DE102010002915A1

DE102010002915A1 - Mikrofluidischer Sensor

Info

Publication number: DE102010002915A1
Application number: DE102010002915A
Authority: DE
Inventors: Dr. Gründig Bernd; Heiko Wedig
Original assignee: SENSLAB GES ZUR ENTWICKLUNG und HERSTELLUNG BIOELEKTROCHEMISCHER SENSOREN MBH; SENSLAB-GESELLSCHAFT ZUR ENTWICKLUNG und HERSTELLUNG BIOELEKTROCHEMISCHER SENSOREN MBH
Current assignee: SENSLAB GES ZUR ENTWICKLUNG und HERSTELLUNG BIOELEKTROCHEMISCHER SENSOREN MBH; SENSLAB-GESELLSCHAFT ZUR ENTWICKLUNG und HERSTELLUNG BIOELEKTROCHEMISCHER SENSOREN MBH
Priority date: 2010-03-16
Filing date: 2010-03-16
Publication date: 2011-09-22
Anticipated expiration: 2030-03-17
Also published as: US20110233059A1; DE102010002915B4

Abstract

Die Erfindung betrifft einen mikrofluidischen Sensor, der einen planaren Grundsensor und eine strukturierten Polymerfolie aufweist. Die dem Grundsensor zugewandte Unterseite der Folie weist unterschiedlich vertiefte geometrische Formen bzw. Kompartiments auf, die z. B. photolithographisch, im Mikrospritzguss-, im Tiefzieh- oder Heißprägeverfahren erzeugt werden. Der erfindungsgemäße mikrofluidische Sensor ist besonders geeignet für die Herstellung von Biosensoren in Form von Einmalgebrauchs-Enzym- und Affinitätssensoren, wobei die vertieft strukturierten Geometrien Probeaufnahme-, Probeaufbereitungs-, Inkubations-, Puffer-, Misch-, Reaktions-, Reagenzdepot-, Mess- Abfall-, und Entlüftungskammern, Verteiler und/oder Verbindungskanäle bilden, deren äußere umlaufende Konturen als schmale umlaufende Wandungsstege in Höhe der Nullebene der Folie und mit einer Breite zwischen 50 μm und 500 μm ausgebildet sind; denen sich außen eine vertiefte Fläche oder eine im Abstand von 0,1 mm bis 1,0 mm folgende umlaufende Fugenanordnung anschließt.

Description

Die Erfindung betrifft einen mikrofluidischen Sensor, der einen planaren Grundsensor und eine strukturierten Polymerfolie aufweist. Die dem Grundsensor zugewandte Unterseite der Folie weist unterschiedlich vertiefte geometrische Formen bzw. Kompartiments auf, die z. B. photolithographisch, im Mikrospritzguss-, im Tiefzieh- oder Heißprägeverfahren erzeugt werden. Der erfindungsgemäße mikrofluidische Sensor ist besonders geeignet für die Herstellung von Biosensoren in Form von Einmalgebrauchs-Enzym- und Affinitätssensoren.
Stand der Technik
Mit der Nutzung diagnostischer Einmalgebrauchs-Sensoren auf der Grundlage enzymatischer und affinitätsbasierender Detektionsprinzipien, die eine unmittelbare, schnelle und quantitative Messung für Point of Care und Home Care-Anwendungen ermöglichen, sind Sensorstrukturen erforderlich, die einerseits eine möglichst richtige und reproduzierbare Messung sichern, andererseits aber kostengünstig herstellbar sein müssen. Diese Kriterien erfordern ein streng reproduzierbares Liquid-Handling der Probe, das gegebenenfalls Probeaufbereitungsschritte und – splitting sowie ein mehrkanaliges Ausmessen der Probe umfassen kann. Darüber hinaus sollte die erforderliche Probemenge so gering als möglich sein.
Sensorelemente, die in Kombination mit einem Handmessgerät eine einfache quantitative Vor-Ort-Messung ermöglichen, sind als so genannte ”Einmal”- oder ”Wegwerf”-Teststreifen oder -Sensoren bekannt. Insbesondere im Diabetesbereich haben sich derartige Messsysteme für Home Care – Anwendungen bewährt. In Eigenanwendung nutzen Diabetespatienten Glucoseteststreifen bzw. -sensoren zur Selbstkontrolle des Blutzuckerwertes.
In der Regel wird durch den Kontakt eines Kapillarbluttropfens an einer Probeaufnahmezone des Sensors ein Teil der Blutprobe durch Kapillarkraft auf eine interne Reagenzfläche des Sensors befördert. Auf der Reagenzfläche sind ein spezifisch die Glucose umsetzendes Enzym, ein Elektronenakzeptor und Additive zur Stabilisierung und schnellen Benetzbarkeit deponiert. Bei dem Enzym kann es sich um Oxidoreduktase wie Glucoseoxidase, Glucosedehydrogenase mit PQQ- oder FAD⁺ als prosthetischer Gruppe oder eine NAD⁺- abhängige Dehydrogenase handeln. Als Elektronenakzeptoren werden beispielsweise Chinone, chinoide Redoxfarbstoffe oder redoxaktive Metallkomplexe verwendet.
Die Oxidoreduktase reagiert mit der Blutglucose und überträgt ihre Elektronen, die bei dem Oxidationsprozess generiert werden, auf den Elektronenakzeptor, der damit equivalent zur Glucosekonzentration im Blut reduziert wird. Diese Redoxzustandsänderung des Elektronenakzeptors kann optisch oder elektrochemisch detektiert werden.
Bei einer elektrochemischen bzw. voltammetrischen Indikation des Elektronenakzeptors wird zwischen einer polarisierbaren Arbeitselektrode und einer Bezugselektrode eine Polarisationsspannung angelegt, die einen solchen Wert hat, dass an der anodisch geschalteten Arbeitselektrode der reduzierte Elektronenakzeptor zuverlässig oxidiert werden kann. Der resultierende Stromfluss im Außenkreis zwischen Arbeitselektrode und der Bezugselektrode ist aufgrund des stöchiometrischen Umsatzes proportional zur Zuckerkonzentration im Blut. Ein Handmessgerät stellt für die voltammetrische Messung des Sensors die erforderliche Polarisationsspannung bereit, misst den Signalstrom, ermittelt den Konzentrationswert, zeigt diesen auf dem LCD an und speichert den Messwert.
Für den Aufbau derartiger Einmalgebrauchs-Sensoren, die eine enzymatischvoltammetrische Indikation nutzen, ist eine Vielzahl technischer Lösungen bekannt.
Elektrochemisch-enzymatischer Sensoren für den Einmalgebrauch bestehen prinzipiell aus einem planaren Grundsensor mit einer voltammetrischen Zwei- oder Drei-Elektrodenanordnung, die in einem „Messfenster” angeordnet ist, einschließlich Zuleitungen und elektrischen Kontaktflächen, einer das Messfenster bedeckenden Reagenzschicht, die das analyterkennende Enzym- oder Enzymsystem einschließlich Elektronenakzeptor sowie Additive enthält und einem Schichtaufbau um das Messfenster, der dem schnellen und definierten Zuführen der Probe dient.
Die Probe wird entweder direkt auf die Schichtenfolge gegeben oder mittels Kapillarkrafteffekt in einen Kapillarspalt, der über dem Messfenster angeordnet ist, auf die Reaktionsschicht gezogen.
Die zuletzt genannte technische Lösung wurde erstmals in EP 0 274 215 A1 beschrieben und wird derzeit am häufigsten für die Realisierung von Einmalgebrauchssensoren zur Blutzuckermessung angewandt.
