DE69636564T2

DE69636564T2 - Verfahren zur freisetzung von magnetischen teilchen, die an zelloberflächen gebunden sind

Info

Publication number: DE69636564T2
Application number: DE69636564T
Authority: DE
Inventors: Stephan Miltenti
Original assignee: Miltenyi Biotec Inc
Current assignee: Miltenyi Biotec Inc
Priority date: 1995-04-06
Filing date: 1996-03-11
Publication date: 2007-06-06
Anticipated expiration: 2016-03-12
Also published as: EP0819250B1; EP0819250A4; ATE340254T1; EP0819250A1; AU5360596A; WO1996031776A1; DE69636564D1

Description

EINLEITUNG Technisches Gebiet
Das Gebiet der Erfindung betrifft die magnetische Zellsortierung.
Hintergrund
Multiparameter-Zellsortierung und deren Vorteile sind aus der leuchtstoffaktivierten Zellsortierung (FSCS) bekannt. Zellen in Suspension können mithilfe dieser Technik entsprechend der Parameter bis zur Höchstzahl von vier gleichzeitig getrennt werden. Während FACS wegen dieser Fähigkeit vorteilhaft ist, hat es aufgrund des seriellen Wesens des Sortierungsprozesses, bei dem die Zellen einzeln bearbeitet werden müssen, viele Nachteile.
Es wurden mehrere Methoden der Parallel-Sortierung beschrieben. Zu ihnen zählen große Magnet-Perlschnüre, das Schwenken, Affinitätssäulen und Hochgradient-Magnettrennung (HGMS). Parallele Sortierungsmethoden verschaffen im Vergleich zur Durchflusscytometrie einige Vorteile. Sie erfordern ausschließlich billige Reagenzien und Geräte, die leicht zu bedienen und zu warten sind. Viele Proben können zur gleichen Zeit bearbeitet werden. Für die Vereinfachung der Bearbeitung einer großen Zahl von Proben kann ein automatisiertes System verwendet werden.
Parallele Sortiermethoden, wie die magnetische Teilchensortierung, haben den Nachteil, dass nur ein Parameter auf ein Mal bearbeitet werden kann. Zellen sind entweder an einen festen Träger gebunden oder nicht. In der Praxis hat dies die verfügbaren Trennungen auf entweder (a) Einstufen-Anreicherung oder -Abreicherung oder (b) Zweistufen-Trennungen beschränkt, bei der die Abreicherung von der Anreicherung gefolgt wird. Es ist nur möglich, doppelte Anreicherungen oder von Abreicherung gefolgte Anreicherung durchzuführen, wenn man die magnetische Kennzeichnung der Zellen entfernen kann.
Vorschläge für diese Entfernung wurden vorgetragen. Das Europäische Patent EP 0395355 beschreibt die Freisetzung von magnetischen Perlschnüren von einer Zellenoberfläche mittels Behandlung mit Chymopapain. Dies hat den Nachteil, dass dabei viele andere Zellantigene zerstört werden. Die Internationale Patentanmeldung WO 91/15766 beschreibt die Verwendung von Antikörpern zur Absetzung von an magnetische Teilchen gebundene Antikörper. Die Prozedur ist langsam und arbeitet für viele Antikörper von hoher Affinität schlecht.
Daher besteht ein wesentliches Interesse an Methoden zur wirksamen Entfernung von magnetischen Teilchen nach der Trennung, ohne die Oberflächenantigene zu beeinträchtigen.
Einschlägige Literatur
U.S. Patent 4,452,773 beschreibt die Zubereitung von magnetischen Eisen-Dextran-Mikrokugeln und gibt eine allgemeine Beschreibung der unterschiedlichen Zubereitung von Teilchen, die geeignet sind, sich an biologisches Material zu binden. U.S. Patent Nr. 4,230,685 beschreibt Verbesserungen in der Anbringung von spezifischen Bindemitteln an die magnetischen Teilchen. Eine Beschreibung der Polymer-Beschichtungen von magnetischen Teilchen, die bei Hochgradient-Magnetsortierung verwendet werden, kann in der PCT-Anmeldung WO 85/04330 gefunden werden. Methoden zur Zubereitung von superparamagnetischen Teilchen werden im U.S. Patent 4,770,183 beschrieben. Superparamagnetisches Material sind hochgradig magnetempfindlich, d.h. sie werden stark magnetisch, wenn sie einem Magnetfeld ausgesetzt werden, verlieren jedoch ihren Magnetismus schnell, sobald sie aus dem Feld entfernt werden. Dies geschieht in ferromagnetischem Material wenn der Kristalldurchmesser auf einen kritischen Wert verringert wird.
Das Europäische Patent EP 0395355 beschreibt die Freisetzung von magnetischen Perlschnüren von einer Zellenoberfläche mittels Behandlung mit Chymopapain. Die Internationale Patentanmeldung WO 91/15766 beschreibt die Verwendung von Antikörpern zur Absetzung von an magnetische Teilchen gebundene Antikörper. Das U.S. Patent 5,240,640 beschreibt die Freisetzung von mit Gelatine beschichteten magnetischen Teilchen mittels Behandlung mit Kollagen. N. Pope u. a. Biomed. Materials Res. 28:449-457 beschreibt die Verwendung von Alginat als eine freisetzbare Beschichtung für magnetische Teilchen.
Ljungquist u. a. DNA & Cell Biology 12 (1993) 191–197 beschreibt die Fixierung von Fusionsproteinen und β-Lymphozyten, die über eine Gummilackhemmer-Sequenz an magnetische Perlschnüre gebunden sind, die die Gummilack-Bediener-Sequenz wiedergeben. Zellen und Proteine werden durch unterschiedliche Mittel wieder gewonnen, einschließlich DNAse 1-Digestion
Schlossman u. a. J. Immunol 110 (1973) 313 beschreibt die Anreicherung von Lymphozyten mittels Verwendung eines unlöslichen Sephanex-Trägers, der mit Dextranase digerierf wird.
Basch u. a. J. Immunol. Methods 56 (1983) 269–280 beschreibt eine Zelltrennung mittels Verwendung von positiven immunoselektiven Techniken und weist darauf hin, dass Ligand-verbundene magnetische Perlschnüre zur Trennung der Zellen verwendet wurden.
WO94/02016 beschreibt Methoden zur positiven Immunoselektion von Stammzellen mittels Fixierung auf einem in festem Zustand befindlichen Bindemittel über eine Zwischenwirkung von Hapten/Immunn-Wirkstoff und der Elution der Zellen unter Verwendung von löslichem Hapten.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es werden Methoden und Anweisungen vorgetragen zur Freisetzung mittels eines Affinitätswirkstoffes von kolloidalen superparamagnetischen Teilchen, die an eine Zelloberfläche gebunden sind.
Das Teilchen wird durch die Wirkung einer für eine glykosidische Bindung spezifischen Glykosidase freigesetzt, die in wenigstens einer der (a) Beschichtungen des Teilchens und (b) einer Bindungsgruppe zwischen der Beschichtung und dem Affinitätsreagenten besteht. Die glykosidische Bindung ist in normalen Säugetierzellen nicht vorhanden. Der Freisetzungsprozess ist bei sequentiellen Zelltrennungsprozessen nützlich.
KURZBESCHREIBU/NG DER ABBILDUNGEN
1 zeigt eine Untersuchung einer magnetischen Trennung von CD45RA, die T-Helferzellen aus PBMC wiedergibt. 1a zeigt die für die Untersuchung verwendete vorwärts-seitliche Streublende. 1b zeigt die PI- verglichen mit der für die Untersuchung verwendete CD45RA-Blende. 1c zeigt ein Rasterpunktdiagramm von CD4 (FI-1) im Vergleich mit CD45RA (FI-2) der Zellen vor der Trennung. 1d zeigt ein Rasterpunktdiagramm von CD4 (FI-1) im Vergleich mit CD45RA (FI-2) des magnetischen Teils nach der Trennung von CD4. 1e zeigt ein Rasterpunktdiagramm von CD4 (FI-1) im Vergleich mit CD45RA (FI-2) des magnetischen Teils nach der Trennung von CD45RA.
