がないようにするこ
ともできる。マトリックス素材が伸長下に保持される前
か後に細胞をマトリックス素材に加えられる。しかしな
がらチャンバー内で素材が伸長下に保持される前に、細
胞を素材に加えることが望ましい。

マトリックス素材は、補綴の靭帯あるいは腱の形状で
デザインされる。例えばマトリックス素材が補綴の靭帯
の形態の場合、応力をかけない時の靭帯の長さは１から
30cmの範囲にあることが望ましい。マトリックス素材
は、埋め込みによって、例えば膝においてかかる応力の
大きさに耐えられるように選択する必要がある。

応力を印加する手段は、マトリックス素材の両端ある
いは１端を引っ張ることにより作用し、マトリックス素
材の伸長をもたらす。これは種々の手段、例えば機械
的、電気化学的、電気的、ピエゾ電気的、空気圧的、油
圧的あるいはその他の手段で行うことができる。マトリ
ックス素材は、チャンバーの一端にある静止成分に取り
外し可能に取り付けられ、マトリックス素材の逆の端は
張力印加部分（例えば巻き上げ装置など）に取り付けら
れる。チャンバー内に一端があり、他端はチャンバー外
にある隔壁によって、応力をマトリックス素材に印加す
ることが好適である。枢軸的に取り付けたレバーを用い
て応力を印加しても良い。

本発明はまた、マトリックスと細胞をおおうのに適当
な量の培地を有するチャンバー内において、生存細胞を
密接に接触してもっているマトリックス素材を剥離可能
に固定し、単一の軸に沿ってマトリックス素材に応力を
印加することとからなる応力下に細胞を培養する方法を
提供する。

本発明のマトリックスにおいて用いるのに適切な素材
は、以下に例示するように評価することができる。

素材の評価 繊維芽細胞の生育を補助する適切な素材の初期評価を
行うために、以下の表１に示されるように、様々の素材
（これは限定的に解釈されるべきではない）を取得し、
次の温度で2.5トンで５分間、膜状に成形した。ポリラ
クチド170℃、ポリグリコリド245℃、ポリヒドロキシブ
チレート185℃およびポリカプロラクトン65℃。

繊維芽細胞を素材1cm²あたり１×10⁴個の密度でこれ
らの素材の表面上に接種し、培養条件下で３日間培養し
た。

培養期間後に、細胞を接種をした試料の顕微鏡写真を
とった。これらは上の表１に示される試料について、図
1aから1dに示されている。（この出願のため提供された
全ての写真の写真複写は関連する写真の直後に作られ
る。） 繊維芽細胞が全ての素材の表面に十分付着し、健全な
培養繊維芽細胞に特有の形態を示していることが見て取
れる。

繊維芽細胞の１つの試料を、長い（16日間の）培養期
間を用いた以外は上記と同様にしてポリラクチド上で成
長させた。

この期間の後、細胞を生体染料（カルセインAM（２μ
Ｍ））で染色し、フルオレセインフィルタを用いて蛍光
顕微鏡で視覚化した。生存細胞の融合性単一層が観察さ
れ、ポリラクチドは培養時間の延長に対して生存繊維芽
細胞を支持する能力があることが示された。

図２は、生物同化性合成素材の４例すなわち（いずれ
も上述の）ポリラクチド（PLA）、ポリグリコリド（PG
A）、ポリヒドロキシブチレート（PHB）およびポリカプ
ロラクトン（PCL）上の繊維芽細胞の増殖を、組織培養
処理したポリスチレン（TCP）コントロール（TCPは良い
繊維芽細胞成長を支持することが知られているので）と
比較した時の相対割合を示すグラフである。