Zur Erzeugung des Spaltes werden verklebte Kunststoffzwischenlagen, doppelseitige Klebefilme oder starke Klebeschichten, die im Sieb- oder Schablonendruck aufgetragen werden, verwendet. Diese Spacerschicht wird durch vorhergehendes Ausstanzen, oder entsprechende Laminieranordnungen derart aufgebracht, dass sie die Längsseiten des Messfensters begrenzen, der Messfensterbereich und die Stirnseiten des Fensters jedoch unbedeckt bleiben. Durch die anschließende Laminierung einer Deckfolie auf die Spacerschicht wird eine Messkammer über dem Messfenster gebildet, so dass gleichzeitig eine Ein- und Austrittsöffnung für die Probeflüssigkeit generiert wird. Die Dicke der Klebefolie definiert den Spalt bzw. die Höhe über der Messkammer. Länge und Breite der ausgestanzten Öffnung legen gemeinsam mit der Spalthöhe das Messkammervolumen fest.
Eine modifizierte technische Lösung sieht die Ausbildung einer konkaven Wölbung in der Abdeckung vor, die nach dem Verkleben mit dem Support einen Kapillarspalt erzeugt.
In den beschriebenen technischen Lösungen wird die Probe aufgrund der Kapillarwirkung auf die sensitive Fläche des Sensors transportiert. Eine große Austrittsöffnung führt zur Aufhebung der Kapillarwirkung, so dass die Probeaufnahme damit beendet wird. Varianten nutzen als Austrittsöffnung beispielsweise eine Öffnung in der Abdeckung oder eine Öffnung im Support des Sensors.
Die Kapillarwirkung wird durch die Verwendung hydrophilisierter Oberflächen und das zusätzliche Einbringen hydrophiler Polymere und sorptiver Polymere bzw. hydrophilisierter Gewebe in ihrer Wirkung in verschiedenen technischen Lösungen verbessert.
Eine mikrofluidische Lösung wird im Patent DE 10211204 A1 beschrieben, die eine Kunststoffdeckfolie verwendet, deren zum Grundsensor gerichtete Fläche strukturierte Kompartiments in Form von Kammern und Kanälen aufweist, so dass nach der irreversiblen Verbindung mit dem Grundsensor eine Probeaufnahme, eine Messkammer und ein Luftaustrittsspalt gebildet werden, die über Kanäle miteinander verbunden sind. Die Höhe der Kammern wird einerseits durch die Dicke des Klebers und andererseits durch die Tiefe der Strukturierung der Polymerfolie bestimmt.
Bei den zuvor beschriebenen Systemen ist allen Messkammern bzw. Kapillarspaltanordnungen gemeinsam, dass die Kammerhöhe und damit das erforderliche Probevolumen wesentlich von der Dicke der Klebefilme bestimmt wird. Darüber hinaus ist die gleichmäßige und schnelle Befüllung der Messkammer abhängig von den hydrophoben bzw. hydrophilen Eigenschaften der Kleberkomponente, die gegebenenfalls vor oder während des Fertigungsprozesses durch eine zusätzliche Behandlung stärker hydrophilisiert werden muss. Es ist außerdem zu beachten, dass derartige Kleberschichten einer Alterung unterliegen, in deren Folge die Messkammergeometrie und das Aufziehverhalten sich beispielsweise aufgrund von Schrumpfungsprozessen und Verlust bzw. Zersetzung funktionalisierter Gruppen, die für den hydrophilen Charakter der Klebefilmoberfläche verantwortlich sind, ändern können. Schließlich ist die Strukturierbarkeit von Klebefilmen, wie sie derzeit für Einmalgebrauchssensoren Anwendung finden, begrenzt, so dass damit nur eine eingeschränkte Miniaturisierbarkeit mikrofluidischer Anordnungen möglich ist.
Andere prinzipiell zum formschlüssigen Fügen des Schichtaufbaus in Frage kommende technische Lösungen bestehen im Verkleben, Schweißen und Heißsiegeln. In der Regel ist die Oberfläche des Grundsensors jedoch mit metallischen, siebgedruckten Leiterzügen oder einer siebgedruckten Isolationsschicht versehen, die entweder aufgrund der resultierenden Unebenheiten oder materialbedingt ungeeignet für eine dieser Technologien sind. Es besteht außerdem die Gefahr, das aufgrund von Lösungsmitteln im Kleber oder des erforderlichen Wärmeeintrages beim Schweißen bzw. Heißsiegeln das während des Fügeprozesses bereits aufgetragene Indikationsreagenz auf dem Messfenster beschädigt wird. Es muss auf einen ausreichenden Abstand zwischen Fügeflächen und den mikrofludischen Strukturen geachtet werden, um ein Zulaufen der Kanäle durch Kleber, geschmolzenem Material und um ein wärmebedingtes Deformieren des den Mikrofluidkbereich begrenzenden Kunststoffs oder Spannungsbildungen zu verhindern.
So ist z. B. die Verwendung eines Faserlasers beschrieben, mit dessen Hilfe Polycarbonat mit einer Schweißnahtbreite im Bereich von 100 μm verschweißt werden kann.
Bekannte technische Lösungen zum Aufbau immunochemischer Teststreifen oder Sensoren, die Affinitätsreaktionen nutzen, basieren in aller Regel auf nacheinander überlappend angeordneten, filtrierenden und gut saugfähigen natürlichen oder synthetischen Polymermembrangerüstschichten aus zelluloseartigen Materialien wie Zellulosenitrat, Zelluloseester und regenerierter Zellulose oder Materialien aus modifizierten Polyamiden oder modifiziertem Polyethersulfon. Dadurch werden vertikal oder horizontal verlaufende Fließstrecken realisiert. Neben einer Separation der Probe kann sowohl die immunochemische Reaktion als auch die sekundäre Nachweisreaktion in qualitativer Form durch Visualisierung einer Farbreaktion oder Aufkonzentrierung metallischer Nanopartikel oder in quantitativer Form mittels elektrochemischer oder optischer Detektion erfolgen. Von Nachteil sind das vergleichsweise große erforderliche Probevolumen, die begrenzte Strukturierbarkeit der Fluidik und begrenzte Miniaturisierbarkeit.
Im Grundlagenbereich sind eine Vielzahl technologischer Lösungsansätze bekannt, die bisher nur für einfach strukturierte Biochips zu einer Kommerzialisierung geführt haben.
Eine Möglichkeit zur Erzeugung mikrofluidischer Strukturen bieten die Siliziumtechnologie durch anisotropes Ätzen bzw. Silizium-Tiefätzen und die LIGA-Technologie in Kombination mit Mikrospritzgießen.
Beide Verfahren sind vergleichsweise kostenintensiv. Die Siliziumtechnologie ist im F&E-Bereich insbesondere für die Generierung komplizierterer Mikrofluidikstrukturen wie sie für zukünftige „lab-on the chip”-Lösungen erforderlich sind, d. h., in Verbindung mit integrierten Fluidikelementen wie Ventilen, Mischkammern oder Mikropumpen und in Kombination mit piezoelektrisch oder elektromechanisch initiierten Fluidtransport sinnvoll und etabliert. Für die kostengünstige Fertigung einfacher mikrofluidischer Disposables konnte sie sich bisher nicht durchsetzen.
Aufgrund von Materialeigenschaften, Verfügbarkeit und potentieller Fertigungstechnologien erscheint ein Lösungsansatz unter Nutzung von Kunststoffen sinnvoller, wenn es gelingt, die mikrofluidischen Strukturen bei geringen Kosten und in hohen Stückzahlen als strukturierte Elemente zur Verfügung zu stellen.
