DE102011120394A1

DE102011120394A1 - Verfahren und Mikrostrukturvorrichtung zur elektrischen Kontaktierung biologischer Zellen

Info

Publication number: DE102011120394A1
Application number: DE102011120394A
Authority: DE
Inventors: Jan Behrends; Gerhard Baaken; Srujan Kumar Dondapati
Original assignee: Universitaetsklinikum Freiburg
Current assignee: Universitaetsklinikum Freiburg
Priority date: 2011-12-06
Filing date: 2011-12-06
Publication date: 2013-06-06
Anticipated expiration: 2031-12-07
Also published as: WO2013083270A3; WO2013083270A2; DE102011120394B4

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur elektrischen Kontaktierung mindestens eines Lipidmembranpartikels, insbesondere einer biologischen Zelle, weist die Schritte auf; -Bereitstellen einer Mikrostrukturvorrichtung, die mindestens ein Trägersubstrat aufweist, dessen Oberseite mindestens eine Mikroapertur aufweist, die einen Durchmesser aufweist, der kleiner ist als der Durchmesser des mindestens einen, zu messenden Lipidmembranpartikels, mindestens ein unterhalb der Mikroapertur angeordnetes erstes Kompartiment, mindestens ein oberhalb der Mikroapertur angeordnetes zweites Kompartiment, mindestens eine erste Elektrode, die im Kontakt mit dem mindestens einen ersten Kompartiment angeordnet ist, mindestens eine zweite Elektrode, die im Kontakt mit dem mindestens einen zweiten Kompartiment angeordnet ist, und mindestens eine elektrische Steuereinrichtung; – Bereitstellen mindestens eines ersten Elektrolyten in dem mindestens einen ersten Kompartiment; – Ausbilden einer Lipidmembran auf der Oberseite des Trägersubstrats, wobei die Lipidmembran die mindestens eine Mikroapertur überspannt; – Bereitstellen mindestens eines zweiten Elektrolyten in dem mindestens einen zweiten Kompartiment; – Bereitstellen mindestens eines Lipidmembranpartikels oberhalb der mindestens einen Mikroapertur und oberhalb der Lipidmembran in dem mindestens einen zweiten Kompartiment, wobei das Lipidmembranpartikel einen Membrankontaktabschnitt aufweist, der eine erste Membranseite aufweist, mit der das Lipidmembranpartikel auf der Lipidmembran aufliegt und sich über dem Trägersubstrat abstützt, und eine der ersten Membranseite gegenüberliegende zweite Membranseite aufweist; – Erzeugen eines ohmschen Kontaktes zwischen dem mindestens einen ersten Elektrolyten und dem an der zweiten Membranseite des mindestens einen Lipidmembranpartikels vorliegenden Elektrolyten durch Erzeugen mindestens eines Spannungspulses zwischen der mindestens einen ersten und der mindestens einen zweiten Elektrode durch die mindestens eine Steuereinrichtung. Die Erfindung betrifft ferner eine dazu verwendbare Mikrostrukturvorrichtung.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Mikrostrukturvorrichtung zur elektrischen Kontaktierung biologischer Zellen und anderer durch Lipidmembranen begrenzter Lipidmembranpartikel, wie z. B. Lipidvesikel oder Zellorganellen.
Im Bereich der Pharmakologie besteht das Interesse, die Wirksamkeit von Wirkstoffen zu ermitteln, indem Messungen der Wirkung mit hohem Durchsatz durchgeführt werden und statistisch ausgewertet werden. Eine große Rolle spielen hierbei elektrophysiologische Messungen an Ionenkanälen von biologischen Zellmembranen. Circa 30% aller Krankheiten involvieren direkt oder indirekt Ionenkanalproteine, so dass die Suche nach chemischen Substanzen, die auf diese Proteine wirken (Ion Channel-Active Drugs, ICAD) eine der wichtigsten Aufgaben der pharmazeutischen Forschung ist.
Prinzipiell liefert die Elektrophysiologie mit der patch-clamp-Technik eine äußerst präzise und aussagekräftige Analysemethode für die Ionenkanalfunktion. Beim klassischen patch-clamp-Verfahren wird eine Glaspipette mit einem Öffnungsdurchmesser von etwa 1 μm mit einer Elektrolytlösung gefüllt und ihre Öffnung auf die Oberfläche der Zellmembran einer lebenden Zelle aufgesetzt. Durch Anlegen eines Unterdrucks zwischen dem Inneren und Äußeren der Glaspipette wird bei aufgesetzter Pipettenspitze eine elektrisch dichte Verbindung zwischen der Glaspipette und der Zellmembran erzeugt. Dadurch ist es möglich, Ströme durch einzelne Ionenkanäle, die sich im Membranfleck (Patch) direkt unterhalb der Pipettenspitze befinden, zu messen. Ebenfalls ist es möglich, diesen Membranfleck zu perforieren, um einen ohmschen Kontakt zwischen dem Elektrolyten in der Glaspipette und dem Cytoplasma im Inneren der Zelle zu erzeugen und so eine Strommessung zwischen dem Inneren der Glaspipette dem Äußeren der Zelle durchzuführen. Letztgenanntes Messverfahren nennt man auch „whole-cell-recording”. Voraussetzung für die Messung von Strömen durch einzelne, wenige oder eine Vielzahl von Ionenkanälen ist es, dass Leckströme zwischen dem Inneren und dem Äußeren der Glaspipette im Bereich der Verbindung der Pipettenspitze mit der Zellmembran ausreichend reduziert sind. Der Abdichtwiderstand zwischen der Zelle und dem Öffnungsrand der Glaspipette liegt dabei vorzugsweise mindestens bei 1 Gigaohm, man spricht von „Gigaseal”.
Ein Ionenkanalprotein in einer Zellmembran bildet eine Pore durch die Zellmembran mit spezifischer Leitfähigkeit für bestimmte Ionen. Ionenströme durch diese Pore können z. B. mit der Spannungsklemmtechnik (voltage-clamp) detektiert werden. Bei diesem Messprinzip wird die Spannung zwischen zwei Kompartimenten über einen Rückkopplungsverstärker präzise konstant gehalten, die durch diese Zellmembran (oder eine andere Membran oder Trennschicht) getrennt sind. Der zur Konstanterhaltung des Potentials gelieferte Strom ist proportional zu dem Ionenstrom, der durch die Membran oder Trennschicht fließt. Aufgrund der Konstanz der Spannung kann dieser Strom nach dem Ohmschen Gesetz direkt in die Leitfähigkeit umgerechnet werden. Für dieses Messprinzip ist es erforderlich, die zwei Kompartimente, nämlich die elektrolytgefüllten Bereiche diesseits und jenseits der Membran, die der Ionenkanal durchspannt, elektrisch zu kontaktieren.
Das klassische patch-clamp-Verfahren ist methodisch relativ aufwendig und langsam. Daher wurden in den letzten Jahren chip-basierte (planare), automatisierte patch-clamp-Verfahren mit erhöhtem Durchsatz entwickelt. Bei Messanordnungen für das „planare patch-clamp-Verfahren” wird die zu behandelnde Zelle über der Mikroapertur einer Trägersubstratoberfläche sedimentiert, wobei die Mikroapertur den oberen Rand einer Mikrokavität oder eines Mikrolochs in diesem Trägersubstrat bildet. Durch Anlegen eines Unterdrucks des unteren Kompartiments gegenüber dem oberen Kompartiment lässt sich analog zur klassischen patch-clamp-Technik ein Gigaseal zwischen Zellmembran und isolierendem Trägersubstrat herstellen. Ebenfalls analog zur klassischen patch-clamp-Technik kann durch weitere Erhöhung des Unterdrucks oder durch Anlegen grösserer Spannungspulse (z. B. 800 V für 0.01–10 ms) oder durch Zugabe von porenbildenden Peptiden wie Nystatin oder Amphotericin B kann der Membranfleck (patch) oberhalb der Mikroapertur perforiert werden und so ein whole-cell-recording realisiert werden.
Diese Methoden erhöhen die Datenleistung gegenüber dem manuellen Verfahren etwa um den Faktor fünf bis zehn auf ca. 50–100 Messungen am Tag, sind aber für das primäre Screening großer Substanzbibliotheken, noch immer zu langsam und wegen relativ hoher Kosten für die Chips zu teuer. Wünschenswert sind daher weitere Entwicklungen, die eine Steigerung des Durchsatzes (vorzugsweise auf > 100 Messungen pro Tag oder > 1000 Messungen pro Tag) beim planaren patch-clamp-Verfahren ermöglichen.
Eine stark vereinfachte Mikrostruktur für Spannungsklemmtechnik-Messungen an Membranen wurde deshalb jeweils vorgeschlagen in Baaken, Prucker, Behrends, Rühe 2005, European Cells and Materials 5, Suppl. 5, p. CS4; Baaken, Prucker, Sondermann, Behrends, Rühe 2007, Tissue Engineering 18, 889; bzw. im Dokument „Baaken et al." (Baaken et al., "Planar microelectrode-cavity array for high-resolution and parallel electrical recording of membrane ionic currents", Lab Chip, 2008, 8, 938–944). Bei der dort beschriebenen Mikrostruktur wurde im Gegensatz zu früheren Verfahren die Membran nicht auf einer Mikroapertur zwischen zwei Kompartimenten, sondern auf der Öffnung einer in einem elektrisch isolierenden Material eingebrachten Kavität (in Form eines Sackloches) aufgebracht. Die elektrische Kontaktierung des einige pL bis einige 100 fL großen Elektrolytvolumens innerhalb der Kavität erfolgt dabei insbesondere mit Hilfe einer am Boden derselben mikrogalvanisch ausgebildeten Ag/AgCl-Mikroelektrode (Mikroelektroden-Kavitäten-Arrays, MECA). Eine ähnliche Mikrostrukturvorrichtung beschreibt auch die US 2009/0167288 A1 .
Durch diese Vereinfachung sinkt der Platzbedarf pro Messposition dramatisch, was sehr viel höhere Integrationsdichten als bisher ermöglicht und zudem die elektrischen Parameter (Kapazität, Zugangswiderstand) optimiert; zusätzlich werden die Herstellungskosten gesenkt.
Aus der WO 2006/048447 A1 ist ein anderes Verfahren zur Durchführung eines „whole-cell-recording”-Verfahrens bekannt, insbesondere ein Verfahren zur elektrischen Kontaktierung des Zellinneren. Bei diesem Verfahren sind bei einer Messvorrichtung zwei elektrolytgefüllte Kammern durch eine horizontale Trennwand getrennt, die eine Öffnung aufweist. In jeder der Kammern ist eine Elektrode angeordnet. Über der Öffnung wird eine Lipidmembran aufgebracht, welche die Öffnung überspannt. Werden biologische Zellen auf die aufgespannte Lipidmembran sedimentiert, so dass die Zellen auf der freitragenden Lipidmembran aufliegen, so wird in einigen Fällen beobachtet, dass sich spontan ein ohmscher Kontakt vom unteren Kompartiment in das Innere der Zelle ausbildet.
Die Entwicklung dieses Kontakts kann gemäß WO 2006/048447 A1 durch Bewegen der Vorrichtung, des Elektrolyten oder durch Ausnutzung der attraktiven Wechselwirkungen zwischen der Lipidmembran und den Zellen oder durch den Einsatz von Substanzen begünstigt werden, die die Verschmelzung zwischen Lipidmembranen fördern. Daraus wird geschlossen, dass die ohmsche Kopplung zwischen dem Elektrolyten der unteren Kammer und dem Zellinneren entsteht, indem die sich kontaktierenden Abschnitte von freistehender Lipidmembran und Zellmembran verschmelzen. Bei einer vollständigen Verschmelzung der Zellmembran der Zellen mit der planaren Lipidmembran bilden diese Membranen eine durchgehende elektrische Barriere, welche die beiden Kammern elektrisch gegeneinander abdichtet. Nach Art des „whole-cell-recording” kann hier für mehrere Zellen gleichzeitig die Aktivität von Ionenkanälen in der Zellmembran der verbundenen Zellen detektiert werden, solange ein Gigaseal vorliegt. Ein Nachteil dieser Lösung ist, dass die Verschmelzung nicht mit hinreichender Zuverlässigkeit oder nur durch die genannten Mittel bewirkt werden kann.
Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein verbessertes Verfahren und eine verbesserte Mikrostrukturvorrichtung zur Detektion von Ionenkanalströmen bereitzustellen, bei denen die elektrische Kontaktierung des Inneren einer Zelle, oder ähnlichen durch Lipidmembran begrenzten Partikeln, zuverlässiger gelingt.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch das Verfahren gemäß Anspruch 1 und die Mikrostrukturvorrichtung gemäß Anspruch 9. Bevorzugte Ausgestaltungen des Verfahrens sind Gegenstände der Unteransprüche 2 bis 8, die insbesondere durch bevorzugte Ausgestaltungen der Mikrostrukturvorrichtung gemäß Anspruch 9 erreicht werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur elektrischen Kontaktierung mindestens eines Lipidmembranpartikels, insbesondere einer biologischen Zelle, weist die Schritte auf:

– Bereitstellen einer Mikrostrukturvorrichtung, die mindestens ein Trägersubstrat aufweist, dessen Oberseite mindestens eine Mikroapertur aufweist, die einen Durchmesser aufweist, der kleiner ist als der Durchmesser des mindestens einen, zu messenden Lipidmembranpartikels, mindestens ein unterhalb der Mikroapertur angeordnetes erstes Kompartiment, mindestens ein oberhalb der Mikroapertur angeordnetes zweites Kompartiment, mindestens eine erste Elektrode, die im Kontakt mit dem mindestens einen ersten Kompartiment angeordnet ist, mindestens eine zweite Elektrode, die im Kontakt mit dem mindestens einen zweiten Kompartiment angeordnet ist, und mindestens eine elektrische Steuereinrichtung;
– Bereitstellen mindestens eines Elektrolyten, insbesondere eines ersten Elektrolyten, in dem mindestens einen ersten Kompartiment;
– Ausbilden einer Lipidmembran auf der Oberseite des Trägersubstrats, wobei die Lipidmembran die mindestens eine Mikroapertur überspannt;
– Bereitstellen mindestens eines Elektrolyten, insbesondere eines zweiten Elektrolyten, in dem mindestens einen zweiten Kompartiment;
– Bereitstellen mindestens eines Lipidmembranpartikels oberhalb der mindestens einen Mikroapertur und oberhalb der Lipidmembran in dem mindestens einen zweiten Kompartiment, wobei das Lipidmembranpartikel einen Membrankontaktabschnitt aufweist, der eine erste Membranseite aufweist, mit der das Lipidmembranpartikel auf der Lipidmembran aufliegt und sich über dem Trägersubstrat abstützt, und eine der ersten Membranseite gegenüberliegende zweite Membranseite aufweist;
– Erzeugen eines ohmschen Kontaktes zwischen dem mindestens einen Elektrolyten im ersten Kompartiment und dem an der zweiten Membranseite des mindestens einen Lipidmembranpartikels vorliegenden Elektrolyten durch Erzeugen mindestens eines Spannungspulses zwischen der mindestens einen ersten und der mindestens einen zweiten Elektrode durch die mindestens eine Steuereinrichtung.

Unter einem ohmschen Kontakt zwischen dem Elektrolyten und dem Inneren des Lipidmembranpartikels, das flüssigkeitsgefüllt ist, wird ein Übergang zwischen diesen Flüssigkeitsbereichen mit einem elektrischen Widerstand verstanden, welcher sich wie ein ohmscher Widerstand verhält und insbesondere keine gleichrichtende Wirkung aufweist. Insbesondere kann aufgrund dieses ohmschen Kontakts der Ionenstrom gemessen werden, der durch diesen ohmschen Widerstand zwischen den Elektroden fließt. Beim Anlegen des Spannungspulses wird im Bereich innerhalb der Mikroapertur die Perforation von aufgespannter Lipidmembran und darüber liegender Membran des Lipidmembranpartikels erreicht, so dass die elektrisch isolierenden Membranen im Bereich der Mikroapertur teilweise oder vollständig zerstört werden. Es bildet sich – für den Fachmann überraschend – induziert durch den Spannungspuls in reproduzierbarer Weise neben dem genannten ohmschen Kontakt eine elektrisch dichte Verbindung zwischen planarer Lipidmembran und Partikel-Lipidmembran aus. Die Abdichtung ist in vielen Fällen ausreichend, und entspricht in vielen Fällen einem „Gigaseal” von mindestens Gigaohm, um die Ionenströme durch die in der Membran des Lipidmembranpartikels angeordneten Kanalproteine zu detektieren. Es ist noch nicht wissenschaftlich nachgewiesen, aber wahrscheinlich, dass es zur Verschmelzung von planarer Lipidmembran und Partikel-Lipidmembran im Bereich des Randes der Mikroapertur kommt, wodurch dieser hohe Abdichtwiderstand bewirkt wird.
Durch die Erfindung lässt sich der beschriebene elektrische Kontakt (ohmsche Kontakt) zuverlässiger ausbilden, als dies z. B. durch spontane Verschmelzung möglich wäre. Insbesondere lässt sich dieser Kontakt vorzugsweise ohne mechanische Einwirkung auf die Lipidmembran eines Lipidmembranpartikels, z. B. durch Induzieren von mechanischen Stößen zwischen aufgespannter Lipidmembran und Lipidmembranpartikel, oder chemische Einwirkung, z. B. die Verwendung von Verschmelzungsproteinen, herstellen. Auf diese Weise lassen sich Lipidmembranpartikel elektrophysiologisch mit erhöhtem Durchsatz kontaktieren und insbesondere im „whole-cell-recording”-Verfahren vermessen. Dies gelingt insbesondere durch die Integration einer Vielzahl von Mikroaperturen auf einem Trägersubstrat, die das parallele Kontaktieren und Messen einer Vielzahl von Lipidmembranpartikeln ermöglicht.
Die Lipidmembran ist vorzugsweise eine Bilipidschicht (Doppel-Lipidschicht), die der typische Grundbestandteil natürlicher biologischer (Zell-)Membranen ist. Über einer Mikroapertur kann eine „freitragende” Bilipidmembran („Black Lipid Membrane”, BLM) insbesondere künstlich hergestellt werden. Dies erfolgt bekanntermaßen z. B. durch „Aufstreichen” („Streichmethode”, „Painting”) einer Lösung aus erstem Lösungsmittel (z. B. Hexan, Heptan, Oktan, Nonan, Dekan, Hexadekan oder andere Alkane, oder einer Mischung aus einem oder mehrerer dieser Stoffe) und diesem Lipid in einer Konzentration von z. B. 1 mg/ml auf dem Trägersubstrat über dieser Mikroapertur. Eine solche Lipidmembran kann ferner durch Vesikelfusion auf der Oberseite des Trägersubstrats oder durch die Langmuir-Blodgett/Langmuir-Schäfer-Technik oder andere Verfahren hergestellt sein. Solche künstlichen Lipidmembranen werden oft als Modelle natürlicher Membranen verwendet. Sie dienen dann z. B. als Umgebung zur Untersuchung von Membrankanalproteinen, die z. B. zwischen zwei durch die Membran getrennten Kompartimenten Ladungen durch die Membran transportieren. Vorliegend dient die aufgespannte Lipidmembran vorzugsweise als Hilfsmittel, um den „Gigaseal” eines Lipidmembranpartikels über der Mikroapertur zu bewirken. Die freitragende Lipidmembran trennt die zwei Kompartimente voneinander, was Messanordnungen zur Realisierung einer Spannungsklemmtechnik ermöglicht. Geeignete amphiphile Moleküle zur Herstellung der Molekülschichten sind insbesondere Lipide, insbesondere vorzugsweise Phospholipide, insbesondere zur Bildung von membranartigen Doppellipidschichten geeignete Lipide, wie sie z. B. u. a. in dem Dokument „Baaken et al.” oder in US 2009/0167288 A1 genannt werden. Die Dicke der Lipidmembran hat insbesondere molekulare Abmessungen, kann insbesondere zwischen 1 nm und 100 nm liegen. Neben Lipiden kann die aufgespannte Lipidmembran andere Bestandteile aufweisen.
Eine solche Lipidmembran kann aber auch eine natürliche, biologische Lipidmembran sein, die über der mindestens einen Mikroapertur aufgebracht wird. Dies kann erfolgen, indem ein im wesentlichen planarer Abschnitt („patch”) der Membran einer biologischen Zelle verwendet wird oder indem eine komplette, behandelte oder unbehandelte biologische Zelle verwendet wird, die auf der mindestens einen Mikroapertur aufliegt.
Als Lösungsmittel, nämlich als Elektrolyt, insbesondere als erster oder zweiter Elektrolyt, der unterhalb und/oder oberhalb der Membran (Molekülschicht) platziert wird, kommen insbesondere wässrige Salzlösungen in Frage, insbesondere physiologische Salzlösungen, welche die elektrophysiologische Vermessung der Molkülschicht, z. B. Lipid-Membran, und darin enthaltener, ladungstransportierender Poren, z. B. Kanalproteine, erlauben. Geeignete Lösungsmittel, insbesondere zur Durchführung von Messungen mittels Spannungsklemmtechnik, ergeben sich z. B. aus dem Dokument „Baaken et al.” oder der US 2009/0167288 A1 . Der erste Elektrolyt und der zweite Elektrolyt können unterschiedliche Zusammensetzung aufweisen oder können im wesentlichen dieselbe Zusammensetzung aufweisen. Insbesondere kann der erste Elektrolyt im wesentlichen dieselbe Zusammensetzung aufweisen wie das Innere des Lipidmembranpartikels.
Ein Lipidmembranpartikel ist vorzugsweise eine biologische Zelle, kann aber auch ein künstliches oder natürliches Lipidvesikel oder eine andere Lipidmembranstruktur sein, z. B. eine Zellorganelle oder ein Zellfragment. In der Lipidmembran des Lipidmembranpartikels befinden sich vorzugsweise Kanalproteine, die eine Ionenleitung von der einen Seite der zur anderen Seite dieser Lipidmembran, insbesondere zwischen dem Inneren und Äußeren des Lipidmembranpartikels ermöglichen. Die Kanalproteine können dort natürlich vorhanden sein, indem das Lipidmembranpartikel, z. B. eine Zelle eines bestimmten Typs, in seinem natürlichen Zustand behandelt wird. Es können aber zum Beispiel z. B. Kanalproteine oder andere Substanzen auch künstlich eingebracht sein oder eingebracht werden. Grundsätzlich ist insbesondere jedes Lipidmembranpartikel für das erfindungsgemäße Verfahren geeignet, das mit der Lipidmembran über der Mikroapertur einen Gigaseal ausbilden kann, insbesondere verschmelzen kann, so dass die über der Mikroapertur dicht angebundene Membran eine elektrische Barriere bildet, die zur Messung von Ionenkanalströmen in der Größenordnung von μA bis fA durch diese Membran geeignet ist. Die zu messenden Ionenströme liegen vorzugsweise im Bereich zwischen 1 μA und 1 fA, vorzugsweise zwischen 500 nA und 10 fA.
Das Lipidmembranpartikel kann auch ein Verbund aus anderen Lipidmembranpartikeln sein, z. B. ein Zellverbund oder ein Vesikelverbund. Vorzugsweise werden dem zweiten, Elektrolyten eine Vielzahl von Lipidmembranpartikeln, insbesondere Zellen, beigegeben, insbesondere bevor, während, oder nachdem dieser Elektrolyt im mindestens einen zweiten Kompartiment angeordnet wurde. Vorzugsweise liegen die Lipidmembranpartikel im wesentlichen einzeln vor, das heißt im wesentlichen nicht als Zellverbund. Diese Vereinzelung kann mechanisch durch Trituration (schonendes Zerreiben von Zellverbünden in schnellen Flüssigkeitsströmen an Engstellen) oder insbesondere enzymatisch erfolgen, in dem zum Beispiel Trypsin verwendet wird.
Die Positionierung der Lipidmembranpartikel, insbesondere Zellen, über der mindestens einen Mikroapertur kann ungesteuert erfolgen, indem zum Beispiel eine Zellsuspension hoher Dichte verwendet wird, so dass mit hoher Wahrscheinlichkeit oberhalb einer Mikroapertur ein Lipidmembranpartikel sedimentiert. Es kann aber auch eine Positionierungseinrichtung zur Positionierung einzelner Lipidmembranpartikel vorgesehen seien. Diese Positionierungseinrichtung kann durch die Mikrostrukturvorrichtung bereitgestellt sein und kann insbesondere deren Bestandteil sein. Die Positionierungseinrichtung kann Führungsabschnitte zum mechanischen Führen von Zellen aufweisen, zum Beispiel Mikro-Rinnenelemente oder Mikro-Kanalelemente.
