Gebiet der Erfindung
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Diese Erfindung betrifft einen Hautersatz
(Wundheilungsmaterial), der in geeigneter Weise zur Abdeckung der
Oberfläche eines geschädigten Hautbereichs verwendet werden kann,
der typischerweise eine Wunde ist, die durch einen
traumatischen, lokalen Verlust der Haut des menschlichen Körpers als
Folge einer Verbrennung oder durch irgendeine andere
Verletzungsursache erzeugt wurde.
Stand der Technik
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Die Haut umfaßt die drei Schichten der Epidermis, der
Dermis und der Hypodermis. Wenn die Dermis lokal vollständig
geschädigt ist als Ergebnis einer Verbrennung oder aus
irgendeinem anderen Grund, kann sie nicht regeneriert werden,
und es erscheint eine Narbe auf dem geschädigten Bereich, um
die Dermis zu ersetzen. Während eine Hauttransplantation die
bis jetzt einzig bekannte Methode ist, die Haut des
geschädigten Bereichs vollständig und perfekt wiederherzustellen,
ist die einzig mögliche Hautquelle, die zur Transplantation
verwendet werden kann, der Patient/die Patientin selbst und,
falls möglich, die Haut des anderen von eineiigen Zwillingen.
Mehrere Arten von Hautersatz, oder künstlicher Haut, wurden
vorgeschlagen, um dieses Problem zu lösen. Einige von diesen
werden bereits praktisch angewendet, wohingegen die anderen
sich noch im Stadium der technischen Entwicklung befinden.
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Bekannte künstliche Häute, die bereits in der Praxis
verwendet werden, schließen halbsynthetische Filme
verschiedener Typen ein, die durch resynthetisierende Gewebe von
Organismen, wie beispielsweise Kollagenfilm in der Form von
nichtgewebten Kollagengeweben, das durch Veredeln der Haut
des Schweines (1982 auf den Markt gebracht) oder derjenigen
vom Rind gewonnen wurden, Chitinfilm in der Form von
nichtgewebten Geweben aus Chitin, die aus Krebs- bzw. Krabbenschale
(1988 auf den Markt gebracht) gewonnen wurden und aus Chitin
in der Form von Blättern, die aus Tintenfischschulp (squid
pen) gewonnen wurden (ein Loligo, veredeltes und isoliertes
Tintenfischchitin), hergestellt wurden.
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Jedoch stellt keine der künstlichen Häute, die aus der
Haut vom Schwein oder derjenigen vom Rind gewonnene Kollagen-
Filme einschließen und die einen Chitinfilm vom Krebs
einschließen, eine zufriedenstellende Geschmeidigkeit noch ein
ausreichendes Haftvermögen für Fibroblasten an der
Zwischenfläche der künstlichen Haut und der Oberfläche einer Wunde
bereit. Noch fördern sie die Vermehrung von Fibroblasten.
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Während die Blätter aus Tintenfischchitin, die sich noch
im Stadium der Entwicklung befinden, jedes andere bekannte
vergleichbare Produkt bezüglich der Geschmeidigkeit
übertreffen, sind sie unter dem Gesichtspunkt des Haftvermögens und
der Vermehrung von Fibroblasten nicht zufriedenstellend.
Zusammenfassung der Erfindung
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Im Hinblick auf die oben genannten Probleme, die für
alle künstlichen Häute aus veredelten und isolierten Zellen
unvermeidbar sind, ist es deswegen die Aufgabe der vorliegenden
Erfindung, die Vorteile eines Blattes aus Tintenfischchitin
auszunutzen, das geschmeidig ist und die Lysozym-Produktion
unterstützt, um die Wunde zu schützen und zur selben Zeit die
Nachteile löst, daß Fibroblasten zur Heilung der Wunde nicht
zufriedenstellend an diesem anhaften und daß insbesondere die
Vermehrung von Zellen nicht unterstützt wird, indem ein
Laminat aus einem Blatt aus Tintenfischchitin und einer Schicht
aus Fischhautkollagen gebildet wird, das aus Lachs, Forelle,
Alaska-Seelachs, Fliegendem Fisch und Hai gewonnen wird, die
bisher nicht für künstliche Haut verwendet wurden. Ein
derartiges Laminat kann das Haftvermögen und die Vermehrung von
Zellen verbessern und die Transmutation von normalen Zellen
zu Krebszellen durch transformierende Faktoren im Verlauf der
Zell-Vermehrung vermeiden.
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Erfindungsgemäß wird die obige Aufgabe gelöst, indem ein
Hautersatz bereitgestellt wird, der von Meeresorganismen
Gebrauch macht, und der ein Blatt aus Tintenfischchitin als
Substrat und eine laminare Schicht aus Fischhautkollagen
umfaßt, die auf das Substrat aufgetragen ist.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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Fig. 1 zeigt das Verhältnis zwischen der Viskosität und
der Temperatur eines laminaren Kollagens aus Lachshaut, das
als ein erfindungsgemäßer Hautersatz verwendet werden kann,
wie es bei einem Experiment gewonnen wurde.
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Fig. 2 zeigt die Veränderung der Anzahl von
Fibroblasten-Zellen über die Zeit hinweg, die an einem
erfindungsgemäßen Hautersatz anhaften.
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Fig. 3 zeigt das Verhältnis zwischen der Anzahl
vermehrter Fibroblasten-Zellen und der verstrichenen Zeit für
mehrere unterschiedliche erfindungsgemäße Hautersatze, die
unterschiedliche Dicken der laminaren Kollagenschicht aus Lachs-
Haut aufweisen.
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Fig. 4 zeigt das Verhältnis zwischen der Anzahl
vermehrter Fibroblasten-Zellen und der verstrichenen Zeit für einen
erfindungsgemäßen Hautersatz, einen Hautersatz, der ein
Tintenfischchitinblatt und eine Schicht aus Kalbshautkollagen
umfasst und einen Hautersatz, der nur ein Tintenfischchitin-
Blatt umfaßt.
