DE202005022036U1

DE202005022036U1 - Paralleles Patch-Clamp-System

Info

Publication number: DE202005022036U1
Application number: DE202005022036U
Authority: DE
Original assignee: Molecular Devices LLC
Current assignee: Molecular Devices LLC
Priority date: 2004-09-10
Filing date: 2005-09-09
Publication date: 2012-08-07
Anticipated expiration: 2015-09-10
Also published as: EP1802752A2; DE202005022035U1; WO2006031612A2; DK1802752T3; EP1802752B1; US8048289B2; WO2006031612A9; WO2006031612A3; US20060194255A1; EP1802752A4

Abstract

Ein System (30) zur Analyse von Ionenkanäle aufweisenden Membranproben mit hohem Durchsatz, wobei das System aufweist: mindestens eine Membranprobe (44); eine Mehrkammerstruktur mit einer Vielzahl von extrazellulären Kammern (33) und mindestens einer gegenüberliegenden intrazellulären Kammer (37), wobei eine Abtrennung (40) die extrazellulären von der mindestens einen intrazellulären Kammer trennt und wobei jede extrazelluläre Kammer (33) mindestens 10, 50, 64, 100 oder 1000 Abtrennungsöffnungen (42) hat, die die extrazellulären und die mindestens eine intrazelluläre Kammern fluidtechnisch und elektrisch verbinden; eine elektrische Quelle, die dazu ausgelegt ist, eine Spannung und/oder einen Strom zwischen den extrazellulären und der mindestens einen intrazellulären Kammer anzulegen; und einen Stromsensor; wobei die elektrische Quelle und der Stromsensor jeweils dazu ausgelegt sind, den Gesamtstrom durch die Vielzahl der extrazellulären Kammern (33) und die mindestens eine intrazelluläre Kammer (37) bei einer Messbedingung anzulegen oder zu messen, bei der mindestens eine der Öffnungen (42) durch...

Description

VERWEISE AUF VERWANDTE ANMEDLUNGEN
Die vorliegende Anmeldung beansprucht Priorität in Bezug auf die vorläufige US-Patentanmeldung Nr. 60/700,464, eingereicht am 18.7.2005 mit dem Titel POPULATION PATCH CLAMP IMPROVES DATA CONSISTENCY AND SUCCESS RATES IN THE MEASUREMENT OF IONIC CURRENTS, die vorläufige US-Patentanmeldung Nr. 60/614,361, eingereicht am 28.9.2004 mit dem Titel ESTIMATION OF ELECTROPHYSIOLOGICAL PARAMETERS und die vorläufige US-Patentanmeldung Nr. 60/608,699, eingereicht am 10.9.2004 mit dem Titel POPULATION PATCH CLAMP SYSTEM, wobei der gesamte Inhalt dieser Anmeldungen hiermit durch Bezugnahme aufgenommen wird.
STAND DER TECHNIK DER ERFINDUNG
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Elektrophysiologie und insbesondere das Gebiet der Patch-Clamp-Elektrophysiologie, und ganz besonders automatisierte Instrumente und Systeme zur Patch-Clamp-Elektrophysiologie sowie Verfahren zu ihrer Verwendung.
Elektrophysiologie umfasst, aber ohne Beschränkung darauf, die elektrischen Eigenschaften von biologischen Membranen, wie etwa Transmembranpotential(e) und den Transmembran-Stromfluss durch membranzugehörige Ionenkanäle.
Beschreibung des Stands der Technik
Die Grundkonzepte der Patch-Clamp-Elektrophysiologie sind in der Technik bekannt. Es wird verwiesen auf Single Channel Recording von Sakmann und Neher (alle bisherigen Auflagen), The Axon Guide von Axon Instruments, Inc., und Ion Channels of Excitable Membranes von B. Hille, 3. Auflage, die hiermit alle durch Bezugnahme vollständig für alle Zwecke aufgenommen werden.
Elektrophysiologie kann unter Verwendung vielfältiger Techniken untersucht werden. Siehe z. B. die oben zitierten The Axon Guide, Single Channel Recording und Ion Channels of Excitable Membranes, die alle hiermit durch diese Bezugnahme aufgenommen werden. Zum Beispiel kann die Patch-Clamp-Technik verwendet werden, um die elektrischen Eigenschaften von Membranen zu untersuchen, einschließlich des Stroms durch Ionenkanäle in den Membranen. Typische Patch-Clamp-Aufzeichnungskonfigurationen sind Ganzzellen im Einzelkanalmodus, wobei beide Modi auf dem Gebiet bekannt sind. Typische Ganzzellenaufzeichnung erfordert das Erhalten eines Zugangs zum Zelleninneren, der gewöhnlich durch Saugen, Zapping und Antibiotikum ermöglicht wird. 1 zeigt eine elektrische grundsätzliche Ersatzschaltung, die Aspekte des membranelektrischen Verhaltens modelliert. Hierbei ist der Zellenwiderstand R auch als der Membranwiderstand oder Leckwiderstand bekannt. Der Pipettenwiderstand R_s wird oft erwähnt und ist gewöhnlich von dem Zugang – Widerstand oder Reihenwiderstand – nicht unterscheidbar.
Automatisierte Patch-Clamp-Einrichtungen führen bisher ein Spannungsklemmen einer einzelnen Zelle pro Kammer durch, gleichgültig, ob diese Kammer ein Well in einer Kassette, ein Fluss durch einen Kanal oder das Innere oder Äußere einer Pipette ist. Dies kann den Durchsatz begrenzen, die Anwendungen begrenzen und einen niedrigeren Grundwert für die Kosten pro Datenpunkt setzen, aus Gründen, die beschrieben werden sollen. Der Anmelder trifft auch keine Stellungnahme, dass die folgende Diskussion Material für eine Patentierbarkeit ist, und die folgende Diskussion soll nicht als Anerkennung in Richtung Interesse auf irgendeine Weise aufgefasst werden.
Im Allgemeinen werden zwei Ansätze in derzeitigen automatisierten Patch-Clamps verwendet. Diese zwei Ansätze unterscheiden sich hauptsächlich durch die Methodologie, die verwendet wird, um Fluidaustausch zu verwalten und elektrophysiologische Aufzeichnung durchzuführen.
Ansatz I: Mehrfaches Hinzugeben, Lesen und Waschen.
Dieser Ansatz ist gekennzeichnet durch eine einzige Zelle pro Well mit einer Fluidik mit der Fähigkeit, wiederholt Fluide aus jeder Zelle unabhängig hinzuzugeben und zu entfernen. Dieser Ansatz benutzt die Fluidik zum Waschen von Zellen mit Puffer und dem Hinzugeben mehrerer Stoffe, so dass mehrere Datenpunkte aus jeder Zelle beschafft werden können.
Typische Einrichtungen sind das System PatchXpress^® von der Molecular Devices Corporation, das Q-Patch von Sophion und das Port-A-Patch von Nanion. Diese Arten von Einrichtungen können sehr flexibel sein und können vielfältige Experimente durchführen, aber ihr Durchsatz ist gering. Zum Beispiel kann das sechzehnkanälige PatchXpress^® 7000A maximal etwa 240 Datenpunkte pro Tag sammeln (d. h. vier Datenpunkte pro Well, acht Wells pro SealChip^®-Kassette und acht SealChip^®-Kassetten pro Tag, unter der Annahme einer Erfolgsrate von 50% an jeder SealChip-Kassette, z. B. 50% von 16 Wells pro SealChip^®-Kassette = 8 Wells, Experimentdauer 30–60 Minuten).
Solche Systeme können Kontrollantworten derselben Zelle bestimmen, auf die der Teststoff angewandt wird, gleichgültig, ob der angewandte Stoff einen spannungsgesteuerten Ionenstrom (VGIC – Voltage Gated Ion Current) oder einen Liganten-gesteuerten Ionenstrom (LGIC – Ligand Gated Ion Current) modifiziert. Durch Prüfen der Viabilität der Zellen und Ausnutzen von Zufallszugangs-Fluidik ist es größtenteils möglich, zu garantieren, dass alle Stoffe geprüft werden und mit Ausnahme der statistischen Robustheit besteht keine Notwendigkeit, einen Stoff an mehr als einer Zelle zu prüfen.
Ansatz II: Hinzugeben und Lesen
Bei einem System des Typs „Hinzugeben und Lesen” werden keine Vorkehrungen getroffen, um die Kammer mit Puffer zu waschen oder die Stoffe auszuwechseln oder typischerweise die Stoffe sogar nachzureichen; somit wird von jeder Kammer nur ein einziger Datenpunkt akquiriert.
Dieser Ansatz wird im System IonWorks^® HT von der Molecular Devices Corporation realisiert. Dieses System ist auf das Hinzugeben von Lösung und das Lesen der Antwort (Hinzugeben und Lesen) beschränkt. Stoffe werden in Gruppen hinzugefügt, ungeachtet der Viabilität der Zellen in den Wells. Der Vorteil dieses Systems besteht darin, dass es viel einfacher als ein System ist, das Fluidaustausch erlaubt. Der Nachteil besteht darin, dass, da die typische Rate der Bildung einer erfolgreichen Ganzzellen-Aufzeichnungskonfiguration in der Umgebung von 60% bis 70% liegt, Stoffe redundant angewandt werden müssen, um zu garantieren, dass mindestens eine erfolgreiche Aufzeichnung jedes Stoffs besteht. Gewöhnlich ist die Redundanz vierfach, es ist aber achtfache oder höhere Redundanz erforderlich, wenn die Zellen die Ganzzellenkonfigurationen bei niedrigeren Erfolgsraten bilden. Diese Redundanz erhöht sowohl die Kosten pro Datenpunkt und vermindert auch den Durchsatz.
Wie jedes Messsystem kann das System des Typs Hinzugeben und Lesen nur funktionieren, wenn eine Kontrollmessung vorgenommen werden kann, mit der die Prüfstoffantwort verglichen wird. Im Fall von VGICs ist dies leicht. Als erstes wird die Antwort auf eine Reihe von Spannungsbefehlen vor dem Hinzugeben des Prüfstoffs gemessen. Dies ist die Kontrollantwort, die 100% darstellt. Als zweites wird die Antwort auf dieselbe Reihe von Spannungsbefehlen gemessen, nachdem der Prüfstoff hinzugefügt wird. Indem dies durch die Kontrollantwort dividiert wird, erhält man die prozentuale Inhibition oder Aktivierung.
Es ist nicht möglich, die Kontrollmessung im Fall von LGICs durchzuführen, weil es notwendig wäre, einen Agonisten hinzuzugeben, um die Kontrollantwort zu bestimmen, und ihn dann herauszuwaschen, bevor der Prüfstoff (typischerweise eine Mischung aus Prüfstoff und Agonist) zugesetzt wird. Dies kann in einem herkömmlichen System des Typs Hinzugeben und Lesen nicht durchgeführt werden. Eine mögliche Lösung wäre, die Kontrollantwort in einer Zelle in einem ersten Well zu messen und den Prüfstoff einer anderen Zelle in einem zweiten Well zuzugeben. Die Variabilität bei der Expression von Ionenkanälen in einer beliebigen gegebenen Zelle kann jedoch von null bis zum Vielfachen des Durchschnitts reichen, so dass die Antwort auf Kontrollstoffe eine ähnliche Variabilität aufweisen wird. Die bei der Verwendung einer einzigen Zelle als Kontrolle und einer anderen Zelle zur Prüfung auftretenden resultierenden Fehler sind nicht annehmbar.
Der Durchsatz von Systemen des Typs Hinzugeben und Lesen ist verglichen zum Ansatz I hoch. Zum Beispiel werden an einem typischen 8-stündigen Tag sechs bis zehn 384-Well-PatchPlate^TM-Substrate verarbeitet, da die typische Dauer eines Experiments etwa 45–75 Minuten beträgt. Bei der gewöhnlichen vierfachen Redundanz werden 96 Stoffe pro 384-Kammer-PatchPlate^TM-Substrat verabreicht. Somit beträgt die Anzahl der Datenpunkte pro Tag nominal 600–1000.
Für Dosisantwortanwendungen in ein System des Typs Hinzugeben und Lesen werden Dosisantwortkurven erhalten, indem man Stoffe mit verschiedenen Dosen auf verschiedene Gruppen von vier Kammern (unter der Annahme von vierfacher Redundanz) anwendet.
Sowohl für Ansatz I als auch Ansatz II kann einer von mehreren Stoffverabreichungsansätzen benutzt werden.
Fluidik I: Mehrere Spitzen, Nicht-Wahlfreier Zugriff
Bei diesem Ansatz wird ein Kopf mit mehreren Spitzen verwendet, um viele verschiedene Stoffe auf einmal aufzunehmen, um den Durchsatz zu vergrößern oder zu maximieren. Bei einer einfachen Implementierung besteht eine eindeutige Abbildung zwischen Stofforten und Ausgabesorten. Wenn die Zelle an einem bestimmten Patching-Ort nicht viabel ist, wird der Stoff somit trotzdem an diesem Ort ausgegeben. Um zu garantieren, dass alle Stoffe geprüft werden, müssen die Stoffe redundant auf mehrere Kammern, typischerweise vier oder mehr Kammern, angewendet werden.
Fluidik II: Einzelne Spitze, Wahlfreier Zugriff
Bei diesem Ansatz setzt ein Fluid-Dispenser einen Stoff einer Kammer auf einmal zu. Zum Beispiel verwendet das PatchXpress^®-System einen Dispenser des Typs Cavro^® (Tecan) für diesen Zweck. Der Vorteil dieses Ansatzes besteht darin, dass die Software einen beliebigen Stoff von einer beliebigen Position wählen kann. Analog zu Computerspeicher ist diese Auswahlflexibilität als „Wahlfreier Zugriff” bekannt. Der Vorteil des wahlfreien Zugriffs besteht darin, dass Stoffe nicht in irgendeiner bestimmten Reihenfolge verwendet werden müssen und alle Stoffe ungeachtet des Erfolgs des Patching-Prozesses in irgendeiner gegebenen Patch-Clamp-Kammer zugänglich sind und angewendet werden können. Der Nachteil dieses Ansatzes ist die Geschwindigkeit. Es besteht einfach eine Grenze dafür, wie schnell ein einzelner Pipettierungskopf eine auswechselbare Spitze aufnehmen, Stoff ansaugen und sie in eine Kammer ausgeben kann. Ein voller Zyklus kann etwa fünfzehn Sekunden dauern.
Fluidik III: Mehrere Spitzen, Wahlfreier Zugriff
Eine Modifikation des Ansatzes der Fluidik II besteht darin, mehrere Spitzen mit wahlfreiem Zugriff zu verwenden. Dies lasst sich durch Verwendung mehrerer unabhängiger Spitzenroboter erzielen, die durch eine zentrale Softwareanwendung gesteuert werden. Als Alternative sind zur Zeit Ansätze verfügbar, bei denen der Lösungsfluss in einem mehrkanaligen Spitzenkopf für jede einzelne Spitze gesteuert werden kann. Zusätzlich existieren Roboter, die die Steuerung des Abstands zwischen Spitzen in einem Mehrspitzen-Kopf steuern und somit räumlich und zeitlich gesteuerten Zugang zu mehreren Wells von einem Mehrspitzen-Kopf aus erlauben.
Zusätzlich zu derzeit von Firmen wie Molecular Devices, Sophion, Nanion usw. erhältlichen kommerziellen automatisierten Elektrophysiologieprodukten gibt es eine Anzahl von Patenten und Patentanmeldungen in Bezug auf die automatisierte Elektrophysiologie. Beispiele umfassen die US-Patentanmeldung Nr. 09/900,627 (d. h. die US-Patentanmeldung, Publikation Nr. US 2002/0053915 A1), übertragen auf die Bristol-Myers Squibb Company, und die Internationale Patentpublikation Nr. WO 99/66329 , übertragen auf CeNeS.
Die existierenden Einrichtungen und die existierende Literatur zeigen, dass auf dem Gebiet ein Bedarf an einer Einrichtung und Verfahren zum automatischen und genauen Aufzeichnen von elektrophysiologischen Signalen mit hohem Durchsatz und hoher Auflösung für vielfältige Anwendungen auf kosteneffektive Weise besteht.
Es gibt andere Beschränkungen von Patch-Clamp-Techniken des Standes der Technik. Während der Patch-Clamp-Aufzeichnung können Benutzer vielfältige Schaltungskompensationsmechanismen aktivieren, von denen ein Teil in kommerziellen Patch-Clamp-Verstärkern anzutreffen sind, einschließlich der Axopatch-Reihe von Verstärkern von der Molecular Devices Corporation. Zum Beispiel können Benutzer die Elektrode und/oder Ganzzellenkapazität nullen und eine Reihenwiderstandskompensation aktivieren. Außerdem können Benutzer eine Passiv-Lecksubtraktion aktivieren.
Während der elektrophysiologischen Aufzeichnung ist es oft vorteilhaft, die elektrischen Eigenschaften der analysierten Zelle oder des analysierten Präparats zu schätzen. Zum Beispiel können Benutzer wünschen, die Ganzzellenkapazität zu schätzen oder zu bestimmen, ob sich der Reihenwiderstand während des Verlaufs des Experiments geändert hat. Ein Ansatz, der verwendet werden kann, besteht darin, einen Rechteckspannungsimpuls an die dem Patch-Clamping unterzogene Zelle anzulegen und dann die Stromantwort der Zelle zu analysieren. Die Stromantwort auf ein Rechtecksignal ist ein mittels Tiefpass gefiltertes einfach- oder mehrfachexponentielles Abklingen, wobei die Zeitkonstanten der Signalkurve eine Funktion des Widerstands und der Kapazität der Zelle und der Instrumentation sind. Die Funktion „Membrane Test” im Industriestandard-Softwarepaket pClamp (Molecular Devices Corporation) verwendet diesen Ansatz zur Schätzung verschiedener experimenteller Parameter. Siehe z. B. pCLAMP9 – DATA ACQUSITION AND ANALYSIS FOR COMPREHENSIVE ELECTROPHYSIOLOGY – User's Guide, Axon Instruments, Inc. (August 2003). 2B zeigt ein Beispiel für die Daten, die aus dem Protokoll Membrane Test in pClamp gesammelt und geschätzt werden.
Bei Ansätzen wie etwa dem bei Membrane Test verwendeten kann es leider sehr schwierig sein, eine Kurvenanpassung der Stromantwort genau vorzunehmen, nachdem eine elektronische Kompensation beim Verstärker aktiviert wurde. Wenn zum Beispiel Ganzzellen-Membrankapazitätskompensation aktiviert wurde, wird die Passiv-Membranstromantwort auf einen Rechteck-Spannungsimpuls signifikant kleiner oder sogar null sein, und somit wird eine genaue Kurvenanpassung aufgrund eines niedrigeren Signal-/Rausch-Verhältnisses schwierig oder unmöglich.
Somit wird ein System benötigt, um elektrophysiologische Parameter während der Patch-Clamp-Aufzeichnung zu schätzen, wenn eine Kompensation von zumindest einiger dieser Parameter im Verstärker aktiviert wurde.
KURZFASSUNG DER ERFINDUNG
Im Allgemeinen stellt die vorliegende Erfindung ein System zur Analyse von Ionenkanäle aufweisenden Membranproben mit hohem Durchsatz bereit, bei dem jedes Well mehr als eine Öffnung aufweist und bei dem eine Analyse ungeachtet dessen durchgeführt werden kann, ob alle Öffnungen perfekt zu einer Zelle versiegelt sind. Vorteilhafterweise erlaubt die Konfiguration der vorliegenden Erfindung eine erhöhte Erfolgsrate, erhöhten Durchsatz, erhöhte Datenkonsistenz und verringerte Kosten.
Kurz gefasst betrifft ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ein System zur Analyse von Ionenkanäle aufweisenden Membranproben mit hohem Durchsatz, wobei das System Folgendes aufweist: mindestens eine Membranprobe; eine Mehrkammerstruktur einschließlich einer extrazellulären Kammer, einer gegenüberliegenden intrazellulären Kammer und einer Abtrennung, die die extrazelluläre und die intrazelluläre Kammer trennt, wobei die Abtrennung eine Vielzahl von Öffnungen hat, die die extrazelluläre und die intrazelluläre Kammer fluidtechnisch und elektrisch verbinden, wobei mindestens eine der Öffnungen durch die mindestens eine Membranprobe abgedichtet ist und eine andere der Öffnungen nicht abgedichtet ist; und eine elektrische Quelle, die dazu ausgelegt ist, eine Spannung und/oder einen Strom zwischen der extrazellulären und der intrazellulären Kammer anzulegen, wobei ein Teil des Stroms durch die nicht abgedichtete Öffnung fließt.
Bei einer Ausführungsform kann die Membranprobe aus der folgenden Gruppe ausgewählt werden: Zellen, Vesikeln, Organellen, Zellenmembranfragmenten oder synthetischen Membranen, die einen Ionenkanal umfassen. Die Membranprobe kann im Wesentlichen kugelförmig sein. Der Teil der Membranprobe außerhalb der einen Öffnung der Abtrennung kann im Wesentlichen intakt sein.
Die Mehrkammerstruktur umfasst eine Vielzahl von extrazellulären Kammern und mindestens eine gegenüberliegende intrazelluläre Kammer, wobei die Abtrennung die extrazellulären Kammern von der mindestens einen intrazellulären Kammer trennt. Die andere der Öffnungen kann offen sein. Jede extrazelluläre Kammer kann mindestens 2, 10, 50, 64, 100 oder 1000 Öffnungen umfassen. Die Abtrennung kann im Wesentlichen planar sein. Die Öffnungen haben einen Durchmesser im Bereich von ungefähr 0,5 μm bis 5 μm.
Der zur nichtabgedichteten Öffnung zugehörige Widerstand kann kleiner als 50 MOhm sein, und der zur mindestens einen Membranprobe zugehörige Widerstand, die zur abgedichteten Öffnung abgedichtet ist, kann größer als 50 MOhm sein. Der zur nichtabgedichteten Öffnung zugehörige Widerstand kann weniger als ungefähr 25%, 42%, 50% oder 75% des mittleren Widerstands zwischen der extrazellulären und der intrazellulären Kammer sein.
Optional kann das System ferner einen Stromsensor umfassen, der dafür ausgelegt ist, den Strom zwischen der extrazellulären und intrazellulären Kammer zu messen. Die elektrische Quelle und der Stromsensor können jeweils dafür konfiguriert sein, mit dem Anlegen und Messen des Stroms über die extrazelluläre und intrazelluläre Kammer hinweg zu beginnen, bevor alle Öffnungen durch jeweilige Membranproben abgedichtet sind. Die elektrische Quelle kann ein Verstärker sein. Die elektrische Quelle kann ein Patch-Clamp-Verstärker sein.
Das System kann ferner ein Fluidsystem zum Hinzugeben von Fluiden zu der extrazellulären Kammer umfassen, wobei das Fluidsystem dafür konfiguriert sein kann, Fluidik hinzuzugeben, zu lesen und zu waschen. Das Fluidsystem kann dafür konfiguriert sein, eine Lösung von Membranproben in Suspension in der extrazellulären Kammer zu verteilen. Die mindestens eine Membranprobe kann innerhalb von fünf Minuten ab der Verteilung durch das Fluidsystem zu der mindestens einen Öffnung abgedichtet werden. Die mindestens eine Membranprobe kann innerhalb von 60 Sekunden ab der Verteilung durch das Fluidsystem zu der mindestens einen Öffnung abgedichtet werden. Die mindestens eine Membranprobe hat eine Abdichtung mit niedrigem Widerstand mit der mindestens einen Öffnung im Bereich von ungefähr 10 MOhm bis 100 MOhm und die elektrische Quelle kann dafür konfiguriert sein, die mindestens einen Membranprobe durch Spannung zu clampen (klemmen).
Optional kann das System ferner eine erste Elektrode in elektrischem Kontakt mit der extrazellulären Kammer und eine zweite Elektrode in elektrischem Kontakt mit der intrazellulären Kammer umfassen, wobei die erste und die zweite Elektrode zum Anlegen der elektrischen Spannung über die extrazelluläre und die intrazelluläre Kammer mit der elektrischen Quelle elektrisch verbunden sind.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Analyse von Ionenkanäle aufweisenden Membranproben mit hohem Durchsatz, umfassend: Vorsehen eines Systems mit einer Mehrkammerstruktur mit einer extrazellulären Kammer, einer gegenüberliegenden intrazellulären Kammer und einer Abtrennung, die die extrazelluläre und die intrazelluläre Kammer trennt, wobei die Abtrennung eine Vielzahl von Öffnungen aufweist, die die extrazelluläre und die intrazelluläre Kammer fluidtechnisch und elektrisch verbinden, wobei die Öffnungen zum elektrischen Abdichten einer Membranprobe bemessen und ausgelegt sind; Verteilen einer Vielzahl von Membranproben in der extrazellulären Kammer, so dass die Membranproben mindestens eine der Öffnungen abdichten; Anlegen einer elektrischen Spannung und/oder eines elektrischen Stroms zwischen der extrazellulären und der intrazellulären Kammer, während eine andere der Öffnungen nicht abgedichtet ist; und Erfassen eines resultierenden Stroms und/oder einer resultierenden Spannung über die extrazelluläre und die intrazelluläre Kammer, wobei ein Teil des Stroms durch die nichtabgedichtete Öffnung fließt.
Bei einer Ausführungsform kann der Verteilungsschritt durchgeführt werden, indem eine Lösung von Membranproben in Suspension in die extrazelluläre Kammer verteilt wird. Die Membranproben können aus der folgenden Gruppe ausgewählt werden: Zellen, Vesikeln, Organellen, Zellenmembranfragmenten oder synthetischen Membranen, wobei diese Proben einen Ionenkanal umfassen. Die Membranprobe kann im Wesentlichen kugelförmig sein. Ein Teil der Membranprobe außerhalb der einen Öffnung der Abtrennung kann im Wesentlichen intakt sein. Die Membranprobe kann eine Abdichtung mit niedrigem Widerstand zu der mindestens einen abgedichteten Öffnung aufweisen, der mindestens ungefähr 10 MOhm, 100 MOhm oder 1000 MOhm ist.
Der Verteilungsschritt kann durchgeführt werden, indem mindestens zwei Membranproben mindestens zwei jeweilige Öffnungen abdichten, wobei das Verfahren ferner den Schritt des Summierens des resultierenden Stroms und/oder der resultierenden Spannung auf der Basis der zwei abgedichteten Membranproben umfasst. Außerdem kann der Verteilungsschritt durch mindestens zwei Membranproben durchgeführt werden, die mindestens zwei jeweilige Öffnungen abdichten, wobei das Verfahren ferner den Schritt des Mittelns des resultierenden Stroms und/oder der resultierenden Spannung auf der Basis der zwei abgedichteten Membranproben umfasst. Als Alternative kann der Verteilungsschritt durch mindestens n Membranproben erzielt werden, die n jeweilige Öffnungen abdichten, wobei das Verfahren ferner den Schritt des Mittelns des resultierenden Stroms und/oder der resultierenden Spannung auf der Basis der n abgedichteten Membranproben umfasst.
Der Anlegungsschritt kann ferner das Spannungsklemmen der einen Membranprobe umfassen. Die Schritte des Anlegens und Erfassens können eingeleitet werden, bevor die Membranprobe zu der mindestens einen Öffnung abdichtet.
Das Verfahren umfasst ferner den Schritt des Aufzeichnens des Stroms. Der Aufzeichnungsschritt kann innerhalb von ungefähr 60 Sekunden ab dem Verteilungsschritt begonnen werden. Als Alternative kann der Aufzeichnungsschritt innerhalb von ungefähr 5 Minuten ab dem Verteilungsschritt begonnen werden. Das Verfahren umfasst ferner den Schritt des Messens des Stroms und des Anwendens eines Lecksubstraktionsdaten-Akquisitionsprotokolls.
Das parallele Patch-Clamp-System der vorliegenden Erfindung besitzt weitere Merkmale und Vorteile, die aus den beigefügten Zeichnungen, die in die vorliegende Beschreibung integriert sind und einen Teil dieser bilden, und aus der folgenden ausführlichen Beschreibung der Erfindung, die zusammen zur Erläuterung der Prinzipien der vorliegenden Erfindung dienen, ersichtlich werden und dort ausführlicher dargelegt werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine schematische Darstellung, die eine Ersatzschaltung für eine einfache Zelle zeigt.
2 ist eine schematische Querschnittsansicht einer beispielhaften Parallel-Patch-Clamp-(PPC-)Einrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung.
3 ist eine schematische Querschnittsansicht einer anderen beispielhaften PPC-Einrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung, die die Blockierung von offenen Löchern mit Blockierungsperlen zeigt.
4 ist eine schematische Querschnittsansicht einer anderen beispielhaften PPC-Einrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung, die Doppelelektroden mit virtueller Masse umfasst.
5 ist eine schematische Querschnittsansicht einer anderen beispielhaften PPC-Einrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung mit Zweielektroden-Verstärkern in extrazellulären und intrazellulären Abteilungen.
6 ist eine schematische Querschnittsansicht einer anderen beispielhaften, PPC-Einrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung, die eine Abtrennung mit nanoporengroßen Löchern und mehreren Löchern pro Zelle umfasst, und die die optionale Verwendung von Blockierungsperlen zeigt.
7 ist eine schematische Draufsicht einer beispielhaften auswechselbaren Elektrodenplatte mit Löchern zur Stoffzugabe (Karomuster) und umgebenden Verstärkern gemäß der vorliegenden Erfindung.
8 ist eine schematische Seitenansicht einer beispielhaften Elektrodenplatte, die ein Beispiel für eine Verbindungsleitung zeigt. Extrazelluläre Elektroden stehen in jede Kammer gemäß der vorliegenden Erfindung vor. Ein Zugangsloch erlaubt es den Fluidausgaberöhren, Stoffe in die Kammern einzuspritzen.
9 ist eine Bildschirmkopie von Membrane Test der pClamp-Software, Version 9.1.
10 ist ein Flussdiagramm einer modifizierten Membranprüfung gemäß Aspekten der vorliegenden Erfindung.
11 ist eine schematische Querschnittsansicht einer anderen beispielhaften PPC-Einrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung.
12A und 12B sind Graphen von ionischen und Leckströmen, bevor bzw. nachdem passiver Leckstrom subtrahiert wurde.
12C und 12D sind Graphen des Kanalstroms, der unter Verwendung der PPC-Technik der vorliegenden Erfindung bzw. unter Verwendung einer Einzelöffnungstechnik gemessen wurde.
13A und 13B sind Graphen von Strömen, die unter Verwendung einer Einzelöffnungstechnik bzw. der PPC-Technik der vorliegenden Erfindung gemessen wurden.
13C ist ein Graph, der eine I-V-Kurve zeigt, die in einem einzelnen PPC-System-Well gemessen wurde.
13D ist ein Graph, der G-V-Kurven zeigt, die aus einer Familie von Lesevorgängen aus einer einzelnen Gruppe von 48 Wells gemessen wurden.
14A, 14B und 14C sind Stromamplitudenhistogramme für einzelne Wells bei Verwendung einer einzelnen Öffnung im Vergleich zu einem PPC-Substrat mit 64 Öffnungen.
15 ist ein Graph von Erfolgsraten für einzelne Wells im Einzelzellen- und PPC-Modus.
16A und 16B sind Graphen, die die Pharmakologie von K_v1.3- und Na_v1.5-Kanälen zeigen.
17 ist ein Graph, der eine Prädiktion offener Öffnungen und aller anderen Öffnungen zeigt.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Es wird nun ausführlich auf die bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung Bezug genommen, wofür Beispiele in den beigefügten Zeichnungen dargestellt sind. Obwohl die Erfindung in Verbindung mit den bevorzugten Ausführungsformen beschrieben wird, versteht sich, dass sie die Erfindung nicht auf diese Ausführungsformen beschränken sollen. Im Gegenteil soll die Erfindung Alternativen, Modifikationen und Äquivalente abdecken, die in dem durch die angefügten Ansprüche definierten Gedanken und Schutzumfang der Erfindung enthalten sein können.
Die vorliegende Erfindung stellt Systeme, die Vorrichtungen und Verfahren umfassen, zum Durchführen von parallelen Patch-Clamps bereit. Diese Systeme können (i) die Erfolgsrate pro Well erhöhen, (ii) den Durchsatz verbessern, (iii) die Datenkonsistenz verbessern, (iv) die Kosten pro Datenpunkt verringern und (v) im Fall von Systemen des Typs Hinzugeben und Lesen die potentiellen elektrophysiologischen Anwendungen so erweitern, dass sie LGICs umfassen. Die Systeme umfassen das Konzept des Messens von Ganzzellenströmen bei einer großen Anzahl von Zellen, die an vielen Löchern in einem einzelnen Well dem Patch-Clamping unterzogen werden. Die Einrichtung kann ihrerseits einen oder mehrere Wells aufweisen und kann für einzelne Experimente und/oder mehrere Experimente, z. B. effizientes Screening mit hohem Durchsatz, verwendet werden. Die Systeme können funktionsfähig sein, gleichgültig, ob alle Löcher in einem einzelnen Well elektrisch abgedichtet sind oder nicht. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung soll der Ausdruck „abgedichtet”, wie auf dem Gebiet der Elektrophysiologie in seinem allgemeinsten Kontext aufgefasst, elektrisch abgedichtet bedeuten. Es versteht sich, dass der Ausdruck „abgedichtet” den physikalischen Zustand einschließt, bei dem eine Membranprobe ausreichend an eine Öffnung gebunden ist, um die Erzielung sinnvoller Daten zu erlauben.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem verbesserte Systeme, die Vorrichtungen und Verfahren umfassen, zum Schätzen von elektrophysiologischen Parameter bereit, insbesondere wenn eine Kompensation eines oder mehrerer dieser Parameter aktiviert wurde.
Der Klarheit halber werden durchweg die folgenden Definitionen benutzt.

