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Die
Erfindung betrifft ein Verfahren, das es gestattet festzustellen,
ob Mikroorganismen eine biologische Aktivität behalten haben oder nicht.
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Die
Stärke
des Verluststroms, der durch das an eine Mikroorganismensuspension
in einem dielektrischen Öl
angelegte elektrische Feld erzeugt wird, gestattet es, auf die Anwesenheit
oder die Abwesenheit biologischer Aktivität zurückzuschließen. Das Verfahren kann zur
Bestimmung der Lebensfähigkeit von
Mikroorganismen nach Anlegen eines elektrischen Feldes verwendet
werden, wenn die Mikroorganismen in einer nachfolgenden Stufe abgetrennt und
gezählt
werden.
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Die
einfache und schnelle Bestimmung der biologischen Aktivität von Mikroorganismen
ist in vielen Fällen
wichtig, beispielsweise bei Schadstoffausstoßkontrollen, bei der Qualitätssicherung
und bei klinischen Analysen. In den Bereichen der Forschung und
der Nahrungsmittelindustrie werden immer mehr Mikroorganismen wie
zum Beispiel Bakterien und Hefen als Produktionsmittel eingesetzt.
Die Verwendung und die Wirksamkeit der eingesetzten verschiedenen
biochemischen Prozesse hängen
von der Lebensfähigkeit
dieser Mikroorganismen ab.
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In
diesem Zusammenhang besteht die Standardmethode darin, eine Probe
unter besonderen Bedingungen und in einem geeigneten Agar-Kulturmedium
zu kultivieren. Die wirksame Reproduktion der abgenommenen Elemente,
die mit bloßem
Auge oder unter dem Mikroskop besichtigt und gezählt werden, erlaubt einen Rückschluß auf das
Vorhandensein einer biologischen Aktivität. In diesem Falle wird der
Ursprungsstamm als lebend bezeichnet. Im gegenteiligen Falle wird
auf seine biologische Inaktivität
geschlossen.
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Dieses
Verfahren weist zahlreiche Nachteile auf, insbesondere die notwendige
Zeit, bis man ein Resultat erhält.
In den meisten Fällen
sind zur Bildung sichtbarer Kolonien 18 Stunden erforderlich.
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Im
US-Patent 4 321 322 wird ein Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins
der biologischen Aktivität
von Mikroorganismen durch Anlegen eines elektrischen Feldes an in
wäßriger Suspension vorliegenden
Mikroorganismen beschrieben.
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Aus
dem US-Patent 5 824 494 ist insbesondere eine Vorrichtung zur Bestimmung
der Zahl der in einer flüssigen
Probe vorhandenen Mikroorganismen bekannt.
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Das
europäische
Patent 0 543 090 schlägt überdies
ein analytisches Verfahren vor, das auf der direkten Messung der
metabolischen Aktivität
von Bakterien unter Verwendung einer bioelektrochemischen Zelle
basiert. Mehrere Aspekte des Systems der bioelektrochemischen Bestimmung
sind im europäischen
Patent 0 221 663 beschrieben, das ein Verfahren und ein Instrument
zur Messung der mikrobiellen Aktivität in einer bioelektrochemischen
Zelle betrifft, in
EP 0 219 247 ,
das die bioelektrochemische Zelle und deren Elektroden betrifft,
in
EP 0 238 322 , das
die bioelektrochemischen Mediatoren betrifft, und in
EP 0 352 138 , das die in den bioelektrochemischen
Zellen verwendeten, verbesserten Elektroden betrifft. Einige dieser
Verfahren umfassen eine der Analyse vorausgehende Stufe, in der
die Bakterien durch ein Filter konzentriert werden, das ein wichtiges
Element der Vorrichtung ist. Andere verwenden eine Elektrode mit
bestimmter Konfiguration und spezieller Zusammensetzung aus porösem Kohlenstoff oder
teuren Edelmetallen.
