JP2022061818A - マイクロ流体デバイス及びマイクロ流体デバイスの使用方法 - Google Patents
マイクロ流体デバイス及びマイクロ流体デバイスの使用方法 Download PDFInfo
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Abstract
【課題】構造が簡単で、かつ灌流培養が可能で、均一な細胞密度を保った細胞層バリアの形成を可能とするマイクロ流体デバイス及びこのマイクロ流体デバイスの使用方法を提供する。【解決手段】マイクロ流体デバイス１は、第一基板１０と、第一基板１０に対して部分的に接合された第二基板２０と、第一基板１０と第二基板２０の間で延在する第一流路２５と、第二流路２６と、第三流路２７と、第一流路２５に接続される複数の第一流路ポート２１，２２と、第二流路２６に接続される少なくとも一つの第二流路ポート２３と、第三流路２７に接続される少なくとも一つの第三流路ポート２４と、を備え、第一流路２５の主面２０ｂ側の壁面２５ｄは、第二流路２６の主面２０ｂ側の壁面２６ｄ及び第三流路２７の主面２０ｂ側の壁面２７ｄよりも主面２０ｂに近い。【選択図】図４
Description
本発明は、マイクロ流体デバイス及びマイクロ流体デバイスの使用方法に関する。
上皮（内皮）細胞層は、細胞間同士の結合、及び細胞と細胞外マトリックス（ECM）との結合により形成される。この細胞層は上皮（内皮）組織の境界として働くだけでなく、物質の透過を能動的に制限するバリアとして機能する。このバリアは生体内では小腸粘膜、気道粘膜、血管、血液脳関門(Blood-brain barrier：BBB)、角膜、表皮等に存在する。
バリアに対する研究対象物質の透過（吸収）、毒性、代謝などの反応性を知ることは、創薬において重要な課題であり、細胞培養を用いたin vitroでの評価系が開発されている。これらの評価系では、細胞層バリアの両面がコンパートメントで隔てられている必要があり、下記のような、人工的な支持体で隔てられたコンパートメントをもつ培養容器が開発されてきた。
下記特許文献１には、細胞培養チャンバー、及びこの細胞培養チャンバーを利用した組織モデルとその作製方法に関する技術が開示されている。
図１９は、特許文献１に開示されている細胞培養チャンバー１００を容器１０１の中に挿入した状態を示す断面模式図である。アクリル製やポリスチレン製の筒状の枠体１００ａは、内部に細胞を保持するための空間を有している。細胞培養チャンバー１００は、筒状の枠体１００ａの一方の開放端面に、ビトリゲル膜乾燥体１００ｂが被覆固定され、筒状の枠体１００ａの他方の開放端面の外周縁に、外側へ突出する係止部１００ｃが設けられている。容器１０１の上側から細胞培養チャンバー１００を挿入し、容器１０１上部に係止部１００ｃを掛け、容器１０１内に細胞培養チャンバー１００を保持する。容器１０１内に、生理活性物質を注入することができ、ビトリゲル膜を介して培養細胞へ生理活性物質を浸透させることで、細胞への影響を検定することができる。
また、下記特許文献２には、上皮バリア機能に対する化合物のデータを提供することができるマイクロ流体プレートに関する技術が記載されている。
図２０は、特許文献２に開示されているマイクロ流体プレートを使用して細管を形成する工程を示す模式図である。図２０の左図はマイクロ流体プレートの部分拡大図、図２０の右図はマイクロ流体プレートの断面図である。マイクロ流体プレートは、入口と、入口につながるマイクロ流体チャンバー２００を有しており、長手方向にフェーズガイド２０１と呼ばれる突起が設けられている。第一の流体(図２０のECMなど)は入口からマイクロ流体チャンバー２００へと流動し、フェーズガイド２０１による毛細管力や表面張力、重力などの作用により、マイクロ流体チャンバー２００は選択的に充填される。残りの部分に、細胞を導入した第二の流体（図２０の培地など）を充填し、培養することにより、細管を形成する。