2 zeigt eine Untersuchung einer magnetischen Anreicherung von CD45RO, das T-Helferzellen aus PBMC ausdrückt. 2a zeigt die für die Untersuchung verwendete vorwärts-seitliche Streublende. 2b zeigt den PI verglichen mit der für die Untersuchung verwendete Blende. 2c zeigt ein Rasterpunktdiagramm ₁₆ von CD4 (FI-1) im Vergleich mit CD45RO (FI-2) der Zellen vor der Trennung. 2d zeigt ein Rasterpunktdiagramm von CD4 (FI-1) im Vergleich mit CD45RO (FI-2) des magnetischen Teils nach der Anreicherung von CD4. 2e zeigt ein Rasterpunktdiagramm von CD4 (FI-1) im Vergleich mit CD45RO (FI-2) des magnetischen Teils nach der Isolierung von CD45RA.
3 zeigt eine magnetische Anreicherung von CD34⁺-Zellen aus PBMC mit Antikörpern gegen zwei verschiedene CD34-Epitope. 3a zeigt die für die Untersuchung verwendete vorwärts-seitliche Streublende. 3b zeigt den PI verglichen mit der für die Untersuchung von HPCA2 verwendete Blende. 3c zeigt ein Rasterpunktdiagramm von QBEnd 10-FITC (FI-1) im Vergleich mit HPCA2-dig mAB plus a-dig-PE (FI-2) der Zellen vor der Trennung. 3d zeigt ein Rasterpunktdiagramm von QBEnd 10-FITC (FI-1) im Vergleich mit HPCA2-dig mAB plus a-dig-PE (FI-2) des magnetischen teils nach der Anreicherung von QBEnd10. 3e zeigt ein Rasterpunktdiagramm von QBEnd 10-FITC (FI-1) im Vergleich mit HPCA2-dig mAB plus a-dig-PE (FI-2) des magnetischen Teils nach der Isolierung von HPCA2.
4.1 zeigt eine Untersuchung einer magnetischen Isolierung von CD45RA, das blutbildende Stammzellen aus PBMC ausdrückt. 4.1a zeigt die für die Untersuchung verwendete vorwärts-seitliche Streublende. 4.1b zeigt den PI verglichen mit der für die Untersuchung verwendete CD45RA-Blende. 4.2c zeigt ein Rasterpunktdiagramm von CD34 (FI-1) im Vergleich mit CD45RA (FI-2) der Zellen vor der Trennung. 4.1d zeigt ein Rasterpunktdiagramm von CD34 (FI-1) im Vergleich mit CD45RA (FI-2) des magnetischen Teils nach der Anreicherung von CD34. 4.1e zeigt ein Rasterpunktdiagramm von CD34 (FI-1) im Vergleich mit CD45RA (FI-2) des magnetischen Teils nach der Isolierung von CD45RA.
4.2 zeigt eine Untersuchung einer magnetischen Anreicherung von CD45RA, das CD34⁺-Zellen aus PBMC ausdrückt. 4.2a zeigt die für die Untersuchung verwendete vorwärts-seitliche Streublende. 4.1b zeigt den PI verglichen mit der für die Untersuchung verwendete CD34-Blende. 4.2c zeigt ein Rasterpunktdiagramm von CD45RA (FI-1) im Vergleich mit CD34 (FI-2) der Zellen vor der Trennung. 4.2d zeigt ein Rasterpunktdiagramm von CD45RA (FI-1) im Vergleich mit CD34 (FI-2) des magnetischen Teils nach der Anreicherung von CD34. 4.2e zeigt ein Rasterpunktdiagramm von CD45RA (FI-1) im Vergleich mit CD34 (FI-2) des magnetischen Teils nach der Isolierung von CD345RA.
5 zeigt eine Untersuchung einer magnetischen Anreicherung von HLA-DR negative CD34⁺-Zellen aus PBMC. 5a zeigt die für die Untersuchung verwendete vorwärts-seitliche Streublende. 5b zeigt den PI verglichen mit der für die Untersuchung von CD34 verwendete Blende. 5c zeigt ein Rasterpunktdiagramm von HLA-DR (FI-1) im Vergleich mit CD34 (FI-2) der Zellen vor der Trennung. 5d zeigt ein Rasterpunktdiagramm von HLADR (FI-1) im Vergleich mit CD34 (FI-2) des magnetischen Teils nach der Anreicherung von CD34. 5e zeigt ein Rasterpunktdiagramm von HLADR (FI-1) im Vergleich mit CD34 (FI-2) des magnetischen Teils nach der Abreicherung von CD34.
BESCHREIBUNG DER SPEZIFISCHEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Kolloidale superparamagnetische Teilchen (magnetische Mikroteilchen), die an eine Zelle über eine chemische Verbindung mit einem Affinitäts-Reagens gebunden sind, werden durch die Wirkung einer spezifischen Glykosidase für die glykosidische Bindung, die entweder in der Teilchenbeschichtung oder in der Verbindungsgruppe zwischen der Beschichtung und dem Affinitäts-Reagenten vorhanden ist. Der Freisetzungsprozess wird bei Zelltrennungen verwendet, bei denen die Entfernung von magnetischen Teilchenkennzeichnungen gewünscht wird.
Superparamagnetische Teilchen werden mit einer Beschichtung versehen, vorzugsweise einer Polysaccharid-Beschichtung, die eine glykosidische Bindung aufweist, die in normalen Säugetierzellen nicht vorkommt. Die glykosidische Bindung kann in der Beschichtung selbst vorkommen oder kann einem Bindemittel zugeführt werden, der den Affinitäts-Reagenten an die Beschichtung bindet. Wesentliche glykosidische Bindungen werden auf der Oberfläche von normalen Säugetierzellen nicht vorkommen. Nach einem anfänglichen Trennungsschritt mittels Mikroteilchen, werden die Mikroteilchen durch die Wirkung einer für die Polysaccharid-Beschichtung spezifische Glykosidase freigesetzt.
Geeignete Magnetteilchen werden in Molday U.S. Patent 4,452,773 und Europäisches Patent 452342-B (am 20. November 1994 veröffentlicht) beschrieben. Gallertförmige Teilchen, wie die in Owen U.S. 4,795,698 und Liberti u. a. U.S. 5,200,084 beschriebenen, sind ebenfalls geeignet. Die Mikroteilchen besitzen gewöhnlich einen Durchmesser von weniger als 100 nm und gewöhnlich einen Durchmesser von mehr als 10 nm.
Bei der Zubereitung der Teilchen wird eine makromolekulare Beschichtung verwendet. Wesentliche Beschichtungen schließen Dextrane, Zellulose, Pektin, Chitin usw. ein, die eine angemessen spezifische Hydrolase aufweisen, die als Freisetzungsmittel nützlich ist. Die Beschichtung wird entsprechend derivatisiert, um für die Bindung des Affinitäts-Reagenten funktionelle Gruppen zu erhalten. Eine Vielfalt von solchen Veränderungen ist in der Branche bekannt. Die Funktionsgruppen werden anschließend verwendet, um die Mikroteilchen an die Affinitäts-Reagenten zu binden, die für den in einer biologischen Zielgruppe vorhandenen Größenstandard spezifisch sind.
Amino-Gruppen können vor oder nach der Bildung der Perlschnüre eingeführt werden. Es kann eine Aldehyd-Funktion hinzugefügt werden, indem man ein Polysaccharid mit Di-Imidazol oder DCCD reagieren lässt und Hexan-Diamin mit den Zuckermolekülen verbindet. Ersatzweise, kann bei der Zubereitung des Dextrans für die Beschichtung Aminodextran mit reinem Dextran gemischt werden, um Amino-Gruppen zu erhalten. Vorzugsweise werden die Amino-Gruppen den Enden des Polymers, d. h. dem sechsteiligen Zucker des Dextran-Moleküls beigefügt. Die Polysaccharide können mit Periodat entsprechend oxidiert werden, um Aldehyd-Funktionsgruppen zu erhalten, die mit Amino-Ersatz mit einem proteinbindendem Teil verbunden werden können, insbesondere im Fall von reduktiver Aminierung. Antikörper können mit den Teilchen mittels Seitenketten-Amino- oder Sulfhydryl-Gruppen und heterofunktionellen Querverbindungs-Reagenten gekoppelt werden In manchen Fällen kann die glykosidische Seitenkette des Antikörpers mittels Periodat oxidiert und mit freien Amino-Gruppen der für die Beschichtung verwendeten Moleküle gekoppelt werden.
