EP1042944A1 - Verfahren und vorrichtung zur vermessung, kalibrierung und verwendung von laser-pinzetten - Google Patents

Verfahren und vorrichtung zur vermessung, kalibrierung und verwendung von laser-pinzetten

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EP1042944A1
EP1042944A1 EP98966384A EP98966384A EP1042944A1 EP 1042944 A1 EP1042944 A1 EP 1042944A1 EP 98966384 A EP98966384 A EP 98966384A EP 98966384 A EP98966384 A EP 98966384A EP 1042944 A1 EP1042944 A1 EP 1042944A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
particle
focus
field
particles
forces
Prior art date
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Granted
Application number
EP98966384A
Other languages
English (en)
French (fr)
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EP1042944B1 (de
Inventor
Günter FUHR
Thomas Schnelle
Torsten Müller
Hermine Hitzler
Karl-Otto Greulich
Shamci Monajembashi
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Evotec OAI AG
Original Assignee
Evotec Biosystems GmbH
Evotec OAI AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Evotec Biosystems GmbH, Evotec OAI AG filed Critical Evotec Biosystems GmbH
Publication of EP1042944A1 publication Critical patent/EP1042944A1/de
Application granted granted Critical
Publication of EP1042944B1 publication Critical patent/EP1042944B1/de
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Expired - Lifetime legal-status Critical Current

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Classifications

    • H—ELECTRICITY
    • H05—ELECTRIC TECHNIQUES NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • H05H—PLASMA TECHNIQUE; PRODUCTION OF ACCELERATED ELECTRICALLY-CHARGED PARTICLES OR OF NEUTRONS; PRODUCTION OR ACCELERATION OF NEUTRAL MOLECULAR OR ATOMIC BEAMS
    • H05H3/00—Production or acceleration of neutral particle beams, e.g. molecular or atomic beams
    • H05H3/04—Acceleration by electromagnetic wave pressure
    • G—PHYSICS
    • G21—NUCLEAR PHYSICS; NUCLEAR ENGINEERING
    • G21K—TECHNIQUES FOR HANDLING PARTICLES OR IONISING RADIATION NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; IRRADIATION DEVICES; GAMMA RAY OR X-RAY MICROSCOPES
    • G21K1/00—Arrangements for handling particles or ionising radiation, e.g. focusing or moderating
    • G21K1/006—Manipulation of neutral particles by using radiation pressure, e.g. optical levitation

Definitions

  • the invention relates to methods and devices for measuring and calibrating optical field traps and the determination of optically induced forces in all three spatial directions, which are exerted on micrometer-sized particles, and for the use of optical field traps.
  • Optical field traps also called “optical tweezers”, “laser tweezers” or “optical traps” have been used for about two decades in the fields of biotechnology, medicine and molecular biology as well as in other technical fields for the positioning and manipulation of micrometer-sized and sub-micrometer-sized particles used [G. Weber et al. in “Int. Rev. Cytol.” Vol. 131, 1992, p. 1; S.M. Block in “Nonmvasive Techniques in Cell Biology", Wiley-Liss., New York 1990, p. 375].
  • the development of the laser tweezers is mainly due to A. Ashkin [A. Ashkin in "Phys. Rev. Lett.”, Vol.
  • the principle of particle capture by optically induced forces is based on the fact that, in addition to the light pressure, which always pushes a particle away from the light source, gradient forces occur which lead to a particle reaching a focus or being held stable in it or with it is moved.
  • the prerequisite is that the absorption and reflection of the particle is low, while the difference in the refractive index from the surrounding solution should be as large as possible.
  • Electromagnetic field cages go to W. Paul [W. Paul et al. n "Research reports from the Ministry of Economics of North Rhine-Westphalia", No. 415 and 450; W. Paul m “Phys. Blatter”, Vol. 46, 1990, p. 227]. They are mainly used in elementary particle physics to capture and measure atomic particles at low gas pressure. In 1993, liquid-filled, three-dimensional microfield cages using dielectrophoretic forces were presented for the first time [T. Schnelle et al. m "Biochim. Biophys. Acta", Vol. 1157, 1993, p. 127].
  • the surface charges induced in the E field are arranged and polarized in such a way that repulsive forces act on the particle [G. Fuhr et al. m "Biochim. Biophys. Acta” Vol. 1201, 1994 p. 353].
  • This principle can also be used for catching, positioning and moving particles [T. Schnelle et al. in "Biochim. Biophys. Acta", Vol. 1157, 1993, p. 127].
  • Objects corresponding to the Mie and Rayleigh particles can also be held in these dielectric field cages.
  • a calibratable flow acts on a particle caught in the laser focus.
  • a catching force can be calculated from this flow rate using Stokes friction.
  • the main disadvantage of this method is that it is difficult to carry out repeated measurements with the same particle and that only very complicated channel structures allow measurement in different spatial directions.
  • a truly spatial (x, y, z) force measurement is not possible.
  • This method is also limited to certain particle shapes (spheres, ellipsoids) with a smooth surface.
  • a tearing off of a particle is examined by means of laser tweezers, which is attached to a base in a defined manner.
  • the scattering of an evanescent surface wave with total reflection is used to determine the movement of the object in the z direction (perpendicular to the surface) with an accuracy in the nm range.
  • This method too, cannot be used in all spatial directions and, above all, cannot be used quickly, but requires a high level of calibration and equipment.
  • the optical radiation field m near the surface does not correspond to the conditions m of free solution.
  • Adhesion forces intermolecular attraction forces acting between particles.
  • Both synthetic and natural particles based on biological materials tend to stick to each other when they come into contact with one another.
  • Adhesion schemes can be distinguished depending on the type of adhesion m non-specific and specific adhesions or on the type of bonds that occur m adhesions with chemical bonds or adhesions with van der Waals bonds.
  • the determination of the specificity, the type of binding and thus the binding forces in the case of adhesions between microscopic particles are of great interest in the fields of biology, medicine and pharmacology.
  • the invention is based on the object of specifying improved methods for handling particles with laser tweezers, with which in particular the determination of optically induced forces or forces and the exertion of predetermined forces is made possible.
  • a method according to the invention is intended in particular to ensure the determination of force with increased measuring speed and better reproducibility and accuracy. Forces which act on microscopic particles are to be determined via an electrical signal in a form which can be quickly repeated and automated, the forces being to be detected with an accuracy in the pN range and below in any spatial direction.
  • the object of the invention is also to provide devices for implementing the method.
  • the focus of the optical cage with the particle is first positioned at a distance from the capture area, ie at a distance from the electric field minimum of the capture area, which represents an electric field cage.
  • the field forces in the optical cage and / or in the electrical capture area and / or the distance between the optical cage and the electrical capture area are then varied until a transition movement of the particle from the focus to the capture area or vice versa takes place.
  • the field properties given when the transition movement occurs become force determination according to the invention or the transitional movement itself is used to exert predetermined forces.
  • forces acting on the particle or particles are thus generated within a microelectrode arrangement with a three-dimensional electrical field, which has electrical field gradients forming the capture region.
  • the minimum of the electrical field forces corresponds to the catch area.
  • the minimum of the optical induced forces is the focus of the optical cage.
  • a field bar is present between the two M ima, which depends on the amplitudes of the effective electric fields, the light output of the optical cage and the distance of the Mmima.
  • the particle or particles can now be positioned within the microelectrode arrangement in a predetermined manner or (in the case of several particles) separated from one another.
  • the optically induced forces acting on a particle in the focus of an optical cage In this embodiment, only one particle is present in the focus or temporarily in the capture area of the microelectrode arrangement.
  • the field properties, ie the amplitude of the electric field, the light output and / or the distance of the Mmima is varied until the transition movement of the particle between the Mmima, ie between the focus and the capture range or vice versa.
  • the optically induced forces in the optical cage can be determined from the amplitude of the electrical fields in the microelectrode arrangement required to trigger the transition movement.
  • each particle is arranged in the focus of the optical cage and one particle in the electrical capture area.
  • the field properties in the microelectrode arrangement can be varied in order to determine those field properties in which the transition movement of the particle takes place from the focus to the particle in the capture region or vice versa.
  • This principle can also be implemented with particle groups in focus or in the capture area.
  • the adhesive force acting between the particles can be determined by observing the transitional movement or a tear-off movement between the particles.
  • a particular advantage of the invention is that these processes can be observed and evaluated specifically for the substance, particle and type of material.
  • microscopic particles in a microelectrode arrangement with the above-mentioned, simultaneously present at least two field ima, with the setting of predetermined field forces relative to one another, are positioned or combined at least temporarily, or groups or assemblies such as these are disassembled .
  • This assembly manipulation according to the invention is in turn preferably combined with the above-mentioned aspects of the invention, but can also be implemented as a function thereof when predetermined (albeit unknown) electrical and / or optical field forces are set.
  • the invention also relates to a microsystem which is set up to form an opto-electrical double cage which is produced by the simultaneous generation of at least two field mmima of an electrical capture region and an optical cage.
  • a fluidic microsystem has a microelectrode arrangement for generating the electrical capture area and a structure which is transparent for forming the optical cage within the microelectrode arrangement.
  • the microsystem is preferably a fluidic microsystem, which can be open on one side, hm to a light source for producing the optical cage.
  • a particle in “laser trapping”, a particle can be kept in a local equilibrium, which is formed by an optical trap or an optical cage in the focus of at least one laser beam.
  • a particle In a high-frequency microfield cage, a particle can be kept in a local equilibrium, which is formed by an electrical capture range of the respectively realized field distribution.
  • the catch area can be formed by a point, a line or a spatial area. In the following description, reference is made to the implementation of the catch area as a catch point without limitation, but the invention can be implemented accordingly with catch areas of any design.
  • the invention is based on the above
  • the first point of view is to determine the optically induced forces in the optical trap (optical cage) from the electrical forces on the particle during the transition between the equilibrium states, ie from the focus to the capture point or vice versa.
  • the object is achieved in particular in that the "laser trappmg" takes place in an electrical high-frequency microfield cage, the field forces and electrical field distribution of which are known and which is set up to decouple the laser light required to form the optical cage.
  • the decoupling of the laser light required to form the optical cage is achieved by various structural measures on the microfield cage. These include, in particular, the attachment of at least a subset of the electrodes of the microfield cage to a substrate which is transparent and so thin that a laser light source can be guided close enough to the microfield cage so that the focus is formed on it.
  • the laser light source includes u. a.
  • the focal length is usually in the range of a few hundred micrometers.
  • the transparent substrate thus preferably has a thickness smaller than the focal length of the laser light source.
  • the invention allows the qualitative and / or quantitative parameters of the optically induced forces on a particle to be recorded.
  • the quantitative determination the optically induced forces can be made from a few large z. B. include the locations of the focus and the capture point, the field distribution between the electrodes, the electrical properties of the particle and its surrounding solutions as well as the shape, phase position, frequency and amplitude of all electrode signals. All of these variables can be determined independently of the actual measurement or in advance by purely electrical means or via a unique numerical simulation of the field distribution in the high-frequency cage.