しかしながら、特許文献１の構造では、容器１０１のほかに、ゲルの膜を張った細胞培養チャンバー１００を別途用意する必要があり、この細胞培養チャンバー１００を製造するためには特許文献１の図１に記載されているように製造工程も多い。
また、ゲルの膜の下に人工的な支持体が存在し、実際の生体内で起こる細胞や物質の透過に制限が生じる。
そして、細胞培養チャンバー１００の構造上、培養液を流通させることができず、静置培養しかできない。つまり、灌流培養ができない。そのため、細胞の機能発現に影響を与える、流体のせん断応力、気体の分圧をコントロールできない。
また、特許文献２の構造では、フェーズガイド２０１による毛細管力や表面張力を利用する機構であるため、第一の流体(図２０のECMなど)の表面の形状は曲面になる。このため、その面上に培養される細胞層バリアも曲面になり、細胞層バリアの作製が困難であり、細胞層バリアの観察も難しい。
また、細胞外マトリックス（ECM）に接していない細胞も存在する為、培養環境に偏りが生じ、研究対象物質の細胞層バリアだけに対する反応性を知ることは難しい。
そして、表面張力を利用して細胞層バリアを形成するため、流路の高さに制限が生じる。その為、培養液を増やせず、培地交換の頻度が高い。
本発明は、上記の課題に鑑み、構造が簡単で、かつ灌流培養が可能で、均一な細胞密度を保った細胞層バリアの形成を可能とするマイクロ流体デバイスとこのマイクロ流体デバイスの使用方法を提供することを目的とする。
本発明に係るマイクロ流体デバイスは、第一基板と、
前記第一基板に対して部分的に接合された第二基板と、
前記第一基板と前記第二基板の間で前記第二基板の第一主面に沿う方向に延在する第一流路と、
前記第一流路に接続され、前記第一主面に沿う方向に延在する第二流路と、
前記第一流路に接続され、前記第一主面に沿う方向に延在する第三流路と、
前記第一流路に接続され、前記第二基板の前記第一主面とは反対側に位置する第二主面に向かって、前記第二基板を貫通して形成される複数の第一流路ポートと、
前記第二流路に接続され、前記第二主面に向かって、前記第二基板を貫通して形成される少なくとも一つの第二流路ポートと、
前記第三流路に接続され、前記第二主面に向かって、前記第二基板を貫通して形成される少なくとも一つの第三流路ポートと、を備え、
前記第一流路の前記第二主面側の壁面は、前記第二流路の前記第二主面側の壁面及び前記第三流路の前記第二主面側の壁面よりも前記第二主面に近いものである。
前記第一基板に対して部分的に接合された第二基板と、
前記第一基板と前記第二基板の間で前記第二基板の第一主面に沿う方向に延在する第一流路と、
前記第一流路に接続され、前記第一主面に沿う方向に延在する第二流路と、
前記第一流路に接続され、前記第一主面に沿う方向に延在する第三流路と、
前記第一流路に接続され、前記第二基板の前記第一主面とは反対側に位置する第二主面に向かって、前記第二基板を貫通して形成される複数の第一流路ポートと、
前記第二流路に接続され、前記第二主面に向かって、前記第二基板を貫通して形成される少なくとも一つの第二流路ポートと、
前記第三流路に接続され、前記第二主面に向かって、前記第二基板を貫通して形成される少なくとも一つの第三流路ポートと、を備え、
前記第一流路の前記第二主面側の壁面は、前記第二流路の前記第二主面側の壁面及び前記第三流路の前記第二主面側の壁面よりも前記第二主面に近いものである。
このマイクロ流体デバイスは、第一基板又は第二基板に予め各流路及び各流路ポートを形成した後、第一基板と第二基板を接合することで製造できる構造のため、構造が簡単である。また、例えば、一つの第一流路ポートから第一流路を通って別の第一流路ポートへ培養液等を流通させることができる。さらに、例えば、第二流路ポートから第二流路、第一流路、第三流路を通って第三流路ポートへ培養液等を流通させることもできる。すなわち、本発明のマイクロ流体デバイスは灌流培養が可能である。
本発明に係るマイクロ流体デバイスの使用方法は、上記のマイクロ流体デバイスの使用方法であって、