Die Positionierungseinrichtung kann ferner insbesondere eine als Positionierungseinrichtung ausgebildete elektrische Steuereinrichtung sein, die insbesondere die erste und die zweite Elektrode ansteuert. Vorzugsweise ist die Steuereinrichtung zur Durchführung eines Positionierungsverfahrens ausgebildet, bei dem durch Anlegen eines elektrischen Wechselfeldes zwischen der ersten und zweiten Elektrode über die Mikroapertur ein inhomogenes elektrisches Wechselfeld erzeugt wird, das insbesondere einen Feldlinienverlauf aufweist, bei dem im Bereich der Mikroapertur die Feldlinien von der Mikroapertur „verdichtet” verlaufen, was durch den Spannungsabfall über die Mikroapertur verursacht wird. Durch das inhomogene Wechselfeld wird ein dielektrophoretischer Effekt erzeugt, bei dem eine elektromechanische Kraft auf das Lipidmembranpartikel wirkt und dieses zentriert in Richtung der Mikroapertur bewegt. Dies kann insbesondere durch elektrische Wechselfelder mit Frequenzen im Bereich zwischen 100–1000 kHz erreicht werden und mit Feldstärken um 10–120 V/cm. Vorzugsweise ist die mindestens eine elektrische Steuereinrichtung dazu ausgebildet, den mindestens einen Spannungspuls in einem vorbestimmten Zeitabstand t1 automatisch durchzuführen, nachdem ein Positionierverfahren zum Positionieren des mindestens einen Lipidmembranpartikels auf der mindestens einen Mikroapertur beendet ist, wobei vorzugsweise t1_u < t1 < t1_o, und die untere Grenze t1_u jeweils vorzugsweise ausgewählt aus der Menge von Zeiten {0 s, 1 s, 2 s, 3 s, 5 s, 10 s, 60 s}, und die obere Grenze t1_o jeweils vorzugsweise ausgewählt aus der Menge von Zeiten {5 s; 10 s; 30 s; 60 s; 200 s; 300 s}. Vorzugsweise wird ein Lipidmembranpartikel konzentrisch oberhalb einer Mikroapertur angeordnet oder positioniert. Das Lipidmembranpartikel ist vorzugsweise auf der Mikroapertur positioniert, wobei möglich ist, dass zwischen Lipidmembranpartikel zumindest die Lipidmembran angeordnet ist. Es ist ferner möglich, dass die Oberfläche des Trägersubstrats eine weitere Beschichtung aufweist.
Der mindestens eine Spannungspuls weist eine Dauer T auf, die vorzugsweise zwischen 0,1 ms und 500,0 ms liegt, vorzugsweise zwischen 1 μs und 10,0 s, vorzugsweise zwischen 10 μs und 10,0 s, vorzugsweise zwischen 100 μs und 10,0 s, vorzugsweise zwischen 1 ms und 10,0 s, vorzugsweise zwischen 10 ms und 10,0 s, wobei sich insbesondere der Bereich zwischen 0,1 ms und 500 ms in Experimenten als besonders effizient herausgestellt hat. Der Spannungspuls ist vorzugsweise eine Gleichspannung (DC) zwischen der mindestens einen ersten Elektrode und der mindestens einen zweiten Elektrode. Vorzugsweise wird mehr als ein Spannungspuls durchgeführt, vorzugsweise eine Anzahl von in einem Zeitabstand t2 aufeinander folgenden Spannungspulsen zwischen 1 und 100 Spannungspulse, vorzugsweise zwischen 1 und 10 Spannungspulsen, wobei vorzugsweise t2_u < t2 < t2_o, und die untere Grenze t2_u jeweils vorzugsweise ausgewählt aus der Menge von Zeiten {0 s, 1 μs, 10 μs, 100 μs, 1 ms, 10 ms, 100 ms}, und die obere Grenze t2_o jeweils vorzugsweise ausgewählt aus der Menge von Zeiten {100 μs, 1 ms, 10 ms, 100 ms, 1 s, 10 s}. Falls eine Vielzahl von Spannungspulsen verwendet werden, werden diese vorzugsweise periodisch angelegt. Das Verhältnis zwischen Pulsdauer und Periodendauer (Tastgrad) kann zischen 0 und 1 sein und ist vorzugsweise zwischen 0,1 und 0,5. Vorzugsweise ist der Tastgrad 0,5. Es ist aber auch möglich und bevorzugt, dass eine Vielzahl von Spannungspulsen nach einem nicht-periodischen Muster oder in zufälliger Abfolge angelegt werden.
Der mindestens einen Spannungspuls kann auch als Wechselspannung aufgebracht werden, die insbesondere einen rechteckförmig- oder sinusförmig oszillierenden Verlauf aufweisen kann oder Sägezahn-förmig sein kann. Ein sägezahnförmiger Verlauf kann einen oder mehrere sägezahnförmige Spannungsverläufe aufweisen, kann insbesondere periodisch oder nicht-periodische sein, wobei der sägezahnförmige Spannungsverlauf jeweils einen langsameren Anstieg als Abfall der Spannung aufweisen kann. Es kann vorgesehen sein, dass während des Anstiegs der Spannung der Strom oder der elektrische Widerstand zwischen erstem und zweitem Kompartiment gemessen oder beobachtet wird und dass insbesondere bei Erreichen eines Referenzwertes für Strom oder Widerstand) der weitere Anstieg der Spannung abgebrochen wird, was insbesondere einem im wesentlichen sofortigen Aufheben der Spannungsdifferenz entspricht. Insbesondere für einen solchen, sägezahnförmigen Verlauf kann die Dauer des Anstiegs zwischen 5 μs und 120 s betragen. Die Frequenz dieser Wechselspannung kann zum Beispiel zwischen 1 kHz und 10 kHz liegen, die Amplitude z. B. zwischen 100 mV und 1000 mV, insbesondere bei einem minimalen Abstand der ersten und der zweiten Elektrode zwischen 1 mm und 10 mm.
Der mindestens eine Spannungspuls weist eine Amplitude V_A auf, deren Betrag vorzugsweise zwischen 100 mV und 1000 kV liegt; besonders bevorzugt zwischen 100 mV und 2000 mV, was sich in Experimenten als besonders effizient herausgestellt hat, jeweils insbesondere bei einem minimalen Abstand der ersten und der zweiten Elektrode zwischen 1 mm und 10 mm.
Vorzugsweise ist vorgesehen, nach der Durchführung des mindestens einen Spannungspulses eine elektrische Messung an dem mindestens einen Lipidmembranpartikel zwischen der mindestens einen ersten und der mindestens einen zweiten Elektrode durch die mindestens eine Steuereinrichtung durchzuführen, wobei die Messung der Detektion von Ionenstromen zwischen dem Inneren des Lipidmembranpartikels und dem zweiten Elektrolyten dient. Vorzugsweise erfolgt diese Messung in einer „whole-cell”-Konfiguration an einer biologischen Zelle oder einem anderen, von einer Lipidmembran umgrenzten Partikel. Ferner erfolgte diese Messung vorzugsweise in einem „voltage-clamp”-Messverfahren, bei dem insbesondere die Spannung zwischen der mindestens einen ersten Elektrode und der mindestens einen zweiten Elektrode konstant gehalten wird und dabei die Ströme zwischen den Elektroden dekretiert werden, die insbesondere den Ionenströmen durch Kanalproteine entsprechen und insbesondere im Bereich von 0,1 Femtoampere (fA) bis 1 Nanoampere (nA) liegen. Es kann aber auch ein anderes elektrisches Messverfahren verwendet werden.
Es ist z. B. auch möglich, vorzugsweise Messungen in einem ”current-clamp”-Messverfahren durchzuführen bei dem die Spannung zwischen den Kompartimenten aufgrund des Ionenstroms frei variieren kann, wobei der vom Verstärker gelieferte Strom konstant gehalten wird. Dieses Verfahren kann besonders zur Messung von Aktionspotentialen erregbarer Muskel- oder Nervenzellen von Bedeutung sein.
Vorzugsweise erfolgt die elektrische Messung in einem zeitlichen Abstand t3 nach dem Erzeugen des ohmschen Kontaktes zwischen dem mindestens einen ersten Elektrolyten und dem Elektrolyt der apertur-abgewandten Seite der über der Mikroapertur anliegenden Lipidmembran des Partikels, insbesondere dem Inneren des mindestens einen Lipidmembranpartikels, wobei vorzugsweise t3_u < t3 < t3_o, und die untere Grenze t3_u jeweils vorzugsweise ausgewählt aus der Menge von Zeiten {0 s, 1 μs, 10 μs, 100 μs, 1 ms, 10 ms, 100 ms, 1 s, 10 s, 60 s}, und die obere Grenze t3_o jeweils vorzugsweise ausgewählt aus der Menge von Zeiten {100 μs, 1 ms, 10 ms, 100 ms, 1 s, 10 s, 60 s, 300 s, 10 min, 20 min}. Dabei kann der Zeitpunkt der Herstellung des ohmschen Kontaktes insbesondere durch Beobachten des elektrischen Widerstands oder einer anderen, zur Detektion des ohmschen Kontaktes geeigneten elektrischen Größe zwischen der ersten und der zweiten Elektrode erfasst werden. Vorzugsweise ist die mindestens eine elektrische Steuereinrichtung dazu ausgebildet, diese elektrische Messung in diesem zeitlichen Abstand t3 nach dem Erzeugen dieses ohmschen Kontaktes automatisch zu starten, insbesondere ohne dass eine Benutzeraktivität erforderlich wäre. Dies hat den Vorteil, dass die Messung automatisiert werden kann und der Durchsatz bei einem solchen Verfahren oder einer zu dessen Durchführung ausgebildeten Vorrichtung gesteigert werden kann.
Vorzugsweise wird bei einem Verfahren zur elektrischen Kontaktierung von mindestens einem, von mindestens zwei, oder insbesondere einer Vielzahl von Lipidmembranpartikeln vorgesehen, dass durch die mindestens eine Steuereinrichtung jeweils elektrisch gemessen wird, insbesondere zeitgleich oder zeitlich überlappend oder zeitlich nacheinander elektrisch gemessen wird, ob über einer Mikroapertur, insbesondere zu welchem jeweiligen Zeitpunkt T1, der ohmsche Kontakt zu einem darüber angeordneten Lipidmembranpartikel hergestellt wird. Vorzugsweise ist auch vorgesehen, dass jeweils, nämlich für jede Mikroapertur, nach Herstellen des ohmschen Kontaktes, insbesondere in einem Zeitabstand t3 nach dem Zeitpunkt T1, durch die mindestens eine Steuereinrichtung automatisch diese elektrische Messung durchgeführt wird. Vorzugsweise ist die mindestens eine Steuereinrichtung dazu ausgebildet, z. B. durch eine geeignet vorgesehene Programmierung oder geeignet ausgebildete Mikroelektronik der mindestens einen Steuereinrichtung, dieses Verfahren durchzuführen. Durch ein solches Verfahren lassen sich die elektrischen Messungen mit hohem Durchsatz durchführen. Vorzugsweise weist dazu die Mikrostrukturvorrichtung mindestens eine, vorzugsweise mindestens zwei und vorzugsweise eine Vielzahl N von Mikroaperturen auf, die vorzugsweise jeweils durch eine Mikrokavität gebildet sind und jeweils vorzugsweise eine individuelle erste Elektrode aufweisen. Vorzugsweise ist jeder Mikroapertur eine individuelle zweite Elektrode zugeordnet; es kann aber auch insgesamt eine kleinere Anzahl von zweiten Elektroden als ersten Elektrode vorgesehen sein. Insbesondere kann auch eine einzige zweite Elektrode für alle individuellen ersten Elektroden vorgesehen sein.
Die Richtungsbezeichnung „oben” bzw. „nach oben” bezeichnet vorliegend die Richtung des Normalenvektors, der aus der Ebene der Mikroapertur von der Mikrokavität wegweist. Diese Richtung wird auch als die Richtung der positiven z-Achse eines kartesischen Koordinatensystems definiert (der Ursprung dieses Koordinatensystems wird hierdurch vorzugsweise nicht festgelegt). Die Richtungsbezeichnung „unten” bzw. „nach unten” bezeichnet vorliegend die Richtung des Normalenvektors, der aus der Ebene der Mikroapertur in die Mikrokavität hinein weist (auch bezeichnet als die Richtung der negativen z-Achse dieses Koordinatensystems). Die Ebene der Mikroapertur ist die Ebene, die mit der von einer planaren Mikroapertur umrahmten Fläche (Mikroaperturfläche) coplanar liegt. Die Mikroapertur liegt vorzugsweise im wesentlichen vollständig in einer Ebene, die insbesondere parallel zur x-y-Ebene dieses Koordinatensystems (= horizontale Ebene) verläuft. Die Mikroapertur kann aber auch in mehr als einer Ebene verlaufen, insbesondere einen kontinuierlichen (stufenfreien) Verlauf aufweisen.
