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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung eines hämatokritabhängigen Messsignals bei der Bestimmung eines Analyten aus Vollblut unter Verwendung von enzymatisch-voltammetrischen Einmalgebrauchs-Sensoren, das bei Abschluss der Konzentrationsmessung von Elektronenmediator-enthaltenden Einmalgebrauchssensoren innerhalb eines kurzen Intervalls unmittelbar nach einer Änderung der Polarisationsspannung in die entgegengesetzte Richtung erhalten wird. Das erfindungsgemäße Verfahren ist besonders geeignet zur Hämatokritkorrektur von Konzentrationswerten, die mittels enzymatisch-voltammetrischer Einmalgebrauchs-Sensoren bestimmt werden.
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Stand der Technik
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Vollblutmessungen mittels enzymatisch-voltammetrischer Einmalgebrauchs-Sensoren werden durch eine Reihe von Parametern, die sowohl aus Umgebungsbedingungen als auch der Probematrix selbst resultieren, beeinflusst. Eine wesentliche Ursache für fehlerhafte Messungen kann vom Hämatokrit einer Probe ausgehen. Der Hämatokrit (Hct) stellt den Volumenanteil an Erythrozyten im Blut dar, der ca. 99% der zellulären Bestandteile im Vollblut ausmacht. Bei gesunden Erwachsenen liegt der Hämatokrit zwischen 40% und 48% (Männer) bzw. 36–42% (Frauen). In Abhängigkeit von der genetischen Veranlagung eines Probanden, seines Alters, seines Geschlechts, seines Gesundheitszustandes und seiner körperlicher Aktivität können jedoch auch Werte zwischen 20% und 70% auftreten.
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Erythrozyten sind ovalförmige Zellen mit einem Durchmesser von 2 bis 30 μm, die mit 74,6 g/dl (W/V) einen deutlich geringeren Wassergehalt als Plasma (94,2 g/dL, W/V) aufweisen (Jones et al. Scand J Clin Lab Invest 50 (1990), 77–80). Beispielsweise führt dieser Sachverhalt bei der Ausmessung von Glucose, die die Erythrozytenmembran barrierefrei durchdringen kann, im Vollblut, dessen Hct im Normalbereich liegt, zu einem um ca. 10% niedrigeren Messwert im Vergleich zur Plasmamessung (Niederau, CH. M., Diabetes und Stoffwechsel 7(1998)3, 96–101).
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Handelt es sich um Metabolite, die über Transporterproteine in die Erythrozyten gelangen, so dass zwischen deren Konzentration im Plasma und in den Erythrozyten eine Differenz liegt, kann die Abweichung deutlich größer sein. Beispielsweise wird für Laktat beschrieben, das die Konzentration in den Erythrozyten zwischen 50% und 70% des Plasmawertes beträgt.
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Bei der Konzeption von Einmalgebrauchssensoren wird für den normalen Hämatokritbereich der Messwert auf den Vollblutwert kalibriert, so dass Hct-bedingte Messfehler innerhalb eines definierten, zuvor ermittelten Konzentrationsbereiches liegen und in der Spezifikation ausgewiesen werden.
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Bei Hämatokritwerten, die außerhalb des normalen Bereichs liegen, kann dieser durch das Erythrozyten-volumen bedingte Messfehler jedoch erheblich anwachsen.
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Darüber hinaus trägt der Hct bei voltammetrischen Messungen von Einmalgebrauchssensoren, die eine Oxidoreduktase zur spezifischen Reaktion mit dem Zielanalyten und einen Redoxmediator, der zum Elektronentransfer zwischen der Oxidoreduktase und der Arbeitselektrodenoberfläche aufweisen, zu weiteren fehlerverursachenden Effekten bei: (i) Aufgrund der im Vergleich zum Plasma geringeren Leitfähigkeit der Erythrozyten führt die stationäre Messung in einer elektrochemischen Messzelle zur Erhöhung des Messzellenwiderstandes und damit zu einem geringeren Strom. Dieser Effekt kann durch die Nutzung einer potentiostatischen Dreielektrodenanordnung weitgehend kompensiert werden. (ii) Aufgrund des „Partikelcharakters” der Erythrozyten tritt eine Behinderung der Diffusionsprozesse ein, die sowohl das enzymatische Substrat bzw. den Analyten, als auch den Elektronenmediator, der die Elektronen für oder aus der enzymatischen Redoxreaktion zwischen Enzym und Elektrodenoberfläche transportiert, betreffen. Analoges gilt für den entsprechenden Stofftransport an der Bezugs- bzw. Gegenelektrode. Infolge der Diffusionsbehinderung wird im Vergleich zur Plasmamessung ein geringerer Faradaystrom generiert.