前記第二流路ポートまたは前記第三流路ポートからグリセロールまたは熱相転移ヒドロゲルを注入し、前記グリセロールまたは熱相転移ヒドロゲルの高さを前記第二流路の前記第二主面側の壁面及び前記第三流路の前記第二主面側の壁面よりも高く且つ前記第一流路の前記第二主面側の壁面よりも低くする第一ステップと、
前記第一流路ポートからゲル水溶液を注入する第二ステップと、
前記ゲル水溶液をゲル化させる第三ステップと、
前記第三流路ポートまたは前記第二流路ポートから前記グリセロールまたは熱相転移ヒドロゲルを排出する第四ステップと、を有するものである。
前記第二流路ポートまたは前記第三流路ポートからグリセロールまたは熱相転移ヒドロゲルを注入し、前記グリセロールまたは熱相転移ヒドロゲルの高さを前記第二流路の前記第二主面側の壁面及び前記第三流路の前記第二主面側の壁面よりも高く且つ前記第一流路の前記第二主面側の壁面よりも低くする第一ステップと、
前記第一流路ポートからゲル水溶液を注入する第二ステップと、
前記ゲル水溶液をゲル化させる第三ステップと、
前記第三流路ポートまたは前記第二流路ポートから前記グリセロールまたは熱相転移ヒドロゲルを排出する第四ステップと、を有するものである。
この使用方法によれば、第二流路の第二主面側の壁面及び第三流路の第二主面側の壁面よりも高く且つ第一流路の第二主面側の壁面よりも低い位置にゲルを形成することができるため、ゲルの上に均一な細胞密度を保った細胞層バリアを形成することができる。
本発明に係るマイクロ流体デバイスにつき、図面を参照しながら説明する。なお、本明細書に開示された各図面は、あくまで模式的に図示されたものである。すなわち、図面上の寸法比と実際の寸法比とは必ずしも一致しておらず、また、各図面間においても寸法比は必ずしも一致していない。
図１は、本実施形態に係るマイクロ流体デバイス１を製造する前の状態における斜視図である。マイクロ流体デバイス１は、第一基板１０と第二基板２０とを有し、これらが接合されることで製造される。図１は、第一基板１０に第二基板２０を接合する直前の、両基板を示した斜視図に対応する。
マイクロ流体デバイス１は、第一基板１０の一つの主面１０ａ上に、第二基板２０の一つの主面２０ａ（本発明の第一主面に相当する）が部分的に接触するように積層し、接合されて形成される。主面とは、基板１０，２０を構成する面のうち他の面よりもはるかに面積の大きい面を指す。基板１０，２０には二つの主面があり、この二つの主面は互いに対向配置される。第一基板１０に部分的に接触する第二基板２０の主面２０ａは凹部（後述する）を有する。第二基板２０のもう一つの主面２０ｂ（本発明の第二主面に相当する）は、第一基板１０とは反対側に位置し、流路ポート２１～２４（後述する）を有する。
以下の説明では、第一基板１０と第二基板２０とが接合された状態において、第一基板１０の主面１０ａ，１０ｂ及び第二基板２０の主面２０ａ，２０ｂに平行な面をＸＹ平面とし、このＸＹ平面に直交する方向をＺ方向とする、ＸＹＺ座標系が適宜参照される。
また、本明細書において、方向を表現する際に、正負の向きを区別する場合には、「＋Ｘ方向」、「－Ｘ方向」のように、正負の符号を付して記載される。また、正負の向きを区別せずに方向を表現する場合には、単に「Ｘ方向」と記載される。すなわち、本明細書において、単に「Ｘ方向」と記載されている場合には、「＋Ｘ方向」と「－Ｘ方向」の双方が含まれる。Ｙ方向及びＺ方向についても同様である。なお、マイクロ流体デバイス１は、通常、Ｚ方向を上下方向として使用され、－Ｚ方向が上方向に相当する。
図２は、接合前の第二基板２０を主面２０ａ側から見た斜視図である。図３は、マイクロ流体デバイス１の平面図である。図４は、第一基板１０上に第二基板２０が接合されたマイクロ流体デバイス１の断面模式図を示し、当該断面模式図は、図３に示すマイクロ流体デバイス１のＡ－Ａ線断面図である。図４の断面模式図は、図の理解を容易にするために、両基板の外形線のうち断面上に表れる線のみを示している。後述する図６Ａ～図１６についても同様である。図５は、図３に示すマイクロ流体デバイス１のＢ－Ｂ線断面図及びＣ－Ｃ線断面図である。