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung
Beispiel
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Ein Hautersatz gemäß der vorliegenden Erfindung wird
durch Laminieren einer Schicht aus Tintenfischchitin und
einer Schicht aus laminarem Kollagen aus Fischhaut mittels
einer bekannten geeigneten Technik hergestellt. Ein derartiges
Laminat kann beispielsweise hergestellt werden, indem ein
Blatt aus Tintenfischchitin gegossen wird und indem Kollagen
aus Fischhaut aufgegossen wird, und indem sowohl das Chitin
als auch das Kollagen in einem Kühlschrank ungefähr eine
Woche lang getrocknet werden.
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Bevor das Herstellungsverfahren eines Blattes aus
Tintenfischchitin und ein bekanntes Verfahren zur Herstellung
von Krebschitin zu Vergleichszwecken beschrieben wird, werden
einige der Hauptunterschiede der unterschiedlichen Chitine
dargestellt. Das aus dem Tintenfischschulp erhältliche Chitin
ist weich und wird -Chitin genannt, das eine gegenüber
derjenigen des Chitins aus der Krebsschale unterschiedliche
Kristall-Struktur aufweist, die -Chitin genannt wird, obwohl
die Chitinmenge, die aus einem einzelnen Tintenfisch
gewinnbar ist, nur ungefähr 1/40 derjenigen des Chitins beträgt,
das aus einem einzigen Krebs extrahierbar ist. Es ist leicht
mit Wasser quellbar und kann relativ leicht zu einem Blatt
geformt werden. Es zeigt eine höhere Durchlässigkeit für
Wasserdampf und eine höhere Hygroskopizität als das Krebschitin,
was es für einen Hautersatz geeigneter macht. Das Chitin
zeigt eine ausgezeichnete Verträglichkeit im lebenden Körper
und unterstützt wie oben beschrieben die Erzeugung von
Lysozym, um ein gutes Milieu zur Verteidigung des lebenden
Körpers bereitzustellen.
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Weil das Tintenfischchitin eine weiche kristalline
Struktur aufweist, kann es durch eine einfache Vorrichtung,
wie beispielsweise durch einen Mischer, leicht in Wasser
desintegriert werden und erfordert kein kompliziertes Verfahren
zur Auflösung in einem Lösungsmittel und zur Regenerierung
durch Bildung eines Blattes mit einem Bindemittel, wie im
Falle von Krebs-Chitin. Somit ergibt das Tintenfisch-Chitin
einen Vorteil bezüglich niedriger Energiekosten.
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In einem Beispiel wurde ein Blatt aus Tintenfischchitin
durch eine Batch-type Ansaugmaschine zur Papierherstellung
hergestellt.
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1) 3 g veredeltes Tintenfischchitin wurden in 300 ml
destilliertem Wasser dispergiert und in Wasser durch einen
Mixer zweimal, 5 Minuten lang mit 40 V und 10 Minuten lang bei
70 V, desintegriert.
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2) Die Blattherstellungslösung wurde in einen großen
Büchner-Trichter einer Batch-type Ansaugmaschine zur
Papierherstellung mit einer Bodenfläche von 0,024 m² (ein
Durchmesser von 17,5 cm) gegossen, um drei unterschiedliche Gewichte
von 10, 20 und 40 (g/m²) zu erzeugen, und wurde dann einem
Ansaug-Papierherstellungsverfahren unterworfen. Aus Teflon
hergestelltes Filterpapier wurde zur Filtration im Verfahren
verwendet.
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3) Jedes der hergestellten Tintenfisch-Chitinblätter
mit unterschiedlichen Dicken wurde dann zwischen 5 Blättern
Teflon-Filterpapier und einer Teflonplatte geschichtet und
bei einem Druck von 3 kg/cm² für drei (3) Minuten gepresst
und dieser Preßvorgang wurde zweimal wiederholt.
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4) Die Filterpapierblätter wurden durch Neue ersetzt
und das erzeugte Tintenfisch-Chitinblatt wurde
luftgetrocknet, während es unter drei Telefonbüchern gepreßt wurde.
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5) Die Filterpapierblätter wurden nach vier Stunden
wiederum durch Neue ersetzt, und das Tintenfisch-Chitinblatt
wurde weiterhin 20 Stunden lang getrocknet, um ein
Tintenfisch-Chitinblatt als Endprodukt zu erzeugen.
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Andererseits wurde ein Krebsschalenchitinblatt durch
eine Homogenisierungstechnik hergestellt, bei der das
Krebschitin durch mechanische Ausübung eines hohen Druckes wegen
einer relativ harten kristallinen Struktur zu Mikrofibrillen
reduziert wurde. Die Anwendung eines hohen Druckes zur
Erzeugung eines Krebs-Chitinblattes wurde deswegen festgelegt,
weil die Möglichkeit erwogen wurde, daß, wenn das Chitin in
einem Lösungsmittel gelöst wurde, die native mikrofibrilläre
Struktur von Krebs-Chitin zerstört werden kann, so daß das
Produkt schwer beschädigt wird.
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Die für das Verfahren zur Herstellung eines Krebs-
Chitinblattes angewendete Technik war wie folgt.
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1) Man ließ destilliertes Wasser in einem 15MR-
Laboratory Homogenizer, der bei Gaulin bezogen werden kann,
zirkulieren, und der Innendruck wurde auf 30 kg/cm²
angehoben, bevor gemahlenes Krebs-Chitin (20 mesh) langsam in das
Gerät gegossen und homogenisiert wurde, bis kein körniges
Krebs-Chitin in der Krebs-Chitinsuspension mehr beobachtet
werden konnte, die dann als die Ausgangslösung für das
nachfolgende Papierherstellungsverfahren verwendet wurde.
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2) Danach wurde das oben beschriebene
Papierherstellungsverfahren für Tintenfisch-Chitin ebenfalls für Krebs-
Chitin in derselben Batch-type Papieransaugmaschine
angewendet.
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Tabelle I unten zeigt die Dicke und das Gewicht pro
Flächeneinheit jedes der hergestellten Proben-Blätter aus
Tintenfisch-Chitin und Krebs-Chitin.
Tabelle I
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Einige der Analyseergebnisse der Beispiele von
Tintenfisch-Chitin und Krebs-Chitin werden hierin nachfolgend
ausführlicher beschrieben werden.
