DE19939574B4

DE19939574B4 - Verfahren zur dreidimensionalen Objektabtastung

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Publication number: DE19939574B4
Application number: DE1999139574
Authority: DE
Inventors: Ernst-Ludwig Dr. Florin; J.K. Heinrich Dr. Hörber; Ernst H.K. Dr. Stelzer
Original assignee: Europaisches Laboratorium fuer Molekularbiologie EMBL
Current assignee: Europaisches Laboratorium fuer Molekularbiologie EMBL
Priority date: 1999-08-20
Filing date: 1999-08-20
Publication date: 2010-08-05
Anticipated expiration: 2019-08-21
Also published as: DE19939574A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Erfassen eines Objekts oder/und einer Objektumgebung oder/und eines Objektinneraums mittels eines in einem Fangpotential gefangenen Abtastteilchens (8). Es wird vorgeschlagen, dass in einer ersten Positionsbestimmungsstufe, die einer ersten Größenskala zugeordnet ist, das Fangpotential in einem in Bezug auf das Objekt oder einen Bezugspunkt definierten Positionsbereich bereitgestellt wird, und dass in einer zweiten Positionsbestimmungsstufe, die einer zweiten, gegenüber der ersten Positionsbestimmungsstufe kleineren Größenskala zugeordnet ist, das in dem Fangpotential gefangene Abtasteilchen (8) innerhalb eines dem Positionsbereich zugeordneten Abtastvolumens eine im Wesentlichen ungebundene dreidimensionale Abtastbewegung unter Einfluss des Fangpotentials durchführt und derart das Abtastvolumen abtastet, und dass eine Mehrzahl von in Folge des Abtastens eingenommenen Positionen des Abtastteilchens innerhalb des Abtastvolumens erfasst wird. Die Erfindung betrifft ferner eine Vorrichtung (4, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30) zur Durchführung dieses Verfahrens.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Erfassen eines Objekts, gewünschtenfalls einschließlich einer Objektumgebung oder/und eines Objektinnenraums, in Bezug auf physikalische oder/und chemische oder/und biologische Fragestellungen, bei dem ein in einem Fangpotential gefangenes Abtastteilchen das Objekt bzw. die Objektumgebung bzw. den Objektinnenraum abtastet und wenigstens eine von dem Abtasten abhängige Position des Abtastteilchens erfasst wird. Es wird vor allem, aber nicht ausschließlich, an ein derartiges Verfahren gedacht, bei dem das Fangpotential auf lichtoptischem Wege erzeugt wird.
Hintergrund der Erfindung
Wie spätestens seit Maxwell bekannt ist, haben Photonen einen Impuls, der gleich dem Produkt der Photonwellenlänge und des Planck'schen Wirkungsquantums ist und der auf Materie übertragen werden kann. Ashkin (Ashkin A (1970) Acceleration an trapping of particles by radiation pressure, Physical Review Letters, 24(4): 156–159) konnte zeigen, dass sich kleine Partikel in einem im Wesentlichen kollimierten Laserstrahl in den Bereich des stärksten Feldes (höchste Intensität) bewegen. Er konnte mit einem leicht divergenten, vom Erdmittelpunkt weg weisenden Laserstrahl die Gravitationskraft kompensieren und Glaspartikel mit Durchmessern im 20 μm-Bereich in einer Position fangen, in der sich die vom Strahldruck erzeugte Kraft und die Gravitationskraft kompensieren (Ashkin A, Dziedzik JM (1971) Optical levitation by radiation pressure, Applied Physics Letters, 19(8): 283–285). In einem weiteren Versuch wurde gezeigt, dass zwei gegeneinander gerichtete Laserstrahlen ein dreidimensionales Potential schaffen, das Partikel in allen drei Raumrich tungen fangen kann (Ashkin A, Dziedzik JM (1985) Observation of radiation pressure trapping of particles by alternating light beams, Physical Review Letters 54(12): 145–1247). Ferner konnte gezeigt werden, dass ein stark fokussierter Laserstrahl (unter Verwendung von Objektiven mit einer hohen nummerischen Apertur) Partikel in wässrigen Medien in allen drei Raumrichtungen halten kann (Ashkin A, Dziedzik JM, Bjorkholm JE, Chu S (1986) Observation of a single-beam gradient force optical trap for dielectric particles, Optics Letters 11(5): 288–290). Wird der Laserstrahl bewegt, so folgen die Partikel dem Fokus des Fangstrahls.
Aufbauend auf diesen Arbeiten wurden sogenannte ”optische Pinzetten” (optical tweezers) in Mikroskope integriert und für Messungen kleiner Kräfte verwendet, wie sie bei der Wechselwirkung zwischen Proteinen auftreten (Visscher, K., Brakenhoff GJ (1991) Single beam optical trapping integrated in a confocal microscope for biological applications, Cytometry. 12: 486–491). Entscheidend für solche Messungen sind Sensoren, die die Position des Partikels relativ zum geometrischen Fokus des Laserfangstrahls erfassen. Im einfachsten Fall lassen sich Kameras verwenden (Malmqvist L, Hertz HM (1992) Trapped particle optical microscopy, Optics Communication, 94, 19–24). Malmqvist und Hertz bauten auf der Basis der optischen Pinzette ein Nahfeldmikroskop, bei dem ein gefangenes Teilchen das Licht streut und so als eine durch ein zu beobachtendes Objekt geführte Lichtquelle angesehen werden kann, die den zu beobachtenden Objekten bis auf wenige Nanometer nahe kommt. Das Objekt wird dabei nicht vom Fernfeld des Mikroskopobjektivs, sondern vom durch das Partikel induzierten Nahfeld bestrahlt. Das Bild wird als Schattenwurf im Fernfeld aufgezeichnet.
Nach einem anderen Vorschlag wird ein quasi-heterodynes Interferometer zur Positionsbestimmung von Partikeln im Fokus verwendet (Denk W, Webb WW (1990) Optical measurement of picometer displacements of transparent microscopic objekts, Applied Opticas 29(16), 2382–2391).
Das vorwärts gestreute und das nicht gestreute Licht interferieren in einer Diode, so dass eine eindimensionale Position des Partikels relativ zum geometrischen Fokus des Laserfangstrahls gemessen werden kann. Die Genauigkeit der Positionsbestimmung hängt im Prinzip nur vom Signal-zu-Rausch-Verhältnis des Detektionsprozesses ab.
In der Literatur wurden mehrfach Systeme beschrieben, die z. B. Kameras (aber auch Quadrantenfotodioden, Kathodenstrahlkameras, CCD- bzw. CID-Kameras und ortsauflösende Sekundärelektronenvervielfacher) für die subpixelgenaue Positionsbestimmung von kleinen Partikeln verwenden (vgl. z. B. Saxton, M. J. und K. Jacobson (1997) ”Single-particle tracking: applications to membrane dynamics.” Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structures, 26: 373–399).
Ghislain und Webb beschreiben ein Instrument, in dem zunächst ein Glasstück mit einer optischen Pinzette gefangen und anschließend über eine Oberfläche bewegt wird. Die Auslenkung des Objektes wird über das oben erwähnte Interferometer erfasst (Ghislain LP, Webb WW (1993) Scanning-force microscope based on an optical trap, Optics Letters, 18(19), 1678–1680). Aus der Änderung des Streuverhaltens lässt sich auf die Änderung in der Topologie schließen.
Aus der US-5,445,011 A ist ein auf dem Prinzip der optischen Pinzette beruhendes Kraftmikroskop bekannt. Nach dieser Patentschrift wird eine Probe mikroskopisch ausgelenkt und die Auslenkung bestimmt. Das Instrument der US-5,445,011 A soll gegenüber einem herkömmlichen Kraftmikroskop unterlegen sein und keine besonderen Vorteile aufweisen (Stout AL, Webb WW (1998) Optical force microscopy. Methods in Cell Biology 55: 99–116). In der US-Patentschrift wird angemerkt, dass das Auflösungsvermögen des Instruments durch thermische Vibrationen der Probe begrenzt ist.
In einem wissenschaftlichen Beitrag der Erfinder (Florin E-L, Hörber JKH, Stelzer EHK (1996) High-resolution axial and lateral position sensing using two-photon excitation of fluorophores by a continuous-wave Nd:YAG laser, Applied Physics Letters, 69(4): 446–448) wurde gezeigt, dass sich die Position eines gefangenen, fluorophor-markierten Latexpartikels auch über die Intensität der Fluoreszenzemission bestimmen lässt. Da die Feldstärke, die ein Partikel in einer optischen Pinzette erfährt, sich mit seiner Position in der Punktverschmierungsfunktion (point spread function) ändert, variiert auch die Intensität der Fluoreszenzemission als Funktion der Partikelposition entlang der optischen Achse. Die axiale Position lässt sich so mit einer Genauigkeit von besser als 8 nm bestimmen.