  • the optically induced forces that act on the particle can be determined from the amplitude of the electrical control signals of the electrical field cage during the transition between the equilibria (transition movement).
  • An advantage of the invention is that the force gradient of the optically induced forces is relatively steep, so that the aforementioned transition between the equilibria takes place in a threshold-like or abrupt manner and can therefore be registered particularly easily and precisely.
  • this procedure can be automated and used to calibrate the laser beam.
  • the measurements can be repeated any number of times, can be carried out in a few seconds and can also be carried out on the same particle in the environment that will be used later.
  • deviations in symmetry of the optical radiation and their intensity profiles close to and in the focal range ie also relative values, can be determined.
  • the above explanations for the determination of optical induced forces apply accordingly to the determination of ground forces, since these can be understood as an additional contribution to the electrical field forces in the electrical capture range.
  • the invention can be implemented with any particles such as synthetic particles or biological cells or their components.
  • the particle size is in the entire large range of particles that can be manipulated with laser tweezers, preferably a size smaller than 200 ⁇ m.
  • FIG. 1 shows a schematic representation of the arrangement of field cage electrodes and an optical cage according to a first embodiment of the invention
  • FIG. 2 shows a further basic illustration of the arrangement of field cage electrodes and an optical cage
  • FIG. 5 shows a curve to illustrate the captive forces of the field cage shown in FIG. 4 in the z direction
  • FIG. 6 an outline representation of the arrangement of cells in an optical cage and a capture area according to a second embodiment of the invention
  • FIG. 7 an outline representation of the arrangement of cells in a microelectrode arrangement according to a third embodiment of the invention.
  • FIG. 8 an outline representation of the arrangement of cells in a microelectrode arrangement according to a fourth embodiment of the invention.
  • the invention is described below with reference to the combination of an octopole field cage to form the capture region with a single capture laser beam to form the optical cage, but can accordingly be implemented with any field cage shapes or a plurality of laser beams.
  • a microsystem according to the invention is shown schematically in an enlarged detail.
  • the illustration shows only a microelectrode arrangement, consisting of the microelectrodes 11 to 18 (without control lines) and a microscopic particle 113 suspended between the microelectrodes in a suspension liquid.
  • the microelectrodes are arranged in planar form on opposite walls of the microsystem structure, the xy plane, for example spans a substrate plane.
  • the microelectrodes 11 to 18 are set up to be subjected to electrical potentials in such a way that field gradients with a field minimum are formed.
  • the technique of electrode control for generating a predetermined minimum is known per se and is therefore not described in detail here.
  • the location of the The field minimum depends on the phases and amplitudes of the control potentials at the microelectrodes 11 to 18 and can be set in a predetermined manner.
  • the capture range or the electrical field cage is also referred to as a high-frequency cage, since the microelectrodes are preferably subjected to high-frequency control potentials (frequency range see below) for manipulating the microscopic particles on the basis of negative dielectrophoresis.
  • the electrical high-frequency field cage formed by the microelectrodes 11 to 18 is combined with the focused light beam 19 in such a way that the focus 110a in the electrical field of the microelectrodes, i. H. is either inside the field cage 111 or in the immediate vicinity 112 outside the cage, while the field minimum is the catch point 110b of the high-frequency field cage at a spaced-apart location (for example a fraction up to several particle diameters away) (for example at position 114, characterized by the coordinates (xl, yl, zl)).
  • the determination according to the invention of optically induced field forces on the particle 113 takes place in such a way that the particle 113 is first caught in the focus of the laser beam and brought into the designated position (for example 114) by a focus shift.
  • the focus is shifted by a mechanical change in the relative positions of the microsystem and the source of the laser beam 19 by means of adjusting devices and / or deflection devices of the laser beam which are known per se.
  • the electrical polarization forces of the field cage are increased until the particle 113 is torn out of the laser focus and moves to the capture point 110b (transition movement between the local equilibria in the field mmima).
  • the transition between the local equilibria can alternatively also be carried out by increasing the laser power and moving the particle from the catch area of the field cage to the focus and / or by shifting the locations of the catch points or the focus and determining the path or distance the field mmima occurs at which the transition movement takes place. Since the electrical polarization forces on the particle and the field distribution between the electrodes 11 to 18 are known, there is a direct proportionality between the measurable laser power in the focal region, the amplitude of the electrical signals and the optically induced forces acting on the particle. By repeating the procedure and moving the particle 113 m in any spatial direction, the optically induced forces acting on the concrete particle can be determined quantitatively. It is consequently an electrical calibration of the optically induced opposing forces, which can be provided with little effort and allows forces in the range from fN to a few hundred pN to be recorded.
  • optically induced forces are thus determined in at least one case from the field or location properties of the particle 113 during a transition movement, the electrical polarization forces on the particle 113 from the field distribution, which can be calculated per se, between the microelectrodes 11 to 18 and that when the transition movement is carried out given locations of focus 110a and capture point 110b can be determined. These locations can be measured with an observation microscope. In all other cases, a relative determination of the optically induced forces can be made on the basis of the aforementioned proportionality.
  • FIG. 2 shows an expanded representation of a system for measuring the optically induced forces that act on em
  • the microfield cage will formed by microelectrodes which are attached to mutually facing surfaces of the substrates 27, 29.
  • the substrates 27, 29 are separated by a spacer 28, which forms a suspension space in which the particle to be examined is exposed to the field of the microfield cage.
  • the upper substrate in FIG. 2 is sufficiently thin that the focus of the optical cage in the suspension space can be adjusted.
  • Cells or other microparticles suspended in a solution are wound into the channel 22 via an opening 21 and then enter the field cage 23, the output electrodes 24a-d of which have a high-frequency field (kHz or MHz range, any signal shape (e.g. square wave -, sine, triangle or other signal forms), amplitude a few mV up to some 10 V)) can be applied.
  • kHz or MHz range any signal shape (e.g. square wave -, sine, triangle or other signal forms), amplitude a few mV up to some 10 V))
  • an electrical field camera for emulsified microparticles is formed in the channel 22. If there is a particle in the cage 23, the input electrodes 25a-d are also switched on and / or the flow is stopped.
  • the particle is moved with the laser beam 26 in the field cage space and the measurement of the optically induced forces is carried out.
  • the typical phase shifts of the electrode signals for two possible alternating field and two rotation field control types (2 * AC field or 2 * red field) for electrical trapping are summarized in Table 1.
  • Tab. 1 Phase control of the electrode signals of an octopole
  • the red field exerts a torque on the particle, which leads to the formation of a rotation (last line of Tab. 1), which can also be used to determine the force. Torque compensation takes place with the values from the penultimate line of Table 1.
  • the electrodes have been processed in planar form on two glass substrates 27, 29 using semiconductor technology methods, which are liquid-tightly mounted overhead by a spacer 28, so that they are immersed in the channel liquid 22.
  • semiconductor technology methods which are liquid-tightly mounted overhead by a spacer 28, so that they are immersed in the channel liquid 22.
  • the substrate 27 is 150 to 200 ⁇ m thick
  • the substrate 29 consists of 0.5 to 1 mm thick glass or plastic.
  • FIG. 3 shows the relationship between the laser output power, ie the magnitude of the optically induced forces and the amplitudes of the cage voltages, ie the amplitudes of the electrical potentials with which the microelectrodes are applied.
  • larger amplitudes of the cage voltages are required in order to achieve the transition movement of the respective particle between the focus and the capture point.
  • the catching power of the optical trap is weaker in the z direction (upper curve) than in the x or y direction (lower curve).
  • the m Figure 5 shown capture forces of the laser tweezers m z direction.
  • the curve shown relates to a signal amplitude of the cage electrodes of 10 V. Experiments were able to apply amplitudes up to 30 V.
  • a particular advantage of the invention is that the method can be used quickly and easily, in particular in the ambient medium to be used later with the particles to be examined or manipulated under comparable conditions. Furthermore, this method is not limited to specific particle and surface shapes, but can be implemented with any particle geometry. The forces on connected particle groups (e.g. aggregates or the like) of any shape can even be determined.
  • FIG. 6 shows a microelectrode arrangement in octopole configuration with the microelectrodes 61 to 68 analogous to FIG. 1.
  • the microelectrodes 61 to 64 and 65 to 68 are in a microsystem set up to implement the method according to the invention in two spaced apart planes to form an electrical field cage with a arranged field minimum forming the catch area or point.
  • the electrical field cage is formed inside the microelectrode arrangement, which is schematically outlined by the cuboid shown in FIG. 6.
  • Reference numeral 69 designates a light beam (preferably laser beam) focused in the interior of the microelectrode arrangement.
  • the first particle in the form of a biological cell 611 is in the focus of the light beam 69.
  • a second particle, which in the example shown is also a biological cell 612, is located in the catch point of the electric field cage.
  • two cells 611, 612 m in succession are introduced into the interior of the microelectrode arrangement 61 to 81. This is preferably done with the coil technology explained with reference to FIG. 2, in which the microelectrode arrangement is connected to a channel structure of a fluidic microsystem.
  • the first cell 611 is wound in the microelectrode arrangement and, after the octopole field has been activated completely, is kept in the electrical capture range.
  • the first cell 611 with the optical cage, which is formed by the laser beam 69 is taken over and positioned at a distance from the capture region.
  • the second cell 612 is then wound in and positioned in the capture area, for example in the middle of the microelectrode arrangement 61 to 68.
  • both particles are biological cells of the same or different types or biological cells or cell components on the one hand and / or synthetic particles with predetermined active substances on the other hand.
  • the cells 611, 612 are brought into contact, an adhesive bond being formed between the two cells.
  • Adhesive binding is accomplished, for example, by one of the following techniques. First, it is possible to release the first cell 611 by switching off the laser beam 69 and thereby moving under the action of the electrical field forces hm to the catch area of the electrical field cage, where the second cell 612 is touched and the adhesive bond is formed. Secondly, it is possible to adjust the focus of the laser beam 69 m with respect to the capture area so that the first cell 611 is brought into contact with the second cell 612 or is even pressed against it with a predetermined force.
  • the mutual force of the anemander printing of the cells can be derived from the electrical field forces in the capture area and the optical forces in the focus of the laser beam 69, which are determined, for example, according to the technique explained above.
  • the adhesive bond is set for a predetermined time range (e.g. around 0.1 to 10 seconds). But there are also longer times of e.g. up to 1000 seconds possible.
  • the binding forces (interaction forces, strength of adhesion) between the cells are determined as follows.
  • the force is determined analogously to the above-described determination of the optically induced forces on an individual particle by varying the field properties and determining those Field strengths in the electrical capture area and optical cage, in which a tear-off movement takes place between the cells.
  • the laser beam 69 focused on the first cell 611 is repeatedly adjusted so that the focus moves away from the capture area and, if the first cell 611 has not moved with the focus, is reset and with a step-wise increased light output acted upon.
  • the tear-off force between the two cells and thus the mutual binding force can be determined from the light output at which the first cell 611 is carried with the adjusted focus.
  • Other possibilities of this force determination result from the step-by-step variation of the electrical potential amplitudes and adjustment of the location of the capture area by appropriate control of the microelectrodes 61 to 68. Combinations of both techniques can also be used to vary the field properties.