第一基板１０及び第二基板２０は、それぞれ同一形状の主面を有する矩形基板である。第一基板１０及び第二基板２０の主面の縦と横は、例えば１５ｍｍと２５ｍｍである。また、第二基板２０の厚みは第一基板１０の厚みよりも大きい。第一基板１０の厚みは例えば１ｍｍ、第二基板２０の厚みは例えば５ｍｍである。
第二基板２０の主面２０ａは、第一凹部２５ａ、第二凹部２６ａ、及び第三凹部２７ａを備える。第一凹部２５ａ、第二凹部２６ａ、及び第三凹部２７ａは、第一基板１０と第二基板２０とが接合されることにより、両基板１０，２０に挟まれた中空状の第一流路２５、第二流路２６、及び第三流路２７として機能する。
第一凹部２５ａ、第二凹部２６ａ、及び第三凹部２７ａは、何れも主面２０ａのＹ方向中央部にＸ方向へ延びるように形成されている。本実施形態の第一凹部２５ａ、第二凹部２６ａ、及び第三凹部２７ａは、直線状に並んでいる。
第一凹部２５ａ、第二凹部２６ａ、及び第三凹部２７ａは、それぞれ一定の幅及び深さでＸ方向に延びるスリット状である。第一凹部２５ａ、第二凹部２６ａ、及び第三凹部２７ａのＹ方向の幅ｗ（図３を参照）は、すべて同じであって、例えば０．５～５ｍｍである。
一方、第一凹部２５ａ、第二凹部２６ａ、及び第三凹部２７ａの主面２０ａからの深さは、異なっており、第一凹部２５ａの深さｈ１（図４を参照）は、第二凹部２６ａの深さｈ２（図４を参照）及び第三凹部２７ａの深さｈ３（図４を参照）よりも深い。これにより、第一基板１０上に第二基板２０が接合された状態において、図４に示されるように、第一流路２５の主面２０ｂ側の壁面２５ｄは、第二流路２６の主面２０ｂ側の壁面２６ｄ及び第三流路２７の主面２０ｂ側の壁面２７ｄよりも主面２０ｂに近い。なお、第二凹部２６ａの深さｈ２と第三凹部２７ａの深さｈ３は、同じであっても異なっていてもよく、すなわち、第二流路２６の壁面２６ｄと第三流路２７の壁面２７ｄは、Ｚ方向に同じ位置であっても異なる位置であってもよい。第一凹部２５ａの深さｈ１は、例えば２．５～５ｍｍであり、本実施形態では２．５ｍｍである。また、第二凹部２６ａの深さｈ２及び第三凹部２７ａの深さｈ３は、例えば０．１～０．５ｍｍである。
第一流路ポート２１は、第一凹部２５ａの一端２５ｂに接続され、第二基板２０の主面２０ａから主面２０ｂに向かって延び、第二基板２０を貫通して形成される。
また、第一流路ポート２１は、第二凹部２６ａの一端２６ｂにも接続している。すなわち、第二凹部２６ａは、第一流路ポート２１を介して第一凹部２５ａに接続されている。
第一流路ポート２２は、第一凹部２５ａの他端２５ｃに接続され、第二基板２０の主面２０ａから主面２０ｂに向かって延び、第二基板２０を貫通して形成される。また、第一流路ポート２２は、第三凹部２７ａの一端２７ｂにも接続している。すなわち、第三凹部２７ａは、第一流路ポート２２を介して第一凹部２５ａに接続されている。
第二流路ポート２３は、第二凹部２６ａの他端２６ｃに接続され、第二基板２０の主面２０ａから主面２０ｂに向かって延び、第二基板２０を貫通して形成される。
第三流路ポート２４は、第三凹部２７ａの他端２７ｃに接続され、第二基板２０の主面２０ａから主面２０ｂに向かって延び、第二基板２０を貫通して形成される。
第一流路ポート２１，２２、第二流路ポート２３、及び第三流路ポート２４は、何れもＺ方向に延びる円柱状の空洞である。この実施例においては、第一流路ポート２１，２２、第二流路ポート２３、及び第三流路ポート２４の直径ｄ（図３を参照）は、すべて同じであって、例えば１～５ｍｍである。
第一流路ポート２１，２２同士の間隔ｐ１（図３を参照）は、例えば３～１０ｍｍであり、本実施形態では１０ｍｍである。第一流路ポート２１と第二流路ポート２３との間隔ｐ２（図３を参照）は、例えば１～３ｍｍである。また、第一流路ポート２２と第三流路ポート２４との間隔ｐ３（図３を参照）は、例えば１～３ｍｍである。
第一流路ポート２１，２２、第二流路ポート２３、及び第三流路ポート２４は、液体をマイクロ流体デバイス１に注入する目的と、液体をマイクロ流体デバイス１から排出する目的と、の少なくとも一方の目的を有する。例えば、第一流路ポート２１が液体注入口として使用され、第一流路ポート２２が液体排出口として使用されてもよい。