Für die Fluoreszenzdetektion der axialen Position eines in einer optischen Pinzette gefangenen Teilchens ist es von Bedeutung, dass das Teilchen nicht im geometrischen Fokus, sondern – abhängig von der Teilchengröße – in Strahlrichtung dahinter gefangen wird (Wohland T, Rosin A, Stelzer EHK (1996) Theoretical determination of the influence of the polarization on forces exerted by optical tweezers, Optik, 102(4): 181–190). Dies ist aufgrund des auf das Teilchen wirkenden Strahldrucks bei bekannten ”optischen Pinzetten” in der Regel der Fall. Aufgrund der unterschiedlichen Stärke der Wechselwirkung selbst in axialsymmetrischen Potentialen kann deshalb die Position des Partikels entlang der optischen Achse angegeben werden (vgl. auch Pralle A, Prummer M, Florin E-L, Stelzer EHK, Hörber JKH (1999) Three-dimensional high-resolution position tracking for optical tweezers by forward scattered light, Microscopy Research and Techniques, 44(5), 378–386).
Ein weiteres Verfahren zur Bestimmung der Position eines Partikels in einem optischen Potential beruht auf der Analyse eines Interferenzmusters, das beispielsweise in einer zur Bild- oder Fourier-Ebene konjugierten Ebene gewonnen wird. Als Beispiel kann auf einen Vorschlag der Erfinder und ihrer Mitarbeiter verwiesen werden (Pralle A, Prummer M, Florin E-L, Stelzer EHK, Hörber JKH (1999) Three-dimensional high-resolution position tracking for optical tweezers by forward scattered light, Microscopy Research and Techniques, 44(5), 378–386). Nach diesem Vorschlag kann mittels einer Quadrantenfotodiode ein aus einer Interferenz ungestreuter Laserstrahlung und an dem Partikel gestreuten Laserlichts entstehendes Interferenzmuster ausgewertet und hierdurch die Position des das Streuzentrum bildenden Teilchens bezüglich einem geometrischen Fokus der optischen Pinzette bestimmt werden.
Eine Kalibrierung der auf ein in einer optischen Pinzette gefangenes Teilchen wirkenden photonischen (optischen) Kraft kann auf Grundlage einer Analyse thermischer Fluktuationen der Position des Teilchens im Fangpotential der optischen Pinzette erfolgen (Florin E-L, Pralle A, Stelzer EHK, Hörber JKH (1998) Photonic force microscope calibration by thermal noise analysis, Applied Physics A, 66: S75–S78). Ferner kann auf Grundlage einer statistischen Analyse der Brown'schen Teilchenbewegung in dem Fangpotential einer optischen Pinzette eine die Wechselwirkung mit einem das Teilchen umgebenden Medium beschreibende lokale Viskosität bestimmt werden (Pralle A, Florin E-L, Stelzer EHK, Hörber JKH, (1998) Local viscosity probed by photonic force microscopy, Applied Physics A, 66: S71–S73).
Ein photonisches (optisches) Kraftmikroskop auf Grundlage einer optischen Pinzette, bei dem die axiale Position eines in einem Fangpotential der optischen Pinzette gefangenen Teilchens durch Erfassen von vom Teilchen ausgehender, auf Zwei-Photonen-Anregung beruhender Fluoreszenzintensität bestimmt wird, ist in einem weiteren Aufsatz der Erfinder und ihrer Mitarbeiter beschrieben (Florin E-L, Pralle A, Hörber JKH, Stelzer EHK (1997) Photonic force microscope based on optical tweezers and two-photon excitation for biological applications, Journal of Structural Biology, 119: 202–211). Durch Abtasten von biologischen Proben mittels des gefangenen Teilchens, ein Latexkügelchen, unter Aufzeichnung der zwei-Photonen-induzierten Fluoreszenzintensität werden zweidimensionale Bilder erzeugt.
Optische Pinzetten können auch zum Manipulieren von Analyten verwendet werden, indem etwa ein kleines Kügelchen am jeweiligen Analyt angeheftet wird und dann der Analyt über das Kügelchen bewegt oder Kräfte auf den Analyt ausgeübt werden ( WO96/41154 A1 ). Man hat ferner auch schon ein in einer optischen Pinzette gefangenes Teilchen mittels eines Membranproteins an einer Neuritoberfläche eines Neurons angebunden, um eine Diffusionsbewegung des Membranproteins entlang der Oberfläche zu beobachten (Pralle A, Prummer M, Florin E-L, Stelzer EHK, Hörber JKH (1999) Three-dimensional high-resolution position tracking for optical tweezers by forward scattered light, Microscopy Research and Techniques, 44(5), 378–386). Bei einer derartigen Anwendung haftet das im Fangpotential der optischen Pinzette gefangene Teilchen vermittels des Membranproteins stets an der Neuritoberfläche, da die thermischen Positionsfluktuationen aufgrund der bei der Anwendung herrschenden Bedingungen nicht ausreichen, die Verbindung zwischen dem Teilchen und der Oberfläche zu unterbrechen.
Bei herkömmlichen Anwendungen stellt die Brown'sche (thermische) Bewegung des im Fangpotential der optischen Pinzette gefangenen Teilchens regelmäßig einen begrenzenden Faktor dar. Nur ausnahmsweise konnten thermische Positionsfluktuationen des Teilchens im Hinblick auf spezielle Fragestellungen ausgewertet werden, etwa zur Bestimmung der lokalen Viskosität oder zur Kalibrierung des Fangpotentials, wie erwähnt.
Speziell auch beim Erfassen eines Objekts oder/und einer Objektumgebung oder/und eines Objektinnenraums (in Bezug auf physikalische oder/und chemische oder/und biologische Fragestellungen) in der eingangs genannten Art und Weise führen die herkömmlich angewendeten, nur zu Informationen über eine mittlere Teilchenposition führenden Abtastschemata zu einer inhärenten Auflösungbegrenzung aufgrund des thermischen Rauschens, da die Brown'sche Bewegung des Abtastteilchens im Fangpotential zu Fluktuationen im erfassten Positionssignal, ggf. Fluoreszenzsignal, führt.
Erfindung
Auf Grundlage des Ansatzes, kurzzeitige Variationen des die Position des Teilchens im Fangpotential beschreibenden Positionssignals (ggf. der Intensität des fluoreszierenden bzw. gestreuten Lichts) nicht einfach als Rauschen abzutun, sondern auf die thermische Positionsfluktuationen des Partikels innerhalb des von der optischen Pinzette aufgespannten Potentials zurückzuführen, sowie auf Grundlage der Erkenntnis, dass sich das Partikel im Laufe eines Beobachtungszeitraums mit einer von der Stärke des Potentials abhängigen Aufenthaltswahrscheinlichkeit durch ein Teilvolumen des von der optischen Pinzette (allgemein einer Falle) definierten Volumens bewegt, schlägt die Erfindung mit dem in Anspruch 1 definierten Verfahren vor, Positionsfluktuationen des Partikels innerhalb des Fangpotentials für das Abtasten eines Objekts, gewünschtenfalls umfassend das Abtasten einer Objektumgebung oder/und eines Objektinnenraums, auszunutzen. Bei den Positionsfluktuationen kann es sich um thermisch induzierte Positionsfluktuationen oder/und um auf anderen Mechanismen beruhende, den thermischen Positionsfluktuationen regelmäßig überlagerte Positionsfluktuationen des im Fangpotential gefangenen Teilchens (Abtastteilchen) handeln. Ferner ist die Erfindung nicht auf den Einsatz einer sogenannten optischen Pinzette bzw. allgemein auf den Einsatz von Lichtstrahlung zum Erzeugen des Fangpotentials beschränkt. Grundsätzlich ist es denkbar, das Fangpotential beispielsweise auf magnetischem oder/und elektrostatischem Wege oder/und durch Einsatz von nicht-optischen elektromagnetischen Wechselfeldern zu erzeugen.