Es steht eine große Anzahl von heterofunktionellen Verbindungen für die Bindung an Einheiten zur Verfügung. Beispielhafte Einheiten umfassen: Azidobenzoyl-Hydrazid, N-[4-(p-Azidosalicylamino)Butyl]-3'-[2'-Pyridyldithio]-Propionamid), Bis-SulfoSuccinimidyl-Suberat, Dimethyladipimidat, Disuccinimidyltartrat, N- -Maleimidobutyryloxysuccinimid-Ester, N-Hydroxy-Sulfosuccinimidyl-4-Azidobenzoat, N-Succinimidyl [4-azidophenyl]-1,3'-Dithiopropionat, N-Succinimidyl [4-iodoacetyl]-Aminobenzoat, Glutaraldehyd, NHS-PEG-MAL, Shearwater-Polymere, und Succinimidyl 4-[N-Maleimidomethyl]Cyclohexan-1-Carboxylat. Eine vorgezogene Bindegruppe ist 3-(2-Pyridyldithio)-Propion-Säure-N-Hydroxysuccinimid-Ester (SPDP) oder 4-(N-Maleimidomethyl)-Cyclohexan-1-Carboxyl-Säure-N-Hydroxysuccinimid-Ester (SMCC) mit einer reaktiven Sulfhydryl-Gruppe auf dem Antikörper und einer reaktiven Amino-Gruppe auf dem magnetischen Teilchen.
Die Hydrolase, bzw. der Freisetzungswirkstoff hebelt eine auf der der makromolekularen Mikroteilchen-Beschichtung oder in dem Bindemittel bestehende glykosidische Bindung auf. Der Freisetzungswirkstoff wird die auf dem biologischen Target vorhandenen Oberflächen-Antigene im Wesentlichen unbeschadet lassen, d. h. Zellen, Organelle usw. Vorgezogen Freisetzungswirkstoffe sind Enzyme, die unter physiologischen Bedingungen reagieren und so die Auswirkung auf das Target minimieren. Nach der Freisetzungsreaktion wird die Lebensfähigkeit der Zelle erhalten, wie z. B. die Fähigkeit, zusätzliche Affinitäts-Reagenten an die Zelloberflächen-Marker zu binden, auf Wirkstoffe mittels Oberflächen-Rezeptoren zu reagieren usw.
Die Wahl der Freisetzungswirkstoffe wird durch die glykosidische Bindung bestimmt. Ist die makromolekulare Beschichtung ein Polysaccharid, wird ein Polysaccharid gewählt, das glykosidische Bindungen enthält, die in normalen Säugetierzellen nicht vorkommen. Es können Hydrolasen als Freisetzungswirkstoff verwendet werden, die spezifische glykosidische Strukturen erkennen, wie z. B. Dextran und Dextranase, das α (1 → 6)-Bindungen, Zellulose und Zellulase, das β (1 → 4)-Bindungen aushebelt, Amylose und Amylase, Pectin und Pectinase, Chitin und Chitinase usw.
Der Freisetzungswirkstoff wird einer Zellbevölkerung hinzugefügt, an die magnetische Mikropartikel mittels spezifischer Affinitäts-Reagenten gebunden sind. Das Medium, in dem die Zellen freigesetzt werden kann jedes Medium sein, dass die Lebensfähigkeit der Zellen erhält und die Wirkung des Freisetzungswirkstoffes ermöglicht. Geeignete Medien umfassen phosphat-unterstützte Salinen mit 0.1 bis 0,5% BSA, Dulbecco's Modified Eagle Medium (dMEM), Hank's Basic Salt Solution (HBSS), Dulbecco's phosphat-unterstützte Saline (dPBS), RPMI, Iscove-Medium, PBS mit 5 mM EDTA usw., oft unter Zusatz von Kalbsfötus-Serum, BSA, HSA usw.
Die zugesetzte Menge an Freisetzungswirkstoff reicht aus, um im Wesentlichen alle Mikroteilchen von den Zellen im gewünschten Zeitraum freizusetzen. Gewöhnlich werden mindestens 80% der Mikroteilchen, häufiger mindestens 95%, vorzugsweise mindestens 99% der Mikroteilchen freigesetzt. Die Freisetzungsbedingungen können empirisch hinsichtlich der Temperatur, des pH, des Vorkommens von metallenen Kofaktoren, reduzierender Wirkstoffe usw. durch die Veränderung dieser Bedingungen und durch die Bestimmung der quantitativen Wirkung auf die Freisetzung der Mikroteilchen optimiert werden. Die Freisetzung wird gewöhnlich nach 15 Minuten, häufiger nach 10 Minuten abgeschlossen sein und dauert in der Regel nicht länger als 30 Minuten. Die Zellen können nach Beendigung der Reaktion gespült werden.
Um eine Reaktion des Rückstands des Freisetzungswirkstoffes mit den Mikroteilchen während der anschließenden Trennungsschritte zu verhindern, wird gewöhnlich eine Blockierlösung zugesetzt. Die Zusammensetzung der Blockierlösung wird auf der Grundlage der Wirkung des Freisetzungswirkstoffes gewählt und enthält gewöhnlich ein Substrat für das Enzym, z. B. Dextran für Dextranasen, Zellulose für Zellulasen usw., in einer ausreichenden Menge, um wirksam im Wesentlichen jede Rest-Enzymaktivität gegenüber den Mikroteilchen zu unterbinden. Ersatzweise können die Mikroteilchen in den anschließenden Schritten so gewählt werden, dass sie eine Bindung besitzen, die nicht für den ersten Freisetzungswirkstoff empfänglich ist, zum Beispiel, Eisenstärke-Partikel in Verbindung mit einem Dextranase-Freisetzungswirkstoff.
Als Beispiel einer geeigneten Freisetzungsreaktion, werden Zellen, die an mit Dextran beschichteten Mikroteilchen gebunden sind, mit Dextranase kombiniert, wie in den Beispielen beschrieben. Das Gemisch wird bei Umgebungstemperatur zwischen 1 bis zu 15 Minuten ausgebrütet. Die Zellen werden gespült und erneut in die Suspension gegeben. Wahlweise wird der Zellsuspension Dextran beigegeben, gewöhnlich etwa 1 bis 100 mg/ml, um jede weitere Freisetzung von Mikroteilchen zu verhindern.
Spezifische Zell-Teilgruppen in einem komplexen Gemisch werden durch Hochgradient-Magnettrennung auf der Grundlage der Oberflächenaussage von spezifischen Markern getrennt. Der Trennungsprozess kann eine Abreicherung darstellen, wenn die gewünschte Teilgruppe nicht magnetisch gekennzeichnet ist, oder eine Anreicherung, wenn die gewünschte Teilgruppe auf einem magnetischen Fixiermittel fixiert wird. Die Freisetzungsmethode des Gegenstands ermöglicht die schnelle Freisetzung der Mikroteilchen ohne Fresisetzung der Affinitäts-Reagenten und ohne eine wesentliche Veränderung der auf der Zelle befindlichen Oberflächenantigene.
Die Freisetzungsmethode ist nützlich bei der Aussonderung spezifischer Zellarten aus komplexen Gemischen, bei denen die Prozedur mehrere Trennschritte vorsieht. Die Prozedur kann eine Vielzahl von Kombinationen aus Anreicherungs- und Abreicherungsschritten verwenden, gewöhnlich mit einer Anreicherung beginnend. Um einen hohen Aussonderungsgrad für einen einzelnen Marker zu erhalten, können zwei aufeinanderfolgende Anreicherungsschritte durchgeführt werden, wobei spezifische Antikörper für zwei verschiedene Epitope des Markers verwendet werden, z. B., zwei verschiedene anti-CD34 Antikörper. Zwei aufeinanderfolgende positive Auslesen können 250 für verschiedene Marker durchgeführt werden, indem Auslesen kombiniert werden für zwei oder mehr CD34, thy-1, CD71, Transferrin-Rezeptor, HB-F-Fötuszellenauslese, ein Cocktail von blutbildenden Abstammungsmarkern, wie die Kombination von CD4/CD8/CD19, Cykotin-Rezeptoren, CD45RA/RO usw. Es ist oft wünschenswert, zunächst eine Anreicherung durchzuführen, wenn eine kleinere Zellbevölkerung aus einem komplexen Gemisch ausgesondert werden soll, um die Anzahl der manipulierten Zellen zu begrenzen. Zum Beispiel sind die Anreicherung von CD34 positivern Zellen bei der Auslese von blutbildenden Stammzellen oder die Anreicherung von CD71 positiven Zellen bei der Auslese von Fötuszellen im Mutterblut nützliche erste Schritte. Diese Anreicherung wird anschließend von einem Abreicherungsschritt gefolgt und, wahlweise, einer weiteren positiven Auslese. Die Zahl der Ausleseschritte kann nach Bedarf erweitert werden.
