DE2219778B2 - Verfahren zur Ermittlung physiologischer Eigenschaften nativer Blutzellen und Anordnung zur Durchführung des Verfahrens - Google Patents

Description

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Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Ermittlung physiologischer Eigenschaften nativer Blutzellen, die in einem Elektrolyten suspendiert sind.

Unter dem Namen seines Erfinders — Coulter — ist ein elektronisch arbeitendes Meßverfahren zur Bestimmung der Volumengrößen von in einer elektrolytischen Untersuchungsflüssigkeit suspendierten Partikeln bekannt geworden, das mit Hilfe von zwei Gefäßen arbeitet, die durch eine kleine Meßöffnung miteinander verbunden sind. Die Untersuchungsflüssigkeiit fließt so durch diese Meßöffnung von dem einen Gefäß in das andere. In die Untersuchungsflüssigkeit tauchen zu beiden Seiten der Meßöffnung Elektroden unterschiedlichen Potentials ein, die an einen elektrischen Meßkreis angeschlossen sind. Die Leitfähigkeit der Untersu- « chungsflüssigkeit zwischen den Elektroden ändert sich beim Durchtritt eines Partikels durch die Meßöffnung DroDortional mit dem Volumen des Partikels. womit eine Volumenbestimmung der in der Untersuchungsflüssigkeit suspendierten Partikel möglich ist

Die von Coulter angegebene Vorrichtung wurde inzwischen weiterentwickelt So ist 7. B. aus der DE-AS 18 06 512 eine nach dem Coulter Verfahren arbeitende Vorrichtung bekannt, bei der die Partikel nicht der Elektrolytflüssigkeit in dem Gefäß vor der Meßöffnung beigemengt sind, sondern der Meßöffnung durch eine eigens dafür vorgesehene Zuführungseinrichtung zugeleitet werden, die eine Austrittsöffnung in sehr geringem Abstand vor der Meßöffnung hat, so daß der in die Meßöffnung einfließende Elektrolyt Probensuspension aus der Austrittsöffnung der Zuführungseinrichtung heraussaugt Es Findet dann ein hydrodynamischer Fokussiervorgang statt wodurch bewirkt wird, daß alle zu zählenden Partikel nahezu im Zentrum der Meßöffnung durch diese hindurch wandern. Durch eine derartige Anordnung wird eine erhebliche Steigerung der Meßgenauigkeit erreicht

Bei der Bestimmung des mittleren Zellvolumens lebender Zellen ergaben sich insbesondere bei der Bestimmung von Säugetiererythrozyten Diskrepanzen zwischen der elektronischen Volumenbestimmung nach dem Coiiltei-Verfahren und der physikalischen Bestimmung über Hämatokrit und Zellzahl. Es wurde eine Unterbewertung der Zellvolumina bei der Messung mit dem Coulter-Verfahren festgestellt. Man hat dies zunächst allem auf die Form und Verformbarkeit der zu untersuchenden Zellen zurückgeführt und entsprechende Korrekturen in den Meßergebnissen vorgesehen, denn der Einfluß von Form und Verformbarkeit der Zellen ist zweifellos gegeben. Dennoch wurden nach dieser Korrektur bei der Messung nativer Zellen noch immer Diskrepanzen der genannten Art festgestellt, die bei der Messung fixierter Zellen jedoch nicht auftraten.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein neuartiges Verfahren zur Ermittlung physiologischer Eigenschaften nativer Blutzellen anzugeben, die in einem Elektrolyten suspendiert sind.

Diese Aufgabe wird gemäß der Erfindung dadurch gelöst, daß der spezifische elektrische Widerstand der Suspension als Funktion der elektrischen Feldstärke gemessen wird und jene diskreten Feldstärken bestimmt werden, bei denen sprunghafte Änderungen des spezifischen elektrischen Widerstandes der Suspension auftreten.

