CH620519A5

CH620519A5 -

Info

Publication number: CH620519A5
Application number: CH1284577A
Authority: CH
Inventors: Volker Dr Kachel; Ewald Glossner
Original assignee: Max Planck Gesellschaft
Priority date: 1976-12-14
Filing date: 1977-10-21
Publication date: 1980-11-28
Also published as: GB1585295A; JPS5374476A; DE2656654C3; DE2656654B2; US4198160A; DE2656654A1; JPH0114531B2

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Messung von mindestens zwei Parametern von in einer Partikelsuspension suspendierten Partikeln der im Oberbegriff des Patentanspruchs 1 angegebenen Art.

Derartige Vorrichtungen sind bekannt (US-PS 3 710 933 ; Steinkamp u.a., Rev. Sei. Instrum., Bd. 44, Nr. 9 (September 1973, S. 1301-1310, vgl. insbes. Fig. 2 auf S. 1302). Es handelt sich um eine Kombination einer Messung nach dem Coulter-Prinzip mit einer Fluoreszenz-Messung mit Hilfe der optischen Einrichtung. Dabei wird der Partikelstromfaden vor der Messöffnung, in der das Partikel-Volumen gemessen wird, an Beobachtungsfenstern vorbeigeführt, durch die auf die Partikel eine anregende Strahlung, z.B. eine Laserstrahlung, fällt und die dabei induzierte Fluoreszenz gemessen wird; an derselben Stelle kann auch eine Messung der Lichtstreuung erfolgen. Es werden also zwei Parameter, nämlich das Volumen und die Fluoreszenz, an zwei hintereinander angeordneten Messstellen gemessen. Bei der Auswertung ist es wichtig, die Messergebnisse für einen Parameter den Messergebnissen für den anderen Parameter zuzuordnen. Bei der Auswertung der an den beiden Messstellen gemessenen Messergebnisse muss die Laufzeit des Partikels zwischen beiden Messstellen berücksichtigt werden (vgl. dazu US-PS 3 710 933, Spalte 10, Zeilen 31-34). Darin ist ein schwerer Nachteil; die Laufzeit, die genau eingestellt sein muss, hängt insbesondere von verschiedenen Einflussgrössen, z.B. Strömungsgeschwindigkeit des Mediums, Temperatur, Druckdifferenz usw. ab, die alle Quellen für mögliche Messfehler sind.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Vorrichtung der eingangs genannten Art zu schaffen, bei der Verfälschungen der Auswertung der Messergebnisse zweier Messungen infolge unterschiedlicher oder nicht genau bestimmbarer Laufzeiten der Partikel zwischen den zwei Messstellen, an denen die verschiedenen Messungen vorgenommen werden, praktisch ausgeschaltet sind.

Bei den eingangs genannten bekannten Vorrichtungen sind die Verbesserungen, die sich dadurch erzielen lassen, dass man die beiden Messstellen möglichst nahe zueinander legt, nicht ausreichend.

Erfindungsgemäss wird die Aufgabe durch die im Kennzeichen des Patentanspruchs 1 angegebenen Merkmale gelöst.

Mit einer derartigen Anordnung wird es möglich, die Messung nach dem Coulter-Prinzip und die optische Messung praktisch an einer Stelle, nämlich in der Ebene des in Strömungsrichtung unteren Endes der Messöffnung durchzuführen. Der Impuls für die optische Messung fällt praktisch in die Rück-flanke des Impulses der Volumenmessung in der Messöffnung, so dass eine eindeutige Zuordnung der den beiden Parametern eines Partikels entsprechenden Messergebnisse ohne Fehler möglich ist. Die eindeutige Zuordnung von zwei Messwerten eines Partikels erlaubt es auch, diese eindeutig in Beziehung zu setzen. Ist z.B. die Fluoreszenz eines Partikels seinem Gehalt eines bestimmten Wirkstoffes (z.B. RNS) proportional, so kann man aus der gemessenen Menge und dem Volumen die Konzentration des Wirkstoffes in den Partikeln bestimmen. Das kann durch einen einfachen Rechner geschehen.