Nach dem in Anspruch 1 definierten, erfindungsgemäßen Verfahren ist vorgesehen, dass in einer ersten Positionsbestimmungsstufe, die einer ersten Größenskala zugeordnet ist, das Fangpotential in einem in Bezug auf das Objekt oder einen Bezugspunkt definierten Positionsbereich bereitgestellt wird, und dass in einer zweiten Positionsbestimmungsstufe, die einer zweiten, gegenüber der ersten Positionsbestimmungsstufe kleineren Größenskala zugeordnet ist, das in dem Fangpotential gefangene Abtastteilchen innerhalb eines dem Positionsbereich zugeordneten Abtastvolumens eine im Wesentlichen ungebundene dreidimensionale Abtastbewegung unter Einfluss des Fangpotentials durchführt und derart das Abtastvolumen abtastet, und dass eine Mehrzahl von in Folge des Abtastens eingenommenen Positionen des Abtastteilchens innerhalb des Abtastvolumens erfasst wird. Dabei ist erfindungsgemäß vorgesehen, dass eine Änderung des Positionsbereichs des Fangpotentials relativ zum Objekt durch absolute Änderung des Positionsbereichs des Fangpotentials oder/und durch absolute Änderung der Position des Objekts herbeigeführt wird, um einen über das Abtastvolumen oder/und die Ausdehnung des Fangpotentials hinaus gehenden Bereich abzutasten.
Während beim herkömmlichen Abtasten beispielsweise einer Oberfläche das Abtasten nur innerhalb einer Positionsbestimmungsstufe, nämlich durch sukzessives Positionieren des Fangpotentials an ein Raster bildenden Positionsbereichen erfolgt, so dass für ein hoch auflösendes Abtasten der Rasterabstand entsprechend klein gewählt werden muss und schließlich die thermischen Fluktuationsbewegungen des Abtastteilchens eine inhärente Auflösungsgrenze bilden, sieht der Erfindungsgedanke vor, das eigentliche Abtasten auf Grundlage der im Wesentlichen ungebundenen dreidimensionalen Abtastbewegung (beispielsweise die Brown'sche Bewegung des Abtastteilchens) durchzuführen und derart das Abtastvolumen abzutasten. Die Abtastbewegung erfolgt unter Einfluss des Fang potentials und ggf. unter Wechselwirkungseinflüssen eines benachbarten Objekts. Das Abtastteilchen darf aber nicht an das Objekt gebunden sein, beispielsweise über eine chemische Bindung oder eine Molekülbindung oder eine andere kurzreichweitige chemische Bindung, da sonst das vom Fangpotential und – je nach Positionsbereich des Fangpotentials in Bezug auf ein etwaiges Objekt – ggf. vom Objekt bestimmte Abtastvolumen nicht dreidimensional abgetastet werden könnte.
Nach der Erfindung ist es möglich, auf Grundlage einer Analyse der Abtastbewegungen, ggf. Positionsfluktuationen, des Abtastteilchens ein Objekt, insbesondere einen Oberflächenbereich des Objekts, eine Objektumgebung und ggf. auch einen Objektinnenraum zu erfassen. Ferner können die Abtastbewegungen bzw. Positionsfluktuationen dazu verwendet werden, das dreidimensionale Fangpotential zu vermessen, die Punktverschmierungsfunktion (point spread function) zu bestimmen und Bereiche zu erfassen, die zwar in der Punktverschmierungsfunktion liegen, jedoch aus mechanischen, elektrischen, magnetischen, chemischen, biochemischen oder anderen Gründen vom Abtastteilchen nicht erreicht werden können. Hierdurch sind Rückschlüsse auf grundlegende physikalische (z. B. thermodynamische, rheologische oder tribologische) Größen möglich. Da die Messung (das Abtasten) in drei Raumdimensionen erfolgt und das Fangpotential keinen speziellen Bedingungen genügen muss, können auch anisotrope Größen ermittelt werden und insbesondere anharmonische Potentiale als Fangpotential verwendet werden.
Die erste Größenskala ist dabei eine mikroskopische Größenskala und die zweite Größenskala eine submikroskopische Größenskala.
Die Erfindung sieht vor, eine mikroskopische Abtastung einer Probe entsprechend einem herkömmlichen Abtastschema um eine Erfassung der submikroskopischen Abtastbewegung des Abtastteilchens im Abtastvolumen zu ergänzen. Hierbei wird nicht wie im Stand der Technik die mitt lere Position des Partikels im Fangpotential erfasst, sondern es werden einzelne Volumina, die das Teilchen an verschiedenen Orten des Abtastvolumens, ggf. an verschiedenen Orten innerhalb eines Objekts, abtastet, aufgelöst. Man kann davon sprechen, dass eine ”Fernfeldauflösung” einer mittleren Abtastteilchenposition durch eine submikroskopische Auflösung ergänzt wird. Wird in der ersten Positionsbestimmungsstufe das Fangpotential in einen anderen Positionsbereich in Bezug auf das Objekt oder den Bezugspunkt verlagert, so bedeutet dies eine Verlagerung des gesamten Abtastvolumens in Bezug auf das Objekt oder den Bezugspunkt.
Gemäß einer vorteilhaften Weiterbildung der vorliegenden Erfindung ist vorgesehen, dass die für verschiedene (mikroskopische) Positionsbereiche gewonnenen submikroskopischen Abtastergebnisse (auf Grundlage der Abtastbewegung des Abtastteilchens im jeweiligen Abtastvolumen) zu einem Gesamtabtastergebnis zusammengesetzt werden und dass aus diesem Grund die Genauigkeit, mit der der jeweilige Positionsbereich bestimmt bzw. bestimmbar ist und die Genauigkeit, mit der sich die Position des Abtastteilchens im Abtastvolumen bestimmen lässt, in der gleichen Größenordnung, vorzugsweise in der Größenordnung von Nanometern, liegen. Ein jeweiliger Positionsbereich des Fangpotentials in Bezug auf das Objekt bzw. den Bezugspunkt lässt sich durch Angabe eines das Fangpotential charakterisierenden Fokuspunkts, oder/und einer mittleren Fangstrahlposition definieren.
Es wird ergänzend vorgeschlagen, dass das Fangpotential in einem mikroskopischen Prozeß, vorzugsweise auf optischem Wege, im Positionsbereich bereitgestellt wird. Für die Bereitstellung des Fangpotentials in einem mikroskopischen Prozess auf optischem Wege kann beispielsweise ein herkömmlicher Lichtpinzettenaufbau verwendet werden. Ein Beispiel für einen das Abtasten bewirkenden submikroskopischen Prozess ist die Wechselwirkung des Abtastteilchens mit einem Wärmebad, also die zu den thermischen Positionsfluktuationen (Brown'sche Bewegung) des Abtastteilchens führenden submikroskopischen Wechselwirkungen. Andere submikroskopische Prozesse, die ebenfalls ausgenutzt werden kön nen, sind Fluktuationen oder Änderungen des Fangpotentials und mechanische, insbesondere akustische Einwirkungen auf das Abtastteilchen. Die auf dem submikroskopischen Prozess beruhenden Abtastbewegungen des Abtastteilchens im Abtastvolumen werden durch eine geeignete Positionsbestimmungsanordnung oder Bewegungserfassungsanordnung erfasst und so der Analyse in Bezug auf die interessierenden Fragestellungen zugänglich gemacht.
Es ist bevorzugt, dass ein/der das Abtasten des Abtastvolumes durch Abtastteilchen induzierender Prozess derart ist, dass die Bewegung des Abtastteilchens innerhalb des Abtastvolumens auf einer gegenüber einer Autokorrelationszeit längeren Zeitskala statistisch oder quasi-statistisch ist und vorzugweise einer vorgegebenen Statistik, ggf. der Boltzmann-Statistik, entspricht. Durch ein derartiges ”statistisches” oder ”quasi-statistisches” Abtasten lassen sich dreidimensionale Strukturen besonders effektiv abbilden.
Um Informationen über das Objekt oder/und die Objektumgebung oder/und den Objektinnenraum zu erhalten, ist es besonders zweckmäßig, wenn die Bewegung des Abtastteilchens über einen die Autokorrelationszeit übersteigenden Erfassungszeitraum erfasst wird, um eine Mehrzahl von zu verschiedenen Zeitpunkten erfassten Positionen des Abtastteilchens im Hinblick auf die interessierende Fragestellung statistisch auswerten zu können. Möchte man aber zusätzlich oder alternativ Informationen über lokale Eigenschaften des Objekts oder/und der Objektumgebung oder/und des Objektinnenraums oder/und über ein Diffusionsverhalten des Abtastteilchens erhalten, so kann man alternativ oder zusätzlich die Bewegung des Abtastteilchens über ein der Autokorrelationszeit entsprechendes oder gegenüber der Autokorrelationszeit kürzeres Erfassungszeitintervall erfassen.