第一流路ポート２１と第一流路ポート２２は、第一流路２５で接続されている。すなわち、第一流路２５は、第一流路２５に接続され、主面２０ｂに向かって延びる複数の第一流路ポート２１，２２を有するとも言える。また、第一流路ポート２１と第二流路ポート２３は、第二流路２６で接続されている。すなわち、第二流路２６は、第二流路２６に接続され、主面２０ｂに向かって延びる第二流路ポート２３を有するとも言える。また、第一流路ポート２２と第三流路ポート２４は、第三流路２７で接続されている。すなわち、第三流路２７は、第三流路２７に接続され、主面２０ｂに向かって延びる第三流路ポート２４を有するとも言える。
以上のように、本実施形態のマイクロ流体デバイス１は、第一基板１０と、第一基板１０に対して部分的に接合された第二基板２０と、を備える。また、マイクロ流体デバイス１は、第一基板１０と第二基板２０の間で第二基板２０の主面２０ａに沿う方向に延在する第一流路２５と、第一流路２５に接続され、主面２０ａに沿う方向に延在する第二流路２６と、第一流路２５に接続され、主面２０ａに沿う方向に延在する第三流路２７と、を備える。さらに、マイクロ流体デバイス１は、第一流路２５に接続され、第二基板２０の主面２０ａとは反対側に位置する主面２０ｂに向かって、第二基板２０を貫通して形成される複数の第一流路ポート２１，２２と、第二流路２６に接続され、主面２０ｂに向かって、第二基板２０を貫通して形成される少なくとも一つの第二流路ポート２３と、第三流路２７に接続され、主面２０ｂに向かって、第二基板２０を貫通して形成される少なくとも一つの第三流路ポート２４と、を備える。そして、第一流路２５の主面２０ｂ側の壁面２５ｄは、第二流路２６の主面２０ｂ側の壁面２６ｄ及び第三流路２７の主面２０ｂ側の壁面２７ｄよりも主面２０ｂに近くなっている。
次に、マイクロ流体デバイス１の製造方法について詳細に説明する。
（基板の準備工程）
マイクロ流体デバイス１を構成する第一基板１０と第二基板２０とを準備する。
マイクロ流体デバイス１を構成する第一基板１０と第二基板２０とを準備する。
基板１０，２０を構成する材料には、好ましくは実質的に非多孔質体の材料を使用する。ここで、「実質的に非多孔質体」であるとは、基板の見かけ状の表面積が、実際の表面積に近似している状態を指す。上記のような非多孔質体を形成する材料の例としては、ガラスやシリコンなどの無機材料、又はポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、シクロオレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）、ポリスチレン（ＰＳ）、シリコーン等の樹脂材料が挙げられる。なお、これらの樹脂材料が２種以上組み合わせられていても構わない。また、第一基板１０と第二基板２０とで使用する材料を異ならせてもよい。
本実施形態における基板の形状について説明する。第一基板１０及び第二基板２０は、それぞれ同一形状の主面を有する矩形基板を使用している。また、第二基板２０の厚みは第一基板１０の厚みよりも大きい。しかしながら、第一基板１０及び第二基板２０の主面は、同一形状でなくてもよい。例えば、第一基板１０の主面の縦と横の寸法が、第二基板２０の主面の縦と横の寸法より大きくてもよく、第二基板２０の主面の縦と横の寸法が、第一基板１０の主面の縦と横の寸法より大きくてもよい。また、第二基板２０の厚みは第一基板１０の厚みと同じでもよく、第二基板２０の厚みは第一基板１０の厚みよりも小さくてもよい。
本実施形態における第一基板１０の二つの主面１０ａ，１０ｂは共に平坦である。第二基板２０の一つの主面２０ａは、第一基板１０と接合された後に中空状の第一流路２５、第二流路２６、及び第三流路２７をそれぞれ形成するための第一凹部２５ａ、第二凹部２６ａ、及び第三凹部２７ａを有する。第二基板２０のもう一つの主面２０ｂには、第一流路ポート２１，２２、第二流路ポート２３、及び第三流路ポート２４が開口している。