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Tabelle II, unten, zeigt die Steifheit jeder der Proben,
die als Ergebnis eines Bruchfestigkeitstests, eines
Zugfestigkeitstests, und eines Einreißbeständigkeitstests
gewonnenen Proben und des dynamischen Young'sche Elastizitätsmoduls
gewonnen wurde.
Tabelle II
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Wie aus der obigen Tabelle ersichtlich ist, war die
Bruchfestigkeit jedes der Tintenfisch-Chitinblätter zweimal
größer als diejenige des Krebs-Chitingegenstückes und seine
Einreißbeständigkeit war mehr als 102 mal größer als
diejenige des Krebs-Chitinblattes, wohingegen jedes der Tintenfisch-
Chitinblätter eine Bruchlänge zeigte, die im wesentlichen mit
derjenigen des Krebs-Chitinblattes gleich war (die
Einreißbeständigkeit des Krebs-Chitinblattes betrug einen Bruchteil
einer Einheit und ist deswegen in Tabelle II nicht
dargestellt). Es zeigte auf der anderen Seite eine
Geschmeidigkeit, die mehr als (5) mal größer als diejenige des Krebs-
Chitinblattes war. Der Unterschied mag auf dem strukturellen
Unterschied zwischen der Fibrillen-Struktur und der Lamellen-
Struktur beruhen, die Chitin einnehmen kann, und ebenfalls
von der oben beschriebenen Tatsache abhängen, daß das Krebs-
Chitin ein -Chitin ist, wohingegen das Tintenfisch-Chitin
ein -Chitin ist, das sich bezüglich der Kristall-Struktur
von -Chitin unterscheidet.
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Während das Tintenfisch-Chitin eine Einreißbeständigkeit
und eine Bruchfestigkeit aufweist, die beträchtlich höher als
diejenige von Krebs-Chitin ist, ist das Erstere fünf mal geschmeidiger
als das Letztere, wie in Tabelle II dargestellt
ist. Die Eigenschaften auf Seiten des Tintenfisch-Chitins
machen dieses für die Wunde sehr geeignet, wenn es als
Hautersatz verwendet wird. Zusätzlich ist das Tintenfisch-Chitin
gegenüber dem Krebs-Chitin insofern von Vorteil, weil anders
als bei einem Blatt aus Krebs-Chitin kein
Papierherstellungsverfahren zur Herstellung eines Blattes aus Tintenfisch-
Chitin erforderlich ist.
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Nunmehr wird das Fischhautkollagen, der andere
Bestandteil eines erfindungsgemäßen Hautersatzes bezüglich dessen
Herstellungsverfahren beschrieben werden.
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Die Meeresprodukte verarbeitende Industrie erzeugt eine
enorme Menge an industriellen Abfällen wie beispielsweise
Haut, Knochen, Köpfe und innere Organe der verarbeiteten
Fische. Bezüglich der Tatsache, daß Meeresprodukte gegenwärtig
lediglich als Nahrungsmittel verwendet werden, wird es ein
großer Durchbruch sein, wenn irgendeiner dieser Abfälle als
Ressource für die Herstellung neuer Produkte verwendet werden
kann. Das in der Haut von Lachs, Forelle und anderen Fischen
enthaltene Kollagen zieht unter diesem Gesichtspunkt die
Aufmerksamkeit auf sich.
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Wie bereits bekannt ist, umfaßt ein Kollagen-Molekül
Peptid-Ketten, die an den gegenüberliegenden Enden, die
Telopeptide genannt werden, keine helikale Struktur aufweisen.
Ein Telopeptid enthält 12 bis 27 Aminosäurereste und es wird
angenommen, daß die Antigenität von Kollagen durch diese
Ketten aktiviert wird. Deswegen muß das Telopeptid des Kollagens
eliminiert werden, bevor Kollagen für lebende Organismen
verwendet wird und ein Verfahren zur Eliminierung des
Telopeptids besteht darin, es mit Pepsin zu behandeln.
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Die zur Herstellung von Kollagen aus Lachshaut für die
Ziele der Erfindung verwendete Technik wird jetzt nachstehend
beschrieben.
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1) Entfettete Lachshaut wurde in eine 0,2 M
Essigsäurelösung in einem Verhältnis von 1 : 15 (w : v) eingelegt und das
Gemisch wurde leicht gerührt und bei 4ºC drei (3) Tage
stehengelassen.
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2) Die Lachshaut/Essigsäurelösung wurde durch eine
weitere 0,2 M Essigsäurelösung verdünnt und bei 5ºC 30
Minuten lang einem Zentrifugations-Verfahren mit 30.000 g
unterworfen.
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3) Pepsin wurde dem Überstand zu 1 Gew.-% bezüglich
des Substrates zugesetzt, um das Letztere 24 Stunden lang mit
Pepsin zu behandeln.
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4) Die behandelte Lösung wurde in ein dialysierendes
Diaphragma eingelegt und wurde 48 Stunden lang einem
Aussalzverfahren durch Verwendung von 10% Natriumchlorid unterworfen
und das Reaktionsprodukt wurde bei 5ºC 30 Minuten lang einem
Zentrifugier-Verfahren mit 30.000 g unterworfen.
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5) Der Überstand wurde entfernt und der Kollagenrest
wurde bei 4ºC zwei (2) Tage lang in einer 0,2 M
Essigsäurelösung gelöst.
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6) Die Lösung von 5) wurde in ein dialysierendes
Diaphragma eingelegt und die Schritte 3) bis 5) wurden drei (3)
Mal wiederholt.
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7) Die veredelte Kollagen-Lösung wurde erneut in ein
dialysierendes Diaphragma eingelegt und in destilliertem
Wasser dialysiert.
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8) Die perfekt neutralisierte Kollagen-Lösung wurde
gefriergetrocknet, um eine wasserfreie Probe herzustellen.
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Die Eigenschaft des gewonnenen Lachshautkollagens, das
für die vorliegende Erfindung am wichtigsten erschien, kann
darin bestehen, daß seine Hitzedenaturierungstemperatur
beträchtlich niedriger als diejenige von Rinderhaut-Kollagen
ist.