Es wurde eingangs schon erwähnt, daß man bei der Partikelvolumenanalyse nach dem Coulter-Verfahren in dem bei einer Coulter-Anordnung verwendeten elektrischen Meßkreis volumenproportionale oder nahezu volumenproportionale Stromänderungen beim Durchtritt eines Partikels durch die Meßöffnung erhält. In der Praxis geht man dabei so vor, daß man eine bestimmte Potentialdifferenz zwischen den beiden Elektroden, die zu beiden Seiten der Meßöffnung in der Elektrolytflüssigkeit angeordnet sind, einstellt, wodurch sich ein bestimmter Strom, der durch die Elektrolytflüssigkeit von der einen Elektrode zur anderen durch die Meßöffnung hindurchfließt, ergibt. Bei konstanter Potentialdifferenz zwischen den beiden Elektroden ändert sich diese Stromstärke beim Durchtritt eines Partikels durch die Meßöffnung, sofern die Leitfähigkeit des Partikels eine andere ist als die Leitfähigkeit des das Partikel umgebenden Elektrolyten. Man mißt also im Grunde einen bestimmten elektrischen Widerstand zwischen den beiden Elektroden, der sich verändert, wenn ein Partikel sich in der Meßöffnung befindet. Dieser Widerstand ist selbstverständlich von der Art des

verwendeten Elektrolyten und von der Konzentration der in diesem suspendierten Partikel abhängig.

Vergrößert man z. B. die Potentialdifferenz zwischen den beiden Elektroden, so vergrößert sich linear hiermit auch der Strom durch den Elektrolyten, sofern nicht dessen Leitfähigkeit durch eine durch höheren Strom bewirkte Erwärmung verändert wird.

Entsprechend der Stromvergrößerung im Elektrolyten vergrößern sich auch die Stromunterschiede im Meßkreis beim Durchtritt eines Partikels durch die Meßöffnung. ,Mat man dem Elektrolyten z. B. Latexpartikel beigemischt, so stellt man fest, daß die Stromänderungen linear mit dem Strom im MeSkreis anwachsen. Bewertet man nur das Verhältnis von Stromänderungen zu Strom im Meßkreis, so geht der absolute spezifische Widerstand des Meßkreises, d. h. der Elektrolytenstrekke im Meßkreis, nicht mehr in die Messung ein. Einflüsse durch Temperaturerhöhungen des Elektrolyten sind hiennit ausgeschaltet. Es findet damit eine Bewertung der relativen Änderung des spezifischen Widerstandes der Elektrolytstrecke in der Meßöffnung statt Damit ist eine nach dem Coulter-Verfahren arbeitende Anordnung in hervorragender Weise geeignet, zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Ermittlung von physiologischen Eigenschaften nativer Blutzellen herangezogen zu werden. Führt man nämlich die soeben am Beispiel von Latexpartikeln erläuterte Messung mit nativen Blutzellen durch, so stellt man fest, da 3 das Verhältnis von Stromänderung zu Stromstärke für eine gegebene Partikelart, z. B. Erythrozyten nicht unabhängig von der eingestellten Stromstärke ist Das bedeutet, daß die Leitfähigkeit oder der spezifische Widerstand des sich in der Meßöffnung befindenden Untersuchungsflüssigkeits-Volumens, in dem ein Partikel enthalten ist, nicht unabhängig von der Stromstärke ist. Hiermit erklärt sich auch die eingangs erwähnte, zwischen nativen und fixierten Zeilen auftretende Diskrepanz.

Die genannten Stromänderungen werden beim Coulter-Verfahren als Impulse erfaßt Man braucht also nur die Impulshöhen über der Stromstärke aufzutragen, um festzustellen, in welcher Weise die Impulshöhen von der eingestellten Stromstärke abhängig sind. Dabei stellt man fest, daß von der Stromstärke Null beginnend die Impulse zunächst linear mit der Stromstärke anwachsen. Ab einer bestimmten Stromstärke wachsen die Impulse jedoch nicht in gleichem Maße wie die Stromstärke an, sondern langsamer. Trägt man die Funktion in einer Graphik auf, so stellt man fest, daß für jede Art von untersuchten Blutzellen ein ausgeprägter so Knick im Kurvenverlauf vorhanden ist. Die Lage dieses Knickpunktes läßt für die einzelne Blutzellart Rückschlüsse auf deren Zustand zu. So wurde festgestellt, daß die Knickpunkte bei verschiedenen Personen bei verschiedenen Stromstärken liegen. Es konnte auch festgestellt werden, daß die Knickpunkte für die verschiedenen Blutzellarten ebenfalls bei verschiedenen Stromstärken liegen.