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Demzufolge wird der Messwert einer Analytkonzentration von Proben mit hohem Hämatokritwert zu niedrig und von Proben mit niedrigem Hämatokritwert zu hoch ausfallen.
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Deshalb gibt es eine Reihe technischer Lösungen, um diese durch die Erythrozyten bedingten Fehlerquellen bei der Ausmessung von Vollblut zu erfassen und zu kompensieren oder zumindest zu minimieren.
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In der Patentschrift
US 6,645,358 (Roche) werden zur Kompensation des Hämatokritwertes zwei Elektroden der amperometrischen Messkette parallel zur Gleichspannung mit einem Wechselstromanteil beaufschlagt um eine Impedanzmessung zu ermöglichen. Aus der Admittanz und/oder dem Phasenwinkel, die erforderlichenfalls bei unterschiedlichen Frequenzen ermittelt werden, wird ein Faktor für die Hämatokritabhängigkeit ermittelt und zur Korrektur der amperometrischen Messung verwendet.
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Die US-Patentanmeldung US 2012/0111739 (Pasqua et al.) beschreibt die Durchführung zweier Impedanzmessungen in der Probemesskammer eines Disposables, deren Frequenzen sich um den Faktor zwei bis 100 unterscheiden können und die zweite Frequenz größer als 20 KHz ist. Die Impedanzmessung erfolgt an einer Zwei-Elektrodenanordnung, die in der Nähe der Probeaufnahmeöffnung angeordnet ist, so dass unmittelbar mit dem Probeeintritt und vor dem Auflösen des Reagenzgemisches eine erste Impedanzmesssung und nach dem Auflösen des Reagenzgemisches eines zweite Impedanzmessung erfolgt. Aus den beiden Messwerten wird anhand empirisch ermittelter Funktionen, die auch von Zellparametern und dem Reagenzsystem abhängig sind, eine multipler Regressionsanalyse durchgeführt und damit der Hämatokritwert errechnet, der zur Kompensation des analytabhängigen Nutzsignals dient.
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Die technische Lösung nach
US 2011/0139634 (Taidoc) sieht in einer Messkammer zwei Messzonen mit jeweils zwei nacheinander angeordneten Elektrodenpaaren vor, von denen die ersten beiden mit einer analytdetektierenden Reagenzschicht bedeckt sind und eine amperometrische Zweielektrodenanordnung bilden. Dieser Messzone folgt ein separierendes Element in Form einer Polymerschicht, der sich dann die zweite Messzone mit dem zweiten Elektrodenpaar anschließt. Letztere werden mit einer Wechselspannung betrieben und dienen zur Messung der Leitfähigkeit der Probe. Der hämatokritabhängige Leitfähigkeitsmesswert wird zur Kompensation der hämatokritabhängigen amperometrischen Konzentrationsmessung verwendet.
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US Patent US 7,351,375 (Arkray) offenbart eine Sensoranordnung mit Kapillarspaltmesskammer, bei der die zwei seitlichen Spacerwandungen aus leitfähigem Material bestehen, an die eine Wechselstrommessung angelegt wird, um die Leitfähigkeit der Probe und damit den Hämatokritwert zu bestimmen, der zur Korrektur der analytabhängigen amperometrischen Messung dient.
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Das Patent
US 6,287,451 (Nova Biomedical) beschreibt eine Kapillarmesskammer mit drei nacheinander angeordneten identischen kreisförmigen Elektroden, die zwei Arbeitselektroden, und die Bezugselektrode darstellen und über einen darüber angeordneten spaltartigen Kanal mikrofluidisch miteinander verbunden sind. Eine der Arbeitselektroden und die Bezugselektrode weisen ein identisches Reagenzgemisch auf, so dass nach dem Aufziehen der Probe über den Verbindungskanal zwischen beiden Elektroden die hämatokritabhängige Leitfähigkeit der Probe gemessen wird, die zur Korrektur der amperometrischen Messung genutzt wird.
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Andere technische Lösungen nutzen Pulspotential- und Potentialscanverfahren, spezielle Elektrodenanordnungen einer Messzelle sowie zusätzliche Redoxindikatoren, um diffusionsabhängige Einflüsse bei voltammetrischen Messungen in Blutproben, wie sie vom Hämatokrit ausgehen, zu quantifizieren.
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Die Patentanmeldung US 2005/017009,
WO 2005/114164 (Bayer) nutzt diffusionsbestimmende Scanphasen während eines zyklischen Scans, um den Hämatokritanteil zu ermitteln, beispielsweise durch die Bestimmung des Verhältnisses aus Peakstrom und Plateaustrom, das analytunabhängig ist und im Wesentlichen nur noch von der Komponente der Probe abhängig ist, die diffusionsbestimmend ist.
