DE10343442A1

DE10343442A1 - Verfahren zum quantitativen Nachweis von Kontaminanten in komplexen Zellgemischen

Info

Publication number: DE10343442A1
Application number: DE2003143442
Authority: DE
Inventors: Helmut Prof. Dr. Erdmann; Jürgen Dr. Treumer; Jan Lenke
Original assignee: Fachhochschule Flensburg
Current assignee: Fachhochschule Flensburg
Priority date: 2003-09-19
Filing date: 2003-09-19
Publication date: 2005-04-14

Abstract

Verfahren zum quantitativen Nachweis von biologischen Kontaminanten in komplexen Zellgemischen mit den folgenden Schritten: Entnehmen einer Probe des komplexen Zellgemisches, Versetzen der Probe mit einem ersten gegen die biologischen Kontaminanten gerichteten mit einem Fluoreszenzfarbstoff gekoppelten Antikörper, Bindenlassen des ersten Antikörpers an die biologischen Kontaminanten, gekennzeichnet durch Versetzen der Probe mit einem zweiten gegen die Kontaminanten oder gegen den ersten Antikörper gerichteten mit einem Magnetpartikel gekoppelten Antikörper, Bindenlassen des zweiten Antikörpers, Anlegen eines magnetischen Feldes, Überführen der magnetischen Partikel in ein Durchflusszytometer und Erfassen der über den zweiten Antikörper an die Kontaminanten gebundenen fluoreszierenden Magnetpartikel.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Kontaminanten in Kulturen für die Lebensmittelindustrie mit Hilfe der Durchflusszytometrie.

Neben der Beurteilung der Qualität von Trinkwasser besitzt die Erkennung von mikrobieller Kontamination in der Lebensmittelindustrie eine besondere Bedeutung. Um selbst geringe Kontamination mit pathogenen Mikroorganismen vollständig ausschließen zu können, sind bei der Produktion von Lebensmitteln hohe Hygienestandards erforderlich. Dazu gehören neben hygienischem Arbeiten auch die regelmäßige Beprobung von Medien oder komplexen Zellgemischen, wie z.B. Milch, Joghurt oder Käse.

Die entnommenen Proben müssen dafür unter definierten Bedingungen in Kultur genommen werden, da die Kontaminanten oftmals in nur geringer Anzahl vorhanden und keine genügend empfindlichen Nachweismethoden zum Nachweis der Kontaminanten verfügbar sind. Deshalb werden die Zellen vermehrt und auf Kontamination mit unerwünschten Mikroorganismen untersucht. Der Nachweis einer Kontamination selbst kann auf unterschiedliche Weise erbracht werden, z.B. durch die Auswahl der Kultivierungsbedingungen, unspezifische und spezifische Färbemethoden, anatomischmorphologische Kriterien, die Verwendung monoklonaler Antikörper oder auch mit gentechnischen Verfahren.

Der gemeinsame Nachteil aller dieser Nachweismethoden ist, dass die Kultivierung der Zellen einen hohen Materialbedarf mit sich bringt, qualifiziertes Fachpersonal erfordert, zeitaufwändig und kostenintensiv ist. Insbesondere stellt der Zeitbedarf der Kultivierung ein Problem für den Produktionsablauf in der Lebensmittelindustrie dar, da ein Testergebnis nicht unmittelbar nach Probennahme, sondern erst nach mehreren Tagen der Kultivierung verfügbar ist. Gerade bei Testergebnissen, die positiv ausfallen und eine weitere Beprobung notwendig machen ist der Produktionsablauf in hohem Maße behindert, da eine Weiterverarbeitung des Ansatzes zunächst ausgeschlossen ist.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zu Grunde, ein sensitives und schnelles quantitatives Verfahren zum Nachweis von Kontaminanten in komplexen Zellgemischen zu entwickeln.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, dass sich an das Verfahren mit den folgenden Schritten: Entnehmen einer Probe des komplexen Zellgemisches, Versetzen der Probe mit einem ersten gegen die biologischen Kontaminanten gerichteten mit einem Fluoreszenzfarbstoff gekoppelten Antikörper, Binden lassen des ersten Antikörpers an die biologischen Kontaminanten, die Schritte Versetzen der Probe mit einem zweiten gegen die Kontaminanten oder gegen den ersten Antikörper gerichteten mit einem Magnetpartikel gekoppelten Antikörper, Binden lassen des zweiten Antikörpers, Anlegen eines magnetischen Feldes, Überführen der magnetischen Partikel in ein Durchflusszytometer und Erfassen der über den zweiten Antikörper an die Kontaminanten gebundenen fluoreszierenden Magnetpartikel anschließen.

Das erfindungsgemäße Verfahren verwendet im Unterschied zum bereits bekannten zum Stand der Technik gehörenden Verfahren einer Zellseparation als ersten Schritt gefolgt von einer Antikörper vermittelten Färbung mittels eines Fluoreszenzfarbstoffs diese Verfahrensschritte in umgekehrter Reihenfolge, um einer unspezifischen Anfärbung der Magnetpartikel vorzubeugen.

