KR102295057B1 - 전기화학적 혈당센서 및 그 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 전기화학적 혈당센서 및 그 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 일 실시예에 따른 전기화학적 혈당센서는 혈액과 접촉하여 전기화학적 현상이 발생하는 작동 전극(working electrode)을 포함하되, 상기 작동 전극은, 스테인리스 스틸(stainless steel)을 포함하는 금속기재; 포도당 산화효소(glucose oxidase)와, 포도당 산화효소와 가교 결합(cross link)하여 포도당 산화효소를 고정(immobilizing)하는 제1 고정 물질을 각각 포함하며, 금속기재 상에 마련되는 반응층; 및 반응층의 포도당 산화효소를 추가 고정하는 제2 고정 물질을 포함하며, 반응층을 덮도록 마련된 고정층을 포함하는 것을 특징으로 한다.

Description

전기화학적 혈당센서 및 그 제조방법{Electrochemical biosensor and manufacturing method thereof}
본 발명은 전기화학적 혈당센서 및 그 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 전기화학적 방법을 이용하여 혈당을 측정하는 혈당센서 및 그 제조방법에 관한 것이다.
혈당 측정을 통해 당뇨병 등의 다양한 질환에 의한 건강 이상이 확인될 수 있다. 특히, 성인의 질병 사망의 주요 원인 중 하나인 당뇨병과 그로 인한 합병증 관리를 위해, 대상자의 혈당을 자주 그리고 정확히 측정 및 모니터링하는 것은 필수적이라고 할 수 있다. 이러한 혈당 측정을 위해, 분광학적 측정법과 전기화학적 방법이 주로 사용되고 있다.
분광학적 측정법은 포도당 산화효소와 과산화효소에 의한 포도당의 산화반응을 이용하는 방법으로서, 반응 후 나타나는 흡광 또는 형광의 변화를 이용해 혈당의 양을 결정한다. 전기화학적 방법은 포도당 특이적 효소를 매개로 하여 혈당의 산화 환원 반응을 유발하고 이에 비롯된 전하의 흐름을 혈당 센서에 구비된 전극으로 측정함으로써 혈당 농도를 결정한다. 특히, 분광학적 측정법에 비해, 전기화학적 방법은 혈액 내의 다른 물질들에 의해 발생하게 되는 간섭 효과가 적고, 혈당 측정 시간을 단축할 수 있으며, 기기 자체에 대한 소형화, 단순화 및 저렴화 등이 가능한 이점 등으로 인해 최근에 주로 사용되는 방법이다.
종래의 전기화학적 방법을 이용한 혈당센서(이하, “종래 센서”이라 지칭함)의 경우, 그 측정 대상 물질인 포도당에 의해 발생되는 신호에 비해 잡음(noise) 신호가 굉장히 크다는 문제점(이하, “문제점 1”이라 지칭함)이 있었다. 즉, 종래 센서를 이용하여 혈당 농도를 측정할 경우, 포도당 농도에 따라 발생되는 전류의 증가 정도에 비해 전류신호 자체의 잡음 증가 정도가 더욱 크다.
또한, 종래 센서에서는 포도당의 농도가 증가함에 따라 검출되는 신호의 오차 범위도 비례하여 증가하는 문제점(이하, “문제점 2”라 지칭함)이 발생하였다. 즉, 종래 센서를 이용하여 혈당 농도를 측정할 경우, 높은 혈당에서 검출되는 신호일수록 더 큰 오차 범위가 발생한다.
이러한 문제점 1 및 2 등에 따라, 종래 센서는 그 성능 편차가 15 % 내외로 매우 클 수 밖에 없었다. 더욱이, 종래 센서는 모두 전극 물질이 백금(Pt) 등의 귀금속으로 이루어짐에 따라, 그 제조 비용이 커질 수 밖에 없는 문제점(이하, “문제점 3”이라 지칭함)이 있었다.
상기한 바와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명은 포도당 농도에 따른 전류신호에 비하여 전류신호 자체의 잡음이 적은, 즉 신호 대 잡음 비(SNR)가 큰 전기화학적 혈당센서 및 그 제조방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명은 포도당 농도의 증가에 따라 커지는 전류신호의 오차 범위를 줄일 수 있는 전기화학적 혈당센서 및 그 제조방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명은 저렴한 금속을 전극으로 사용함으로써 그 제조비용을 줄일 수 있는 전기화학적 혈당센서 및 그 제조방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명은 간섭물질의 농도에 대한 영향을 줄여 측정 대상 물질인 포도당을 효과적으로 검출할 수 있는 전기화학적 혈당센서 및 그 제조방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
다만, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 과제를 해결하기 위한 본 발명의 일 실시예에 따른 전기화학적 혈당센서는 혈액과 접촉하여 전기화학적 현상이 발생하는 작동 전극(working electrode)을 포함하되, 상기 작동 전극은, 스테인리스 스틸(stainless steel)을 포함하는 금속기재; 포도당 산화효소(glucose oxidase)와, 포도당 산화효소와 가교 결합(cross link)하여 포도당 산화효소를 고정(immobilizing)하는 제1 고정 물질을 각각 포함하며, 금속기재 상에 마련되는 반응층; 및 반응층의 포도당 산화효소를 추가 고정하는 제2 고정 물질을 포함하며, 반응층을 덮도록 마련된 고정층을 포함한다.
상기 반응층 및 상기 고정층은 금속기재 상의 혈액과 접촉하는 부위에 형성될 수 있다.
상기 전기화학적 현상은 반응층의 포도당 산화효소와 혈액 내의 포도당 간의 반응으로 생성된 과산화수소가 금속기재에서 공급되는 이온과 반응하는 현상일 수 있다.
상기 제2 고정 물질은 금속기재 외에 과산화수소와 반응하는 간섭물질들 중 적어도 한 종류의 간섭물질의 침투를 방지하거나 그 침투율을 줄일 수 있다.
상기 작동 전극은 니들 형상 부위를 포함하며, 니들 형상 부위에 반응층 및 고정층을 구비할 수 있다.
상기 제1 고정 물질은 키토산(chitosan)을 포함하고, 상기 제2 고정 물질은 나피온(nafion)을 포함할 수 있다.
위한 본 발명의 일 실시예에 따른 전기화학적 혈당센서는, 작동 전극에서의 전기화학적 현상에 따라 생성되는 전류의 측정을 위해 구비된 상대 전극(counter electrode); 및 작동 전극으로의 전압 인가를 위해 구비된 상대 전극인 기준 전극(reference electrode)을 더 포함하며, 혈당측정기에 삽입 가능하도록 구현될 수 있다.
상기 혈당측정기에서 금속기재와 기준 전극 간에 일정 크기의 전압이 인가되되 금속기재에 더 낮은 전압이 인가될 수 있다.
상기 일정 크기는 0.07 V 내지 0.13 V일 수 있다.