a. Ionenkanal = Ein Membran-zugehöriger biologischer Mechanismus (passiv und/oder aktiv), wie etwa ein Membranprotein, zum Ermöglichen des Durchgangs von Ionen durch biologische Membranen, darunter, aber ohne Beschränkung darauf, herkömmliche Ionenkanäle, wie etwa spannungs- oder Liganden-abhängige Ionenkanäle, sowie Ionentransporter und andere Ionenflussmechanismen, die in biologischen und/oder synthetischen Membranen anzutreffen sind. Die Ionenkanäle können den Durchgang von Ionen in und/oder aus Zellen, Organellen usw. und/oder durch synthetische Membranen, wie etwa Vesikel, suspendierte Lipidbischichten usw., ermöglichen.
b. Patch Clamp – ein Mechanismus zum Aufzeichnen von Ionenkanaleigenschaften aus Membran-Patches, einschließlich biologischer und/oder künstlicher Membranen. Diese Eigenschaften können unter anderem Spannungs- und/oder Stromeigenschaften umfassen, darunter Stromänderungen als Reaktion auf ein Spannungsklemmen und/oder Spannungsänderungen als Reaktion auf ein Stromklemmen. Der Ausdruck wird hier nur als ein Beispiel verwendet. Die hier beschriebenen Systeme können allgemeiner bei beliebigen geeigneten elektrophysiologischen Aufzeichnungstechniken verwendet werden. Die Patch-Clamp-Technik kann Patch-Clamp-Techniken auf Pipettenbasis umfassen, wie zum Beispiel in den oben zitierten Literaturstellen The Axon Guide, Single Channel Recording und Ion Channels of Excitable Membranes beschrieben, die hiermit alle durch Bezugnahme aufgenommen werden, und automatisierte Patch-Clamp-Techniken, wie zum Beispiel in der US-Patentanmeldung Nr. 10/236,684, eingereicht am 5.9.2002 (nun US-Patentanmeldung, Publikation Nr. 2003/0070923 A1) und US-Patentanmeldung Nr. 10/334,815, eingereicht am 31.12.2002 (nunmehr US-Patentanmeldung, Publikation Nr. 2003/0146091 A1) beschrieben, wobei der gesamte Inhalt dieser Anmeldungen hiermit durch diese Bezugnahme aufgenommen wird.
c. Datenpunkt – Eine Messung bei einem Stoff bei einer Konzentration, gleichgültig, ob es sich um eine einzelne Antwort von einer Zelle oder um eine gemittelte Antwort von zwei oder mehr Zellen handelt.
d. Durchsatz – Die Anzahl der Datenpunkte pro Zeitraum, am üblichsten einem 8-stündigen Tag.
e. Well oder Kammer – Eine einzelne Abteilung in einer Mehrabteilungsstruktur. Well und Kammer werden austauschbar verwendet. Zum Beispiel wird ein einzelnes Well in einer Multiwell-Platte auch als Kammer bezeichnet.
f. Zelle oder Zellenmembran – Eine biologische Entität, die Ionenkanäle, Transporter und Ionenflussmechanismen umfasst. Eine Zelle kann eine intakte biologische Zelle oder Organelle sein oder ein Zellenmembranfragment oder eine synthetische Membran, das bzw. die einen Ionenkanal, Transporter oder Ionenflussmechanismus umfasst.
g. Abtrennung – Eine Struktur, die zwei gegenüberliegende Wells oder Kammern trennt, um somit teilweise eine Mehrkammerstruktur zu bilden, und die eine oder mehrere Öffnungen zum Binden von Zellen oder Zellenmembranen zur Analyse umfassen kann. Die Ausdrücke Substrat und Abtrennung können austauschbar verwendet werden. Die Struktur kann insofern von einer Pipettenspitze unterschieden werden, als sie ein Ausdehnung quer zu etwaigen zugehörigen Öffnungen aufweist, die mindestens so signifikant wie und typischerweise mindestens mehrmals so signifikant wie der Durchmesser (oder die charakteristische Breite) der Öffnung ist. Die Struktur kann mindestens im Wesentlichen planar sein, insbesondere in der Umgebung jeglicher zugehöriger Öffnungen (wie etwa der Region, die die Öffnung umgibt, die beim Binden von Zellen und/oder Zellenmembranen beteiligt ist).
h. Pipetten-Patch-Clamp – Herkömmliches Patch-Clamp-System, bei dem eine Pipette eine Abdichtung zu einer Membran bildet, wie zum Beispiel durch Sakmann und Neher exemplifiziert (siehe das oben zitierte Single Channel Recording).
i. Planar-Patch-Clamp – Neues Patch-Clamp-System, bei dem ein typischerweise planares Substrat (z. B. wie oben definiert) eine Abdichtung zu einer Membran bildet, wie zum Beispiel durch die oben erwähnte US-Patentanmeldung Nr. 10/334,815, eingereicht am 31.12.2002 (nun US-Patentanmeldung, Publikation Nr. 2003/0146091 A1) exemplifiziert, wobei deren gesamter Inhalt hiermit durch Bezugnahme aufgenommen wird.
j. Einheiten – GOhm = 10⁹ Ohm, MOhm = 10⁶ Ohm.
k. Ensemblestrom – Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung und zusätzlich zu herkömmlichen Definitionen kann sich der Ausdruck „Ensemblestrom” auf die Gesamtmessung der Ströme in den Zellen beziehen, die in einem Array von Messöffnungen (bis zu eine Zelle pro Öffnung) in jedem Well einer Mikroplatte abgedichtet sind, wobei ein einziger Spannungsklemmverstärker pro Well verwendet wird (z. B. „Ensemblestrom eines Wells” zusätzlich zu dem herkömmlichen „Ensemblestrom einer Zelle”). Zusätzlich kann sich der Ausdruck „Ensemblestrom” auch auf die Gesamtmessung von Strömen durch das Array von Messöffnungen beziehen, gleichgültig, ob alle Öffnungen mit einer Zelle abgedichtet sind oder nicht (z. B. eine oder mehrere offene oder teilweise verschlossene Öffnungen).
l. Membranprobe – Eine biologische Entität, die einen Ionenkanal, Transporter oder Ionenflussmechanismus umfasst. Die Entität kann eine Zelle, ein Vesikel, eine Organelle, ein Zellenmembranfragment oder eine synthetische Membran sein.