Besonders nützliche Affinität-Reagentien für Zelloberflächen-Antigene spezifische Antikörper. Es können ganze Antikörper oder Fragmente verwendet werden, z. B., Fab, F(ab')₂, leichte oder schwere Kettenfragmente usw. Diese Antikörper können polyklonal oder monoklonal sein und sind allgemein im Handel erhältlich oder können ersatzweise mittels Fachkräften der Branche bekannten Techniken extra hergestellt werden. Indirekte Kopplung kann durch verschiedene Methoden erzielt werden. Die Antikörper können mit einem Bauteil eines hochaffinen Bindungssystem, z. B. Biotin, und die Teilchen mit dem anderen Bauteil, z. B. Avidin, gekoppelt werden. Es können auch Antikörper der zweiten Stufe verwendet werden, die artspezifische Epitope der Abreicherungs-Antikörper erkennen, z. B. Anti-Maus-Ig, Anti-Ratten-Ig usw. Indirekte Kopplungsmethoden ermöglichen die Verwendung einer einzelnen magnetisch gekoppelten Antikörperart mit einer Vielzahl von Abreicherungs-Antikörpern.
Die Antikörper werden einer Zellsuspension hinzugefügt und für eine Zeitdauer gebrütet, die für die Bindung der verfügbaren Zelloberflächen-Antigene erforderlich ist. Der Brütvorgang dauert gewöhnlich mindestens eine Minute und gewöhnlich weniger als 30 Minuten. Es ist wünschenswert, über eine ausreichende Konzentration von Antikörpern im Gemisch zu verfügen, so dass die Wirksamkeit der magnetischen Trennung nicht durch den Mangel an Antikörpern eingeschränkt wird. Die geeignete Konzentration wird durch Titration bestimmt.
Sofern ein magnetisch gekoppelter Antikörper der zweiten Stufe verwendet wird, kann die Zellsuspension gespült werden und erneut in einem wie oben beschriebenen Medium gelöst werden, vorbehaltlich einer Inkubation mit den Antikörpern der zweiten Stufe. Ersatzweise, kann der Antikörper der zweiten Stufe unmittelbar dem Reaktionsgemisch hinzugefügt werden. Werden direkt gekoppelte Abreicherungs-Antikörper verwendet, kann die Zellsuspension unmittelbar im nächsten Schritt verwendet oder gespült und erneut in einem Medium gelöst werden.
Die Suspension von magnetisch gekennzeichneten Zellen wird in eine Säule oder Kammer gegeben, wie in WO 90/073890 beschrieben. Die Grundmasse kann aus fest gepackten ferromagnetischen Kugeln, Stahlwolle, Drähten, magnetisch empfänglichen feinen Teilchen usw. bestehen. Die Grundmasse besteht aus einem ferromagnetischen Material, z. B. Eisen, Stahl usw. und kann mit einer wasserdichten Beschichtung versehen sein, um den Kontakt der Zellen mit dem Metall zu verhindern, Die Grundmasse sollte eine ausreichende Oberfläche besitzen, um ausreichende Magnetfeld-Gradienten in der Trennkammer zu erzeugen, um eine wirksame Zurückhaltung der magnetisch gekennzeichneten Zellen zu ermöglichen. Das für eine gegebene Trennung erforderliche Volumen kann empirisch bestimmt werden und wird sich mit der Zellgröße, der Antigendichte auf der Zelloberfläche, der Zellenanzahl, der Antikörper-Affinität usw. verändern.
Die gekennzeichneten Zellen werden an die Grundmasse bei Vorliegen eines Magnetfelds gebunden, üblicherweise bei mindestens 100 mT, häufiger bei etwa 500 mT, gewöhnlich bei nicht mehr als 2 T, häufiger bei nicht mehr als 1 T. Die Quelle des Magnetfelds kann ein Dauer- oder ein Elektromagnet sein. Die nicht gekennzeichneten Zelle werden aus der Säule gespült. Die übriggebliebenen Zellen werden für die Teilgruppe angereichert, die für den gewünschten Marker positiv ist.
Die gebundene Zellbevölkerung kann von der Grundmasse entbunden werden, indem entweder (1) das Magnetfeld beseitigt wird oder (2) ein Freisetzungswirkstoff hinzugefügt wird, der die Zellen von den Mikroteilchen befreit, wobei die vorher beschrieben Bedingungen befolgt werden. Im ersten Fall werden die eluierten Zellen in einem physiologisch annehmbaren Medium gesammelt und anschließend mit Freisetzungswirkstoff behandelt, wobei der Freisetzungsschritt wie oben beschrieben durchgeführt wird. Die freigesetzten Zellen können gespült und wahlweise mit einer Blockierlösung behandelt werden.
Die angereicherte Zellbevölkerung wird anschließend in einem zweiten Trennungsschritt verwendet. Wird eine Anreicherung durchgeführt, erfolgt die Trennung im Wesentlichen wie im ersten schritt beschrieben, allerdings mit weniger Zellen. Nach der Anbindung an die Grundmasse werden die gebundenen Zellen durch Beseitigen des Magnetfeldes und Elution in einem geeigneten Puffermedium freigesetzt Die Zellen können in jedem Medium gesammelt warden, das die Lebensfähigkeit der Zellen erhält. Ist der zweite Trennungsschritt eine Abreicherung, werden die gelösten Zeilen gesammelt, nachdem die Probe über die zweite magnetische Grundmasse geführt wird. Die Zellen können nach Wunsch nach dem Einsammeln gespült und konzentriert werden. Das Verfahren kann nach Bedarf zusätzliche Trennschritte hinzufügen. Ist die Trennung beendigt, können die Zellen sachgemäß verwendet werden. Das Ertragsverfahren wird von der Art der Untersuchung abhängen, die ausgeführt werden soll.
In vielen Fällen wird die Untersuchung an Aliquoten des Originals und getrennten Bevölkerungen durchgeführt, um das Trennverfahren zu verfolgen. Es kann nützlich sein, die Antikörper mit einem Fluorochrom zu kennzeichnen, z. B. Phycoeritrin, FITC, Rhodarnin, Texas-Rot, Allophycocyanin usw. Die Fluorchrom-Kennzeichnung kann ebenfalls verwendet werden zur Miskroskop- bzw. Durchflusscytometrie-Überwachung der Zellzusammensetzung nach den Trennschritten. Die Fluorchrom-Kennzeichnung kann geeigneterweise das gleiche indirekte Kopplungssystem wie die magnetischen Teilchen verwenden.
Um den Bedürfnissen von Forschungs- und Kliniklabors entgegenzukommen, kann ein Bausatz mit dem für die Ausführung der Erfindung erforderlichen Gerät und den Reagentien geliefert werden. Dieser Bausatz enthält den Freisetzungswirkstoff und Mikroteilchen mit der sachgemäßen Beschichtung oder dem Verbindungmittel. Es kann eine geeignete Blockierlösung hinzugefügt werden. Die Mikroteilchen können bereits mit Affinitäts-Reagentien gepaart geliefert werden, z. B. spezifische Antikörper für Zellmarker, Anti-Hapten-Antikörper, Anti-Ig-Antikörper usw. Falls die Mikroteilchen mit Antikörpern der zweiten Stufe gepaart sind, können auch Antikörper der ersten Stufe geliefert werden. Andere gelieferte Teile können Säulen, Puffer für Enzym-Digestion usw. sein. Während Einzelsäulen verwendet werden können, wird vorausgeschickt, dass Mehrfach-Säulen gleichzeitig betrieben werden können und dass auf Wunsch ein Gerät für automatisierte oder manuelle Verfahren für diesen Zweck geliefert werden können.
Die folgenden Beispiele werden zur Veranschaulichung und nicht im einschränkenden Sinn wiedergegeben.
VERSUCHE Materialien und Verfahren
Dextranase. In den Versuchen wurde Dextranase aus einem ausgewählten Stamm von Penicilium sp. (Sigma, St. Louis, Missouri) und aus Penicilium liacinum verwendet. Für die Aussonderung des Enzyms wurden standardmäßige Aussonderungsverfahren angewandt. Ein Aussonderungsverfahren für Dextranase aus Streptococcus sobrinus UAB66 ist in Wanda und Curtiss (1994) J. Bacteriol. 176:3839-3850 beschrieben. Die Präparate hatten eine typische Aktivität von 100–200 Einheiten/mg Protein. Eine Einheit setzt 1.0 Pmole Isomaltose pro Minute bei pH 6 bei 37°C frei, bei Verwendung von Dextran als Substrat.