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Welche
Systeme auch immer in diesen Patenten beschrieben sind, die Verwendung
eines chemischen Beschleunigers ist unabdingbar. Dieser Beschleuniger
ist eine organische Verbindung wie zum Beispiel 1,4-Benzochinon,
die im Medium gelöst
ist und dem Elektronentransport zwischen den Elektroden und den
Mikroorganismen dient. Er erzeugt beim Kontakt mit den Bakterien
eine Antwort, die durch Meßelektroden
detektiert und gemessen wird. In Abhängigkeit des Beschleunigers,
seiner Konzentration und seines Oxidationsgrades verändern sich
die gemessenen Antworten deutlich, was die Interpretation und den
Vergleich der Ergebnisse schwierig macht. Außerdem sind gegebenenfalls
vorhandene Verunreinigungen in Form von Stoffen oder Elementen,
die zum Elektronenaustausch mit dem Beschleuniger in der Lage sind,
die Ursache für
zahlreiche Fehler. Schließlich
macht es die Anwesenheit des Beschleunigers und eines Filters schwierig,
die untersuchten Mikroorganismen später wiederzuverwenden.
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Bei
der Verwendung einer bioelektrochemischen Zelle werden die Mikroorganismen
elektrischen Feldern in wäßrigem Milieu
ausgesetzt, insbesondere in einem gepufferten Milieu mit genau definierten
Innenkonzentrationen. Hochfrequente elektrische Wechselströme erzeugen
elektrische Wechselfelder. Solche Bedingungen erlauben es nicht,
Spannungen von mehr als einigen Volt während mehr als einigen Sekunden
anzulegen. Bei Verwendung von Gleichstrom besitzt die durch Kondensatorentladungen
erhaltene elektrische Spannung immer einen Übergangs- oder impulsartigen
Charakter. Man kann sie auf einem höheren Wert von einigen Kilovolt
nur während
relativ kurzer Zeiten von weniger als einer Sekunde aufrechterhalten;
dies gestattet folglich nur diskontinuierliche bzw. stufenförmige Messungen.
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Der
Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die oben beschriebenen Nachteile
zu vermeiden und ein schnelles Verfahren zur Bestimmung des Zustandes
einer Mikroorganismenkultur vorzuschlagen, das an verschiedene Arten
von Mikroorganismen anpaßbar
ist.
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Der
Erfindung liegt ferner die Aufgabe zugrunde, eine Vorrichtung zu
schaffen, mit der sich das vorgenannte Verfahren auf einfache und
kostengünstige
Weise ausführen
läßt. Ein
weiteres Ziel besteht darin, die Wiederverwendung der untersuchten Mikroorganismen
nach dem Anlegen eines elektrischen Feldes gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren
zu ermöglichen.
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Gegenstand
der Erfindung ist deshalb ein Verfahren zur Feststellung des Vorhandenseins
einer biologischen Aktivität
von Mikroorganismen durch Anlegen eines elektrischen Feldes, welches
dadurch gekennzeichnet ist, daß es
das Anlegen eines elektrischen Feldes an ein dielektrisches Medium,
das durch in einem dielektrischen Öl suspendierte Mikroorganismen
gebildet wird, und die Messung eines für lebende Mikroorganismen charakteristischen
Verluststroms umfaßt.
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Zur
Herstellung der Zellsuspension werden die Mikroorganismen zunächst von
der Oberfläche eines
Agar-Kulturmediums abgenommen und dann in ein dielektrisches Öl verbracht.
Das dielektrische Öl
kann ein Ölgemisch
oder ein Mineralöl
oder ein organisches Öl
sein und ist vorzugsweise ein Silikonöl. Das Gemisch aus Mikroorganismen
und dielektrischem Öl
kann mittels einer Ultraschallsonde homogenisiert werden.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
besteht darin, daß man
an die dielektrische Suspension fortschreitend ein elektrisches
Feld, ausgehend vom Wert 0 bis zum gewählten Maximalwert, anlegt.