Nunmehr mit Bezug auf die Zeichnungen, in denen in den verschiedenen Figuren durchweg gleiche Komponenten mit gleichen Bezugszeichen bezeichnet sind, wird die Aufmerksamkeit auf 2 gelenkt, die ein Parallel-Patch-Clamp-(PPC-)System gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt, das allgemein mit 30 bezeichnet wird. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung bezieht sich paralleles Patch-Clamping auf Patch-Clamping, bei dem Strom parallel zwischen zwei oder mehr Öffnungen von einer Kammer zur anderen fließt. Die durch jede Öffnung fließenden Ströme sind im Allgemeinen nicht gleich, aber sie sind parallel zueinander.
Das PPC-System umfasst ein oder mehrere Wells 32 (in der Figur ist ein einziges Well gezeigt). Eine obere (extrazelluläre) Kammer 33 wird mit einer herkömmlichen extrazellulären Lösung 35 gefüllt. Eine untere (intrazelluläre) Kammer 37 wird mit einer herkömmlichen intrazellulären Lösung 39 gefüllt, obwohl dieser Lösung zusätzliche Reagenzien zugesetzt werden können, wie später ausführlicher besprochen wird. Die Ausdrücke Oberes und Unteres werden hier der Zweckmäßigkeit halber verwendet; es besteht keine Notwendigkeit, dass die Kammern physisch auf solche Weise orientiert werden. Die extrazelluläre und intrazelluläre Kammer bilden somit eine Mehrkammerstruktur.
Die beiden Kammern werden durch eine Abtrennung 40 mit mindestens zwei oder mehr Löchern oder Öffnungen 42 getrennt, die durch die Abtrennung verlaufen und eine elektrische Verbindbarkeit zwischen den beiden Kammern erlauben. Die Löcher können einen Durchmesser von etwa 0,2 μm bis etwa 20 μm und vorzugsweise etwa 0,5 μm bis etwa 5 μm aufweisen, obwohl sie allgemeiner eine beliebige andere geeignete Größe aufweisen können. Die Abtrennung ist typischerweise etwa 10 μm bis etwa mehrere Millimeter dick, obwohl sie allgemeiner eine beliebige geeignete Dicke aufweisen kann. An jedes Well ist eine herkömmliche Elektrophysiologieelektronik angeschlossen, die verwendet wird, um zu stimulieren und von Zellen aufzuzeichnen, die in die obere Kammer gebracht wurden. Die Zellen 44 werden zu der extrazellulären Kammer hinzugefügt und werden zu den Löchern in der Abtrennung gelenkt und bilden eine elektrische Abdichtung zu der Abtrennung in der Umgebung des Lochs.
Die PPC-Einrichtung weist mehrere Löcher pro Well auf und kann sogar arbeiten, wenn nicht alle Löcher durch eine Zelle abgedichtet sind. Genauer gesagt, arbeitet die PPC-Einrichtung, wenn Strom von der oberen zu der unteren Kammer nicht nur durch (a) Ionenkanäle oder Transporter, die in Zellen residieren, die zu der Abtrennung abgedichtet sind, sondern auch (b) offene und/oder teilweise verschlossene Löcher fließen kann.
Es besteht im Allgemeinen keine Beschränkung bezüglich der Anzahl der Wells, die in einem einzelnen Verbrauchsgegenstand einer PPC-Einrichtung anwesend sein können, obwohl die üblichsten Konfigurationen diejenigen sind, die komplementär mit existierenden Screening-Einrichtungen mit hohem Durchsatz sind, wie zum Beispiel, unter anderem, 96, 384 oder 1536 Wells pro Verbrauchsgegenstand.
Im Folgenden werden mehrere Merkmale der PPC-Einrichtung ausführlich besprochen.
Fluidik
Die PPC-Einrichtung kann optional ein geeignetes Fluidsystem 46 zum Zugeben von Proben, Reagenzien und/oder dergleichen zu den Wells benutzen.
Das Fluidsystem kann Fluidik des Typs Hinzugeben und Lesen umfassen, in dem Fluid und/oder andere Materialien hinzugegeben werden und dann ein Ergebnis erfasst oder gelesen wird. In bestimmten Fällen kann es wichtig sein, den Spannungsklemmstrom und/oder andere Parameter kontinuierlich zu messen oder solche, die gesampelt werden bevor, während und/oder nachdem die Kontroll- und Prüfstoffe hinzugegeben werden, werden addiert, da LGIC-Antworten gewöhnlich desensibilisieren.
Das Fluidsystem kann Fluidik zum Beispiel auch unter Verwendung eines wahlfreien Zugriffs-Fluidik-Ansatzes hinzugeben, lesen und waschen. Dieser Ansatz maximiert die Flexibilität der PPC-Einrichtung, kann aber den Durchsatz der Einrichtung verringern.
Bei bestimmten Ausführungsformen werden Lösungen unter kontinuierlicher Spannungsklemmung und Aufzeichnung von Strömen ausgegeben. 7 und 8 zeigen eine Ausführungsform der Kammern eines PPC-Systems. Eine entfernbare Elektrodenplatte 47 könnte über einer PatchPlate^TM- oder anderen geeigneten Mehrkammerstruktur, wie etwa einer Mikroplatte 49, die eine Vielzahl von Wells 32 verwendet. Vorzugsweise würde diese Konfiguration einzelne leitende Drähte aufweisen, um jede Elektrode 51 mit ihrem entsprechenden Verstärker zu verbinden. Vorzugsweise bestehen die Elektroden aus Ag/AgCl, es versteht sich jedoch, dass die Elektroden aus Graphit-, Platin- oder anderen geeigneten Materialien bestehen können. Jede Elektrode würde in eine extrazelluläre Kammer 33 in der Mikroplatte eintauchen. Ein Loch 53 über jeder Mikroplattenkammer würde es den Ausgaberöhren 54 des Fluidsystems erlauben, den Prüfstoff der Kammer hinzuzufügen. Die Elektrodenplatte könnte gewaschen werden, bevor jede neue Mikroplatte zu dem Instrument hinzugefügt wird, oder es könnte ein Satz von Elektrodenplatten verwendet werden, einer pro Mikroplatte, während des Verlaufs des Tages, und gewaschen oder ausgewechselt werden. Wenn es notwendig ist, können etwaige regenerierbare Elektroden, wie etwa Ag/AgCl-Elektroden täglich oder weniger häufig regeneriert werden.
Kammern und Abtrennung
Für ein gegebenes Well liegt typischerweise eine intrazelluläre Kammer 37 vor, die einer extrazellulären Kammer 33 gegenüberliegt, und die Kammern werden durch die Abtrennung 40 (2) getrennt. Es kann eine einzige extrazelluläre Kammer für jede intrazelluläre Kammer vorliegen oder es kann eine gemeinsame Kammer für eine Gruppe von gegenüberliegenden Kammern vorliegen. Zum Beispiel können mehrere unabhängige extrazelluläre Kammern und eine einzige intrazelluläre Kammer vorliegen oder eine Teilmenge von extrazellulären Kammern, die von einer einzigen intrazellulären Kammer versorgt werden.
Die Abtrennung, die eine intrazelluläre Kammer von einer extrazellulären Kammer trennt, enthält mindestens ein Loch oder eine Öffnung 42, das bzw. die durch die gesamte Abtrennung verläuft. Bei der PPC-Einrichtung der vorliegenden Erfindung gibt es mehrere Öffnungen pro extrazellulärem Well, vorzugsweise mehr als ein Loch pro Well, besonders bevorzugt mehr als etwa 10 Löcher pro Well, noch mehr bevorzugt 64 Löcher pro Well und ganz besonders bevorzugt mehr als etwa 100 Löcher pro Well, und es können mehr als 1000 Löcher sein. Die Löcher in der Abtrennung können in einem Prozess hergestellt werden, dessen Kosten nicht proportional oder minimal proportional zu der Anzahl der Löcher sind. Als Alternative oder zusätzlich können die Kosten pro Loch relativ zu den Kosten der gesamten verbrauchbaren Platte, die viele Wells umfasst, relativ gering sein. Wenn zum Beispiel die Abtrennung aus geätztem Silizium hergestellt ist, ist der Preis pro Einheitsfläche unabhängig von der Anzahl der Löcher.
Die Abtrennung kann aus einem beliebigen geeigneten Material bzw. beliebigen geeigneten Materialien hergestellt sein, darunter, aber ohne Beschränkung darauf, Kunststoff, Glas, Silizium und/oder ein Polymer wie etwa Sylgaard. Die Löcher können in der Abtrennung unter Verwendung von in der Technik bekannten Techniken hergestellt sein. Typischerweise wären die Durchmesser der Löcher etwa 0,2 μm bis etwa 20 μm und bevorzugt 0,5 μm bis etwa 5 μm. Die Dicke der Abtrennung beträgt typischerweise etwa mehrere Mikrometer bis zu mehreren Millimetern Dicke. Wie oben diskutiert, können die Durchmesser der Löcher und die Dicke der Abtrennung jedoch allgemeiner beliebige geeignete Werte umfassen. Es können Fotolithographieansätze verwendet werden, um Löcher in Silizium zu ätzen. Als Alternative können Laserbohransätze verwendet werden, um Löcher in Glas oder Kunststoff herzustellen. Solche Laserbohrprozesse sind in der Technik wohlbekannt. Typischerweise werden beim Laserbohren jedoch sequentiell einzelne Löcher gebildet. Zusätzlich kann Laserbohren in Glas oder Kunststoff für herkömmliche automatisierte Patch-Clamp-Einrichtungen eine sorgfältige Kontrolle der Laserparameter erfordern, um ordnungsgemäß bemessene und geformte Löcher sicherzustellen (z. B. Durchmesser, Verjüngung des Lochs, Oberflächentextur usw.). Deshalb vergrößert das Erhöhender Anzahl der Löcher in der Abtrennung linear die Kosten der Abtrennung. Es ist auch erkennbar, dass die Löcher durch andere geeignete Mittel gebildet werden können, darunter, aber ohne Beschränkung darauf, Formen, Prägen und/oder chemisches Ätzen.
Der PPC-Ansatz erfordert keine Abdichtungen mit hohem Widerstand (d. h. GOhm) zwischen einer Zelle und der Oberfläche um ein Loch herum. In dieser Situation ist die Qualität (z. B. Durchmesser, Verjüngung des Lochs, Oberflächentextur usw.) des Lochs nicht so kritisch. In bestimmten Fällen kann es deshalb möglich sein (i) die Komplexität des Laserbohrprozesses zu verringern und/oder (ii) Löcher parallel mit Laser zu bohren, wobei beides die Kosten der Abtrennung stark verringert. Zum Beispiel kann es möglich sein, den Laserbohrstrahl in mehrere Teilstrahlen aufzuteilen, wobei jeder Teilstrahl ein Loch in der Abtrennung bilden kann. Bei einer bevorzugten Ausführungsform könnten alle Löcher in der Abtrennung bei einer einzigen Laserstrahlbelichtung gebildet werden, so dass die zum Bewegen eines Laserstrahls von putativem Loch zu putativem Loch notwendige Todzeit eliminiert wird. Als Alternative kann eine einzige Belichtung vom Laserstrahl verwendet werden, um eine Teilsatz von Löchern in der Abtrennung, zum Beispiel alle Löcher in einem einzelnen Well, herzustellen. Der Laserstrahl würde dann über die gesamte Abtrennung gescannt, bis alle Löcher, die zu einem Well gehören, hergestellt wurden. Obwohl er nicht so effizient wie eine einzige Belichtung ist, ist der letztere Ansatz effizienter als ein völlig sequentieller Prozess.
Die Oberfläche der Abtrennung um das Loch herum und möglicherweise einschließlich der Oberfläche der Wände des Lochs in der Abtrennung können modifiziert werden, um die Abdichtungsbildung zwischen den Zellen und der Abtrennung zu erleichtern. Es gibt eine Anzahl von Ansätzen zum Modifizieren solcher Oberflächen, um die Abdichtungsbildung zu verbessern, darunter Glättung der Oberfläche des Lochs mit Wärme, Reinigen der Oberfläche, Modifikation der Ladung auf der Oberfläche, Immobilisierung von an Zellen haftenden Molekülen wie Polylysin an der Oberfläche und so weiter. Beispielhafte Ansätze sind in der oben erwähnten US-Patentanmeldung Nr. 10/334,815, eingereicht am 31.12.2002 (nun US-Patentanmeldung, Publikation Nr. 2003/0146091) beschrieben, deren gesamter Inhalt hiermit durch Bezugnahme aufgenommen wird. Elektronik
Elektroden werden in der Elektrophysiologie verwendet, um Spannung zu messen und Strom zu leiten. Eine häufige Fehlerquelle bei jeder elektrophysiologischen Aufzeichnungskonfiguration ist die Spannungsdrift im Übergangspotential der intrazellulären und extrazellulären Elektroden. Es versteht sich, dass der Ausdruck „Potential” synonym mit dem Ausdruck „Spannung” verwendet werden kann und eine beliebige elektrische Spannungsdifferenz zwischen zwei Punkten einschließt. Spannungsdriften von mehr als einigen wenigen Millivolt kann zu einer fehlerhaften Bestimmung der Aktivierungsschwellen der untersuchten zellulären Ströme führen oder zu Verschiebungen des Haltepotentials, die letztendlich zu einer verfrühten Verschlechterung der Zellenviabilität führen kann.
In der Elektrophysiologie werden typischerweise Festelektroden verwendet und Ag/AgCl-Elektroden werden häufig verwendet, weil sie weniger als die meisten anderen Festelektroden driften. Dessen ungeachtet beginnen Ag/AgCl-Elektroden, die anfänglich stabil sind, oft nach einem Zeitraum der Verwendung, inakzeptables Driften aufzuweisen. Einer der Beiträge zu der Entwicklung des Spannungsdriftens ist der Gesamtstrom pro Einheitsoberfläche (d. h. Stromdichte), der von der Elektrode geleitet wird, insbesondere wenn der Strom hauptsächlich eine Polarität aufweist. Große Momentanstromdichten könnten auch zu der Entwicklung von Spannungsdriften entweder transienter oder permanenter Beschaffenheit beitragen.
Driftprobleme können durch Verwendung beliebiger geeigneter Techniken reduziert oder minimiert werden. Solche Techniken umfassen, aber ohne Beschränkung darauf, großflächige Elektroden und/oder virtuelle Massen mit zwei Anschlüssen.

a. Großflächige Elektroden – Diese können die Stromdichte verringern oder minimieren.
b. Virtuelle Masse mit zwei Anschlüssen – Dabei handelt es sich um eine Technik, die nicht oft verwendet wird. Sie wird gewöhnlich nur für spezifische Elektrophysiologiekonfigurationen implementiert, die als Spannungsklemmung mit zwei Elektroden von großen Zellen, wie Oocyten, bekannt sind. Bei diesem Ansatz werden die Funktionen des Stromleitens und der Spannungsaufzeichnung getrennt und zwei verschiedenen Elektroden zugewiesen. Die Spannungsaufzeichnungselektrode besteht typischerweise aus Ag/AgCl und die Stromleitelektrode besteht typischerweise aus einem reinen Metall. Übergangspotentiale in der Stromleitelektrode sind irrelevant, selbst wenn sie wesentlich variieren.