위한 본 발명의 일 실시예에 따른 전기화학적 혈당센서의 제조방법은 혈액과 접촉하여 전기화학적 현상이 발생하는 작동 전극(working electrode)을 포함하는 전기화학적 혈당센서의 제조방법으로서, 스테인리스 스틸(stainless steel)을 포함하는 작동 전극의 제1 구성인 금속기재를 준비하는 준비 단계; 포도당 산화효소(glucose oxidase)와, 포도당 산화효소와 가교 결합(cross link)하여 포도당 산화효소를 고정(immobilizing)하는 제1 고정 물질을 각각 포함하는 작동 전극의 제2 구성인 반응층을 금속기재 상에 형성하는 반응층 형성 단계; 반응층의 포도당 산화효소를 추가 고정하는 제2 고정 물질을 포함하는 작동 전극의 제3 구성인 고정층을 형성하되 반응층을 덮도록 형성하는 고정층 형성 단계를 포함한다.
상기 반응층 형성 단계는 혈액과 접촉하는 금속기재의 부위를 제1 고정 물질과 포도당 산화효소가 섞인 제1 용액에 침지(soaking)시키는 단계를 포함할 수 있다.
상기 제1 용액은 0.12 % (v/v) 내지 0.13 % (v/v) 함량의 제1 고정 물질이 포함된 용액에 포도당 산화효소가 섞인 용액일 수 있다.
상기 고정층 형성 형성 단계는 반응층이 형성된 금속기재의 부위를 제2 고정 물질이 포함된 제2 용액에 침지시키는 단계를 포함할 수 있다.
상기 제2 용액은 1.4 % (v/v) 내지 1.6 % (v/v) 함량의 제2 고정 물질이 포함된 용액일 수 있다.
상기 전기화학적 혈당센서는 작동 전극에서의 전기화학적 현상에 따라 생성되는 전류의 측정을 위해 구비된 상대 전극(counter electrode)과, 작동 전극으로의 전압 인가를 위해 구비된 상대 전극인 기준 전극(reference electrode)을 더 포함하되, 혈당측정기에 삽입 가능하도록 구현되며, 혈당측정기에서 금속기재와 기준 전극 간에 일정 크기의 전압이 인가되되 금속기재에 더 낮은 전압이 인가될 수 있다.
상기 일정 크기는 0.07 V 내지 0.13 V일 수 있다.
상기와 같이 구성되는 본 발명은 포도당 농도에 따른 전류신호에 비하여 전류신호 자체의 잡음이 적은, 즉 신호 대 잡음 비(SNR)가 큰 이점이 있다.
또한, 본 발명은 포도당 농도의 증가에 따라 커지는 전류신호의 오차 범위를 줄일 수 있는 이점이 있다.
또한, 본 발명은 저렴한 금속인 스테인리스 스틸을 전극으로 사용함으로써 그 제조비용을 줄일 수 있는 이점이 있다.
또한, 본 발명은 간섭물질의 농도에 대한 영향을 줄이고 측정 대상 물질인 포도당의 선택성을 높여 포도당을 보다 효과적으로 검출할 수 있는 이점이 있다.
본 발명에서 얻을 수 있는 효과는 이상에서 언급한 효과들로 제한되지 않으며, 언급하지 않은 또 다른 효과들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 전기화학적 혈당센서(100)와 혈당측정기(200)를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 전기화학적 혈당센서(100)의 구성을 나타낸다.
도 3는 도 2(b)에서 작동 전극(10)의 혈액 접촉부(11)에 도시된 점선을 따라 잘라낸 단면의 다양한 예를 나타낸다.
도 4는 작동 전극(10)의 혈액 접촉부(11)에서 나타나는 전기화학적인 현상을 나타낸다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 전기화학적 혈당센서(100)의 작동 전극(10)의 제조공정 순서를 나타낸다.
도 6은 제1 경우 및 제2 경우 각각에 대한 과산화수소의 농도(0 M, 10 μM, 20 μM, 30 μM)에 따른 시간대전류(chronoamperometry)의 그래프를 나타낸다.
도 7은 제1 경우 및 제2 경우 각각에 대한 과산화수소의 농도(0 M, 0.2 μM, 0.6 μM, 1.2 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM)에 따른 시간대전류(chronoamperometry)의 그래프와, 과산화수소의 농도 별 전류 변화 그래프를 나타낸다.
도 8은 제1 경우 및 제2 경우 각각에 대한 시간에 따른 Open Circuit Potential 그래프를 나타낸다.
도 9는 제2 경우에 대해 과산화수소가 있을 때와 없을 때를 비교한 Cyclic voltammetry 그래프를 나타낸다.
도 10은 제3 니들을 준비하는 과정을 나타낸다.
도 11은 제4 니들을 준비하는 과정을 나타낸다.
도 12 및 13은 제3 경우 및 제4 경우 각각에 대한 포도당의 농도(0 M, 1 mM, 3 mM, 6 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM)에 따른 시간대전류(chronoamperometry)의 그래프와, 포도당 농도 별 전류 변화 그래프를 나타낸다.
도 14 및 도 15는 제3 경우 및 제4 경우 각각에 대해 서로 다른 일정 인가 전압에서 간섭물질의 농도 변화에 따른 전류 변화의 그래프를 나타낸다.
도 16 내지 도 20은 제5 경우 내지 제7 경우, 제4 경우 및 제8 경우 각각에 대해 일정 인가 전압에서 간섭물질의 농도 변화에 따른 전류 변화의 그래프를 나타낸다.
도 21 및 도 22는 제9 경우 및 제4 경우 각각에 대해 일정 인가 전압에서 간섭물질의 농도 변화에 따른 전류 변화의 그래프를 나타낸다.
도 23은 본 발명의 일 실시예에 따른 전기화학적 혈당센서(100)에 대한 성능 분석의 실험을 위해 사용된 실험 기구를 나타낸다.
본 발명의 상기 목적과 수단 및 그에 따른 효과는 첨부된 도면과 관련한 다음의 상세한 설명을 통하여 보다 분명해 질 것이며, 그에 따라 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 본 발명의 기술적 사상을 용이하게 실시할 수 있을 것이다. 또한, 본 발명을 설명함에 있어서 본 발명과 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략하기로 한다.
본 명세서에서 사용된 용어는 실시예들을 설명하기 위한 것이며, 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 명세서에서, 단수형은 문구에서 특별히 언급하지 않는 한 경우에 따라 복수형도 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다", “구비하다”, “마련하다” 또는 “가지다” 등의 용어는 언급된 구성요소 외의 하나 이상의 다른 구성요소의 존재 또는 추가를 배제하지 않는다.
본 명세서에서, “또는”, “적어도 하나” 등의 용어는 함께 나열된 단어들 중 하나를 나타내거나, 또는 둘 이상의 조합을 나타낼 수 있다. 예를 들어, “또는 B”“및 B 중 적어도 하나”는 A 또는 B 중 하나만을 포함할 수 있고, A와 B를 모두 포함할 수도 있다.
본 명세서에서, “예를 들어” 등에 따르는 설명은 인용된 특성, 변수, 또는 값과 같이 제시한 정보들이 정확하게 일치하지 않을 수 있고, 허용 오차, 측정 오차, 측정 정확도의 한계와 통상적으로 알려진 기타 요인을 비롯한 변형과 같은 효과로 본 발명의 다양한 실시 예에 따른 발명의 실시 형태를 한정하지 않아야 할 것이다.