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In
WO 2011/079937 , (Roche) erfolgt unter Verwendung der Differenzpulsvoltammetrie für die Konzentrationsbestimmung in Blut die Auswertung der resultierenden Stromkurven noch unterhalb des diffusionslimitierenden Peakstroms, so dass der Diffusionseinfluss des Hämatokrit auf das Messergebnis weitgehend ausgeschlossen werden kann. Es werden dabei insbesondere kurze hochfrequente Pulse angelegt, um die Diffusionsschicht der Reagenzschicht aufrecht zu erhalten.
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Schließlich ist die Patentanmeldung US 2010/0206750 (Abbott) bekannt, die Square Wave Voltammetrie zur Detektion einer redoxmediierten enzymatischen Nachweisreaktion in Blutproben nutzt und dabei einen zusätzlichen Redoxmediator verwendet. Dessen formales Redoxpotential liegt weit genug von dem des Indikationsmediators entfernt, so dass der Mediator weder mit dem Indikationsmediator noch mit der Oxidoreduktase eine Reaktion eingehen kann. Dieser Redoxmediator agiert als ein interner Standard, der ebenso wie das signalgenerierende System von Hämatokrit und Temperatur über die Diffusionsrate beeinflusst wird, der jedoch substratunabhängig detektiert wird und damit eine Hämatokritinformation erhalten werden kann.
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Die Mobilität bzw. die Diffusionsfähigkeit des Redoxmediators, der wesentlich durch den Hct beeinflusst wird, wird in dem Patent
US 7,964,089 (Agamatrix) wie folgt ermittelt: Nach der voltammetrisch-enzymatischen Messung der Analytkonzentration wird die Polarisationsspannung abgeschaltet und der Spannungsabfall, der wesentlich von der Mobilität des Redoxmediators bestimmt wird, potentiometrisch zwischen Arbeits- und Bezugselektrode verfolgt. Die Geschwindigkeit des Abfalls ist damit eine Größe zur indirekten Bestimmung des Hämatokritwertes, der zur Korrektur der Konzentrationsmessung dient und mit dessen Hilfe ggf. auch eine Unterscheidung zwischen Kontrolllösung und Probe möglich ist. In dem Patent
US 8,088,271 (Panasonic (Arkray) wird die Mobilität des Redoxmediators bestimmt, in dem der Redoxmediator auf die Bezugselektrode aufgetragen wird und nach Anlegen einer gegenüber der Bezugselektrode negativen Spannung an der Arbeitselektrode der resultierende Reduktionsstrom gemessen wird. Der Messstrom hängt ausschließlich davon ab, wie schnell der Redoxmediator zur Arbeitselektrode diffundieren kann. Je kleiner der Strom ausfällt, desto größer ist die Diffusionsbarriere bzw. desto höher ist der Anteil der Erythrozyten in der Probe, so dass ein hämatokritabhängiges Signal erhalten wird, das zur Korrektur des eigentlichen konzentrationsabhängigen Messsignals genutzt werden kann.
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Anhand der hämatokritbedingten Viskositätsänderung der Probe, die zu entsprechend unterschiedlichen Befüllzeiten der Messkammer eines Kapillarspaltsensors führen kann, soll in dem Patent
US 8,083,925 ein hämatokritabhängiges Signal ermittelt werden, was insbesondere bei schwankenden Umgebungstemperaturen fehleranfällig wird.
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Die US Patentanmeldung US 2007/0235346 (Home Care) beschreibt neben der Verwendung des für die enzymatische Redoxreaktion erforderlichen Elektronenmediators die Nutzung eines zweiten Redoxmediators, der nicht mit dem ersten reagiert und sich in seinem formalen Redoxpotential um mindestens 200 mV vom ersten Redoxmediator unterscheidet. Die amperometrische Detektion der Reduktion oder Oxidation dieses Mediators wird dann wesentlich von seiner Diffusionsfähigkeit in der Messzelle abhängen, die von der Hämatokritkonzentration bestimmt wird. Das resultierende hämatokritabhängige Stromsignal, das mittels Chronoamperometrie, SWV, DPV oder CV quantifiziert und nach einem empirisch ermittelten Algorithmus Hct-kalibriert wird, dient noch zur Kompensation der Hämatokritabhängigkeit des analytabhängigen Signals. Die Patentanmeldung geht davon aus, dass der Aufladungsstrom unmittelbar nach Anlegen der Polarisationsspannung wesentlich durch den Hämatokrit bestimmt wird. Wird dieser Wert in Relation zum sich anschließend einstellenden Faradaystrom durch Quotientenbildung gesetzt, erhält man ebenfalls eine hämatokritabhängige Größe.