図2a）からｅ）は、（それぞれの参照例について）単
一のグラフ上で、これらの各々の素材を示す。細胞を１
×10⁴cells.cm^-2で三つに分けて接種し、標準細胞培養
技術を用いて培養の後、７日までの時間点において、細
胞DNAへのトリチウム化したチミジンの摂取量を測定す
ることにより、拡散率を定量した。培地は２日、４日、
および６日に変えた。点は３つの測定量の平均を表し、
誤差線は範囲を表す。全てのポリマーは繊維芽細胞の増
殖を支持した。

図３は15日間の培養の後の３次元コラーゲンゲルの中
に埋め込まれた繊維芽細胞の顕微鏡写真である。、マト
リックスに接触させるためには用いられなかった点以外
は（後述の）実施例２に記載されているようにして、細
胞を接種したゲルを調製した。ゲルは、細胞が埋め込ま
れ、膜インテグリン受容体を通じてコラーゲン分子との
反応を形成できる３次元構造を提供する。細胞はランダ
ムに配置され、長い突起を示し、ゲルの中のコラーゲン
原繊維を再編成する能力がある。

図４は、ゲルが、組織培養適合性接着剤で培養皿に貼
り付けた２つのステンレススチールの釘（peg）により
１つの方向に収縮することを抑制された点を除いて、上
の図３に記述されたような３次元コラーゲンゲル内に埋
め込まれた繊維芽細胞の顕微鏡写真である。細胞は高度
に方向づけられた態様で、その長い軸が抑制釘（constr
aining pegs）の間の軸に平行になるように配置され
る。コラーゲン原繊維（fibrils）は同じ軸に沿って整
列する。この効果は、培養物中に繊維芽細胞が存在する
時に、起こるであろうゲル収縮を防止する釘のためであ
る。

つぎの実施例は、制限的に解釈すべきではないが、細
胞を接種した種々のマトリックスがいかに生成されるか
を示す。

実施例1:繊維芽細胞を接種したポリラクチドマトリック
スプロステーシスの調製 ａ）細胞の調製 バイオプシーをリン酸緩衝食塩水（PBS）で３回洗浄
し、70％アルコールですすいだ。すすいだバイオプシー
は次に、ダルベッコの修正基礎培地（DMEM）に浸し、37
℃で24時間培養した。培養の後、バイオプシーをPBSの
下で小片に切り分けた。切り分けた小片は、消化させる
ための５ミリリットルのコラーゲナーゼ溶液を含む50mm
のペトリ皿に移された。表皮シートをコラーゲナーゼ溶
液から取り除いた。得られた溶液を遠心分離した。繊維
芽細胞ペレットをDMEMに再懸濁し、その後DMEMを用いて
35mmのペトリ皿に接種した。細胞は２日から４日の間に
集密的であってもよい。その後、マトリックスに接種す
るため適切な量の繊維芽細胞を提供するため、細胞を培
養してもよい。

分離した繊維芽細胞を培養するための適切な培地は、
以下のものすなわち、グルタミン、胎児子牛血清、非必
須アミノ酸および抗生物質を補ったDMEMからなる。さら
に培地は、重炭酸塩などの緩衝剤を有してもよい。

ｂ）マトリックス素材の調製 靭帯と置き換えるプロステーシスにおいて用いるのに
好適なポリラクチドマトリックス素材は、ポリラクチド
繊維を得て、靭帯と置き換えるのに適切な寸法の編みひ
も（braid）を形成するためにそれらを編む（braidin
g）ことにより調製できる。

ポリラクチド繊維は、押し出し成形、繊維紡糸、溶融
紡糸、延引成形、熱アニーリングなどにより得ることが
できる。

繊維を編むことは、標準の編み技術によって行うこと
ができ、適切な性質をもつ編みひもを形成するため、編
みひもの長さと厚さ、存在する繊維の数および存在する
繊維の直径を選択される。

装置の両端は、ネジあるいはその他の固定手段によっ
て装置に固定することを助けるために適切な方法で構成
される。これは両端に小穴（eyelets）を形成すること
により行われる。