Das Verfahren macht dabei im Wesentlichen Gebrauch von den Verfahren der Zellseparation mit Magnetpartikeln und der Durchflusszytometrie. Ausgehend davon, dass die kontaminierenden Mikroorganismen bei einem hohen Überschuss von Nutzorganismen nur in geringer Zahl vorkommen, wird die Konzentration der Kontaminanten in der Probe durch spezifische Markierung mit Magnetpartikeln gekoppelten Antikörpern und anschließender Separation in einem Magnetfeld erhöht. Die darauf folgende durchflusszytometrische Messung macht sich die Eigenschaft von für das Verfahren geeigneten Magnetpartikeln zu Nutze. Zum einen wird dadurch, dass die Magnetpartikel deutlich von anderen Partikeln (z.B. Zellen) im Durchflusszytometer abgegrenzt werden können, eine höhere Trennschärfe zwischen markierten und unmarkierten Zellen erreicht, als wenn man einfach Fluoreszenz markierte kontaminierende Zellen von Nutzzellen mit in etwa gleichen Eigenschaften (z.B. Größe, Granularität) differenzieren muss. Zum anderen können die für das Verfahren geeigneten über die Antikörper an Kontaminanten gebundenen Magnetpartikel durch ihr Fluoreszenzverhalten von den an Antikörpern gekoppelten Magnetpartikel, die nicht an Kontaminanten gebunden sind, unterschieden werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren resultiert in einem hoch empfindlichen Nachweisverfahren, das innerhalb einer Stunde durchgeführt werden kann. Ein weiterer Vorteil besteht darin, dass durch die Bindung Magnetpartikel gekoppelter Antikörper an die Kontaminanten ein Shift in der Fluoreszenz der Magnetpartikel erfolgt und so ausschließlich ohne weitere Analyse die Zellzahl der Kontaminanten ermittelt werden kann.

Im Folgenden wird die Erfindung anhand von Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen:

1 eine zytometrische Aufzeichnung einer nicht kontaminierten Zellkultur und

2 eine zytometrische Aufzeichnung einer kontaminierten Zellkultur.

In 1A ist die Granularität aller durch ein Durchflusszytometer registrierten Partikel gegenüber dem Volumen der registrierten Partikel dargestellt. 1B zeigt die Fluoreszenz aller durch ein Durchflusszytometer registrierten Partikel gegenüber dem Volumen der registrierten Partikel, während in 1C in derselben Darstellung hingegen ausschließlich die Partikel aufgetragen sind, die Magnetbeads sind. 1D schließlich stellt ein Histogramm von 1C als Zählereignisse gegenüber der Fluoreszenz der Magnetbeads dar. Die Darstellung der 2A – D sind entsprechend ausgelegt.

In den 1A und 2A können die Magnetbeads aufgrund ihrer Granularität als auch aufgrund ihrer Fluoreszenz deutlich von anderen Partikeln (i.e. Zellen) unterschieden werden. Der in diese Art der Darstellung eingezeichnete Rahmen stellt jeweils die Auswahl für die Darstellungen in 1 und 2C und D dar. Der Vergleich der nicht kontaminierten Zellkultur aus 1D mit der mit unerwünschten Mikroorganismen kontaminierten Kultur aus 2D zeigt deutlich, dass Magnetbeads, die über einen Antikörper an den Kontaminanten gebunden sind (M2), eine höhere Fluoreszenz aufweisen als nicht an Kontaminanten gebundene Magnetbeads (M1). Für die Bestimmung der Zellzahl der Kontaminanten müssen also nur die Zählereignisse im Bereich (M2) registriert werden.

Beispiel 1
In einer Ausführung der Erfindung wird die Probe des komplexen Zellgemisches zentrifugiert und der Überstand abgesaugt. Ein gegen den gesuchten Kontaminanten gerichteter biotinylierter Primärantikörper wird mit dem Pellet der Probe inkubiert. Nach zeitlich ausreichender Inkubation wird die Probe erneut zentrifugiert und mehrmals gewaschen, wobei der Überstand jeweils verworfen wird. Daraufhin wird ein zweiter gegen den ersten Antikörper gerichteter mit einem Fluoreszenzfarbstoff (z.B. FITC) gekoppelter Sekundärantikörper mit dem Pellet inkubiert. Nach zeitlich ausreichender Inkubation wird erneut zentrifugiert und gewaschen. Das Pellet wird dann in einer Suspension von mit Streptavidin gekoppelten Magnetpartikeln aufgenommen und unter ständigem Schütteln inkubiert. Die so behandelte Probe wird in einen Magnetpartikelkonzentrator gestellt und der Überstand vorsichtig abpipettiert. Das Pellet wird gewaschen und die Partikel in einem Durchflusszytometer wie bereits beschrieben gemessen.
Beispiel 2
In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung werden vor der Probenbehandlung zunächst zwei Ansätze vorbereitet. Der erste Ansatz enthält entweder einen mit einem Fluoreszenzfarbstoff gekoppelten gegen den gesuchten Kontaminanten gerichteten Primärantikörper oder einen gegen den gesuchten Kontaminanten gerichteten Primärantikörper und einen gegen den Primärantikörper mit einem Fluoreszenzfarbstoff gekoppelten Sekundärantikörper. Der zweite Ansatz enthält einen gegen den Primärantikörper gerichteten biotinylierten Antikörper, zu denen man mit Streptavidin gekoppelte Magnetbeads hinzu gibt.
Eine Probe des komplexen Zellgemisches wird zentrifugiert und der Überstand abgesaugt. Das Pellet wird zunächst mit dem ersten Ansatz inkubiert, zentrifugiert und gewaschen. Das entstandene Pellet wird darauf mit dem zweiten Ansatz versetzt und inkubiert. Wahlweise können beide Ansätze aber auch zeitgleich zum ersten aus dem komplexen Zellgemisch erhaltenen Pellet gegeben werden. Anschließend wird zentrifugiert und gewaschen. Die so behandelte Probe wird in einen Magnetpartikelkonzentrator gestellt und der Überstand vorsichtig abpipettiert. Das Pellet wird gewaschen und die Partikel in einem Durchflusszytometer wie bereits beschrieben gemessen.
Beispiel 3
Im Folgenden wird die Arbeitsanweisung zum Nachweis von Klebsiella pneumoniae als besonders bevorzugte Ausführungsbeispiel wiedergegeben. Die Anweisungen folgen im Wesentlichen den Ausführungen von Beispiel 2:

a. 5 μl der Magnetpartikel-Stammsuspension (6 × 10⁸ Partikel/ml) in ein 1,5 ml Eppendorf Reaktionsgefäß überführen und 4 × mit jeweils 500 μl FACS-Puffer (Trägerflüssigkeit für Zytometer) waschen; nach dem letzten Waschschritt wieder in 500 μl FACS-Puffer aufnehmen. Die Partikel werden dabei mit Hilfe eines Magnetseparators vom Überstand getrennt.
b. 250 μl der Partikel werden 20 min im Laborrüttler (1400 rpm) mit 5 μg biotinyliertem Sekundärantikörper (Ziege-anti-Kaninchen) bei Raumtemperatur inkubiert. Dann die Probe wie unter a. beschrieben 6 × mit 500 μl FACS-Puffer waschen und nach dem letzten Waschschritt in 250 μl FACS-Puffer aufnehmen.
c. Probe auf ca. 10⁷ Zellen/ml verdünnen und dann 1 ml davon in ein 1,5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäß füllen und zentrifugieren (8000 rpm, 8 min)
d. Auf das Pellet 20 μg polyklonalen Antikörper gegen Klebsiella pneumoniae geben und 20 min im Laborrüttler inkubieren (RT, 1400 rpm). Anschließend die Probe 2 × mit jeweils 1 ml FACS-Puffer waschen, Überstand jeweils vorsichtig absaugen.
e. Auf das Pellet 2,5 μg FITC-markierten anti-rabbit-Sekundärantikörper geben und 20 min im Laborrüttler inkubieren (RT, 1400 rpm). Anschließend die Probe 3 × mit jeweils 1 ml FACS-Puffer waschen, Überstand jeweils vorsichtig absaugen.
f. Auf das Pellet 20 μl der vorbereiteten Magnetpartikel geben. Die Magnetpartikel müssen dann mit Hilfe zweier Magneten wiederholt durch die Probe gezogen werden, die zwischendurch immer wieder vorsichtig geschüttelt werden sollte.
g. Schließlich werden die Partikel mit Hilfe des Magnetseparators von der Probe getrennt, 6 × mit je 500 μl FACS-Puffer gewaschen, am Schluss in 300 μl FACS-Puffer aufgenommen und im Durchflusszytometer gemessen.

Die Auswertung solch eines nach diesen Anweisungen durchgeführten Versuchs sind in 1 (nicht kontaminiert) und 2 (mit Klebsiella pneumoniae kontaminiert) wiedergegeben.

Claims

Verfahren zum quantitativen Nachweis von biologischen Kontaminanten in komplexen Zellgemischen mit den folgenden Schritten: Entnehmen einer Probe des komplexen Zellgemisches, Versetzen der Probe mit einem ersten gegen die biologischen Kontaminanten gerichteten mit einem Fluoreszenzfarbstoff gekoppelten Antikörper, Binden lassen des ersten Antikörpers an die biologischen Kontaminanten, gekennzeichnet durch Versetzen der Probe mit einem zweiten gegen die Kontaminanten oder gegen den ersten Antikörper gerichteten mit einem Magnetpartikel gekoppelten Antikörper, Binden lassen des zweiten Antikörpers, Anlegen eines magnetischen Feldes, Überführen der magnetischen Partikel in ein Durchflusszytometer und Erfassen der über den zweiten Antikörper an die Kontaminanten gebundenen fluoreszierenden Magnetpartikel.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der erste gegen die Kontaminanten gerichtete Antikörper aus einem Komplex aus einem gegen die Kontaminanten gerichteten Primärantikörper und einem weiteren gegen den Primärantikörper gerichteten mit einem Fluoreszenzfarbstoff gekoppelten Sekundärantikörper besteht.