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Andere amperometrische Messprozeduren, die aus technischen Lösungen bekannt sind, werten Übergangszustände nach dem Anlegen der Polarisationsspannung, die in Amplitute und Vorzeichen geändert wird, aus, um neben dem analytabhängigen Signal den Hct-Anteil zu ermitteln.
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Das Patent
US 6,475,372 (Lifescan, 2002) beschreibt ein Verfahren, bei dem nacheinander zwei in Ihrem Vorzeichen entgegengesetzte Polarisationsspannungen über eine Zeitdauer von 1 bis 20 s und angelegt werden, wobei die erste negativ und die zweite positiv ist. Aus den resultierenden „Transient” strömen, die von der Analytkonzentration und der elektrochemischen Zellkonstanten und damit vom Hämatokrit abhängig sind, wird anhand eines dreidimensionalen Kalibriergraphen hämatokritkorrigierte Analytkonzentration ermittelt. Im Einzelnen liegen dem Graphen das Verhältnis aus negativen und positiven Stromwerten und Analytkonzentrationskurven, die gegen ein Referenzsystem kalibriert ist, zugrunde, die jeweils bei unterschiedlichen Hämatokritwerten aufgenommen wurden. Die hämatokritabhängige Information wird aus dem Sachverhalt gewonnen, dass unmittelbar nach dem Anlegen einer geeigneten Polarisationsspannung der resultierende Strompuls sich zunächst wesentlich aus Ladestrom und einem Faraday-Stromanteil zusammensetzt und gegen Ende des Pulses der Faraday-Anteil überwiegt, der durch die Cotrell-Gleichung charakterisiert wird. Da der effektive Diffusionskoeffizient des Analyten bzw. eines bei der Indikationsreaktion involvierten Mediators vom Hämatokrit beeinflusst wird, kann aus einer geeigneten Verhältnisbildung von Stromabschnitten des anfänglichen Signalstromes bei einer bestimmten Polarisationsspannung oder zwei nacheinander angelegten Polarisationsspannungen mit entgegengesetzten Vorzeichen ein hämatokritabhängiger Wert ermittelt werden, der zur Korrektur des Nutzsignals verwendet werden kann. Da jedoch der Hämatokriteinfluss in Abhängigkeit von der Höhe des anodisch generierten Stroms des Analyten unterschiedlich ausfällt, ist die Analytkonzentration bei der Berechnung der Hämatokritkorrektur zusätzlich zu berücksichtigen. Aus diesem Sachverhalt, der bei jeder elektrochemischen Zellkonstanten zu beachten ist, resultiert die Notwendigkeit einer dreidimensionalen Kurvenschar.
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In
WO 2008/040998 (Lifescan Scotland) wird zum Erhalt einer Hct-unbahängigen Analytmessung mittels einer amperometrische Zweielektrodenanordnung, das aus einem Mikroelektrodenarray als Arbeitselektrode und einer Bezugselektrode besteht, die Polarisationsspannung in Intervallen angelegt, die bis zu dreimal und mit einer Dauer von jeweils zwischen 0,1 s und 1 s und dazwischenliegenden „Erholphasen” ablaufen. Die Polarisationsspannung wird nahe 0 mV über eine Dauer von jeweils 0,05 s und 1 s angelegt. Der jeweils resultierende chronoamperometrische Stromkurvenabschnitt wird aufgezeichnet, wobei die Stromwerte am Ende des jeweiligen Intervalls w zur Auswertung verwendet werden, in dem sie logarithmisch über den Logarithmus der Messzeiten aufgetragen werden. Es wurde gefunden, dass der resultierende Schnittpunkt mit der Ordinate einem nahezu hämatokritunabhängigen Nutzsignal entspricht.
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Eine weitere Vorgehensweise unter Verwendung dieser amperometrischen Elektrodenanordnung und wie in der Patentanmeldung
US 2010/0219084 (Lifescan Scotland) erläutert, zielt auf die Messung eines sogenannten Teststromwertes unmittelbar nach Zuschaltung der Polarisationsspannung und nach Erreichen eines steady state Stromverlaufs ab. Aus der Auftragung der jeweiligen Quotienten über der inversen Quadratwurzel der Zeit wird ein linearer Anstieg erhalten, der dem Diffusionskoeffizienten entspricht und zur hämatokritkompensierten Berechnung des Analytwertes verwendet wird.