본 명세서에서, 어떤 구성요소가 다른 구성요소에 '연결되어’ 있다거나 '접속되어' 있다고 기재된 경우, 그 다른 구성요소에 직접적으로 연결되어 있거나 또는 접속되어 있을 수도 있지만, 중간에 다른 구성요소가 존재할 수도 있다고 이해되어야 할 것이다. 반면에, 어떤 구성요소가 다른 구성 요소에 '직접 연결되어' 있다거나 '직접 접속되어' 있다고 언급된 때에는, 중간에 다른 구성요소가 존재하지 않는 것으로 이해될 수 있어야 할 것이다.
본 명세서에서, 어떤 구성요소가 다른 구성요소의 '상에' 있다거나 '접하여' 있다고 기재된 경우, 다른 구성요소에 상에 직접 맞닿아 있거나 또는 연결되어 있을 수 있지만, 중간에 또 다른 구성요소가 존재할 수 있다고 이해되어야 할 것이다. 반면, 어떤 구성요소가 다른 구성요소의 '바로 위에' 있다거나 '직접 접하여' 있다고 기재된 경우에는, 중간에 또 다른 구성요소가 존재하지 않은 것으로 이해될 수 있다. 구성요소간의 관계를 설명하는 다른 표현들, 예를 들면, '～사이에'와 '직접 ～사이에' 등도 마찬가지로 해석될 수 있다.
본 명세서에서, '제1', '제2' 등의 용어는 다양한 구성요소를 설명하는데 사용될 수 있지만, 해당 구성요소는 위 용어에 의해 한정되어서는 안 된다. 또한, 위 용어는 각 구성요소의 순서를 한정하기 위한 것으로 해석되어서는 안되며, 하나의 구성요소와 다른 구성요소를 구별하는 목적으로 사용될 수 있다. 예를 들어, '제1구성요소'는 '제2구성요소'로 명명될 수 있고, 유사하게 '제2구성요소'도 '제1구성요소'로 명명될 수 있다.
다른 정의가 없다면, 본 명세서에서 사용되는 모든 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 공통적으로 이해될 수 있는 의미로 사용될 수 있을 것이다. 또한, 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 용어들은 명백하게 특별히 정의되어 있지 않는 한 이상적으로 또는 과도하게 해석되지 않는다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명에 따른 바람직한 일 실시예를 상세히 설명하도록 한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 전기화학적 혈당센서(100)와 혈당측정기(200)를 나타낸다. 또한, 도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 전기화학적 혈당센서(100)의 구성을 나타낸다. 즉, 도 2(a)는 본 발명의 일 실시예에 따른 전기화학적 혈당센서(100)의 외부를 간략히 나타내고, 도 2(b)는 본 발명의 일 실시예에 따른 전기화학적 혈당센서(100)의 내부를 간략히 나타낸다.
본 발명의 일 실시예에 따른 전기화학적 혈당센서(100)는 전기화학적 방법을 이용하여 혈당을 측정하는 센서로서, 스트립, 검사지 등으로 다양하게 지칭될 수 있으며, 일회용 또는 연속혈당측정용 등으로 사용될 수 있다. 이러한 본 발명의 일 실시예에 따른 전기화학적 혈당센서(100)는, 도 1에 도시된 바와 같이, 혈당측정기(200)의 삽입부(210)에 삽입 가능한 형태로 구성될 수 있다.
이때, 혈당측정기(200)는 그 삽입부(210)에 삽입된 혈당센서(100)의 각종 전극(10, 20, 30)과 접촉하여 전기화학적 방법에 따른 혈당을 측정할 수 있으며, 그 결과를 표시부(220)를 통해 표시할 수 있다. 이러한 혈당측정기(200)는 다양한 형태일 수 있으며, 연속혈당측정기일 수도 있다.
도 2를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 전기화학적 혈당센서(100)는 각종 전극인 작동 전극(working electrode)(10), 상대 전극(counter electrode)(20) 및 기준 전극(reference electrode)(30)과, 혈액이 유입되는 부분인 혈액 투입부(40) 등을 포함할 수 있다. 이때, 각 전극들(10, 20, 30)은 서로 이격되게 배치될 수 있다. 다만, 각 전극들(10, 20, 30)은 도 2 등에 도시된 형상에 한정되는 것은 아니며, 다양한 형상을 가질 수 있다. 특히, 도 2에 도시된 바와 같이, 상대 전극(20)은 작동 전극(10) 보다 면적이 클 수 있다.
작동 전극(10)은 혈액 접촉에 따른 전기화학적 현상이 발생하는 전극이다. 즉, 작동 전극(10)은 혈액과 접촉하는 혈액 접촉부(11)(도 2(b)에서 체크 무늬로 표시)를 포함한다. 다만, 도 2에 도시된 바와 달리, 작동 전극(10) 외에 상대 전극(20) 및 기준 전극(30)에도 혈액 접촉부가 포함될 수 있다.
도 3는 도 2(b)에서 작동 전극(10)의 혈액 접촉부(11)에 도시된 점선을 따라 잘라낸 단면의 다양한 예를 나타낸다.
도 3을 참조하면, 혈액 접촉부(11)는 금속기재(12), 반응층(13) 및 고정층(14)이 차례로 적층된 구조를 포함할 수 있다.
구체적으로, 금속기재(12)는 전도성의 금속재질로 이루어지되 스테인리스 스틸(stainless steel)을 포함한다. 스테인리스 스틸에 따른 효과에 대해서는 후술하도록 한다.
반응층(13)은 혈당과 반응하는 포도당 산화효소(glucose oxidase)를 가져 화학적 반응이 발생하는 층으로서, 금속기재 상에 마련된다. 특히, 반응층(13)은 포도당 산화효소 외에도, 포도당 산화효소와 결합하여 포도당 산화효소를 고정(immobilizing)하는 제1 고정 물질을 포함한다. 이때, 제1 고정 물질은 포도당 산화효소를 1차 고정하는 물질로서, 포도당 산화효소와 가교 결합(cross link)하는 물질인 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 제1 고정 물질은 키토산(Chitosan) 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
고정층(14)은 반응층(13)의 포도당 산화효소를 추가 고정하는 제2 고정 물질을 포함하는 층으로서, 반응층(13) 상에서 반응층(13)을 덮도록 마련된다. 이때, 고정층(14)은 혈액 접촉부(11)에서 최상위층에 해당할 수 있다. 특히, 제2 고정 물질은 포도당 산화효소를 2차 고정하는 물질로서, 소정의 점착성을 가지는 물질인 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 제2 고정 물질은 나피온(Nafion) 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
즉, 본 발명은 반응층(13)의 제1 고정 물질의 가교 결합에 의한 1차 고정 외에도, 추가적으로 반응층(13)을 덮는 고정층(14)의 제2 고정 물질에 의한 2차 고정이 가능한 구조를 가짐으로써, 포도당 산화효소에 대한 고정 정도를 크게 향상시킬 수 있다.
도 4는 작동 전극(10)의 혈액 접촉부(11)에서 나타나는 전기화학적인 현상을 나타낸다.