Die erfindungsgemäße Mikrostrukturvorrichtung zur elektrischen Messung an Lipidmembranpartikeln, insbesondere an biologischen Zellen, weist auf: mindestens ein Trägersubstrat mit einer Oberseite zum Tragen mindestens einer Lipidmembran und mindestens eines Lipidmembranpartikels über dieser Lipidmembran, wobei die Oberseite mindestens eine Mikroapertur aufweist, die einen Durchmesser D aufweist, der kleiner ist als der Durchmesser eines zu messenden Lipidmembranpartikels, wobei D insbesondere zwischen 5 nm und 50 μm ist, wobei insbesondere 5 nm <= D <= 1 μm im Fall von Organellen oder Vesikeln, und insbesondere 1 μm <= D <= 50 μm im Fall von Zellen, mindestens ein unterhalb der Mikroapertur angeordnetes erstes Kompartiment zum Aufnehmen eines Elektrolyten, insbesondere eines ersten Elektrolyten, mindestens ein oberhalb der Mikroapertur angeordnetes zweites Kompartiment zum Aufnehmen eines mindestens eine biologische Zelle enthaltenden Elektrolyten, insbesondere eines zweiten Elektrolyten, mindestens eine erste Elektrode, die zum elektrischen Kontaktieren des Elektrolyten, insbesondere des ersten Elektrolyten, im Kontakt mit dem mindestens einen ersten Kompartiment angeordnet ist, mindestens eine zweite Elektrode, die zum elektrischen Kontaktieren des Elektrolyten, insbesondere des zweiten Elektrolyten, im Kontakt mit dem mindestens einen zweiten Kompartiment angeordnet oder anordenbar ist, und mindestens eine elektrische Steuereinrichtung, wobei die mindestens eine elektrische Steuereinrichtung dazu ausgebildet ist, in einem ersten Schritt mindestens einen Spannungspuls zwischen der mindestens einen ersten und der mindestens einen zweiten Elektrode zu erzeugen, mit dem ein ohmscher Kontakt zwischen dem Elektrolyten im ersten Kompartiment, insbesondere dem ersten Elektrolyten, und dem Inneren des oberhalb der Lipidmembran und der Mikroapertur angeordneten Lipidmembranpartikels oder zwischen dem Elektrolyten im ersten Kompartiment und dem über dem Lipidmembranpartikel vorliegenden Elektrolyt, insbesondere dem zweiten Elektrolyten, erzeugbar ist und insbesondere dazu ausgebildet ist, in einem zweiten Schritt, der insbesondere zur automatischen Durchführung durch die mindestens eine Steuereinrichtung in einem vorbestimmten zeitlichen Abstand t3 nach dem ersten Schritt vorgesehen ist, eine elektrische Messung zwischen der ersten und der zweiten Elektrode durchzuführen, die zur Detektion von Ionensträmen zwischen dem Inneren und dem Äußeren des Lipidmembranpartikels dient, insbesondere zur Messung von Ionenströmen zwischen dem Inneren des Lipidmembranpartikels und dem zweiten Elektrolyten dient.
Die elektrische Steuereinrichtung weist vorzugsweise mindestens eine Leiterplatte und vorzugsweise Komponenten mit integrierten Schaltkreisen (ICs) auf, die vorzugsweise auf mindestens einer Leiterplatte angeordnet sind. Vorzugsweise weist die Steuereinrichtung programmierbare elektrische Schaltkreise auf. Die Steuereinrichtung weist vorzugsweise eine Signalverarbeitungseinrichtung auf, mit der das mindestens eine Messsignal erfasst wird, durch das der ohmsche Kontakt mindestens einer Mikroapertur beobachtet wird. Die Signalverarbeitungseinrichtung ist vorzugsweise zur Verarbeitung von analogen Signalen ausgebildet, was als analoge Signalverarbeitungseinrichtung bezeichnet wird. Vorzugsweise weist die Signalverarbeitungseinrichtung eine digitale Datenverarbeitungseinrichtung auf, die insbesondere eine Recheneinheit (CPU) oder eine Mikroprozessoreinrichtung, einen Datenbus, Datenspeicher, ein oder mehrere Schnittstellen zur vorrichtungsinternen oder -externen Datenübertragung, und/oder ein oder mehrere Signalverbindungen, z. B. leitungsgebunden oder drahtlos, zu anderen elektrischen Einrichtungen aufweist. Vorzugsweise ist die Steuereinrichtung dazu ausgebildet, den mindestens einen elektrischen Messwert digital zu erfassen, insbesondere digital zu verarbeiten, insbesondere digital auszuwerten und insbesondere digital zu speichern.
Vorzugsweise weist die Steuereinrichtung einen Messwertspeicher, insbesondere Messdatenspeicher, zur Speicherung des mindestens einen Messwertes auf. Dadurch können verschiedene erfindungsgemäße Gestaltungen der Mikrostrukturvorrichtung oder der diese aufweisenden Messvorrichtung realisiert werden. Der Messdatenspeicher ist vorzugsweise in einem physikalisch wiederbeschreibbaren Speicherbaustein untergebracht, z. B. RAM, FLASH-Speicher, EEPROM, kann aber auch in anderen Speicherbausteinen angeordnet sein.
Vorzugsweise weist die mindestens eine Steuereinrichtung mindestens einen Programmdatenspeicher auf, in dem ein Programmcode speicherbar ist. Der Programmcode ist vorzugsweise zur Durchführung einer Funktion der Steuereinrichtung ausgebildet, und insbesondere dazu ausgebildet, den mindestens einen elektrischen Messwert zu verwenden, und diesen auszuwerten. Diese Funktion kann die Schritte umfassen, das Verfahren zur Überwachung des Gigaseals über mindestens einer Mikroapertur und/oder die Erzeugung des mindestens einen Spannungsimpulses und/oder die Durchführung mindestens einer elektrischen Messung an einer Mikroapertur zu steuern. Vorzugsweise ist der Programmcode dazu ausgebildet, in einem ersten Schritt mindestens einen Spannungspuls zwischen der ersten und der zweiten Elektrode zu bewirken, mit dem ein ohmscher Kontakt zwischen dem erstem Elektrolyten und dem Inneren des oberhalb der Lipidmembran und der Mikroapertur angeordneten Lipidmembranpartikels erzeugbar ist und insbesondere in einem zweiten Schritt, der insbesondere zur automatischen Durchführung durch die mindestens eine Steuereinrichtung in einem vorbestimmten zeitlichen Abstand nach dem ersten Schritt vorgesehen ist, eine elektrische Messung zwischen der ersten und der zweiten Elektrode durchzuführen, die zur Detektion von Ionenströmen zwischen dem Inneren des Lipidmembranpartikels und dem zweiten Elektrolyten dient.
Unter einer Steuereinrichtung, die zur Ausbildung einer bestimmten Funktion gestaltet ist, wird vorliegend eine solche Steuereinrichtung verstanden, die nicht nur zur Durchführung dieser Funktion nach einer noch erforderlichen Anpassung prinzipiell geeignet ist, wobei diese Anpassung z. B. das Aufspielen einer Software oder eines Programmierens einer programmierbaren Mikroprozessoreinrichtung sein kann, sondern bereits alle Mittel besitzt, um diese Funktion tatsächlich zu erfüllen, indem sie z. B. den erforderlichen Programmcode bzw. die erforderliche Software bereits besitzt, insbesondere in Form einer Firmware der Mikrostrukturvorrichtung oder Messvorrichtung. Die Mittel zur Ausführung dieser Funktion umfassen insbesondere eine Auswerteeinrichtung. Insbesondere können Mittel zur Ausführung dieser Funktion, insbesondere die Auswerteeinrichtung, z. B. entsprechend ausgestaltete elektrische Schaltkreise aufweisen, die z. B. ein analoges Signal, das den Messwert darstellt, auswerten und z. B. mittels einer Komparatorschaltung mit einem Referenzsignal (Referenzwert) vergleichen. Insbesondere im Falle eines digital vorliegenden Messwertes können diese Mittel eine digitale Signalverarbeitungsanlage aufweisen.
Zur Auswertung des mindestens einen Messwertes weist die Steuereinrichtung vorzugsweise eine elektrische Auswerteeinrichtung auf, die elektrische Schaltkreise und/oder geeigneten Programmcode umfassen kann. Durch die Auswerteeinrichtung kann insbesondere erfasst werden, ob und/oder wann eine gemessene elektrische Größe einen vorbestimmten Referenzwert unterschreitet oder überschreitet, wodurch das vorliegen eines ohmschen Kontaktes detektiert werden kann. Eine solche elektrische Größe kann der Widerstand zwischen der mindestens einen ersten Elektrode und der mindestens einen zweiten Elektrode sein. Der ohmsche Kontakt wird vorzugsweise so definiert, dass der gemessene Widerstand R größer ist als der vorzugsweise vorbestimmte Referenzwert R_Ref, der jeweils vorzugsweise zwischen 0,1 und 2 Gigaohm und vorzugsweise zwischen 0,5 oder 1 Gigaohm festgelegt ist, und der in der Steuereinrichtung gespeichert sein kann. Eine solche elektrische Größe kann ferner auch der elektrische Strom, die Spannung oder eine Impedanz sein.
Bei der Beobachtung, ob und wann dieser ohmsche Kontakt vorliegt, kann insbesondere auch der zeitliche Verlauf des Widerstands oder einer anderen elektrischen Größe zwischen erster und zweiter Elektrode berücksichtigt werden. Eine Mikroapertur, über der eine Lipidmembran aufgespannt ist, weist vorzugsweise einen Widerstand R_LM im Bereich von vorzugsweise größer 1 Gigaohm oder besonders bevorzugt R_LM > 10 Gigaohm auf, wobei der letztgenannte Bereich insbesondere das Vorliegen einer stabilen Lipiddoppelschicht über der Mikroapertur anzeigt. Eine Zerstörung dieser aufgespannten Lipidmembran würde zu Widerständen R_D im Bereich < 20 Megaohm, insbesondere R_D < 10 Megaohm führen. Es ist deshalb vorzugsweise vorgesehen, dass das Vorliegen eines ohmschen Kontaktes über einer Mikroapertur jeweils automatisch -oder nicht automatisch- dann festgestellt wird, wenn einerseits R > R_Ref und andererseits in einem Zeitabstand t4 (z. B. t4 = t3) davor bis zum Zeitpunkt T1 ein Widerstand von R > R_LM gemessen wurde und insbesondere nicht R < R_D gemessen wurde. Auf diese Weise kann das Vorliegen eines ohmschen Kontaktes über einer Mikroapertur, insbesondere über einer Vielzahl von Mikroaperturen insgesamt zuverlässiger bestimmt werden. Auf diese Weise wird eine Hochdurchsatzmessung zuverlässiger.
Sowohl für eine hohe Präzision der Messung (hohes Signal- zu Rausch-Verhältnis) sowie für einen hohen Durchsatz von Voltage-Clamp Messungen ist es wünschenswert, solche Messungen in Mikrostrukturen durchzuführen, in denen die dielektrische Trennschicht integriert ist. Je kleiner die Abmessungen der Trennschicht sowie der elektrolytgefüllten Kompartimente, desto geringer ist das elektrische Messrauschen und desto mehr solcher Messanordnungen lassen sich in Form eines Arrays auf kleiner Fläche unterbringen. Eine hohe Dichte solcher Anordnungen ist Voraussetzung für Messungen mit hohem Durchsatz. Aus diesem Grund ist die erste Elektrode vorzugsweise im ersten Kompartiment angeordnet, das vorzugsweise durch eine in das Trägersubstrat integrierte Mikrokavität gebildet wird.