基板１０，２０に開口及び凹部を設けるには、例えば、射出成型、フォトリソグラフィ工程とエッチング工程との組合せ、鋳造、切削加工等の手段があるが、基板を構成する材料に応じて最適な手段を選択するとよい。一例として、第二基板２０を、上述したようにポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、シクロオレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）、ポリスチレン（ＰＳ）、シリコーン、アクリルなどの樹脂材料で構成することで、射出成形により容易に凹部を形成することができる。また、第一基板１０については、凹部を設けない場合には、上記樹脂材料の他、ホウケイ酸ガラスなどのガラス材料を用いても構わない。
（基板の接合工程）
作製された第一基板１０の主面１０ａと第二基板２０の主面２０ａとを接合する。以下に示す接合方法は、基板上に接着剤となる薄膜の形成が不要となる方法であり、以下の手順で実行される。
作製された第一基板１０の主面１０ａと第二基板２０の主面２０ａとを接合する。以下に示す接合方法は、基板上に接着剤となる薄膜の形成が不要となる方法であり、以下の手順で実行される。
まず、両基板の接合面（１０ａ，２０ａ）に対して、表面を活性化する処理を行う。表面活性化処理の方法としては、紫外線を照射する方法や、プラズマガスを接触させる方法が利用できる。
紫外線を照射する方法には、例えば、波長１７２ｎｍの光を放射するキセノンエキシマランプなどの紫外線光源から、第二基板２０の主面２０ａ、及び第一基板１０の主面１０ａに対して、波長２００ｎｍ以下の真空紫外線を照射することで実行される。紫外線光源の他の例としては、１８５ｎｍに輝線を有する低圧水銀ランプ、波長１２０～２００ｎｍの範囲に輝線を有する重水素ランプを好適に用いることができる。真空紫外線の照度は、例えば１０～５００ｍＷ／ｃｍ２であり、照射時間は樹脂に応じて適宜設定されるが、例えば５～６秒間である。
プラズマガスを接触させる方法には、窒素ガスやアルゴンガスなどを主成分とし、酸素ガスが０．０１～５体積％含有してなるプロセスガスを大気圧プラズマによってプラズマ化したものを、第二基板２０の主面２０ａ、及び第一基板１０の主面１０ａに対して接触させることで実行される。窒素ガスとクリーンドライエア（ＣＤＡ）との混合ガスを用いることも可能である。プラズマガスの接触時間は、例えば５～１００秒間である。
次に、表面活性化処理が施された両基板の接合面（１０ａ，２０ａ）を接触させるように第一基板１０と第二基板２０とを重ね合わせ、プレス機を使用して両基板を押圧し接合する接合工程を行う。接合工程は、表面活性化状態を維持するために、紫外線照射工程が完了してから所定時間内、例えば１０分以内に行うとよい。
この接合工程は、接合を強固にするために、必要に応じて加熱された環境において行われる。接合工程において、加熱温度や押圧力等の接合条件は、第一基板１０の構成材料及び第二基板２０の構成材料に応じて設定される。具体的な条件を挙げると、押圧する際の温度は、例えば４０～１３０℃であり、接合するための押圧力は、例えば、０．１～１０ＭＰａである。
第一基板１０と第二基板２０とが接合された基板（以下、「接合基板」と呼ぶ場合がある。）を所定時間加圧した後、必要に応じてさらに所定時間加熱してもよい。接合基板を加圧した後に加熱することにより、加圧後の積層基板における接合界面に、十分な接合状態が得られている部分と、十分な接合状態が得られていない部分とが混在している場合であっても、加熱により、十分な接合状態が得られていない部分において、その接合状態を、所期の状態とすることができる。
接合基板の加圧状態を所定時間にわたって維持し、その後、その加圧状態を解除し、接合基板の温度を所定温度まで上昇させ、その温度を、所期の接合状態が得られるまで維持するようにしてもよい。ここに、所定温度とは、接合基板に変形が生じることのない温度である。例えば、加熱温度が例えば４０～１３０℃であり、加熱時間が例えば６０～６００秒間である。