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Ein generelleres Vorgehen, das jedoch auch die oben beschriebenen Effekte nutzt, beinhaltet
EP 2098857 ,
US 2009/0184004 (LifeScan). Es werden an eine amperometrische Zwei-Elektrodenanordnung aus Anode und Kathode, die planparallel gegeneinander angeordnet sind und der resultierende Spalt die Messkammer darstellt, in zwei aufeinander folgenden Intervallen Polarisationsspannungen entgegengesetzten Vorzeichens angelegt. Die Höhe der als Testpotential bezeichneten Spannung, die zwischen –100 mV und –600 mV bzw. +100 mV und +600 mV liegt, soll gerade eine partielle Reduktion oder Oxidation an den Elektrodenflächen ermöglichen. Es wird während des ersten Intervalls eine Spannung angelegt, die an der zweiten Elektrode eine partielle Oxidation des reduzierten Mediators verursacht, d. h. die erste Elektrode ist kathodisch wirksam und reduziert den Mediator. Während des zweiten Intervalls erfolgt an der ersten Elektrode eine partielle Oxidation des Mediators, der ggf. durch die enzymatische Indikationsreaktion reduziert wurde. Demzufolge werden beispielsweise bezogen auf die erste Elektrode zunächst ein negatives und dann ein positives Potential angelegt. Aus dem Signalstrom, der aus einem der beiden Intervalle resultiert, wird zunächst ein vorläufiger Messwert für die Analytkonzentration ermittelt. Im Anschluss wird die hämatokritabhängige Fehlerquelle ermittelt und der Analytwert unter Berücksichtigung bereits ermittelter Faktoren wie unterschiedliche Konzentrationsbereiche für Analyt- und Hämatokritwerte und bewertender Kriterien für hohe oder niedrige Analytkonzentration bei hohen oder niedrigen Hämatokritwerten, denen empirisch ermittelte, unterschiedliche Funktionen zugrunde liegen, korrigiert.
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In der technischen Lösung
US 2010/0206749 , (Philosys, SK) werden ebenfalls zwei aufeinander folgende Polarisationsspannungen mit gleicher Polarität an eine amperometrische Zwei-Elektrodenanordnung angelegt, wobei nach Triggerung innerhalb der ersten Sekunde eine niedrige anodische Spannung zwischen 10 mV und 150 mV und im Anschluss eine höhere anodische Spannung zwischen 250 mV und 350 mV angelegt wird. Der resultierende Strompuls 450 ms bis 530 ms nach Triggerung wird zur Bestimmung des Hämatokrit ausgewertet und der darauffolgende Puls mit höherer Polarisationsspannung dient der Bestimmung eines vorläufigen Analytkonzentrationswertes.
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Die Bestimmung des Hämatokrits erfolgt unter Nutzung einer zuvor mit definierten Analyt- und Hämatokritkonzentrationen ermittelten Kurvenschar. Für drei vorbestimmte Konzentrationsabschnitte, die den gesamten analytisch relevanten Bereich des Analyten abdecken, wurden jeweils unterschiedliche, empirisch ermittelte Gleichungen ermittelt, die zur Hämatokritkorrektur der gemessenen Analytkonzentration eingesetzt werden.
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Nachteilig bei den zuletzt beschriebenen Verfahren ist, dass komplexe Berechnungen unter Nutzung empirisch ermittelter dreidimensionaler Kurvenscharen zugrunde liegen, die den diffusionsabhängigen Faraday-Stromanteil des Signalstromes bzw. die Höhe der Analytkonzentration mit zu berücksichtigen haben.
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Aufgabe der Erfindung ist es deshalb, diese Nachteile zu überwinden und ein Verfahren zur Ermittlung eines Hct-abhängigen Messsignals bereitzustellen, mit dessen Hilfe in einfacher Weise eine Hct-Korrektur des Konzentrationswertes erfolgen kann. Die Aufgabe der Erfindung wird gemäß des unabhängigen Anspruches 1 gelöst. Die Unteransprüche stellen bevorzugte Ausführungsvarianten dar.
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Überraschend wurde gefunden, dass innerhalb eines bestimmten Zeitintervalls ein Hct-abhängiges und weitgehend analytunabhängiges Stromsignal, erhalten wird, wenn an einer Zwei- oder Drei-Elektrodenanordnung eines enzymatisch-amperometrischen Einmalgebrauchs-Sensors mit einem Redoxmediator, dessen Konzentration in der Messkammer im Überschuss, vorzugsweise doppelt bis zehnfach konzentrierter, als die höchste in der Probe vorkommende Analytkonzentration ist, nach dem Ende der Messprozedur zur amperometrisch-enzymatischen Analytmessung die Polarisationsspannung auf einen Wert eingestellt wird, der eine zur Indikationsreaktion entgegengesetzte Redoxreaktion des Mediators bei maximaler Reaktionsrate an der Arbeitselektrodenoberfläche ermöglicht.