ｃ）細胞によるマトリックス素材の接種 編んだ装置は体積比で10％の血清を含む培地で24時間
培養され、マトリックス素材の表面が細胞懸濁液で完全
に覆われるまで、細胞懸濁液をマトリックス素材の表面
上にピペットで分取することにより細胞を接種する。
（あるいはまたマトリックスを、例えばボトルローラー
上で撹拌する条件のもとで約６時間懸濁液とともに培養
してもよい。また別の方法としては、真空下で装置の中
を通して細胞懸濁液を吸引する（もし多孔質である場
合）ことによるか、あるいは装置を通して細胞懸濁液を
遠心分離することにより装置に接種することである。

ｄ）細胞を接種したマトリックスに応力をかけること 細胞を接種した装置は、単一の長手方向の軸に沿って
装置に応力をかける応力装置において両端を把持する。
これは、細胞の顕微鏡解析により評価されるように、長
手方向の一般的方向に沿って繊維芽細胞を実質的に整列
させることができるように十分の時間をかけて行われ
る。応力の印加が数時間にわたってあるいは数日にわた
って起こるが細胞が生育可能のままであるように、装置
は培養チャンバーを備える。通常は装置は37℃で応力を
印加する。

応力印加時、好適な条件下で細胞を培養するため培地
が用いられる。これは血清と、アスコルビン酸塩あるい
はその安定な類似体と、成長因子を含有する。

アスコルビン酸塩は繊維芽細胞を刺激してコラーゲン
を合成させる。血清は細胞の拡散と細胞の付着を促進す
る因子を含有し、成長因子は細胞拡散と成長および移動
を刺激することができる。

ｅ）細胞を接種したマトリックスの埋め込み 繊維芽細胞の整列が所期の程度になるよう十分な期
間、細胞を接種した装置に応力を印加した後、装置を細
胞応力装置から剥離し、所期の技術の何れかによって患
者に埋め込まれる。

侵襲的外科術が最小になることが望まれる。人工器官
の前方十字靭帯については、埋め込みは「２トンネル」
あるいは「オーバーザトップ」技術を利用して行われ
る。固定は、マトリックスの小穴を通して置かれたネジ
（あるいはその他の固定成分）を用いて達成できる。ネ
ジは、ポリヒドロキシブチレートなどの生物分解性素材
から形成されるのが好適である。

実施例2:繊維芽細胞が組み込まれたコラーゲンゲルを含
有する、繊維芽細胞を接種したポリラクチドマトリック
スプロステーシス調製。

これは、ポリラクチドマトリックスに接種するのに用
いられるコラーゲンゲル中に繊維芽細胞が組み込まれる
という代替的手順を挿入すること以外は実施例１に記載
した方法と類似の態様で行うことができる。この別段の
手順は以下に記載している。

ａ）コラーゲンの調製 酸に可溶で、かつ架橋していない形態でコラーゲンを
形成することが望ましい。これは次のように行うことが
できる。

Ｉ型のコラーゲンを腱から調製するが、例えば皮膚の
ような他の組織からのものであっても良い。組織を細か
く切り刻み、（体積比）70％のエタノールで少なくとも
30分消毒し、（体積比１％の）酢酸に分散させ、４℃で
撹拌しつつ培養する。上澄みを取り除き、適当な量の1.
0M水酸化ナトリウムを加えて中性にする。沈澱した１型
のコラーゲンを8000×ｇでの遠心分離によりペレット化
し、適当な量の（体積比１％の）酢酸にペレットを再懸
濁する。この溶液のコラーゲン濃度は適当な方法（例え
ば全タンパク検定−BCA検定）の何れかで測定し、コラ
ーゲン溶液の濃度を適切に（例えば3mg.ml−ｌを用いる
ことができる）調節する。

もし生成物がキットの場合が、無菌のコラーゲン溶液
を冷凍乾燥し、架橋形成を防ぐため、真空下あるいは不
活性ガス（例えばアルゴン）下で保存する。希釈（酢
酸）も準備することができる。あるいは溶液として準備
し４℃から−20℃で保存してもよい。