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Insbesondere weist Kollagen eine dreifach helikale
Struktur aus drei Polypeptidketten mit einem Molekulargewicht
von ungefähr 100.000 auf, und diese Struktur wird durch
Wasserstoffbrückenbindungen, die die Polypeptidketten verbinden,
stabilisiert. Wenn es erhitzt wird, werden die
Wasserstoffbrückenbindungen zerstört, so daß Gelatine mit einer
zufälligen Knäuelstruktur erzeugt wird. Zu diesem Zeitpunkt
verändert das Kollagen als Folge der Hitzedenaturierung seine
physikalischen Eigenschaften in hohem Maße, einschließlich der
Viskosität der Lösung und der optischen Drehung. Die
Temperatur, bei der eine derartige thermische Denaturierung
eintritt, ist eine der essentiellen Eigenschaften von Kollagen.
Die Probe aus Lachshautkollagen, die durch die oben
beschriebene Technik gewonnen wurde, wurde in Essigpufferlösung von
pH 5,0 in einer Konzentration von 0,5% desintegriert, und die
Temperatur der Lösung wurde von 4ºC ab unter Beobachtung der
Viskosität mittels eines Ostwald-Viskosimeters angehoben, um
die Hitzedenaturierungstemperatur zu bestimmen. Fig. 1 zeigt
das für das Verhältnis zwischen der Temperatur und der
Viskosität gewonnene Ergebnis. Wie in Fig. 1 dargestellt ist,
nimmt die Viskosität bei einer Temperatur zwischen 15 bis
20ºC dramatisch ab.
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In anderen Worten liegt die
Hitzedenaturierungstemperatur von Lachshaut-Kollagen ungefähr zwischen 16 und 18ºC, was
bemerkenswert niedriger als die vergleichbare Temperatur von
Rinderhaut-Kollagen oder von ungefähr 37-38ºC ist. Es ist
bekannt, daß die Denaturierungstemperatur von Kollagen mit dem
Organismus, von dem es stammt, enge Beziehungen aufweist, und
die obige Tatsache kann dadurch erklärt werden, daß Lachs ein
Fisch ist, der in der kalten Gezeiten-Strömung lebt.
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Bei dem Lachshaut-Kollagen ist der Hydroxyprolin-Gehalt
nur Zweidrittel (2/3) desjenigen von Kalbshaut-Kollagen
(Denaturierungstemperatur: 37ºC). Weil Hydroxyprolin an der
intramolekularen Wasserstoff-Brückenbindung teilnimmt, mag
der niedrige Hydroxyprolin-Gehalt einer der Gründe für die
niedrige Denaturierungstemperatur von Lachshaut-Kollagen
ergeben.
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Die Lösung des Lachshaut-Kollagens geliert schnell bei
einer Temperatur unterhalb 4ºC und einem pH von 7,5, und der
Schmelzpunkt des erzeugten Gels liegt ungefähr bei 3,6ºC.
Andererseits geliert das Kalbshaut-Kollagen erst bei einer
Temperatur von 37ºC. Wie oben beschrieben, mag dies durch die
Tatsache erklärt werden, daß Lachs ein Fisch ist, der in der
kalten Gezeitenströmung lebt, und das Lachshaut-Kollagen
bildet bei ungefähr 15ºC ein stabiles Kollagen-Gewebe. Somit
steht der Hydroxyprolin-Gehalt ebenfalls zu dem Gel-Punkt von
Kollagen in Bezug. Ein Hautersatz gemäß der vorliegenden
Erfindung, der ein Tintenfisch-Chitinblatt und eine Schicht aus
Fischhaut-Kollagen umfaßt, wird durch direkte Aufbringung des
Tintenfisch-Chitinblattes auf die Oberfläche einer Wunde
angewendet. Deswegen ist es erforderlich, daß das Tintenfisch-
Chitin die Vermehrung der Fibroblasten, die in der Dermis
enthalten sind, fördert, um die Wunde zu heilen. Der Prozess
der Vermehrung von Zellen beginnt, wenn die Zellen an dem
Gewebe und/oder Matrix anhaften. Es soll somit bewirkt werden,
daß eine große Anzahl von Zellen an dem Gewebe und/oder der
Matrix zur Vermehrung anhaften. Andererseits sollten die
Zellen nicht zu Krebszellen umgewandelt werden, bevor sie sich
vermehren. Diese Angelegenheiten in Erwägung ziehend wurde
die Anzahl der Zellen, die Anzahl der vermehrten Zellen und
der DNA-Markierungsindex der Zellen auf einer Hautersatz-
Probe beobachtet, wie hierin nachstehend beschrieben wird.
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Fibroblastenzellen wurden dem Verfahren einer Passagen-
Kultur unterworfen. Insbesondere muß, wenn die Zellen sich
vervielfältigen, so daß sie die Wand des Kulturgefäßes mit
einer Zellschicht vollständig bedecken oder das Kulturgefäß
mit Zellen übervölkert wird, die Übervölkerung durch
Übertragung einiger der Zellen in ein anderes Kulturgefäß zur
Bildung einer Subkultur aufgelöst werden, und dieser
Transfervorgang wird als Passagen-Kultur bezeichnet. Für eine
Passagen-Kultur wird eine gleichmäßige Suspension aus Zellen
hergestellt, indem die Zellen aus dem ursprünglichen Kulturgefäß
entnommen werden und danach die Anzahl der Zellen gezählt
wird, die Suspension auf eine geeignete Konzentration
verdünnt wird und in ein neues Kulturgefäß übertragen wird.
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Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wurden
Fibroblastenzellen in der folgenden Weise kultiviert.
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1) Das Medium in einem Kolben (mit einem Boden von
75 cm²), das Fibroblastenzellen enthielt, wurde mittels einer
Pasteur-Pipette abgesaugt.
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2) Die innere Bodenoberfläche des Kolbens wurde mit 15
ml Hanks' BSS w/o Ca²&spplus; Mg²&spplus; drei (3) Mal gewaschen.
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3) 10 ml 0,05% Trypsin EDTA (0,5% Trypsin 53 mM EDTA-
4Na 11m + Hanks' BSS 9 ml) wurde in einen Kulturkolben
eingebracht, für fünf (5) Minuten inkubiert und die
Fibroblastenzellen vom Boden des Kulturgefäßes abgetrennt.