  • Preferred applications of the procedure described with reference to FIG. 6, which until now could not be implemented or could only be implemented with unacceptably high expenditure, are the precisely timed contact of two or more biological cells of the same or different type. It is therefore possible to use it for tests which are of pharmacological and medical-diagnostic interest. Examples of the processes that occur are the stimulation of the second cell 612 by the temporary contact by the first cell 611, so that the behavior of the second cell 612 is changed. This changed exposure behavior can then be coupled a third cell (not shown) can be tested. Another example is the so-called screening of peptide or other molecular libraries by first introducing a first cell of a first type into the microelectrode arrangement.
  • the surface receptors of the first cell are then brought into contact with a test substance or active substance from a molecular library via the suspension solution in the microsystem. Then a second cell (or a synthetic particle with well-binding surface molecules) is brought up to the first cell.
  • a test substance or active substance from a molecular library via the suspension solution in the microsystem.
  • a second cell or a synthetic particle with well-binding surface molecules is brought up to the first cell.
  • FIG. 7 shows, analogously to FIGS. 1 and 6, a microelectrode arrangement with the microelectrodes 71 to 78 and a light beam 79 focused in the interior of the microelectrode arrangement.
  • a first cell 711 is captured and positioned in the electrical capture region of the microelectrode arrangement 71 to 78.
  • a second cell 712 or a synthetic particle with an active substance is captured with the light beam 79 and guided past the first cell 711 along a predetermined path 713 or brought into contact with it for a predetermined contact time. Even if there is no firm bond or adhesion between the cells or particles, a chemical signal transmission can take place by touching the surfaces, which can then be analyzed. changes in one or both cells. Instead of the individual cells, cell groups or aggregates can also be brought together and separated again for mutual stimulation for a predetermined time under the action of predetermined forces.
  • This method of stimulating biological cells or cell groups has numerous uses in medicine and biotechnology.
  • the stimulation e.g. by applying a drug from the environmental solution, which previously could only be achieved with great effort for individual cells, it can thus be carried out cell-specifically under defined and reproducible conditions.
  • stimulations or inhibitions
  • the conditions occurring in organisms can advantageously be simulated using the method according to the invention.
  • the procedure illustrated in FIG. 7 can also advantageously be combined with the above-described determination of optically induced forces, but can also be implemented independently of this by setting predetermined field properties. The same also applies to the method for exerting predetermined forces on cells or cell groups for aggregate formation explained with reference to FIG. 8.
  • FIG. 8 again shows a microelectrode arrangement with the microelectrodes 81 to 88 and a light beam 89 focused in the interior of the microelectrode arrangement.
  • a large number of biological cells are wound into the interior of the microelectrode arrangement.
  • cells are targeted in the capture area. leads and where appropriate positioned relative to existing cells.
  • four cells 811 to 814 are shown in FIG. 8 in the electrical capture area, to which a fifth cell 815 is added in a predetermined position (corresponding to the direction of the arrow).
  • the fifth cell 815 is pressed for a predetermined time with a predetermined force against the already formed cell group 811 to 814 in order to enable the formation of forces in this predetermined relative position.
  • any cell aggregates with predetermined aggregate shapes can be built.
  • This procedure can also be implemented with synthetic microparticles that can be negatively polarized and are repelled by the microelectrodes in the electrical capture area (negative dielectrophoresis).
  • a device consists of an arrangement of a fluidic microsystem 91, an illumination device 92 for producing an optical cage in a microelectrode arrangement of the microsystem 91, the microsystem 91 and the illumination device 92 being adjustable relative to one another with an adjusting device 93, and an observation and / / or sensor device 94 (eg microscope), as is shown schematically in FIG. 9.
  • the microsystem is provided with fluidics and potential control device 95, as is known per se.
  • the illumination device 92 is, for example, a laser tweezer known per se, which contains, for example, a diode laser or a semiconductor laser as the light source and a microscope arrangement for focusing.

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Description

Verfahren und Vorrichtung zur Vermessung, Kalibrierung und Verwendung von Laser-Pinzetten
Die Erfindung betrifft Verfahren und Vorrichtungen zur Vermessung und Kalibrierung optischer Feldfallen und der Bestimmung von optisch induzierten Kräften in allen drei Raumrichtungen, die auf mikrometergroße Teilchen ausgeübt werden, und zur Verwendung optischer Feldfallen.
Optische Feldfallen, auch "optical tweezers", "Laser- Pinzetten" oder "optical traps" genannt, werden seit etwa zwei Jahrzehnten auf den Gebieten der Biotechnologie, Medizin und Molekularbiologie sowie auf anderen technischen Gebieten zur Positionierung und Manipulation mikrometergroßer und submikro- metergroßer Partikel eingesetzt [G. Weber et al . in "Int. Rev. Cytol." Bd. 131, 1992, S. 1; S.M. Block in "Nonmvasive Techniques in Cell Biology", Wiley-Liss., New York 1990, S. 375] . Die Entwicklung der Laser-Pinzette geht vor allem auf A. Ashkin zurück [A. Ashkin in "Phys. Rev. Lett.", Bd. 24, 1970, S. 156]. Das Prinzip des Partikeleinfangs durch optisch induzierte Kräfte beruht darauf, daß neben dem Lichtdruck, der stets ein Teilchen von der Lichtquelle wegdruckt, Gradienten- krafte auftreten, die dazu fuhren, daß ein Teilchen in einen Fokus gelangt bzw. stabil in diesem gehalten oder mit diesem bewegt wird. Voraussetzung ist, daß die Absorption und Reflexion des Teilchens gering ist, wahrend der Unterschied im Brechungsindex zur Umgebungslosung möglichst groß sein sollte.
Laser-Pinzetten haben in den letzten Jahren vor allem deshalb eine größere Verbreitung erlangt, weil bei gleicher, stets starker Fokussierung des Lichtstrahls sowohl Teilchen, die großer als die Wellenlange (sogenannte Mie-Teilchen) , als auch Teilchen, die kleiner als die Wellenlange sind (sogenannte Rayleigh-Teilchen), gefangen werden können. Das sind vor allem biologische Objekte wie Zellen, Organellen und andere Zeilbestandteile als auch große Moleküle (wie DNA) und künstliche Mikropartikel [S.M. Block et al. in "Nature", 1990, S. 348; E.M. Bonder et al . in "J. Cell Biol.", Bd. 11, 1990, S. 421].
Elektromagnetische Feldkafige gehen auf W. Paul [W. Paul et al. n "Forschungsberichte des Wirtschaftsministeriums Nord- rhem-Westfalen", Nr. 415 und 450; W. Paul m "Phys. Blatter", Bd. 46, 1990, S. 227] zurück. Sie werden vor allem m der Ele- mentarteilchenphysik zum Fangen und Vermessen atomarer Teilchen bei niedrigem Gasdruck verwendet. 1993 wurden erstmals flussigkeitsgefullte, dreidimensionale Mikrofeldkafige unter Nutzung dielektrophoretischer Kräfte vorgestellt [T. Schnelle et al. m "Biochim. Biophys . Acta", Bd. 1157, 1993, S. 127]. Wird die Leitfähigkeit einer Suspensionslosung hoher gewählt, als die mittlere Leitfähigkeit des Teilchens, so sind die im E-Feld induzierten Oberflachenladungen an dem Partikel derart angeordnet und gepolt, daß auf das Partikel abstoßende Kräfte wirken [G. Fuhr et al . m "Biochim. Biophys. Acta" Bd. 1201, 1994 S. 353]. Auch dieses Prinzip kann zum Fangen, Positionieren und Bewegen von Teilchen benutzt werden [T. Schnelle et al. in "Biochim. Biophys. Acta", Bd. 1157, 1993, S. 127]. In diesen dielektrischen Feldkafigen können ebenfalls den Mie- als auch Rayleigh-Teilchen entsprechende Ob ekte gehalten werden. Eine Kombination beider Prinzipien zum Zwecke einer höheren Fangkraft wurde mehrfach vorgeschlagen, da das optische und das elektrische Kraftfeld nahezu nicht miteinander interferieren [G. Fuhr et al . in "Topics in Current Chemistry", Bd. 194, 1998, S. 84] .
Ein bisher ungelöstes Problem ist die Ermittlung der real im optischen Feld (Lasertrap) auf ein Teilchen wirkenden optisch induzierten Kräfte. Hierzu gibt es mehrere, außerordentlich zeit- und gerateaufwendige Methoden, die sich wie folgt zusammenfassen lassen:
Variante I [K. Svoboda et al . in "Ann. Rev. Biophys. Biomol . Struc", 1994, S. 247] :
Auf ein im Laserfokus gefangenes Teilchen wirkt eine kali- bπerbare Strömung. Gesucht wird die Stromungsgeschwindigkeit, bei der das Teilchen gerade aus dem Laserfokus gerissen wird oder gerade noch in diesem verbleibt. Aus dieser Stromungsgeschwindigkeit kann über die Stokes'sche Reibung eine Fangkraft berechnet werden. Nachteilig an diesem Verfahren ist vor allem, daß es schwer fallt, mit e n und demselben Teilchen wiederholt Messungen auszufuhren, und daß nur sehr komplizierte Kanalaufbauten eine Vermessung m verschiedene Raumrichtungen erlauben. Eine wirklich räumliche (x-, y-, z-) Kraftvermessung ist nicht möglich. Dieses Verfahren ist ferner auf bestimmte Teilchenformen (Kugel, Ellipsoid) mit glatter Oberflache beschrankt .
Variante II [C.P. Dennis m "Faraday Discuss. Chem. Soc", Bd. 90, 1990, S. 209] :
Es erfolgt eine Messung der mittleren Auslenkung eines Teilchens im Laserfokus aufgrund der Brown' sehen Stoße. Hier ist zwar prinzipiell eine Vermessung in alle Raumrichtungen möglich, sie erfordert jedoch eine sehr präzise Messung der Partikelbewegung mit Submikrometergenauigkeit und kann für die meisten Mie-Teilchen nicht verwendet werden, da diese zu groß für eine merkliche Auslenkung sind. Hinzu kommt, daß die Messungen mit steigender Laserleistung immer schwieriger und ungenauer werden und daß nur im sehr engen Fokalbereich des Lasers gearbeitet werden kann. Variante III [C.P. Dennies et al . in "Applied Optics", 1993, S. 1629] :
Es wird ein Abreißen eines Teilchens mittels einer Laser- Pinzette untersucht, das in definierter Weise an einer Unterlage befestigt ist. Dabei wird die Streuung einer evaneszenten Oberflachenwelle bei Totalreflexion benutzt, um die Bewegung des Objektes in z-Richtung (senkrecht zur Oberflache) mit einer Genauigkeit im nm-Bereich zu bestimmen. Auch dieses Verfahren kann nicht m alle Raumrichtungen und vor allem nicht rasch angewendet werden, sondern erfordert einen hohen Kalibrier- und Gerateaufwand. Außerdem entspricht das optische Strahlungsfeld m Oberflachennahe nicht den Verhaltnissen m freier Losung.