한편, 도 4를 참조하면, 혈액 투입부(40)를 통해 혈액이 유입되면, 작동 전극(10), 상대전극(20) 및 기준전극(30)의 혈액 접촉부 상에 유입된 혈액이 위치하게 되면서, 전기화학적 현상이 발생된다. 이때, 전기화학적 현상은 반응층(13)의 포도당 산화효소와 혈액 내의 포도당 간의 반응으로 과산화수소(H2O2)가 생성되며, 생성된 과산화수소(H2O2)가 금속기재(12)에서 공급되는 이온, 즉 전자(2e-)와 반응하는 현상을 지칭한다. 즉, 혈액 투입부(40)를 통해 유입된 혈액의 포도당이 고정층(14)을 거쳐 반응층(13)에 침투하면서 반응층(13)의 포도당 산화효소와 반응하며, 그 반응 결과 생성된 과산화수소(H2O2)가 금속기재(12)의 이온과 반응하게 된다.
이때, 고정층(14)의 제2 고정 물질은 포도당(Glucose)은 침투시키되, 간섭물질들 중 한 종류의 간섭물질의 침투를 방지하거나 그 간섭물질의 침투율을 줄일 수 있다. 이때, 간섭물질은 과산화수소의 전기화학적 검출에 영향을 주는 물질을 지칭한다. 예를 들어, 간섭물질은 아스코르브산(Ascorbic acid), 아세트아미노펜(Acetaminophen) 등일 수 있다.
상대 전극(20)은 전기화학적 현상에 따라 생성되는 전류의 측정을 위해 구비된 전극으로서, 전도성 재질을 포함한다. 즉, 본 발명의 일 실시예에 따른 전기화학적 혈당센서(100)가 혈당측정기(200)에 삽입되는 등의 경우, 작동 전극(10)에서의 전기화학적 현상에 따라 발생되는 전류가 작동 전극(10)과 상대 전극(20) 사이에서 측정될 수 있다. 이때, 측정된 전류의 값은 혈액 투입부(40)를 통해 투입된 혈액의 포도당 농도에 비례한 값을 가질 수 있다. 다만, 이러한 전류 측정 원리는 본 발명의 기술분야에서 잘 알려져 있으므로, 이에 대한 보다 상세한 설명은 생략하도록 한다.
기준 전극(30)은 작동 전극(10)으로의 전압 인가를 위해 구비된 전극으로서, 전도성 재질을 포함한다. 즉, 본 발명의 일 실시예에 따른 전기화학적 혈당센서(100)가 혈당측정기(200)에 삽입되는 등의 경우, 혈당측정기(200)에 의해 작동 전극(10)와 기준 전극(30) 간에 전압이 인가된다. 이러한 인가 전압에 의해 작동 전극(10)의 금속기재(12)에 전하가 공급될 수 있다. 이와 같이 공급된 전하에 의해, 과산화수소(H2O2)와 반응하는 상술한 금속기재(12)의 이온이 계속해서 공급될 수 있다. 이를 위해, 작동 전극(10)의 금속기재(12)와 기준 전극(30) 간에 일정 크기의 전압이 인가되되, 금속기재(12)에 더 낮은 전압이 인가되고, 기준 전극(30)에 더 높은 전압이 인가되는 것이 바람직할 수 있다.
이때, 인가 전압의 크기(절대값)는 0.07 V 내지 0.13 V인 것이 바람직할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다만, 상술한 인가 전압의 범위는 포도당 농도의 증가에 따라 커지는 전류 측정 신호의 오차 범위를 줄일 수 있는 범위에 해당할 수 있으며, 이에 대해서는 후술할 실험을 통해 보다 상세하게 설명하도록 한다.
또한, 도면에 상세히 도시되지 않았지만, 본 발명의 일 실시예에 따른 전기화학적 혈당센서(100)는 상술한 구성 외에도, 각 전극들(10, 20, 30) 등을 지지하는 기판, 일단이 뾰족하여 피부의 각질층을 뚫어 채혈이 가능하게 하는 니들(needle) 등을 더 포함할 수 있다. 이때, 니들은 복수 개 구비될 수도 있으며, 무고통의 채혈이 가능하도록, 그 선단의 직경이 마이크로미터 범위로 형성될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 작동 전극(10)이 니들 형상의 부위를 가져, 니들의 기능을 수행할 수도 있다. 이 경우, 작동 전극(10)의 니들 형상 부위에 혈액 접촉부(11)가 형성되는 것이 바람직할 수 있다.
이하, 본 발명의 일 실시예에 따른 전기화학적 혈당센서(100)의 제조방법에 대해서 설명하도록 한다. 다만, 본 발명의 일 실시예에 따른 전기화학적 혈당센서(100)의 구성 중에 작동 전극(10)의 구성이 종래 기술과 가장 큰 차별점을 가지므로, 이하에서는 작동 전극(10)의 제조방법에 대해서만 보다 상세하게 설명하도록 한다. 즉, 작동 전극(10) 외의 나머지 구성은 종래 기술을 이용하여 제조할 수 있다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 전기화학적 혈당센서(100)의 작동 전극(10)의 제조공정 순서를 나타낸다.
도 5를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 전기화학적 혈당센서(100)의 작동 전극(10)을 제조하기 위해, S10 내지 S30가 수행될 수 있다.
즉, 스테인리스 스틸을 포함하는 금속기재(12)를 준비한다(S10). 이때, 금속기재(12)를 에탄올(Ethanol) 등을 이용해 세척(Washing)한 후, 일정 시간 동안 고온에서 건조(Drying)(예를 들어, 75 ℃ 이상에서 1 시간 이상 건조)시킬 수 있다.
이후, 금속기재(12) 상에 반응층(13)을 형성한다(S20). 이때, 제1 고정 물질과 포도당 산화효소가 섞인 제1 용액을 먼저 준비한다. 다음으로, 준비된 제1 용액에 금속기재(12)의 혈액 접촉부(11)를 일정 시간 동안 침지(soaking)(예를 들어, 30 분 이상 침지)시킨 후, 금속기재(12)를 일정 시간 동안 건조(예를 들어, 1 시간 이상 상온에서 건조)시키는 과정을 3회 반복함으로써, 반응층(13)을 형성할 수 있다. 다만, 혈액 접촉부(11) 상에 반응층(13)을 형성하기 위해, 혈액 접촉부(11)를 제외한 금속기재(12)의 영역을 코팅(coating)한 후에, 상술한 침지 및 건조 공정이 수행될 수 있다.
특히, 제1 용액은 0.12 % (v/v) 내지 0.13 % (v/v) 함량의 제1 고정 물질이 포함된 용액에 포도당 산화효소를 섞은 용액인 것이 바람직할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다만, 상술한 제1 고정 물질의 함량 범위는 포도당 농도의 증가에 따라 커지는 전류 측정 신호의 오차 범위를 줄일 수 있는 범위에 해당할 수 있으며, 이에 대해서는 후술할 실험을 통해 보다 상세하게 설명하도록 한다.
이후, 반응층(13)을 덮는 고정층(14)을 형성한다(S30). 이때, 제2 고정 물질이 포함된 제2 용액을 준비한다. 다음으로, 준비된 제2 용액에 반응층(13)이 형성된 금속기재(12)의 부위를 일정 시간 동안 침지(예를 들어, 30 분 이상 침지)시킨 후, 금속기재(12)를 일정 시간 동안 건조(예를 들어, 1 시간 이상 상온에서 건조)시킴으로써, 고정층(14)을 형성할 수 있다. 다음으로, S20에서 혈액 접촉부(11)를 제외한 금속기재(12)의 영역이 코팅된 경우, 해당 영역의 적어도 일부에 대한 코팅을 제거할 수 있다.