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Es wurde erwartet, dass nach dem Umschalten der Polarisationsspannung nach dem Ende der enzymatischen Analytkonzentrationsmessung im kapillaren Vollblut Stromwerte generiert werden, die von der analytumsetzenden enzymatischen Reaktion unabhängig und im Wesentlichen nur noch von der Verfügbarkeit Redoxmediatormoleküle und deren Diffusionsfähigkeit bestimmt werden, wie bereits in anderen technischen Lösungen beschrieben. Prinzipiell sollten demzufolge die Stromwerte, die innerhalb eines bestimmten Messintervalls, das sich über eine Zeitdauer von 0,25 s bis 2 s erstreckt, nach dem Umschalten der Polarisationsspannung gemessen werden, umso niedriger ausfallen, je höher der Hämatokrit der Probe ist. Dieser Effekt wurde jedoch erst dann gefunden, wenn das Messintervall in einen zeitlich ausreichenden Abstand zwischen 10 s und 20 s nach Umschaltung der Polarisationsspannung gelegt wird. Beginnt das Messintervall jedoch innerhalb einer Zeitdauer zwischen 0,5 s und 2 s nach Umschalten der Polarisationsspannung, kehrt sich die Beziehung zwischen den Stromwerten des Messintervalls und dem Hct-Anteil, der in der Probe enthalten ist, überraschend um, d. h., je höher der Hämatokrit, desto höher fallen die Stromwerte des Messintervalls aus und umgekehrt. Die Relation zwischen den Stromwerten des Messintervalls, die über die Intervallzeitdauer integriert werden und dem zeitlichen Abstand zwischen der Umschaltung der Polarisationsspannung und dem Beginn des Messintervalls kehrt sich nach einer Zeitdauer, die zwischen 10. s und 16. s nach Polarisationsspannungswechsel liegt, um (1).
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Das erfindungsgemäße Verfahren macht sich diesen überraschenden Zusammenhang zunutze, um unmittelbar nach dem Abschluss der Konzentrationsmessung ein Hct-abhängiges Messsignal zu erhalten.
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Zur Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens sind enzymatisch-amperometrische Einmalgebrauchs-Sensoren mit einem Redoxmediator geeignet, dessen Konzentration in der Messkammer vorzugsweise doppelt bis zehnfach höher als die höchste in einer Probe zu erwartende Analytkonzentration ist. Das erfindungsmäße Messverfahren zur Bestimmung eines Hct-abhängigen Messsignals sieht vor, dass nach Ablauf der Messprozedur zur enzymatisch-amperometrischen Konzentrationsbestimmung eines Analyten, die Polarisationsspannung auf einen Wert eingestellt wird, der eine zur Indikationsreaktion entgegengesetzte Redoxreaktion des Mediators bei maximaler Reaktionsrate an der Arbeitselektrodenoberfläche ermöglicht. In der Regel ist damit eine Änderung der Polarität der anzulegenden Spannung verbunden und der resultierende Stromfluss ist in seinem Vorzeichen entgegengesetzt zur Redoxreaktion mit der analytumsetzenden Oxidoreduktase.
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Das Umschalten der Polarisationsspannung nach Beendigung der Analytmessung kann sowohl in Form einer Sprungfunktion als auch in Rampenform, die über eine Zeitdauer zwischen 0,1 s und 1,0 s angelegt wird, erfolgen. In Abhängigkeit von der Indikationsreaktion zwischen der analytumsetzenden Oxidoreduktase und dem Redoxmediator wechselt die Polarisationsspannung zwischen zwei Werten, die jeweils dem Optimum zur Oxidation und Reduktion des reversiblen Redoxmediators entsprechen.
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Das Messintervall, das 0,5 s bis 2,0 s nach dem Erreichen der entgegengesetzten Polarisationsspannung beginnt, verläuft über eine Zeitdauer von 0,1 s bis 2,0 s.
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Die Stromkurve bzw. der resultierende Ladungswert, der aus der Integration der Stromwerte innerhalb des Messintervalls erhalten wird, resultiert aus einem kapazitiv bedingten Umladungsstrom sowie dem Faradaystrom aus der Oxidation oder Reduktion des Elektronenmediators, dessen Anteil von der Reproduzierbarkeit des Reagenzvolumenauftrags und der Einhaltung der Messkammergeometrie abhängig ist.