Es ist zwar an sich bekannt, die die Partikel transportierende Strömung nach Austritt aus einer Düse oder Bohrung im wesentlichen rechtwinklig umzulenken und derart eine Messstelle für eine optische Einrichtung zu bilden (DE-OS 1 815 352; 1 919 628). Diese Vorrichtungen haben jedoch nicht zwei Messungen, von denen eine nach dem Coulter-Prinzip erfolgt; sie legen dies auch nicht nahe, da sie die Messung des Volumens nach dem Coulter-Prinzip ausdrücklich als zu ungenau bezeichnen und durch eine photometrische Messung ersetzen (vgl. DE-OS 1 815 352, S. 3, Z. 10 ff). Anregungen zur Lösung der dargestellten Aufgabe der Berücksichtigung der Laufzeit eines Partikels zwischen den zwei verschiedenen Messstellen bei Vorrichtungen der eingangs genannten Art sind daraus nicht zu entnehmen

Ein Ausführungsbeispiel der Erfindung und ihrer vorteilhaften Weiterbildungen sind im folgenden an Hand der beigefügten Zeichnungen beschrieben. Es stellen dar: _

Fig. 1 ein Ausführungsbeispiel der Vorrichtung;

Fig. 2 einen vergrössert dargestellten Teil des Ausführungsbeispiels nach Fig. 1 ;

Fig. 3 den zeitlichen Verlauf von zwei Impulsen, die sich bei Messung des Volumens und der Fluoreszenz eines Partikels ergeben;

Fig. 4 eine Photographie der Bildanzeige einer Vielzahl von Impulsen nach Fig. 3 auf einem Oszillographen;

Fig. 5 eine Photographie der Bildanzeige eines 2-Parame-ter-Vielkanalanalysators, der die Messergebnisse für Volumen und Fluoreszenz einer Probemenge kultivierter Ratten-Nerven-zellen anzeigt;

Fig. 6 ein Blockschaltbild der Auswertevorrichtung.

Die Vorrichtung nach Fig. 1 besteht aus einem Tank 1 für partikelfreien Elektrolyt 2 mit einer Entlüftungsöffnung 3, der über eine Leitung 4 mit einer ersten Tropfenkammer 5 in Verbindung steht. In dieser ist ein Schwimmer 6 mit einer Nadel 7 vorgesehen; bei Ansteigen des Flüssigkeitspegels verschliesst die Nadel 7 die Öffnung 8. Dadurch wird zwischen Elektrolyt in der Tropfenkammer 5 und im Tank 1 eine galvanische Trennung bewirkt und gleichzeitig erreicht, dass der Flüssigkeitspegel in der Tropfenkammer — bezogen auf die Halterungsplatte 5 ' — stehts einen bestimmten Wert hat. Die Tropfenkammer 5 steht über die Leitung 9 mit einer Kammer 11 in Verbindung und führt dieser stetig Elektrolyt zu. Die Tropfenkammer 5 ist ferner an einer Schiene 12 mit Hilfe einer Schaube 13 höhenverstellbar und -einstellbar. Da der Pegel des Elektrolyten in der Tropfenkammer 5 stets gleich ist, kann durch diese Höhenverstellung der Tropfenkammer 5 der Druck in der Kammer 11

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eingestellt werden. Der Tank 1 steht ferner über eine zweite Leitung 112, eine zweite Tropfenkammer 113 und eine weitere Leitung 15 mit einer Kammer 16 in Verbindung. Die Leitung 112 kann durch eine Klemmschraube 14 unterbrochen werden. Die Verbindung mündet zunächst in einer etwas verbreiterten Vorkammer 15'. Über diese Verbindung wird der Kammer 16 stetig Elektrolyt zugeführt. Die Kammer 16 weist ferner ein Abflussrohr 17 auf, an der eine (nicht gezeigte) Unterdruckquelle anliegt, die einen bestimmten Sog erzeugt. Die erste Kammer 11 und die zweite Kammer 16 stehen ferner über eine Messöffnung 18 in Verbindung. Kurz vor der Messöffnung 18 endet mit ihrer Austrittsöffnung eine Kapillare 19, die zur Zuführung von Partikelsuspension dient. Die Partikelsuspension befindet sich in einem Behälter 20, der mit der Kappilare 19 in Verbindung steht. In der Kammer 16 befindet sich ferner eine Spülkapillare 21 und ein Entlüftungsrohr 22.