특히, 제2 용액은 1.4 % (v/v) 내지 1.6 % (v/v) 함량의 제2 고정 물질이 포함된 용액인 것이 바람직할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다만, 상술한 제2 고정 물질의 범위는 포도당 농도의 증가에 따라 커지는 전류 측정 신호의 오차 범위를 줄일 수 있는 범위에 해당할 수 있으며, 이에 대해서는 후술할 실험을 통해 보다 상세하게 설명하도록 한다.
한편, 금속기재(12), 반응층(13), 고정층(14) 등은 도 1 내지 도 4를 따라 이미 상술하였으므로, 이들에 대한 상세한 설명은 생략하도록 한다.
이하, 본 발명의 일 실시예에 따른 전기화학적 혈당센서(100)에 대한 성능을 분석하기 위해 수행된 실험에 대해서 설명하도록 한다.
도 23은 본 발명의 일 실시예에 따른 전기화학적 혈당센서(100)에 대한 성능 분석의 실험을 위해 사용된 실험 기구를 나타낸다.
실험의 편의를 위해, 작동 전극(WE)은 로드(Rod) 형태가 아닌 니들(needle) 형태를 이용하였고, 상대 전극(CE)과 기준 전극(RE)은 각각 와이어(Wire)와 로드(Rod) 형태를 사용하였다. 또한, 도 23에 도시된 바와 같이, 각 전극을 유리 셀에 넣고 각 전극을 도선에 연결된 금속 집게를 이용하여 측정기에 연결함으로써 각 실험을 수행하였다. 이때, 필요할 경우에 유리 셀에 실험하고자 하는 용액(혈액 등)을 넣어 각 실험을 수행하였다.
구체적으로, 각 실험에서, 포화칼로멜 전극(saturated calomel electrode)을 기준 전극으로 사용하였고, 백금 와이어(pt wire)를 상대 전극으로 사용하였으며, 각 실험에 따라 Stainless 304 니들(needle) 또는 그 가공품을 작동 전극으로 사용하였다.
<백금과 스테인리스 스틸 간의 성능 비교 실험>
본 실험은 종래 기술에서 작동 전극으로 사용되었던 백금과, 본 발명에 따라 작동 전극의 금속기재로 사용되는 스테인리스 스틸 간의 성능을 비교하기 위한 실험이다. 구체적으로, Stainless 304 니들에 백금 나노 구조체를 형성한 것(이하, “제1 니들”이라 지칭함)과, Stainless 304 니들(이하, “제2 니들”이라 지칭함)을 각각 준비한다.
이때, 제1 니들을 준비하는 과정은 다음과 같다. 즉, Stainless 304 니들을 에탄올로 1 시간 이상 초음파세척기를 이용해서 세척한 후, 오븐에서 75 ℃로 1 시간 동안 건조시킨다. 그 다음, Stainless 304 니들의 단부 3 cm 정도를 10 mM cysteamine 용액 3 mL에 3 시간 동안 담가 그 표면에 cysteamine 단분자층을 형성시킨 후, 증류수를 이용해 세척한다. 그 다음, cysteamine 단분자층이 형성된 Stainless 304 니들을 증류수 8 mL, chloroplatinic acid 12 μL, 0.1 M ascorbic acid 1 mL의 혼합 용액에 침지시켜 70 ℃에서 4 시간 동안 교반시켜 그 표면에 백금 나노 구조체를 형성한다.
한편, 본 실험에서, 0.1 M KCl을 포함한 pH 6.8의 1X PBS(Phosphate Buffer Saline) 용액을 이용하였다.
- 시간대전류(chronoamperometry) 실험 -
먼저, 제1 니들이 작동 전극인 경우(이하, “제1 경우”라 지칭함)와 제2 니들이 작동 전극인 경우(이하, “제2 경우”라 지칭함)에 대해 각각, 과산화수소의 농도를 달리한 PBS 용액에서 일정 인가 전압(약 -0.15 V)을 가하여, 시간에 따라 전류 변화를 측정, 즉 chronoamperometry 실험을 수행하였다.
도 6은 제1 경우 및 제2 경우 각각에 대한 과산화수소의 농도(0 M, 10 μM, 20 μM, 30 μM)에 따른 시간대전류(chronoamperometry)의 그래프를 나타낸다. 즉, 도 6(a)는 제1 경우에 과산화수소의 농도(0 M, 10 μM, 20 μM, 30 μM)에 따른 chronoamperometry 그래프, 도 6(b)는 제2 경우에 과산화수소의 농도(0 M, 10 μM, 20 μM, 30 μM)에 따른 chronoamperometry 그래프를 각각 나타낸다.
도 6을 참조하면, 각 경우에 대해, 전류의 증가가 관찰되었다. 이는 과산화수소가 환원되면서 발생하는 전류로 판단된다. 하지만, 도 6(a)에 도시된 바와 같이, 제1 경우는 농도에 따른 경향성이 나타나지 않았을 뿐 아니라, 잡음(noise)도 크게 나타났다. 따라서, 제1 니들과 같이 백금을 포함한 작동 전극이 과산화수소의 센서로 적합하지 않다는 것을 알 수 있다.
반면, 도 6(b)에 도시된 바와 같이, 제2 경우는 과산화수소의 농도 증가에 따라, 전류가 증가하고 그 신호 변화가 일정한 경향이 나타났을 뿐 아니라 잡음도 매우 적은 것으로 나타났다. 따라서, 제2 니들과 같이 스테인리스 스틸을 포함한 작동 전극이 과산화수소의 센서로 매우 적합하다는 것을 알 수 있다.
또한, 제1 경우 및 제2 경우 각각에 대한 과산화수소 농도에 따른 전류의 선형성을 비교하기 위해, PBS 용액에서 과산화수소의 농도 0 ~ 4 mM 범위에서의 chronoamperometry 실험을 추가 수행하였다.
도 7은 제1 경우 및 제2 경우 각각에 대한 과산화수소의 농도(0 M, 0.2 μM, 0.6 μM, 1.2 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM)에 따른 시간대전류(chronoamperometry)의 그래프와, 과산화수소의 농도 별 전류 변화 그래프를 나타낸다. 즉, 도 7(a)는 제1 경우에 과산화수소의 농도(0 M, 0.2 μM, 0.6 μM, 1.2 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM)에 따른 chronoamperometry 그래프, 도 7(b)는 제2 경우에 과산화수소의 농도(0 M, 0.2 μM, 0.6 μM, 1.2 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM)에 따른 chronoamperometry 그래프, 도 7(c)는 제1 경우에 과산화수소의 농도 별 전류 변화 그래프, 도 7(d)는 제2 경우에 과산화수소의 농도 별 전류 변화 그래프를 각각 나타낸다.