Das Anlegen des elektrischen Feldes erzeugt im Inneren des Mediums,
das die Mikroorganismen und das dielektrische Öl enthält, einen Verluststrom. Wenn
die Mikroorganismen leben, sind die Änderungen der Stärke des
Verluststroms in Abhängigkeit
vom angelegten elektrischen Feld charakteristisch und gestatten
den Rückschluß auf das
Vorhandensein einer biologischen Aktivität. Wie auch immer der durch
Anlegen des elektrischen Feldes erzeugte Streß geartet sein mag, es erscheint
ein charakteristischer Peak, der die Lebensfähigkeit der untersuchten Mikroorganismen
wiedergibt. Wenn die Mikroorganismen tot sind, beobachtet man dagegen
eine konstante Änderung
der Stärke
in Abhängigkeit
des angelegten elektrischen Feldes.
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Die
Erfindung betrifft außerdem
eine Vorrichtung zur Bestimmung des Vorhandenseins einer biologischen
Aktivität
von Mikroorganismen, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie einen
mit Elektroden ausgerüsteten
Behälter
umfaßt,
in den die Suspension von Mikroorganismen in einem dielektrischen Öl gebracht
wird, Mittel zur Erzeugung eines elektrischen Feldes zwischen zwei
oder mehreren Elektroden, Mittel zur Messung und Mittel zur Aufzeichnung
des induzierten Verluststroms. Der Behälter, in den die Mikroorganismensuspension
verbracht wird, ist mit metallischen Elektroden ausgerüstet.
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Bei
einer anderen Ausführungsform
der Erfindung besteht der Behälter,
in den die Suspension verbracht wird, aus einer isolierenden Platte,
die mit einem Zwischenraum zwischen den Elektroden versehen ist.
Vorzugsweise beträgt
die Spannung des elektrischen Stroms zwischen den Elektroden zwischen
0 und 250 V/mm.
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Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren kann
an das Anlegen des elektrischen Feldes eine Stufe des Überführens in
ein wäßriges Milieu
und danach eine Stufe der Zählung
folgen. Diese Anwendung des Verfahrens bildet ein einfaches und
wirksames Mittel der Selektion von Mikroorganismen, die das elektrische
Feld überlebt
haben.
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Die
Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden
genaueren, aber nicht als beschränkend
aufzufassenden Beschreibung der Beispiele.
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1 zeigt den Behälter 1 mit
einem Mantel 4, der die Elektroden 2 hält, zwischen
die die Mikroorganismensuspension 3 gebracht wird.
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2 zeigt eine Variante des
Behälters,
bestehend aus einer Petri-Schale 5 mit Elektroden 2, zwischen
denen sich die Mikroorganismensuspension 3 auf einer Lamelle 6 im
Zwischenelektrodenraum 7 befindet.
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3 zeigt eine Kurve der Änderungen
des Verluststroms in Abhängigkeit
des angelegten elektrischen Feldes, wenn die Mikroorganismen tot
sind.
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4 zeigt eine Kurve der Änderungen
der Verluststromstärke
in Abhängigkeit
des angelegten elektrischen Feldes von 0 bis 250 V/mm, wenn die Mikroorganismen
leben.
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5 zeigt eine Kurve der Änderungen
der Verluststromstärke
in Abhängigkeit
der Zeit, wenn die Spannung stufenweise alle 15 Sekunden um 2,5 V/mm
bis zu einer Endspannung von 25 V/mm (symbolisiert durch den Pfeil)
erhöht
wird und dann auf diesem Wert gehalten wird.
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6 zeigt eine Kurve der Änderungen
der Verluststromstärke
in Abhängigkeit
von der Zeit, wenn die Spannung alle 15 Sekunden stufenweise um
5 V/mm bis zu einer Endspannung von 50 V/mm (symbolisiert durch
den Pfeil) erhöht
und dann auf diesem Wert gehalten wird.
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7 zeigt eine Kurve der Änderungen
der Verluststromstärke
in Abhängigkeit
von der Zeit, wenn die Spannung alle 15 Sekunden stufenweise um
10 V/mm bis zu einer Endspannung von 250 V/mm (symbolisiert durch
den Pfeil) erhöht
und dann auf diesem Wert gehalten wird.