Möglichkeiten eröffnen sich hier prinzipiell durch das Mikrospritzgießen, das Heißprägen und Kombinationen davon sowie durch neuere Lithographie- und laserstrukturierende Verfahren ( EP 1 225 477 A1 , M.F. Jensen, J.E. McCormack, B. Helbo, L.H. Christensen, T.R. Christensen, N.J. Mikkelsen, and T. Tang. ”Rapid Prototyping of Polymeric Microstructures with a UV Laser, Proc. CIRP seminar an micro and nano technology” Copenhagen, Denmark (2003)).
Die Technologien sind aufgrund der vergleichsweise hohen Kosten vor allem für Rapid Prototyping und die Fertigung kleinerer Stückzahlen geeignet.
Massenproduktionstechnologien bei Einmalgebrauchssensoren nutzen deshalb zur Generierung kapillarer Messkammern über den Elektrodenanordnungen bzw. Messfenstern im Wesentlichen Laminiertechniken, die durch die Aufeinanderfolge von Zwischenlagen aus Kleber- und/oder Distanzschichten und einer Abdeckfolie generiert werden und denen demzufolge die oben genannten Nachteile inherent sind.
Insbesondere die eingeschränkte Strukturierbarkeit der Klebefilme begrenzt die Miniaturisierung Fluidik, die auch für die Weiterentwicklung von Einmalgebrauchs-Affinitätssensoren, erforderlich sind, da einerseits komplexe Abläufe zur Probeaufbereitung und deren Ausmessung in Bezug auf mehrere Parameter erforderlich sind und andererseits nur eine begrenzte Probemenge zur Verfügung steht. Darüber hinaus muss insbesondere bei passiv agierenden Mikrofluidikanordnungen ein streng reproduzierbarer Ablauf eingehalten werden.
Dennoch erscheint aufgrund der Kompatibilität zu den etablierten Fertigungstechnologien ein Lösungsansatz unter weiterer Nutzung von Laminiertechnik als anstrebenswert, wenn es gelingt, die oben beschriebenen Nachteile zu überwinden, so dass auch mikrofluidische Strukturen aus Kunststofffolien für komplexere Applikationen in Form von Einmalgebrauchs-Sensoren massenproduktionstauglich nutzbar werden.
Aufgabe der Erfindung war es deshalb, einen mikrofluidischen Sensor, bevorzugt zur Verwendung als Biosensor, für den Einmalgebrauch vorzugsweise unter Nutzung des Laminierens mittels doppelseitiger Klebefolien bereitzustellen, der die oben genannten Nachteile sowohl bei den bekannten Einmalgebrauchs-Enzymsensoren als auch Einmalgebrauchs-Affinitätssensoren vermeidet und technologisch kostengünstig und streng reproduzierbar herstellbar ist. Darüber hinaus soll der Sensor eine einfache Handhabung ermöglichen, ein minimales und gut definiertes Probevolumen aufnehmen und die Bestimmung z. B. sowohl von Substanzen als auch von Enzymaktivitäten ermöglichen.
Die Aufgabe der Erfindung wird gemäß des unabhängigen Anspruches 1 gelöst. Die Unteransprüche stellen bevorzugte Ausführungsvarianten dar.
Es wurde gefunden, dass ein mikrofluidischer Einmalgebrauchs-Sensor aus einem Grundsensor 1 und einer strukturierten Polymerfolie 2, bei der die dem Grundsensor 1 zugewandte Polymerfolienfläche unterschiedlich vertiefte geometrische Formen 3 aufweist, die parallel oder nacheinander angeordnet sind, streng reproduzierbare, kostengünstige und massenproduktionsfähigen Eigenschaften zur Ausmessung von Substanzen oder Enzymaktivitäten mit geringsten Probevolumina ermöglicht, wenn die äußeren Wandungskonturen einzelner oder sämtlicher gegenüber der Nullebene der Folie 2 vertieft strukturierten Geometrien 3 als schmale, umlaufenden Stege 4 in Höhe der Nullebene der Folie und mit einer Breite zwischen 50 μm und 500 μm ausgebildet sind und sich eine gegenüber der Nullebene der Folie vertiefte Fläche 5, die zur Aufnahme einer Klebefolie 6 dient, oder eine umlaufende Fugenanordnung, die im Abstand von 0,1 mm bis 1,0 mm folgt, anschließt.
Die Strukturierung der Polymerfolie, die aus Polycarbonat, Polymethylmethacrylat, Polystyrol oder Polyvinylchlorid bestehen kann und eine bevorzugte Dicke zwischen 100 μm und 250 μm aufweist, erfolgt z. B. mittels Heißprägeverfahren, eines photolithographischen Verfahrens, Laserablation, Mikrospritzguss oder Tiefziehverfahren.
Die Tiefe der strukturierten Geometrien 3 auf der zum Grundsensor 1 zugewandten Seite der Polymerfolie 2 beträgt mit Bezug zur Nullebene Folie vorzugsweise zwischen 0,5μm und 150 μm. Bei den vertieften Geometrien 3 kann es sich um Probeaufnahme-, Probeaufbereitungs-, Inkubations-, Puffer-, Misch-, Reaktions-, Reagenzdepot-, Mess-Abfall-, und Entlüftungskammern, Verteiler und Verbindungskanäle handeln, die in Abhängigkeit von der umzusetzenden mikrofluidischen Aufgabe ggf. entsprechend miteinander verbunden sind.
Die als äußere Wandungsstege 4 die einzelnen oder alle vertiefte Geometrien begrenzen, verlaufen auf Nullebene der Polymerfolie 2 mit einer Breite zwischen 50 μm und 500 μm. Die Fläche der Stege 4, die zum Grundsensor weisen, haben bevorzugt eine ebene 4a, halbkreisförmige 4b oder spitz 4c zulaufende Form.
In Abhängigkeit von der Tiefe der Geometrien, die zwischen 05, μm und 150 μm beträgt, variiert die Tiefe der inneren Flanken entsprechend.
In einer bevorzugten Ausführungsform schließt sich an der äußeren Stegflanke eine gegenüber der Foliennullebene vertiefte Fläche 5 an, deren Tiefe identisch mit der der äußeren Stegflanke ist und vorzugsweise zwischen 20 μm und 100 μm beträgt.
Diese der Wandungsstege sich anschließende, vertiefte Fläche 5 dient der bündigen Aufnahme einer doppelseitigen Klebefolie 6 mit einer bevorzugten Dicke zwischen 20 μm und 100 μm, so dass die strukturierte Polymerfolie 2 mit der planaren Oberfläche des Grundsensors 1 irreversibel form- und kraftschlüssig verbunden wird.