Diese Phänomene, die bei fixierten Blutzellen nicht auftreten, können nur dadurch bedingt sein, daß bei höheren Stromstärken, das bedeutet bei einer höheren Feldstärke, der die einzelne Blutzelle ausgesetzt ist, eine Änderung im Isolationsverhalten der Blutzellen eintritt. Es wird vermutet, daß ein lonendurchbruch durch die Zellmembran stattfindet, und daß dadurch die Leitfähig- b5 keit der untersuchten Blutzelle erhöht wird.

Der genannte Effekt der gemäß der Erfindung für die Bestimmung physiologischer Eigenschaften nativer Blutzellen herangezogen werden soil, wurde bislang noch nicht beobachtet Dies mag seine Ursache darin haben, daß bei den bislang verwendeten Methoden der Leitfähigkeitsuntersuchung von Blut die hohen Feldstärken, die zu dem vermuteten lonendurchbruch durch die Zellmembran führen, nicht auftreten. Bei Messungen mit einer nach dem Coulter-Verfahren arbeitenden Anordnung werden jedoch bereits bei verhältnismäßig niedrigen Spannungen, z. B. bei einer Potei.tialdifferenz zwischen den beiden Elektroden von 20 Volt aufgrund der geringen Abmessungen der Meßöffnung in dieser Feldstärken von etwa 2 kV/cm hervorgerufen. Die Ströme, die dabei fließen, liegen in der Größenordnung von etwa 1 mA. Die in Wärme umgesetzte Energie in der Meßöffnung ist daher denkbar gering. Eine nach dem Coulter-Verfahren arbeitende Anordnung ist daher besonders geeignet das Verfahren nach der Erfindung zu vollziehen. Besonders vorteilhaft eignet sich hierzu eine nach dem Coulter-Verfahren arbeitende Anordnung, bei der die Partikel durch eine eigens dafür vorgesehene Zuruhrungseinrichtung der MeQöffnung zugeleitet werden. Der Elektrolyt in dem Gefäß vor der Meßöffnung ist dabei partikelfrei. Die Zuführungseinrichtung weist eine öffnung auf, die der Meßöffnung zugekehrt ist Die Partikel, die aus dieser Zuführungseinrichtung austreten, werden durch den in die Meßöffnung einfließenden Elektrolyten hydrodynamisch in das Zentrum der Meßöffnung hineinfokussiert. Dabei kann gemäß der Lehre der DE-AS 18 06 512 der Abstand der Austrittsöffnung der Zuführungseinrichtung zur Meßöffnung derart klein gemacht werden, daß der in die Meßöffnung einfließende Elektrolyt die Probensuspension aus der öffnung der Zuruhrungseinrichtung heraussaugt wodurch die Fokussierung in das Zentrum der Meßöffnung besonders gut wird. Die durch die hydrodynamische Fokussierung erreichten Meßgenauigkeitssteigerungen sind erheblich.

Eine Anordnung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht daher aus einer der bekannten nach dem Coulter-Verfahren arbeitenden Vorrichtungen mit oder ohne getrennte Partikelzuführung und einer Einrichtung, mit der der genannte Potentialunterschied zwischen den Elektroden, die bei diesen Anordnungen vorgesehen sind, veränderbar ist Vorzugsweise ist im elektrischen Meßkreis eine Auswerteeinrichtung vorzusehen, mit deren Hilfe die Impulsamplituden, d. h. die Stromänderungen entsprechend der verschiedenen in der Probensuspension vorhandenen Blutzellpopulationen getrennt erfaßbar sind und mit der eine Zuordnung der Impulsamplituden zu dem jeweils herrschenden Potentialunterschied zwischen den Elektroden durchführbar ist Mit einer solchen Anordnung wäre das Meßverfahren weitgehend automatisierbar.