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Beispiel 1
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Wenn
die untersuchten Mikroorganismen von einem Agar-Kulturmedium stammen,
werden sie von der Oberfläche
mit Hilfe eines Spatels abgenommen und in ein Eppendorf-Röhrchen gegeben,
das 1 ml dielektrisches Silikonöl
enthält.
Man führt
eine Ultraschallsonde in das Mikroröhrchen ein. Um eine homogene
Suspension zu erhalten, läßt man Ultraschallwellen
mit 25 W und einer Frequenz von 20 kHz 30 Sekunden lang, alternierend
mit zwei bis drei Ruhephasen von jeweils 5 Sekunden, auf das Gemisch einwirken;
die Zellhaufen und der gegebenenfalls anwesende Agar werden durch
Zentrifugieren bei 4000 Umdrehungen/min während 30 Sekunden bei 4°C abgetrennt.
Die homogene Suspension wird anschließend in einen der in den 1 und 2 dargestellten Behälter gegeben. Der Abstand zwischen den
Elektroden 2 beträgt
1,8 mm bei der Anordnung gemäß 1 und 3 mm bei der Anordnung
gemäß 2. Eine ununterbrochene
Spannung, die sich fortschreitend von 0 bis 250 V/mm ändert, wird
von einem Generator geliefert und fortschreitend an die Suspension
angelegt. Gleichzeitig zeichnet ein Amperemeter den induzierten
Verluststrom auf.
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Entsprechend
dem Verlauf der Kurve, die die Veränderung der Verluststromstärke i in
Mikroampère
in Abhängigkeit
von dem angelegten elektrischen Feld V in Volt zwischen den Elektroden 2 wiedergibt,
kann man sofort und einfach bestimmen, ob die Mikroorganismen leben
oder tot sind.
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Wenn
die Mikroorganismen tot sind, verläuft die in 3 dargestellte Kurve, die mit der Vorrichtung
gemäß 1 erhalten wurde, linear.
Wenn sie dagegen leben, verläuft
die in 4 wiedergegebene
Kurve, die mit der Vorrichtung gemäß 1 erhalten wurde, ganz anders. Der Verluststrom
steigt bei schwachen Spannungen drastisch an, durchläuft ein Maximum
bei einer Spannung von ungefähr
220 V und nimmt anschließend
wieder stark ab, um sich ab einem Wert von ungefähr 300 V zu stabilisieren.
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Beispiel 2
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Die
von einem Agar-Kulturmedium stammenden untersuchten Mikroorganismen
werden von der Oberfläche
mit Hilfe eines Spatels abgenommen und in zwei Eppendorf-Röhrchen eingeführt, die
jeweils 1 ml dielektrisches Silikonöl enthalten. Man führt eine
Ultraschallsonde in die Mikroröhrchen
ein, die Versuchsröhrchen
und Vergleichsröhrchen
genannt werden. Der Ultraschall mit 25 W und einer Frequenz von
20 kHz wird 30 Sekunden lang, alternierend mit 2 bis 3 Ruhephasen
von jeweils 5 Sekunden, auf das Gemisch angewandt, um eine homogene
Suspension zu erhalten; die Zellhaufen und der gegebenenfalls vorhandene
Agar wird durch 30 sec Zentrifugieren bei 4000 Umdrehungen/min bei
4°C entfernt.
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Nach
der Einführung
der in dem Versuchsröhrchen
enthaltenen homogenen Suspension in einen der in den 1 und 2 dargestellten Behälter wird das elektrische Feld
angelegt. Auf diese Weise wird ein elektrisches Feld mit zuvor je
nach An der durchgeführten
Untersuchungen und je nach den untersuchten Mikroorganismen bestimmten
qualitativen und quantitativen Eigenschaften an eine der Suspensionen 3 während einer
vorbestimmten Dauer angelegt. Das Medium wird in ein Eppendorf-Versuchsröhrchen 2 verbracht.
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Die
beiden Mikroröhrchen
werden anschließend
bei 10000 Umdrehungen/min 30 Sekunden lang bei 4°C zentrifugiert,
um die Rückstände wiederzugewinnen.