Als Grundsensor 1 dient z. B. ein planarer elektrochemischer Sensor oder ein planares, optisch durchlässiges Supportmaterial, auf dessen Messfenster 7 eine Reagenzschicht 8 zur Analytindikation deponiert ist. Der Grundsensor 1 ist gegenüber der strukturierten Polymerfolie 2 derart angeordnet, dass dessen Messfenster 7 sich innerhalb einer entsprechenden vertieften Geometrie 3 befindet, die die Messkammer 3a darstellt. Die Messkammergeometrie und deren fluidischen Eigenschaften werden ausschließlich von der Strukturierung der Polymerfolie 2 und deren Oberflächeneigenschaften bestimmt. Unabhängig von den technologischen Möglichkeiten zur Strukturierung der Klebefolien können auf diese Weise Messkammern mit Volumina bis in den unteren Nanoliterbereich streng reproduzierbar hergestellt werden. Da die Klebefolie 6 lediglich die Aufgabe wahrnimmt, die Polymerfolie 2 mit dem Grundsensor 1 formschlüssig zu verbinden und im Gegensatz zu bisherigen technischen Lösungen nicht mehr Bestandteil der Messkammer ist bzw. auch keine Spacerfunktion besitzt, hat die mit Toleranzen behaftete Strukturierung der Klebefolien keinen Einfluss auf die Messkammergeometrie. Insbesondere spielen Alterungserscheinungen der Klebefolie wie Schrumpfung, oder das Nachlassen hydrophiler Eigenschaften, die zu Änderungen der Kammergeometrie und des Probebefüllungsverhaltens führen, keine Rolle mehr, so dass das Probevolumen wesentlich reproduzierbarer als bisher möglich über dem Messfenster vorliegt.
Bei komplexeren mikrofluidischen Strukturen kann es vorteilhaft sein, wenn in einer anderen Ausführungsvariante dem umlaufende Steg 4 im Abstand zwischen 0,1 mm und 1 mm eine Fugenanordnung folgt, die z. B. aus zwei Nuten 9a, 9b mit einem dazwischen befindlichen Fugensteg 10 besteht und insbesondere dem form- und kraftschlüssigen Fügen zwischen Polymerfolie und dem Grundsensor mittels Laser- oder Ultraschallschweißen, Heißsiegeln oder Kleben dient. Der Fugensteg 10 zwischen den Nuten 9a, 9b ist vorzugsweise zwischen 50 μm und 500 μm breit und weist gegenüber der Nullebene der Folie eine bevorzugte Höhe zwischen –1 μm und 5 μm auf. Die davor und dahinter angeordneten Nuten 9a, 9b sind vorteilhafter Weise zwischen 50 μm und 1000 μm breit und gegenüber der Nullebene der Folie bevorzugt um 10 μ bis 150 μm vertieft. Diese Fugenanordnung ist insbesondere deshalb für die damit gedichtete Mikrofluidik vorteilhaft, da auf diese Weise während des Fügens eine Beeinflussung der vertieft angeordneten Geometrie einschließlich darin befindlicher Reagenzien vermieden wird. Bei Wärmeentwicklung wird während des Schweiß- oder Heißsiegelprozesses durch die Nut 9a bzw. den Luftspalt, der zwischen dem zu verschweißendem Steg und der vertieft strukturierten Geometrie Liegt, eine Beschädigung oder Deformierung der Mikrofluidikstrukturen sowie eine hitzebedingte Deaktivierung der dort deponierten Reagenzschicht 8 vermieden. Die beiden Nuten 9a, 9b dienen außerdem zum Auffangen von Kunststoffschmelze des dazwischen befindlichen Steges 10, dessen Oberfläche durch Laserschweißen oder Heißsiegeln angeschmolzen wird. In analoger Weise nehmen die Nuten 9a, 9b beim Verkleben des Steges Kleberüberstand auf, so dass die Randbereiche der Mikrofluidik nicht zugesetzt werden. Zur Verbesserung der hydrophilen Eigenschaften können die Wandungen der vertieft strukturierten Geometrien 3 in der Polymerfolie 1 mit einem Detergenz behandelt oder lokal definiert einer physikalischen Plasmabehandlung ausgesetzt werden.
Im einfachsten Fall besteht ein bevorzugter mikrofluidischer Einmalgebrauchs-Sensor aus einer strukturierten Polymerfolie 2 und einem planaren amperometrischen Grundsensor 1, an dessen einem Ende parallel und zentrisch zu dessen Längsachse sich ein rechteckigförmiges Messfenster 7 befindet. Das Messfenster 7a, in dem eine amperometrische Dreielektrodenanordnung aus Arbeits-Gegen- und Bezugselektrode (11a, b, c) angeordnet ist, wird durch die Aussparung eines auf dem Grundsensor aufgetragenen Isolationslackes 7 erzeugt, unter dem sich die Leiterzüge 12a–c zwischen Elektroden und Kontaktflächen 13a–c, die am anderen Ende des Grundsensors angeordnet sind, befinden.
Elektroden 11a–c, Zuleitungen 12a–c und Kontaktflächen 13a–c bestehen aus einer Kohlenstoffsiebdruckschicht oder einer Edelmetalldünnschicht, die photolithographisch – galvanisch oder mittels Laser strukturiert sind.
Die dem Grundsensor 1 zugewandte Polymerfolienfläche weist in Höhe des Messfensters 7 eine rechteckige mittels Laserablation, Photolithographie oder Heißprägen erzeugte Vertiefung 3a zwischen 5 μm und 100 μm auf, deren Wandungen mit Ausnahme der vom Sensor wegweisenden Stirnseite, in einen auf Nullebene der Polymerfolie 2 verbleibenden umlaufenden Steg 4 mit einer Stegbreite zwischen 50 μm und 500 μm übergehen. Der Wandungssteg an der gegenüberliegenden Stirnseite ist mittig unterbrochen. An der Unterbrechung befindet sich ein sogenannter Entlüftungskanal 14 mit einer Breite von 10 μm bis 50 μm, einer Höhe von 25 μm bis 100 μm und einer Länge von 0,5 mm bis 2,0 mm. Der Entlüftungskanal 14 mündet in einer großvolumigen Kammer 15, die Luftaustrittsöffnungen 15a, b aufweist.
An den äußeren Flanken der Wandungsstege 4 schließt sich eine umlaufend und gegenüber der Foliennullebene vertiefte Fläche 5 an, deren Tiefe identisch mit der der äußeren Stegflanken ist und zwischen 20 μm und 100 μm beträgt. Diese vertiefte Fläche 5 dient zum Einlegen einer doppelseitigen Klebefolie 6 mit einer Dicke zwischen 20 μm und 100 μm, die derart ausgestanzt ist, dass die stegumrandete Messkammer 3a gerade in die Ausstanzung 6a passt. Der Grundsensor 1 ist dann gegenüber der strukturierten Polymerfolie 2 derart angeordnet, dass dessen Messfenster 7 sich innerhalb der stegumrandeten vertieften Rechteckgeometrie befindet. Die Grundfläche der resultierenden Messkammer 3a bildet das Messfenster 7 des Grundsensors und die Seiten- und Deckfläche die vertiefte Rechteckgeometrie. Die doppelseitige Klebefolie 6 dient ausschließlich der form- und kraftschlüssigen Verbindung zwischen Polymerfolie 2 und Grundsensor 1 außerhalb des Messkammerbereiches. Durch die Klebeverbindung wird die Oberfläche der umlaufenden Wandungsstege 4, die zum Grundsensor weist und eben 4a, halbrund 4b oder spitz zulaufend 4b ausgebildet sein kann, derart auf dem Rand des Messsfensters des Grundsensors gedrückt, dass ein Austreten z. B. einer Blutprobe unter dem Steg hindurch vermieden wird.
Wenn ein Blutstropfen an die spaltartige Öffnung der Sensorstirnseite gelangt, wird aufgrund der Kapillarkraftwirkung soviel Probevolumen in die Messkammer 3a gezogen, bis die Messkammer befüllt ist. Die durch das Blut verdrängte Luft der Messkammer 3a entweicht über den Entlüftungskanal 14a in die Luftaustrittskammer, in der atmosphärischer Umgebungsdruck herrscht. In der Messkammer 3a wird die Reagenzschicht durch die Blutprobe aufgelöst und die Indiktionsreaktion zur Detektion des Zielanalyten ermöglicht.