ｂ）細胞によるマトリックス素材の接種 マトリックスに接種するため、通常３つの成分、すな
わち適当な培地に懸濁した細胞と、コラーゲン溶液とゲ
ル化剤（例えば1Mの水酸化ナトリウム）を用いる。最終
のコラーゲン濃度はおよそ1mg.ml−ｌであり接種密度
は、ゲル1ml（あるいはマトリックスの中の体積）当た
りの細胞数でおおよそ３×10⁴個である。３成分を０℃
から４℃に維持し、混合してマトリックスに加える。マ
トリックスを十分に含侵させた後、37℃で培養し、ゲル
化を開始させる。

マトリックスの含浸は好適な方法の何れかを用いて行
う。マトリックスを型内で溶液中に単に浸しても良い。
あるいは溶液を、真空を利用して骨格の中へ吸引する
か、遠心分離で（例えば500rpmで５分間、０から４℃で
遠心分離した型の中で）押し込めてもよい。

温度を変化させることにより、ゲルの固化速度を変化
させることができる。

実施例3:繊維芽細胞が組み込まれた繊維素（fibrin）ゲ
ルを含有する、繊維芽細胞を接種したポリラクチドマト
リックスプロステーシスの調製。

これは、コラーゲンゲルのかわりに繊維素ゲルが用い
られることを除いて、実施例２に記載した方法に類似の
方法によって行うことができる。

この場合もまた、３つの成分すなわち細胞懸濁液と、
フィブリノーゲン溶液と、塩化カルシウム（mM）を含有
するトロンビン溶液が用いられる。最終の細胞濃度は、
1mlあたり細胞数３×10⁴個であり、フィブリノーゲン濃
度は3mg/mlで、トロンビン活性は2.5ユニット/mlで、塩
化カルシウム濃度は5mMである。試薬を混合しマトリッ
クスと共に培養する。溶液と含浸させた後、マトリック
スを37℃で培養して高速にゲル化させる。マトリックス
の含浸は、上記の何れかの技術によって行うことができ
る。

トロンビン活性及び／又は温度を変化させることによ
り、ゲル化速度を変化させることができる。

装置を形成するため合わせることのできる種々の構成
要素を示す、図5a）、ｂ）、ｃ）、ｄ）およびｅ）のみ
を参照して、例示により、前に言及した細胞応力装置を
説明する。

装置はパースペックス（Perspex:商標）の容器10（カ
ッタウェイ部分図で示す）およびふた20（図5a）および
5e）を参照）を備える。容器10は、細胞培養条件下で繊
維芽細胞を接種した伸長可能な素材を収容するのに用い
ることができる。参照し易いように、当業者によく知ら
れているであろうような、サーモスタットやセンサーや
培地の上部除去（topping up）のための入口（inlets）
やその他の成分は図示していない。

装置はさらに第一および第二グリップ30および40を備
え、そのそれぞれは釘（pegs）50を有する２つの平行な
アーム45を持っている。（図5c）およびｅ）を参照） グリップの１つ（グリップ40）は、モーター（図示せ
ず）により単一の長手方向の軸に沿って他方のグリップ
30へ向かってあるいは遠ざかる向きに動かすことのでき
るサポート60を備える。もう一方のグリップ30は装置の
端壁35に固定的に取り付けられている。

グリップ30と40は、スプール70および80を受けとめ保
持するように働く（図5c）および5e）を参照）。これは
溝90にはまる釘（ペグ、pegs）50によりなされ、それぞ
れスプール70および80のグリップ30および40に対する回
転を防ぐように、スプール70および80をグリップ30およ
び40に取り付ける。