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Bei gut reproduzierbarer Sensorfertigung kann dieser Anteil als konstant betrachtet werden. Produktionsbedingte Schwankungen infolge der Variation der Arbeitselektrodengeometrie oder der elektrokatalytischen Eigenschaften des Elektrodenmaterials führen sowohl für den anodisch als auch den kathodisch gemessenen Anteil des Faradaystroms zu Änderungen und können über die Ermittlung einer Sensitivitäts-Codeziffer korrigiert werden.
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Im Gegensatz dazu wurde gefunden, dass der Umladungsstrom bei Messung in Vollblut wesentlich vom Hct-Wert der Probe abhängig ist. Vollblutproben, mit einem Hct-Wert von beispielsweise 20% vermindert den kapazitiv bedingten Umladungsstrom um bis zu –15% im Vergleich zu einer Vollblutprobe mit einem Hämatokritwert von 45% und Vollblutproben, mit einem Hct-Wert von 70% erhöhen den kapazitiv bedingten Umladungsstrom um bis zu 18% im Vergleich zu einer Vollblutprobe mit einem Hämatokritwert von 45%.
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Aufgrund des Überschusses an Elektronenmediator sowie dem Umstand, dass in unmittelbarer Nähe der Elektrode der Redoxmediator aus der Oxidoreduktasereaktion an der Arbeitselektrodenoberfläche sofort regeneriert wird, ist innerhalb des Messintervalls, in dem der Umladungsstrom erfasst wird nahezu keine Abhängigkeit des Umladungsstromes bzw. seines Ladungswertes von der Analytkonzentration vorhanden.
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Demzufolge kann eine Kalibrationskurve des Umladungsstromes, die in Abhängigkeit vom Hct-Wert aufgenommen wird, als Grundlage zur Ermittlung des Hämatokritwertes der Vollblutprobe dienen.
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Aufgrund des erfindungsgemäßen Verfahrens kann unabhängig von der eigentlichen Messprozedur und nach deren Abschluss ein Hct-abhängiges Messignal erhalten werden, das weitgehend unabhängig von der Analytkonzentration ist und in einfacher Weise zur Korrektur des Konzentrationswertes einer enzymatisch-amperometrischen Messung genutzt werden kann.
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Enzymatisch-amperometrische Einmalgebrauchs-Sensoren auf der Grundlage enzymatischer und affinitätsbasierender Detektionsprinzipien sind dem Fachmann bekannt (z. B. aus
DE 10 2010 002 915 B4 ). Als Oxidoreduktasen werden z. B. Oxidasen, Peroxidasen und cofaktorabhängige Dehydrogenasen verwendet. Redoxmediatoren können z. B. chinoide Redoxfarbstoffe, organometallische Verbindungen oder Metallkomplexe sein.
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Das erfindungsgemäße Verfahren wird durch nachfolgendes Ausführungsbeispiel, und die Zeichnungen 2 bis 4 näher erläutert.
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Ausführungsbeispiel
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Erfindungsgemäßes Verfahren zum hämatokritkompensierten Nachweis von Laktat in Vollblut. Zur Erläuterung dienen 2 bis 4.
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Zur beispielhaften Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens dient ein mikrofluidischer Einmalsensor zur Messung von Laktat im kapillaren Vollblut, dessen prinzipieller Aufbau im Patent
DE 10 2010 002 915 B4 beschrieben wurde. Der Sensor besteht aus einer potentiostatisch arbeitenden Drei-Elektrodenanordnung, die mittels Siebdruck einer Kohlenstoffpaste hergestellt wurde. Die mittels Heißprägen hergestellte mikrofluidische Messkammer weist ein Kammervolumen von 0,2 μl auf. Laktatoxidase (1 U/Messkammer) wird zur spezifischen Umsetzung des Analyten genutzt und als Redoxmediator wird Kaliumhexacyanoferrat (III) in einer Konzentration von 75 mM verwendet. Der lineare Bereich des Sensors liegt zwischen 0,5 mM und 25 mM Laktat.
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Für die Untersuchungen wird heparinisiertes venöses Vollblut mit einem Hct-Wert von 45 % verwendet, das in Bezug auf den Hämatokrit auf bis zu 70% angereichert und bis zu 20% mit dem Plasma dieser Blutprobe verdünnt wird.
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Zur Durchführung des Verfahrens wird der Sensor über die entsprechenden Kontaktbahnen der Elektroden an eine potentiostatische Ausleseeinheit (Handmessgerät SensLab) angeschlossen, dass über eine Software-gesteuerte bipolare Einstellmöglichkeit der Polarisationsspannung im Bereich zwischen –600 mV und +600 mV verfügt. Die Messprozedur zur enzymatisch-amperometrischen Bestimmung der Laktatkonzentration, die mit der Befüllung der Messkammer durch die Blutprobe startet und mit der Anzeige und Abspeicherung des Messwertes endet, dauert 8 s.