Direkte Paarung von Antikörpern mit kolloidalen Eisen-Dextran-Teilchen. 3 ml gallertförmige Eisen-Dextran-Mikroperlenschnüre mit verändertem Amino (Amino-Mikroschnüre. Milteny Biotec, Deutschland) wurden mit einer Lösung aus 3 mg SPDP (Pierce) (10mg/ml in DMF) aktiviert und reagierten 60 Minuten bei Raumtemperatur. Die aktivierten Schnüre wurden mittels einer Magnetsäule des Typs AS (Milteny Biotec, Deutschland) ausgesondert und in 3 ml PBS-EDTA eluiert. 500 μg monoklonaler Antikörper reagiert mit Iminothiolan in DMSO unter Bedingungen, bei denen 1–3 SH-Gruppen pro Antikörper eingeführt werden. Das überflüssige Iminothiolan wir durch Dialyse beseitigt. Das SH-modifizierte Protein wird den aktivierten magnetischen Teilchen in einer Konzentration von 10 bis 40 μg pro OD₄₅₀ = 10 hinzugefügt und reagiert 2 Stunden lang bei Raumtemperatur. Das Paarungsergebnis wird in einer Hoch-Gradient-Magnetsäule des Typs AS ausgesondert und in 10 ml PBS-EDTA eluiert. Azid zu 0.05% Massenanteil wird als antimikrobieller Wirkstoff zugesetzt.
Paarung von Antikörpern mit kolloidalen Eisen-Dextran-Teilchen mittels Zusatz von Dextran-Distanzstücken (Distanz-Mikroschnüre). Amino-Mikroschnüre (Milteny Biotec, Deutschland) werden durch Zusatz von 1 mg N-Succinimidyl 3-(2-Pyridyldithium)-Propionat (SDPD; Pierce) pro ml Schnüre 60 Minuten lang bei Raumtemperatur aktiviert (Paarung entsprechend der Spezifikationen des Lieferanten). Das überflüssige SPDP wird durch eine Behandlung in einer AS-Magnettrennsäule beseitigt. Die aktivierten Teilchen werden mit SH-modifiziertem 500 kD Aminodextran (Molecular Probes, Oregon, etwa 0.5 SH-Gruppe pro Dextran-Moleküle) gepaart. Antikörper können mit Amino-Gruppen der gepaarten Dextran-Moleküle wie oben beschrieben gekoppelt werden.
Präparierung von menschlichen PBMC. PBMC wurden aus leukozyten-reichen Leukozytenfilmen durch Zentrifugierung über Ficoll-Paque gewonnen (Pharmacia, Uppsale, Schweden). Nach dem Zentrifugieren, warden Zwischenphasen-Zellen gesammelt, erneut in Puffermedium suspendiert und bei 300 × g sedimentiert, anschließend erneut in Puffermedium suspendiert und bei 200 × g zentrifugiert, um die Plättchen zu beseitigen.
Kennzeichnung von Zellen mit CD34-Distanz-Mikroschnüren und CD34 PE für die erste Trennung. 10₈ PBMC werden 15 Minuten lang bei 8°C mit CD34-Distanz-Mikroschnüren gebrütet, die mit anti-CD34-Antikörpern (QBEnd10) gepaart sind, und zusätzliche zehn Minuten mit Fluorchrom gepaartem CD34-Antikörper (HPCA-2-PE, Becton Dickinson), anschließend einmal mit 10 ml PBS gespült.
Positive Anreicherung von positiven CD34-Zellen durch HGMS (MiniMACS Auslese). Magnetisch gekennzeichnete CD34⁺-Zellen wurden in einer MiniMACS MS-Säule angereichert (magnetisierbare Stahlkugel-Grundmasse), die in einen MiniMACS-Dauermagneten eingebaut war. Um die Wirksamkeit der Zelltrennung beurteilen zu können, wurden Aliquoten von ungetrennten Zellen und von den magnetischen und nicht magnetischen Zellteilgruppen mittels Durchflusscytometrie unter Verwendung eines FACScan untersucht.
Freisetzung der kolloidalen supermagnetischen Teilchen der angereicherten ersten Marker⁺-Zellen. Die magnetische Zellgruppe wurde mit 20 μl einer 20 μg/ml Dextranase-Lösung pro 1 ml Zelllösung 10 Minuten bei 8°C gebrütet. Die Zellen wurden in eine MiniMACS Trennsäule (Miltenyi Biotec) gegeben, um Zellen mit nicht freigesetzten Teilchen zu entfernen. Die nicht magnetische Zellgruppe wurde durch Zentrifugieren gespült (300 × g). 20 μl Stopp-Reagens (10% T40 Dextran (Pharmacia) in PBS) und PBS/BSA/EDTA wurden dem Zellniederschlag bis zu einem endgültigen Volumen von 100 μl hinzugefügt.
Magnetische und fluoreszierende Kennzeichnung mit CD45RA-gepaarten kolloidalen superparamagnetischen Mikroschnüren, CD45RA-PE und CD45RA-FLUOS. Das fluoreszierende Einfärben der nicht-magnetischen Teilgruppe der oben genannten Trennungen wurde durch den Zusatz von CD45Ra-gepaarten kolloidalen superparamagnetischen Mikroschnüren (L48, Becton Dickinson) und einer Brütung von 15 Minuten bei 8°C erzielt. Die Einfärbung des CD45 erfolgte durch anschließende Inkubation mit CD45RA-FLUOS (L48, Becton Dickinson) von 10 Minuten bei 8°C oder mit CD45RA-PE (Klon: L48, Becton Dickinson) von 5 Minuten bei 8°C.
Magnetische und fluoreszierende Kennzeichnung mit CD45RO-gepaarten kolloidalen superparamagnetischen Mikroschnüren, CD45RA-PE und CD45RO-PE. Das fluoreszierende Einfärben der nicht magnetischen Zellgruppe der oben genannten Trennungen wurde durch den Zusatz von CD45RO-gepaarten superparamagnetischen Mikroschnüren (UCHL1, CLB) und einer Inkubation von 15 Minuten bei 8°C erzielt. Die Einfärbung des CD45 erfolgte durch anschließende Inkubation mit CD45RO-PE (UCHL1, CLB) von 5 Minuten bei 8°C.
Magnetische und fluoreszierende Kennzeichnung mit CD4-FITCIsomer 1 und αFITC_Isomer ₁-gepaarten kolloidalen superparamagnetischen Mikroschnüren.. Die fluoreszierende Einfärbung der nicht-magnetischen Teilgruppe der oben erwähnten Trennungen erfolgte durch Zusatz von CD4-FITC_Isomer1 (Leu3a, Becton Dickinson) und einer Inkubation von 7 Minuten bei 8°C. Die magnetische Kennzeichnung erfolgte durch anschließende Inkubation mit FITC_{Isomer 1}-gepaarten kolloidalen superparamagnetischen Mikroschnüren (2f3.1, Samuel, UK; Harmer und Samuel (1989) J. Immunol. Methods 122:115-121) von 15 Minuten bei 8°C.
Magnetische und fluoreszierende Kennzeichnung mit CD4-FITCIsomer 1 und αFITC_Isomer ₁-gepaarten kolloidalen superparamagnetischen Mikroschnüren. Die fluoreszierende Einfärbung der nicht-magnetischen Teilgruppe der obigen Trennungen wurde durch den Zusatz von CD34FITC_{Isomer 1}(QBEnd10, P. Grimsley u. a. (1993) Leukemia 7:898.908) und einer Inkubation von 7 mInuten bei 8°C erzielt. Die magnetische Kennzeichnung erfolgte durch anschließende Inkubation mit αFITC_Isomer ₁-gepaarten kolloidalen superparamagnetischen Mikroschnüren (2f3.1, Samuel, wie oben) von 5 Minuten bei 8°C.
Magnetische Kennzeichnung mit CD34-Digoxigenin (dig) und a-dig-gepaarten kolloidalen superparamagnetischen Mikroschnüren. Die fluoreszierende Einfärbung der nicht magnetischen Teilgruppe der obigen Trennungen wurde durch den Zusatz von CD34-dig- (HPCA2, Becton Dickinson) und einer Inkubation von 7 Minuten bei 8°C erzielt. Die magnetische Kennzeichnung erfolgte durch anschließende Inkubation mit a-dig-gepaarter kolloidalen superparamagnetischen Mikroschnüren (Boehringer, Mannheim) von 15 Minuten bei 8°C:
Positive Anreicherung von positiven Zellen durch HGMS (MiniMACS Auslese). Die Anreicherung erfolgte wie oben für CD34- Zellen beschrieben.