Die oben beschriebenen Probleme des Spannungsdriftens treten zu einem gewissen Grad bei allen elektrophysiologischen Aufzeichnungssituationen auf, sind aber wahrscheinlich größer, wenn große Ströme durch dieselbe Elektrode geleitet werden, die für die Spannungsaufzeichnung verwendet wird. Bei vorbekannten automatisierten Patch-Clamps wird eine einzelne Elektrode für die intrazelluläre Spannungsaufzeichnung und das Leiten von Strom verwendet und eine andere Einzelelektrode wird für die extrazelluläre Spannungsaufzeichnung und das Leiten von Strom verwendet. Die durch Strom verursachten Spannungsdrifts sind kein großes Problem, da die Ströme durch eine einzige Säugetierzelle, die typischerweise bei einem automatisierten Patch-Clamp verwendet wird, klein sind (in der Größenordnung eines Nanoampere). Die Beschichtungen an Elektroden nutzen sich mit der Zeit jedoch ab, und soweit diese Abnutzung durch Stromfluss verursacht wird, würden Standard-Patch-Clamps von einer Technik Nutzen ziehen, die den Strom von der Spannungsaufzeichnungselektrode beseitigt.
Im vorliegenden Fall eines parallelen Patch-Clamp-Systems könnten die Ströme in jeder Kammer ein oder mehrere Mikroampere betragen, was zu sehr hohen Stromdichten führt und in bestimmten Fällen zu tausendfach höheren Stromwerten. Bei einem so hohen Vielfachen des Stromwerts werden die Driftprobleme wahrscheinlich entweder unmittelbar schlechter oder beginnen viel früher.
Bei bestimmten Ausführungsformen kann das Driftproblem in der extrazellulären Seite (oberen Seite) durch Verwendung einer großflächigen Elektrode in Kontakt mit der extrazellulären Lösung gelindert werden. Es kann ferner durch Verwendung von einmal oder einige wenige Male verwendbaren Wegwerfelektroden oder von Elektroden, die regeneriert werden können, weiter gelindert werden. Als Alternative oder zusätzlich kann dieses Problem ähnlich auf der intrazellulären Seite gelindert werden. In dem Spezialfall, dass die intrazelluläre Seite ein großes Plenum ist (wie etwa das bei dem System IonWorks^® HT verwendete), könnten anstelle der Verwendung einer einzigen Elektrode mehrere oder mehrere zehn Elektroden parallel verwendet werden, um die Stromdichte pro Elektrode zu verringern.
Bei bestimmten Ausführungsformen sind die Funktionen des Stromleitens und der Spannungsaufzeichnung für beide Seiten einer Abtrennung getrennt (siehe z. B. 4). In jedem Fall werden die existierenden Elektroden durch ein Paar von Elektroden ersetzt, wobei eine eine ausschließlich für Spannungsaufzeichnung verwendete Elektrode 51 und die andere eine zum Stromleiten 51' verwendete Elektrode ist. Als Alternative kann ein Paar von Elektroden nur auf einer Seite des planaren Substrats verwendet werden und auf der alternativen Seite eine herkömmliche Einzelelektrode. Obwohl die bevorzugte Elektrodenkonfiguration im Kontext einer Parallel-Patch-Clamp-Konfiguration beschrieben wird, versteht sich, dass eine solche Konfiguration auch bei einem herkömmlichen Patch-Clamp auf Pipettenbasis verwendet werden kann.
Es versteht sich, dass das Trennen der Funktionen des Stromleitens und der Spannungsaufzeichnung in den Elektroden auf beiden Seiten des Substrats auch verwendet werden kann, falls Zellen alle Öffnungen verschließen (siehe z. B. 5).
Eine praktische Beschränkung bei der dualen Zweielektrodenkonfiguration besteht darin, dass zwei Elektroden physisch platziert werden müssen, wo zuvor nur eine erforderlich war. Da die Spannungsaufzeichnungselektrode keinerlei Strom leitet, muss sie jedoch nicht mit Rücksicht auf das Niedrighalten der Stromdichte bemessen werden und kann somit so schmal sein, wie es mit strukturellen Gesichtspunkten kompatibel ist. Da die Stromleitungselektrode keine Spannung aufzeichnet, ist es ähnlich gleichgültig, wie hoch die Stromdichte ist (solange sie nicht so hoch ist, dass sie die Bildung von Blasen verursacht), und im Allgemeinen bedeutet dies, dass die Stromleitungselektrode auch schmal sein kann.
Bei bestimmten Ausführungsformen kann die Stromleitungselektrode aus fast jedem beliebigen Metall hergestellt sein, wie etwa, aber ohne Beschränkung darauf, Platin, Gold, Wolfram, Silber und rostfreiem Stahl. Unter der Annahme, dass sich die Elektroden für längere Zeit mit nichtfließenden Lösungen in Kontakt befinden werden, sollte das Metall so gewählt werden, dass es minimale toxische Effekte hat. Es ist möglich, dass Elektrolyse an der Metalloberfläche auftritt. Die Erfahrung mit Oocyten-Spannungsklemmen hat gezeigt, dass bei Platin dieses Problem weniger auftritt als bei Gold.
Verfahren der Benutzung
Zellen werden zum Beispiel aus einem robotisch gesteuerten Ausgabekopf des Fluidsystems 46 in die Wells verteilt und fallen zu dem Substrat 40 und/oder werden unter der Schwerkraft und/oder anderen passiven und/oder ausgeübten Kräften dorthin gelenkt. Vorzugsweise werden Zellen aus einer Lösung von Zellen in Suspension ausgegeben. Vorzugsweise werden etwa 1.000 bis 10.000 Zellen und vorzugsweise mindestens 5000 Zellen und in bestimmten Fällen sogar 200.000 Zellen in jedes Well ausgegeben, wobei jedes Well etwa 1–100 μl Lösung enthält. Vorzugsweise ist das Verhältnis der Zellen zu Öffnungen größer als 1:1 und kann 1:10, 1:100, 1:1000, 1:10.000 oder 1:100.000 betragen. Diese Zellen setzen sich dann unter der Schwerkraft auf das Substrat, obwohl andere Kräfte benutzt werden können. Zellen können auch direkt auf das Substrat aufgewachsen werden. Ein wichtiger Aspekt der PPC-Einrichtung besteht darin, dass keine Notwendigkeit besteht, dass alle Löcher in jedem Well verschlossen sind. Wenn eine Lösung von Zellen in ein Well ausgegeben wird, müssen deshalb nicht alle Löcher durch eine Zelle abgedeckt werden. Wenn Zellen in den Wells wachsen gelassen werden, wie z. B. unter Verwendung herkömmlicher Zellenkulturtechniken, ist es als Alternative keine Notwendigkeit, dass Zellen Konfluenz erreichen und jedes Loch verschließen. Zellen, die sich in Lösung befanden und in jedes Well ausgegeben wurden, werden kurz nach der Ausgabe, typischerweise innerhalb etwa einiger weniger Sekunden bis mehrerer Minuten, aufgezeichnet. Zum Beispiel kann die Aufzeichnung innerhalb von etwa einer, zwei, drei, vier oder fünf Minuten ab dem Ausgeben beginnen und sogar innerhalb von ungefähr 60 Sekunden ab dem Ausgeben.
Zusätzlich zur Schwerkraft, durch die sich Zellen passiv auf dem Substrat absetzen können, können die Zellen durch alternative Anziehungsmittel zu den Löchern geleitet werden. Solche Anziehungsmittel wären, aber ohne Beschränkung darauf, elektrische Felder, chemische Anziehungsmittel und Saugen oder positiver Druck. Vorzugsweise wird Schwerkraft verwendet, um es Zellen zu erlauben, auf oder in der Nähe der Oberfläche des Substrats zu migrieren. Eine geringe Stärke der Saugkraft wird verwendet, um die Zellen zu den Löchern anzuziehen. Beispielhafte Mechanismen zum Anwenden von Saugkraft und elektrischen Feldern werden im US-Patent Nr. 6,776,896 und in der oben erwähnten Anmeldung '815 offenbart, wobei der gesamte Inhalt dieses Patents und dieser Anmeldung hiermit durch Bezugnahme aufgenommen werden.
Ein wichtiger Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass der vorliegende PPC-Ansatz mit oder ohne Notwendigkeit von Abdichtungen mit hohem Widerstand funktioniert. Zum Beispiel erzielt das System PatchXpress^® 7000 typischerweise Abdichtwiderstände von mehr als etwa 1 GOhm. Das System IonWorks^® HT erreicht Abdichtwiderstände im Bereich von etwa mehreren 100 MOhm. Das PPC-Instrument kann sehr niedrige Widerstände tolerieren, in der Größenordnung von einigen 10 MOhm, und kann sogar mehrere offene Löcher im Substrat tolerieren, wobei jedes Loch ein Widerstand von ungefähr mehreren MOhm aufweisen kann. Deshalb besteht keine Notwendigkeit von Abdichtungen mit hohem Widerstand mehr, ein Merkmal, das im Stand der Technik als wesentlich erwähnt wurde (siehe z. B. die oben erwähnte US-Patentanmeldung, Publikation Nr. 2002/0053915 A1).
Die elektrische Stimulation und die Aufzeichnung von Signalen aus jedem Well können unter Softwarekontrolle durch einen Computer 56 angelegt werden. Der allgemeine Ansatz zum Stimulieren und Aufzeichnen von Ionenkanalaktivität beim Einzelöffnungs-Patch-Clamping ist in der Technik bekannt. Bei einer PPC-Einrichtung mit mehreren Wells ist die bevorzugte Ausführungsform ein Verfahren zum Stimulieren und Aufzeichnen aus Wells auf synchrone Weise; genauer gesagt wird jedes Well gleichzeitig derselben elektrischen Stimulation und demselben Aufzeichnungsprotokoll ausgesetzt. Dieser Ansatz vereinfacht den Entwurf des Instruments und beseitigt etwaiges kapazitives Übersprechen, das aufgrund der Dichte der Elektroden in der Multiwellplatte auftreten kann. Als Alternative könnte man unabhängig jedes Well stimulieren und daraus aufzeichnen. Falls keine nützlichen Daten aus allen Wells gesammelt werden können (z. B. im Fall eines mechanischen Fehlers oder eines Lösungsausgabefehlers, durch den ein Well nutzlos wird), stellt der asynchrone Ansatz sicher, dass Reagenzien nur auf Wells angewendet werden, die nützliche Daten zurückgeben können. Der asynchrone Ansatz ist potentiell ein kosteneffektiveres Verfahren zum Screenen einer Bibliothek von Stoffen, wobei kostspielige Reagenzien nur in Wells benutzt werden, die nützliche Daten zurückgeben. Der asynchrone Ansatz ist jedoch komplizierter und bei ihm kann kapazitives Übersprechen auftreten.
Der PPC-Ansatz kann bei Verfahren zum Screenen von LGICs verwendet werden, bei denen separate Wells verwendet werden können, um Kontrollantworten von Prüfantworten zu messen. Bei einem System des Typs Hinzugeben und Lesen ist typischerweise kein Assay von LGICs möglich, weil es notwendig ist, einen Agonisten hinzuzugeben, um die Kontrollantwort zu bestimmen, und ihn dann herauszuwaschen, bevor der Prüfstoff (typischerweise eine Mischung aus Prüfstoff und Agonist) hinzugegeben wird. Bei einer nichtbevorzugten Ausführungsform wird die Kontrollantwort aus einer einzigen Zelle in einem ersten Well gemessen und wird mit einer Prüfantwort von einer anderen Zelle in einem anderen Well verglichen. Die Variabilität beim Expressionsniveau von Ionenkanälen in einer gegebenen Zelle und die inhärente biologische Variabilität, die mit jeder Zelle verbunden ist (z. B. Zellengesundheit, Zellengröße usw.), schließen typischerweise jedoch aus, diesen Ansatz zu bevorzugen.
Die bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Lehren ist ein Assay von LGICs durch Bestimmung einer Kontrollantwort von einem oder mehreren Kontrollwells, wobei jedes Well mehrere Zellen und mehrere Löcher enthält. Der Agonist wird auf jedes Kontrollwell angewandt und die Kontrollantwort wird gemessen. Zum Beispiel kann es positive und negative Kontrollstoffe geben, die bekannte Antworten hervorrufen sollten. Die Prüfantworten auf Prüflösungen (typischerweise Agonist und Prüfstoff) werden von verschiedenen Prüfwells gemessen, wobei jedes Prüfwell mehrere Zellen und mehrere Löcher enthält. Der Effekt des Prüfstoffs wird durch Vergleichen der von den Prüfwells gemessenen Antwort mit der von den Kontrollwells gemessenen Antwort evaluiert. Wenn die Anzahl der Löcher pro Well in den Kontroll- und Prüfwells, aus denen aufgezeichnet wird, ausreichend hoch ist, wird die Variabilität des Systems auf einen annehmbaren Wert verringert.
Mit Bezug auf den Ausdruck „ausreichend hoch” ist dieser Ausdruck wahrscheinlich assay- oder experimentabhängig. Wenn die inhärente Variabilität der Zellen hoch ist, muss auch die Anzahl der Löcher pro Well hoch sein, um sicherzustellen, dass statistisch signifikante Werte aus den Zellen erhalten werden, aus denen aufgezeichnet wird. Wenn zum Beispiel das Niveau funktionaler Ionenkanalexpression bei einer bestimmten Zellenlinie stark variiert, könnte es notwendig sein, über eine große Anzahl von Löchern pro Well zu verfügen, um sicherzustellen, dass jede gemessene Änderung der Antwort auf eine experimentelle Manipulation zurückzuführen ist und nicht auf inhärente Variabilität der funktionalen Ionenkanalexpression zurückzuführen ist Es folgt, dass für Zellenlinien, die funktionale Ionenkanäle auf einem relativ gleichförmigen Niveau ausdrücken, die Anzahl der Löcher pro Well verringert werden kann. Die funktionale Ionenkanalexpression wird oben lediglich als ein Beispiel verwendet, um zu demonstrieren, dass der Ausdruck „ausreichend hoch” wahrscheinlich assay- oder experimentabhängig sein wird. Es gibt andere Faktoren, die beim Bestimmen von geeigneten oder optimalen Anzahlen von Löchern pro Well berücksichtigt werden müssen.
Der PPC-Ansatz kann auch in Verfahren zur Bewertung der funktionalen Ionenkanalexpression bei einer Population von Zellen verwendet werden. Zum Beispiel ist es unter Verwendung von herkömmlichen Patch-Clamp-Prozeduren kostspielig und zeitaufwändig, die Wirksamkeit von Ionenkanal-Mutationsexperimenten zu bewerten. Im Allgemeinen wird eine genetische Manipulation, wie etwa eine Einfügung, Löschung oder Änderung von Aminosäuren, ausgeführt, die zu einer Modifikation der Ionenkanalfunktion führt. Das Bewerten der Auswirkung auf die Ionenkanalfunktion kann ein mühsames Patch-Clamping von mehreren Zellen erfordern, bis eine statistisch gültige Analyse abgeschlossen werden kann. Wenn genauer gesagt die genetische Manipulation eine Manipulation ist, die die Spannungsempfindlichkeit eines spannungsaktivierten Ionenkanals ändert, erfolgt ein Patch-Clamping einer einzigen Zelle und es werden die geeigneten Spannungsklemm-Aquisitions- und -analyseprotokolle ausgeführt. Dieser Prozess wird an mehreren Zellen bis zur Erreichung einer statistischen Signifikanz durchgeführt. Hierbei handelt es sich um einen kostspieligen und zeitaufwändigen Prozess, bei dem konventionelle Patch-Clamp-Techniken verwendet werden. Unter Verwendung des PPC-Ansatzes kann ein Assay einer großen Anzahl von Zellen aus einer Population von Zellen, die genetisch manipuliert wurden, in einem einzigen Well erfolgen, das einen einzigen Satz von Spannungsprotokollen ausgesetzt wird. Das Ergebnis ist eine statistisch gültige Analyse, die auf der Basis eines einzigen Experiments abgeschlossen werden kann.
Der PPC-Ansatz kann auch mit nur einem einzigen Well anstelle von mehreren Wells verwendet werden. Typischerweise wird der PPC-Ansatz nach Art des hohen Durchsatzes verwendet, um die Geschwindigkeit des Assays der Ionenkanalfunktion zu maximieren. Ein wichtiges Merkmal des PPC-Ansatzes ist die Feststellung, dass sich die „Ausbeute” des PPC-Verfahrens 100% nähern kann. Bei einem typischen Patch-Clamp-Experiment an einer einzigen Zelle kann zum Beispiel die Erfolgsrate etwa 50% betragen. Bei einer PPC-Prozedur kann die Erfolgsrate oder Ausbeute etwa 100% betragen, da es wahrscheinlicher ist, dass mindestens ein Loch bedeckt wird und da Daten auch dann gesammelt werden können, wenn einige Löcher unbedeckt sind. Diese Zunahme der Ausbeute führt zu einer Zunahme der Effizienz. Zusätzlich zu den Zeitersparnissen kann diese Zunahme der Ausbeute die Ausführung von Experimenten erlauben, die bei labilen begrenzt verfügbaren Reagenzien, wie etwa isolierten Proteinen oder Peptiden, nicht möglich waren.
Verwendung des PPC mit offenen oder teilweise verschlossenen Löchern
Bei Verwendung der Schwerkraft und Saugkraft zum Lenken von Zellen zu Löchern kann es einen Prozentsatz von Löchern geben, die nicht dicht mit einer Zelle abgedichtet werden. Ein Aspekt der vorliegenden Lehren ist die Feststellung, dass es zwar wünschenswert ist, jedes Loch zu blockieren, es aber nicht notwendig ist, dass jedes Loch blockiert wird, damit der PPC-Ansatz funktioniert. Falls ein Prozentsatz der Löcher offen bleibt, kann es zu einer Anzahl von Problemen kommen. Die Auswirkung jedes dieser Probleme kann jedoch unter Verwendung des PPC-Ansatzes der vorliegenden Erfindung verringert oder eliminiert werden.
Da eine herkömmliche Spannungsklemmschaltung verwendet wird, um den Ensemblestrom durch alle Löcher im Substrat zu messen, gleichgültig, ob sie offen, auf beliebige Weise verschlossen, durch eine Perle abgedichtet oder durch eine Zelle abgedichtet sind, kann es eine Verfälschung des Ensemble-Gesamtzellenstroms geben. Speziell:

a. Es kann einen großen elektrischen Leckstrom durch nichtblockierte Löcher geben, der größer als der kombinierte Strom durch die abgedichteten und Patch-Clamping unterzogenen Zellen in demselben Well sein könnte. Dieses elektrische Leck kann ein linearer Effekt sein.
b. Es kann ein kleinerer elektrischer Strom durch die besetzten Löcher, die nicht abgedichtet wurden, oder die keine Ganzzellenkonfigurationszellen geben. Dieses elektrische Leck kann auch ein linearer Effekt sein.