Das Abtasten des Abtastvolumens durch das Abtastteilchen kann, wie erwähnt, auf thermisch induzierten Positionsänderungen des Abtastteilchens beruhen. Durch Einstellen einer entsprechenden Temperatur oder/und durch Einstellen des Fangpotentials hinsichtlich Stärke und Verlauf kann das thermisch induzierte Abtasten hinsichtlich der Bewegungsamplituden des Abtastteilchens beeinflusst werden. Auch bei anderen Mechanismen zum Induzieren der Abtastbewegungen des Abtastteilchens werden thermisch induzierte Positionsänderungen des Abtastteilchens in der Regel zum Abtasten des Abtastvolumens durch das Abtastteilchen zumindest beitragen.
Eine weitere Möglichkeit ist, dass das Abtasten des Abtastvolumens durch das Abtastteilchen auf elektromagnetisch induzierten Positionsänderungen des Abtastteilchens beruht oder elektromagnetisch induzierte Positionsänderungen des Abtastteilchens hierzu zumindest beitragen. Dabei können Positionsänderungen des Abtastteilchens dadurch induziert werden, dass ein mit dem Abtastteilchen wechselwirkendes äußeres elektromagnetisches Feld in geeigneter Weise geändert wird. Je nach Art des Abtastteilchens könnten beispielsweise magnetische oder elektrische (elektrostatische) Felder eingesetzt werden, die beispielsweise durch Einsatz von Rauschgeneratoren zeitlich verändert werden, um sich zeitlich ändernde Kräfte auf das Abtastteilchen auszuüben und so die Positionsänderungen zu induzieren.
Gegenüber solchen externen Feldern ist es aber besonders bevorzugt, dass das äußere elektromagnetische Feld ein das Fangpotential zumindest miterzeugendes Feld ist, wobei das Fangpotential ein effektives Potential ist, das die Wechselwirkung des Abtastteilchens mit dem äußeren elektromagnetischen Feld auf einer der ersten Positionsbestimmungsstufe zugeordneten Zeitskala beschreibt, die die Positionsänderungen des Abtastteilchens induzierenden Änderungen des äußeren elektromagnetischen Feldes nicht auflöst. Wird das Fangpotential gemäß einer beson ders bevorzugten Ausführungsform mittels fokussierter Laserstrahlung erzeugt, so besteht beispielsweise die Möglichkeit, eine optische Komponente im Strahlengang der Laserstrahlung, beispielsweise eine Fokussieroptik, mechanisch zu vibrieren bzw. zu rütteln, um über das Fangpotential entsprechende, die Positionsänderungen des Abtastteilchens induzierende Kräfte auf das Abtastteilchen auszuüben. Eine andere Möglichkeit ist, die Intensität der Laserstrahlung zeitlich zu ändern, um hierdurch die Stärke des Fangpotentials und dementsprechend die vom Fangpotential auf das Abtastteilchen ausgeübten Kräfte zeitlich zu verändern und dementsprechend Positionsänderungen des Abtastteilchens anzustoßen. Derartige Intensitätsänderungen der Laserstrahlung können mit im optischen Fachgebiet bekannten Modulatoren (z. B. ein elektrooptischer oder akustooptischer Modulator) oder durch entsprechende Ansteuerung des Lasers (Modulation des Lasers über das Laserpumpen) erfolgen. Es kommt auch ein kurzzeitiges wiederholtes Unterbrechen der Laserstrahlung beispielsweise mittels eines Zerhackers in Betracht.
Es ist darauf hinzuweisen, dass derartige Beeinflussungen des Abtastteilchens über das Fangpotential nicht zur ersten Positionsbestimmungsstufe gehören, da das Teilchen im Mittel ein seinen mittleren Positionsbereich bestimmendes mittleres (effektives) Potential am in Bezug auf das Objekt oder den Bezugspunkt definierten Positionsbereich sieht. Dieses mittlere Fangpotential definiert alleine oder gemeinsam mit einem zu untersuchenden Objekt und ggf. Strukturen eines Objektträgers oder einer Probenkammer ein Abtastvolumen, das alle Raumbereiche umfasst, die das in dem Fangpotential gefangene Abtastteilchen erreichen kann, wobei die Wahrscheinlichkeit, dass das Teilchen sich in einem bestimmten Teilvolumen des Abtastvolumens tatsächlich aufhält, vom Potentialverlauf und von der Potentialstärke abhängt.
Eine weitere Möglichkeit ist, dass das Abtasten des Abtastvolumens durch das Abtastteilchen auf mechanisch induzierten Positionsänderun gen des Abtastteilchens beruht oder mechanisch induzierte Positionsänderungen des Abtastteilchens hierzu zumindest beitragen. Es wird dabei vor allem an akustisch induzierte Positionsänderungen gedacht. Zum Induzieren der Positionsänderungen kann mechanisch, insbesondere akustisch, auf einen das Objekt tragenden Objektträger oder/und eine das Objekt enthaltende Probenkammer eingewirkt werden, beispielsweise mittels Schallgebern auf Piezoelementbasis.
Ein zentrales Element der Erfindung ist die Erfassung von vom Abtastteilchen innerhalb des Abtastvolumens eingenommenen Positionen, beispielsweise relativ zu einer Ruheposition des Abtastteilchens im Fangpotential oder – bevorzugt – relativ zu einem eindeutigen Bezugspunkt des Fangpotentials selbst, im Falle eines lichtoptischen Fangpotentials beispielsweise ein geometrischer Fokus. Es bestehen grundsätzlich viele Möglichkeiten, wie diese Positionen erfasst werden können. Bevorzugt ist eine Erfassung der Abtastteilchenpositionen auf elektromagnetischem, vorzugsweise optischem Wege. So kann zur Erfassung der Position des Abtastteilchens innerhalb des Abtastvolumens von dem Abtastteilchen ausgehende oder/und durch das Abtastteilchen hindurchgehende elektromagnetische Strahlung erfasst werden. Wird das Fangpotential auf Grundlage elektromagnetischer Strahlung erzeugt, so kann die für die Positionserfassung des Abtastteilchens erfasste elektromagnetische Strahlung mit dieser zum Fangpotential beitragenden elektromagnetischen Strahlung im Zusammenhang stehen oder von dieser vollkommen unabhängig sein. Es ist also beispielsweise denkbar, durch Einsatz von Laserstrahlung einer ersten Wellenlänge das Fangpotential zu erzeugen und über eine Wechselwirkung des Abtastteilchens mit Laserstrahlung einer anderen Wellenlänge die Position des Abtastteilchens zu bestimmen. In diesem Zusammenhang ist es aber besonders bevorzugt, wenn aus der Wechselwirkung der das Fangpotential erzeugenden elektromagnetischen Strahlung mit dem Abtastteilchen mittelbar oder unmittelbar auch die Position des Abtastteilchens innerhalb des Abtastvolumens bestimmt werden kann.
Die vom Abtastteilchen ausgehende elektromagnetische Strahlung kann am Abtastteilchen gestreute oder reflektierte Strahlung umfassen. Ferner kann die vom Abtastteilchen ausgehende elektromagnetische Strahlung atomaren oder/und molekularen Übergängen des Abtastteilchen zugeordnete Rekombinationsstrahlung umfassen, die vorzugsweise durch einen Mehrphotonenprozess induziert wird. Man kann also vom Abtastteilchen ausgehende Lumineszenzsstrahlung, insbesondere Fluoreszenz- oder/und Phosphoreszenzstrahlung erfassen und hieraus die Position des Abtastteilchens, insbesondere die axiale Position des Abtastteilchens, bestimmen. Es wird auf die obigen Ausführungen betreffend die Positionserfassung über Fluoreszenzstrahlung des Abtastteilchens verwiesen.
Eine besonders hochauflösende Positionserfassung ist möglich, wenn zur Erfassung der Position des Abtastteilchens innerhalb des Abtastvolumens ein von dieser Position abhängiges Interferenzmuster aus elektromagnetischer Strahlung analysiert wird. Bei der elektromagnetischen Strahlung kann es sich beispielsweise um nach vorne gestreute Laserstrahlung einer optischen Pinzette handeln. Es wird hierzu speziell auf den schon genannten Aufsatz von Pralle et al, ”Three-dimensional high-resolution particle tracking for optical tweezers by forward scattered light” verwiesen.
Wie schon mehrfach erwähnt, kann das Fangpotential unter Einsatz von mit dem Abtastteilchen wechselwirkender optischer Strahlung, insbesondere Laserstrahlung, erzeugt werden, wobei zur Erfassung der Position des Abtastteilchens innerhalb des Abtastvolumens vorzugsweise elektromagnetische Strahlung erfasst wird, die aus der Wechselwirkung dieser optischen Strahlung mit dem Abtastteilchen resultiert.