Man zieht das Silikonöl
ab, indem man die Eppendorf-Röhrchen
umdreht. Man fügt
1 ml 0,05 M-Phosphatpufferlösung
von pH 7 sowohl den Vergleichs- als auch den Versuchsröhrchen 2 zu
und homogenisiert jedes der Gemische durch Ultraschallbehandlung
bei 25 W und einer Frequenz von 20 kHz während 5 Sekunden. Jede Suspension
wird in ein cottonisiertes Röhrchen
gegossen, das 9 ml eines für die
untersuchten Mikroorganismen geeigneten Kulturmediums enthält.
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Die
Bakterienzellen werden anschließend
an das Schütteln
der cottonisierten Vergleichs- und Versuchsröhrchen während 3 Stunden bei 150 Umdrehungen/min
wiederbelebt. 1 ml dieser ersten Verdünnung wird von jedem Röhrchen abgenommen
und in ein Hämolyseröhrchen verbracht,
um die optische Dichte jeder Zellsuspension zu messen. Man gibt
den beiden abgenommenen Proben jeweils wieder eine ausreichende
Menge 0,05 M-Phosphatpuffer von pH 7 zu, um eine endgültige optische
Dichte von zwischen 0 und 0,4 zu erhalten. In Kenntnis der optischen
Dichte des Vergleichs und des Versuchs, bestimmt man durch Vergleich
mit einer Eichkurve, die durch Auszählen einer Thoma-Zelle erhalten
wurde, die in jedem Röhrchen
vorhandene Zahl von Zellen.
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Man
bereitet eine Verdünnungsreihe
von 10 zu 10 für
jedes Röhrchen.
Für jede
Verdünnung
impft man drei Petrischalen, die Agar-Kulturmedium enthalten, mit
0,1 ml Zellsuspension. Nach einer Inkubationszeit von 72 Stunden
bei 30°C,
zählt man
die auf jeder Schale gebildeten Kolonien aus. Man bestimmt dann
den Prozentsatz an lebenden Zellen im Anschluß an das Anlegen eines elektrischen
Feldes, indem man das Verhältnis
der Zahl der im Versuchsröhrchen
vorhandenen Zellen zur Zahl der im Vergleichsröhrchen vorhandenen Zellen bestimmt.
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Beispiel 3
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Man
arbeitet, wie in Beispiel 1 beschrieben.
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Die
Stärke
des an die Suspension 3 angelegten elektrischen Feldes
wird stufenweise um 2,5 V/mm alle 15 Sekunden erhöht, bis
man eine Spannung von 25 V/mm erhält. Das Ende des Spannungsanstiegs
wird in 5 durch den
Pfeil symbolisiert. Die für
diesen Spannungsanstieg benötigte
Zeit beträgt
1 Minute und 15 Sekunden. Anschließend wird die Spannung auf
diesem Wert 13 Minuten und 45 Sekunden lang gehalten, was zu einer
Gesamtdauer des Versuchs von 15 Minuten führt. Gleichzeitig zeichnet
ein Amperemeter den induzierten Verluststrom auf.
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Sobald
die Stärke
des elektrischen Feldes nicht mehr wächst, nimmt die Stärke des
Verluststroms zu, und zwar zunächst
linear während
100 Sekunden, dann tritt ein Bruch auf und die Verluststromstärke steigt
stark an, um einen Maximalwert von mehr als 70 μA nach 330 Sekunden zu erreichen. Während des
Restes der Zeit, während
der das elektrische Feld an die Zellsuspension 3 angelegt
wird, nimmt die Verluststromstärke
ab bis auf einen endgültigen
Wert in der Nähe
von 20 μA.
Die Stetigkeit dieser Abnahme wird durch Sekundärpeaks schwacher Intensität unterbrochen.
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Beispiel 4
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Man
arbeitet wie in Beispiel 1.
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Die
Stärke
des an die Suspension 3 angelegten elektrischen Feldes
wird stufenweise um 5 V/mm alle 15 Sekunden erhöht, bis eine Spannung von 50 V/mm
erreicht ist. Das Ende des Spannungsanstiegs wird in 6 durch den Pfeil symbolisiert.