Magnetische und fluoreszierende Kennzeichnung mit HLADR-gepaarten kolloidalen superparamagnetischen Mikroschnüren und HLA-DR-FLUOS. Das fluoreszierende Einfärben der nicht magnetischen Zellgruppe der oben genannten Trennungen wurde durch den Zusatz von 8 μl HLA-DR-gepaarten superparamagnetischen Mikroschnüren (CLB HLA-DR) und einer Inkubation von 15 Minuten bei 8°C erzielt. Die Einfärbung erfolgte durch anschließende Inkubation mit HLA-DR-FLUOS (910/D7 [BMA0122] Behring) von 10 Minuten bei 8°C.
Ergebnisse
Magnetische Trennung von CD45RA, die T-Helferzellen aus PBMC wiedergibt. 5 × 10₇ PBMC in 500 μl PBS/EDTA/BSA wurden für die Dauer von 15 Minuten bei 8°C mit CD4-FITC (Becton Dickinson) gekennzeichnet (Konzentration entsprechend der Angaben des Lieferanten), anschließend mit PBS gespült. Nach dem Zentrifugieren wurden die Zellen erneut in 400 μl PBS gelöst und 100 μl magnetische Mikroteilchen, die wie oben beschrieben präpariert und mit Anti-FITC-Antikörpern (Harmer und Samuel (1989) J. Immunol. Methods 122:1145-121) gepaart wurden, wurden zugesetzt. Die Zellen wurden 15 Minuten bei 8°C gebrütet, anschließend einmal gespült und erneut in 1 ml PBS gelöst.
Die Zellen wurden in einer MiniMACS Trennsäule (MS⁺) getrennt. Die nicht-magnetischen und magnetischen Teilgruppen wurden eingesammelt. Die magnetische positive Teilgruppe, die CD4⁺-T-Helferzellen enthält, wurde mit 20 μl Dextranase-Lösung gebrütet, um die magnetischern Mikro-Teilchen freizusetzen. Diese Zellen wurden in einer MiniMACS-Trennsäule (MS⁺) getrennt, um die Zellen zu beseitigen, die magnetisch gekennzeichnet geblieben waren. Die Zellen der nicht-magnetischen Teilgruppe wurden nach Zentrifigurieren erneut in PBS bis zu einem endgültigen Volumen von 50 μl gelöst und 30 μl Stopp-Reagens wurde hinzugefügt. Die Zelllösung wurde mit magnetischen Mikroteilchen (OD₄₅₀ = 10, 1:200), wie oben beschrieben zubereitet, gebrütet und mit CD45RA-Antikörpern (L48, Becton Dickinson) gepaart. Die fluoreszierende Einfärbung erfolgte anschließend durch Inkubation mit PE gepaarten CD45RA-Antikörper (Becton Dickinson).
Für die Untersuchung mittels Durchflusscytometrie wurde der Probe 1 μl (1 mg/ml) Propidium-Iodid zugesetzt und die Zellen wurden in einem FACScan Durchflusscytometer (Becton Dickinson) untersucht. Abfall und tote Zellen wurden durch Ausblendung ausgeschlossen.
1a zeigt die für die Untersuchung verwendete vorwärts-seitliche Streublende. 1b zeigt die FI-1- verglichen mit der für die Untersuchung verwendete FI-3-Blende. 1c zeigt ein Rasterpunktdiagramm von CD4 (FI-1) verglichen mit CD45RA (FI-2) der Zellen vor der Trennung; 22,5% der Zellen drücken CD4 und CD45RA aus. 1d zeigt ein Rasterpunktdiagramm von CD4 (FI-1) verglichen mit CD45RA (FI-2) der magnetische Teilgruppe nach der CD4-Trennung; 54,4% der Zellen drücken CD4 und CD45RA aus. 1e zeigt ein Rasterpunktdiagramrn von CD4 (FI-1) verglichen mit CD45RA (FI-2) der magnetische Teilgruppe nach der CD45RA-Trennung; > 96,6% der Zellen drücken CD4 und CD45RA aus.
Magnetische Trennung von CD45RO, die T-Helferzellen aus PBMC wiedergibt. 5 × 10⁷ PBMC in 500 μl PBS/EDTA/BSA wurden für die Dauer von 15 Minuten bei 8°C mit CD4-FITC (Becton Dickinson) gekennzeichnet (Konzentration entsprechend der Angaben des Lieferanten), anschließend mit PBS gespült. Nach dem Zentrifugieren wurden die Zellen erneut in 400 μl PBS gelöst und 100 μl magnetische Mikroteilchen, die wie oben beschrieben präpariert und mit Anti-FITC-Antikörpern (Harmer und Samuel (1989) J. Immunol. Methods 122:1145-121) gepaart wurden, wurden zugesetzt. Die Zellen wurden 15 Minuten bei 8°C gebrütet, anschließend einmal gespült und erneut in 1 ml PBS gelöst.
Die Zellen wurden in einer MiniMACS Trennsäule (MS⁺) getrennt. Die nicht-magnetischen und magnetischen Teilgruppen wurden eingesammelt. Die magnetische positive Teilgruppe, die CD4⁺-T-Helferzellen enthält, wurde mit 20 μl Dextranase-Lösung gebrütet, um die magnetischern Mikro-Teilchen freizusetzen. Diese Zellen wurden in einer MiniMACS-Trennsäule (MS⁺) getrennt, um die Zellen zu beseitigen, die magnetisch gekennzeichnet geblieben waren. Die Zellen der nicht-magnetischen Teilgruppe wurden nach Zentrifigurieren erneut in PBS bis zu einem endgültigen Volumen von 50 μl gelöst und 30 μl Stopp-Reagens wurde hinzugefügt. Die Zelllösung wurde mit magnetischen Mikroteilchen (OD₄₅₀ = 10, 1:200), wie oben beschrieben zubereitet, gebrütet und mit CD45RO-Antikörpern (UCHL1) gepaart. Die fluoreszierende Einfärbung erfolgte anschließend durch Inkubation mit PE gepaartem CD45RO-Antikörper (Becton Dickinson).
Für die Untersuchung mittels Durchflusscytometrie wurde der Probe 1 μl (1 mg/ml) Propidium-Iodid zugesetzt und die Zellen wurden in einem FACScan Durchflusscytometer (Becton Dickinson) untersucht. Abfall und tote Zellen wurden durch Ausblendung ausgeschlossen.
2a zeigt die für die Untersuchung verwendete vorwärts-seitliche Streublende. 2b zeigt die FI-1- verglichen mit der für die Untersuchung verwendete FL-3-Blende. 2c zeigt ein Rasterpunktdiagramm von CD4 (FI-1) verglichen mit CD45RO (FI-2) der Zellen vor der Trennung; 27,0% der Zellen drücken CD4 und CD45RO aus. 2d zeigt ein Rasterpunktdiagramm von CD4 (FI-1) verglichen mit CD45RO (FI-2) der magnetischen Teilgruppe nach der CD4-Trennung; 40,4% der Zellen drücken CD4 und CD45RO aus. 2e zeigt ein Rasterpunktdiagramm von CD4 (FI-1) verglichen mit CD45RO (FI-2) der magnetischen Teilgruppe nach der CD45RA-Trennung; 91,2% der Zellen drücken CD4 und CD45RO aus.
Magnetische Anreicherung von CD34⁺-Zellen aus PB-MC mit Antikörpern gegen zwei verschiedeneCD34-Epitope. Dieser Versuch zeigt auf, dass die Reinheit der Zellezubereitung nach der Trennung weiter gesteigert werden kann durch eine zweite Trennung mit einem Antikörper, der ein unterschiedliches Epitop erkennt.
1,5 × 10⁸ PBMC in 1 ml PBS/EDTA mit 4 mg/ml Beriglobin (Behringwerke Marburg, Deutschland) wurden mit Anti-CD34-FITC (QBEnd10, Grimsley u. a. (1993) Leukemia 7:898-908) und mit Digosxigenin, gepaart mit Anti-CD34-Antikörpern (HPCA2, Becton Dickinson) für die Dauer von 15 Minuten bei 8°C gekennzeichnet, anschließend mit PBS gespült. Nach dem Zentrifugieren wurden die Zellen erneut in 500 μl PBS gelöst und 500 μl magnetische Mikroteilchen, die wie oben beschrieben präpariert und mit Anti-FITC-Antikörpern (Harmer und Samuel (1989) J. Immunol. Methods 122:1145-121) gepaart wurden, wurden zugesetzt. Die Zellen wurden 15 Minuten bei 8°C gebrütet, anschließend einmal gespült und erneut in 1 ml PBS gelöst.