スプール70と80は、細胞を接種したポリラクチド編み
ひもプロステーシス100で示される、繊維芽細胞を接種
した伸長可能な素材を保持する働きをする。

これは開口部110および120を通してプロステーシス10
0の両端を通し、プロステーシス100がスプール70および
80に摩擦によって保持されるように、スプール70と80を
それぞれ軸ＡおよびＢのまわりに数回回転させることに
よりなされる。（図5b）参照） 次にスプール70と80は上に述べたようにグリップ30と
40にはめ込まれ（図5c）参照）、グリップ30と40の間隔
がより大きくなるように容器の中でサポート60を引き込
むことにより、プロステーシス100を伸長させることが
できる。一旦所望の伸長がなされた時、取り外し可能な
ロック装置（図示せず）によりサポート60を固定保持
し、伸長したプロステーシス100を、必要な時間だけ培
養条件下で培養することができる。

プロステーシス100を容易に見ることができるよう
に、透明あるいは半透明の素材でできた窓130が設けら
れる。これは、いつプロステーシス100が埋め込みでき
る状態になったかを決めるため、プロステーシス100上
に生育する繊維芽細胞の顕微鏡的解析に用いることがで
きる。

容器10の底に置くために溝をつけた透明あるいは半透
明のブロック140も設けられる（図5d）参照）。スプー
ル70と80がグリップ30と40により保持された状態で、ス
プール70と80の上に置かれたとき、プロステーシス100
をおおう十分な培地を溝150が収容することができるよ
うに、ブロックの大きさが決められる。このことにより
用いられる培地の量が経済的になる。

応力装置の要素を形成するのに用いられる素材は、オ
ートクレーブ処理可能でアルコールで消毒可能である。
通常、その装置は37℃の温度で５％のCO₂の雰囲気で作
動させる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 ９３１４４７１．５ (32)優先日 平成５年７月７日(1993．7．7) (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号 ９３１４５８０．３ (32)優先日 平成５年７月14日(1993．7．14) (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号 ９３２０３５２．９ (32)優先日 平成５年10月２日(1993．10．2) (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号 ９３２０３６８．５ (32)優先日 平成５年10月２日(1993．10．2) (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） 前置審査 (72)発明者 サール，リチャード，ジョン イギリス国、ヨーク ワイオー２ ６エ イチイー、アッパー・ポップルトン、フ ェアウェイ・ドライブ 12 (72)発明者 マシューズ，ジェーン，ブリジェット イギリス国、ヨーク ワイオー２ １デ ィーピー、サウス・バンク・アベニュー 84 (72)発明者 キング，ジョン，ビー. イギリス国、ケント ビーアール１ ２ エヌダブリュ、ブロムリ、チゼルハース ト・ロード、ウェル・コテージ（番地な し) (72)発明者 パーマー，デブラ イギリス国、ドーセット エスピー７ ８ピーダブリュ、テン・エーカーズ、シ ヤフツベリ（番地なし) (72)発明者 シェルトン，ジュリア キャロライン イギリス国、ロンドン イー９ ７エヌ デー、ハックニイ、ビクトリア・パー ク・ロード 187 (56)参考文献 特表 平４−505717（ＪＰ，Ａ) 特表 平１−501362（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) A61L 27/00