Diese beiden elektrischen Lecks können (i) das Signal-/Rausch-Verhältnis verringern und (ii) die Ionenkanalströme wesentlich verdecken. Typischerweise kann das Rauschen nicht verringert werden, aber im Allgemeinen übersteigt das Signal durch die Ionenkanäle der Zellen, die als Ganzzellen geclampt sind, das Rauschen, wodurch eine ausreichend genaue Messung möglich wird.
Im Fall eines elektrischen Lecks kann dies unter anderem durch ein Lecksubtraktions-Datenaquisitionsprotokoll entfernt werden, bei dem das ohmsche Leck zuerst für kleine nichtaktivierende Kontrollspannungsstufen gemessen und dann von den Antworten auf die Prüfbefehle subtrahiert wird, wobei eine als passive Subtraktion bezeichnete Technik verwendet wird. Siehe z. B. das leak current subtraction method for IonWorks^TM HT – IONWORKS HT TECHNICAL NOTE Nr. 1 von der Molecular Devices Corporation.
Bei einer alternativen Ausführungsform könnte eine p/n-Lecksubtraktion verwendet werden. Bei diesem Ansatz werden kleine nichtaktivierende Kontrollspannungsstufen an die Zelle angelegt und dann wird die Signalkurve der Antwort auf diese Kontrollspannungsstufen skaliert und von den Antworten auf die Prüfbefehle subtrahiert. Im Gegensatz zu der obigen passiven Subtraktionstechnik, die nur das ohmsche Leck entfernt, verringert dieses p/n-Subtraktionsprotokoll auch die Kapazitätsbeiträge. Diese Art von p/n-Subtraktion wird in der pCLAMP-Software von der Molecular Devices Corporation, dem Industriestandard-Elektrophysiologie-Datenaquisitions- und Analysesoftwarepaket, implementiert.
Zusätzlich kann der Verstärkerdynamikumfang (d. h. der Bereich annehmbarer Ströme, die durch den Patch-Clamp-Verstärker aufgezeichnet werden können) so eingestellt werden, dass er einen Beitrag des elektrischen Lecks antizipiert. Dies erfolgt typischerweise durch Ändern des Wert des Rückkopplungswiderstands. Wenn zum Beispiel der Kopfstufen-Rückkopplungswiderstand zu groß für den gemessenen Strom ist, wird die Kopfstufe gesättigt. Bei den in der PPC-Einrichtung möglichen großen Leckströmen wird es bevorzugt, den Rückkopplungswiderstand von etwa 500 MOhm auf etwa 50 MOhm zu verringern, oder es ist besonders bevorzugt, den Rückkopplungswiderstand auf etwa 5 MOhm zu verringern. Es wird bevorzugt, den Rückkopplungswiderstand proportional zu der Anzahl der Offnungen, zum Beispiel auf etwa 500/n, zu verringern, wobei n die Anzahl der Öffnungen ist. Ganz besonders bevorzugt wird der Rückkopplungswiderstand auf einen Wert verringert, der Aufzeichnung aus jedem Well ohne Sättigung der Kopfstufe erlaubt, während bei typischen Signalen ein wesentlicher Anteil des Dynamikumfangs des Verstärkers genutzt wird. Es ist in der Technik wohlbekannt, den Rückkopplungswiderstand eines herkömmlichen Patch-Clamp-Verstärkers zu verkleinern beim Umschalten vom Aufzeichnen von kleinen Strömen (Picoampere) aus einzelnen Kanälen im Vergleich zum Aufzeichnen von größeren Ganzzellenströmen (hunderte Picoampere oder Nanoampere). Herkömmliche Patch-Clamp-Verstärker, wie etwa der Verstärker MultiClamp 700B von Axon Instruments/Molecular Devices Corporation, bieten die Möglichkeit, den Rückkopplungswiderstand aus einem von vier Werten auszuwählen: 50 GOhm, 5 GOhm, 500 MOhm oder 50 MOhm.
Züsätzlich zu den oben skizzierten elektrischen Leckproblemen kann ein wesentliches Fluidleck vorliegen, wenn extrazelluläre Lösung durch die Löcher in die intrazelluläre Kammer eingesogen wird.
Im Fall eines solchen Fluidlecks kann das Ausmaß des Lecks zum Beispiel durch Verringern der Saugstärke verringert werden, indem zum Beispiel die kleinste Saugstärke verwendet wird, die notwendig ist. Seine Auswirkung könnte auch verringert oder beseitigt werden, indem ein größerer intrazellulärer Raum verwendet wird, oder indem die intrazelluläre Lösung kontinuierlich oder zu einem kritischen Zeitpunkt nach der Abdichtungsbildung ausgewechselt wird. Falls positiver Druck von der intrazellulären Kammer aus angewendet wird, was dazu führen würde, dass intrazelluläres Fluid das extrazelluläre Fluid verunreinigt, könnte das extrazelluläre Fluid ausgewechselt werden oder das anfängliche Volumen des extrazellulären Fluids könnte vergrößert werden, um einen solchen Verunreinigungseffekt zu minimieren.
Verwendung des PPC mit Zellen unter vielfältigen Bedingungen
Die Zellen, die Löcher in der Ganzzellen-Konfigurations-PPC-Einrichtung einnehmen, können sich in vielfältigen physiologischen Zuständen und/oder unter vielfältigen Bedingungen befinden.

a. Gesunde Zellen mit guten Ionenkanal-Expressionsniveaus und einem guten Zeitverlauf des heterologen Stroms. Diese Zellen würden ein kleines elektrisches Leck aufweisen, das über mittlere Zeitverläufe stabil ist.
b. Gesunde Zellen mit schlechter oder keiner Ionenkanalexpression. Diese Zellen würden ein kleines elektrisches Leck aufweisen, das über mittlere Zeitverläufe stabil ist.
c. Zellen, die elektrisch lecken und vielfältige Expressionsniveaus aufweisen. Diese Zellen würden ein größeres elektrisches Leck aufweisen, das über mittlere Zeitverläufe nicht stabil sein könnte.