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4) Die Suspension der Zellen wurde 10 mal pipettiert
und 1 ml FCS wurden hierzu als einzelne Zellen zugesetzt und
das Gemisch bei einer Geschwindigkeit von 1.000 bis 1.500 UpM
für fünf (5) Minuten zentrifugiert.
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5) Der Überstand wurde mittels einer Pasteur-Pipette
abgesaugt und in 12 ml einer Lösung von Kulturmedium
eingebracht. 100 l des Mediums, das die Zellen enthielt, wurden
entnommen und durch Isoton II auf 20 ml verdünnt.
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6) Die Anzahl der Zellen, die mit einem Durchmesser
von 10 bis 30 m in 500 l der verdünnten Lösung vorgefunden
wurden, wurde mittels eines Coulter-Zählers gezählt. Ein Teil
der verbleibenden Suspension der Fibroblastenzellen wurde
dazu verwendet, Fibroblastenzellen in einen Kulturkolben zu
transplantieren, so daß der 75 cm²-Boden des Kolbens in einer
Menge von 104 Zellen/cm² bevölkert wurde. Darauf wurde der
Kolben mit 20 bis 30 ml Kulturmedium-Lösung befüllt.
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7) Der Kolben wurde in einen CO&sub2;-Inkubator eingelegt,
der auf 37ºC und 5% CO&sub2; eingestellt wurde.
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Wie vorstehend beschrieben, üben die Materialien des
Hautersatzes, die verwendet werden, bei einer Wunde einen
großen Einfluß auf die Heilung der Wunde aus, weil der
Hautersatz bei dem Regenerationsprozeß der Haut des Patienten
direkt mit der Oberfläche der Wunde in Berührung gehalten
wird. Insbesondere die Vermehrung der Fibroblasten ist eine
Hauptunterstützung für die Regeneration der Dermis. Wenn die
Dermis total zerstört ist, falls lokal, kann sie nicht
regeneriert werden und eine Narbe erscheint auf dem geschädigten
Bereich, um die Dermis zu ersetzen.
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Im Verfahren der Vermehrung von Fibroblasten haftet jede
Fibroblastenzelle an der Matrix an und expandiert zu einer
sternförmigen Form, die für die Fibroblasten charakteristisch
ist und kontrahiert sich dann, wenn sie von der Matrix am
einen Ende abgetrennt wird, bevor sie sich teilt, wobei dann
beide Teile an der Matrix anhaften. Somit müssen
Fibroblastenzellen in geeigneter Weise an dem Wundabdeckungsmaterial
anhaften, damit das Wundabdeckungsmaterial die Fibroblasten-
Vermehrung unterstützt. Bei einem Experiment wurde die
Anzahl der kultivierten Fibroblastenzellen (zwischen 4. und 8.
Passage), die an einem Hautersatz anhafteten
(Wundabdeckungsmaterial) mittels eines Coulter-Zählers
gezählt.
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Drei Hautersatze, umfassend Tintenfisch-Chitin-Blätter
mit einem jeweiligen Gewicht pro Flächeneinheit von 10, 20
und 40 g/cm² und einer Hüllschicht aus Fischhaut-Kollagen
wurden als Proben für das obige Experiment hergestellt.
Zusätzlich wurde ein Atelokollagen-Film zum Vergleich
verwendet. (Siehe Tabelle III). Die Anzahl der Fibroblastenzellen
auf dem Chitin-Blatt jeder der Proben wurde in regelmäßigen
Intervallen gezählt (Anlagerung). Das Experiment ist
nachstehend beschrieben.
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1) Nach dem oben beschriebenen Vorgang der Passagen-
Kultur wurde das Kulturmedium alle drei Tage für jede der
Proben ersetzt, und die Fibroblastenzellen, die 10 bis 14
Tage lang kultiviert wurden, wurden aus dem Kulturmedium
mittels Trypsin abgetrennt und mittels einer Zentrifuge
gesammelt.
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2) Eine Zellsuspension wurde für jede der Proben durch
Rühren der gesammelten Pellets in einem Kulturmedium
hergestellt.
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3) Die Zellen der Suspension wurden mittels eines
Coulter-Zählers gezählt, und Fibroblastenzellen wurden
zugesetzt, bis die Zellkonzentration 50.000 Zellen/cm² betrug.
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4) 2 ml der flüssigen Kultur wurden dann zur
Beobachtung für 3, 6, 24 und 48 Stunden in einem Milieu von 5% CO&sub2;
und 37ºC belassen.
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5) Nach Abschluß des Kultur-Vorgangs wurde jede der
Proben dreimal (3) gewaschen und die Zellen durch 2 ml
Trypsin-EDTA getrennt.
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6) Die Zellen mit einem Durchmesser von 10 bis 30 m
wurden mittels eines Coulter-Zählers gezählt.
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Fig. 2 zeigt die Anzahl der Fibroblastenzellen, die drei
(3) Stunden und 24 Stunden nach Beginn des Kultivierens für
jede der Chitinblatt-Proben gezählt wurden. Wenn sie drei (3)
Stunden nach dem Start gezählt wurden, haftete für jedes der
Chitin-Blattmaterialien die Hälfte von diesen an einem
Kollagen-Film zum Kultivieren von Gewebszellen an, jedoch zeigte
ein Laminat aus einem Tintenfisch-Chitinblatt und einer
Lachshaut-Kollagen-Hülle eine Anzahl von Zellen, die daran
anhafteten, die zu 90% den Zellen auf dem Kollagen-Film
entsprachen. Wenn sie 24 Stunden nach Beginn gezählt wurden,
betrug das Verhältnis der Zellen auf dem Chitinblatt zu
denjenigen auf dem Kollagen-Film nur 80% für jedes der
Chitinblatt-Materialien, was beweist, daß eine Chitinschicht
Fibroblastenzellen nur schlecht halten kann. Damit bei einer
Wunde die Haut zur Regeneration unterstützt werden kann,
bedarf es eines Substrates, auf dem Fibroblasten-Zellen sich
vermehren und, wenn ein Hautersatz verwendet wird, muß es die
Rolle eines derartigen Substrates einnehmen. Ein Tintenfisch-
Chitinblatt kann die Anzahl der Fibroblastenzellen, die daran
anhaften, dramatisch erhöhen, wenn es mit einem Lachshaut-
Kollagen oder Kalbshaut-Kollagen beschichtet ist.