Die Zellen wurden in zwei MiniMACS Trennsäulen (MS⁺) getrennt, um die optimale Reinheit der positiv ausgewählten Zellen zu erhalten. Die magnetische positive Teilgruppe, die QBEnd 10-Zellen enthält, wurde mit 20 μl Dextranase-Lösung gebrütet, um die magnetischern Mikro-Teilchen freizusetzen. Diese Zellen wurden in einer MiniMACS-Trennsäule (MS⁺) getrennt, um die Zellen zu beseitigen, die magnetisch gekennzeichnet geblieben waren. Die Zellen der nicht-magnetischen Teilgruppe wurden nach Zentrifigurieren erneut in PBS bis zu einem endgültigen Volumen von 50 μl gelöst und 30 μl Stopp-Reagens wurde hinzugefügt. Die magnetische Kennzeichnung erfolgte durch Zusatz von magnetischen Mikroteilchen (OD₄₅₀ = 10, 1:200), wie oben beschrieben zubereitet, und wurde 8 Minuten lang bei 8°C mit einem α-Digoxygenin-Antikörper (Boehringer Mannheim, Deutschland) gepaart und die fluoreszierende Einfärbung erfolgte durch Inkubation mit PE, gepaart mit α-Digoxygenin-Antikörper (Boehringer Mannheim, Deutschland) von 8 Minuten bei 8°C.
Für die Untersuchung mittels Durchflusscytometrie wurde der Probe 1 μl (1 mg/ml) Propidium-lodid zugesetzt und die Zellen wurden in einem FACScan Durchflusscytometer (Becton Dickinson) untersucht. Abfall und tote Zellen wurden durch Ausblendung ausgeschlossen. Der Gesamt-Anreicherungsanteil ist 13.000- bis 50.000-fach.
3a zeigt die für die Untersuchung verwendete vorwärts-seitliche Streublende. 3b zeigt die FI-2- verglichen mit der für die Untersuchung verwendete FI-3-Blende. 3c zeigt ein Rasterpunktdiagramm von QBEnd 10-FITC (FI-1) im Vergleich mit HPCA2-dig mAB plus α-dig-PE (FI-2) der Zellen vor der Trennung. Weniger als 0,4% der Zellen drücken CD34 aus. 3d zeigt ein Rasterpunktdiagramm von QBEnd 10-FITC (FI-1) im Vergleich mit HPCA2-dig mAB plus α-dig-PE (FI-2) des magnetischen Teils nach der Trennung von CD4. Die Reinheit der Zellen betrug 87,5%. 3e zeigt ein Rasterpunktdiagramm von QBEnd 10-FITC (FI-1) im Vergleich mit HPCA2-dig mAB plus α-dig-PE (FI-2) des magnetischen Teils nach der Trennung von CD45RA. Die Reinheit der Zellen ist besser als 98,2%.
Magnetische Trennung von CD45RA, die blutbildende Stammzellen aus PBMC wiedergibt. 3 × 10⁸ PBMC in 1,5 ml PBS/EDTA/BSA wurden 15 Minuten lang bei 8°C mit α-CD34-FITC (QBEnd10, Grimsley u. a. (1993) Leukemia 7:989-908) gekennzeichnet, anschließend mit PBS gespült. Nach dem Zentrifugieren wurden die Zellen erneut in 750 μl PBS gelöst und 750 μl magnetische Mikroteilchen, die wie oben beschrieben präpariert und mit Anti-FITC-Antikörpern (Harmer und Samuel (1989) J. Immunol. Methods 122:1145-121) gepaart wurden, wurden zugesetzt. Die Zellen wurden 15 Minuten bei 8°C gebrütet, anschließend einmal gespült und erneut in 1 ml PBS gelöst.
Die Zellen wurden in zwei MiniMACS Trennsäulen (MS⁺) getrennt. Die magnetische positive Teilgruppe, die CD34⁺-Zellen enthält, wurde mit 20 μl Dextranase-Lösung gebrütet, um die magnetischern Mikro-Teilchen freizusetzen. Diese Zellen wurden in einer MiniMACS-Trennsäule (MS⁺) getrennt, um die Zellen zu beseitigen, die magnetisch gekennzeichnet geblieben waren. Die Zellen der nicht-magnetischen Teilgruppe wurden nach Zentrifigurieren erneut in PBS bis zu einem endgültigen Volumen von 50 μl gelöst und 30 μl Stopp-Reagens wurde hinzugefügt. Die Zelllösung wurde mit magnetischen Mikroteilchen (OD₄₅₀ = 10, 1:200), wie oben beschrieben zubereitet, gebrütet und mit CD45RA-Antikörpern (L48, Becton Dickinson) gepaart. Die fluoreszierende Einfärbung erfolgte anschließend durch Inkubation mit PE gepaarten CD45RA-Antikörper (L48, Becton Dickinson).
Für die Untersuchung mittels Durchflusscytometrie wurde der Probe 1 μl (1 mg/ml) Propidium-lodid zugesetzt und die Zellen wurden in einem FACScan Durchflusscytometer (Becton Dickinson) untersucht. Abfall und tote Zellen wurden durch Ausblendung ausgeschlossen.
4.1a zeigt die für die Untersuchung verwendete vorwärts-seitliche Streublende. 4.1b zeigt die FI-2- verglichen mit der für die Untersuchung verwendete FI-3-Blende. 4.1c zeigt ein Rasterpunktdiagramm von CD34 (FI-1) verglichen mit CD45RA (FI-2) der Zellen vor der Trennung; weniger als 0,12% der Zellen drücken CD34 und CD45RA aus. 4.1d zeigt ein Rasterpunktdiagramm von CD34 (FI-1) verglichen mit CD45RA (FI-2) der magnetischen Teilgruppe nach der CD4-Trennung; 24,2% der Zellen drücken CD34 und CD45RA aus. 4.1e zeigt ein Rasterpunktdiagramm von CD34 (FI-1) im Vergleich mit CD45RA (FI-2) des magnetischen Teils nach der Trennung von CD45RA.
Mehr als 82.,6% der Zellen drücken CD34 und CD45RA aus.
Magnetische Trennung von CD45RA, die CD34⁺-Zellen aus PBMC wiedergibt. 10⁸ PMBC in 500 μl PBS/EDTA/BSA wurden 15 Minuten lang bei 8°C mit magnetischen Mikropartikeln (OD₄₅₀ = 10, 1:200), wie oben beschrieben zubereitet, gekennzeichnet und mit α-CD34-Antikörper-FITC (QBEnd10, P. Grimsley u. a. (1993) Leukemia 7: 898-908) gepaart, anschließend mit PBS gespült. Die fluoreszierende Einfärbung erfolgte durch anschließende Inkubation von 10 Minuten bei 8°C mit CD34-Antikörper (HPAC2, Becton Dickinson) gepaartem PE und erneute Lösung in 1 ml PBS.
Die Zellen wurden in zwei MiniMACS Trennsäulen (MS⁺) getrennt. Die nicht-magnetischen und magnetischen Teilgruppen wurden eingesammelt. Die magnetische positive Teilgruppe, die CD34⁺-Zellen enthält, wurde mit 20 μl Dextranase-Lösung gebrütet, um die magnetischern Mikro-Teilchen freizusetzen. Diese Zellen wurden in einer MiniMACS-Trennsäule (MS⁺) getrennt, um die Zellen zu beseitigen, die magnetisch gekennzeichnet geblieben waren. Die Zellen der nicht-magnetischen Teilgruppe wurden nach Zentrifigurieren erneut in PBS bis zu einem endgültigen Volumen von 50 μl gelöst und 30 μl Stopp-Reagens wurde hinzugefügt. Die Zelllösung wurde mit magnetischen Mikroteilchen (OD₄₅₀ = 10, 1:200), wie oben beschrieben zubereitet, gebrütet und mit CD45RA-Antikörpern (L48, Becton Dickinson) gepaart. Die fluoreszierende Einfärbung erfolgte anschließend durch Inkubation mit PE gepaarten CD45RA-Antikörper (L48, Becton Dickinson).
Für die Untersuchung mittels Durchflusscytometrie wurde der Probe 1 μl (1 mg/ml) Propidium-lodid zugesetzt und die Zellen wurden in einem FACScan Durchflusscytometer (Becton Dickinson) untersucht. Abfall und tote Zellen wurden durch Ausblendung ausgeschlossen.