Die beschriebene Ausführungsform ist besonders für voltammetrische Enzymsensoren zum Einmalgebrauch geeignet.
Aufgrund der sehr geringen Messkammervolumina, die mit der erfindungsgemäßen Lösung realisierbar sind und die zwischen 5,0 nl und 500 nl betragen können, erfolgt eine sehr schnelle Befüllung, so dass Befüllungsfehler aufgrund zu kleiner Blutstropfen, verlaufener Blutstropfen oder aufgrund eingeschränkter motorischer Fähigkeiten von Eigenanwendern drastisch vermindert werden. Die Messungen werden damit zuverlässiger. Insbesondere Diabetikern, die sich regelmäßig und pro Tag mehrfach Bluttropfen für die Blutzuckermessung entnehmen müssen, kommt das sehr geringe erforderliche Probevolumen entgegen und ermöglicht auch die Messung an alternativen Körperstellen („alternative site testing”).
Eine andere Ausführungsform des mikrofluidischen Einmalgebrauchs-Sensors, der in Bezug auf die verwendeten Materialien identisch mit denen der vorangegangenen Ausführungsform ist und aus einem planaren Grundsensor 1 und einer Polymerfolie 2 besteht, ist dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den gegenüber der Foliennullebene vertieft strukturierten Geometrien der Polymerfolie um eine Probeabfallkammer 16, Mischkammer 17, Affinitätssäule 18, Enzymsubstratdepot 19, Messkammern 3b, 3c und Entlüftungskammern 20a, b und Verbindungskanäle 21 handelt, deren äußere umlaufende Konturen als schmale umlaufende Wandungsstege 4 in Höhe der Nullebene der Folie mit einer Breite zwischen 50 μm und 500 μm ausgebildet sind und denen sich eine im Abstand von 0,1 mm bis 1,0 mm folgende umlaufende Fugenanordnung anschließt. Die umlaufende Fugenanordnung besteht aus zwei Nuten 9a, b mit einem dazwischen befindlichen Fugensteg 10, der zwischen 50 μm und 500 μm breit ist und gegenüber der Nullebene der Folie eine Höhe zwischen –1 μm und 5 μm aufweist. Die Nuten 9a, b sind zwischen 50 μm und 1000 μm breit und gegenüber der Nullebene der Folie um 10 μ bis 150 μm vertieft.
Die Polymerfolie wird mittels Bündel-Laser über die Fläche des umlaufenden Fugensteges 10 der Fugenanordnung auf dem Isolationslack 12 des Grundsensors verschweißt, so dass die vertieft strukturierten Geometrien 3ab, 16–21 entlang der diese umgebenden Wandungsstege 4 flüssigkeitsdicht eingeschlossen sind. Die Nuten 9a, b der Fugenanordnung stellen Luftspalte dar, die während des Fügevorganges ein Anschmelzen von angrenzenden Strukturen der vertieft strukturierten Geometrien oder eine hitzebedingte Deaktivierung der proteinhaltigen Reagenzschichten 8b, c, die in den Messkammern 3b, c aufgetragen sind, verhindern.
Der Grundsensor 1 ist analog dem der ersten Ausführungsform, weist jedoch zwei Messfenster 7a, b mit jeweils einer Arbeits-Gegen- und Referenzelektrode auf 11a–c und 11d–f, die am Ende des Sensors, unmittelbar vor den Kontaktflächen 13a–f angeordnet sind.
Die dem Grundsensor 1 zugewandte Polymerfolienfläche weist an der Stirnseite, die den Kontaktierungsflächen gegenüber liegt, zentrisch zur Längsachse des Grundsensors 1 eine Probeabfallkammer 16 mit einem Volumen zwischen 3 μl und 5 μl, auf, der sich nacheinander eine meanderartige Mischstrecke 17 mit einem Volumen zwischen 1 μl und 2 μl, und Verbindungskanäle 21a, b anschließen. Einer der beiden Verbindungskanäle 21a führt über ein Enzymsubstratdepot 19a mit einem Volumen zwischen 0,5 μl und 1 μl direkt zur ersten Messkammer 3b mit einem Volumen zwischen 0,05 μl und 0,2 μl und der andere Kanal 21b führt zu einer Affinitäts- bzw. Reaktionssäule 18 mit einem Volumen zwischen 0,5 μl und 1 μl, die über den Verbindungskanal 21b und einem weiteren Enzymsubstratdepot 19b mit einem Volumen zwischen 0,5 μl und 1 μl mit der zweiten Messkammer 3c in Verbindung steht. Von beiden Messkammern 3b, 3c führt jeweils der Kanal weiter zu einer Probeabfallkammer 20a, b, die jeweils Entlüftungskanäle 22a, b aufweisen. Die Probeabfallkammern 22a, b weisen Volumina zwischen 0,5 μl und 2,0 μl auf.
Der Grundsensor 1 ist gegenüber der strukturierten Polymertolie derart angeordnet, dass dessen Messfenster 7b, c sich jeweils innerhalb der stegumrandeten vertieft strukturierten Rechteckgeometrie bzw. Messkammer 3b, 3c befinden.
Die beschriebenen vertieft strukturierten Geometrien werden mittels Laserablation, Photolithographie oder Heißprägen erzeugt und weisen Vertiefungen zwischen 5 μm und 100 μm auf. Aufgrund der Schweißverbindung des Fugensteges 10 mit der Isolationsschicht des Substrates sitzt die umlaufende Stegoberfläche, die eben, halbrund oder spitz zulaufend ausgebildet sein kann, dicht auf dem Isolationslack 12 des Grundsensors auf, so dass die Kammerwandungen das Kammervolumen seitlich flüssigkeitsdicht begrenzt.
Bei kurzzeitigem Kontakt mit Probeflüssigkeit mit der Eintrittsöffnung 16a der Probeabfallkammer 16 erfolgt eine die rasche, kapillarkraftgetriebene definierte Aufnahme der Probe, die von der Probeabfallkammer aus die nachfolgenden Kanäle und Kammern bzw. Kompartiments passiv bzw. kapillarkraftgetrieben befüllt.
Mit der Befüllung der Meanderanordnung bzw. Mischstrecke 17 erfolgt eine Auflösung der darin enthaltenen Antikörper, DNA-Abschnitte oder Oligonukleotide, die mit einem Enzym oder einem optisch oder elektrochemisch aktiven Molekül konjugiert sind und bei Anwesenheit der Probe in der Lösung frei diffusionsfähig sind. Dabei erfolgt eine Mischung und Bindung zwischen dem markierten Molekül und dem Analyten. Ein Teil der Probe gelangt über den Verbindungskanal 21a in das Enzymsubstratdepot 19a, wo ggf. das darin enthaltene Enzymsubstrat und Cosubstrat mit dem Eintritt der Probe aufgelöst wird und eine Reaktion zwischen Markerenzym und Enzymsubstrat beginnt. Die Probe durchläuft die Messzelle und kommt nach Befüllung der Probeabfallkammer 20a zum Stillstand. Die Konzentration des während der enzymatischen Reaktion gebildeten elektrochemisch aktiven Reaktionsproduktes bzw. die Konzentration des elektrochemisch aktiven Markers wird in der ersten Messkammer 3b amperometrisch über ein definiertes Zeitintervall gemessen und dient als Referenz- und Funktionskontrollwert. In analoger Weise zu diesem Sandwich-Assay kann ein kompetitiver Assay in der Anordnung umgesetzt werden.