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Eine Fibroblastenzelle expandiert im Verlaufe der
Vermehrung zu einer sternförmigen Form. Genauer beginnt die
Vermehrung nach Expansion zu einer sternförmigen Form. Weil die
Vermehrung von Zellen signifikant davon abhängt, wie sie am
Substrat anhaften, wurden die Proben durch ein Lichtmikroskop
beobachtet, um die Art der Anhaftung der Zellen zu beobachten.
Für diese Beobachtung wurden Fibroblastenzellen auf
einem Chitin-Blatt wie im Falle der Anlagerung kultiviert.
Danach wurde der folgende Vorgang durchgeführt.
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1) Das Chitinblatt wurde aus dem Kulturmedium mit
daran anhaftenden Fibroblastenzellen entnommen und mit PBS
gewaschen.
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2) Die Fibroblastenzellen auf dem gewaschenen
Chitinblatt wurden eine (1) Stunde mit 70% EtOH fixiert.
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3) Das Ethanol wurde vollständig entfernt und die
Probe mit Hämatoxylin eingefärbt.
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4) Die Probe wurde beobachtet, um zu sehen, wie die
Zellen sich an dem Chitin-Blatt anlagern.
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Als Folge der Beobachtung unter Verwendung eines
Lichtmikroskopes hat sich herausgestellt, daß die sternförmige
Expansion der Fibroblastenzellen nur in geringem Maße auf dem
Chitin-Blatt zu beobachten war, wenn nur Tintenfisch-Chitin
verwendet wurde, und daß die Zellen kugelförmig vorlagen, als
ob sie in Lösung wären. Andererseits war die sternförmige
Expansion der Fibroblastenzellen auf dem Chitin-Blatt, das eine
Hülle aus Fischhaut-Kollagen oder Kalbshaut-Kollagen trug,
klar beobachtbar. Wenn dies zusammen mit dem Ergebnis der
Beobachtung der Anzahl von Zellen betrachtet wird, die auf
jeder der oben beschriebenen Proben anhaften, würde es klar
sein, daß Kollagen als Zellträger leistungsfähiger als
Tintenfisch-Chitin arbeitet. Obwohl angenommen wird, daß Chitin
antibakteriell ist und daher für die Wundheilung wirksam ist,
ist es nicht besonders vorteilhaft, wenn es bewirken soll,
daß Zellen anhaften, jedoch kann dieser Nachteil wettgemacht
werden, indem es zusammen mit einer Kollagen-Hüllschicht
verwendet wird.
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Das Chitin erzeugt Lysozym, um ein für den Schutz
lebender Organismen gutes Milieu zu schaffen, unterstützt jedoch
die Vermehrung von Fibroblastenzellen nicht sonderlich.
Andererseits haftet das Kollagen aktiv an Zellen an, wenn die
Kollagen-Moleküle eine Fibrillen-Struktur zeigen (zur
Erzeugung von Fibrillen), das heißt, daß es die Vermehrung von
Zellen unterdrücken kann. Es wurde berichtet, daß eine Lösung
aus Kalbshaut-Kollagen oder menschlichem Plazenta-Kollagen
Fibroblasten in einem physiologisch aktiven Milieu erzeugt
und geliert wird. Das Kollagen sollte den Anforderungen der
Rolle entsprechen, lebende Organismen als Protein in einem
physiologisch aktiven Milieu strukturell zu erhalten.
Bezüglich dieser Eigenschaft auf Seiten des Kollagens ist es sehr
wahrscheinlich, daß das Kollagen, das von einer fremden
Kreatur stammt, im menschlichen Körper in einem physiologisch
aktiven Milieu weder Fibrillen erzeugt, noch die von Zellen
unterdrückt. Somit wurden Proben eines Laminats eines
Tintenfisch-Chitinblattes und einer Lachshautkollagen-Beschichtung
hergestellt, und das Zellvermehrungsmuster wurde auf den
Proben zusammen mit anderen Hautersatz-Proben beobachtet.
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Bei diesem Experiment wurden Fibroblastenzellen der
vierten bis achten Passagenkulturen verwendet, und die
vermehrten Zellen wurden auf jedem getesteten Hautersatz
(Wundabdeckungsmaterialien) mittels eines Coulter-Zählers
gezählt.
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Die Zellen wurden an den Proben in einer Rate von 5000
Zellen/cm² anhaftend gemacht, und die vervielfältigten Zellen
(Wachstum) wurden gezählt. Das Wachstum auf jedem der
Tintenfischchitin-Basisblätter mit unterschiedlichen Dicken wurde
zum Vergleich beobachtet. Als Kontrolle wurde ein
Kollagenfilm zur Kultivierung von Epidermiszellen verwendet.
Hüllschichten unterschiedlicher Typen von Kollagen wurden zum
Vergleich verwendet. Basisschichten aus Chitin
unterschiedlicher Herkunft wurden ebenfalls zum Vergleich verwendet.
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Das Experiment wurde in der folgenden Weise
durchgeführt.
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1) Nach Durchführung einer Passagenkultur wurde das
Kulturmedium alle drei Tage für jede der Proben ersetzt und
die Fibroblastenzellen, die 10 bis 14 Tage lang kultiviert
wurden, wurden aus dem Kulturmedium mittels Trypsin
abgetrennt und mittels einer Zentrifuge gesammelt.
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2) Eine Zellsuspension wurde für jede der Probe durch
Rühren der gesammelten Pellets in einem Kulturmedium
hergestellt.
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3) Die Zellen in der Suspension wurden mittels eines
Coulter-Zählers gezählt, und die Fibroblastenzellen wurden
zugesetzt, bis die Zellkonzentration 5000 Zellen/cm² betrug.