Die für
diesen Spannungsanstieg notwendige Zeit beträgt 2 Minuten und 30 Sekunden.
Anschließend
wird die Spannung auf diesem Wert während 12 Minuten und 30 Sekunden
gehalten, was zu einer Gesamtdauer des Versuchs von 15 Minuten führt. Gleichzeitig zeichnet
ein Amperemeter den induzierten Verluststrom auf.
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Nach
einer Phase geringen Anstiegs während
der ersten Minute beginnt die Verluststromstärke schnell anzusteigen. Es
handelt sich um den Ausgangspunkt des nach dem Ende des Spannungsanstiegs
unvermutet auftretenden Peaks der Verluststromstärke. Der nach 4 Minuten und
30 Sekunden aufgezeichnete Maximalwert der Verluststromstärke beträgt 306 μA. Während des
Restes der Zeit, während
der das elektrische Feld an die Zellsuspension 3 angelegt
wird, sinkt die Verluststromstärke
auf einen Endwert in der Nähe
von 47 μA.
Die Stetigkeit dieses Absinkens wird durch die Anwesenheit von Sekundärpeaks schwacher
Intensität
unterbrochen.
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Beispiel 5
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Man
arbeitet wie in Beispiel 1.
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Die
Stärke
des an die Suspension 3 angelegten elektrischen Feldes
wird stufenweise alle 15 Sekunden von 10 V/mm erhöht, bis
eine Spannung von 250 V/mm erreicht ist. Das Ende des Spannungsanstiegs
wird in 7 durch den
Pfeil symbolisiert. Die für
diesen Spannungsanstieg erforderliche Zeit beträgt 6 Minuten und 15 Sekunden.
Anschließend
wird die Spannung auf diesem Wert während 8 Minuten und 45 Sekunden
gehalten, was zu einer Gesamtdauer des Versuchs von 15 Minuten führt. Gleichzeitig
zeichnet ein Amperemeter den induzierten Verluststrom auf.
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Die
Verluststromstärke
wächst
geringfügig während der
beiden ersten Minuten des Spannungsanstiegs an, bis die Stärke des
elektrischen Feldes 80 V/mm erreicht. In der folgenden Minute, das
heißt zwischen
90 und 130 V/nun, wird ein sehr starker Anstieg der Verluststromstärke verzeichnet.
Am Ende dieses Anstieges beträgt
der Wert der Verluststromstärke
97,6 V/mm. Anschließend
sinkt die Verluststromstärke
quasi exponentiell bis zum Ende des Anlegens der Spannung und erreicht
einen Endwert von 15 μA.
Die Stetigkeit dieser Abnahme wird durch die Anwesenheit von Sekundärpeaks schwacher
Intensität
unterbrochen.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
gestattet die Bestimmung des Zustands der Bakterienkultur innerhalb
einer Zeit von weniger als einer Stunde. Dadurch werden kostspielige
Maßnahmen
vermieden, aber auch der Einsatz ausgebildeten Personals für die visuelle
Beobachtung und das Zählen
der in ein Nährmedium umgesetzten
Elemente. Wegen der geringen Dauer der Kontrolle ist außerdem die
Entwicklung von Verunreinigungen vernachlässigbar. Es ist daher nicht
nötig,
in steriler Atmosphäre
oder unter streng aseptischen Bedingungen zu arbeiten.
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Weitere
Vorteile wie zum Beispiel die Abwesenheit eines speziellen Beschleunigers
und die Verwendung klassischer Elektroden erlauben die Gewinnung
genauer Ergebnisse zu niedrigen Kosten.
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Das
Verfahren besitzt außerdem
den Vorteil der Anlage wachsender elektrischer Felder starker Intensität über lange
Zeiträume.
Die so durchgeführten
kontinuierlichen Messungen führen
folglich zu widerspruchsfreieren Ergebnissen, deren Interpretation zuverlässiger ist.
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Die
Erfindung besitzt ferner den Vorteil, daß sie eine Wiederaufarbeitung
für eine
eventuelle spätere
Verwendung der Mikroorganismen gestattet, die das Anlegen des elektrischen
Feldes überlebt
haben.