Der andere Teil der Probe gelangt über Verbindungskanal 21b in die Affinitätssäule 18, die durch eine entsprechende Strukturierung ihrer Wandungen eine große Oberfläche aufweist, an denen Fängermoleküle wie Antikörper, Aptamermoleküle, DNA-Abschnitte, oder Oligonukleotide kovalent immobilisiert sind. Die in der Probe enthaltenen Analytmoleküle, an denen jeweils ein Markersystem gebunden ist, werden aufgrund der Affinitätsreaktion mit den Fängermolekülen in der Affinitätssäule 18 zurück gehalten. Die weiter strömende Probe gelangt analog des anderen Probeanteils über ein Enzymsubstratdepot 19b in die zweite Messzelle 3c und kommt ebenfalls nach Befüllung der Probeabfallkammer 20b zum Stillstand. Die Konzentration des ungebunden verbliebenen Markers wird analog elektrochemisch detektiert. Die Differenz beider Messungen ist proportional der Analytkonzentration. Anstelle der elektrochemischen Detektion kann bei Verwendung eines optisch klaren Grundsensormaterials auch jeweils eine spektralphotometrische, photometrische oder fluorimetrische Detektion geeigneter Markermoleküle erfolgen.
Aufgrund des geringen erforderlichen Probevolumens, des vorteilhaften Verhältnisses von Probevolumen zu Festphasenoberfläche und des einfachen und streng reproduzierbaren Flüssigkeitshandlings ist diese Ausführungsform besonders zur Realisierung hochsensitiver Affinitätssensoren für den Einmalgebrauch geeignet.
Aufgrund der erfindungsgemäßen Strukturierung der Polymerfolie werden der Grundsensor und die Polymerfolie z. B. unter Verwendung einer doppelseitigen Klebefolie, eines Klebers oder durch Anwendung eines Schweißprozesses form- und kraftschlüssig miteinander verbunden, die unabhängig von der Art und Weise der kraft- und formschlüssigen Verbindung streng reproduzierbare Kammer- und Kanalgeometrien mit Voluminia bis in den unteren Nanoliterbereich ermöglichen. Ein Biosensor ist so kostengünstig und massenproduktionsfähig herstellbar und besonders zur Ausmessung von Substanzen oder Enzymaktivitäten in geringsten Probevolumina geeignet.
Bezugszeichenliste

1: Grundsensor
2: Polymerfolie
3a, b, c: Messkammer
4, 4a, b, c: Wandungsstege
5: vertiefter Fläche
6: doppelseitiger Klebefolie
6a: Aussparung der doppelseitigen Klebefolie
7: Isolationslackschicht
7a, b, c: Messfenster
8a, b: Reagenzschicht
9a, b: Nuten
10: Fugensteg
11a, b, c, 11d, e, f: Arbeits-Gegen- und Referenzelektrodenflächen
12a–f: Zuleitungen
13a–f: elektrische Kontaktflächen
14: Entlüftungskanal
15: Luftaustrittskammer
16: Probeaufnahmekammer
16a: Probeaufnahmespalt
17: Meander-Mischkammer
18: Affinitätssäule
19a, b: Enzymsubstratdepots
20a, b: Probeabfallkammern
21a, b: Verbindungskanäle
22a, b: Luftaustrittsöffnungen

Der erfindungsgemäße mikrofluidische Sensor wird durch nachfolgende Ausführungsbeispiele, und Zeichnungen näher erläutert.
1 Querschnittdarstellung des mikrofluidischen Enzymsensors durch die Messkammer 3a mit Grundsensor 1, Polymerfolie 2, umlaufenden Wandungsstegen 4, vertiefter Fläche 5, doppelseitiger Klebefolie 6, Elektrodenflächen 11a–c und Reagenzschicht 8
2 Explosionsdarstellung eines mikrofluidischen Enzymsensors mit einem Grundsensor 1, Arbeits-Gegen- und Referenzelektrodenflächen 11–c, Zuleitungen, 12a–c, Kontaktflächen 13a–c, Isolationslack 7, Messfenster 7a, Reagenzschicht 8, doppelseitiger Klebefolie 6, Aussparung der Klebefolie 6a und Polymerfolie 2 mit Messkammer 3a, umlaufenden Wandungsstegen 4, gegenüber der Foliennullebene vertiefter Fläche 5, Entlüftungskanal 14 und Luftaustrittskammer 15.
3 Querschnittsdarstellungen der Messkammer 3a in der Polymerfolie 2 mit umlaufendem Wandungsstegen 4 mit ebener 4a, halbkreisförmiger 4b und spitz zulaufender 4c Form der zum Grundsensor 2 weisenden Fläche.
4 Querschnittdarstellung des mikrofluidischen Affinitätssensors durch die Probeabfallkammer 16, mit Grundsensor 1, Polymerfolie 2, umlaufenden Wandungsstegen 4, Nuten 9a, b, und Fugensteg 10.
5 Draufsicht auf den mikrofluidischen Affinitätssensor mit Grundsensor 1 und Polymerfolie 2 mit Probeabfallkammer 16 und Probeaufnahmespalt 16a, Meander-Mischkammer 17, Affinitätssäule 18, Enzymsubstratdepots 19a, b, Messkammern 3b, c, Messfenstern 7b, c mit jeweils Arbeits-Gegen- und Referenzelektroden 11a–c, und 11d–f, elektrischen Kontaktflächen 14a–f, Probeabfallkammern 20a, b, Verbindungskanälen 21a, b, Luftaustrittsöffnungen 22a, b und umlaufend verschweißtem Fugensteg 10 mit Nuten 9a, b.
6 Explosionsdarstellung eines mikrofluidischen Affinitätssensors aus einem Grundsensor 1 mit Arbeits-Gegen- und Referenzelektrodenflächen 11a–c, und 11d–f, Zuleitungen, 13a–c, und 13d–f, elektrische Kontaktflächen 14a–c und 14d–f, Isolationslack 7, Messfenstern 7b, c und Polymerfolie 2 mit Probeabfallkammer 16, und Probeaufnahmespalt 16a, Meander-Mischkammer 17, Affinitätssäule 18, Enzymsubstratdepots 19a, b, Messkammern 3b, c, Probeabfallkammern 20a, b, Verbindungskanälen 21a, b, Luftaustrittsöffnungen 22a, b und umlaufend verschweißtem Fugensteg 10 mit Nuten 9a, b.
Beispiel 1
Erfindungsgemäßer mikrofluidischer Einmalgebrauchssensor zum Nachweis von Glucose. Zur Erläuterung dienen 1 bis 3.
Auf einen PET-Kunststoffsupport mit einer Dicke von 0,25 mm werden zur Strukturierung einer amperometrischen Drei-Elektrodenanordnung in Zehnernutzen mittels Siebdruck nacheinander Elektrodenflächen 11a–c, Zuleitungsbahnen 12a–c und Kontaktflächen 13a–c unter Verwendung von Acheson PE 401-Kohlenstoffpaste (Acheson NL) und, Isolationslack 12 (240 SB, ESL Europe) wie in 2 dargestellt aufgedruckt und jeweils bei 70°C gehärtet. Die Einzelflächen von Arbeits-, Referenz- und Gegenelektrode 11a, b, c, die nacheinander angeordnet sind, betragen jeweils 1 mm². Der Isolationslack 7 weist im Bereich der Elektrodenanordnung eine Aussparung von 1 mm × 3,5 mm (B × L) auf, so dass diese Aussparung, die das Messfenster 7a darstellt, die Elektrodenflächen in ihrer Breite definiert begrenzt.