Wie bereits erwähnt, findet die Änderung im Leitfähigkeitsverhalten der Blutzellen sehr plötzlich statt. In den Kurven, die man aufnehmen kann, äußert sich das in einem Knick. Dieser Knick liegt für eine bestimmte Blutzellsorte für verschiedene Personen bei verschiedenen Feldstärken. Ebenso liegen die Knickpunkte der verschiedenen Blutzellsorten ebenfalls bei verschiedenen Feldstärken. Hierauf wurde bereits hingewiesen. Die Lage der Knickpunkte gibt daher Aufscnlüsse über die Art und den Zustand der verschiedenen Blutzellen. Man hat damit ein Mittel in der Hand, wie man z. B. den Medikamenteneinfluß auf die Blutzellen kontrollieren kann.

Das Verfahren nach der Erfindung und eine

vorteilhafte Anordnung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens seien anhand der Zeichnungen noch einmal kurz erläutert.

F i g. 1 zeigt den Widerstandsverlauf einer mit Blutzellen versetzten Elektrolytflüssigkeit, wenn man ihn unter gegebenen Bedingungen bei verschiedenen Stromstärken aufnimmt. Dabei zeigt sich, daß bei verschiedenen Stromstärken, die in der Fi g. 1 mit l\ und /₂ bezeichnet sind, eine sprunghafte Änderung des Widerstandes auftritt. Die Ursache hierin wird — wie bereits erwähnt — darin gesehen, daß die Leitfähigkeit der Blutzellen erhöht und damit der Widerstand der gesamten Untersuchungsflüssigkeit herabgesetzt wird.

Die F i g. 2 zeigt eine nach dem Coulter-Verfahren arbeitende Anordnung mit getrennter Partikeizuiuhrung. Von einem Gefäßraum 1 fließt Elektrolytflüssigkeit 2 durch eine kleine Meßöffnung 3 in einen Gefäßraum 4. In geringem Abstand vor der Meßöffnung 3 ist die Austrittsöffnung einer Zuführungseinrichtung 5 vorgesehen, in der eine Blutprobe enthalten ist. Die in die Meßöffnung 3 einfließende Elektrolytflüssigkeit 2 saugt beim Vorbeifließen an der Austrittsöffnung der Zuführungseinrichtung 5 die Blutprobe aus dieser Zuführungseinrichtung heraus und transportiert sie im Zentrum der Meßöffnung 3 durch diese hindurch. In die Elektrolytflüssigkeit zu beiden Seiten der Meßöffnung tauchen Elektroden 6 und 7 ein, die gegeneinander unterschiedliches Potential aufweisen und an einen elektrischen Meßkreis angeschlossen sind. Eine solche Anordnung ist z. B. in der DE-AS 18 06 512 beschrieben. Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist jedoch in der elektrischen Einrichtung 8, mit Hilfe deren die Messungen durchgeführt werden, eine Einrichtung vorgesehen, mit Hilfe der die Potentialdifferenz zwischen den Elektroden 6 und 7 verändert werden kann. Weiterhin sind in der Einrichtung 8 Mittel vorgesehen, mit deren Hilfe die durch das Hindurchtreten von Partikeln durch die Meßöffnung 3 hervorgerufenen Stromänderungen bei jeder eingestellten Potentialdifferenz festgehalten werden können, um sie den verschiedenen Blutzellarten zuordnen zu können. Weiterhin sind in der Einrichtung 8 Mittel vorgesehen, die als Funktion der Potentialdifferenz zwischen den Elektroden 6 und 7 die absoluten oder relativen Stromänderungen für die einzelnen Blutzellarten aufnehmen und diejenigen Potentiale festhalten, bei denen für die einzelnen Zellarten eine sprunghafte Änderung im Verhalten der Stromänderungen bezüglich der Potentialdifferenz festgestellt wird. Auf diese einzelnen Mittel braucht hier nicht eingegangen zu werden, da sie für einen Fachmann, der mit derartigen

ίο elektronischen Meßproblemen vertraut ist, nichts Ungewöhnliches darstellen.