Allgemein steht somit eine schnelle und leicht anzuwendende Methode zur Kraftmessung, die vor allem auch in dem spater zu nutzenden Umgebungsmedium eines Teilchens, mit eben diesem Teilchen und unter vergleichbaren Bedingungen angewendet werden kann, noch aus.
Ein weiteres, bisher ungelöstes Problem bei der Handhabung mikroskopisch kleiner Teilchen ist die Ermittlung der zwischen Teilchen wirkenden zwischenmolekularen Anziehungskräften (Adhäsionskräfte) . Sowohl synthetische, als auch natürliche Partikel auf der Basis biologischer Materialien (insbesondere biologische Zellen oder Zeilbestandteile) neigen dazu, bei gegenseitigem Kontakt aneinander zu haften. Adhasionserschemun- gen können je nach Art der Adhäsion m unspezifische und spezifische Adhäsionen oder nach Art der auftretenden Bindungen m Adhäsionen mit chemischen Bindungen oder Adhäsionen mit van-der-Waals-Bmdungen unterschieden werden. Die Ermittlung der Spezifitat, des Bindungstyps und damit der Bmdungskrafte bei Adhäsionen zwischen mikroskopisch kleinen Partikeln sind von hohem Interesse im Bereich der Biologie, Medizin und Pharmakologie. So besteht ein Bedarf an quantifizierbaren, wieder- holbaren und schonenden Verfahren zur Erfassung von Adhasion- serschemungen an einzelnen Teilchen, z.B. zur Erfassung spezifischer Bindungen von Makromolekülen (die hier ebenfalls als mikroskopische Teilchen aufgefaßt werden) an biologischen Zellen für die Untersuchung der Immunantwort oder für die Erkennung von Infektions- oder anderen Krankheitszustanden von Zellen. Ein weiteres Beispiel sind Wechselwirkungen zwischen mikroskopischen Teilchen, bei denen spezifische Rezeptor-Ligand- Systeme auf den Teilchenoberflachen wirksam werden.
Ein Verfahren zur Einstellung vorbestimmter Adhasionserschei- nungen zwischen einzelnen suspendierten mikroskopischen Teilchen oder zur Bestimmung der dabei auftretenden Bmdungskrafte ist bisher nicht verfugbar.
Aus der Publikation von K. Morishima et al . in "Proc. of IEEE", 1997, S. 155, ist der kombinierte Einsatz optisch induzierter Kräfte und elektrischer Feldkrafte zur Manipulierung von Bakterien bekannt. Dabei ist vorgesehen, in einem Mikrosy- stem unter mikroskopischer Beobachtung innerhalb einer Bakte- rienanhaufung eine vorbestimmte Bakterie mit einer Laser- Pinzette emzufangen und zu fixieren, wahrend die übrigen Bakterien unter Wirkung der elektrischen Feldkrafte von der einzelnen, fixierten Bakterie weg bewegt werden. Die von K. Morishima et al . beschriebene Verfahrensweise ist in ihrer Anwendung auf die dort beschriebene Trennung einzelner Teilchen aus einer Gruppe von vielen Teilchen beschrankt. Es ist lediglich vorgesehen, die elektrischen Felder ein- oder auszuschalten, um eine trennende Teilchenbewegung zu bewirken. Eine Untersuchung der Wechselwirkung zwischen Teilchen wird damit nicht ermöglicht. Des weiteren ist es ausgeschlossen, daß einzelne Teilchen zu einer vorhandenen Gruppe von Teilchen oder einem Teilchenaggregat zur Erzielung bestimmter Wechselwirkungen bewegt werden. Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, verbesserte Verfahren zur Handhabung von Teilchen mit Laser-Pinzetten anzugeben, mit denen insbesondere die Ermittlung von optisch induzierten Kräften oder Bmdungskraften und die Ausübung vorbestimmter Kräfte ermöglicht wird. Ein erf dungsgemaßes Verfahren soll insbesondere die Krafteermittlung mit einer erhöhten Meßge- schwmdigkeit und einer besseren Reproduzierbarkeit und Genauigkeit gewährleisten. Die Ermittlung von Kräften, die auf mikroskopische Teilchen wirken, soll über ein elektrisches Signal in rasch wiederholbarer und automatisierbarer Form erfolgen, wobei die Kräfte mit einer Genauigkeit im pN-Bereich und darunter in beliebigen Raumrichtungen erfaßt werden sollen. Die Aufgabe der Erfindung ist es auch, Vorrichtungen zur Implementierung der Verfahren anzugeben.
Die genannten Aufgaben werden durch Verfahren bzw. Vorrichtungen mit den Merkmalen gemäß den Patentansprüchen 1 bzw. 17 gelost. Vorteilhafte Ausfuhrungsformen und Verwendungen der Erfindung ergeben sich aus den abhangigen Ansprüchen.
Erf dungsgemaß ist insbesondere vorgesehen, mindestens ein mikroskopisches Teilchen im Fokus eines optischen Käfigs in einer Mikroelektrodenanordnung einzufangen und m Bezug auf einen elektrischen Fangbereich (o. Fangpunkt) zu positionieren, der durch elektrische Feldgradienten m der Mikroelektrodenanordnung gebildet ist. Der Fokus des optischen Käfigs mit dem Teilchen wird zunächst mit Abstand vom Fangbereich, d.h. mit Abstand vom elektrischen Feldminimum des Fangbereiches, der einen elektrischen Feldkafig darstellt, positioniert. Anschließend werden die Feldkrafte im optischen Käfig und/oder im elektrischen Fangbereich und/oder der Abstand zwischen dem optischen Käfig und dem elektrischen Fangbereich variiert, bis eine Ubergangsbewegung des Teilchens vom Fokus zum Fangbereich oder umgekehrt erfolgt. Je nach Anwendungsfall werden die beim Eintritt der Ubergangsbewegung gegebenen Feldeigenschaften zur erfmdungsgemaßen Kraftebestimmung oder die Ubergangsbewegung an sich zur Ausübung vorbestimmter Kräfte verwendet.
Entsprechend der erf dungsgemaßen Verfahrensweise werden somit innerhalb einer Mikroelektrodenanordnung mit einem dreidimensionalen elektrischen Feld, das elektrische, den Fangbereich bildende Feldgradienten aufweist, auf das oder die Teilchen wirkende Kräfte erzeugt, deren Felder jeweils ein Minimum besitzen. Das Minimum der elektrischen Feldkrafte entspricht dem Fangbereich. Das Minimum der optischen induzierten Kräfte ist der Fokus des optischen Käfigs. Zwischen beiden M ima ist eine Feldbarπere vorhanden, die von den Amplituden der wirksamen elektrischen Felder, der Lichtleistung des optischen Käfigs und dem Abstand der Mmima abhangt. Je nach Einstellung dieser Großen können nun das oder die Teilchen innerhalb der Mikroelektrodenanordnung in vorbestimmter Weise positioniert oder (bei mehreren Teilchen) voneinander getrennt werden.
Gemäß einem ersten wichtigen Gesichtspunkt der Erfindung ist vorgesehen, die auf ein Teilchen im Fokus eines optischen Käfigs wirkenden, optisch induzierten Kräfte zu bestimmen. Bei dieser Ausfuhrungsform ist nur ein Teilchen im Fokus bzw. zeitweilig im Fangbereich der Mikroelektrodenanordnung vorhanden. Die Feldeigenschaften, d.h. die Amplitude des elektrischen Feldes, die Lichtleistung und/oder der Abstand der Mmima, wird variiert, bis die Ubergangsbewegung des Teilchens zwischen den Mmima, d.h. zwischen dem Fokus und dem Fangbereich oder umgekehrt, erfolgt. Überraschenderweise konnte festgestellt werden, daß die Ubergangsbewegung sehr genau und reproduzierbar ermittelbar ist. Aus der zum Auslosen der Ubergangsbewegung erforderlichen Amplitude der elektrischen Felder in der Mikroelektrodenanordnung lassen sich die optisch induzierten Kräfte im optischen Käfig ermitteln. Gemäß einem zweiten wichtigen Gesichtspunkt der Erfindung ist vorgesehen, die Bmdungskrafte zwischen mehreren Teilchen (z.B. zwei Teilchen) zu bestimmen. Bei dieser Ausfuhrungsform ist jeweils em Teilchen im Fokus des optischen Käfigs und em Teilchen m elektrischen Fangbereich angeordnet. Wiederum lassen sich die Feldeigenschaften in der Mikroelektrodenanordnung variieren, um diejenigen Feldeigenschaften festzustellen, bei denen die Ubergangsbewegung des Teilchens vom Fokus zum Teilchen im Fangbereich oder umgekehrt erfolgt. Dieses Prinzip ist entsprechend auch mit Teilchengruppen im Fokus bzw. im Fangbereich realisierbar.
Aus den elektrischen Feldkraften und - bei Kombination der Bestimmung von Bmdungskraften mit der Bestimmung optisch induzierter Kräfte gemäß dem ersten Gesichtspunkt - den optisch induzierten Kräften können durch Beobachtung der Ubergangsbewegung oder einer Abreißbewegung zwischen den Teilchen die zwischen den Teilchen wirkenden adhasiven Bmdungskrafte ermittelt werden. Em besonderer Vorteil der Erfindung beteht darin, daß diese Vorgange stoff-, teilchen- und bmdungstyp- spezifisch beobachtet und ausgewertet werden können.
Gemäß einem dritten wichtigen Gesichtspunkt der Erfindung ist vorgesehen, mikroskopische Teilchen m einer Mikroelektrodenanordnung mit den genannten, simultan vorhandenen mindestens zwei Feldm ima unter Einstellung vorbestimmter Feldkrafte relativ zueinander zumindest zeitweilig m Gruppen oder Aggregaten zu positionieren oder zusammenzufügen oder derartige Gruppen oder Aggregate m Teile zu zerlegen. Diese erfmdungsgema- ße Aggregatmanipulierung wird wiederum vorzugsweise mit den obengenannten Gesichtspunkten der Erfindung kombiniert, kann aber auch davon abhangig bei Einstellung vorbestimmter (wenn auch unbekannter) elektrischer und/oder optischer Feldkrafte implementiert werden. Gegenstand der Erfindung ist auch em Mikrosystem, das zur Ausbildung eines opto-elektrischen Doppelkafigs eingerichtet ist, der durch die simultane Erzeugung von mindestens zwei Feldmmima eines elektrischen Fangbereiches und eines optischen Käfigs erzeugt wird. Hierzu besitzt em fluidisches Mikrosystem eine Mikroelektrodenanordnung zur Erzeugung des elektrischen Fangbereiches und eine für die Ausbildung des optischen Käfigs innerhalb der Mikroelektrodenanordnung transparente Struktur. Das Mikrosystem ist vorzugsweise em fluidisches Mikrosystem, das einseitig, hm zu einer Lichtquelle zur Erzeugung des optischen Käfigs offen sein kann.