Claims (21)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】繊維芽細胞が分散したポリマーゲルと密接
   に接触した、生物適合性で合成品の実質的に生物同化性
   のマトリックス素材からなり、ゲルが生物同化性マトリ
   ックス素材をコーティングする形態であるか、あるいは
   生物同化性マトリックス素材に充填された形態である、
   損傷した靭帯、腱、角膜、真皮、硬膜あるいは結合組織
   を有する他の部分用の埋込型プロステーシス。
2. 【請求項２】生物同化性マトリックス素材が、ポリラク
   チド、ポリグリコリド、ポリジオキサノン、ポリカプロ
   ラクトン、ポリヒドロキシブチレート、ポリヒドロキシ
   ブチレートコヒドロキシバレレート、ポリアンヒドリ
   ド、ポリオルトエステル、ポリオルトカーボネート、ポ
   リアミノカーボネート、ポリトリメチレンカーボネート
   あるいは上記のポリマーが形成される単量体を含有する
   コポリマーからなる、請求項１記載のプロステーシス。
3. 【請求項３】生物同化可能でないマトリックス素材をさ
   らに含有する、請求項１あるいは請求項２記載のプロス
   テーシス。
4. 【請求項４】生物同化可能でないマトリックス素材が、
   ポリエステル、ポリエチレン、ポリプロピレン、PTFE、
   カーボンファイバー、あるいは上記の素材の２つ以上の
   複合物である、請求項３記載のプロステーシス。
5. 【請求項５】マトリックスが、プロテオグリカン、グリ
   コサミノグリカン、フィブロネクチン、成長因子、骨誘
   導的あるいは骨通導的な素材の１つ以上をさらに含有す
   る、請求項１〜４のいずれか１つに記載のプロステーシ
   ス。
6. 【請求項６】ゲルがコラーゲンあるいは繊維素ゲルであ
   る、請求項１記載のプロステーシス。
7. 【請求項７】生物同化性マトリックス素材がポリヒドロ
   キシブチレートあるいは複数のヒドロキシブチレート単
   量体を混和したコポリマーである、請求項５〜６の１つ
   に記載のプロステーシス。
8. 【請求項８】マトリックスが可撓性である、請求項１〜
   ７のいずれか１つに記載のプロステーシス。
9. 【請求項９】繊維質の部材の形態である、請求項１〜８
   のいずれか１つに記載のプロステーシス。
10. 【請求項１０】織った、ニッティングした、かぎ針編み
    したあるいは編んだ部材の形態である、請求項１〜９の
    いずれか１つに記載のプロステーシス。
11. 【請求項１１】異なった生物同化速度をもつ複数の生物
    同化性マトリックス素材からなる、請求項１〜10のいず
    れか１つに記載のプロステーシス。
12. 【請求項１２】繊維芽細胞が非ランダムに方向付けられ
    た、請求項１〜11のいずれか１つに記載のプロステーシ
    ス。
13. 【請求項１３】繊維芽細胞が実質的に整列している請求
    項12記載のプロステーシス。
14. 【請求項１４】繊維芽細胞源及び生物同化性なマトリッ
    クス素材からなる、請求項１記載のプロステーシスを生
    成するキット。
15. 【請求項１５】繊維芽細胞源、生物同化性マトリックス
    素材及びポリマーゲルあるいはポリマーゲルを形成する
    ための組成物からなる、請求項５記載のプロステーシス
    を生成するキット。
16. 【請求項１６】繊維芽細胞を生育可能な条件に維持する
    チャンバーを備え、チャンバーがマトリックス素材を離
    脱可能に保持する手段と、単一の軸だけに沿ってマトリ
    ックス素材に応力を印加するようにした手段とからな
    る、請求項12又は請求項13に記載のプロステーシスを製
    造するために用いられる装置。
17. 【請求項１７】マトリックス上あるいは中において繊維
    芽細胞を接種するための適切な条件下で、適切な培地及
    び繊維芽細胞の存在のもとで生物適合性で合成の、実質
    的に生物同化可能なマトリックス素材を培養することよ
    りなる、請求項１の埋込型プロステーシスを得る方法。
18. 【請求項１８】繊維芽細胞を非ランダムに方向付けるた
    めに、繊維芽細胞を接種した時にマトリックス素材に応
    力を印加する手順をさらに含む、請求項17記載の方法。
19. 【請求項１９】非ランダムな方向付けが、繊維芽細胞の
    実質的整列である請求項17記載の方法。
20. 【請求項２０】繊維芽細胞がゲルに混和されている、請
    求項18あるいは請求項19記載の方法。
21. 【請求項２１】ゲルがコラーゲンゲルあるいは繊維素ゲ
    ルである請求項20記載の方法。