In der Fig.3 ist für verschiedene Partikel, die mit einer solchen Vorrichtung untersucht wurden, der jeweils zugehörige Verlauf der sich ergebenden Strcrnändcrungsaniplituder· A über der Stromstärke .' aufgezeichnet. In dieser Darstellung bedeutet die gestrichelte Linie den Kurvenverlauf für native Erythrozyten, wie man ihn normalerweise erwartet. Dieser Kurvenverlauf ist mit 9 bezeichnet. Dabei stellt man fest, daß ab einer bestimmten Stromstärke /* dieser Verlauf nicht mehr den Erwartungen folgt. Vielmehr werden die Stromänderungsamplituden A nicht mehr in gleichem Umfange größer wie die Stromstärke. Im Kurvenverlauf bildet sich ein ausgesprochener Knick heraus, der in der Darstellung durch einen Pfeil hervorgehoben ist. Der zugehörige Kurvenverlauf ist mit 10 bezeichnet. Der strichpunktierte Verlauf 11 gibt denjenigen an, den man bei der Messung fixierter Erythrozyten erhält. Bei diesen Zellen läßt sich der

jo erwähnte Effekt nicht feststellen, die Stromänderungsamplituden beim Durchtritt der Partikel durch die Meßöffnung wachsen linear mit der eingestellten Stromstärke. Die punktierte Linie 12 schließlich ist eine solche, wie sie bei der Messung von Latexpartikeln

J5 gewonnen wird. Diese Partikel sind völlig neutral, daher zeigt die Kurve einen völlig linearen Verlauf. Bei nativen Erythrozyten läßt — wie bereits erwähnt — die Lage des Knickpunktes Rückschlüsse auf die untersuchte Zelle zu. Weiterhin ist in der Größe der Steigung nach dem Knickpunkt im Kurvenverlauf eine weitere Beurteilungsmöglichkeit für die untersuchte Blutzellarl gegeben.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims (5)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Ermittlung physiologischer Eigenschaften nativer Blutzellen, die in einem Elektrolyten suspendiert sind, dadurch ge- s kennzeichnet, daß der spezifische elektrische Widerstand der Suspension als Funktion der elektrischen Feldstärke gemessen wird und jene diskreten Feldstärken bestimmt werden, bei denen sprunghafte Änderungen des spezifischen elektrisehen Widerstandes der Suspension auftreten.

2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Anwendung des sogenannten Coulter-Verfahrens in der Weise, daß die Impulsamplituden bei verschiedenen Feldstärken bestimmt werden. ι s

3. Anordnung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß eine nach dem sogenannten Coulter-Verfahren arbeitende Vorrichtung zum Zählen und Klassieren von in einer elektrolytischen Untersuchungsflüssigkeit suspendierten Partikeln vorgesehen ist, bestehend aus zwei Gefäßen zur Aufnahme der Untersuchungsflüssigkeit, die durch eine kleine Meßöffnung miteinander in Verbindung stehen, und einer Einrichtung zum Erzeugen einer Druckdifferenz zwischen den Gefäßen und zwei in die Untersuchungsflüssigkeit in den Gefäßen eintauchenden Elektroden unterschiedlichen Potentials, die an einen elektrischen Meßkreis angeschlossen sind, und daß Mittel vorgesehen sind, mit denen der genannte Potentialunterschied veränderbar ist

4. Anordnung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Elektrolytflüssigkeit in dem Gefäß größeren Druckes partikelfrei ist und daß eine Zuführungseinrichtung für partikelhaltige Suspension vorgesehen ist, die eine Austrittsöffnung stromaufwärts vor der Meßöffnung aufweist

5. Anordnung nach einem der Ansprüche 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet daß int elektrischen Meßkreis eine Auswerteeinrichtung vorgesehen ist mit deren Hilfe die Impulsamplituden entsprechend der verschiedenen in der Probensuspension vorhandenen Blutzellpopulationen getrennt erfaßbar sind und eine Zuordnung der Impulsamplituden zu dem jeweils herrschenden Potentialunterschied zwischen «5 den Elektroden durchführbar ist