Vorzugsweise weist das Trägersubstrat eine erste Schicht auf, innerhalb der die Elektrode zumindest teilweise oder im wesentlichen vollständig angeordnet ist. Eine Schicht kann eine Schicht im Trägersubstrat sein oder eine Beschichtung des Trägersubstrats sein. Eine solche Schicht ist vorzugsweise zumindest teilweise oder vollständig im wesentlichen planar. Falls die Elektrode vollständig in der ersten Schicht angeordnet ist, bedeutet dies vorzugsweise, dass kein Abschnitt der Elektrode aus der ersten Schicht hervorsteht bzw. nicht die gedachten Hauptebenen durchdringt, die die Schicht z. B. nach oben und nach unten einhüllen. Das Trägersubstrat kann mindestens eine Schicht aufweisen, insbesondere mehr als zwei Schichten oder eine Vielzahl von Schichten, wobei die Mikrokavität in einer dieser Schichten, mehrerer dieser Schichten oder jeder dieser Schichten angeordnet sein kann oder nicht angeordnet sein kann. Insbesondere kann die Mikrokavität sich durch mindestens eine oder mehrere dieser Schichten erstrecken und/oder die erste Elektrode kann in einer weiteren Schicht, insbesondere unterhalb dieser mindestens einen Schicht liegenden Schicht, angeordnet sein. Der Durchmesser der Kavität in einer die erste Elektrode aufweisenden Schicht kann größer sein als der Durchmesser der Kavität in einer darüber liegenden Schicht.
Die erste und/oder zweite Schicht des Trägersubstrats ist vorzugsweise eine Beschichtung des Trägersubstrats, die vorzugsweise dessen Oberseite bildet und vorzugsweise hydrophob ist, besteht vorzugsweise aus einer lichtempfindlichen Schicht, insbesondere ein Epoxidharz oder Fotolack, oder weist diese auf. Die Beschichtung besteht vorzugsweise aus einem Polymer, vorzugsweise aus Epoxidharz oder vorzugsweise aus einem Fotolack, z. B. SU8 oder weist ein solches Material auf. Dieser Fotolack ist vorzugsweise SU8, dessen getrocknete Schichten hydrophob sind. SU-8 ist ein kommerziell erhältlicher Fotolack der Firma Microchem Corp., USA, und gehört zu der Gruppe der Negativ-Resiste. Wie die meisten Resiste besteht SU-8 aus den drei Bestandteilen Grundharz, Lösungsmittel und fotoempfindlicher Komponente. Diese eignen sich besonders zur Herstellung der Mikrostrukturvorrichtung, da sich insbesondere viele Bilipidschichten auf diesen Resisten besonders zuverlässig ausbilden und da diese photolitographisch bearbeitbar sind, um z. B. Mikrostrukturen herzustellen, und chemisch relativ inert sind.
Die Beschichtung des Trägersubstrats kann ferner vorzugsweise Polytetrafluorethylen (PTFE) aufweisen oder aus diesem Material bestehen. Der Vorteil ist, dass solche Schichten chemisch besonders inert sind, wodurch sie sich besonders zur Anwendung in korrosiven Umgebungen eignen (z. B. physiologischen Elektrolyten-physiologischen Salzlösungen).
Vorzugsweise weist die Mikrostrukturvorrichtung mindestens eine Zuleitungseinrichtung auf, mittels der die Elektrode über eine Zuleitungsdistanz elektrisch kontaktierbar ist.
Vorzugsweise ist einer (oder jeder) Elektrode mindestens eine Zuleitungseinrichtung zugeordnet. Eine Zuleitungseinrichtung kann eine metallische Leiterbahn aufweisen oder aus dieser bestehen, die z. B. aus Gold, Titan, Nickel-Chrom, Platin, oder Silber bestehen kann oder eines oder mehrere dieser Materialien aufweist. Zur Unterscheidung von Elektrode und Zuleitungseinrichtung kann definiert werden, dass die mit dem Elektrolyt oder die mit dem Innenvolumen der Mikrokavität in Kontakt stehenden Teile des Systems aus Elektrode und Zuleitungseinrichtung der Elektrode zugerechnet werden während die nicht mit dem Elektrolyt oder mit dem Innenvolumen der Mikrokavität in Kontakt stehenden Teile des Systems aus Elektrode und Zuleitungseinrichtung der Zuleitungseinrichtung zugerechnet werden. Vorzugsweise ist die Zuleitungseinrichtung vollständig oder zumindest zum Teil in der ersten Schicht angeordnet.
Die Elektrode bildet vorzugsweise zumindest einen Teil der Innenwandung der Mikrokavität. Die Mikrokavität ist vorzugsweise derart ausgebildet, dass das Innenvolumen der Mikrokavität von der durch die Mikroapertur umrahmten Fläche und der Innenwand (oder mehrerer Innenwände) der Mikrokavität begrenzt wird. Die mindestens eine Innenwand der Mikroapertur wird vorzugsweise aus seitlichen Innenwänden und einer Bodenwand gebildet. Die Bodenwand der Mikrokavität wird vorzugsweise vollständig oder zumindest teilweise von der Kontaktseite der Elektrode gebildet. Die Elektrode kann aber auch zumindest teilweise oder vollständig vom Innenvolumen der Mikrokavität umgeben sein. Z. B. kann die Elektrode teilweise freitragend angeordnet sein.
Vorzugsweise ist diese erste Schicht im wesentlichen unterhalb oder zumindest teilweise unterhalb der Mikrokavität angeordnet. Dadurch wird insbesondere die einfache Herstellung der Elektrode ermöglicht, welche vorzugsweise unterhalb der Mikrokavität angeordnet ist.
Vorzugsweise weist das Trägersubstrat eine zweite Schicht auf, innerhalb der die Mikrokavität wenigstens teilweise oder im wesentlichen vollständig angeordnet ist. Dadurch wird insbesondere die einfache Herstellung der Mikrokavität ermöglicht, welche vorzugsweise oberhalb der Elektrode angeordnet ist. Es ist aber auch bevorzugt, dass die Mikrokavität zumindest teilweise, vorzugsweise mit weniger als der Hälfte oder einem Viertel ihres Innenvolumens, auch in der ersten Schicht angeordnet ist.
Das Trägersubstrat ist vorzugsweise zumindest abschnittsweise oder im wesentlichen vollständig planar ausgebildet. Das Trägersubstrat weist eine oder mehrere Mikrostrukturen auf, also räumliche Hervorhebungen und/oder Vertiefungen mit kleinen Dimensionen, z. B. diese Mikrokavitäten die z. B. wenige Nanometer, einige wenige Mikrometer, einige wenige zehn Mikrometer oder einige wenige hundert Mikrometer betragen können. Solche Mikrostrukturen lassen sich z. B. durch bekannte optischlitographische Verfahren erzeugen, bei denen mittels optischer Masken definierte Strukturen schichtweise auf einem Trägersubstrat aufgebracht werden und teilweise wieder entfernt werden.
Das Trägersubstrat weist vorzugsweise eine Oberseite auf, die vorzugsweise zumindest abschnittsweise oder im wesentlichen vollständig planar ist. Die Oberseite weist vorzugsweise mindestens eine Mikroapertur auf, vorzugsweise eine Anzahl N von Mikroaperturen, wobei N jeweils vorzugsweise zwischen 2 und 2000, größer als 2000, vorzugsweise zwischen 2 und 400, zwischen 4 und 100, zwischen 4 und 50 oder zwischen 4 und 20 liegt. Die Verwendung mehrere Mikroaperturen und Mikrokavitäten hat den Vorteil, dass mehrere solcher Sensoriken parallel betrieben werden können, was einen höheren Messdurchsatz erlaubt.
Die Lipidmembran kann insbesondere eine Doppellipidmembran sein, also aus zwei übereinander angeordneten Einzelschichten von Lipidschichten bestehen, wobei eine Einzelschicht insbesondere aus selbstorganisierten Molekülen besteht. Eine solche molekulare Membran kann künstlich hergestellt sein, insbesondere kann eine Bilipidschicht aus Lipidmolekülen mittels Painting, durch Vesikelfusion oder Langmuir-Blodgett/Langmuir-Schäfer-Technik oder verwandten Methoden hergestellt sein. Solche künstlichen Lipidmembranen werden oft als Modelle natürlicher Membranen verwendet. Sie dienen z. B. als Umgebung zur Untersuchung von Membranproteinen, die z. B. zwischen zwei durch die Membran getrennten Kompartimenten Ladungen durch die Membran transportieren. Eine solche Membran kann aber auch eine natürliche, biologische Membran sein, die über der mindestens einen Mikroapertur aufgebracht wird. Dies kann erfolgen, indem ein im wesentlichen planarer Abschnitt („patch”) der Membran einer biologischen Zelle verwendet wird oder indem eine komplette, behandelte oder unbehandelte biologische Zelle verwendet wird, die auf der mindestens einen Mikroapertur aufliegt. Die Dicke der molekularen Schicht hat insbesondere molekulare Abmessungen, kann insbesondere zwischen 1 nm und 100 nm liegen.
Unter einer Mikroapertur wird der offene Querschnitt verstanden, der sich z. B. durch eine Öffnung, z. B. eine Vertiefung oder ein Loch, in einer – insbesondere planaren – Oberfläche der Oberseite des Trägersubstrats ergibt. Die Apertur ist also insbesondere vorzugsweise planar, insofern die Substratoberfläche planar ist. Die Form des Mikroaperturumrisses ist vorzugsweise kreisförmig, ellipsoid, dreieckförmig, viereckförmig oder mehreckförmig. Der maximale, minimale oder durchschnittliche Durchmesser der einzelnen Mikroapertur ist vorzugsweise kleiner als 1000 μm und liegt vorzugsweise zwischen 5 nm und 500 μm, vorzugsweise zwischen 500 nm und 500 μm, vorzugsweise zwischen 5 nm und 1 μm, vorzugsweise zwischen 1 μm und 250 μm, vorzugsweise zwischen 2 μm und 50 μm, vorzugsweise zwischen 2 μm und 10 μm, oder zwischen 5 μm und 150 μm. Bei solchen bevorzugten Mikroaperturgrößen (Mikroaperturen) kann eine Molekülschicht über der Mikroapertur erzeugt werden, was bei makroskopischen Aperturen mit Durchmessern von mehreren Millimetern in der Regel nicht möglich ist.
Solche Mikroaperturen können durch selektives Entfernen einer lichtempfindlichen Schicht, z. B. Fotolack, die auf der Oberseite des Trägers angebracht ist, mittels optischer Litographie erzeugt werden, wie z. B. von dem Dokument „Baaken et al.” oder der US 2009/0167288 A1 beschrieben. Die Mikroapertur kann aber auch den Rand eines Lochs bilden, das sich von der Oberseite bis zur Rückseite des Trägersubstrats erstreckt. Dies kann z. B. durch chemisches Ätzen oder durch Bestrahlung mit Laser- oder sonstigen hochenergetischen Strahlen erreicht werden.
Nanoaperturen, insbesondere mit Durchmessern zwischen 5 nm und 1000 nm, können z. B. durch Aufbringen einer weiteren Schicht, z. B. Siliziumoxid oder Siliziumnitrid oder Graphen, oder auch Polymere, z. B. Polyimid, oder Polyelektrolyte auf das bereits Mikroaperturen enthaltende Trägersubstrat gebildet werden, wenn die weitere Schicht entweder bereits Nanometer-grosse Löcher enthält. Solche Nanoaperturen können insbesondere auch durch Anwendung üblicher Nanostrukturierungsverfahren wie FIB („Focussed-Ion-Beam”), E-beam (Elektronenstrahllithografie) oder nasschemische oder trockene Ätzverfahren erzeugt werden.
Die Anordnung der Anzahl N von Mikroaperturen entspricht vorzugsweise einem Array, vorzugsweise einem periodischen Gitter, in dem sich die Position der Mikroaperturen bzw. der Mikroapertur-Zentren durch einen oder wenige Gitterparameter beschreiben lässt. Die Anordnung in einem periodischen Gitter hat Vorteile beim Entwurf einer parallelisierten Sensorik, in der viele möglichst gleichartige Messstellen geschaffen werden sollen. Die Mikroaperturen können aber auch in einem nicht-periodischen oder nicht vollständig periodischen Muster angeordnet sein.
Das Trägersubstrat ist vorzugsweise aus Glas hergestellt oder weist Glas auf. Es kann aber auch aus einem Halbleitermaterial bestehen oder dieses zumindest aufweisen, z. B. Si/SiO2. Andere Materialien sind ebenfalls möglich. Die Oberseite des Trägersubstrats weist vorzugsweise eine Beschichtung auf. Diese ist vorzugsweise hydrophob, kann aber auch hydrophil sein. Der Vorteil einer hydrophoben Oberseite ist, dass sich viele Arten von Bilipidschichten auf solchen Oberflächen besonders zuverlässig ausbilden.