Möchte man ein Objekt über einen über den Positionsbereich des Fangpotentials hinausgehenden Bereich erfassen, beispielsweise ein makroskopisches Objekt teilweise oder vollständig abtasten, kann man den Positionsbereich des Fangpotentials relativ zum Objekt ändern, und zwar durch absolute Änderung des Positionsbereichs des Fangpotentials oder/und durch absolute Änderung der Position des Objekts. Im Falle einer optischen Pinzette kann beispielsweise eine laterale mikroskopische Bewegung des Fangpotentials und damit des Abtastteilchens relativ zum Objekt dadurch erfolgen, dass ein die optische Pinzette bildender Laserstrahl in ein oder zwei Ebenen gekippt wird, vorzugsweise in einer primären oder in einer optisch konjugierten Fourierebene einer zum Fokussieren des Laserstrahls dienenden Linse bzw. eines hierzu dienenden Objektivs. Ferner kann die laterale mikroskopische Bewegung des Fangpotentials und damit des Abtastteilchens relativ zum Objekt durch eine Bewegung des Objekts selbst erfolgen. In Bezug auf eine axiale mikroskopische Bewegung des Fangpotentials und damit des Abtastteilchens relativ zum Objekt wird vorgeschlagen, dass die Bewegung durch eine Bewegung einer optischen Komponente, insbesondere einer Linse, eines Teils eines Objektivs oder dergleichen entlang einer die Laserstrahlausbreitung charakterisierenden optischen Achse erfolgt. Eine axiale mikroskopische Bewegung des Fangpotentials und damit des Abtastteilchens relativ zum Objekt kann aber auch durch eine axiale Bewegung des Objekts erfolgen.
Generell wird vorgeschlagen, dass ein über das Abtastvolumen oder/und die Ausdehnung des Fangpotentials hinausgehender Bereich abgetastet wird, indem dem der zweiten Größenskala zugeordneten Abtasten des Abtastteilchens innerhalb des Abtastvolumens ein übergeordnetes, der ersten Größenskala zugeordnetes Abtasten durch Ändern des Positionsbereichs des Fangpotentials überlagert wird. Das Fangpotential kann also von Positionsbereich zu Positionsbereich (mit der ersten Größenskala entsprechenden Abständen zwischen den Positionsbereichen) verlagert werden, wobei an jedem Positionsbereich das auf der zweiten Größen skala erfolgende Abtasten des Abtastteilchens innerhalb des Abtastvolumens erfolgt. Die Positionsbereiche des Fangpotentials können rasterartig angeordnet sein, um beispielsweise ein makroskopisches Objekt zu erfassen.
Eine derartige Abtaststrategie ist allerdings dann problematisch, wenn ein Objekt eine feste, von einem Abtastteilchen nicht durchdringbare Oberfläche aufweist, was häufig der Fall sein wird. In diesem Fall kann ein einfaches rastermäßiges Abtasten auf der ersten Größenskala dazu führen, dass das Abtastteilchen die Verlagerung des Fangpotentials aufgrund eines Anstoßens an eine Barriere nicht mitmachen kann und dementsprechend aus dem Einfluss des Fangpotentials gerät. Um hier Abhilfe zu schaffen, wird vorgeschlagen, dass das übergeordnete Abtasten nach einer Abtaststrategie erfolgt, bei der der Positionsbereich des Fangpotentials unter Berücksichtigung eines der zweiten Größenskala zugeordneten Abtastergebnisses geändert wird, ggf. unter Einbeziehung von vorab bekannter Information über das Objekt.
Neben der Erfassung von ausgedehnteren Objekten besteht auch die Möglichkeit, ein Objekt oder/und eine Objektumgebung oder/und einen Objektinnenraum lokal über einen Änderungszeitraum zu ”beobachten”, um Änderungen des Objekts oder/und der Objektumgebung oder/und des Objektinnenraums zu erfassen. Hierzu kann der Positionsbereich des Fangpotentials über den Änderungszeitraum aufrechterhalten werden, um über den Änderungszeitraum mehrfach die Mehrzahl von eingenommenen Positionen des Abtastteilchens innerhalb des Abtastvolumens zu erfassen und so Rückschlüsse auf die erfolgten Änderungen machen zu können.
Für manche Fragestellungen kann es auch sinnvoll sein, an einem gegebenen Positionsbereich das zugeordnete Abtastvolumen zu ändern, also beispielsweise ein Volumen, in dem sich das Abtastteilchen mit einer vorgegebenen Wahrscheinlichkeit aufhält, zu vergrößern oder zu verklei nern. Eine solche Änderung des Abtastvolumens kann über eine Änderung der Potentialfeldstärke oder/und des Potentialverlaufs des Fangpotentials erfolgen.
Hinsichtlich der Art der verwendeten Abtastteilchen gibt es grundsätzlich keine Einschränkungen. Das Abtastteilchen ist entsprechend dem eingesetzten Fangpotential zu wählen, so dass es über seine Wechselwirkung mit dem Fangpotential gefangen gehalten werden kann. Häufig ist es zweckmäßig, ein sphärisches oder/und fluoreszierendes Abtastteilchen zu verwenden. Im Falle eines fluoreszierenden Abtastteilchens kann die schon erwähnte Positionserfassung über die Teilchenfluoreszenz vorgesehen werden. Als Abtastteilchen kann insbesondere ein Metallteilchen, ggf. Edelmetallteilchen, oder ein Latexteilchen oder ein Glasteilchen verwendet werden. Eine weitere Möglichkeit ist, ein Nanopartikel, ggf. einen Quantenpunkt (Quantendot) zu verwenden.
Um den Anwendungsbereich des beschriebenen Verfahrens zu erweitern, kann ein in Bezug auf die jeweils interessierende Fragestellung entsprechend funktionalisiertes Abtastteilchen verwendet werden. Es wird vor allem daran gedacht, ein Abtastteilchen zu verwenden, das spezielle Wechselwirkungseigenschaften in Bezug auf das Objekt aufweist. Auf diese Weise lassen sich Oberflächeneigenschaften oder/und Anlagerungseigenschaften oder/und elektromagnetische Eigenschaften oder/und mechanische Eigenschaften eines Objekts näher untersuchen, um nur einige Beispiele zu nennen.
Generell ist das Verfahren dafür geeignet, Wechselwirkungspotentiale in der Nähe eines Objekts, die Mechanik eines Objekts (beispielsweise Vibrationen des Objekts), die chemische Beschaffenheit eines Objekts, insbesondere Grenzflächeneigenschaften, zu untersuchen. Ein weiteres wichtiges Anwendungsgebiet für das vorgeschlagene Verfahren ist die Zellbiologie. Diese Aufzählung ist nicht abschließend. Ein interessantes Anwendungsgebiet für das Verfahren ist auch die Erfassung (das Abtasten) von Nanostrukturen. Es wird geglaubt, dass eine derartige Anwendung im Rahmen der zunehmende Wichtigkeit erlangenden Nanotechnologie einen wichtigen Beitrag leisten kann.
Je nach Anwendungsfall wird man die Art des Fangpotentials, die Art und Weise der Erzeugung des Fangpotentials und die Art und Weise der Teilchenpositionserfassung geeignet wählen. Wird ein optisches Fangpotential eingesetzt, so wird man die verwendete Lichtwellenlänge entsprechend der Messsituation wählen, insbesondere in Abhängigkeit von der Art des Objekts. Für viele biologische Anwendungen ist besonders die 1064-Nanometer-Linie eines Nd:YVO₄-Lasers geeignet. Für andere Anwendungen kommen andere Wellenlängen in Betracht. Beispielsweise wird man im Falle einer Untersuchung von Festkörpern nach Möglichkeit eine Wellenlänge wählen, für die der Festkörper (ggf. Halbleiter) transparent ist. Dies ist insbesondere in Zusammenhang einer Abbildung von Halbleiterstrukturen von Interesse, bei denen es sich anbietet, eine auf die Bandlücke des Halbleiters abgestimmte, entsprechend lange Wellenlänge zu verwenden, so dass im Halbleiter höchstens eine geringfügige Absorption stattfindet.
Die Verwendung einer Lichtwellenlänge, für die das untersuchte Objekt transparent ist, erleichtert nicht nur die Detektion der Teilchenposition beispielsweise über ein Streustrahlungsinterferenzmuster, sondern verhindert auch eine unzulässige Erwärmung und ggf. sogar Zerstörung des Objekts.