도 7을 참조하면, 제1 경우는 높은 크기의 전류를 나타내지만 과산화수소 농도에 따른 선형성을 나타내지 않은 반면, 제2 경우는 비교적 작은 크기의 전류를 보이지만 99.27 %의 높은 신뢰도를 보이며 과산화수소 농도에 따른 분명한 선형성을 나타낸다. 따라서, 제2 니들과 같이 스테인리스 스틸을 포함한 작동 전극이 과산화수소의 센서로 매우 적합하다는 것을 다시 확인할 수 있다.
- 개방회로 전위(Open Circuit Potential) 실험 -
제2 경우에 과산화수소에 의한 식각으로 전류 변화를 보이는지 확인하기 위해 Open circuit potential 실험을 수행하였다. 즉, PBS 용액에서 200 초에 0.2 mM 과산화수소를 첨가할 경우, 제1 경우 및 제2 경우 각각에 대한 Open Circuit Potential을 측정하였다.
도 8은 제1 경우 및 제2 경우 각각에 대한 시간에 따른 Open Circuit Potential 그래프를 나타낸다.
실험 결과, PBS 용액에서 200 초에 0.2 mM 과산화수소를 첨가했을 때, 제2 경우가 제1 경우에 비해 굉장히 빠르게 반응하면서 양의 전위 값이 나타났다. 이는 제2 경우에 그 작동 전극에서 금속이 산화되는 것을 나타낸다. 즉, 제2 경우, 그 작동 전극의 부식과정에서 스테인리스 스틸이 과산화수소에 의해 산화되면서 발생하는 전자교환으로 인해 전류가 발생함을 확인할 수 있다. 따라서, 과산화수소에 의해 제2 니들과 같이 스테인리스 스틸을 포함한 작동 전극이 식각됨에 따른 전류변화를 통해 과산화수소를 검출할 수 있음을 확인했다.
Figure 112019103049089-pat00001
or
Figure 112019103049089-pat00002
다만, 앞서 수행한 Chronoamperometry 실험에서 제2 경우에서 발생하는 전류변화는 스테인리스 스틸의 부식으로 인한 전자교환이 아닌 마이너스 전압에 의해 공급되는 전자를 Fe2+가 과산화수소에 전달할 때의 반응 결과인 것으로 판단된다.
- 순환 전압대전류(Cyclic voltammetry) 실험 -
제2 경우에 대한 과산화수소 농도에 따른 전기화학적 거동을 살펴보기 위해, PBS 용액에서 과산화수소가 존재하지 않을 경우와, 3.5 mM 및 7 mM의 과산화수소가 존재할 경우에 대한 cyclic voltammetry를 측정하였다.
도 9는 제2 경우에 대해 과산화수소가 있을 때와 없을 때를 비교한 Cyclic voltammetry 그래프를 나타낸다.
실험 결과, -0.1 V 부근과, -0.15 V 부근 등에서 과산화수소의 농도에 따른 환원전류의 증가를 확인할 수 있었다. 즉, 이들 부근의 인가 전압을 가하여 전류를 측정할 경우에 과산화수소 농도에 따른 전류 증가가 나타날 것을 예상할 수 있다.
<스테인리스 스틸을 포함한 다양한 작동 전극의 성능 비교 실험>
본 실험은 스테인리스 스틸을 포함하는 다양한 작동 전극 간의 성능을 비교하기 위한 실험이다. 구체적으로, 스테인리스 스틸의 금속기재를 가지되, 그 금속기재 상에 형성되는 층이 서로 다른 2개의 니들(이하, “제3 니들”과 “제4 니들"이라 각각 지칭함)을 각각 준비한다. 이때, 제4 니들이 본 발명에 따른 작동 전극에 해당할 수 있다.
도 10은 제3 니들을 준비하는 과정을 나타낸다.
도 10을 참조하면, 제3 니들을 준비하는 과정은 다음과 같다. 즉, Stainless 304 니들을 에탄올로 1 시간 이상 초음파세척기를 이용해서 세척한 후, 오븐에서 75 ℃로 1 시간 동안 건조시킨다. 그 다음, 0.25 % (v/v)의 나피온(Nafion) 수용액 100 μL에 포도당 산화효소를 3 mg 녹인 용액을 준비한다. 그 다음, 해당 용액에 Stainless 304 니들의 단부를 30 분 정도 침지시킨 후, 상온에서 1 시간 동안 건조시킨다. 그 결과, Stainless 304 니들의 단부 상에 나피온 및 포도당 산화효소의 혼합층이 형성된 제3 니들이 준비될 수 있다. 다만, 나피온 및 포도당 산화효소의 혼합층이 형성되는 영역 외의 Stainless 304 니들 부분에 대해서는 코팅을 수행한 후, 해당 혼합층의 형성 과정(침지 및 건조 등)을 수행할 수 있다.
도 11은 제4 니들을 준비하는 과정을 나타낸다.
도 11을 참조하면, 제4 니들을 준비하는 과정은 다음과 같다. 즉, Stainless 304 니들을 에탄올로 1 시간 이상 초음파세척기를 이용해서 세척한 후, 오븐에서 75 ℃로 1 시간 동안 건조시킨다. 그 다음, 0.125 % (v/v)의 키토산(Chitosan) 수용액 200 μL에 포도당 산화효소를 3 mg 녹인 용액, 즉 제1 용액을 준비한다. 그 다음, 해당 제1 용액에 Stainless 304 니들의 단부를 30 분 정도 침지시킨 후, 상온에서 1 시간 동안 건조시킨다. 키토산 수용액을 침지 및 건조시키는 과정을 2회 더 반복한다. 그 결과, Stainless 304 니들의 단부 상에 키토산 및 포도당 산화효소의 혼합층인 반응층이 형성된다. 그 다음, 1.5 % (v/v)의 나피온 수용액, 즉 제2 용액을 준비한다. 그 다음, 제2 용액에 반응층을 구비한 니들의 단부를 30 분 정도 침지시킨 후, 상온에서 1 시간 동안 건조시킨다. 그 결과, Stainless 304 니들의 단부 상에 반응층과, 반응층을 덮는 나피온을 포함한 고정층이 형성된 제4 니들이 준비될 수 있다. 다만, 반응층 및 고정층이 형성되는 영역 외의 Stainless 304 니들 부분에 대해서는 코팅을 수행한 후, 해당 반응층 및 고정층을 형성 과정을 수행할 수 있다.
한편, 본 실험에서, 0.1 M KCl을 포함한 pH 6.8의 1X PBS 용액 9 mL에 사람의 혈청(serum) 1 mL를 섞은 세럼 용액(실제 혈액 환경)을 각각 이용하였다.
- 시간대전류(chronoamperometry) 실험 -
먼저, 제3 니들이 작동 전극인 경우(이하, “제3 경우”라 지칭함)와 제4 니들이 작동 전극인 경우(이하, “제4 경우”라 지칭함)에 대해 각각, 포도당의 농도를 달리한 세럼 용액에서 일정 인가 전압(약 -0.15 V)을 가하여, 시간에 따라 전류 변화를 측정, 즉 chronoamperometry 실험을 수행하였다.