Unter einer „hydrophoben” Grenzschicht wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine Schicht verstanden, auf der ein Wassertropfen einen Kontaktwinkel von mindestens 70° aufweist, vorzugsweise mindestens 80°, 85° oder 90°, vorzugsweise zwischen 80° und 130° oder zwischen 90° und 120°. Insofern kann die vorliegende Definition des Begriffs „hydrophob” breiter gewählt sein als allgemein in der Literatur üblich, wo der Begriff meist Kontaktwinkel von größer als 90° bezeichnet. Solche Kontaktwinkel (Innenwinkel des Wassertropfens auf dem Substrat) lassen sich leicht mittels im Handel erhältlicher Kontaktwinkelmessgeräte oder durch Auswertung lichtmikroskopischer Querschnittsbilder der Tropfen ermitteln (Raumtemperatur, Standardbedingungen). Bei einer hydrophilen Grenzschicht sind die Kontaktwinkel jeweils vorzugsweise zwischen 70° und 0°, 80° und 0°, 85° und 0° oder 90° und 0°.
Vorzugsweise weist ein Trägersubstrat mindestens eine Mikrokavität auf, oder vorzugsweise ein Array von Mikrokavitäten auf, wobei eine oder jede Mikrokavität nach oben offen ist und in einer der genannten Mikroaperturen in der Oberseite des Trägersubstrats mündet. Die zu messende molekulare Membran lässt sich dann so bilden, dass sie die mindestens eine Mikroapertur oder mehrere Mikroaperturen überdeckt. Eine Mikrokavität ist eine Vertiefung in der Oberseite, deren Tiefe dieselbe Größe wie ein möglicher genannter Mikroaperturdurchmesser haben kann, oder tiefer oder weniger tief sein kann. Jeder Querschnitt durch die Vertiefung (in einer Ebene parallel zur Ebene der Mikroapertur) weist vorzugsweise denselben Querschnitt auf wie die Mikroapertur, welche die Mikrokavität nach oben öffnet. Die Mikrokavität kann insbesondere zylinderartig oder quaderartig sein. Sie kann aber auch hohlkegel(stumpf)förmig sein oder eine andere Form mit veränderlichem Querschnitt aufweisen.
Vorzugsweise weist die Messanordnung oder die Mikrostrukturvorrichtung mindestens eine Sensoreinrichtung auf, die insbesondere einen Sensor für elektrophysiologische Untersuchungen an der Molekülschicht, insbesondere Bilipidschicht, aufweist. Die Sensoreinrichtung kann diese erste Elektrode im ersten Kompartiment aufweisen, die diesseits der Mikroapertur am Trägersubstrat angeordnet ist, und kann ferner mindestens eine weitere Elektrode (Gegenelektrode) auf der anderen Seite der Mikroapertur aufweisen, die im ersten Kompartiment im Elektrolyt oberhalb der Lipidmembran angeordnet ist. Eine Elektrode ist vorzugsweise eine Redoxelektrode, vorzugsweise eine Redoxelektrode „zweiter Art”, vorzugsweise eine Kalomel-Elektrode oder insbesondere vorzugsweise eine Ag/AgCl-Elektrode. Die Elektrode ist vorzugsweise eine nicht polarisierbare Elektrode, die einen einfachen Übergang der ionischen Ladungsträger im Elektrolyten in elektronische Ladungsträger im Metall erlaubt. Vorzugsweise werden dazu Ag/AgCl-Elektroden, vorzugsweise in Kombination mit chlor-ionenhaltigen Messlösungen (Elektrolyt) verwendet.
Diese Sensoreinrichtung ist vorzugsweise zur Durchführung der Spannungsklemmtechnik ausgebildet, mittels der bei konstant gehaltener Spannung kleinste Ströme im Nanoamperebereich und darunter gemessen werden können, insbesondere im Picoamperebereich, z. B. unter Verwendung eines Voltage-Clamp-Verstärkers oder eines Patch-Clamp-Verstärkers (z. B ein Axopatch 200B, Axon Instruments, Foster City, CA, betrieben im „resistive feedback mode”). Die Sensoreinrichtung kann ein Array von Sensoren aufweisen, die im Trägersubstrat oder an dessen Oberfläche angeordnet sein können.
Vorzugsweise ist die Mikrostrukturvorrichtung Bestandteil einer Messvorrichtung, insbesondere einer automatisierten oder teil-automatisierten Messvorrichtung, insbesondere eines Robotersystems, insbesondere mit automatisch gesteuerten Elektrolyttransfereinrichtungen zum automatischen Transfer eines Elektrolyts, insbesondere des ersten und/oder des zweiten Elektrolyts zu mindestens einer Mikroapertur, insbesondere zur automatischen Messung an einer Vielzahl N von Mikroaperturen, wobei vorzugsweise 2 < N < 1000, und vorzugsweise 3 < N < 100.
Weitere Eigenschaften und Merkmale der Mikrostrukturvorrichtung und zur Herstellung der Mikrostrukturvorrichtung, Materialien, Methoden, Messanordnungen und Beispiele zur Messung an Membranen können dem Dokument „Baaken et al.” oder der US 2009/0167288 A1 entnommen werden.
Vorzugsweise ist die Mikrostrukturvorrichtung und/oder deren mindestens eine Steuereinrichtung und/oder ein Programmcode der mindestens eine Steuereinrichtung dazu ausgebildet, das erfindungsgemäße Verfahren teilweise oder vollständig durchzuführen. Vorzugsweise ist die bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendete Mikrostrukturvorrichtung eine erfindungsgemäße Mikrostrukturvorrichtung.
Weitere bevorzugte Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Verfahrens können aus der Beschreibung der erfindungsgemäßen Mikrostrukturvorrichtung abgeleitet werden.
Weitere bevorzugte Ausgestaltungen der erfindungsgemäßen Mikrostrukturvorrichtung können aus der Beschreibung des erfindungsgemäßen Verfahrens abgeleitet werden.
Weitere bevorzugte Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Verfahrens und der erfindungsgemäßen Mikrostrukturvorrichtung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung der Ausführungsbeispiele in Zusammenhang mit den Figuren. Gleiche Bezugszeichen bezeichnen im wesentlichen gleiche Bauteile.
1a zeigt ein erstes Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen Mikrostrukturvorrichtung in einem schematischen, senkrechten Querschnitt, mit aufgespannter Lipidmembran und darüber angeordneter Zelle, bevor ein Spannungspuls erzeugt wurde.
1b zeigt die Mikrostrukturvorrichtung aus 1a, nachdem ein Spannungspuls erzeugt wurde.
2a zeigt ein zweites Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen Mikrostrukturvorrichtung, mit einer Vielzahl von Mikroaperturen.
2b zeigt ein drittes Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen Mikrostrukturvorrichtung, mit einer Vielzahl von Mikroaperturen.
3 zeigt ein Ablaufdiagramm eines Ausführungsbeispiels des erfindungsgemäßen Verfahrens.
4a zeigt Strom-Spannungsmessungen, die mit einer Mikrostrukturvorrichtung gemäß 1 gemessen wurden, wobei eine RBL-Zelle auf einer Bilipidschicht über der Mikroapertur angeordnet und deren Inneres elektrisch mit dem ersten Elektrolyt kontaktiert ist.
4b zeigt Strom-Spannungsmessungen einer Referenzmessung mittels klassischem Patch Clamp an einer BL-Zelle, wie sie im Beispiel der 4a verwendet wurde.
1a zeigt die Mikrostrukturvorrichtung 1 zur elektrischen Messung an Lipidmembranpartikeln, insbesondere an biologischen Zellen 30. Die Mikrostrukturvorrichtung 1 weist ein Trägersubstrat 2 mit einer Oberseite 3 zum Tragen einer Lipidmembran 20 und einer Zelle 30 über dieser Lipidmembran auf. Die Oberseite 3 weist eine Mikroapertur 4 auf, die einen Durchmesser von 10 μm aufweist, der kleiner ist als der Durchmesser eines zu messenden Lipidmembranpartikels, insbesondere einer biologischen Zelle 30.
Die Mikrostrukturvorrichtung 1 weist ein unterhalb der Mikroapertur 4 angeordnetes erstes Kompartiment 5 zum Aufnehmen eines ersten Elektrolyten 6 auf und ein oberhalb der Mikroapertur 4 angeordnetes zweites Kompartiment 7 zum Aufnehmen eines zweiten, die Zelle 30 enthaltenden Elektrolyten 8 auf. Das erste Kompartiment 5 ist als Mikrokavität 5 ausgeführt, bei der die inneren Seitenwände des Kompartiments stufenlos in die Mikroapertur münden. Insbesondere weist die Mikrokavität im wesentlichen über ihre gesamte Höhe denselben horizontalen Querschnitt auf wie die Mikroapertur und wird deshalb auch als Mikroküvette 5 bezeichnet. Die Mikroküvette 5 ist hier insbesondere hohlzylinderförmig. Die Mikrostrukturvorrichtung 1 weist eine erste Elektrode 11 auf, die zum elektrischen Kontaktieren des ersten Elektrolyten 6 im Kontakt mit dem mindestens einen ersten Kompartiment 5 angeordnet ist. Die erste Elektrode 11 ist eine Ag/Ag-Cl Elektrode, die bezüglich der z-Achse konzentrisch mit der Mikroapertur angeordnet ist. Die erste Elektrode weist vorzugsweise mindestens den halben minimalen Durchmesser der Mikroapertur auf. Besonders bevorzugt weist die erste Elektrode den selben Durchmesser auf wie die Mikroapertur, oder einen größeren Durchmesser, wobei letzteres durch Modifikation der Form der Mikrokavität erreicht werden kann. Die relative große Fläche der ersten Elektrode hat den Vorteil, das bei den relativ großen Strömen, die beim Anlegen des Spannungsstoßes entstehen können, an der Fläche der Elektrode selbst nur eine relativ geringe Stromdichte entsteht. Dadurch ist die Elektrode beständiger und eine nachfolgende elektrische Messung zuverlässiger.
Die Mikrostrukturvorrichtung 1 weist ferner eine zweite Elektrode 12 auf, die zum elektrischen Kontaktieren des zweiten Elektrolyten 8 im Kontakt mit dem mindestens einen zweiten Kompartiment 7 angeordnet ist. Die zweite Elektrode 12 kann gegenüber dem zweiten Kompartiment 7 beweglich angeordnet sein, um die Zugabe des zweiten Elektrolyten zu vereinfachen.
Die Lipidmembran 20 ist eine Bilipidschicht. Eine Bilipidschicht bezeichnet allgemein eine Doppelschicht, die im wesentlichen aus zwei übereinanderliegenden, durch Selbstorganisation in polaren Lösungsmitteln wie Wasser angeordneten Lipidmonolayern besteht.
Das Lipidmembranpartikel, hier eine Zelle, weist einen Innenraum 31 auf, der mit einem Elektrolyt, hier einem Cytoplasma gefüllt ist. Das Lipidmembranpartikel weist eine hier als Hülle dienende Lipidmembran 32 mit einem Membrankontaktabschnitt 33 auf, der eine erste Membranseite 34 aufweist, mit der das Lipidmembranpartikel auf der Lipidmembran aufliegt und sich über dem Trägersubstrat abstützt, und eine der ersten Membranseite gegenüberliegende zweite Membranseite 35. Die Lipidmembran 32 weist Kanalproteine 36 auf, mittels denen eine elektrische Leitung von Ionen zwischen dem Inneren und dem Äußeren des Lipidmembranpartikels möglich ist.
Die Mikrostrukturvorrichtung 1 weist eine elektrische Steuereinrichtung 15 auf, die die Spannungsdifferenz zwischen der ersten und der zweiten Elektrode steuert, oder den Strom zwischen diesen Elektroden steuert, und die dazu ausgebildet ist, dass in einem ersten Schritt mindestens einen Spannungspuls zwischen der ersten Elektrode 11 und der zweiten Elektrode 12 erzeugt wird, wobei mit dem Spannungspuls ein ohmscher Kontakt zwischen dem erstem Elektrolyten 6 und dem Inneren 31 des oberhalb der Lipidmembran 20 und der Mikroapertur 4 angeordneten Lipidmembranpartikels 30 erzeugbar ist und insbesondere in einem zweiten Schritt, der insbesondere zur automatischen Durchführung durch die mindestens eine Steuereinrichtung 15 in einem vorbestimmten zeitlichen Abstand nach dem ersten Schritt vorgesehen ist, eine elektrische Messung zwischen der ersten Elektrode 11 und der zweiten Elektrode 12 durchzuführen, die zur Detektion von Ionenströmen zwischen dem Inneren des Lipidmembranpartikels und dem zweiten Elektrolyten dient.