Je nach Messsituation und zu untersuchendem Objekt kann es zweckmäßig sein, gleichzeitig durch mehrere Abtastteilchen abzutasten, so dass also mehrere innerhalb eines gemeinsamen Fangpotentials gefangene Abtastteilchen eingesetzt werden. Erfolgt eine Positionsdetektion über vom Abtastteilchen emittierte Fluoreszenzstrahlung, so könnten die Ab tastteilchen bei verschiedenen Wellenlängen emittieren, so dass hierdurch eine einfache Erfassung der individuellen Abtastteilchenpositionen möglich ist.
Zur Erfassung der Positionen des Abtastteilchens bzw. der Abtastteilchen im Abtastvolumen ist noch anzumerken, dass es für viele Anwendungen ausreichen wird, wenn die Positionen der Abtastteilchen nur summarisch erfasst werden, etwa derart, dass das Abtastergebnis Rückschlüsse darauf zulässt, mit welcher Wahrscheinlichkeit sich das Abtastteilchen in einem oder mehreren Teilvolumina des Abtastvolumens aufgehalten hat. Eine Verfolgung der Bewegung des Abtastteilchens innerhalb des Abtastvolumens ist dann nicht erforderlich und nach der Erfindung auch nicht zwingend vorgesehen. Für viele Fragestellungen wird es aber auch interessant sein, die Bewegung des Abtastteilchens in dem Abtastvolumen zu verfolgen und aufzulösen. Hierzu muss neben der Positionserfassung auch eine zeitliche Erfassung der Abtastteilchenpositionen erfolgen, die Teilchenbewegung also räumlich und zeitlich erfasst und aufgelöst werden, was im Rahmen der Erfindung liegt.
Im Folgenden werden Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung näher erläutert.
1 zeigt schematisch ein in einer optischen Pinzette gefangenes Teilchen, das als Abtastteilchen verwendet werden kann.
2 zeigt einen eine optische Pinzette umfassenden Aufbau, mit dem verschiedene Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens durchgeführt werden können.
3 zeigt ein beispielsweise mittels des Aufbaus der 2 erhaltenes Messergebnis für ein lichtoptisch in wässriger Lösung gefangenes Abtastteilchen.
4 zeigt ein beispielsweise mit dem Aufbau der 2 erhaltenes Messergebnis für ein mittels einer optischen Pinzette in einem Agargel gehaltenes Abtastteilchen.
Zur Erläuterung des Grundprinzips einer optischen Pinzette wird auf 1 verwiesen. Ein Lichtstrahl 2 hinreichend großer Intensität, beispielsweise ein Laserstrahl, wird durch eine Linse oder ein Objektiv 4 derart fokussiert, dass ein dreidimensionales Fangpotential oder Fangpotential 6 etwa in der Umgebung des geometrischen Fokus erzeugt wird. In 1 ist symbolhaft in gestrichelter Darstellung ein Potentialverlauf V_x in gestrichelter Darstellung eingezeichnet, der den Verlauf des Fangpotentials in x-Richtung am Ruhepunkt des Abtastteilchens symbolisiert. Auf den Verlauf des Fangpotentials kommt es für die Durchführung des Verfahrens in der Regel nicht an. Es kann sich um ein harmonisches oder anharmonisches Potential handeln. Häufig wird man zumindest näherungsweise von einem harmonischen Potentialverlauf ausgehen können.
Im Fangpotential 6 ist ein Abtastteilchen 8 gefangen, das aufgrund seiner dielektrischen Wechselwirkung mit dem Fangpotential langfristig eingefangen bleibt. Der Positionsbereich (die mikroskopische Position) des Fangpotentials 6 und damit des Abtastteilchens 8 wird durch die Position und Ausrichtung der Linse 4 relativ zur die Ausbreitung des Laserstrahls 2 charakterisierenden optischen Achse 10 definiert. Eine Verkippung des Laserstrahls 2 führt zu einer lateralen (seitlichen) Bewegung des Fangpotentials 6 und damit des Abtastteilchens 8, also zu einer Bewegung in x- oder/und y-Richtung. Eine Verschiebung der Linse 4 längs der optischen Achse 10 führt zu einer axialen Bewegung des Fangpotentials 6 und damit des Abtastteilchens 8 längs der optischen Achse.
Aufgrund thermischer sowie ggf. aufgrund anderer Fluktuationen bzw. Einflüsse führt das Abtastteilchen 8 im Fangpotential 6 submikroskopische Bewegungen durch, die von einer möglichen mikroskopischen Bewegung des Fangpotentials 6 etwa aufgrund entsprechender Verkippung des Laserstrahls 2 bzw. aufgrund einer Änderung der Linsenposition unabhängig sind. Das Abtastteilchen bewegt sich aufgrund der submikroskopischen Bewegungen innerhalb eines als Abtastvolumen bezeichenbaren (dreidimensionalen) Volumens, das durch das Fangpotential 6 sowie ggf. durch räumliche Randbedingungen (etwa Grenzflächen eines Objekts oder eines Objektträgers) definiert ist. Von derartigen Grenzflächen abgesehen, ist das Abtastvolumen nicht eindeutig begrenzt, jedenfalls in Bezug auf fluktuierende submikroskopische Bewegungen des Abtastteilchens, für die nur Aufenthaltswahrscheinlichkeiten für das Abtastteilchen angegeben werden können. Prinzipiell ist es möglich, dass eine starke Fluktuation zu einem Austreten des Abtastteilchens aus dem Fangpotential und damit aus dem Abtastvolumen und dementsprechend zu einem Verlust des Abtastteilchens führt. Es ist zweckmäßig, als Abtastvolumen beispielsweise ein Volumen anzusehen, in dem sich das Abtastteilchen mit einer vorgegebenen Wahrscheinlichkeit, beispielsweise 90%, aufhält.
In der Darstellung gemäß 2 ist die optische Pinzette gemäß 1 um weitere Komponenten ergänzt, um einen Aufbau zum Erfassen eines Objekts oder/und einer Objektumgebung oder/und eines Objektinnenraums bereitzustellen. Gemäß 2 wird der Lichtstrahl, insbesondere Laserstrahl 2, der hinreichend große Intensität aufweist, durch die Linse 4 in eine Probenkammer 12 fokussiert. Gemäß der Punktverschmierungsfunktion (point spread function) der Linse 4 erzeugt die fokussierte Lichtstrahlung in Verbindung mit den Eigenschaften des Abtastteilchens 8 das dreidimensionale Fangpotential für das Abtastteilchen 8. Vom Abtastteilchen 8 in Vorwärtsrichtung gestreutes Licht wird durch einen Kondensor 14 gesammelt und durch eine Umlenkeinheit 16, insbesondere einen Umlenkspiegel 16, auf einen ortsempfindlichen Detektor 18, beispielsweise eine Quadrantenfotodiode, projiziert, vorzugsweise fokussiert. Eine Lichtveränderungseinheit 20 hinter der Probenkammer 12 erlaubt in Ver bindung mit einer Lichtveränderungseinheit 22 vor der Probenkammer eine Anpassung der Lichteigenschaften an den verwendeten Detektor 18. Beispielsweise kann die Intensität oder/und die Polarisation des Lichts eingestellt werden. Als Lichtveränderungseinheiten können passive Komponenten, beispielsweise Graufilter, Linienfilter, Polarisatoren, polarisierende Strahlteiler oder Wollaston-Prismen oder/und aktive Komponenten, wie akustooptische oder elektrooptische Modulatoren und dergleichen, verwendet werden. Beim Ausführungsbeispiel der 2 ist die Lichtveränderungseinheit 22 sowie eine zusätzliche Lichtveränderungseinheit 24 im Detektionsstrahlengang von einem jeweiligen Wollaston-Prisma gebildet. Im Detektionsstrahlengang ist zusätzlich eine Tubuslinse 26 vorgesehen.
Eine mikroskopische Verschiebung des Abtastteilchens 8 innerhalb der Probenkammer erfolgt wahlweise durch eine Positionierung der Probenkammer oder/und eine Änderung des Einfallswinkels des Laserstrahls 2 in die Linse 4 oder/und durch eine Verschiebung der Linse 4 längs der optischen Achse 10. Dies ist in 2 jeweils durch gestrichelte Pfeile angedeutet, wobei jeweils die beeinflusste Positionskoordinate des Abtastteilchens (x, y und z) angegeben ist.