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Die Firmware des Gerätes wurde derart programmiert, dass unmittelbar nach Ablauf der regulären anodischen Messung, die nach der achten Sekunde zu Ende ist, die Polarisationsspannung innerhalb einer Zeitdauer von 0,5 s von +450 mV auf –350 mV in einem rampenförmigen Verlauf umgestellt wird. Der resultierende kathodische Strom setzt sich unmittelbar nach der Umschaltung aus einem kapazitiven Umladestromanteil und dem Faradaystrom zusammen, der durch die Reduktion des Kaliumhexacyanoferrat (III) zum Kaliumhexacyanoferrat (II) generiert wird. Nach einer Zeit von 1,0 s nach Erreichen der Polarisationsspannung von –350 mV wird über ein Zeitintervall von 0,25 s die Stromkurve aufgenommen und integriert (2). Die resultierende Ladung wird angezeigt.
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Unter Nutzung dieser Prozedur wird eine kathodische Ladungskurve für das definierte Stromintervall in Abhängigkeit vom Hämatokritgehalt der Vollblutproben aufgenommen (3).
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Proben mit einem Hämatokritgehalt zwischen 20% und 70% verursachen im Mittel Änderungen des kathodischen Ladungswertes zwischen 42 μC und 66 μC. Der Anstieg der Geraden beträgt 0,364.
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Bei der Ausmessung der kathodischen Ladungswerte von heparinierten venösen Blutproben, die von zwei unterschiedlichen Probanden entnommen wurden und Laktatkonzentrationen zwischen 1 mM und 5 mM aufwiesen, wurde keine signifikante Abhängigkeit des Messwertes von der Laktatkonzentration festgestellt (4).
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Schließlich wurden mit der im Beispiel beschriebene Prozedur Messungen von stabilisierten Vollblutproben unterschiedlicher Hämatokritwerte durchgeführt und die erhaltenen kathodischen Ladungswerte zur Korrektur der anodischen Konzentrationswerte verwendet. Im Vergleich dazu wurden die Proben mit einem nichtkompensierten, kommerziell erhältlichen Messgerät durchgeführt. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 1 zusammengestellt. Jeder Messwert stellt den Mittelwert aus fünf Einzelmessungen dar. Tabelle 1 Vergleich von nichtkompensierten und verfahrensgemäß Hct-kompensierten Lactatmessungen in Vollblutproben gegenüber einem Laborreferenzmesssystem (EKF-Biosen C-Line)
| Hämatokrit | Laktatwerte/[mmol/L] Referenz: EKF C-Line | nichtkomp. Mess. | Komp. Mess. |
| 45% | 12,65 | 14,0 | 14,3 |
| | 17,56 | 17,9 | 18,0 |
| 70% | 11,10 | 8,3 | 10,0 |
| | 17,2 | 13,6 | 16,7 |
| 20% | 15,65 | 20,5 | 18,9 |
| | 21,02 | 25,0 | 23,6 |
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1 Prozentuale Abweichung der kathodischen Ladungen, die bei 20% Hct und bei 70% Hct ermittelt wurden von der Ladung bei 45% Hct in Abhängigkeit vom Beginn des Messintavalls über 0,5 s nach Umschaltung der Polarisationsspannung auf –500 mV
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2 Aufnahme einer kathodischer Strom- und Ladungskurve nach dem Ende der anodischen Konzentrationsmessung sowie Darstellung des Messintervalls 1, das zur Berechnung der kathodischen Ladung verwendet wird.
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3 Hct-Abhängigkeit der Kathodischen Ladung, die 1,5 s nach Umschaltung der Polarisationsspannung auf –350 mV über eine Intervallzeit 0,25 s für Hämatokritkonzentrationen zwischen 20% und 70% in heparinisierten venösen Vollblutproben gemessen wurden
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4 Messung der kathodischen Ladung in Vollblutproben zweier Probanden mit Hct von 45% bei Lactatkonzentrationen zwischen 1 mM und 5 mM
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- US 6645358 [0010]
- US 2011/0139634 [0012]
- US 7351375 [0013]
- US 6287451 [0014]
- WO 2005/114164 [0016]
- WO 2011/079937 [0017]
- US 7964089 [0019]
- US 8088271 [0019]
- US 8083925 [0020]
- US 6475372 [0023]
- WO 2008/040998 [0024]
- US 2010/0219084 [0025]
- EP 2098857 [0026]
- US 2009/0184004 [0026]
- US 2010/0206749 [0027]
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Zitierte Nicht-Patentliteratur
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