Es wird darauf hingewiesen, daß die zur Implementierung der Erfindung eingesetzten Techniken zum Aufbau des Mikrosystems, zur Erzeugung des elektrischen Feldkrafte und zur Erzeugung des optischen Käfigs an sich bekannt sind, so daß bei der folgenden Beschreibung hierzu auf Einzelheiten nicht eingegangen wird.
Im folgenden werden zunächst allgemeine Erläuterungen zu den der Erfindung zugrundeliegenden Prinzipien gegeben.
Beim "Laser-Trappmg" kann em Teilchen in einem lokalen Gleichgewicht gehalten werden, das durch eine optische Falle oder einen optischen Käfig im Fokus mindestens eines Laserstrahls gebildet wird. In einem Hochfrequenz-Mikrofeldkafig kann em Teilchen in einem lokalen Gleichgewicht gehalten werden, das durch einen elektrischen Fangbereich der jeweilig realisierten Feldverteilung gebildet wird. Der Fangbereich kann je nach Feldverteilung durch einen Punkt, eine Linie oder einen Raumbereich gebildet werden. In der folgenden Beschreibung wird ohne Beschrankung auf die Realisierung des Fangbereiches als Fangpunkt Bezug genommen, die Erfindung kann jedoch entsprechend mit beliebig gebildeten Fangbereichen implementiert werden. Die Erfindung beruht gemäß dem obengenannten ersten Gesichtspunkt insbesondere darauf, die optisch induzierten Krafte in der optischen Falle (optischer Käfig) aus den elektrischen Kräften auf das Teilchen beim Übergang zwischen den Gleichgewichtszuständen, d. h. vom Fokus zum Fangpunkt oder umgekehrt, zu bestimmen. Die Aufgabe wird also insbesondere dadurch gelost, daß das "Laser-Trappmg" m einem elektrischen Hochfrequenz-Mikrofeldkafig erfolgt, dessen Feldkrafte und elektrische Feldverteilung bekannt sind und der zur Emkopplung des zur Bildung des optischen Käfigs erforderlichen Laserlichts eingerichtet ist. Durch Verschieben des im Lasertrap (Fokus) gefangenen Teilchens aus dem Fangpunkt des Feldkafigs bei niedriger elektrischer Fangleistung m eine definierte Position mit Abstand vom Fangpunkt kann durch nachfolgende Erhöhung der Amplitude der elektrischen Ansteuersi- gnale des Feldkafigs genau der Schwellwert bestimmt werden, bei dem die elektrischen Feldkrafte das Teilchen aus dem optischen Fokus zurück zum Fangpunkt bewegen, oder umgekehrt.
Die Emkopplung des zur Bildung des optischen Käfigs erforderlichen Laserlichts wird durch verschiedene bauliche Maßnahmen am Mikrofeldkafig erzielt. Zu diesen zahlt insbesondere die Anbringung mindestens einer Teilgruppe der Elektroden des Mikrofeldkafigs auf einem Substrat, das transparent und so dünn ist, daß eine Laserlichtquelle genügend dicht an den Mikro- feldkafig gefuhrt werden kann, so daß m diesem der Fokus gebildet wird. Bei praktisch verfugbaren Gestaltungen von Laser- Pinzetten umfaßt die Laserlichtquelle u. a. em Emkoppelob- jektiv möglichst hoher numerischer Apertur. Dadurch ist die Brennweite üblicherweise im Bereich einiger hundert Mikrometer. Das transparente Substrat besitzt somit vorzugsweise eine Dicke kleiner als die Brennweite der Laserlichtquelle.
Die Erfindung erlaubt je nach Anwendung, die qualitativen und/oder quantitativen Parameter der optisch induzierten Krafte an einem Teilchen zu erfassen. Die quantitative Bestimmung der optisch induzierten Krafte kann aus wenigen Großen erfolgen, die z. B. die Orte des Fokus und des Fangpunktes, die Feldverteilung zwischen den Elektroden, die elektrischen Eigenschaften des Teilchens und seiner Umgebungslosungen als auch die Form, Phasenlage, Frequenz und Amplitude aller Elektrodensignale umfassen. Alle diese Großen lassen sich unabhängig von der eigentlichen Messung oder vorab auf rein elektrischem Wege oder über eine einmalige numerische Simulation der Feldverteilung im Hochfrequenzkafig bestimmen. Die optisch induzierten Krafte, die auf das Teilchen wirken, lassen sich aus der Amplitude der elektrischen Ansteuersignale des elektrischen Feldkafigs beim Übergang zwischen den Gleichgewichten (Ubergangsbewegung) bestimmen. Durch systematisches Verschieben eines in seinen passiven elektrischen Eigenschaften bekannten Partikels m x-, oder/und y-, oder/und z-Richtung können auf diese Weise die Krafte, die der fokussierte Laserstrahl auf em Teilchen dieser Große ausüben kann, quantitativ und ortsaufgelost bestimmt werden.
Em Vorteil der Erfindung ist es, daß der Kraftegradient der optisch induzierten Krafte relativ steil ist, so daß der genannte Übergang zwischen den Gleichgewichten schwellwertartig oder sprunghaft erfolgt und somit besonders leicht und genau registriert werden kann.
Erfmdungsgemaß kann diese Prozedur automatisiert und zur Kalibrierung des Laserstrahls benutzt werden. Die Messungen lassen sich beliebig oft wiederholen, lassen sich in wenigen Sekunden ausfuhren und können zudem an em und demselben Teilchen in der spater weiter verwendeten Umgebung durchgeführt werden. Neben Absolutwerten der optisch induzierten Krafte können Symmetrieabweichungen der optischen Strahlung und deren Intensitatsprofile nahe und im Fokalbereich, d.h auch relative Werte, bestimmt werden. Die obigen Erläuterungen zur Bestimmung optischer induzierter Krafte gelten entsprechend für die Bestimmung von Bmdungs- kraften, da diese als zusätzlicher Beitrag zu den elektrischen Feldkraften im elektrischen Fangbereich aufgefaßt werden können .
Die Erfindung ist mit beliebigen Teilchen wie synthetischen Partikeln oder biologischen Zellen oder deren Bestandteilen implementierbar . Die Te lchengroße liegt im gesamten Großenbe- reich von Teilchen, die mit Laserpinzetten manipulierbar sind, vorzugsweise bei einer Große kleiner als 200 μm.
Bevorzugte Ausfuhrungsbeispiele der Erfindung werden nachfolgend unter Bezugnahme auf die beigefugten Zeichnungen naher erläutert. Es zeigen:
Fig. 1: eine Prmzipdarstellung der Anordnung von Feld- kafigelektroden und eines optischen Käfigs gemäß einer ersten Ausfuhrungsform der Erfindung;
Fig. 2: eine weitere Prmzipdarstellung der Anordnung von Feldkafigelektroden und eines optischen Käfigs;
Fig. 3: eine Kurvendarstellung zur Illustration experimenteller Ergebnisse;
Fig. 4: beispielhafte Darstellungen der Feldverteilungen eines Oktopol-Feldkafigs;
Fig. 5: eine Kurvendarstellung zur Illustration der Fang- krafte des in Figur 4 gezeigten Feldkafigs in z-Richtung; Fig. 6: eine Prmzipdarstellung der Anordnung von Zellen in einem optischen Käfig und einem Fangbereich gemäß einer zweiten Ausfuhrungsform der Erfindung;
Fig. 7: eine Prmzipdarstellung der Anordnung von Zellen in einer Mikroelektrodenanordnung gemäß einer dritten Ausfuhrungsform der Erfindung;
Fig. 8: eine Prmzipdarstellung der Anordnung von Zellen m einer Mikroelektrodenanordnung gemäß einer vierten Ausfuhrungsform der Erfindung; und
Fig. 9: eine schematische Darstellung einer erfmdungsgemaßen Vorrichtung.
Die Erfindung wird im folgenden unter Bezug auf die Kombination eines Oktopol-Feldkafig zur Bildung des Fangsbereiches mit einem einzelnen Fang-Laserstrahl zur Bildung des optischen Käfigs beschrieben, ist jedoch entsprechend mit beliebigen Feld- kafigformen bzw. mehreren Laserstrahlen realisierbar.
In Fig. 1 ist em erfmdungsgemaßes Mikrosystem ausschnittsweise vergrößert schematisch dargestellt. Die Darstellung zeigt lediglich eine Mikroelektrodenanordnung, bestehend aus den Mikroelektroden 11 bis 18 (ohne Steuerleitungen) und em zwischen den Mikroelektroden in einer Suspensionsflussigkeit suspendiertes mikroskopisches Teilchen 113. Die Mikroelektroden sind in planarer Gestalt an gegenüberliegenden Wanden der Mikrosystemstruktur angeordnet, wobei beispielsweise die x-y- Ebene eine Substratebene aufspannt. Die Mikroelektroden 11 bis 18 sind dazu eingerichtet, mit elektrischen Potentialen derart beaufschlagt zu werden, daß Feldgradienten mit einem Feldminimum gebildet werden. Die Technik der Elektrodenansteuerung zur Erzeugung eines vorbestimmten Minimums ist an sich bekannt und wird deshalb hier im einzelnen nicht beschrieben. Die Lage des Feldminimums ist von den Phasen und Amplituden der Steuerpo- tentiale an den Mikroelektroden 11 bis 18 abhangig und kann m vorbestimmter Weise eingestellt werden. Der Fangbereich bzw. der elektrische Feldkafig wird auch als Hochfrequenzkafig bezeichnet, da die Mikroelektroden vorzugsweise mit hochfrequenten Steuerpotentialen (Frequenzbereich s. unten) zur Manipulierung der mikroskopischen Teilchen auf der Basis negativer Dielektrophorese beaufschlagt werden.
Gemäß Fig. 1 wird der durch die Mikroelektroden 11 bis 18 gebildete elektrische Hochfrequenzfeldkafig mit dem fokussierten Lichtstrahl 19 so kombiniert, daß sich der Fokus 110a im elektrischen Feld der Mikroelektroden, d. h. entweder innerhalb des Feldkaflgraumes 111 oder in unmittelbarer Nahe 112 außerhalb des Käfigs befindet, wahrend das Feldminimum der Fangpunkt 110b des Hochfrequenzfeldkafigs an einem dazu beabstan- deten Ort (z.B. einen Bruchteil bis zu mehrere Partikeldurchmessern entfernt) liegt (z.B. an der Stelle 114, charakterisiert durch die Koordinaten (xl,yl,zl)).