4.2a zeigt die für die Untersuchung verwendete vorwärts-seitliche Streublende. 4.2b zeigt die FI-2- verglichen mit der für die Untersuchung verwendete FI-3-Blende. 4.2c zeigt ein Rasterpunktdiagramm von CD45RA (FI-1) verglichen mit CD45RA (FI-2) der Zellen vor der Trennung; weniger als 0,11 % der Zellen drücken CD34 und CD45RA aus. 4.2d zeigt ein Rasterpunktdiagramm von CD45RA (FI-1) verglichen mit CD34 (FI-2) der magnetischen Teilgruppe nach der CD34-Trennung; 10,8% der Zellen drücken CD34 und CD45RA aus. 4.2e zeigt ein Rasterpunktdiagramm von CD45RA (FI-1) verglichen mit CD34 (FI-2) der magnetischen Teilgruppe nach der CD45RA-Trennung; 78,8% der Zellen drücken CD34 und CD45RA aus.
Magnetische Anreicherungvon negativen HLA-DR CD34⁺-Zellen aus PBMC. 10₈ PMBC in 500 μl PBS/EDTA/BSA wurden 15 Minuten lang bei 8°C mit magnetischen Mikropartikeln (OD₄₅₀ = 10, 1:200), wie oben beschrieben zubereitet, gekennzeichnet und mit α-CD34-Antikörper-FITC (QBEnd10, P. Grimsley u. a. (1993) Leukemia 7:898-908) gepaart, anschließend mit PBS gespült. Die floureszierende Einfärbung erfolgte durch anschließende Inkubation von 10 Minuten bei 8°C mit CD34-Antikörpern (HPCA2, Becton Dickinson) gepaartem PE, es folgte eine einmalige Spülung und eine erneute Lösung in 1 ml PBS.
Die Zellen wurden in zwei MiniMACS Trennsäulen (MS⁺) getrennt. Die nicht-magnetischen und magnetischen Teilgruppen wurden eingesammelt. Die magnetische positive Teilgruppe, die CD34⁺-Zellen enthält, wurde mit 20 μl Dextranase-Lösung gebrütet, um die magnetischern Mikro-Teilchen freizusetzen. Diese Zellen wurden in einer MiniMACS-Trennsäule (MS⁺) getrennt, um die Zellen zu beseitigen, die magnetisch gekennzeichnet geblieben waren. Die Zellen der nicht-magnetischen Teilgruppe wurden nach Zentrifigurieren erneut in PBS bis zu einem endgültigen Volumen von 50 μl gelöst und 30 μl Stopp-Reagens wurde hinzugefügt. Diese Zelllösung wurde 15 Minuten lang bei 8°C mit magnetischen Mikropartikeln (OD₄₅₀ = 10, 1:200), wie oben beschrieben, zubereitet, gebrütet und mit α-HLA-DR-Antikörper (CLB, Niederlande) gepaart. Die fluoreszierende Einfärbung erfolgte durch anschließende Inkubation von 10 Minuten bei 8°C mit FLUOS, das mit HLA-DR-Antikörper (910/D7 (BMA022, Behring, Deutschland) gepaart war.
Für die Untersuchung mittels Durchflusscytometrie wurde der Probe 1 μl (1 mg/ml) Propidium-lodid zugesetzt und die Zellen wurden in einem FACScan Durchflusscytometer (Becton Dickinson) untersucht. Abfall und tote Zellen wurden durch Ausblendung ausgeschlossen.
5a zeigt die für die Untersuchung verwendete vorwärts-seitliche Streublende. 5b zeigt die FI-1- verglichen mit der für die Untersuchung verwendete FI-3-Blende. 5c zeigt ein Rasterpunktdiagramm von HLA-DR (FI-1) im Vergleich mit CD34 (FI-2) der Zellen vor der Trennung, 0,2% der CD34-Zellen sind HLADR-positiv. 5d zeigt ein Rasterpunktdiagramm von HLA-DR (FI-1) verglichen mit CD34 (FI-2) der magnetischen Teilgruppe nach der CD34-Trennung; 20,3% der Zellen drücken CD34 und CD45RA aus. 5E zeigt ein Rasterpunktdiagramm von HLA-DR (FI-1) verglichen mit CD34 (FI-2) der magnetischen Teilgruppe nach der CD45RA-Trennung; 39% der Zellen drücken CD34 und CD45RA aus, 56,45% der Zellen sind HLA-DR-positiv.
Aus den obigen Ergebnissen ist ersichtlich, dass die vorliegende Erfindung ein einfaches, schnelles Verfahren für die Durchführung von mehrfachen magnetischen Trennungen liefert. Mehrfache Trennungen können erhöhte Reinheit der getrennten Bevölkerungen liefern, indem sie gegen mehrfache Epitope eines einzelnen Markers gerichtete Antikörper verwenden. Mehrfache Trennungen ermöglichen auch komplexe Trennungen, bei denen positive und negative Trennschritte miteinander verbunden werden. Die Leichtigkeit der Bedienung und die Fähigkeit, die Anzahl und die Größe der Proben zu erhöhen liefern gegenüber den bestehenden Verfahren wichtige Vorteile.

Claims

Verfahren zum Ablösen von Zellen, die durch ein Affinitätsreagens an superparamagnetische Mikropartikel gebunden sind, umfassend: das Kombinieren der Zellen mit einer Glykosidase, die für eine glykosidische Bindung spezifisch ist, die in zumindest einer aus (a) der Beschichtung der Mikropartikel und (b) einer Bindungsgruppe zwischen der Beschichtung und dem Affinitätsreagens vorhanden ist, worin die glykosidische Bindung in normalen Säugetierzellen nicht vorhanden ist; und das Inkubieren der Zellen mit der Glykosidase, um die Mikropartikel von den Zellen abzulösen.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die glykosidische Bindung eine α-(1-6-)-Bindung ist, die in einer Dextranbeschichtung am Mikropartikel vorhanden ist, und das Ablösemittel Dextranase ist.
Verfahren nach Anspruch 2, worin das Affinitätsreagens ein Antikörper ist, der für einen Zelloberflächenmarker an den Zellen spezifisch ist.
Verfahren nach Anspruch 3, worin die Zellen Säugetierzellen sind.
Verfahren nach Anspruch 4, worin die Zellen hämatopoetische Zellen sind.
Verfahren nach Anspruch 5, worin der Antikörper für CD4 oder CD71 spezifisch ist.
Verfahren zur Abtrennung einer Säugetierzellpopulation-Untergruppe aus einem Gemisch von Zellen unter Verwendung von Hochgradienten-Magnetsortierung, umfassend: (a) das Duchführen eines ersten Selektionsverfahrens, das: das Kombinieren des Zellgemisches mit einem Antikörper, der für ein erstes Zelloberflächenantigen spezifisch ist, das von der Zellpopulation-Untergruppe exprimiert wird, gebunden an ein superparamagnetisches Mikropartikel, das mit einem Polysaccharid mit einer glykosidischen Bindung beschichtet ist, die in normalen Säugetierzellen nicht vorhanden ist; das Hindurchführen des Zellgemsiches durch eine ferromagnetische Matrix in Gegenwart eines Magnetfeldes, worin die von den Antikörpern gebundenen Zellen zurückgehalten werden, das Waschen der Matrix, um ungebundene Zellen zu entfernen; das Eluieren der Zellpopulation-Untergruppe aus der Matrix; das Kombinieren der eluierten Zellpopulation mit einer Glykosidase, die in der Lage ist, die glykosidische Bindung zu spalten; und das Inkubieren der eluierten Zellpopulation mit der Glykosidase, um die Zellen abzulösen, umfasst; und (b) das Durchführen eines zweiten Selektionsverfahrens das: das Kombinieren des Zellgemisches mit einem Antikörper, der für ein zweites Zelloberflächenantigen oder ein zweites Epitop von diesem ersten Zelloberflächenantigen spezifisch ist, das von der Zellpopulation-Untergruppe exprimiert wird, gebunden an ein superparamagnetisches Mikropartikel; das Hindurchführen des Zellgemisches durch eine ferromagnetische Matrix in Gegenwart eines Magnetfeldes, worin die an den Antikörper gebundenen Zellen zurückgehalten werden, und das Gewinnen von zumindest einer der gebundenen oder ungebundenen Zellpopulation umfasst; worin die Zellpopulation-Untergruppe im Vergleich zum ursprünglichen Gemisch angereichert ist.