Das stabile elektrische Leck kann durch passive Lecksubtraktion behandelt werden, wie zum Beispiel hierin skizziert. Bei einer bevorzugten Ausführungsform kann der instabile Leckstrom durch passive Lecksubtraktion behandelt werden, insbesondere wenn (i) der Korrekturfaktor unmittelbar vor jedem Mess-Sweep berechnet wird und (ii) die Mess-Sweeps im Vergleich zu dem Zeitverlauf der Instabilität kurz sind.
Verwendung des PPC mit Ansätzen zur Verringerung der Anzahl offener Löcher
Bei einer Ausführungsform der vorliegenden Lehren wird eine Menge kleiner Perlen 58 in jedes Well eingeführt, kurz nachdem die Zellen eingeführt werden (siehe z. B. 3). Der Durchmesser dieser Perlen ist etwas größer als der Durchmesser der Löcher, und sie sind dichter als die wässrige Lösung. Die Perlen könnten aus Glas, Polydimethylsiloxan (PDMS), Kunststoff, Polystyrol, Teflon^® und/oder einem beliebigen anderen nichtleitfähigen Material bestehen, das Medikamente nicht (wesentlich) maskiert. Die Perlen könnten aus Metall bestehen und mit einem der vorherigen Materialien beschichtet sein. Die Perlen könnten aus einem Material bestehen, das eine nichtleitfähige Oberfläche aufweist, aber permanent elektrisch polarisiert ist.
Die Perlen driften zum Boden und/oder finden ihren Weg anderweitig dorthin oder werden dorthin gelenkt und können durch dieselbe Saugkraft an die unbelegten Löcher angezogen werden, die die Zellen angezogen hat. Die Perlen dienen zum Blockieren offener Löcher. (3).
Gewöhnlich beträgt der Durchmesser der beim automatisierten Patch-Clampen verwendeten Poren zwischen etwa 0,2 μm bis 20 μm. Bei einer weiteren alternativen Ausführungsform werden Standard-Nanopormembranen mit einer großen Anzahl von Submikrometer-Löchern benutzt (siehe z. B. 6). Diese Löcher könnten zu klein sein, um einen Ganzzellenzugang unter Verwendung von Saugkraft zu ermöglichen, könnten aber funktionieren, wenn Ganzzellenzugang erzielt wird, indem die Membran einem Antibiotikum wie etwa Amphotericin ausgesetzt wird. Bei diesem Ansatz kann es mehr als ein Loch pro Zelle geben. Antibiotikum-Ansätze zur Ermöglichung eines Ganzzellenzugangs sind im herkömmlichen Patch-Pipettenstand der Technik wohlbekannt. Zusätzlich wird im System IonWorks^® HT ein auf Antibiotika basierender Ganzzellenzugang benutzt. Ein Unterscheidungsmerkmal des PPC-Ansatzes besteht jedoch darin, dass es mehrere Orte für einen Antibiotikumzugang zu einer Zelle geben kann, da eine einzige Zelle mehrere Löcher abdecken würde. Amphotericinansätze für herkömmlich bemessene Löcher in einer PPC-Einrichtung würden auch funktionieren.
Bei bestimmten Ausführungsformen könnte das Verringern der Anzahl offener Löcher erreicht werden, indem man die Dichte der in jedes Well eingebrachten Zellen vergrößert. Typischerweise beträgt die Anzahl der Zellen in jedem Well etwa 1.000 bis 200.000 Zellen pro Well. Das Vergrößern der Dichte der Zellen kann sekundäre Probleme einführen, wie etwa, dass die Zellen auf das Well angewandte Prüfstoffe maskieren oder Zellen über einen Teil der Löcher verklumpen und Brücken bilden, wodurch Zugang von Zellen oder Perlen zu einem Loch verhindert wird.
Bei bestimmten Ausführungsformen wird die räumliche Anordnung der Löcher in jedem Well optimiert, um die Wahrscheinlichkeit zu vergrößern, dass eine Zelle ein Loch erreicht. Zum Beispiel kann die räumliche Anordnung der Löcher für das Zellenzufuhrsystem optimiert werden, z. B. kann eine kreisförmige oder radiale Lochanordnung für Zellen, die von einer vertikalen Ausgabespitze eingefüllt werden, besser geeignet sein, im Gegensatz zu einer quadratischen oder rechteckigen Anordnung, die für ein Laminatfluss-Zellenzufuhrsystem besser geeignet sein könnte.
Bei bestimmten Ausführungsformen kann das Substrat dafür entworfen sein, die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, dass maximal ein Loch pro Zelle vorliegen würde. Dies könnte zum Beispiel erreicht werden, indem man die Löcher ungefähr 20 μm oder mehr voneinander beabstandet. Bei einer Beabstandung von 20 μm gäbe es 2500 Löcher pro Quadratmillimeter. Bei einer Beabstandung von 50 μm gäbe es 400 Löcher pro Quadratmillimeter. Die Optimierung der Dichte von Löchern würde die Wahrscheinlichkeit verringern, dass ein Loch nur teilweise nur durch einen Teil einer Zelle blockiert wird.
Bei bestimmten Ausführungsformen könnte ein elektrisches Feld (Wechselstrom und/oder Gleichstrom) verwendet werden, um die blockierenden Partikel anzuziehen. Die Partikel könnten mit größerer Kraft in einem Winkel zur Vertikalen zu Löchern gezogen werden, die sich in der Nähe der Peripherie einer Zelle befinden, aber durch die Zelle teilweise verschlossen werden. Damit dies funktioniert, müssen die Partikel möglicherweise eine mobile Ladung auf der Oberfläche oder im Partikel führen. Wenn elektrische Anziehung verwendet wird, um Perlen in die nichtbelegten Löcher zu bringen, wäre eine geeignete Ansteuerspannung eine intrazellulär-negative (hyperpolarisierende) Spannung von etwa 100 mV. Die Zellen auf den belegten Löchern sollten dies ohne Verschlechterung tolerieren, gleichgültig, ob sie intakte oder gerissene Patches aufweisen. Beispielhafte Ansätze werden in der oben erwähnten '815 beschrieben, deren gesamter Inhalt hiermit durch Bezugnahme aufgenommen wird.
Potentielle Vorteile der vorliegenden Erfindung
1. Keine Redundanz, höherer Durchsatz
Das PPC-System kann einen besseren, potentiell vier (oder mehr) Fach höheren Durchsatz als ein existierendes System IonWorks^® HT aufweisen, weil die derzeitige Notwendigkeit vierfacher (oder höherer) Redundanz beseitigt wird. Da es in jedem Well mehrere zehn, hunderte oder tausende Löcher geben kann, ist es wahrscheinlich, dass eine wesentliche Anzahl von Zellen erfolgreich als Ganzzellen geclampt wird, die eine Antwort ausdrücken werden, um dadurch zum gesamten Strom beizutragen. Die Rate des erfolgreichen Erhaltens eines Datenpunkts aus dem Well ist sehr hoch, 95%, 99% oder mehr. Deshalb besteht wenig Notwendigkeit, den Prüfstoff redundant zu zwei oder mehr Wells zu verteilen, um sicher zu sein, dass eine Antwort gemessen wird. Folglich kann nahezu dieselbe Anzahl von Stoffen geprüft werden, wie es Wells gibt. Zum Beispiel kann in einem System des Typs Hinzugeben und Lesen mit einer einzigen Zelle pro Well mit vierfacher Redundanz und 3.84 Wells in jeder Messplatte maximal 96 Stoffe pro Platte geprüft werden. Im Gegensatz dazu kann in einem PPC-System des Typs Hinzugeben und Lesen mit vielen Zellen pro Well ohne Redundanz und mit 384 Wells pro Messplatte maximal 384 Stoffe pro Platte geprüft werden. Wenn alles andere gleich ist, wird das letztere System, gemessen in Datenpunkten pro 8-stündigem Tag, somit nahezu den vierfachen Durchsatz aufweisen.
2. Verringerte Kosten
Die Verringerung oder Beseitigung von Redundanz kann die Kosten drastisch verringern, insbesondere wenn die Kosten der Messplatte die dominanten Ausgaben sind. Beim obigen Beispiel werden, wenn man andere kleine Beiträge zu den Kosten des Durchführens des Assay ignoriert und annimmt, dass die Kosten der PPC-Messplatte dieselben wie die Kosten der Einzelöffnungs-Messplatte sind, die Kosten pro Stoff auf ein viertel verringert. Wenn die Kosten der PPC-Messplatte zweimal die Kosten der Einzelöffnungs-Messplatte sind, werden die Kosten pro Stoff um die Hälfte verringert.
3. Verbesserte Konsistenz
Die Schwankungskoeffizienten im PPC-System sind wesentlich kleiner als im Einzelöffnungssystem, gleichgültig, ob es sich um ein IonWorks HT oder ein anderes Einzelöffnungssystem handelt. Dadurch wird man manchmal in die Lage versetzt, eine Konzentrationsantwortkurve aus einen einzigen Satz von Messungen zu erhalten, während es bei anderen Systemen notwendig sein könnte, die Konzentrationsantwortkurve mehrmals zu wiederholen, um eine statistische Robustheit zu erzielen.
4. Möglichkeit eines Assay von Liganden-geschalteten Ionenströmen
Der PPC-Ansatz der Verwendung mehrerer Zellen pro Well kann ermöglichen, dass ein einfaches System des Typs Hinzugeben und Lesen aus demselben Grund mit LGICs funktioniert, aus dem Fluoreszenzplattenleser (wie etwa der Plattenleser FLIPR^® von der Molecular Devices Corporation) dazu in der Lage sind. Wenn es eine große Anzahl von Zellen gibt, aus denen Messungen in jedem Well durchgeführt werden, ist der Ensemble-Mittelwert aller Messungen viel weniger variabel als die einzelnen Expressionsniveaus. Somit ist es möglich, die Kontrollantwort bei einem oder einer kleinen Anzahl von Wells zu messen und dies als Referenzpegel (d. h. 100%) für die in jedem der übrigen Wells gemessenen Prüfstoffantworten zu verwenden. Die Fehler bei diesem Ansatz verringern sich mit zunehmender Anzahl von Zellen pro Well.
5. Höhere Leistungsfähigkeit als auf Fluoreszenz basierende Ansätze
Dieses PPC kann besser als existierende auf Fluoreszenzmikroskopie basierende Ansätze sein, die zum Assay von Ionenkanalfunktionen verwendet werden, wie etwa der Plattenleser FLIPR^®, weil direkte Aufzeichnung des Ionenkanalstroms eine wesentlich höhere zeitliche Auflösung aufweist und direkte Spannungssteuerung der geprüften Zelle oder Membran erlaubt.
Die nachfolgend beschriebenen PPC-Systeme, die Vorrichtungen und Verfahren und Komponenten und/oder Schritte davon umfassen, können alleine und/oder in Verbindung mit den Systemen (die Vorrichtungen und Verfahren und Komponenten und/oder Schritte davon umfassend) verwendet werden, die oben und in den oben erwähnten Anmeldungen '684 und '815 beschrieben werden, deren gesamter Inhalt hiermit durch diese Bezugnahme aufgenommen wird.
Schätzung elektrophysiologischer Parameter
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem Systeme, die Vorrichtungen und Verfahren umfassen, zum Schätzen elektrophysiologischer Parameter bereit, insbesondere wenn eine Kompensation eines oder mehrerer dieser Parameter aktiviert wurde. Bei diesen Systemen können Werte eines interessierenden Parameters verwendet werden, die mit einer verringerten oder beseitigten Kompensation bestimmt werden, um Werte des mit der aktivierten Kompensation bestimmten Parameters zu justieren und korrigieren. Zum Beispiel lässt sich dies bei bestimmten Ausführungsformen erreichen, indem man eine Stromantwort auf einen Rechtecksspannungsimpuls mit im Verstärker abgeschalteter Ganzzellenkompensation aufzeichnet und dann diese gespeicherte Stromantwort zu jeder nachfolgenden Stromantwort addiert, die bei aktivierter Ganzzellenkompensation aufgezeichnet wurde. Die summierte Stromantwort kann dann analysiert werden, um verschiedene elektrophysiologische Parameter zu schätzen.
Allgemeiner kann der Ansatz unter Verwendung eines beliebigen geeigneten Impulsprofils (z. B. Rechteck, Dreieck, sinusförmig usw.) und eines beliebigen geeigneten Impulsparameters (z. B. Spannung, Strom, usw.) abhängig von der Beschaffenheit des experimentellen Systems, der gewünschten Daten und so weiter verwendet werden.
Zum Beispiel zeigt 10 eine beispielhafte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung. Als Erstes wird eine Patch-Clamp-Ganzzellen-Aufzeichnungskonfiguration erzielt (Schritt 60). Dann wird eine Pipettenkapazitätskompensation beim Verstärker aktiviert und die Ganzzellenkompensation wird deaktiviert (Schritt 61). Bei dieser Ausführungsform wird am Anfang eines Experiments vor dem Aktivieren der Verstärkerkompensation für die Ganzzellenkapazität, für den Zugangswiderstand oder für den Leckwiderstand die Stromantwort auf einen Rechtecksspannungsimpuls, den „Membranprüfimpuls”, einer Zelle, die unter Spannungsklemmungssteuerung steht, aufgezeichnet und gespeichert (Schritt 63). In bestimmten Fällen kann es vorzuziehen sein, eine Reihe von Antworten auf die Membranprüfimpulse aufzuzeichnen und zu speichern (Schritt 65). Diese sind die unkompensierten Membranprüfstromantworten. Die Ganzzellenkompensation des Verstärkers wird dann aktiviert (Schritt 67). Als Nächstes werden weitere Stromantworten der Zelle auf Membranprüfimpulse aufgezeichnet. Diese sind die kompensierten Membranprüfstromantworten. Unmittelbar nachdem die Kompensation im Verstärker aktiviert ist, sind die kompensierten Membranprüfstromantworten vernachlässigbar, während das Experiment voranschreitet, können sich aber die Membrankapazität, der Zugangswiderstand und/oder der Leckwiderstand ändern, was zu einem kleinen, aber schwierig zu messenden Signal führt. Um die Messung zu aktivieren, werden vor der Analyse der kompensierten Membranprüfströme die unkompensierten Membranprüfimpulsströme zu den kompensierten Membranprüfströmen addiert, um die summierten Membranprüfströme zu erzeugen. Die Signale in den summierten Membranprüfströmen liegen typischerweise deutlich über dem Rauschen des Systems. Die summierten Membranprüfströme werden dann zum Beispiel unter Verwendung herkömmlicher Kurvenanpassungsroutinen analysiert, um verschiedene elektrophysiologische Parameter, zum Beispiel den Reihenwiderstand (Schritt 68), zu schätzen. Diese Summierung der Stromantworten vor einer nachfolgenden Analyse wird als eine modifizierte Membranprüfung bezeichnet (Schritt 70). Bei bestimmten Ausführungsformen werden zur Verringerung des Rauschens mehrere unkompensierte Membranprüfströme vor der Summierung mit den kompensierten Membranprüfströmen gemittelt. Für schnellere Messungen können weniger unkompensierte Membranprüfströme verwendet werden, weil die Akquisition weniger Impulse inhärent weniger lang dauert.
Die vorliegende Erfindung kann gegenüber vorbekannten Systemen einen oder mehrere Vorteile bereitstellen. Als erstes erlauben die vorliegenden Lehren die Verwendung von unabhängigen Verstärker und Digitalisierern und erfordern möglicherweise keine Steuerung des Verstärkers, um die Ganzzellenmessung durchzuführen. Die existierende Technologie erfordert (i) eine enge Kopplung zwischen dem Verstärker und dem Digitalisierer, um eine Deaktivierung von Kompensation im Verstärker zu präzisen Zeitpunkten für eine präzise Dauer während der Akquisition zu erlauben, so dass die Membranparameter gemessen werden können, oder (ii) eine lange Zeit zwischen Stimulations-Sweeps während einer experimentellen Manipulation, um ausreichend Zeit dafür bereitzustellen, dass ein lose gekoppelter Verstärker auf die Befehle zum Deaktivieren und Aktivieren einer Kompensation anspricht (Zeit müsste zweimal zwischen jedem Sweep zugeteilt werden; einmal zum Deaktivieren der Kompensation und dann zum Messen der Ganzzellenparameter und ein zweites Mal zum Aktivieren der Kompensation vor dem nächsten Sweep) oder (iii) einen auf Software basierenden Lock-In-Verstärker, der einen sinusformigen Stimulus anlegt und die Phase und Amplitude der Antwort misst. Zweitens können die vorliegenden Lehren auch eine Justierung in Bezug auf den tatsächlichen Effekt des kombinierten Digitalisierers und Verstärkers, nicht nur den theoretischen Effekt des Verstärkers, vornehmen. Drittens können die vorliegenden Lehren kosteneffektiv und auf der existierenden Hardware in diesem Gebiet ohne kostspielige Aufrüstungen zusätzlicher Hardware benutzbar sein.
Die genaue Bestimmung von Membranparametern in Software kann eine große Aufzeichnungsbandbreite erfordern, zum Beispiel 5 kHz oder mehr für Säugetierzellen in einer Patch-Clamp-Konfiguration. Sobald ein Experiment beginnt, wird die Bandbreite des Membranstroms oft vor der Digitalisierung mittels eines Tiefpasses auf Bandbreiten gefiltert, die für eine genaue Softwarebestimmung der Membranparameter zu niedrig sind. Wenn der Verstärker und der Digitalisierer nicht eng gekoppelt wären, würde das System ineffizient werden durch die Zeit, die es dauert, um die Bandbreite zu erhöhen, bevor die Membranparameter bestimmt werden, und sie dann nochmals zu erhöhen, um die Akquisition der experimentellen Daten fortzusetzen. Bei bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Lehren kann deshalb nach dem Digitalisierer ein Softwarefilter verwendet werden, um die Bandbreite zu steuern, um dadurch die notwendige genaue und schnelle Manipulation der Bandbreite zur Akquisition genauer Membranprüfstromantworten zu erlauben.
Verbesserte Datenkonsistenz und Erfolgsraten bei der Messung von ionischen Strömen
Bei dem parallelen Patch-Clamp der vorliegenden Erfindung summiert ein einziger Spannungsklemmverstärker die Ganzzellenströme von mehreren Zellen auf einmal, die jeweils mit einem separaten Loch in einem Planarsubstratwell abgedichtet sind (siehe z. B. 11). Die Ströme von allen Zellen werden im selben Verstärker gesammelt. Ein Mittelwert auf Pro-Zellen-Basis wird entweder durch Verringern des Verstärkungsfaktors des Spannungsklemmverstärkers im Vergleich zu dem Verstärkungsfaktor, der zum Aufzeichnen aus einer einzigen Zelle verwendet würde, oder durch nachfolgendes Teilen des gemessenen Signals mittels Elektronik oder Software gebildet. Der mittlerer Strom weist im Vergleich mit aus Einzelöffnungssystemen gemessenen Strömen ein verringertes Rauschen und eine verbesserte Konsistenz auf.
Bei dieser Ausführungsform ist die PPC-Technik mit den oben besprochenen identisch, bei denen mehrere Zellen 44 in einem einzelnen Well spannungsgeklemmt und all ihre Ströme gleichzeitig (d. h. ihr Gesamtstrom) durch einen einzigen Spannungsklemmverstärker 72 gemessen werden. Es ist ein einzelnes Well 32 in einem Mehröffnungssubstrat gezeigt, wobei das Well eine Anzahl „n” von Öffnungen aufweist. Die gemeinsame intrazelluläre Kammer 37 ist mit der Masseelektrode 51'' sowie dem mit der Elektrode für das obere Well der Mikroplatte verbundenen Spannungsklemmverstärker gezeigt.
Die resultierenden Ensembleströme sind von Well zu Well einheitlicher, und die Erfolgsrate für jeden Aufzeichnungsversuch kann größer als 95%, 99% oder mehr sein. Diese erhöhte Datenkonsistenz und Wahrscheinlichkeit eines erfolgreichen Aufzeichnens erlaubt in Kombination mit parallelen Messungen die direkte elektrophysiologische Aufzeichnung von tausenden ionischen Ensembleströmen pro Tag. Therapeutische Gruppen bei Medikamentenermittlungsprogrammen erfordern diese Größenordnung des Durchsatzes, um gerichtete Stoffbibliotheken gegenüber Ionenkanalzielen in Bezug auf Krankheiten erregbarer Zellen, wie etwa neurologische und Herzerkrankungen oder Nervensystembeschwerden wie Schmerzen, zu screenen. Das Potential zum Untersuchen der Funktion großer Zahlen von Ionenkanalmutanten kann mit der Technik realisiert werden. Die Prozedur umfasst Subtraktionsverfahren, die bei erwarteten Störungen Korrekturen ausführen, und produziert zuverlässig Daten, die mit vorherigen Patch-Clamp-Studien übereinstimmen.
Die derzeitige Ganzzellen-Patch-Clamp-Methodologie weist nur mäßige Konsistenz und mäßigen Durchsatz auf, wodurch funktionale Messungen an großen Zahlen von Ionenkanalliganden oder an großen Zahlen unbekannter oder mutanter Kanalgene impraktikabel werden. Die vor mehr als 50 Jahren entwickelten Spannungsklemmtechniken haben die Kontrolle der Membranspannung und die Messung von spannungsabhängigen ionischen Strömen in großen Weichtier- und amphibischen Neuronen zum ersten Mal ermöglicht. Die ausführlich 1981 beschriebene Patch-Clamp-Technik ist eine Verfeinerung von Spannungsklemmtechniken, die die Messung von Strömen in viel kleineren Zellen erlauben, darunter Säugetierzellen (siehe z. B. Hamill et al., Improved patch clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches, Pflugers Arch, 391, 85–100, 1981). Patch-Clamp-Assays sehen sich einer Anzahl von Problemen gegenüber, darunter mäßige Erfolgsraten für jede Zelle, die dem Patch-Clamping unterzogen ist, und die Variabilität der Expressionsniveaus von Zelle zu Zelle. Selbst bei stabil transfizierten Zellenlinien können die messbaren Expressionsniveaus zehnfach variieren (siehe, z. B. Trapani et al., Control of ion channel expression for patch clamp recordings using an inducible expression system in mammalian cell lines, BMC Neurosci 4, 15, 2003). Diese Faktoren kombinieren sich, um bei herkömmlichem Patch-Clamping einer einzelnen Zelle einen geringen Durchsatz zu erzwingen, wodurch Folgendes beeinträchtigt wird: a) funktionale Messungen an großen Zahlen von Stoffen zum Untersuchen des Modus der Medikamentenbindung oder zur Medikamentenermittlung und (b) Experimente an großen Zahlen von unbekannten oder mutanten Kanalgenen. Aus diesem Grund sind Ionenkanäle eine brauchbare aber unterrepräsentierte Zielklasse für die Medikamentenermittlung, ob es sich um den akademischen oder den pharmazeutischen Firmenkontext handelt. Bei Versuchen, den Durchsatz des Patch-Clamping zu vergrößern, wurde anfänglich die Automatisierung eingeführt, indem Roboter benutzt wurden, die dafür ausgelegt sind, den menschlichen Forscher zu imitieren, oder indem suspendierte Zellen an der Oberfläche eines Lösungstropfens positioniert werden und man sich den Zellen mit der Aufzeichnungselektrode nähert, aber keines dieser Systeme ergab eine wesentliche Zunahme des Durchsatzes oder der Datenqualität (siehe, z. B. Xu et al., Ion-channel assay technologies: quo vadis?, Drug Discov Today 6, 1278–1287, 2001). Ein signifikanter Fortschritt in Richtung erhöhten Durchsatzes wurde erreicht, als die Pipette durch ein Substrat ersetzt wurde, das ein Array von Öffnungen jeweils mit einem Durchmesser von 1–2 μm enthält (siehe, z. B. Fertig et al., Microstructured glass chip for ion-channel electrophysiology, Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys 64, 040901, 2001; Klemic et al., Micromolded PDMS planar electrode allows patch clamp electrical recordings from cells, Biosens Bioelectron 17, 597–604, 2002; Pantoja et al., Bilayer reconstitution of voltagedependent ion channels using a microfabricated silicon chip, Biophys J 81, 2389–2394, 2001; Schmidt et al., A chip-based biosensor for the functional analysis of single ion channels, Agnew Chem Int Ed 39, 3137–3140, 2000; und Schroeder et al., IonWorksTMHT: A New High-Throughput Electrophysiology Measurement Platform, J Biomol Screen 8, 50–64, 2003). Solche automatisierten Systeme ermöglichten eine wesentliche Zunahme des Durchsatzes und direktes elektrophysiologisches Screening (siehe z. B. Kiss et al., High throughput ion-channel pharmacology: planar-array-based voltage clamp, Assay and Drug Development Technologies 1, 127–135, 2003), sie haben aber das Standardparadigma von einer Zelle pro Messung nicht geändert und auch nicht zu einer Verbesserung bei der Datenkonsistenz geführt. Es wurden Erfolgsraten unter Verwendung von Planar-Patch-Techniken im Bereich zwischen 30-80% zum Erhalten eines Datenpunkts von einer einzelnen Zelle berichtet (siehe z. B. Fertig et al., Whole cell patch clamp recording perfömed on a planar glass chip, Biophys J 82, 3056–3062, 2002; Kiss et al., 2003; Schroeder et al., 2003).
sGemäß der vorliegenden Erfindung werden die Datenkonsistenz und die Erfolgsraten verbessert, indem die mittlere Antwort vieler Zellen parallel unter Verwendung der Parallel-Patch-Clamp-(PPC-)Technik gemessen wird. Ein solcher Wechsel des Messparadigmas ist eine Erweiterung des Ganzzellen-Patch-Clamp selbst. Beim Ganzzellen-Patch-Clamp ist der gemessene Strom der Ensemble-Mittelwert tausender Einkanalströme, die von den einzelnen in der Membran verteilten Ionenkanälen beigetragen werden (siehe z. B. Anderson und Stevens, Voltage clamp analysis of acetylcholine produced end-plate current fluctuations at frog neuromuscular junction, J Physiol 235, 655–691, 1973). Die PPC-Technik erstellt eine Gesamtmessung der Ensembleströme in Zellen, die in einem Array von Messöffnungen (bis zu einer Zelle pro Öffnung) in jedem Well einer Mikroplatte abgedichtet sind, unter Verwendung eines einzelnen Spannungsklemmverstärkers pro Well. Im Idealfall ist der gemessene Strom der Mittelwert aller Ensembleströme von jeder der spannungsgeklemmten Zellen in einem Well, in der Praxis enthält er jedoch auch problematische Ströme von Öffnungen, die nicht erfolgreich eine Abdichtung mit einer Zelle gebildet haben, oder aus Zellen, die keine Expression aufweisen. Es werden Lecksubtraktionstechniken verwendet, um die problematischen Ströme zu identifizieren und zu entfernen, und kleine Resteffekte dieser Ströme werden durch die Verbesserungen übertroffen, die bei der Datenkonsistenz und den Erfolgsraten unter Verwendung der PPC-Technik erzielt werden. Die Zunahme der Datenkonsistenz, die die PPC-Technik gewährleistet, ermögliche Erfolgsraten für experimentelle Durchgänge bei Verwendung von 384-Well-Mikroplatten, die 95% oder 99% übertreffen, und häufig sind Läufe zu 100% erfolgreich.
Es wird die Verwendung der PPC-Technik an drei Arten von eine exogene Expression zeigenden Ionenkanälen in stabilen Zellenlinien diskutiert: K_v1.3 und hERG-Kanäle (human ether-a-go-go-related gene) in CHO-Zellen (Chinese Hamster Ovary) und Na_v1.5-Kanäle in CHL-Zellen (Chinese Hamster Lung). In 11 ist ein Schema eines einzelnen Wells zweier angrenzender Wells in der Mikroplatte gezeigt. Zellen werden zu dem Well hinzugegeben und es wird Unterdruck an der unteren gemeinsamen Kammer angelegt. Man beachte, dass im Gegensatz zum Einzelöffnungs-Patch-Clamp der PPC-Ansatz Wells benutzt, die mehrere Öffnungen pro Well aufweisen.
12A und 12B zeigen eine typische Aufzeichnung von K_v1.3-Strömen vor und nach passiver Lecksubtraktion. Der PPC-Ansatz normiert das Gesamt der Ensembleströme jedes Wells in allen Figuren auf einen Einzelöffnungs-Ersatzstrom durch Dividieren des Populations-Gesamtstroms durch 64 (die Anzahl der Öffnungen im Well).
12A zeigt nicht subtrahierte ionische und Leckströme von Kv1.3 gemessen mit einem einzigen Verstärker pro Well. Die Aktivierung des spannungsabhängigen Stroms ist nach dem Abklingen der kapazitiven Transiente zu sehen, wobei der ionische Strom durch die gestrichelte Linie von dem Leckstrom getrennt ist. Die gestrichelte Linie ist der Grundstrom am Haltepotential. Zum Zeitpunkt der Spannungsstufe ist der membrankapazitive Transientenstrom gefolgt von der charakteristischen, sich langsamer aktivierenden Antwort des ionischen Stroms des K_v1.3-Kanals zu sehen. Der Leckstrom durch die Abdichtung ist der zeitunabhängige Strom, der im nicht subtrahierten Sweep von 12A zu sehen ist. Die gestrichelte Linie trennt die zeitabhängigen K_v1.3-Ströme (über der gestrichelten Linie) von dem Sockel-Leckstrom. Ein Schlüssel für den Erfolg der PPC-Technik ist der Umstand, dass der Leckstrom linear (ohmsch) ist, während der spannungsabhängige ionische Strom mit Bezug auf die Spannung nichtlinear ist. Der Leckstrom besteht aus zwei Hauptkomponenten: dem Strom um erfolgreich gepatchte Zellen herum und dem Strom durch Öffnungen, die entweder offen oder teilweise durch Verunreinigungen verschlossen sind.
Es werden Widerstands-Lecksubtraktionstechniken angewandt, um den berechneten Leckstrom bei jeder Spannung digital zu subtrahieren, der aus der Antwort auf einen vor den Prüfspannungsstufen angelegten kleine hyperpolarisierende Prüfspannungsstufe geschätzt wird. Falls sich der Leckstrom aufgrund von Änderungen der elektrischen Abdichtung mit der Zeit langsam ändert, werden Fehler durch Implementieren des Lecksubtraktionsprozesses am Anfang jedes Sweep minimiert. Nach Subtraktion des Leckstroms weist der verbleibende Strom den charakteristischen Aktivierungszeitverlauf des K_v1.3-Stroms auf, der durch herkömmliches Patch-Clamp aufgezeichnet wird (siehe z. B. Chandy et al., A family of three mouse potassium channel genes with intronless coding regions, Science 247, 973–975, 1990). Der spannungsabhängige Strom, nach dem abziehen des passiven Leckstroms ist in 12B dargestellt.
Die Ensemble-Mittelung, die bei der PPC-Technik inhärent ist, verbessert das Signal-/Rausch-Verhältnis, wie durch Vergleichen der PPC-Aufzeichnung von 12C mit der Einzelöffnungsaufzeichnung von 12D zu sehen ist. Diese Figuren zeigen den hERG-Kaliumkanalstrom (human ether-a-go-go-related gene) unter Verwendung der PPC- (12C) und der Einzelöffnungstechnik (12D). Man beachte das größere Signal-/Rausch-Verhältnis in der PPC-Kurve (12C). Es sollte beachtet werden, dass in 12A, 12B und 12C der angezeigte Strom der gemessene Strom dividiert durch 64 ist, damit die Ströme als mittlerer Strom pro Öffnung in der Kammer repräsentiert werden können, wobei 12D der gemessene Strom durch eine einzelne Öffnung ist. Das verbesserte Signal-/Rausch-Verhältnis erlaubt die Messung kleiner Ströme, die bei vorbekannten Einzelöffnungsmodi nicht aufgelöst werden können.
13 zeigt die verbesserte Datenkonsistenz der PPC-Technik. Jede 384-Well-Platte wird in acht dieser Gruppen gemessen. Der PPC-Strommaßstab ist der mittlere Strom pro Öffnung (d. h. der gesamte gemessene Strom/64), der Einzelöffnungsstrommaßstab ist wie gemessen.
Es sind typische Stromaufzeichnungen aus acht angrenzenden Wells dargestellt, gemessen unter Verwendung eines Einzelöffnungs-Modus (13A) und des PPC-Modus (13B) der Aufzeichnung, nämlich Na_v1.5-Ströme, gemessen mit der Einzelöffnungs- und der PPC-Technik in 384-Well-Mikroplatten. Abtastraten betrugen 10 kHz, bei einer Signalbreite von 3 kHz, und die gestrichelten Linien geben 0,61 ms nach dem Impulsanfang an.
13A zeigt Einzelöffnungsaufzeichnungen aus angrenzenden Wells (A1–A8). Die mittlere Stromstärke für diesen experimentellen Durchlauf betrug 3,6 ± 1,4 nA (Mittelwert ± SD, n = 285) und die Zeit bis zum Spitzenstrom betrug 0,76 ± 0,15 (Mittelwert ± SD, n = 285 Wells, Bereich 0,5–14 ms). 13B zeigt PPC-Aufzeichnungen aus angrenzenden Wells (A1–A8). Die Stärke und die Kinetik der mit PPC gemessenen, nach innen gerichteten Na-Ströme sind über die Platte hinweg einheitlicher. Die mittlere Stromamplitude betrug 1,9 ± 0,3 (Mittelwert ± SD, n = 375 Wells) und die Zeit bis zum Spitzenstrom betrug 0,61 ± 0,06 ms (Mittelwert ± SD, n = 375, Bereich 0,5 bis 0,8 ms). Die Stromamplituden und die Zeit bis zur Spitze für die PPC-Ströme ist viel einheitlicher als bei den Einzelöffnungsaufzeichnungen.
13C zeigt die Strom-Spannungs-(I–V)Kurve aus einem einzelnen PPC-Well, und die Kurve ist derjenigen sehr ähnlich, die unter Verwendung von herkömmlichem Patch-Clamp erhalten wird, mit der Ausnahme, dass die Spannung für den Spitzenstrom um 10–20 mV gegenüber publizierten Werten nach links verschoben ist (siehe z. B. Chahine et al., Electrophysiological characteristics of cloned skeletal and cardiac muscle sodium channels, Am J Physiol 271, H498–506, 1996; Nuss et al., Cardiac sodium channels (hH1) are intrinsically more sensitive to block by lidocaine than are skeletal muscle (mu 1) channels, J Gen Physiol 106, 1193–1209, 1995), aufgrund des Spannungsabfalls von 10–20 mV über den Zellenzugangswiderstand (~10 MOhm) und den Öffnungswiderstand (~3 MOhm). Konduktanz-Spannungs-(G-V-)Kurven (13D), die aus einer einzelnen Gruppe von 48 Wells erhalten werden, zeigen die Datenkonsistenz der Technik. 13D zeigt Boltzmann-Anpassungen an Aktivierungs-(G-V-)Kurven, gemessen aus einer Familie von Lesevorgängen aus einer einzelnen Gruppe von 48 Wells. Das V (0,5) für diese Gruppe von Aufzeichnungen betrug –44 ± 0,6 mV (Mittelwert ± SD, r = 0,996), ähnlich zu Werten, von denen in der Literatur berichtet wird (siehe z. B. Sheets and Hanck, Gating of skeletal and cardiac muscle sodium channels in mammalian cells, J Physiol 514 (Pt 2), 425–436, 1999).
Bei Verwendung eines Einzelöffnungssubstrats wurde gezeigt, dass der annehmbare Abdichtwiderstand im Bereich von 50–300 MOhm liegt, im Mittel 120 MOhm (siehe z. B. Kiss et al., 2003; Schroeder et al., 2003). Für dieselbe Zellenlinie ist bei Verwendung des 64-Öffnungen-Substrats der mittlere Abdichtwiderstand in jeder Kammer, normiert auf einen Wert pro Öffnung, gewöhnlich für einen erfolgreichen experimentellen Durchlauf niedriger, im Mittel 50 bis 110 MOhm. Ionische Ströme und pharmakologische Ergebnisse sind wie erwartet, wenn der normierte Abdichtwiderstand über 50 MOhm liegt (z. B. wenn der Abdichtwiderstand ungefähr 42% des mittleren annehmbaren Abdichtwiderstands beträgt); wenn der mittlere Abdichtwiderstand unter ~30 MOhm liegt, bleibt die Technik im Allgemeinen erfolglos. Es wird vermutet, dass dies auf schlechte Zellenqualität zurückzuführen ist und ein unübliches Ereignis ist (< 2% der Durchläufe). Bei erfolgreichen Durchläufen besteht keine Möglichkeit, direkt den Prozentsatz der Öffnungen zu bestimmen, die offen oder durch Verunreinigungen teilweise verschlossen bleiben, um jedoch den vorliegend beobachteten Bereich von Abdichtwiderständen (50 bis 110 MOhm) zu schätzen, hat die vorliegende Erfindung zwei Modelle (siehe z. B. 17, wobei die Vorhersage des Prozentsatzes offener Öffnungen dargestellt ist unter der Annahme, dass das Leck für eine ordnungsgemäß geklemmte Zelle 120 MOhm ist und alle anderen Öffnungen bei 10 MOhm teilweise verschlossen oder bei 3 MOhm völlig offen sind). Das Erste ist, dass bis zu 12% der Öffnungen (7 von 64) auf dem 10 MOhm-Pegel teilweise verschlossen waren und dass Zweite besteht darin, dass bis zu 3% der Öffnungen (2 von 64) bei 3 MOhm völlig offen waren. Damit ein einzelner Durchlauf erfolgreich ist, muss deshalb ein hoher Prozentsatz von Abdichtungen vorliegen. Nachdem die Zellen optimiert sind und eine ausreichende Dichte von Zellen zu jedem Well hinzugegeben wurde, ist die oben erwähnte Abdichtrate nicht schwer zu erzielen.
Typische Einzel-Wellstrom-Amplitudenhistogramme sind in 14 gezeigt, wobei jede Kurve Stromamplitudenhistogramme für einzelne Wells bei Verwendung eines Einzelöffnungs- im Vergleich zu einem 64-Öffnungs-(PPC-)Substrats (z. B. überlagert) zeigt. Jeder Durchlauf wurde mit Zellen aus derselben Kulturpassage am selben Tag aufgezeichnet, und ein Durchlauf besteht aus der Messung von 384 Wells aus einer einzigen Mikroplatte. Es sind Stromamplitudenhistogramme für Kanäle des Typs K_v1.3 (A), Na_v1.5 (B) und hERG (C) gezeigt.
Die Stromamplitudenverteilung ist bei Einzelöffnungsdurchläufen breit, wodurch die biologische Variabilität von herkömmlichen Planar-Patch-Clamp-Messungen aus einzelnen Zellen veranschaulicht wird. Wie von der Ensemble-Mittelungsprozedur der PPC-Technik erwartet, produziert sie eine engere Verteilung von Stromamplituden. Die PPC-Histogramme weisen im Vergleich zu aus Einzelöffnungs-Einzelzellenaufzeichnungen konstruierten Histogrammen eine engere Verteilung auf. Der Variationskoeffizient (CV) ist auf den PPC-Histogrammen 2–4mal kleiner. Zellen, die keine Expression aufweisen, umfassen die Verteilung von Zellen auf den Einzelöffnungs-Histogrammen in der Nähe einer Stromstärke von null. Die Einzelöffnungs-Gaußkurvenanpassungen schließen die Zellen, die keine Expression aufweisen, aus, während alle Zusammenfassungsstatistiken alle Zellen umfassen, einschließlich der Zellen, die keine Expression aufweisen. Die Zellen, die keine Expression aufweisen, tragen keine separate Spitze in der Nähe des Stroms null bei; stattdessen bilden sie einen Teil der mittleren PPC-Stromamplituden, so dass die Durchschnittsstromamplituden für die PPC-Durchläufe kleiner als die bei erfolgreichen Einzelöffnungs-Messungen sind.
Der Vorteil der PPC-Technik gegenüber herkömmlichem oder Einzelöffnungs-Planar-Patch-Clamp ist die Verringerung der Messvariabilität, die sich aus der Expressionsvariabilität ergibt, und eine wesentliche Erhöhung der Erfolgsrate des Erhaltens eines Datenpunkts aus jeder versuchten Messung. Es ist wichtig, die Erfolgsrate so zu definieren, dass ein Vergleich zwischen PPC- und Einzelöffnungssubstraten erfolgen kann. Die Erfolgsrate ist definiert als der Prozentsatz von Aufzeichnungen ionischer Ströme, die aus einer 384-Well-Platte erhalten werden. Ein Well kann aus beliebigen der folgenden vier Gründe versagen; 1) das Well kann unbenutzbar sein, weil die Öffnungen durch Verunreinigungen oder eine Blase blockiert sind, 2) die Zellen können beim Bilden einer benutzbaren Abdichtung > 50 MOhm versagen, 3) der Gesamtstrom kann aufgrund eines Fehlens von Expression zu klein sein, 4) die Stromamplitude kann über die Zeit instabil sein (± > 20% über fünf Minuten). Der Graph in 15 zeigt die Erfolgsraten von PPC- und Einzelöffnungs-Einzeldurchläufen für K_v1.3, Na_v1.5 und hERG. Die Balkengraphen zeigen eine Rate von 99,3% (n = 3456 Wells) für K_v1.3-Kanäle im PPC-Modus, im Vergleich zu 80,1% (n = 4608 Wells) für den Einzelöffnungsmodus. Die Erfolgsrate für Na_v1.5-Kanäle im PPC-Modus betrug 95,5% (n = 3072 Wells) und 71,3% (n = 3456 Wells) im Einzelöffnungsmodus. hERG-Kanäle hatten Erfolgsraten von 97,3% für den PPC-Modus (n = 1536 Wells) und 61,0% für den Einzelöffnungsmodus (n = 3072 Wells). Es sind experimentelle Durchläufe dargestellt, die dafür ausgelegt waren, die spezifische Stromstabilität zu messen, wobei Salzlösung (Ersatz-Stoff) anstelle einer Stoffenthaltenden Lösung über die gesamte Mikroplatte hinweg hinzugegeben wird.
Wie in 15 gezeigt, ist die PPC-Technik bei optimierten Zellen sehr gut vorhersagbar. Seit dem Optimieren der K_v1.3-, Na_v1.5- und hERG-Zellenlinien wurden mehr als 100 aufeinanderfolgende Durchläufe durchgeführt, wobei die PPC-Erfölgsraten 95–100% betrugen.
Die PPC-Ensemblemittelung verringert die biologische Variabilität, wodurch konsistentere pharmakologische Ergebnisse beim Prüfen von Stoffen auf Ionenkanalziele möglich werden. In 16A sind zweiunddreißig Zehn-Punkt-IC50-Kurven für 4-Aminopyridin aufgetragen, die unter Verwendung der PPC-Technik in einem einzigen Durchlauf (66 Minuten) erhalten wurden. Sechzehn IC50-Kurven jeweils für Tetracain und Lidocain wurden in 70 Minuten erhalten und sind in 16B aufgetragen.
Die direkte Messung von Ionenkanalströmen unter Medikamentenermittlungs-Einstellungen war auf die Messung einzelner Zellen unter Verwendung von herkömmlichem Pipetten- oder Einzelöffnungs-Planar-Patch-Clamp beschränkt. Die mit diesen Techniken verbundenen Probleme bestehen darin, dass viele Datenpunkte aufgrund von Dateninkonsistenzen verloren gehen, die durch die Variabilität von Kanalexpressionsniveaus verursacht werden oder durch fehlgeschlagene Messversuche, die durch technische Probleme verursacht werden, wie etwa geringe Abdichtungswiderstände oder der Fehlschlag, den Ganzzellen-Aufzeichnungsmodus zu erzielen. Medikamentenermittlungsprogramme benötigen die Möglichkeit, zig-tausend Stoffe über einen Zeitraum von einigen wenigen Wochen mit einem geringen Prozentsatz verlorener Stoffe zu screenen, so dass keine Neuprüfung einer großen Zahl von Stoffen erforderlich ist. Die PPC-Technik löst viele dieser Probleme, einschließlich der Dateninkonsistenzen, die durch ein Fehlen von Kanalexpression verursacht werden und durch Datenpunkte, die aufgrund von geringen Abdichtungen verloren gehen. Die Ensemblemittelung der Ströme aus 64 Zellen führt zu Datenpunkten, die nur selten aufgrund von Zellen, die keine Expression aufweisen, verlorengehen. Der Schlüssel für diesen Erfolg besteht darin, dass es gleichgültig ist, dass ein kleiner Prozentsatz der Patch-Clamping unterzogenen Zellen in jedem Well keine exogenen Ströme ausprägen; was zählt ist, dass eine wesentliche Zahl dieser tatsächlich interessierende Ströme ausprägt (exprimiert) und dass diese Ströme zu dem gemessenen Ensemble-Durchschnittsstrom beitragen. Alle bei Zellen, die keine Expression aufweisen, vorliegenden kleinen endogenen Ströme werden durch den gesamten ausprägten Stromüberschritten und im Wesentlichen aus dem letztendlichen Stromsignal herausgemittelt. Schlechte Abdichtungen, die beim Planar-Patch-Einzelöffnungsmodus auftreten, liegen tatsächlich auch im PPC-Modus vor, und diese relativ kleinen linearen Ströme werden im größeren gesamten gemessenen Gesamtstrom gemittelt und dann heraussubtrahiert, so dass sich die großen interessierenden nichtlinearen Ensembleströme ergeben.
Die Konsistenz der PPC-Technik ist ein deutlicher Vorteil beim Stoff-Screening, da es unnötig wird, wiederholte Stoffanwendungen durchzuführen, um sicher zu sein, dass der größte Teil der Stoffe in der Bibliothek gescreent wurde. Die Konsistenz ist auch bei detaillierten Untersuchungen der Pharmakologie einzelner Stoffe ein Vorteil. Aufgrund der inhärenten Konsistenz beim PPC-Verfahren ist es zum Beispiel möglich, Zehn-Punkt-Antwortkurven aus zehn Wells zu erhalten, wodurch es unnötig wird, viele Antworten von vielen Wells bei jeder Konzentration zu mitteln, um die Variabilität bei jeder Konzentration auf ein annehmbares Niveau zu verringern.
Unter Verwendung der PPC-Technik sowohl in akademischen als auch Medikamentenermittlungs-Einstellungen kann auch das Screening großer Zahlen mutanter Kanäle in Betracht gezogen werden. Klonale Selektion wird bereits routinemäßig unter Verwendung des Einzelöffnungs-Planar-Patch-Clamp-Formats durchgeführt, wobei 12 einzelne Klone desselben Kanals mit einem n von 32 für jeden Klon bei einem 384-Well-Durchlauf mit der Dauer von weniger als einer Stunde geprüft werden (Guthrie et al., A Place for High Throughput Electrophysiology in Cardiac Safety: Screening hERG Cell Lines and Novel Compounds with the IonWorks HTTM System, Journal of Biomolecular Screening In Press, 2005). Aufgrund der Konsistenz von PPC-Strömen könnten kinetische Studien an transient transfizierten Ionenkanalmutanten ausgeführt werden, wobei bis zu 48 verschiedene Mutanten in einem einstündigen Durchlauf geprüft werden, mit einem n von 8 PPC-Wells pro Mutant. Es könnte ein n von 8 PPC-Wells ausreichen, um unterschwellige kinetische Änderungen zuverlässig zu detektieren, da der Ensemblestrom in jedem Well bereits inhärent aus bis zu 64 einzelnen Zellen gemittelt wird. Es könnten Ionenkanaluntersuchungen geprüft werden, bei denen potentielle Regelungsorte (z. B. eine Phosphorylierung, Calciumbindung, Spannungserfassungsregionen) durch gerichtete Mutagenese herausgenommen wurden, und der Effekt dieser Mutationen könnte in Bezug auf Stromkinetik, Regelung oder Expression untersucht werden. Es könnten gesamte Regionen der Ionenkanalproteine erkundet werden oder alle Konsens-Sequenzen für ein bestimmtes Regelungsmolekül könnten unter Verwendung von PPC sehr schnell einzeln mutiert und auf Effekte gescannt werden.
Es könnte auch ein genetisches Rettungs-Screening in größerem Maßstab an nichtleitenden Kanälen durchgeführt werden, wenn eine Mutation einen Funktionsverlust verursacht hat. Häufig sind Wechselwirkungspaare zwischen Aminosäureresten oder einer bestimmten Tertiärstruktur in einem Kanalprotein für eine ordnungsgemäße Kanalfunktion erforderlich. Es kann ein Mutations-Scan, bei dem alle Aminosäuren an einem bestimmten Rest substituiert werden, im verdächtigen Bereich der Restwechselwirkung oder Tertiärstrukturspaltung durchgeführt werden. Da die nichtleitenden Mutanten keinen Strom zu dem Ensemblemittelwert beitragen, könnten mehrere Mutationen in einem einzigen PPC-Well gepoolt und geprüft werden. Das Multiplexen des Mutantenscreening auf diese Weise würde die Rate gescreenter Mutanten vergrößern, der Grad des Multiplexens auf dem Einzelwellniveau würde durch den Pegel der gewünschten Empfindlichkeit des Rettungs-Assay bestimmt. Das Vergrößern der Anzahl von in einem einzigen Well gepoolten Mutanten würde inhärent aufgrund der Mittelung von Signalen von den anderen Mutanten das Ausgangssignal von einem beliebigen gegebenen Rettungsmutanten verringern. Somit könnte die Schwelleder Detektion des Assay titriert werden: das Poolen vieler Klone in einem PPC-Well würde die Empfindlichkeit verringern, aber die Rate des Screen vergrößern, während eine Verringerung der Anzahl gepoolter Klone die Empfindlichkeit des Assay vergrößern würde.
Zwei Modelle zur Beschreibung der PPC-Abdichtwiderstände
Da eine einzige parallele Messung in einem PPC-Well von mehreren Aufzeichnungsorten und mehreren Zellen vorgenommen wird, besteht keine Möglichkeit, zu bestimmen, wie groß die Werte der Abdichtungen in den einzelnen Zweigen der Parallelschaltung sind. Aus diesem Grund wurden zwei Modelle gemäß der vorliegenden Erfindung bereitgestellt, um dabei zu helfen, den Anteil „erfolgreicher” Abdichtungen, teilweise verschlossener Löcher und völlig offener Löcher in der Parallelschaltung zu schätzen. Das erste Modell nimmt an, dass es nur zwei Populationen von Abdichtungen an den Aufzeichnungsorten gibt, wobei die eine eine erfolgreiche Abdichtungen (120 MOhm) und die andere völlig offene Löcher (3 MOhm) sind. Da die Abdichtrate von 100% abfällt, fällt der mittlere Abdichtwiderstand für die Parallelschaltung scharf ab. Der gemessene Bereich an Abdichtungen, der typischerweise zu sehen ist (50–120 MOhm), entspricht weniger als 3% der Löcher, die völlig offen sind (oder 2 von 64 Löchern). Das zweite Modell nimmt auch zwei Populationen von Abdichtungen an den Aufzeichnungsorten an, wiederum die erfolgreichen Abdichtungen (120 MOhm), die andere Population sind bei diesem Modell jedoch teilweise verschlossene Löcher (von denen angenommen wird, dass sie 10 MOhm betragen). Bei dem zweiten Modell ist der Bereich beobachteter Abdichtwiderstände nur dann erhaltbar, wenn 88% oder mehr der Löcher Abdichtungen von 120 MOhm aufweisen und 12% oder weniger (7 von 64) teilweise verschlossene Löcher aufweisen. Die tatsächliche Situation ist wahrscheinlich zwischen den zwei Modellen. Anders ausgedrückt, besteht wahrscheinlich eine Mischung von erfolgreichen Abdichtungen, teilweise verschlossenen Löchern und völlig offenen Löchern. In jedem Fall legen beide Modelle nahe, dass die Abdichtraten 88% oder mehr betragen müssen, sobald eine Zellenlinie optimiert ist. Dies ist nicht schwierig routinemäßig zu erzielen.
Das PPC ist eine robuste Technik, die einheitlichere und reproduzierbarere Ergebnisse liefert als herkömmliches Ganzzellen-Patch-Clamp mit Glaspipetten oder Einzelöffnungs-Planar-Patch-Clamp. Die Konsistenz bei jeder Messung wird erreicht durch Verwendung des Ensemblemittelwerts einer großen Population von Ganzzellenströmen. Der Hauptunterschied zwischen der PPC-Technik und dem Aufzeichnen einzelner Ganzzellenströme aus der äquivalenten Anzahl von Wells besteht darin, dass bei der PPC-Technik die Mittelung ein intrinsischer Prozess ist, der im analogen Bereich geschieht. Ganzzellenströme aus einer Population von Zellen laufen im Well in einen einzigen Analogverstärker zusammen, während bei der Alternative die Mittelung ein digitaler Prozess ist, bei dem es erforderlich ist, Ströme von einzelnen Wells separat zu akquirieren und dann zu mitteln. Die Konsistenz der Messungen aus jedem Well gleichzeitig kombiniert mit der Messung vieler Wells erhöht den Durchsatz der PPC-Technik auf einen Wert, der mit herkömmlichem Pipetten- oder Einzelöffnungs-Patch-Clamp niemals erzielt werden könnte.
Experimentelle Prozeduren
Experimentelle Zellen umfassen: CHL-Zellen (Chinese Hamster Lung), die Na_v1.5-Kanäle ausprägen; und CHO-Zellen (Chinese Hamster Ovary), die K_v1.3- oder hERG-Kanäle ausprägen.
Experimentelle Reagenzien und Puffer umfassen: Amphotericin (Sigma Kat.-Nr. A-4888), DMSO (Sigma Kat.-Nr. D-2650); Versene^TM (Gibco Kat.-Nr. 15050); Internal Puffer (in mM): 140 KCl, 2 MgCl2 5 EGTA, 10 Hepes pH bis 7,2 mit KOH (Sigma Kat.-Nr. P-9333, M-1028, E-0396, H-7523, P-5958); Externe Puffer (in mM): 137 NaCl, 4 KCl, 1 MgCl2, 1,8 CaCl2, 10 Hepes, 10 Glucose, pH bis 7,4 mit NaOH (Sigma Kat.-Nr. S-7653, P-9333, M-1028, Fluka Kat.-Nr. 21115, Sigma Kat.-Nr. H-7523, G-7528, Fisher Kat.-Nr. SS266-1).
Experimentelle Gewebekulturbehälter umfassen: in T-75-Behältern (Coming Kat.-Nr. 430641) gewachsene Zellen.
Experimentelle Zellenkulturmedien umfassen:

a. Na_v1.5: Das modifizierte Eagle Medium von Dulbecco, enthaltend L-Glutamin, Glucose, Pyroxidin-HCl ohne Na-Pyruvat (Gibco, Kat-Nr. 11965–092) plus die folgenden Zusatzstoffe: 10% FBS (50 ml/500 ml; Irvine Scientific: Kat.-Nr. 3000), 1% (5 ml) Genetecin (Invitrogen: Kat.-Nr. 10131027), 1% (5 ml), Pen/Strep (Irvine Scientific: Kat.-Nr. 9366);
b. K_v1.3: DMEM/Ham's F-12 (Sigma, Kat.-Nr. D8437) plus die folgenden Zusatzstoffe: 10% FBS (50 ml/500 ml; Irvine Scientific: Kat.-Nr. 3000), 1% (5 ml) Genetecin (Invitrogen: Kat.-Nr. 10131027), 1% (5 ml), Pen/Strep (Irvine Scientific: Kat.-Nr. 9366), 1% nichtessentielle Aminosäuren (Irvine: Kat.-Nr: 9304); und
c. hERG: Nährstoffmischung HAMS F12, enthaltend GlutaMAX (Gibco, Kat.-Nr. 31765–035) plus die folgenden Zusatzstoffe: 10% FBS (50 ml/500 ml; Irvine Scientific: Kat.-Nr. 3000), 1% (5 ml) Geneticin (Invitrogen: Kat.-Nr. 10131027), 1% (5 ml) Pen/Strep (Irvine Scientific: Kat.-Nr. 9366), 1% nichtessentielle Aminosäuren (Irvine: Kat.-Nr. 9304).