Submikroskopische Positionsänderungen des Abtastteilchens 8 infolge von etwa thermischen Fluktuationen werden mit Hilfe des Detektors 18 erfasst. Aus wiederholter Erfassung der momentanen Abtastteilchenposition über einen längeren, eine Korrelationszeit überschreitenden Zeitraum kann eine Ortsverteilung für das Abtastteilchen 8 in dem Fangpotential bestimmt werden. 3 zeigt eine näherungsweise ellipsoidale Oberfläche gleicher Aufenthaltswahrscheinlichkeit für ein lichtoptisch in wässriger Lösung gefangenes Teilchen. Die Aufenthaltswahrscheinlichkeit dafür, dass sich das Teilchen innerhalb des von der Oberfläche begrenzten Volumens aufhält, beträgt ca. 80%. Befindet sich das Abtastteilchen in einem Objekt oder in einer Objektumgebung und wird die Bewegung des Abtastteilchens dabei durch das Objekt eingeschränkt, so tastet das Abtastteilchen nur jene Bereiche ab, die ihm aus seiner Wechselwirkung mit dem Objekt überhaupt zugänglich sind. So kann das Teilchen trivialerweise keine Bereiche hinter für das Teilchen undurchdringliche Strukturen erreichen. Neben solchen mechanischen Wechselwirkungen können aber auch andere physikalische, ggf. elektrische, chemische oder auch biologische Wechselwirkungen zwischen dem Abtastteilchen und dem Objekt die Abtastbewegung des Abtastteilchens beschränken oder zumindest die Aufenthaltswahrscheinlichkeit des Abtastteilchens im ihm zugänglichen Volumen beeinflussen.
4 zeigt ein Beispiel für eine derartige Einschränkung der Abtastbewegung eines Abtastteilchens durch ein Objekt. Es sind Flächen gleicher Aufenthaltswahrscheinlichkeit für ein Abtastteilchen mit einem Durchmesser von 200 nm gezeigt, das optisch in einem Agargel gehalten wurde. Die Wahrscheinlichkeit dafür, dass sich das Zentrum des Abtastteilchens innerhalb des durch diese Fläche definierten Volumens aufhält, beträgt ca. 80%. Nicht abgetastete Bereiche entsprechen nicht wässrigen, also massiven Teilen des Objekts.
Die Abtastbewegung des Abtastteilchens kann zusätzlich auch auf andere Weise induziert werden. 2 zeigt in gestrichelten Linien einen Schallgeber 28, der mit einem Rauschgenerator 30 verbunden ist. Durch den Schallgeber 28 wird Schallenergie in die Probenkammer 12 gestrahlt, die zu einer submikroskopischen Abtastbewegung des Abtastteilchens 8 führt.
Eine andere Möglichkeit ist, über das Fangpotential submikroskopische Abtastbewegungen des Abtastteilchens zu induzieren. Hierzu könnte beispielsweise der Laserstrahl 2 moduliert werden. Soweit sich diese Modulation auf die Positionserfassung mittels des Detektors 18 auswirkt, kann der Einfluss der Änderungen des Fangpotentials etwa auf ein auf dem Detektor 18 abgebildetes Interferenzmuster im Zuge der Positionsauswertung herausgerechnet werden.
Möchte man lokale Änderungen eines Objekts beobachten, so wird man über einen längeren Zeitraum für eine gegebene mikroskopische Position des Fangpotentials wiederholt Abtastergebnisse aufnehmen, beispielsweise um eine Volumenänderung eines Objekts als Funktion der Zeit zu erfassen. Hierdurch lassen sich beispielsweise Änderungen biologischer Zellen beobachten.
Sehr häufig wird man aber auch daran interessiert sein, ein Objekt über mikroskopische Entfernungen zu erfassen. Dies kann mittels eines dem submikroskopischen Abtasten überlagerten Abtastens durch entsprechende Änderung des Positionsbereichs des Fangpotentials erfolgen. Bevorzugt erfolgt dieses mikroskopische Abtasten unter Berücksichtigung von vorhandener Information, insbesondere unter Berücksichtigung bisheriger Messergebnisse, um Bereiche zu bestimmen, die nachfolgend abzutasten sind. Die vorhandene Information wird also für die Festlegung des weiteren Abtastens rückgekoppelt.
Die Abtastergebnisse hängen wesentlich davon ab, wie lange abgetastet wurde. Wird der Aufenthaltsort des Abtastteilchens mit einer Abtastrate erfasst, deren Inverse länger oder wenigstens genauso lang wie eine die submikroskopische Bewegung des Partikels charakterisierende Autokorrelationszeit ist, so bestimmt das Diffusionsverhalten des Partikels die Interpretation der Abtastergebnisse. Wird hingegen der Aufenthaltsort des Abtastteilchens mit einer Abtastrate erfasst, deren Inverse kürzer als die kürzeste Autokorrelationszeit in Bezug auf die submikroskopische Bewegung des Abtastteilchens ist, so können Aussagen über die Geschwindigkeit des Abtastteilchens und über die Geschwindigkeit beeinflussende Bedingungen gemacht werden. Man kann hierüber Informationen über die lokale Viskosität in einem viskosen Medium erhalten.
Die Größe der Korrelationszeit hängt vom die submikroskopische Bewegung des Partikels induzierenden submikroskopischen Prozess, der Art des Fangpotentials und der Art der Wechselwirkung des Abtastzeichens mit seiner Umgebung ab. Im Falle einer auf thermischen Fluktuationen beruhenden submikroskopischen Teilchenbewegung des in einem harmonischen Fangpotential gefangenen sphärischen Abtastteilchens mit einem Radius ρ, das sich in einem Medium mit der Viskosität η bewegt, beträgt die Korrelationszeit τ τ = γκ = 6πη·ρκ ,wobei κ die Federkonstante des Potentials und γ der Dämpfungsfaktor auf die Teilchenbewegung aufgrund der Stoke'schen Reibung im viskosen Medium ist (vgl. Pralle et al: ”Local viscosity probed by photonic force microscopy”).
Das erfindungsgemäße Verfahren kann beispielsweise auf Grundlage des in 2 gezeigten Aufbaus hervorragend dafür verwendet werden, Oberflächen eines Objektes abzutasten. Nach einer weiteren bevorzugten Anwendung werden Hohlräume eines Objekts, also Bereiche, in denen sich ein Umgebungsmedium (beispielsweise wässrige Lösung oder Luft) und damit auch das Abtastteilchen frei bewegen können, erfasst. Ferner ist es möglich, ein speziell funktionalisiertes Abtastteilchen zu verwenden, das beispielsweise bestimmte Eigenschaften im Hinblick auf eine Wechselwirkung mit dem Objekt, beispielsweise mit Objekthohlräume begrenzenden Oberflächen, aufweist. Hierdurch können Informationen erhalten werden, die über die durch ein einfaches Abtasten im herkömmlichen Sinne erzielbare Informationen weit hinausgehen.
Man kann erfindungsgemäß auch Oberflächen abtasten, ähnlich wie es bei der Tunnel- und Kraftmikroskopie bekannt ist. im Gegensatz hierzu können aber auch Proben untersucht werden, die – wie in der Lichtmikroskopie üblich – zwischen Gläsern montiert sind, da das Abtastteilchen auf nicht-mechanischem Wege durch das Fangpotential gehalten ist. Es ist damit auch möglich, Objekte von innen zu untersuchen, ohne diese zu zerstören.
Die Erfindung wurde anhand von Ausführungsbeispielen beschrieben, die keinesfalls als beschränkend anzusehen sind. In Bezug auf das Funktionsprinzip einer optischen Pinzette und auf die Möglichkeiten zur submikroskopischen Positionserfassung des Abtastteilchens kann ergänzend auf die oben angegebenen Schriften und Aufsätze verwiesen werden.