Sorgt man nun durch entsprechende Einstellung des Unterdrucks am Abflussrohr 17 dafür, dass der Druck in der Kammer 16 niedriger als in der zweiten Kammer 11 ist, so strömt Elektrolyt von der Kammer 11 durch die Messöffnung 18 in die Kammer 16. Diese Strömung verengt sich vor der Messöffnung 18. Ist ferner der Druck der Partikelsuspension in der Kapillare 19 etwas grösser als in der Kammer 11, so tritt die Partikelsuspension aus der Kapillare 19 in die sich zur Messöffnung 18 hin verjüngende Strömung aus und wird durch diese verengt (hydrodynamische Fokussierung) und durch die Messöffnung hindurch transportiert. In der Kammer 11 ist eine erste Elektrode 23 und in der Kammer 16 eine zweite Elektrode 24 vorgesehen. Die Elektrode 24' in der Vorkammer 15' ist zur Elektrode 24 parallelgeschaltet dadurch, dass die zugeordneten Klemmen 24a und 24b verbunden sind. Zwischen beiden fliesst ein Strom i, der von einer Stromquelle 125 eingeprägt ist. Tritt ein Partikel durch die Messöffnung 18 hindurch, so findet in der Messöffnung 18 eine Verdrängung des elektrischen Feldes und damit eine Widerstandsänderung auf, die bei eingeprägtem Strom i zu einem Spannungsimpuls zwischen den Elektroden 23,24 führt. Die Höhe dieses Spannungsimpulses uv (Fig. 3) ist ein Mass für das Volumen des Partikels. Dieser Spannungsimpuls wird in einem Verstärker 25 verstärkt und einer (nicht gezeigten) Auswerteeinheit, die die Impulse nach ihrer Höhe klassifiziert und auswertet, zugeführt.

Die Kammer 16 ist in einem Block 26 vorgesehen. Die Kammer 16 weist eine Öffnung 27 auf, die mit einer Glasplatte 28 abgedeckt ist. Die Glasplatte wird durch Klemmen 29 gehalten. Hinter der Glasplatte 28 ist eine optische Einrichtung 30 angeordnet. Die Anordnung bzw. Einstellung dieser optischen Einrichtung 30 ist derart, dass die aus der Messöffnung 18 heraustretenden Partikel im Tiefenschärfebereich der optischen Einrichtung liegen. Von den Eigenschaften der optischen Einrichtung hängt auch der Abstand des in Strömungsrichtung hinteren Endes 18' zur Glasplatte 28 ab; er beträgt z.B. lOOfx — 30 mm. Die Partikel werden durch diese optische Einrichtung 30 mit anregender Strahlung, z.B. einer Laserstrahlung, angestrahlt; durch dieselbe optische Einrichtung wird die damit induzierte Fluoreszenz gemessen. Derartige optische Einrichtungen sind bekannt, so dass auf ihre nähere Beschreibung im vorliegenden Falle verzichtet werden kann. Damit wird, wie erwähnt, z.B. die Fluoreszenz gemessen ; ferner kann damit auch das Streulicht gemessen werden. Die mit dieser optischen Einrichtung 30 gemessenen Impulse uf (vgl. Fig. 3) werden ebenfalls in der (nicht gezeigten) Auswerteeinrichtung klassifiziert und ausgewertet.

Wie aus Fig. 2 ersichtlich, erfolgt eine im wesentlichen rechtwinklige Umlenkung des Partikelstromfadens 31 bei seinem Austritt aus dem in Strömungsrichtung hinteren Ende 18' der Messöffnung 18. Nach der Umlenkung folgt der Partikelstromfaden 31 schliesslich dem Pfeil 32; danach kommt es auf seinen genauen Lauf nicht mehr an. Die Partikelsuspension gelangt in den Bereich 16' der Kammer 16 zum oberen Teil der Kammer, in dem das Abflussrohr 17 vorgesehen ist. Auf das hintere Ende 18' der Messöffnung ist die optische Einrichtung fokussiert, wie durch die Strahlengänge 32', 32" angedeutet.

Damit erfolgt einmal die Messung des Volumens beim Durchtritt eines Partikels durch die Messöffnung 18 praktisch gleichzeitig mit der Messung der Fluoreszenz durch die optische Einrichtung 30. Ergänzend ist darauf hinzuweisen, dass man mit der optischen Einrichtung natürlich auch mehrere Messungen gleichzeitig (Fluoreszenz, Streulicht) durchführen kann.

Wie aus Fig. 3 zu ersehen, fällt der Impuls uf, der ein Mass für die Fluoreszenz eines Partikels ist, praktisch in die Rück-flanke des etwas längeren Impulses uv, der an den Elektroden 23,24 entsteht und ein Mass für das Volumen des Partikels ist. Damit wird eine eindeutige Zuordnung der Impulse zueinander möglich. Fig. 4 zeigt eine Aufnahme der Darstellung derartiger Impulse auf einem Oszillographen, die dies bestätigt.

Es ist gewährleistet, dass der Partikelstrom selbst, trotz Umlenkung der Strömung, nicht in Kontakt mit der Glasplatte 28 kommt und diese verschmutzt. Das bewirkt der über die Leitung 15 her zugeführte Strom des Elektrolyten, der insoweit die Funktion eines Spülstromes hat, der den aus der Messöffnung 18 austretenden Partikelstromfaden in den Bereich 16' der Kammer 16 mitnimmt. Die Elektrode 24' in der Vorkammer 15' dient dazu, am Ende der Messöffnung 18 eine zu starke und einseitige Feldlinienkonzentration in dem sehr engen Bereich zwischen Ende 18' der Messöffnung und Glasplatte 28 zu vermeiden.