Experimentelle Instrumenten- und Planarsubstrate umfassen: das Instrument IonWorks Quattro (0200–6140); PatchPlate^TM-Verbrauchsmaterial (Einzelöffnung; 9000–0688); und PatchPlate-PPC^TM-Verbrauchsmaterial (Mehröffnung; 9000–0902) alle von der Molecular Devices Corporation.
Zellen wurden in T-75-Behältern kultiviert und alle zwei bis drei Tage bei 1:3 bis 1:6 Verdünnung passiert. Zellen wurden auch bei niedrigerer Seeding-Dichte (1:50) behalten und alle drei bis vier Tage passiert. Behälter in der Nähe von Konfluenz, die mit Zellen niedrigerer Seeding-Dichte geseedet wurden, wurden häufig verwendet (~ alle 1–2 Wochen), um die Quelle von mit der höheren Dichte geseedeten Zellen bereitzustellen.
Es wird nun die Elektrophysiologie eines beispielhaften experimentellen Durchlaufs auf dem IonWorks Quattro besprochen. K_v1.3-Ströme wurden durch eine Spannungsstufe von einem Haltepotential von –70 mV auf +40 mV für 300 ms hervorgerufen, Na_v1.5-Ströme wurden durch eine Spannungsstufe von einem Haltepotential von –100 mV auf –20 mV für 40 ms hervorgerufen, hERG-Ströme wurden mit einem Vorimpuls auf +40 mV (5 s), gefolgt von einer Stufe auf –50 mV (4 s), um die Ströme hervorzurufen, gemessen. Stoffe wurden 330–430 Sekunden lang zwischen den Vor- und Nach-Stoff-Lesevorgängen inkubiert. Es wurde eine Widerstands-(skalierte)Lecksubtraktion verwendet, wobei die passive Abdichtkonduktanz an zwei hyperpolarisierten Werten berechnet und als eine ohmsche Konduktanz über den gesamten verwendeten Spannungsbereich berechnet wurde. Der berechnete Leckstrom wird dann digital vom Gesamtstrom für jeden Sample-Punkt subtrahiert.
Es wurde eine antibiotische Lösung präpariert, bei der Aliquoten von Amphotericin (5,0 ± 0,3 mg) im Voraus abgewogen und bei 4°C gelagert wurden. Vor der Zellenpräparation wurde einem Aliquot von Amphotericin 180 μl DMSO zugesetzt. Amphotericin-/DMSO-Lösung wurde bis zur Lösbarkeit (~1 Minute) im Ultraschallbad behandelt, einer konischen 50-ml-Röhre aus internem Puffer zugesetzt und ~1 Minute gewirbelt. Die Lösung wurde im Dunkeln gelagert, bis sie bereit zur Verwendung ist.
Es wurden Zellen präpariert, bei denen Zellen auf 70–90% Konfluenz in einem T-75-Behälter gewachsen und 1–2 Tage nach dem Plating aus dem Inkubator (37°C, 5% CO2) entnommen wurden. Das Wachstumsmedium wurde unter Verwendung einer an eine Unterdruckpumpe angeschlossenen 2-ml-Aspirationspipette aus den Kulturbehältern aspiriert. Die Zellen wurden mit 2,5 ml Versene-Lösung ~10 Sekunden lang behutsam gespült, bevor die Lösung aspiriert wurde.
Die Zellen wurden wieder in 2,5 ml Versene-Lösung bei 37°C eingetaucht. Nach 4–5 Minuten wurden sichtbar gerundete Zellen leicht vom Boden des Behälters mit einigen kurzen leichten Schlägen auf einer festen Oberfläche abgelöst. 20 ml PBS wurden dem Behälter zugesetzt und die resultierende Lösung wurde verwendet, um die Seiten des Behälters zu waschen; die Zellensuspension wurde gleichmäßig in zwei konische 15-ml-Röhren aufgeteilt. Die zwei 15-ml-Röhren wurden bei 800 Upm 4 Minuten lang zentrifugiert. Der Zellenüberstand wurde dekantiert, 1,5 ml PBS pro Röhre hinzugesetzt, die Zellensuspensionen kombiniert und die Zellen behutsam 1 Minute lang unter Verwendung eines p200-Pipettors trituriert. Ein Volumen von 3 ml Zellensuspension wurde dem Zellenboot auf dem Instrument IonWorks Quattro kurz vor dem Anfang des experimentellen Durchlaufs zugesetzt.
Die Datenanalyse umfasste das Anpassen von Konzentrationsantwortkurven für Tetracain, Lidocain und 4-Aminopyridin an eine vierparametrige Gleichung: % Kontrolle = 100(1 + ([Medikament/IC50]^p)^–1 Gl. (a) wobei IC50 die Medikamentenkonzentration ist, die erforderlich ist, um den Strom um 50% zu inhibieren, und p die Hillsche Steigung ist.
Die obigen Beschreibungen von spezifischen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wurden zwecks Veranschaulichung und Beschreibung angegeben. Sie sollen nicht erschöpfend sein oder die Erfindung auf die genauen offenbarten Formen beschränken, und offensichtlich sind viele Modifikationen und Abwandlungen im Hinblick auf die obigen Lehren möglich. Die Ausführungsformen wurden ausgewählt und beschrieben, um die Prinzipien der Erfindung und ihre praktische Anwendung am besten zu erläutern, um es anderen Fachleuten dadurch zu ermöglichen, die Erfindung und verschiedenen Ausführungsformen mit verschiedenen Modifikationen, sowie sie für den konkreten in Betracht gezogenen Verwendungszweck geeignet sind, am besten zu benutzen. Es ist beabsichtigt, dass der Schutzumfang der Erfindung durch die angefügten Ansprüche und ihre Äquivalente definiert ist.
Bezugszeichenliste
Fig. 2

42: offenes Loch
44: Zellen
51: AgAgCl-Pellet
56: digital zu Computer

44: Zellen
51: AgAgCl-Pellet
56: digital zu Computer
58: Blockierungsperle

51: AgAgCl-Elektrode
51': Stromleitungselektrode

35: Extrazelluläre Lösung
39: Intrazelluläre Lösung
44: Zellen

35: Extrazelluläre Lösung
39: Intrazelluläre Lösung

47: Elektrodenplatine

47: Elektrodenplatine
49: Patch Plate
51: Ag/AgCl-Elektrode
53: Abstandsloch
54: Fluidausgaberöhren

51'': Gemeinsame Masseelektrode

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

WO 99/66329 [0021]
US 6776896 [0091]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

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Claims

Ein System (30) zur Analyse von Ionenkanäle aufweisenden Membranproben mit hohem Durchsatz, wobei das System aufweist: mindestens eine Membranprobe (44); eine Mehrkammerstruktur mit einer Vielzahl von extrazellulären Kammern (33) und mindestens einer gegenüberliegenden intrazellulären Kammer (37), wobei eine Abtrennung (40) die extrazellulären von der mindestens einen intrazellulären Kammer trennt und wobei jede extrazelluläre Kammer (33) mindestens 10, 50, 64, 100 oder 1000 Abtrennungsöffnungen (42) hat, die die extrazellulären und die mindestens eine intrazelluläre Kammern fluidtechnisch und elektrisch verbinden; eine elektrische Quelle, die dazu ausgelegt ist, eine Spannung und/oder einen Strom zwischen den extrazellulären und der mindestens einen intrazellulären Kammer anzulegen; und einen Stromsensor; wobei die elektrische Quelle und der Stromsensor jeweils dazu ausgelegt sind, den Gesamtstrom durch die Vielzahl der extrazellulären Kammern (33) und die mindestens eine intrazelluläre Kammer (37) bei einer Messbedingung anzulegen oder zu messen, bei der mindestens eine der Öffnungen (42) durch die mindestens eine Membranprobe (44) abgedichtet ist und eine andere der Öffnungen (42) nicht abgedichtet ist, so dass ein Teil des Gesamtstroms durch die nicht abgedichtete Öffnung (42) fließt; und wobei die Öffnungen einen Durchmesser im Bereich von ungefähr 0,5 μm bis 5 μm aufweisen.
Das System nach Anspruch 1, wobei die Membranprobe aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus Zellen, Vesikeln, Organellen, Zellmembranfragmenten oder synthetischen Membranen, die einen Ionenkanal umfassen.
Das System nach Anspruch 2, wobei die Membranprobe im Wesentlichen kugelförmig ist.
Das System nach Anspruch 2, wobei ein Teil der Membranprobe innerhalb der einen Öffnung ist und ein Rest der Membranprobe außerhalb der einen Öffnung der Abtrennung und im Wesentlichen intakt ist.
Das System nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die andere der Öffnungen offen ist.
Das System nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Abtrennung im Wesentlichen planar ist.
Das System nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Widerstand, der mit der nicht abgedichteten Öffnung zusammenhängt, geringer ist als 50 MOhm, und der Widerstand, der mit der mindestens einen Membranprobe zusammenhängt, mit der die abgedichtete Öffnung abgedichtet ist, größer ist als 50 MOhm.
Das System nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Widerstand, der mit der nicht abgedichteten Öffnung zusammenhängt, geringer ist als ungefähr 25%, 42%, 50% oder 75% des mittleren Widerstandes zwischen der extrazellulären und der intrazellulären Kammer.
Das System nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die elektrische Quelle und der Stromsensor jeweils dazu ausgelegt sind, das Anlegen und/oder Messen des Stroms über die extrazelluläre und die intrazelluläre Kammer zu beginnen, bevor alle Öffnungen durch jeweilige Membranproben abgedichtet sind.
Das System nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die elektrische Quelle ein Verstärker oder ein Patch-Clamp-Verstärker ist.
Das System nach einem der vorhergehenden Ansprüche, das ferner ein Fluidsystem zum Zugeben von Fluiden zur extrazellulären Kammer aufweist, wobei das Fluidsystem dazu ausgelegt ist, Zugabe-, Lese- und Waschfluide bereitzustellen.
Das System nach Anspruch 11, wobei das Fluidsystem dazu ausgelegt ist, eine Lösung von Membranproben in Suspension in die extrazelluläre Kammer auszugeben.
Das System nach Anspruch 12, wobei die mindestens eine Membranprobe zu der mindestens einen Öffnung innerhalb fünf Minuten oder 60 Sekunden ab der Ausgabe des Fluidsystems abgedichtet wird.
Das System nach Anspruch 1, wobei die mindestens eine Membranprobe eine Abdichtung zu der mindestens einen Öffnung hat, die mindestens ungefähr 10, 100 oder 1000 MOhm ist, und die elektrische Quelle dazu ausgelegt ist, die mindestens eine Membranprobe durch Spannung zu klemmen.
Das System nach einem der vorhergehenden Ansprüche, das ferner aufweist: eine erste Elektrode in elektrischem Kontakt mit der extrazellulären Kammer; und eine zweite Elektrode in elektrischem Kontakt mit der intrazellulären Kammer; wobei die erste und die zweite Elektrode zum Anlegen der elektrischen Spannung über die extrazelluläre und die intrazelluläre Kammer mit der elektrischen Quelle elektrisch verbunden sind.