1a zeigt die Situation der Mikrostruktureinrichtung mit positionierter Zelle, bevor ein Spannungspuls erzeugt wurde. 1b illustriert die Situation nach Durchführung des Spannungspulses, die zu einer elektrisch dichten Verbindung des Inneren 31 der Zelle mit dem ersten Elektrolyt 6 führt, so dass Ionenströme durch den ohmschen Kontakt des ersten Elektrolyts mit dem Cytoplasma messbar sind. Die Abdichtung erfolgt wahrscheinlich durch eine Verschmelzung der planaren Lipidmembran 20 und der Zellmembran 32 in einem Bereich 21 entlang des Randes der Mikroapertur. Diese Verschmelzung erfolgt vermutlich durch Selbstorganisation der Lipidmoleküle. Innerhalb der x-y-Ebene des Bereiches 21 ist die Lipidmembran und der Membrankontaktabschnitt 33 unmittelbar oberhalb der Mikroapertur zumindest abschnittsweise perforiert, und wahrscheinlich vollständig entfernt (wie in 1b gezeigt), wie dies im Fall einer Bilipdschicht in 4b auch nachgewiesen wurde. Jedenfalls wird ein Gigaseal zwischen den beiden Membranen erzeugt, der von der Mikrostrukturvorrichtung messbar ist. Durch diesen Seal ist nach dem Spannungsstoß der Strom durch Kanalproteine 36 messbar, die im wesentlichen die einzigen elektrischen Durchleitungen zwischen dem Inneren 31 zuzüglich des Elektrolyts 6 und dem Äußeren der Zelle 30 (dem zweiten Elektrolyt 8) bilden.
2a zeigt eine Mikrostrukturvorrichtung 60, bei der in einem Trägersubstrat 62 eine Vielzahl von Mikrokavitäten 65, insbesondere Mikroküvetten 65 vorgesehen sind, die jeweils in eine Mikroapertur 64 münden. Jede dieser Mikroküvetten weist eine erste Elektrode 11' auf, die den Boden der Mikroküvette im wesentlichen vollständig bedeckt. Oberhalb einer Mikroapertur 64 ist jeweils ein individuelles zweites Kompartiment 7' mit einem Elektrolyt 8' angeordnet. In jedem Kompartiment ist eine individuelle zweite Elektrode 12' anordenbar. Diese Elektroden sind durch die Leitungseinrichtung 69 individuell ansteuerbar. Die Steuereinrichtung 15' ist dazu ausgebildet, für jede Mikrokavität die Paare von erster Elektrode und zweiter Elektrode individuell anzusteuern und insbesondere zeitlich parallel anzusteuern. Dadurch kann jede Messstation, bestehend aus Mikrokavität, Mikroapertur und erster und zweiter Elektrode individuell angesteuert werden, insbesondere gemessen oder überwacht werden (Strom und/oder Spannung und/oder Widerstand), der mindestens eine Spannungspuls kann individuell angesteuert werden, und eine nachfolgende elektrische Messung kann individuell erfolgen. Dadurch wird ein erhöhter Arbeitsdurchsatz der Mikrostrukturvorrichtung ermöglicht.
2b zeigt eine Mikrostrukturvorrichtung 80, bei der in einem Trägersubstrat 82 eine Vielzahl von Mikrokavitäten 85, insbesondere Mikroküvetten 85 vorgesehen sind, die jeweils in eine Mikroapertur 84 münden. Jede dieser Mikroküvetten weist eine erste Elektrode 11'' auf, die den Boden der Mikroküvette im wesentlichen vollständig bedeckt. Oberhalb der mehreren Mikroaperturen 84 ist ein zweites gemeinsames Kompartiment 7'' mit einem Elektrolyt 8'' angeordnet, in dem eine gemeinsame zweite Elektrode 12'' anordenbar ist. Diese Elektroden 11'' sind zeitlich versetzt jeweils individuell ansteuerbar. Die Steuereinrichtung 15'' ist dazu ausgebildet, für jede Mikrokavität die Paare von erster Elektrode und zweiter Elektrode individuell anzusteuern und insbesondere zeitlich versetzt anzusteuern. Dadurch kann jede Messstation, bestehend aus Mikrokavität, Mikroapertur und erster und zweiter Elektrode individuell angesteuert werden, insbesondere zeitlich nacheinander gemessen oder überwacht werden (Strom und/oder Spannung und/oder Widerstand), der mindestens eine Spannungspuls kann zeitlich nacheinander individuell angesteuert werden, und eine nachfolgende elektrische Messung kann zeitlich nacheinander individuell erfolgen. Diese Funktionen können aber jeweils auch zeitlich parallel erfolgen. Dadurch wird ein erhöhter Arbeitsdurchsatz der Mikrostrukturvorrichtung ermöglicht. Eine Mikrostrukturvorrichtung kann mehrere Gruppen von Messstationen haben, die unabhängig voneinander und oder gemeinsam betreibbar sind.
Die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird nachfolgend in einem Beispiel beschrieben, dessen Ablauf in 3 schematisch dargestellt ist.
Wie in 3 gezeigt wird, kann ein erfindungsgemäßes Verfahren 100 insbesondere die Schritte aufweisen: Bereitstellen einer erfindungsgemäßen Mikorstrukturvorrichtung, Bereitstellen mindestens eines ersten Elektrolyten in dem mindestens einen ersten Kompartiment und Ausbilden einer Lipidmembran auf der Oberseite des Trägersubstrats, wobei die Lipidmembran die mindestens eine Mikroapertur überspannt (101); Überprüfen des elektrischen Widerstands zwischen erster und zweiter Elektrode, der insbesondere 5–30 Gigaohm betragen sollte (102); Bereitstellen mindestens eines zweiten Elektrolyten in dem mindestens einen zweiten Kompartiment; Bereitstellen mindestens eines Lipidmembranpartikels oberhalb der mindestens einen Mikroapertur und oberhalb der Lipidmembran in dem mindestens einen zweiten Kompartiment und; insbesondere erneutes Überprüfen des elektrischen Widerstands zwischen erster und zweiter Elektrode, der insbesondere weiterhin 5–30 Gigaohm betragen sollte (103); Erzeugen eines ohmschen Kontaktes zwischen dem mindestens einen ersten Elektrolyten und dem an der zweiten Membranseite des mindestens einen Lipidmembranpartikels vorliegenden Elektrolyten durch Erzeugen mindestens eines Spannungspulses zwischen der mindestens einen ersten und der mindestens einen zweiten Elektrode durch die mindestens eine Steuereinrichtung (104); Überprüfen des elektrischen Widerstands zwischen erster und weiter Elektrode (105a) durch Vergleich des bei einer vorgegebenen Spannungsdifferenz fließenden Stroms mit einem Referenzwert (105b) und Feststellen, ob und insbesondere wann der Referenzwert erreicht ist; dieser Referenzwert entspricht vorzugsweise dem elektrischen Widerstand, der dem Eingangswiderstand des vorliegenden Lipidmembranpartikels entspricht und zeigt an, dass der gewünschte ohmsche Kontakt zwischen erstem Elektrolyt und dem Inneren des Lipidmembranpartikels hergestellt ist (105); Abwarten einer Zeitspanne t3 nach dem Vorliegen dieses ohmschen Kontaktes (106); Automatisches Durchführen der elektrischen Messung zwischen der ersten und zweiten Elektrode, insbesondere in „Voltage-Clamp”-Konfiguration (107). Gegebenenfalls kann dieses Verfahren zeitlich parallel an mehreren Messstationen und/oder zeitlich versetzt an mehreren Messstationen einer Mikrostrukturvorrichtung erfolgen.
Basis des erfindungsgemäßen Verfahrens 100 sind im Polymersubstrat hergestellte Arrays von Picoliter-Küvetten (5; 65; 85) („MEC”, „MicroElectrode Cavity”; Durchmesser wenige μm), deren Boden jeweils als Ag/AgCl-Mikroelektrode ausgeführt und über Goldleiterbahnen kontaktiert ist (sog. micoelectrode cavity arrays, MECA). Auf diesen Küvetten werden durch die Aufstreichmethode Lipiddoppelschichten 20 (freistehende synthetische Phospholipidmembranen) ausgebildet, die diese elektrisch dicht verschließen (s. 1a) Dann werden enzymatisch vereinzelte Zellen 30 zugegeben, die auf die Oberfläche des Chips, und auch auf die dort vorhandenen Bilipidschichten sedimentieren (s. 1a).
Überraschenderweise zeigte sich, dass Elektroporation der synthetischen Bilipidschicht, d. h. ihre Zerstörung durch kurze Spannungspulse (0.1–10 ms) hoher Spannung (100–1000 mV. s. ) zur Ausbildung eines elektrischen Zugangs zum Zellinneren führt, in ersten Versuchen zumindest in etwa einem Drittel der Fälle beim Anlegen eines Spannungspulses, was insbesondere deutlich erfolgreicher ist und eine zeiteffizientere Messung ermöglicht als dies bei der spontanen Verschmelzung von Zellmembran und Lipidmembran möglich wäre. Der elektrische Zugang (ohmsche Kontakt) kann zur Messung von Ionenströmen genutzt werden (s. 4a und 4b). Der Mechanismus besteht mit hoher Wahrscheinlichkeit in einer durch die Elektroporation ausgelösten Verschmelzung von synthetischer und biologischer Membran.
Epifluoreszenzaufnahmen zeigen eine durch Aufstreichen in Elektrolyt (150 mM KCl) erzeugte, mit Fluoreszenzfarbstoff, markierte Bilipidschicht (99,5% Diphytanoylphosphocholin, 0,5% L-α-Phosphatidylethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl)) über einer MEC. Zunächst ist die Mikroapertur von einer Bilipidschicht überspannt, die nach Elektroporation zerstört ist, was durch die fehlende Fluoreszenz im Innenbereich der Mikroapertur (dunkler Kreis) erkennbar ist. Die homogene Benetzung der sie umgebenden SU8-Oberfläche mit dem Phospholipid bleibt stabil, was durch die Fluoreszenz in diesem Bereich erkennbar ist.
Als Modellzellen wurden RBL-1 oder RBL-2H3(rat basophilic leukaemia)-Zellen verwendet. Diese exprimieren konstitutiv einen K+-selektiven Ionenkanal, der aufgrund eines Blocks durch intrazelluläre (Poly)kationen (z. B. Mg2+, Spermin) eine sehr charakteristische Strom-Spannungsbeziehung zeigt, indem er bei Membranpotentialen, die positiv vom elektrochemischen K+-Gleichgewichtspotential (EK) liegen, verschlossen wird, während er bei Potentialen, die negativer als EK liegen, zunehmend leitet. Der Kanal verursacht also eine sog. anomale oder Einwärtsgleichrichtung der Membran, ein sehr charakteristisches Phänomen, das beispielsweise durch unspezifische Leitfähigkeiten nicht nachgeahmt werden kann. Dies ist für den Nachweis einer erfolgreichen elektrischen Kontaktierung von Zellen über MECs von entscheidendem Vorteil.
Da die Modellzellen einen Durchmesser von ca. 20 μm aufweisen, wurden MECs mit 6–10 μm für die Kontaktierungsversuche verwendet. Zunächst wurden die MECAs mit Elektrolytlösung benetzt, die in ihrer Zusammensetzung der intrazellulären Pipettenlösung bei klassischen patch-clamp-Messungen entspricht (130 mM KCl, 10 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 4 mM CaCl2, 10 mM HEPES, 10 mM EDTA, pH 7.4). Sodann wurde, wie oben geschildert, eine Phospholipidschicht aufgebracht, was zur Ausbildung einer stabilen Bilipidschicht über den MECs führte (Widerstände > 10 GOhm). Die enzymatisch von den Kulturschalen abgelösten, zentrifugierten und in Elektrolytlösung resuspendierten RBL-Zellen wurden dann in Suspensionen hoher Dichte zugegeben, so dass mit großer Wahrscheinlichkeit Zellen auch auf den MECs zu liegen kamen. Dies wurde mikroskopisch verifiziert. Dabei war die Zusammensetzung des extrazellulären Elektrolyts zunächst identisch mit der o. g. intrazellulären Lösung, was RBL-Zellen sehr gut tolerieren. Nach Sedimentation einer Zelle auf eine präformierte Bilipidschicht blieb der hohe Widerstand zunächst unverändert. In vielen Fällen erhielt man überraschenderweise durch Elektroporation der Bilipidschicht nicht eine vollständige Öffnung mit entsprechend geringem Widerstand (< 10 MOhm), sondern man maß einen Widerstand von ca. 0,6 bis 2 GOhm, der dem Eingangswiderstand einer RBL-Zelle entspricht. Zugleich konnte eine deutliche Zunahme der Kapazität gemessen werden. Diese Beobachtung war insbesondere dann zu machen, wenn sich eine Zelle zentral über der Apertur über der überspannenden Bilipidschicht befand. Eine Positioniereinrichtung zum Positionieren der Zelle ist insofern von Vorteil.