Claims

Verfahren zum Erfassen eines Objekts, bei dem ein in einem Fangpotential gefangenes Abtastteilchen (8) das Objekt abtastet, wobei in einer ersten Positionsbestimmungsstufe, die einer ersten, mikroskopischen Größenskala zugeordnet ist, das Fangpotential (V) in einem in Bezug auf das Objekt oder einen Bezugspunkt definierten Positionsbereich bereitgestellt wird, und wobei in einer zweiten Positionsbestimmungsstufe, die einer zweiten, gegenüber der ersten Positionsbestimmungsstufe kleineren, submikroskopischen Größenskala zugeordnet ist, auf wenigstens einem submikroskopischen Prozess beruhende Positionsfluktuationen des Abtastteilchens (8) für ein Abtasten des Objekts derart genutzt werden, dass das in dem Fangpotential (V) gefangene Abtastteilchen (8) innerhalb eines dem Positionsbereich zugeordneten Abtastvolumens, beruhend auf dem submikroskopischen Prozess, eine im Wesentlichen ungebundene dreidimensionale Abtastbewegung unter Einfluss des Fangpotentials (V) durchführt und derart das Abtastvolumen und damit das Objekt abtastet, wobei eine Mehrzahl von in Folge des Abtastens eingenommenen Positionen des Abtastteilchens (8) innerhalb des Abtastvolumens erfasst wird, und wobei dem der zweiten Größenskala zugeordneten, submikroskopischen Abtasten des Abtastteilchens (8) innerhalb des Abtastvolumens ein übergeordnetes, der ersten Größenskala zugeordnetes, mikroskopisches Abtasten durch Änderung des Positionsbereichs des Fangpotentials (V) überlagert wird, indem eine Änderung des Positionsbereichs des Fangpotentials (V) relativ zum Objekt durch absolute Änderung des Positionsbereichs des Fangpotentials (V) oder/und durch absolute Änderung der Position des Objekts herbeigeführt wird, um einen über die Ausdehnung des Fangpotentials (V) und damit über das Abtastvolumen in einem gegebenen Positionsbereich der ersten Positionierungsstufe hinausgehenden Bereich abzutasten.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet dass die Genauigkeit, mit der der jeweilige Positionsbereich der ersten Positionsbestimmungsstufe bestimmbar ist und die Genauigkeit, mit der sich die Position des Abtastteilchens (8) im Abtastvolumen in der zweiten Positionsbestimmungsstufe bestimmen lässt, in der gleichen Größenordnung liegen, und wobei für verschiedene mikroskopische Positionsbereiche der ersten Positionsbestimmungsstufe auf Grundlage der Abtastbewegung des Abtastteilchens (8) im jeweiligen Abtastvolumen gewonnene submikroskopische Abtastergebnisse zu einem Gesamtabtastergebnis zusammengesetzt werden.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Änderung des Positionsbereichs des Fangpotentials (V) relativ zum Objekt eine laterale mikroskopische Bewegung des Fangpotentials (V) und damit des Abtastteilchens (8) relativ zum Objekt umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Fangpotential (V) in einem mikroskopischen Prozeß im Positionsbereich bereitgestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Fangpotential (V) auf optischem Wege im Positionsbereich bereitgestellt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Bewegung des Abtastteilchens (8) über einen eine Autokorrelationszeit übersteigenden Erfassungszeitraum erfasst wird, um durch statistische Auswertung einer Mehrzahl von zu verschiedenen Zeitpunkten erfassten Positionen des Abtastteilchens (8), die unkorreliert oder quasi-unkorreliert sind, Information über das Objekt oder/und die Objektumgebung oder/und den Objektinnenraum zu erhalten.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Bewegung des Abtastteilchens (8) über ein einer Autokorrelationszeit entsprechendes oder gegenüber der Autokorrelationszeit kürzeres Erfassungszeitintervall erfasst wird, um Information über lokale Eigenschaften des Objekts oder/und der Objektumgebung oder/und des Objektinnenraums oder/und über ein Diffusionsverhalten des Abtastteilchens (8) zu erhalten.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Abtasten des Abtastvolumens durch das Abtastteilchen (8) auf thermisch induzierten Positionsänderungen des Abtasteilchens (8) beruht oder thermisch induzierte Positionsänderungen des Abtastteilchens (8) hierzu zumindest beitragen.
Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass eine Temperatur eingestellt wird, um das thermisch induzierte Abtasten des Abtastteilchens (8) im Abtastvolumen zu beeinflussen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Abtasten des Abtastvolumens durch das Abtastteilchen (8) auf elektromagnetisch induzierten Positionsänderungen des Abtastteilchens (8) beruht oder elektromagnetisch induzierte Positionsänderungen des Abtastteilchens (8) hierzu zumindest beitragen.
Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass Positionsänderungen des Abtastteilchens (8) dadurch induziert werden, dass ein mit dem Abtastteilchen (8) wechselwirkendes äußeres elektromagnetisches Feld geändert wird
Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, dass das äußere elektromagnetische Feld ein das Fangpotential (V) zumindest miterzeugendes Feld (2) ist, wobei das Fangpotential (V) ein effektives Potential ist, das eine Wechselwirkung des Abtastteilchens (8) mit dem äußeren elektromagnetischen Feld auf einer der ersten Positionsbestimmungsstufe zugeordneten Zeitskala beschreibt, die die Positionsänderungen des Abtastteilchens (8) induzierenden Änderungen des äußeren elektromagnetischen Feldes nicht auflöst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Abtasten des Abtastvolumens durch das Abtastteilchen (8) auf mechanisch induzierten, vorzugsweise akustisch induzierten Positionsänderungen des Abtastteilchens (8) beruht oder mechanisch induzierte Positionsänderungen des Abtastteilchens (8) hierzu zumindest beitragen.
Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass zum Induzieren der Positionsänderungen auf einen das Objekt tragenden Objektträger oder/und eine das Objekt enthaltende Probenkammer mechanisch, insbesondere akustisch, eingewirkt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass zur Erfassung der Position des Abtastteilchens (8) innerhalb des Abtastvolumens von dem Abtastteilchen (8) ausgehende oder/und durch das Abtastteilchen (8) hindurchgehende elektromagnetische Strahlung erfasst wird.
Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die vom Abtastteilchen (8) ausgehende elektromagnetische Strahlung am Abtastteilchen (8) gestreute oder reflektierte Strahlung umfasst.
Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, dass die vom Abtastteilchen (8) ausgehende elektromagnetische Strahlung atomaren oder/und molekularen Übergängen des Abtastteilchens (8) zugeordnete Rekombinationsstrahlung umfasst.
Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die vom Abtastteilchen (8) ausgehende elektromagnetische Strahlung durch einen Mehrphotonenprozess induziert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass zur Erfassung der Position des Abtastteilchens (8) innerhalb des Abtastvolumens ein von dieser Position abhängiges Interferenzmuster aus elektromagnetischer Strahlung analysiert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass das Fangpotential (V) unter Einsatz von mit dem Abtastteilchen (8) wechselwirkender optischer Strahlung erzeugt wird.
Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass das Fangpotential (V) unter Einsatz von Laserstrahlung (2) erzeugt wird.
Verfahren nach Anspruch 20 oder 21, dadurch gekennzeichnet, dass die zur Erzeugung des Fangpotentials (V) eingesetzte optische Strahlung eine Wellenlänge aufweist, für die das untersuchte Objekt transparent ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 20 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass zur Erfassung der Position des Abtastteilchens (8) innerhalb des Abtastvolumens optische Strahlung erfasst wird, die aus der Wechselwirkung der optischen Strahlung mit dem Abtastteilchen (8) resultiert.
Verfahren nach Anspruch 2, insbesondere in Kombination mit einem der Ansprüche 3 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass das übergeordnete Abtasten nach einer Abtaststrategie erfolgt, bei der der Positionsbereich des Fangpotentials (V) unter Berücksichtigung eines der zweiten Größenskala zugeordneten Abtastergebnisses geändert wird.
Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass der Positionsbereich des Fangpotentials (V) unter Einbeziehung von vorab bekannter Information über das Objekt geändert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass eine Änderung des Objekts oder/und der Objektumgebung oder/und des Objektinnenraums über einen Änderungszeitraum erfasst wird, indem der Positionsbereich des Fangpotentials (V) über den Änderungszeitraum aufrechterhalten wird und über den Änderungszeitraum mehrfach die Mehrzahl von eingenommenen Positionen des Abtastteilchens (8) innerhalb des Abtastvolumens erfasst wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass zur Änderung des einem gegebenen Positionsbereich zugeordneten Abtastvolumens eine Potentialfeldstärke oder/und ein Potentialverlauf des Fangpotentials (V) geändert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass als Abtastteilchen (8) ein sphärisches oder/und fluoreszierendes Teilchen verwendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 28, dadurch gekennzeichnet, dass als Abtastteilchen (8) ein Metallteilchen oder ein Latexteilchen oder ein Glasteilchen oder ein Nanopartikel verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass als Abtastteilchen (8) ein Edelmetallteilchen verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass als Abtastteilchen (8) ein Quantenpunkt (Quantendot) verwendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 31, dadurch gekennzeichnet, dass ein in Bezug auf die jeweils interessierende Fragestellung entsprechend funktionalisiertes Abtastteilchen (8) verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, dass ein spezielle Wechselwirkungseigenschaften in Bezug auf das Objekt aufweisendes Abtastteilchen (8) verwendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 33, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere innerhalb eines gemeinsamen Fangpotentials (V) gefangene Abtastteilchen (8) eingesetzt werden.