Mittels eines Dispensers werden 0,3 μl einer Reaktionslösung bestehend aus 2 Units Glucoseoxidase (Roche), 140 μg Ferricyanid (Sigma), 1,6 μg Triton X 100 (Sigma) und 1,5 μg mikrokristalliner Zellulose (Aldrich) als Reaktionsschicht 8 in 0,02 μl Dispensierschritten gleichmäßig über das gesamte Messfenster 7a verteilt aufgetragen.
Als Polymerfolie wird eine Polycarbonat – Folie von 0,25 mm Dicke verwendet, die mittels einer Stahlpatrize in einem Heißprägeprozess strukturiert wird. Die als Zehnernutzen hergestellte Patrize weist Erhebungen für eine Messkammer 3a, einen Entlüftungskanal 14, einen auf Nullebene verbliebenen Wandungssteg 4 sowie für eine umlaufend vertiefte Fläche 5 und einen Luftaustrittskammer 15 auf. Die Erhebung auf der Patrize für die vertiefte Fläche 5 betrifft die gesamte Fläche mit Ausnahme der Flächen, die soeben beschrieben wurden. Dementsprechend wurden Kanäle und Kompartimente mit folgenden Geometrien realisiert: Messkammer 3a: 30 μm × 1000 μm × 3500 μm (H × B × L), Entlüftungskanal 14: 50 μm × 100 μm × 1 mm (H × B × L) und Luftaustrittskammer 15: 0,250 mm × 3 mm × 25 mm (H × B × L). Die auf Foliennullebene verbliebenen Wandungsstege 4 sind 100 μm breit und die sich anschließende vertiefte Fläche 5 um 50 μm gegenüber der Foliennullebene vertieft.
Eine doppelseitige Klebefolie 6 mit einer Dicke von 50 μm erhält im Bereich der Messfenster durch Ausstanzung Aussparungen 6a mit den Abmaßen von 1,2 mm × 3,6 mm. Nach entsprechend kontrolliertem Auflegen und Laminieren von Klebefolie 6 und geprägter Polymerfolie 2 auf dem Grundsensor 1 passt die Messkammer 3a einschließlich ihrer Wandungsstege 4 jeweils in die Klebefolienausstanzung 6a. Nach einer Zeit von 24 h hat die Klebefolie die geprägte Folie und den Grundsensor soweit angezogen, dass der umlaufende Steg 4 dicht auf dem Isolationslack 12 des Grundsensors aufsitzt. Danach wird der Nutzen durch Schneiden in zehn Sensoren mit Abmaßen von 6 mm × 36 mm (B × L) vereinzelt.
Das resultierende erforderliche Probevolumen beträgt 105 nl.
Zur Durchführung von Reproduzierbarkeitsuntersuchungen wird der Sensor über die Kontaktbahnen 14a–c an eine potentiostatische Ausleseeinheit (Handmessgerät SensLab) mit einer Polarisationsspannung von +450 mV angeschlossen.
Durch Kontakt der stirnseitigen Messkammeröffnung mit einem Bluttropfen wird die Messkammer 3a in weniger als 0,15 s befüllt. Die Probe löst die Reagenzschicht 8 auf und generiert aufgrund der enzymatisch-elektrochemischen Reaktion einen Messstrom, der über der Zeit von 5 sec integriert wird und der in der Blutprobe enthaltenen Glucosekonzentration proportional ist. Die Reproduzierbarkeit (VK) von zehn nacheinander durchgeführten Einzelmessungen mit venösem, EDTA-stabilisiertem Vollblut beträgt bei einer Blutglucosekonzentration von 4,8 mmol/L 1,8%.
Beispiel 2
Erfindungsgemäßer mikrofluidischer Einmalgebrauchssensor zum Nachweis von N-Acyl-Histamin. Zur Erläuterung dienen 4 bis 6.
Auf einem PET-Kunststoffsupport mit einer Dicke von 0,35 mm werden zur Strukturierung von zwei amperometrischen Drei-Elektrodenanordnungen auf Zehnernutzen mittels Siebdruck nacheinander Elektrodenflächen 11a–f, Leitbahnen 12a–f und Kontaktflächen 13a–f unter Verwendung von Acheson PE 401-Kohlenstoffpaste (Acheson NL) und, Isolationslack (240 SB, ESL Europe) wie in 5 dargestellt aufgedruckt und jeweils bei 70°C gehärtet.
Die Einzelflächen von Arbeits-, Referenz- und Gegenelektrode 11a–f, die nacheinander angeordnet sind, betragen jeweils 1 mm². Der Isolationslack 7 weist jeweils im Bereich der Elektrodenanordnungen eine Aussparung von 1 mm × 3,5 mm (B × L) auf, die das Messfenster 7b, c darstellt. Diese Aussparung, begrenzt die Elektrodenflächen in ihrer Breite definiert.
Mittels eines Dispensers werden jeweils 0,2 μl einer 0,5%igen Tritonlösung X100 in 0,02 μl Dispensierschritten gleichmäßig über das gesamte Messfenster 7b, c verteilt aufgetragen und bei 50°C 10 min getrocknet.
Als Polymerfolie wird eine Polystyren-Folie von 0,25 mm Dicke verwendet, die mittels einer Stahlpatrize in einem Heißprägeprozess strukturiert wird. Die als Zehnernutzen hergestellte Patrize weist für jeden Nutzen erhöht strukturierte Geometrien wie in 5 und 6 dargestellt für eine Probeabfallkammer 16, eine Meander-Mischkammer 17, eine Affinitätssäule 18, zwei Enzymsubstratdepots 19a, b, zwei Messkammern 3b, c, zwei Probeabfallkammern 20a, b, Verbindungskanäle 21a, b, Probeabfallkammern 20a, b, Luftaustrittskanäle 22a, b sowie einen um die vertieften Geometrien 3b, c und 16–22a, b umlaufenden Fugensteg 10 mit Nuten 9a, b auf. Dementsprechend wurden Kanäle und Kompartimente mit folgenden Volumina realisiert: Probeabfallkammer 16: 4 mm³, Meander-Mischkammer 17: 1,5 mm³, Affinitätsreaktionskammer 18: 1,5 mm³, je Enzymsubstratdepotkammer 19a, b: 0,15 mm³, Messkammer 3b, c je: 0,2 mm³, je Probeabfallkammer 20: 1 mm³.
In der Probeabfallkammer 16 werden 1,5 μl einer 0,5%igen Tritonlösung X 100, in der Meander-Mischkammer 17 β-Galactosidase-Histaminkonjugat (0,2 μg/ml, β-Galactosidase, Calbiochem), und in die Enzymsubstartdepotkammern 19a, b jeweils 0,5 μl p-Aminophenylβ-D-galactosidlösung (0,5 mM mit 0,5% Gelatine) aufgetragen. Nach Zwischentrocknung bei 30°C über 40 min wird in die Affinitätssäule 18 1,2 μl anti-Kaninchen Antiserum (Ziege) dosiert, das über 30 min bei 30°C adsorptiv an der Kunststoffoberfläche gebunden wird. Die Affinitätssäule wird im Anschluss vorsichtig mit einem Blockierungspuffer gespült und wieder getrocknet.