In 4a und 4b ist gezeigt, wie in diesen Fällen durch Anlegen einer Reihe von Spannungssprüngen die charakteristische Strom-Spannungsbeziehung der einwärtsgleichrichtenden K+-Leitfähigkeit einer RBL-Zelle nachgewiesen werden kann. Solche Ableitungen waren bis zu 30 Minuten oder einer Stunde stabil. Es wird vermutet, dass die Elektroporation der Bilipidschicht zu einer Destabilisierung auch der ihr direkt aufliegenden Zellmembran führt, so daß ein elektrischer Zugang zum Inneren der Zelle entsteht. Mit gewisser Wahrscheinlichkeit kommt es hier zur elektrisch induzierten „Verschmelzung” der beiden Membranen, zumindest in einer Weise, dass eine elektrisch dichte Verbindung von Zelle und Lipidmembran zur Messung von transmembranen Ionenströmen möglich wird. Dass durch Elektroporation einer synthetischen planaren Lipidmembran eine anliegende Zellmembran ebenfalls elektroporiert werden kann, war für die Experimentatoren äußerst überraschend. Mit hoher Wahrscheinlichkeit kommt es bei dieser Co-Elektroporation zu einer elektrisch erzeugten Destabilisierung und Bildung einer Pore zunächst in der synthetischen, planaren Lipidmembran und, sobald diese elektroporiert ist und die Spannung dann auch über sie abfällt, auch der aufliegenden Zellmembran im Sinne einer sehr lokalen Elektroporation.
4a zeigt die Strom-Spannungsbeziehung an einer MEC in der Konfiguration wie in gezeigt. Sie entspricht dem charakteristischen, einwärtsgleichrichtenden Verhalten der Membran einer RBL-Zelle. 4b zeigt die Vergleichsmessung an einer RBL-Zelle mittels klassischer Patch-Clamp-Messung. Haltepotential war in beiden Fällen 0 mV (= EK in symmetrischen Elektrolytlösungen). Potentialsprünge in positive Richtung führen nicht zu Auswärtsströmen, in negative Richtung finden sich große Stromamplituden. Dies entspricht genau dem für RBL-Zellen erwarteten Verhalten.
Die Erfindung ermöglicht die Herstellung eines nach außen hin dichten elektrischen Zugangs zum Inneren des Lipidmembranpartikels, insbesondere der Zelle, als Voraussetzung für elektrophysiologische Messungen, ohne die Notwendigkeit mechanischer oder chemischer Einwirkung auf die Zellmembran. Damit wird es erstmals möglich, auch Plattformen wie das von den Erfindern entwickelte Microelectrode Cavity Array für Messungen zu verwenden, die aus Gründen der höheren Integrationsdichte und der besseren Meßauflösung auf mikrofluidische Anbindung des mit der aktiven, ersten Elektrode verbundenen ersten Kompartiments verzichten. Damit eröffnet sich die Möglichkeit, den Durchsatz elektrophysiologischer Messungen an Zellen (jetzt einige hundert Messungen pro Tag) nochmals um den Faktor 10 bis 100 zu erhöhen.
Durch die vorliegende Erfindung kann eine zuverlässige und stabile Plattform für die Hochdurchsatzelektrophysiologie bereitgestellt und kostengünstig auf dem Markt angeboten werden. Die Möglichkeit einer hohen Integrationsdichte und die möglichen, hervorragenden Signal-Rauschabstände bieten Anwendern gegenüber bekannten Vorrichtungen erhebliche Vorteile. Der Endnutzer wird in die Lage versetzt, schnell und mit hohem Durchsatz Lipidmembranpartikel elektrisch zu kontaktieren (ohmscher Kontakt) und nachfolgend insbesondere Membranströme aller Art zu messen. Solche Messungen spielen eine wachsende Rolle in der pharmazeutischen Wirkstofffindung sowie der Biotechnologie. Insbesondere können die erfindungsgemäße Mikrostrukturvorrichtung und das erfindungsgemäße Verfahren jeweils zur Messung von Ionenströmen durch die Membran des zu messenden Lipidmembranpartikels, insbesondere in Abhängigkeit von der vorbestimmten Konzentration pharmakologischer Wirkstoffe im zweiten Elektrolyten verwendet werden.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

US 2009/0167288 A1 [0007, 0016, 0018, 0051, 0060]
WO 2006/048447 A1 [0009, 0010]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

Baaken, Prucker, Behrends, Rühe 2005, European Cells and Materials 5, Suppl. 5, p. CS4 [0007]
Baaken, Prucker, Sondermann, Behrends, Rühe 2007, Tissue Engineering 18, 889 [0007]
„Baaken et al.” (Baaken et al., ”Planar microelectrode-cavity array for high-resolution and parallel electrical recording of membrane ionic currents”, Lab Chip, 2008, 8, 938–944 [0007]
Baaken et al. [0016]
Baaken et al. [0018]
Baaken et al. [0051]
Baaken et al. [0060]

Claims

Verfahren zur elektrischen Kontaktierung mindestens eines Lipidmembranpartikels (30), insbesondere einer biologischen Zelle (30), aufweisend die Schritte: – Bereitstellen einer Mikrostrukturvorrichtung (1; 60; 80), die mindestens ein Trägersubstrat (2; 62; 82) aufweist, dessen Oberseite (3) mindestens eine Mikroapertur (4; 64; 84) aufweist, die einen Durchmesser aufweist, der kleiner ist als der Durchmesser des mindestens einen, zu messenden Lipidmembranpartikels, mindestens ein unterhalb der Mikroapertur angeordnetes erstes Kompartiment (5; 65; 85), mindestens ein oberhalb der Mikroapertur angeordnetes zweites Kompartiment (7; 7'; 7''), mindestens eine erste Elektrode (11; 11'; 11''), die im Kontakt mit dem mindestens einen ersten Kompartiment angeordnet ist, mindestens eine zweite Elektrode (12; 12'; 12'')), die im Kontakt mit dem mindestens einen zweiten Kompartiment angeordnet ist, und mindestens eine elektrische Steuereinrichtung (15; 15'; 15''); – Bereitstellen mindestens eines Elektrolyten (6) in dem mindestens einen ersten Kompartiment; – Ausbilden einer Lipidmembran (20) auf der Oberseite des Trägersubstrats, wobei die Lipidmembran die mindestens eine Mikroapertur überspannt; – Bereitstellen mindestens eines Elektrolyten (8) in dem mindestens einen zweiten Kompartiment; – Bereitstellen mindestens eines Lipidmembranpartikels (30) oberhalb der mindestens einen Mikroapertur und oberhalb der Lipidmembran in dem mindestens einen zweiten Kompartiment, wobei das Lipidmembranpartikel einen Membrankontaktabschnitt (33) aufweist, der eine erste Membranseite (34) aufweist, mit der das Lipidmembranpartikel auf der Lipidmembran aufliegt und sich über dem Trägersubstrat abstützt, und eine der ersten Membranseite gegenüberliegende zweite Membranseite (35) aufweist; – Erzeugen eines ohmschen Kontaktes zwischen dem mindestens einen Elektrolyten (6) im ersten Kompartiment und dem an der zweiten Membranseite des mindestens einen Lipidmembranpartikels vorliegenden Elektrolyten (31) durch Erzeugen mindestens eines Spannungspulses zwischen der mindestens einen ersten Elektrode und der mindestens einen zweiten Elektrode durch die mindestens eine Steuereinrichtung.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das erste Kompartiment eine Mikrokavität ist, die in der Oberseite der Trägerplatte ausgebildet ist, wobei die Mikrokavität nach oben offen ist und in der Mikroapertur in der Oberseite des Trägersubstrats mündet, wobei die mindestens eine erste Elektrode zumindest teilweise in der mindestens einen Mikrokavität angeordnet ist und im Abstand zu deren Mikroapertur und dieser gegenüber liegend angeordnet ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, umfassend den Schritt: Durchführung einer elektrischen Messung zwischen der mindestens einen ersten und der zweiten Elektrode durch die mindestens eine Steuereinrichtung, wobei die Messung der Detektion von Ionenströmen zwischen dem Inneren und dem Äußeren des Lipidmembranpartikels dient.
Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei die Messung in einem zeitlichen Abstand nach dem Erzeugen des ohmschen Kontaktes zwischen dem mindestens einen Elektrolyten im ersten Kompartiment und dem Inneren des mindestens einen Lipidmembranpartikels erfolgt.
Verfahren gemäß mindestens einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Mikroapertur kreisförmig ausgebildet ist und ein Lipidmembranpartikel jeweils zentriert mit der Mikroapertur angeordnet wird.
Verfahren gemäß mindestens einem der vorherigen Ansprüche, wobei der mindestens eine Spannungspuls zum Erzeugen des ohmschen Kontaktes eine Dauer aufweist, die zwischen 0,1 ms und 500,0 ms liegt.
Verfahren gemäß mindestens einem der vorherigen Ansprüche, wobei der mindestens eine Spannungspuls zum Erzeugen des ohmschen Kontaktes eine Amplitude aufweist, deren Betrag zwischen 100 mV und 2000 mV liegt.
Verfahren gemäß mindestens einem der vorherigen Ansprüche, wobei eine Vielzahl von Mikroaperturen einer Messvorrichtung verwendet wird, um eine Vielzahl von Lipidmembranpartikeln gleichzeitig kontaktieren und insbesondere eine Vielzahl von elektrischen Messungen parallel durchführen zu können.
Mikrostrukturvorrichtung (1; 60; 80) zur elektrischen Messung an Lipidmembranpartikeln (30), insbesondere an biologischen Zellen (30), aufweisend mindestens ein Trägersubstrat mit einer Oberseite zum Tragen mindestens einer Lipidmembran und mindestens eines Lipidmembranpartikels über dieser Lipidmembran, wobei die Oberseite mindestens eine Mikroapertur aufweist, die einen Durchmesser aufweist, der kleiner ist als der Durchmesser eines zu messenden Lipidmembranpartikels, mindestens ein unterhalb der Mikroapertur angeordnetes erstes Kompartiment zum Aufnehmen eines Elektrolyten, mindestens ein oberhalb der Mikroapertur angeordnetes zweites Kompartiment zum Aufnehmen eines mindestens eine biologische Zelle enthaltenden Elektrolyten, mindestens eine erste Elektrode, die zum elektrischen Kontaktieren des Elektrolyten im Kontakt mit dem mindestens einen ersten Kompartiment angeordnet ist, mindestens eine zweite Elektrode, die zum elektrischen Kontaktieren des Elektrolyten im Kontakt mit dem mindestens einen zweiten Kompartiment anordenbar ist, und mindestens eine elektrische Steuereinrichtung, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens eine elektrische Steuereinrichtung dazu ausgebildet ist, in einem ersten Schritt mindestens einen Spannungspuls zwischen der ersten und der zweiten Elektrode zu bewirken, mit dem ein ohmscher Kontakt zwischen dem Elektrolyten im ersten Kompartiment und dem Inneren des oberhalb der Lipidmembran und der Mikroapertur angeordneten Lipidmembranpartikels erzeugbar ist und insbesondere in einem zweiten Schritt, der insbesondere zur automatischen Durchführung durch die mindestens eine Steuereinrichtung in einem vorbestimmten zeitlichen Abstand nach dem ersten Schritt vorgesehen ist, eine elektrische Messung zwischen der ersten und der zweiten Elektrode durchzuführen, die zur Detektion von Ionenströmen zwischen dem Inneren und dem Äußeren des Lipidmembranpartikels dient.
Verwendung des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 oder der Vorrichtung gemäß Anspruch 9 zur Messung von Ionenströmen durch die Membran des zu messenden Lipidmembranpartikels, insbesondere in Abhängigkeit von der vorbestimmten Konzentration pharmakologischer Wirkstoffe im Elektrolyt des mindestens einen zweiten Kompartiments.