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4) 2 ml der Flüssigkultur wurden dann zur Beobachtung
in einem Milieu von 5% CO&sub2; und 37ºC für 2, 4, 6 und 8 Tage
belassen.
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5) Nach Abschluß der Kultur-Operation wurde jede der
Proben dreimal gewaschen und die Zellen durch 2 ml Trypsin-
EDTA abgetrennt.
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6) Die Zellen mit einem Durchmesser von 10 bis 30 m
wurden mittels eines Coulter-Zählers gezählt.
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Fig. 3 veranschaulicht das Ergebnis des Experiments.
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Die Probe, die ein Tintenfisch-Chitinblatt und eine
Lachshautkollagen-Hüllschicht umfaßte und diejenige, die ein
Tintenfisch-Chitinblatt und eine Kalbshautkollagen-
Hüllschicht umfaßte, zeigten ein im wesentlichen gleiches und
normales Zellvermehrungsmuster. Die Dicke des Chitinblattes
zeigte keine Beziehung zur Vermehrungsaktivität der Zellen.
Wie in Fig. 4 dargestellt, wurde die Vermehrung durch
Verwendung einer Hüllschicht aus Lachshaut oder Kalbshaut auf einem
Tintenfisch-Chitinblatt verstärkt. Während die Zellvermehrung
auf einem Laminat, das Lachshautkollagen-Hüllschicht umfaßte,
ein ideales Muster zeigte, zeigt dasjenige auf einem Laminat,
das eine Kalbshautkollagen-Hüllschicht umfaßte, eine
verspätete initiale Wachstumsphase. Das Lachshautkollagen kehrt bei
37ºC in einer physiologisch aktiven Umgebung in einem
amorphen Zustand zurück, das Kalbshautkollagen verbleibt unter
denselben Bedingungen in einem fibrösen Zustand. Weil
fibröses Kollagen zur Unterdrückung der Vermehrung von Zellen
wirksam ist, muß die Hüllschicht des Kalbshautkollagens in
einem fibrösen Zustand die initiale Wachstumsphase der
Zellvermehrung verzögert haben. Somit ist ein Hautersatz, der
eine Lachshautkollagenschicht umfaßt, wirksamer als dessen
Gegenstück, der eine Kalbshautkollagenschicht umfaßt.
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Es sollte jedoch erwähnt werden, daß Zellen sich unter
normalen Umständen nicht notwendigerweise zu allen
Zeitpunkten proliferieren. Besonders wenn die Zellen sich in einer
hohen Geschwindigkeit proliferieren, können die DNAs in
einigen der Zellen auf eine bestimmte Weise geschädigt werden,
so daß diese Zellen in Krebszellen umgewandelt werden.
Deswegen wurden die Zellen auf jeder der Hautersatzproben auf ihre
Umwandlung hin überprüft, die dem Chitin-Blatt und/oder dem
Kollagen der Probe zuzurechnen sein könnte. DNA's wurden in
vitro mittels eines immunhistochemischen Verfahrens in einem
Kulturmedium synthetisiert, das 5-Brom-2-dioxyuridin (BrdU)
enthielt, um die Zellen nach dem S-Stadium (DNA-
Synthesestadium) sichtbar zu machen und die DNA-
Markierungsindizes wurden beobachtet.
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Die zur obigen Beobachtung verwendeten Techniken sind
nachstehend beschrieben.
Zellkultur
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1) Fibroblastenzellen, die aus der menschlichen Dermis
entnommen wurden, wurden auf dem 75 cm² großen Boden eines
Kolbens in einer Rate von 104 Zellen/cm² gepflanzt und für
zwei (2) Wochen kultiviert. Darauf wurden sie dreimal mit 15
ml Hanks' BSS w/o Ca²&spplus;Mg²&spplus; gewaschen.
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2) Die Zellen wurden mittels Trypsin-EDTA (0,005%)
getrennt und mittels einer Zentrifuge gesammelt. Die
gesammelten Zellen wurden in MEM mit 10% FCS und 1% PC-ST suspendiert
und auf jeder der Proben in einer Konzentration von 50.000
Zellen/cm² eingepflanzt.
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3) Die Zellen wurden darauf 24 Stunden lang in einer
5% CO&sub2;-Umgebung kultiviert.
BrdU-Markierung
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4) 5 mm²-Stücke wurden aus jeder der Proben
ausgeschnitten und ein 10%iges thermisch immobiles fötales
Kalbsserum wurde hierzu zugesetzt. Das Gemisch wurde dann in
ein Vial eingebracht, das Nukleosid- und Nukleotid-freies -
MEM enthielt, wozu 100 M BrdU zugesetzt wurden.
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5) Die Umgebung bzw. das Milieu wurde durch ein
Gemisch aus 95% O&sub2; und 5% CO&sub2; ersetzt und danach wurde das Vial
mittels einer Teflonkunststoffkappe verschlossen. Der
Innendruck wurde auf drei (3) Atmosphären erhöht und die Zellen
wurden eine (1) Stunde lang bei 37ºC in einem
Schüttelwasserbad inkubiert.
Immunhistochemie
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1) Nach Waschen jeder der markierten Gewebe mit PBS
für 10 Minuten wurden die Zellen von der darunterliegenden
Schicht mittels Trypsin-EDTA (0,005%) abgetrennt und fünf (5)
Minuten bei einer Geschwindigkeit von 1.500 UpM
zentrifugiert. Die gesammelten Pellets wurden dann auf einem
Objektträgerglas ausgestreut.
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2) Das Gewebe wurde dann in 2 N HCl bei Raumtemperatur
40 Minuten lang inkubiert, um die DNAs zu denaturieren.
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3) Das inkubierte Gewebe wurde dann mit pH9 PBS und pH
7,4 PBS gewaschen und mit monoklonalen Anti-BrdU Antikörpern
(Anti-BrdU) ( = Maus IgG) in einem Verhältnis von 1 : 100
verdünnt. Danach wurde es in einer Feuchtigkeitskammer bei
Raumtemperatur inkubiert.
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4) Das Gewebe wurde 30 Minuten lang mit PBS gewaschen.
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5) Das Gewebe wurde dann mittels eines
biotinmarkierenden Kaninchen- anti-Maus-IgG-Antikörpers 20 Minuten lang
inkubiert.