Die erfmdungsgemaße Bestimmung optisch induzierter Feldkrafte am Teilchen 113 erfolgt derart, daß zunächst das Teilchen 113 im Fokus des Laserstrahls gefangen und durch eine Fokusverschiebung in die bezeichnete Position (z.B. 114) gebracht wird. Die Fokusverschiebung erfolgt durch eine mechanische Änderung der Relativposit onen des Mikrosystems und der Quelle des Laserstrahls 19 durch an sich bekannte Verstellemπchtun- gen und/oder Umlenkeinrichtungen des Laserstrahls. Über eine Erhöhung der Amplitude der an die Elektroden angelegten Hoch- frequenzsignale werden die elektrischen Polarisationskrafte des Feldkafigs solange erhöht, bis das Teilchen 113 aus dem Laserfokus herausgerissen wird und sich in den Fangpunkt 110b bewegt (Ubergangsbewegung zwischen den lokalen Gleichgewichten in den Feldmmima) . Der Übergang zwischen den lokalen Gleichgewichten kann alternativ auch ausgeführt werden, indem die Laserleistung erhöht wird und das Teilchen aus dem Fangbereich des Feldkafigs in den Fokus bewegt wird und/oder indem die Orte der Fangpunkte oder des Fokus verschoben werden und eine Bestimmung des Weges oder Abstandes der Feldmmima erfolgt, bei dem die Ubergangsbewegung stattfindet. Da die elektrischen Polarisationskrafte auf das Teilchen und die Feldverteilung zwischen den Elektroden 11 bis 18 bekannt sind, besteht eine direkte Proportionalität zwischen der meßbaren Laserleistung im Fokalbereich, der Amplitude der elektrischen Signale und der auf das Partikel wirkenden optisch induzierten Krafte. Durch Wiederholen der Prozedur und Verschieben des Teilchens 113 m beliebigen Raumrichtungen, lassen sich die auf das konkrete Teilchen wirkenden optisch induzierten Krafte quantitativ bestimmen. Es handelt sich dabei folglich um eine elektrische Kalibrierung der optisch induzierten Gegenkräfte, die mit geringem Aufwand bereitzustellen ist, und es erlaubt, Krafte im Bereich von fN bis zu einigen hundert pN zu erfassen.
Die optisch induzierten Krafte werden somit in mindestens einem Fall aus den Feld- oder Ortseigenschaften des Teilchens 113 bei einer Ubergangsbewegung ermittelt, wobei die elektrischen Polaπsationskrafte auf das Teilchen 113 aus der an sich berechenbaren Feldverteilung zwischen den Mikroelektroden 11 bis 18 und der bei Ausfuhrung der Ubergangsbewegung gegebenen Orte des Fokus 110a und des Fangpunktes 110b ermittelt werden. Diese Orte lassen sich mit einem Beobachtungsmikroskop vermessen. In allen weiteren Fallen kann auf der Grundlage der genannten Proportionalitat eine Relativbestimmung der optisch induzierten Krafte erfolgen.
Figur 2 zeigt eine erweiterte Darstellung eines Systems zur Vermessung der optisch induzierten Krafte, die auf em im
Fokus gefangenes Teilchen wirken. Der Mikrofeldkafig wird durch Mikroelektroden gebildet, die an aufeinander zuweisenden Oberflachen der Substrate 27, 29 angebracht sind. Die Substrate 27, 29 werden durch einen Abstandshalter 28 getrennt, der einen Suspensionsraum bildet, m dem das zu untersuchende Teilchen dem Feld des Mikrofeldkafigs ausgesetzt wird. Das in Figur 2 obere Substrat ist genügend dünn, so daß der Fokus des optischen Käfigs im Suspensionsraum einstellbar ist.
Über eine Öffnung 21 werden Zellen oder andere Mikropartikel suspendiert in einer Losung in den Kanal 22 eingespult und gelangen dann in den Feldkafig 23, dessen Ausgangselektroden 24a-d mit einem Hochfrequenzfeld (kHz- oder MHz-Bereich, beliebige Signalform (z. B. Rechteck-, Sinus-, Dreieck- oder andere Signalformen) , Amplitude einige mV bis zu einigen 10 V) ) beaufschlagt werden. Durch diese zunächst einseitige Beaufschlagung der Mikroelektroden mit elektrischen Potentialen wird im Kanal 22 lediglich eine elektrische Feldbamere für emgespulte Mikroteilchen gebildet. Befindet sich em Teilchen im Käfig 23, werden auch die Eingangselektroden 25a-d zugeschaltet und/oder die Strömung wird gestoppt. Mit dem Laserstrahl 26 wird wie oben beschrieben das Teilchen im Feld- kafigraum bewegt und die Vermessung der optisch induzierten Krafte vorgenommen. Die für das elektrische Trappmg typischen Phasenverschiebungen der Elektrodensignale für zwei mögliche Wechselfeld- und zwei Rotationsfeldansteuerungsarten (2* AC- Feld bzw. 2*Rot-Feld) sind in Tabelle 1 zusammengefaßt.
Tab. 1 Phasenansteuerungen der Elektrodensignale eines Oktopols Beim Rot-Feld wird im Unterschied zum AC-Feld em Drehmoment auf das Teilchen ausgeübt, das zur Ausbildung einer Rotation (letzte Zeile von Tab.l) fuhrt, die zusätzlich zur Kraftbestimmung genutzt werden kann. Mit den Werten der vorletzten Zeile von Tabelle 1 erfolgt eine Drehmomentkompensation.
Im vorliegenden Beispiel sind die Elektroden in planarer Form auf zwei Glassubstrate 27, 29 mit halbleitertechnologischen Methoden prozessiert worden, die über Kopf durch einen Spacer 28 flussigkeitsdicht montiert sind, so daß sie in die Kanal- flussigkeit 22 eintauchen. Für eine hohe Laserfokussierung ist es erforderlich, eines der Glassubstrate (hier (27)) möglichst dünn auszufuhren. Im vorliegenden Beispiel ist das Substrat 27 150 bis 200 μm dick, und das Substrat 29 besteht aus 0.5 bis 1 mm dickem Glas oder Kunststoff.
Bei steigender Laser-Ausgangsleistung wachsen die optisch induzierten Krafte, so daß zum genannten Übergang zwischen den Feldmmi a entsprechend steigende elektrische Feldkrafte, d. h. Signalamplituden, erforderlich sind. Dies ist anhand eines experimentellen Ergebnisses in Figur 3 dargestellt. Diese Kurvendarstellung zeigt den Zusammenhang zwischen der Laserausgangsleistung, d. h. dem Betrag der optisch induzierten Krafte und den Amplituden der Kafigspannungen, d. h. den Amplituden der elektrischen Potentiale, mit denen die Mikroelektroden beaufschlagt sind. Mit zunehmender Laserausgangsleistung sind auch größere Amplituden der Kafigspannungen erforderlich, um die Ubergangsbewegung des jeweiligen Teilchens zwischen dem Fokus und dem Fangpunkt zu erzielen. Deutlich ist zu erkennen, daß die Fangleistung der optischen Falle in z- Richtung schwacher ist (obere Kurve) as in x- oder y-Richtung (untere Kurve) . Aus einer Feldverteilung gemäß Figur 4 (erhalten aus einer einmalig auszuführenden numerischen Berechnung unter Beachtung der realen Elektrodengeometrien gemäß Figur 1 und Abstände) und den passiven elektrischen Eigenschaften des Testpartikels (in diesem Fall eines Latex-Beads von 8 μm Durchmesser), ergeben sich die m Figur 5 dargestellten Fangkrafte der Laser- Pinzette m z-Richtung. Die dargestellte Kurve bezieht sich auf eine Signalamplitude der Kafigelektroden von 10 V. Experimentell konnten Amplituden bis zu 30 V appliziert werden. Bei einer quadratischen Abhängigkeit der Fangkraft des elektrischen Käfigs entspricht das einer maximal erfaßbaren Kraft von ca. 150 pN mit einer Auflosung im pN-Bereich und darunter. Dieses Meßergebnis steht guter Übereinstimmung mit der Theorie der "Laser-Pinzetten" (vgl. A. Ashkin in "Biophys. J.", Bd. 61, 1992, S. 569). Feiner ausgeführte Elektroden erlauben es, noch weitaus höhere Signalamplituden und damit elektrisch induzierte Krafte zu erzeugen, so daß auch wesentlich höhere Krafte erfaßbar sind.
Em besonderer Vorteil der Erfindung ist es, daß die Methode schnell und leicht insbesondere auch in dem spater zu nutzenden Umgebungsmedium mit den zu untersuchenden oder zu manipulierenden Teilchen unter vergleichbaren Bedingungen angewendet werden kann. Ferner ist dieses Verfahren nicht auf bestimmte Teilchen- und Oberflachenformen beschrankt, sondern mit beliebigen Teilchengeometrien realisierbar. Es können sogar die Krafte an zusammenhangenden Teilchengruppen (z. B. Aggregate o. dgl . ) beliebiger Form bestimmt werden.
Beispiele für die Bestimmung von Kräften an zusammenhangenden Teilchengruppen und die Ausübung vorbestimmter Krafte auf Teilchen zur Manipulierung von Teilchengruppen werden im folgenden unter Bezug auf die Figuren 6 bis 8 beschrieben. Figur 6 zeigt eine Mikroelektrodenanordnung in Oktopolgestalt mit den Mikroelektroden 61 bis 68 analog zu Figur 1. Die Mikroelektroden 61 bis 64 bzw. 65 bis 68 sind m einem zur Implementierung des erfmdungsgemaßen Verfahrens eingerichteten Mikrosystem m zwei voneinander beabstandeten Ebenen zur Ausbildung eines elektrischen Feldkafigs mit einem den Fangbereich oder -punkt bildenden Feldminimum angeordnet. Der elektrische Feldkafig wird im Inneren der Mikroelektrodenanordnung ausgebildet, das durch den in Figur 6 dargestellten Quader schematisch umrissen wird. Das Bezugszeichen 69 bezeichnet einen im Innenraum der Mikroelektrodenanordnung fokussierten Lichtstrahl (vorzugsweise Laserstrahl). Em erstes Teilchen m Gestalt einer biologischen Zelle 611 befindet sich im Fokus des Lichtstrahls 69. Em zweites Teilchen, das beim dargestellten Beispiel ebenfalls eine biologische Zelle 612 ist, befindet sich im Fangpunkt des elektrischen Feldkafigs. Analog zur oben erläuterten Ermittlung der optisch induzierten Krafte durch Beobachtung der Ubergangsbewegung eines Teilchens vom Fokus in den Fangbereich kann nun eine Bestimmung der Bmdungskrafte zwischen den Teilchen durchgeführt werden, wie dies im folgenden erläutert wird.
Zuerst werden zwei Zellen 611, 612 m Folge in den Innenraum der Mikroelektrodenanordnung 61 bis 81 eingebracht. Dies erfolgt vorzugsweise mit der unter Bezug auf Figur 2 erlauteten Emspultechnik, bei der die Mikroelektrodenanordnung mit einer Kanalstruktur eines fluidischen Mikrosystems verbunden ist. Die erste Zelle 611 wird m die Mikroelektrodenanordnung e - gespult und nach vollständiger Ansteuerung des Oktopolfeldes im elektrischen Fangbereich gehalten. Dann wird die erste Zelle 611 mit dem optischen Käfig, der durch den Laserstrahl 69 gebildet wird, übernommen und vom Fangbereich beabstandet positioniert. Anschließend erfolgt das Einspulen der zweiten Zelle 612 und deren Positionierung im Fangbereich, z.B. m der Mitte der Mikroelektrodenanordnung 61 bis 68. Es ist aber auch jede andere Technik der Einbringung mikroskopischer Teilchen in die Mikroelektrodenanordnung möglich. Anwendungsabhangig sind beide Teilchen biologische Zellen gleicher oder verschiedener Art oder biologische Zellen oder Zellbestandteile einerseits und/oder synthetische Teilchen mit vorbestimmten Wirkstoffen andererseits.