Die auf diese Weise präparierte Polymerfolie 2 wird derart über dem Grundsensor fixiert, das die beiden Messfenster 12b, c jeweils unterhalb der Messkammern 3b, c positioniert werden und die Probeabfallkammer 16 an der Stirnseite des Grundsensors 1 abschließt. Mittels Bündellaser wird der umlaufende Fugensteg 10 mit der Isolationsschicht 8 des Grundsensors verschweißt, so dass diese bis auf den Probeeintrittspalt 16a und die Luftaustrittsöffnungen 22a, b der Probeaabfallkmmern 20a, b flüssigkeitsdicht sind. Durch die Schweißverbindung sitzen auch die umlaufenden Wandungsstege 4 entlang der äußeren Konturen der Kammern und Kanäle dicht auf dem Isolationslack 7 des Grundsensors, so dass ein Austreten von Probe unter den Wandungsstegen hindurch vermieden wird.
Zur Durchführung der Histaminbestimmung wirden die beiden Dreielektrodenanordnungen der Messfenster über die Kontaktbahnen 13a–c und 13d–f jeweils an eine potentiostatische Ausleseeinheit (Handmessgerät SensLab) mit einer Polarisationsspannung von +200 mV vs. interner Referenzelektrode angeschlossen.
Durch Kontakt der Probe mit dem Probeaufnahmespalt 16a der Probeabfallkammer 16 erfolgt eine rasche und definierte Aufnahme der Probe, die zur passiven bzw. kapillarkraftgetriebenen Befüllung der nachfolgenden Kanäle und Kammern bzw. Kompartiments führt.
Mit der Befüllung der Meander-Mischstrecke 17 erfolgt eine Auflösung des darin enthaltenen, mit β-Galactosidase markierten Acetyl-Histamins, das bei Anwesenheit der Probe in der Lösung frei diffusionsfähig ist. Dabei erfolgt eine Vermischung zwischen dem markierten Acetyl-Histamin und dem Acetyl-Histamin der Probe. Ein Teil der Probe gelangt über den ersten Verbindungskanal 21a in das Enzymsubstratdepot 19a, wo das darin enthaltene p-Aminophenyl-β-D-galactosid aufgrund der Gelatineschicht verzögert aufgelöst wird und eine Umsetzung durch β-Galactosidase, das Markerenzym des Konjugats, beginnt. Die Probe durchläuft die Messzelle und kommt nach Befüllung der Probeabfallkammer 20a zum Stillstand. Die Konzentration des während der enzymatischen Hydrolyse abgespaltenen elektrochemisch aktiven p-Aminophenols wird in der ersten Messkammer 3b an der Dreielektrodenanordnung des ersten Messfensters 7b amperometrisch über ein definiertes Zeitintervall gemessen und dient als Referenz- und Funktionskontrollwert.
Der andere Teil der Probe gelangt über den Verbindungskanal 21b in die Affinitätssäule 18, die aufgrund ihrer Strukturierung eine große Oberfläche aufweist und auf der die Fänger-Antikörper adsorptiv immobilisiert sind. Das in der Probe enthaltene Acetyl-derivatisierte Histamin geht eine kompetitive Reaktion mit dem β-Galactosidase-Acetyl-Histaminkonjugat um die Bindungsstellen der in der Affinitätsreaktionskammer 18 immobilisierten Antikörperschicht ein.
Je mehr Acetyl-Histamin in der Probe enthalten ist, um so weniger Konjugat wird gebunden.
Die weiter strömende Probe und mit ihr das nicht gebundene β-Galactosidase-Histaminkonjugat gelangt über den Verbindungskanal 21b in das zweite Enzymsubstratdepot 19b. Das vorliegende p-Aminophenyl-β-D-galactosid wird gelöst und es beginnt die enzymatische Hydrolyse zu p-Aminophenol. Die Probe tritt unmittelbar darauf in die zweite Messkammer 3c ein und kommt nach Befüllung der zweiten Probeabfallkammer 21b zum Stillstand.
Die β-Galactosidase des Konjugats, das in der Affinitätssäule 18 keine Bindung eingehen konnte und mit dem Probestrom bis in die zweite Messzelle 3b gelangt ist, bildet analog zum Referenzkanal das elektrochemisch aktive p-Aminophenol, das über die Dreielektrodenanordnung des zweiten Messfensters 7c in der Messkammer 3c amperometrisch detektiert wird. Die Differenz zwischen Messungen in Messkammer 3c und 3b ist proportional der Analytkonzentration.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

EP 0274215 A1 [0010]
DE 10211204 A1 [0015]
EP 1225477 A1 [0024]

Claims

Mikrofluidischer Sensor, der einen Grundsensor (1) und eine strukturierte Polymerfolie (2) aufweist, wobei die dem Grundsensor (1) zugewandte Polymerfolienfläche unterschiedlich vertieft strukturierte Geometrien gegenüber der Foliennullebene besitzt, die parallel oder nacheinander angeordnet sind, dadurch gekennzeichnet, dass die vertieft strukturierten Geometrien Probeaufnahme-, Probeaufbereitungs-, Inkubations-, Puffer-, Misch-, Reaktions-, Reagenzdepot-, Mess- Abfall-, und Entlüftungskammern, Verteiler und/oder Verbindungskanäle (3, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21) bilden, deren äußere umlaufende Konturen als schmale umlaufende Wandungsstege (4) in Höhe der Nullebene der Folie (2) und mit einer Breite zwischen 50 μm und 500 μm ausgebildet sind; denen sich außen eine vertiefte Fläche (5) oder eine im Abstand von 0,1 mm bis 1,0 mm folgende umlaufende Fugenanordnung anschließt, die der Verbindung von Grundsensor (1) und Polymerfolie (2) dienen.
Mikrofluidischer Sensor nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass die Folie (2) eine Dicke zwischen 100 μm und 250 μm aufweist.
Mikrofluidischer Sensor nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die gegenüber der Foliennullebene vertieft strukturierten Geometrien Tiefen zwischen 0,5 μm und 150 μm aufweisen und ggf. miteinander in Verbindung stehen.
Mikrofluidischer Sensor nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die zum Grundsensor (1) weisenden Flächen der umlaufenden Wandungsstege (4a, b, c) eine ebene, halbkreisförmige oder spitz zulaufende Form aufweisen.
Mikrofluidischer Sensor nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die sich anschließende, gegenüber der Nullebene der Folie (2) vertiefte Fläche (5) eine Tiefe zwischen 20 μm und 100 μm aufweist und zur bündigen Aufnahme. einer doppelseitigen Klebefolie (6) mit einer Dicke zwischen 20 μm und 100 μm dient.
Mikrofluidischer Sensor nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, das die umlaufende Fugenanordnung (10) aus zwei Nuten (9, a, b) mit einem dazwischen befindlichen Steg (10) besteht.
Mikrofluidischer Sensor nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, das der Steg (10) zwischen den Nuten (9a, b) 50 μm bis 500 μm breit ist und gegenüber der Nullebene der Folie (2) eine Höhe zwischen –1 μm und 5 μm aufweist.
Mikrofluidischer Sensor nach Anspruch 6 und 7, dadurch gekennzeichnet, das die Nuten (9a, b) zwischen 50 μm und 1000 μm breit und gegenüber der Nullebene der Folie um 10 μ bis 150 μm vertieft sind.
Mikrofluidischer Sensor nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass als Grundsensor (1) ein planarer elektrochemischer Sensor oder ein planares, optisch durchlässiges Supportmaterial dient und als Polymerfolie (2) eine Folie aus Polycarbonat, Polyamid, Polystyren oder einem Acrylat.
Mikrofluidischer Sensor nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Strukturierung der Polymerfolie (2) mittels Heißprägeverfahren, eines photolithographischen Verfahrens, Laserablation, Mikrospritzguss oder Tiefziehverfahren erfolgt.