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6) Das Gewebe wurde mit PBS 30 Minuten lang gewaschen.
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7) Das Gewebe wurde darauf mittels Peroxidase
markierendem Streptoavidin inkubiert.
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8) Das Gewebe wurde 30 Minuten lang mit PBS gewaschen.
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9) Der antikörperbindende Anteil des Gewebes wurde
mittels Diaminobenzidin sichtbar gemacht. (50 ml PBS/50 ml
destilliertes Wasser/33 l H&sub2;O&sub2;/3 mg Diaminobenzidin für 10
Minuten).
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Bei der in vitro DNA-Synthese wurde ein Teil der
Hautzellen in einem Kulturmedium kultiviert, das Bromodioxyuridin
(5-brom-2"-deoxyuridin, um genauer zu sein) enthielt, das
eine Nukleinsäure funktional inoperativ macht, indem es sie mit
einem DNA-Syntheseinhibitor umgibt. In einem lebenden
Organismus wird es in die DNA als eine Substanz aufgenommen, die
Thymidin ähnlich ist und eine Mutation induziert, weil es
eine Fehl-Paarung mit Guanosin entstehen läßt, und danach wird
der Kern jeder Zelle nach dem S-Stadium markiert. Eine maligne
Erkrankung neigt dazu, den DNA-Markierungs-Index zu
erhöhen.
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In einem kürzlichen Bericht wurden die Synthese-
Geschwindigkeiten von Tumorzellen, die auf unterschiedlichen
Medien in vitro unter hohem Druck in einem Milieu von 95% O&sub2;
und 5% CO&sub2; kultiviert wurden, verglichen. Tabelle III, unten,
zeigt das Ergebnis eines Experimentes, das in einer wie oben
in vitro unter hohem Druck beschriebenen Weise durchgeführt
wurde, wobei die Technik der BrdU-Markierung angewendet
wurde.
Tabelle III
DNA-Markierungs-Index von menschlichen Hautzellen
Probe (Anzahl der Proben) Markierungsindex
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Kalbshautkollagen-Film (3) 1,3 0,4%
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Tintenfischchitin-Blatt (3) 1,0 0,1%
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Laminat aus
Tintenfischchitin/Lachshautkollagen (4) 1,7 0,5%
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Laminat aus
Tintenfisch-Chitin/Kalbshautkollagen (3) 1,5 0,5%
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Normale Hautzellen (4) 1,4 0,4%
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Morbus Bowen-Zellen (10) 7,7 1,4%
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Normale Krebszellen (5) 8,5 1,2%
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Wie aus der vorstehenden Tabelle III ersichtlich ist,
sind die Markierungindizes auf dem Tintefischchitin-Blatt,
dem Lachshautkollagen beschichteten Tintenfischchitin-Blatt
und dem Kalbshautkollagen-beschichteten Tintenfischchitin-
Blatt im wesentlichen demjenigen von Fibroblastenzellen auf
üblicher menschlicher Haut gleich, innerhalb einer Abweichung
von 15%. Andererseits zeigten die Morbus Bowen-Zellen und
das Basalzellkarzinom jeweils DNA-Markierungs-Indizes, die
mehr als fünf (5) mal höher als diejenigen von normalen
Hautzellen sind. Somit existierte kein Hinweis, daß die
Vermehrung von Fibroblastenzellen auf jeder der Hautersatz-Proben
durch Umwandlung zu Krebszellen verstärkt wurde.
Vorteile der Erfindung
-
Wie oben ausführlich beschrieben wurde, wird
erfindungsgemäß ein Laminat eines Tintenfisch-Chitinblattes und einer
Fischhautkollagen-Hüllschicht bereitgestellt, um die
Geschmeidigkeit und die Wirkung von Tintenfisch-Chitin, ein
Milieu zur Unterstützung der Produktion von Lysozym und zur
Verteidigung der Wunde bereitzustellen, auszubeuten und zur
selben Zeit den Nachteil eines schlechten Haftvermögens von
Fibroblastenzellen zu kompensieren, die zur Wundheilung
dienen, und den Nachteil zu kompensieren, daß die
Fibroblastenzellen, die daran anhaften, nicht expandieren, und so keine
sternförmige Form zeigen. Zusätzlich zeigten diejenigen
Fibroblastenzellen, die an einem Laminat eines
Tintenfischchitin-Blattes und einer Kalbshautkollagen-Hüllschicht
anhafteten, eine verzögerte initiale Wachstumsphase, während die an
einem Laminat eines Tintenfisch-Chitinblattes und einer
Fischhautkollagen-Hüllschicht anhaftenden Fibroblastenzellen
eine normale Zellvermehrungskurve zeigten, um das
vorhergehende noch zufriedenstellender unter Beweis zu stellen. Dies
ist darauf zurückzuführen, daß das Lachshautkollagen in einem
physiologisch aktiven Zustand amorph ist, wohingegen das
Kalbshautkollogan ein Kollagengewebe erzeugt und die
Vermehrung von Fibroblastenzellen unterdrückt, wie durch ein
Experiment unter Verwendung verschiedener Kollagen-Hüllschichten
bestätigt wurde, die auf einer Petri-Schale angeordnet
wurden. Es kann daher sicher geschlossen werden, daß ein Laminat
aus einem Tintenfischchitin-Blatt und einer
Fischhautkollagen-Hüllschicht als ein Hautersatz hochwirksam ist. Zuletzt
hat sich durch Beobachtung der DNA-Markierungs-Indizes
verschiedener Proben herausgestellt, daß ein Tintenfisch-
Chitinblatt, ein Laminat aus einem Tintenfischchitin-Blatt
und einer Fischhautkollagen-Hüllschicht, ein Laminat aus
einem Tintenfischchitin-Blatt und einer KalbshautKollagen-
Hüllschicht und die normale menschliche Haut im wesentlichen
denselben Wert für einen DNA-Markierungs-Index zeigten. Somit
kann wiederum sicher geschlossen werden, daß ein Laminat aus
einem Tintenfischchitin-Blatt und einer Fischhautkollagen-
Hüllschicht als Hautersatz hochwirksam ist.