Im weiteren Verlauf werden die Zellen 611, 612 m Kontakt gebracht, wobei zwischen beiden Zellen eine adhasive Bindung ausgebildet wird. Die adhasive Bindung wird beispielsweise durch eine der folgenden Techniken herbeigeführt. Erstens ist es möglich, die erste Zelle 611 durch Abschalten des Laserstrahls 69 freizugeben und dadurch unter Wirkung der elektrischen Feldkrafte hm zum Fangbereich des elektrischen Feldkafigs zu bewegen, wo die Berührung der zweiten Zelle 612 und die Ausbildung der adhasiven Bindung erfolgt. Zweitens ist es möglich, den Fokus des Laserstrahls 69 m Bezug auf den Fangbereich so zu verstellen, daß die erste Zelle 611 mit der zweiten Zelle 612 in Kontakt gebracht oder sogar mit einer vorbestimmten Kraft gegen diese gedruckt wird. Die gegenseitige Kraft des Anemanderdruckens der Zellen laßt sich aus den elektrischen Feldkraften im Fangbereich und den beispielsweise gemäß der oben erläuterten Technik ermittelten optischen Krafte im Fokus des Laserstrahls 69 ableiten. Zur quantitativen Vergleichbarkeit der Bestimmung von Bmdungskraften wird die adhasive Bindung für einen vorbestimmten Zeitbereich (z.B. rd. 0.1 bis 10 Sekunden) eingestellt. Es sind aber auch längere Zeiten von z.B. bis zu 1000 Sekunden möglich.
Nach Ablauf der anwendungsabhangig eingestellten Kontaktzeit werden die Bmdungskrafte (Wechselwirkungskrafte, Adhasions- starke) zwischen den Zellen wie folgt bestimmt. Die Kraftebe- stimmung erfolgt analog zur oben erläuterten Bestimmung der optisch induzierten Krafte auf em einzelnes Teilchen durch Variation der Feldeigenschaften und Feststellung derjenigen Feldstarken im elektrischen Fangbereich und optischen Käfig, bei denen eine Abreißbewegung zwischen den Zellen erfolgt. Beispielsweise wird bei gegebenen elektrischen Potentialampli- tuden wiederholt der auf die erste Zelle 611 fokussierte Laserstrahl 69 verstellt, so daß sich der Fokus vom Fangbereich entfernt, und falls sich die erste Zelle 611 nicht mit dem Fokus bewegt hat, zurückgestellt und mit einer schrittweise erhöhten Lichtleistung beaufschlagt. Durch Kenntnis der in Abhängigkeit von der Lichtleistung induzierten optischen Krafte laßt sich so aus der Lichtleistung, bei der die Mitfuhrung der ersten Zelle 611 mit dem verstellten Fokus erfolgt, die Abreißkraft zwischen beiden Zellen und damit die gegenseitige Bindungskraft ermitteln. Andere Möglichkeiten dieser Kraftebe- stimmung ergeben sich aus der schrittweisen Variation der elektrischen Potentialamplituden und Verstellung des Ortes des Fangbereiches durch entsprechende Ansteuerung der Mikroelektroden 61 bis 68. Es sind auch Kombinationen aus beiden Techniken zur Variation der Feldeigenschaften einsetzbar.
Em besonderer Vorteil dieser Verfahrensweise besteht in ihrer
Wiederholbarkeit mit einem gegebenen Teilchenpaar und in der
Möglichkeit, beliebige Kontaktzeiten zwischen den Zellen genau vorzugeben .
Bevorzugte Anwendungen der unter Bezug auf Fig. 6 beschriebenen Verfahrensweise, die bisher nicht oder nur unter unannehmbar hohem Aufwand zu verwirklichen war, sind die zeitlich exakt geregelte Berührung zweier oder auch mehrerer biologischer Zellen gleichen oder verschiedenen Typs. Somit ist eine Verwendung für pharmakologisch und medizinisch-diagnostisch interessierende Tests ermöglicht. Beispiele für dabei auftretende Vorgange sind die Stimulation der zweiten Zelle 612 durch die zeitweilige Berührung durch die erste Zele 611, so daß sich das Bmdungsverhalten der zweiten Zelle 612 ändert. Dieses veränderte Bmdungsverhalten kann dann durch Ankopplung einer dritten Zelle (nicht dargestellt) getestet werden. Em weiteres Beispiel ist das sogenannte Screenmg von Peptid- oder anderen Molekularbibl otheken, indem zunächst eine erste Zelle eines ersten Typs in die Mikroelektrodenanordnung eingebracht wird. Die Oberflachenrezeptoren der ersten Zelle werden dann mit einer Test- oder Wirksubstanz aus einer molekularen Bibliothek über die Suspensionslosung im Mikrosystem m Kontakt gebracht. Anschließend wird eine zweite Zelle (oder em synthetisches Teilchen mit gut bindenden Oberflachenmolekulen) an die erste Zelle herangeführt. Die oben erläuterte Bestimmung der Bmdungskrafte liefert z.B. eines der folgenden Ergebnisse. Sind die Bindungsstellen der ersten Zelle bereits durch die Wirksubstanz abgesattigt, so erfolgt keine oder eine schwache Bindung der Testzelle. Andernfalls erfolgt eine starke Bindung der Testzelle. Damit lassen sich biologische Zellen bewerten und in Bezug auf die Reaktion auf bestimmte Wirksubstanzen sortieren.
Em weiteres Beispiel für die Stimulierung biologischer Zellen wird im folgenden unter Bezug auf Figur 7 erläutert. Figur 7 zeigt analog zu den Figuren 1 und 6 eine Mikroelektrodenanordnung mit den Mikroelektroden 71 bis 78 und einen im Innenraum der Mikroelektrodenanordnung fokussierten Lichtstrahl 79.
Analog zum oben erläuterten Einspul- oder Durchstromprmzip wird eine erste Zelle 711 im elektrischen Fangbereich der Mikroelektrodenanordnung 71 bis 78 eingefangen und positioniert. Eine zweite Zelle 712 oder em synthetisches Teilchen mit einem Wirkstoff wird mit dem Lichtstrahl 79 eingefangen und entlang eines vorbestimmten Weges 713 an der ersten Zelle 711 vorbeigefuhrt bzw. für eine vorbestimmte Kontaktzeit mit dieser m Berührung gebracht. Auch wenn es nicht zu einer festen Bindung oder Adhäsion zwischen den Zellen oder Teilchen kommt, kann über die Berührung der Oberflachen eine chemische Signalubertragung erfolgen, die eine anschließend analysierba- re Veränderung einer oder beider Zellen zur Folge hat. Anstelle der Einzelzellen können auch Zellgruppen oder -aggregate zur gegenseitigen Stimulation für eine vorbestimmte Zeit unter Wirkung vorbestimmter Krafte zusammengeführt und wieder getrennt werden.
Diese Verfahrensweise zur Stimulation biologischer Zellen oder Zellgruppen besitzt zahlreiche Verwendungen in der Medizin und Biotechnologie. Die Stimulation z.B. durch Applikation eines Medikaments aus der Umgebungslosung, die bisher für einzelne Zellen nur unter hohem Aufwand erreicht werden konnte, kann damit unter definierten und reproduzierbaren Bedingungen zell- spezifisch erfolgen. In lebenden Organismen erfolgen derartige Stimulationen (oder Hemmungen) in der Regel auch meist durch Wechselwirkungen zwischen Zellen, wobei diese m enge Nachbarschaft kommen oder sich berühren müssen. Die m Organismen auftretenden Verhaltnisse können mit der erfmdungsgemaßen Verfahrensweise vorteilhaft simuliert werden.
Auch die in Figur 7 illustrierte Verfahrensweise kann vorteilhaft mit der oben erläuterten Bestimmung optisch induzierter Krafte kombiniert, jedoch auch unabhängig von dieser unter Einstellung vorbestimmter Feldeigenschaften implementiert werden. Entsprechendes gilt auch für das unter Bezug auf Figur 8 erläuterte Verfahren zur Ausübung vorbestimmter Krafte auf Zellen oder Zellgruppen zur Aggregatformierung.
Figur 8 zeigt wiederum eine Mikroelektrodenanordnung mit den Mikroelektroden 81 bis 88 und einem im Innenraum der Mikroelektrodenanordnung fokussierten Lichtstrahl 89.
Nach der oben erläuterten Emspul- oder Durchstromtechnik wird eine Vielzahl von biologischen Zellen in den Innenraum der Mikroelektrodenanordnung eingespult. Mit dem optischen Kafig des Lichtstrahls 89 werden Zellen gezielt m den Fangbereich ge- fuhrt und dort gegebenenfalls relativ zu bereits vorhandenen Zellen positioniert. Beispielhaft sind m Figur 8 vier Zellen 811 bis 814 im elektrischen Fangbereich dargestellt, zu denen eine fünfte Zelle 815 in vorbestimmter Position (entsprechend der Pfeilrichtung) zugefugt wird. Dabei wird die fünfte Zelle 815 für eine vorbestimmte Zeit mit einer vorbestimmten Kraft gegen die bereits formierte Zellgruppe 811 bis 814 gedruckt, um die Ausbildung von Bmdungskraften in dieser vorbestimmten Relativposition zu ermöglichen.
In dieser Weise lassen sich beliebige Zellaggregate mit vorbestimmten Aggregatformen aufbauen. Diese Verfahrensweise ist auch mit synthetischen Mikroteilchen implementierbar, die sich negativ polarisieren lassen und im elektrischen Fangbereich von den Mikroelektroden abgestoßen werden (negative Dielektrophorese) .
Eine erfmdungsgemaße Vorrichtung besteht aus einer Anordnung eines fluidischen Mikrosystems 91, einer Beleuchtungseinrichtung 92 zur Erzeugung eines optischen Käfigs m einer Mikroelektrodenanordnung des Mikrosystems 91, wobei das Mikrosystem 91 und die Beleuchtungseinrichtung 92 mit einer Versteileinrichtung 93 relativ zueinander verstellbar sind, und einer Beobachtungs- und/oder Sensoreinrichtung 94 (z.B. Mikroskop), wie dies schematisch in Fig. 9 dargestellt ist. Das Mikrosystem ist mit Fluidik- und Potentialsteuereinrichtung 95 versehen, wie dies an sich bekannt ist. Die Beleuchtungseinrichtung 92 ist beispielsweise eine an sich bekannter Laser- Pinzette, die als Lichtquelle beispielsweise einen Diodenlaser oder einen Halbleiterlaser und zur Fokussierung eine Mikroskopanordnung enthalt.