Fig. 5 ist eine photographische Wiedergabe der Bildanzeige eines 2-Parameter-Vielkanalanalysators. Er zeigt das auf einem Bildschirm eines solchen Gerätes aufgezeichnete Profil der Volumen- und Fluoreszenzmessung einer bestimmten Partikelmenge. Gemessen wurde die Parameter-Fluoreszenz und Volumen bei kultivierten Ratten-Nervenzellen, die sich teilweise im Zustand der Zellteilung befinden, wobei an die bei der Teilung synthetisierte DNS Mithramycin angelagert ist, das fluoresziert. Eine sehr hohe Anzahl von Zellen hat ein geringes Volumen und geringe Fluoreszenz. Das ist der erste hohe Berg der gebirgsartigen Darstellung links vorne im Bild. Diese Zellen befinden sich in ihrer sogenannten G 1-Phase, in der der DNS-Gehalt der Zellen konstant bleibt. Im Bereich zunehmender Fluoreszenz sinkt die Anzahl der Zellen ab. Der folgende Höhenrücken kennzeichnet die sogenannte Synthesephase S, in der als Vorbereitung der späteren Zellteilung DNS synthetisiert wird. Das Volumen nimmt dabei ebenfalls leicht zu. Kurz vor und während der Teilungsphase (G 2-Phase) fallen die Zellen dann in den zweiten kleinen Gipfel schräg hinten in der Darstellung 4, d.h. die Zahl dieser Zellen ist wieder etwas höher. Dieses Beispiel zeigt, dass sich mit der erfindungsgemässen Vorrichtung einwandfreie 2-Parameter-Messungen vornehmen lassen.

Fig. 6 zeigt in prinzipieller Darstellung eine Vorrichtung nach Fig. 1 bis 3. Ein von der optischen Messeinrichtung 30 abgeleiteter Messimpuls wird im Verstärker 35 verstärkt. Der verstärkte Messimpuls uf gelangt an einen Dividierer 36. An den Dividierer 36 gelangt ebenfalls der im Verstärker 25 verstärkte Messimpuls uv. Im Dividierer 36 wird der Quotient uf/uv gebildet. Das ist die Volumen-Konzentration eines bestimmten Wirkstoffes in einem Partikel unter der Voraussetzung, dass uf, also die Fluoreszenz, der Menge des Wirkstoffes im Partikel proportional ist. Das ist z.B. bei der RNS der Fall.

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2 Blatt Zeichnungen

Claims

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1. Vorrichtung zur Messung von mindestens zwei Parametern von in einer Partikelsuspension suspendierten Partikeln mit zwei über eine Messöffnung miteinander verbundenen Kammern, in denen je eine Elektrode angeordnet ist, und bei der infolge einer Durckdifferenz zwischen den Kammern eine Strömung eines Elektrolyten durch die Messöffnung stattfindet, und bei der die Partikelsuspension durch eine mit ihrer Austrittsöffnung vor der Messöffnung endende Kapillare in die Strömung des Elektrolyten eingeführt und durch die Messöffnung hindurchgeführt wird, und bei der ferner eine optische Messeinrichtung angeordnet ist, dadurch gekennzeichnet, das in Ström-mungsrichtung in kurzem Abstand hinter dem Ende (18') der Messöffnung (18) senkrecht zu deren Achse eine Glasplatte (28) die Strömung im wesentlichen rechtwinklig umlenkt, und dass die optische Messeinrichtung (30) koaxial zur Messöffnung hinter der Glasplatte angeordnet ist.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein Spülstrom, der der zweiten Kammer (16) hinter der Messöffnung ( 18) im wesentlichen senkrecht zu deren Achse zugeführt wird, die Strömung in Richtung der Umlenkung wegführt.

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PATENTANSPRÜCHE

3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass hinter der Messöffnung (18) in der zweiten Kammer (16) zu beiden Seiten je eine zweite Elektrode (24,24') angeordnet ist, die miteinander parallelgeschaltet sind.

4. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder einem der folgenden, dadurch gekennzeichnet, dass eine Recheneinheit (36) vorgesehen ist, die das von der optischen Einrichtung (3G) abgegebene Signal (uf) durch das von den Elektroden abgeleitete Signal (uv) dividiert und ein Signal abgibt, das das Ergebnis darstellt.