도 12 및 13은 제3 경우 및 제4 경우 각각에 대한 포도당의 농도(0 M, 1 mM, 3 mM, 6 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM)에 따른 시간대전류(chronoamperometry)의 그래프와, 포도당 농도 별 전류 변화 그래프를 나타낸다. 즉, 도 12(a)는 제3 경우에 포도당의 농도(0 M, 1 mM, 3 mM, 6 mM, 10 mM, 15 mM, 20mM)에 따른 chronoamperometry 그래프, 도 12(b)는 제3 경우에 포도당의 농도 별 전류 변화 그래프, 도 13(a)는 제4 경우에 포도당의 농도(0 M, 1 mM, 3 mM, 6 mM, 10 mM, 15 mM, 20mM)에 따른 chronoamperometry 그래프, 도 13(b)는 제4 경우에 포도당의 농도 별 전류 변화 그래프를 각각 나타낸다.
즉, 포도당이 산소 존재 하에 포도당 산화효소에 의해 산화되면서 과산화수소가 발생함을 이용하여 제3 경우 및 제4 경우에 대한 포도당 농도에 따른 전류변화를 관찰하였다. 도 12 및 도 13을 참조하면, 제3 경우 및 제4 경우 모두 1 ~ 20 mM의 포도당 농도 범위 내에서 포도당 농도 증가에 따라 99.5 % 이상의 높은 신뢰도로 전류가 일정하게 증가하였고, 잡음도 매우 적은 것으로 나타났다. 다만, 제3 경우는 변이계수(Coefficient of Variation)가 0.1 ~ 0.84 %의 범위에 있고, 제4 경우는 변이계수가 0.063 ~ 0.71 %의 범위에 있다. 즉, 제4 경우가 제3 경우 보다 전류변동이 더 적은 것으로 나타났다. 따라서, 제3 니들이 작동 전극이고 제4 니들이 작동 전극인 경우 모두, 실제 혈액 환경에서 포도당 검출 센서로 적합하나, 전류변동을 고려하면 본 발명과 같이 제4 니들이 작동 전극인 경우가 포도당 검출 센서로 더 적합하다는 것을 알 수 있다.
- 간섭물질 영향 비교 실험 -
먼저, 혈액에 많이 존재하며 과산화수소에 대한 간섭물질로 잘 알려진 Ascorbic acid 및 Acetaminophen의 혈액 내 평균 최저농도, 평균농도, 평균 최고농도를 각각 확인하였다. 그 결과, 실제 혈액 내에 존재하는 간섭물질의 농도는 표 1과 같다.
간섭물질 종류
(Interfering species)		 농도[mM] 참고
최소 평균 최대
포도당
(Glucose)		 7 공복 시 당뇨병 환자의 최소값
아스코르브산
(Ascorbic acid)		 0.15 0.25 0.035 사람 혈청(human serum)의 평균치(mean value)
아세트아미노펜
(Acetaminophen)		 0.06 0.13 0.2 사람 혈청(human serum)의 평균치(mean value)
다음으로, 제3 경우 및 제4 경우 각각에 대해, 혈액에 존재하는 이들 간섭물질들의 영향을 확인함으로써 포도당에 대한 선택성 여부를 확인하고자 하였다. 즉, 이들 간섭물질(Ascorbic acid 및 Acetaminophen)의 농도를 늘려가며, 이들 간섭물질이 공복상태의 당뇨환자 최저 혈당인 7 mM의 포도당을 검출함에 방해요소로 작용하는지를 알아보고자 하였다. 구체적으로, 세럼 용액에서 이들 간섭물질의 농도를 각각, 혈중 평균 최소농도(Minimum), 평균농도(Average), 평균 최고농도(Maximum), 평균 최고농도의 두 배(2x Maximum)로 점점 그 농도를 늘려가면서 전류를 측정하였다. 도 14 및 도 15는 제3 경우 및 제4 경우 각각에 대해 서로 다른 일정 인가 전압에서 간섭물질의 농도 변화에 따른 전류 변화의 그래프를 나타낸다. 즉, 도 14는 제3 경우에 -0.15 V의 인가 전압인 경우, 도 15는 제4 경우에 -0.1 V의 인가 전압인 경우를 각각 나타낸다.
그 결과, 도 14 및 도 15에 도시된 바와 같이, 제3 경우 및 제4 경우 모두 포도당이 포함되지 않은 조건에서, 간섭물질의 농도에 따른 전류변화가 적은 것으로 나타났으나, 제4 경우가 제3 경우 보다 그 전류변화가 더 적은 것으로 나타났다. 또한, 포도당이 포함된 조건에서, 제3 경우는 간섭물질 농도에 따라 전류가 점차 증가하였으나, 제4경우는 간섭물질의 농도에 따른 전류변화가 적었다. 이때, 제 3 경우와 제4 경우는 각각 -0.15 V, -0.1 V의 인가전압을 가진다. 따라서, 제4 니들이 작동 전극이면서 그 인가전압이 -0.1 V인 경우가 포도당의 선택성이 가장 좋은 포도당 검출 센서로 적합하다는 것을 알 수 있다.
<제1 고정 물질 또는 제2 고정 물질의 농도에 따른 작동 전극의 성능 비교 실험>
본 실험은 본 발명에 따른 스테인리스 스틸을 포함하는 작동 전극이되, 그 제조 시 제1 고정 물질 또는 제2 고정 물질의 농도가 달리 제조된 각 작동 전극 의 성능을 비교하기 위한 실험이다. 구체적으로, 제4 니들 외에, 제1 고정 물질의 농도를 달리하여 제조한 본 발명에 따른 작동 전극인 4개의 니들(이하, “제5 니들”, “제6 니들”, "제7 니들” 및 “제8 니들”이라 각각 지칭함)을 각각 준비한다. 또한, 제2 고정 물질의 농도를 달리하여 제조한 본 발명에 따른 작동 전극인 1개의 니들(이하, “제9 니들” 이라 각각 지칭함)을 각각 준비한다.
이때, 제5 니들 내지 제9 니들의 준비 과정은 제1 용액의 키토산 농도 또는 제2 용액의 니피온 농도만 다를 뿐 상술한 제4 니들의 준비 과정과 동일하다. 즉, 제5 니들 내지 제8 니들의 준비 과정은 상술한 제4 니들의 준비 과정에서 제1 용액의 키토산 농도만 다르다. 즉, 키토산 농도가 각각 0.05 % (v/v), 0.075 % (v/v), 0.1 % (v/v) 및 0.15 % (v/v)이다. 또한, 제9 니들의 준비 과정은 상술한 제4 니들의 준비 과정에서 제2 용액의 니피온 농도만 다르다. 즉, 니피온 농도가 0.25 % (v/v)이다.
먼저, 제5 니들이 작동 전극인 경우(이하, “제5 경우”라 지칭함), 제6 니들이 작동 전극인 경우(이하, “제6 경우”라 지칭함), 제7 니들이 작동 전극인 경우(이하, “제7 경우”라 지칭함), 제8 니들이 작동 전극인 경우(이하, “제8 경우”라 지칭함), 제9 니들이 작동 전극인 경우(이하, “제9 경우”라 지칭함) 및 제4 경우에 대해 각각, 혈액에 존재하는 간섭물질들(Ascorbic acid 및 Acetaminophen)의 영향을 확인함으로써 포도당에 대한 선택성 여부를 확인하고자 하였다. 즉, 이들 간섭물질의 농도를 늘려가며, 이들 간섭물질이 공복상태의 당뇨환자 최저 혈당인 7 mM의 포도당을 검출함에 방해요소로 작용하는지를 알아보고자 하였다. 구체적으로, 세럼 용액에서 이들 간섭물질의 농도를 각각, 혈중 평균 최소농도(Minimum), 평균농도(Average), 평균 최고농도(Maximum), 평균 최고농도의 두 배(2x Maximum)로 점점 그 농도를 늘려가면서 전류를 측정하였다.