Claims

PATENTANSPRUCHE
1. Verfahren zur Bestimmung oder Ausübung optisch induzierter Kräfte auf mindestens ein Teilchen im Fokus eines optischen Käfigs mit den Schritten: a) Positionieren des Fokus in einer Mikroelektrodenanordnung mit einem dreidimensionalen elektrischen Feld, das einen elektrischen Fangbereich bildende Feldgradienten aufweist, mit Abstand vom Fangbereich, und b) Variation der Amplitude des elektrischen Feldes, der Lichtleistung der den optischen Käfig bildenden Lichtstrahlung und/oder des Abstands des Fangbereiches vom Fokus, um zu erfassen, unter welchen dieser variierten Feldeigenschaften eine Übergangsbewegung des Teilchens vom Fokus zum Fangbereich oder umgekehrt erfolgt oder um eine zumindest zeitweilige Anordnung des Teilchens im Fangbereich bereitzustellen.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem zur Bestimmung optisch induzierter Kräfte ein Teilchen entweder im Fokus oder im Fangbereich angeordnet wird und die optisch induzierten Kräfte aus der Amplitude des elektrischen Feldes und dem Abstand des Fangbereiches vom Fokus bestimmt wird, bei denen die Ubergangsbewegung des Teilchens vom Fokus zum Fangbereich bzw. umgekehrt erfolgt.
3. Verfahren gemäß Anspruch 2, bei dem die Bestimmung der optisch induzierten Kräfte für alle interessierenden Raumrichtungen entsprechend der gegenseitigen Ausrichtung der Position des Fokus zum Fangbereich wiederholt wird.
4. Verfahren gemäß Anspruch 2 oder 3, bei dem eine Kalibrierung des optischen Käfigs durch Ermittlung des Zusammenhangs zwischen der Lichtleistung zur Erzeugung des optischen Käfigs und den jeweils an einem Teilchen im optischen Käfig induzierten Kräften erfolgt.
5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4, bei dem der Abstand zwischen dem Fokus und dem Fangbereich mindestens em Zehntel des Teilchendurchmessers betragt.
6. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem der Fangbereich em Fangpunkt ist, der innerhalb des Strahlungsfeldes des optischen Käfigs liegt, so daß das Teilchen bei Erniedrigung oder Erhöhung der Amplitude der Elektrodensi- gnale bzw. der Lichtleistung zwischen dem Fangpunkt und dem Fokus hm- und herspringt und der zugehörige Wert der Amplituden zur Bestimmung der optisch induzierten Krafte verwendet wird.
7. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem zur Bestimmung von Bm- dungskraften zwischen mikroskopischen Teilchen mindestens em erstes Teilchen im Fokus und mindestens em zweites Teilchen im Fangbereich angeordnet werden, wobei für eine vorbestimmte Kontaktzeit die ersten und zweiten Teilchen m Kontakt gebracht und anschließend die Variation der Amplitude des elektrischen Feldes, der Lichtleistung und/oder des Abstandes des Fangbereiches vom Fokus erfolgt, bis als Ubergangsbewegung festgestellt wird, daß das erste Teilchen mit dem Fokus vom Fangbereich und dem zweiten Teilchen entfernt werden kann, wobei die Bmdungskrafte zwischen den Teilchen aus der Amplitude des elektrischen Feldes und der Lichtleistung bei der Ubergangsbewegung ermittelt wird.
8. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Elektroden der Mikroelektrodenanordnung alternierend mit um 180° phasenverschobenen Signalen und/oder mit rotationser- zeugenden Signalen vorbestimmter Phasenaufspaltung beaufschlagt werden.
9. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem der Fangbereich durch mindestens eine Feldbarπere vom optischen Kafig getrennt ist.
10. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem aufeinanderfolgend im Fangbereich eine Vielzahl von Teilchen angeordnet wird, die jeweils mit dem optischen Käfig den Fangbereich und in diesem m vorbestimmter Position relativ zu gegebenenf lls im Fangbereich bereits vorhandenen Teilchen positioniert werden.
11. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, bei dem eine Justierung der Lichtstrahlung des optischen Käfigs und/oder eine Bestimmung der Fanggute, Symmetrie oder weitere Kalibπerungseigenschaften des optischen Käfigs erfolgt.
12. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, bei dem auf der Grundlage der bestimmten optisch induzierten Krafte eine Charakterisierung der Teilchen erfolgt.
13. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Teilchenbewegungen optisch und/oder elektrisch detek- tiert werden.
14. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Teilchen synthetische oder natürliche Teilchen mit einer Große unterhalb von 200 μm sind.
15. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Teilchen biologische Zellen oder deren Bestandteile sind.
16. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Ubergangsbewegung des Teilchens vom Fangbereich zum Fokus bzw. umgekehrt zur Justage des optischen Käfigs verwendet wird.
17. Vorrichtung zur Bestimmung oder Ausübung optisch induzierter Krafte auf mindestens em Teilchen im Fokus eines optischen Käfigs, die umfaßt:
- em fluidisches Mikrosystem mit einer Mikroelektrodenanordnung, die zur Ausbildung eines dreidimensionalen elektrischen Feldes mit einem elektrischen Fangbereich eingerichtet ist,
- eine Beleuchtungseinrichtung, die zur Ausbildung eines optischen Käfigs innerhalb der Mikroelektrodenanordnung des Mikrosystems eingerichtet ist, und
- eine Beobachtungs- und/oder Detektionsemπchtung zur Erfassung der Bewegung von Teilchen innerhalb der Mikroelektrodenanordnung .
18. Vorrichtung gemäß Anspruch 17, bei der die Mikroelektrodenanordnung planare Elektroden umfaßt, die in Gruppen auf zwei voneinander beabstandeten Substraten angebracht sind, von denen mindestens em Substrat transparent ist.
19. Vorrichtung gemäß Anspruch 18, bei der das transparente Substrat eine Dicke von weniger als 500 μm besitzt.
20. Vorrichtung gemäß Anspruch 18, bei der die Elektroden an aufemanderzuweisenden Oberflachen der Substrate angebracht und die Substrate voneinander durch einen Abstandshalter getrennt sind, der einen Suspensionsraum bildet, in dem der Fokus des optischen Käfigs von der Beleuchtungseinrichtung durch eines oder beide Substrate eingekoppelt werden kann.
21. Vorrichtung gemäß Anspruch 20, bei der der Suspensionsraum Teil einer Kanalstruktur ist, durch die die Teilchen mittels einer Losungsstromung in das Feld der Mikroelektrodenanordnung fuhrbar sind.
22. Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 17 bis 21, bei der die Mikroelektrodenanordnung eine Vielzahl von Elektroden umfaßt, die zur Erzeugung eines Multipolfeldes mit einer in x-, y- und/oder z-Richtung symmetrischen elektrischen Feldverteilung eingerichtet ist.
23. Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 17 bis 22, bei der die Elektroden mit einer isolierenden, dielektrischen Schicht überzogen sind oder aus gegenüber der Suspensionsflussigkeit im Mikrosystem im wesentlichen inerten Metallen bestehen.
24. Vorrichtung gemäß Anspruch 23, bei der die Elektroden aus Platin, Titan, Tantal oder Gold bestehen.
25. Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 17 bis 24, bei der die Elektroden mit halbleitertechnologischen Methoden m dreidimensionaler Form oder in Hybridtechnik ausgebildet sind.
26. Verwendung eines Verfahrens oder einer Vorrichtung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche zur Kalibrierung einer
Laser-Pinzette.
2 . Verwendung eines Verfahrens oder einer Vorrichtung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche zur selektiven Stimulation biologischer Zellen.
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Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19939574B4 (de) * 1999-08-20 2010-08-05 Europäisches Laboratorium für Molekularbiologie (EMBL) Verfahren zur dreidimensionalen Objektabtastung
DE10130004C2 (de) * 2001-06-25 2003-04-30 Europ Lab Molekularbiolog Verfahren zur Bestimmung der Position eines Teilchens in einem fokussierten Laserstrahl
ATE285590T1 (de) * 2002-10-25 2005-01-15 Evotec Technologies Gmbh Methode und vorrichtung zur aufnahme dreidimensionaler abbildungen von schwebend gehaltenen mikroobjekten unter verwendung hochauflösender mikroskopie
US7586684B2 (en) * 2005-01-21 2009-09-08 New York University Solute characterization by optoelectronkinetic potentiometry in an inclined array of optical traps
US7745788B2 (en) * 2005-09-23 2010-06-29 Massachusetts Institute Of Technology Optical trapping with a semiconductor
US8169600B2 (en) * 2006-09-15 2012-05-01 Arryx, Inc. Surface mapping by optical manipulation of particles in relation to a functionalized surface
DE102007046516A1 (de) * 2007-09-28 2009-04-02 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Vorrichtung und Verfahren zur Konditionierung biologischer Zellen
CN101430942B (zh) * 2007-11-06 2011-11-16 瑞鼎科技股份有限公司 一种具有微粒抬升装置的光钳装置
DE102007055598A1 (de) * 2007-11-20 2009-05-28 Universität Bielefeld Verfahren zur Messung der Kraft, die auf ein in einer optischen Pinzette/Falle gefangenes Objekt wirkt und optische Pinzette/Falle
DE102008034089A1 (de) * 2008-07-21 2010-01-28 Universität Bielefeld Verfahren und Vorrichtung zur Messung der Kraft, die auf ein in einer optischen Fallenanordnung gefangenes Objekt wirkt
JP6582867B2 (ja) 2015-10-22 2019-10-02 株式会社ジェイテクト 光ピンセット装置
JP6551149B2 (ja) * 2015-10-22 2019-07-31 株式会社ジェイテクト 微粒子捕捉方法及び光ピンセット装置
JP6606975B2 (ja) * 2015-10-28 2019-11-20 株式会社ジェイテクト 光ピンセット装置
EP3558540A4 (de) * 2017-04-23 2020-08-12 Hewlett-Packard Development Company, L.P. Partikeltrennung
EP3990285A4 (de) 2019-06-25 2023-04-19 Hewlett-Packard Development Company, L.P. Geformte strukturen mit kanälen
CN112880912B (zh) * 2021-01-08 2022-01-18 浙江大学 基于真空全息光镊的空间分辨压强测量系统及方法
CN112466506B (zh) * 2021-01-29 2021-04-27 之江实验室 一种真空光阱起支方法及装置与应用
CN113238075B (zh) * 2021-04-22 2023-02-14 哈尔滨工程大学 一种基于光纤光镊技术的流速计
CN112863728B (zh) * 2021-04-26 2021-07-02 之江实验室 一种基于电场量标定的多维度光镊校准装置及方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5198369A (en) * 1990-04-25 1993-03-30 Canon Kabushiki Kaisha Sample measuring method using agglomeration reaction of microcarriers
JP3244764B2 (ja) * 1992-04-03 2002-01-07 科学技術振興事業団 微粒子反応とその計測方法
US5620857A (en) * 1995-06-07 1997-04-15 United States Of America, As Represented By The Secretary Of Commerce Optical trap for detection and quantitation of subzeptomolar quantities of analytes

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See references of WO9934653A1 *

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Publication number Publication date
ATE221305T1 (de) 2002-08-15
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US6991906B1 (en) 2006-01-31
DE59804934D1 (de) 2002-08-29
WO1999034653A1 (de) 1999-07-08
DE19757785A1 (de) 1999-07-15
JP2002500110A (ja) 2002-01-08

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