도 16 내지 도 20은 제5 경우 내지 제7 경우, 제4 경우 및 제8 경우 각각에 대해 일정 인가 전압에서 간섭물질의 농도 변화에 따른 전류 변화의 그래프를 나타낸다. 즉, 도 16은 제5 경우, 도 17은 제6 경우, 도 18은 제7 경우, 도 19는 제4 경우, 도 20은 제8 경우에 각각 전류 변화 그래프를 나타낸다.
또한, 도 21 및 도 22는 제9 경우 및 제4 경우 각각에 대해 일정 인가 전압에서 간섭물질의 농도 변화에 따른 전류 변화의 그래프를 나타낸다. 즉, 도 21은 제9 경우, 도 22는 제4 경우에 각각 전류 변화 그래프를 나타낸다.
그 결과, 도 16 내지 도 20에 도시된 바와 같이, 0.125 % (v/v)의 키토산 농도의 제1 용액을 이용해 제조된 제4 경우에 전류변화가 가장 적은 것으로 나타났다. 또한, 도 21 및 도 22에 도시된 바와 같이, 1.5 % (v/v)의 나피온 농도의 제1 용액을 이용해 제조된 제4 경우가 제9 경우 보다 전류변화가 더 적은 것으로 나타났다. 따라서, 제4 니들이 작동 전극인 경우가 제5 니들 내지 제9 니들이 작동 전극인 경우 보다 포도당의 선택성이 더 좋은 포도당 검출 센서로 적합하다는 것을 알 수 있다.
상술한 본 발명의 구성 및 그 효과에 대한 실험을 통해 나타낸 바와 같이, 본 발명은 포도당 농도에 따른 전류신호에 비하여 전류신호 자체의 잡음이 적은, 즉 신호 대 잡음 비(SNR)가 클 뿐 아니라, 포도당 농도의 증가에 따라 커지는 전류신호의 오차 범위를 줄일 수 있는 이점이 있다. 또한, 본 발명은 저렴한 금속인 스테인리스 스틸을 전극으로 사용함으로써 그 제조비용을 줄일 수 있으며, 간섭물질의 농도에 대한 영향을 줄이고 측정 대상 물질인 포도당의 선택성을 높여 포도당을 보다 효과적으로 검출할 수 있는 이점이 있다.
본 발명의 상세한 설명에서는 구체적인 실시 예에 관하여 설명하였으나 본 발명의 범위에서 벗어나지 않는 한도 내에서 여러 가지 변형이 가능함은 물론이다. 그러므로 본 발명의 범위는 설명된 실시 예에 국한되지 않으며, 후술되는 청구범위 및 이 청구범위와 균등한 것들에 의해 정해져야 한다.
10: 작동 전극 11: 혈액 접촉부
20: 상대 전극 30: 기준 전극
100: 혈당센서 200: 혈액측정기
210: 삽입부 220: 표시부

Claims (16)

  1. 혈액과 접촉하여 전기화학적 현상이 발생하는 작동 전극(working electrode)을 포함하는 전기화학적 혈당센서의 제조방법으로서,
    스테인리스 스틸(stainless steel)을 포함하는 작동 전극의 제1 구성인 금속기재를 준비하는 준비 단계;
    포도당 산화효소(glucose oxidase)와, 포도당 산화효소와 가교 결합(cross link)하여 포도당 산화효소를 고정(immobilizing)하는 제1 고정 물질을 각각 포함하는 작동 전극의 제2 구성인 반응층을 금속기재 상에 형성하는 반응층 형성 단계;
    반응층의 포도당 산화효소를 추가 고정하는 제2 고정 물질을 포함하는 작동 전극의 제3 구성인 고정층을 형성하되 반응층을 덮도록 형성하는 고정층 형성 단계;
    를 포함하며,
    상기 반응층 형성 단계는 혈액과 접촉하는 금속기재의 부위를 제1 고정 물질과 포도당 산화효소가 섞인 제1 용액에 침지(soaking)시키는 단계를 포함하고,
    상기 제1 용액은 0.12 % (v/v) 내지 0.13 % (v/v) 함량의 제1 고정 물질이 포함된 용액에 포도당 산화효소가 섞인 용액인 것을 특징으로 하는 전기화학적 혈당센서의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 반응층 및 상기 고정층은 금속기재 상의 혈액과 접촉하는 부위에 형성된 것을 특징으로 하는 전기화학적 혈당센서의 제조방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 전기화학적 현상은 반응층의 포도당 산화효소와 혈액 내의 포도당 간의 반응으로 생성된 과산화수소가 금속기재에서 공급되는 이온과 반응하는 현상인 것을 특징으로 하는 전기화학적 혈당센서의 제조방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 제2 고정 물질은 금속기재 외에 과산화수소와 반응하는 간섭물질들 중 적어도 한 종류의 간섭물질의 침투를 방지하거나 그 침투율을 줄이는 것을 특징으로 하는 전기화학적 혈당센서의 제조방법.
  5. 제2항에 있어서,
    상기 작동 전극은 니들 형상 부위를 포함하며, 니들 형상 부위에 반응층 및 고정층을 구비한 것을 특징으로 하는 전기화학적 혈당센서의 제조방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 제1 고정 물질은 키토산(chitosan)을 포함하고, 상기 제2 고정 물질은 나피온(nafion)을 포함하는 것을 특징으로 하는 전기화학적 혈당센서의 제조방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 전기화학적 혈당센서는,
    작동 전극에서의 전기화학적 현상에 따라 생성되는 전류의 측정을 위해 구비된 상대 전극(counter electrode); 및
    작동 전극으로의 전압 인가를 위해 구비된 상대 전극인 기준 전극(reference electrode)을 더 포함하며,
    혈당측정기에 삽입 가능하도록 구현된 것을 특징으로 하는 전기화학적 혈당센서의 제조방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 전기화학적 혈당센서는 상기 혈당측정기에서 금속기재와 기준 전극 간에 일정 크기의 전압이 인가되되 금속기재에 더 낮은 전압이 인가되는 것을 특징으로 하는 전기화학적 혈당센서의 제조방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 일정 크기는 0.07 V 내지 0.13 V인 것을 특징으로 하는 전기화학적 혈당센서의 제조방법.
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 제1항에 있어서,
    상기 고정층 형성 형성 단계는,
    반응층이 형성된 금속기재의 부위를 제2 고정 물질이 포함된 제2 용액에 침지시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 전기화학적 혈당센서의 제조방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 제2 용액은 1.4 % (v/v) 내지 1.6 % (v/v) 함량의 제2 고정 물질이 포함된 용액인 것을 특징으로 하는 전기화학적 혈당센서의 제조방법.
  15. 삭제
  16. 삭제
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