その後、冷却工程を経て、第一基板１０の主面１０ａ上に第二基板２０が接合されたマイクロ流体デバイス１が作製される。
次に、マイクロ流体デバイス１の使用方法について詳細に説明する。使用方法は、灌流のやり方で、（１）両面灌流と（２）片面灌流の大きく２つに分けられる。両面灌流とは、ゲルの上面側と下面側の両方に培養液を流すもので、２層流路灌流（多層流路灌流）とも呼ばれる。一方、片面灌流とは、ゲルの上面側に培養液を流すもので、単層流路灌流とも呼ばれる。
また、使用方法は、細胞の培養の仕方で、（ａ）On-Gel培養、（ｂ）On＆In-Gel培養、（ｃ）In-Gel培養で分けられる。On-Gel培養では、ゲルの上面側で細胞を培養する。On＆In-Gel培養では、ゲルの上面側と、ゲル内の両方で細胞を培養する。In-Gel培養では、ゲル内で細胞を培養する。
以上の組み合わせで、６種類の使用例がある。さらに、細胞層バリアの上に培養液の替わりに空気を流すと、気液界面培養が可能となる。
（１）両面灌流
＜使用例１＞
（ａ）On-Gel培養
例えば、血管内皮を媒介する化学誘引物質に対する白血球、腫瘍細胞の細胞遊走性の測定をすることができる。
＜使用例１＞
（ａ）On-Gel培養
例えば、血管内皮を媒介する化学誘引物質に対する白血球、腫瘍細胞の細胞遊走性の測定をすることができる。
i）細胞支持体の形成
初めに、図６Ａに示すように、グリセロールまたは熱相転移ヒドロゲル９１を第二流路ポート２３から注入する。このとき、注入されるグリセロールまたは熱相転移ヒドロゲル９１の量は、注入されたグリセロールまたは熱相転移ヒドロゲル９１の高さが、第二流路２６の壁面２６ｄ及び第三流路２７の壁面２７ｄよりも高く、且つ第一流路２５の壁面２５ｄよりも低くなるように設定される。
初めに、図６Ａに示すように、グリセロールまたは熱相転移ヒドロゲル９１を第二流路ポート２３から注入する。このとき、注入されるグリセロールまたは熱相転移ヒドロゲル９１の量は、注入されたグリセロールまたは熱相転移ヒドロゲル９１の高さが、第二流路２６の壁面２６ｄ及び第三流路２７の壁面２７ｄよりも高く、且つ第一流路２５の壁面２５ｄよりも低くなるように設定される。
次いで、図６Ｂに示すように、ゲル９２の水溶液を第一流路ポート２１から注入し、グリセロールまたは熱相転移ヒドロゲル９１の上に展開した後、ゲル化させる。
次いで、図６Ｃに示すように、グリセロールまたは熱相転移ヒドロゲル９１を第二流路ポート２３または第三流路ポート２４から取り除く。これにより、ゲル９２の部分が残り、ゲル９２の層と第一基板１０の間には空隙が形成される。
ii）細胞層バリアの形成
次いで、図６Ｄに示すように、第二流路ポート２３から培養液９３を注入する。
次いで、図６Ｄに示すように、第二流路ポート２３から培養液９３を注入する。
次いで、図６Ｅに示すように、第一流路ポート２１から細胞９４ａを含んだ培養液９３を投入し、培養する。これにより、図６Ｆに示すように、細胞層バリア９５ａがゲル９２上に形成される。
iii）培養液の灌流・観察
次いで、図６Ｇに示すように、第二流路ポート２３、第一流路ポート２１からそれぞれ培養液、化学物質、細胞を注入し、第三流路ポート２４、第一流路ポート２２から回収する。すなわち、細胞層バリア９５ａ側の両面において、それぞれサンプリングすることにより、注入した化学物質や細胞の移行経路を反映した作用や動態を、生化学的、分子生物学的に解析することが可能である。また、顕微鏡などを用いて、注入した化学物質や細胞の組織モデルに対する拡散や影響を組織学的に解析することも可能である。
次いで、図６Ｇに示すように、第二流路ポート２３、第一流路ポート２１からそれぞれ培養液、化学物質、細胞を注入し、第三流路ポート２４、第一流路ポート２２から回収する。すなわち、細胞層バリア９５ａ側の両面において、それぞれサンプリングすることにより、注入した化学物質や細胞の移行経路を反映した作用や動態を、生化学的、分子生物学的に解析することが可能である。また、顕微鏡などを用いて、注入した化学物質や細胞の組織モデルに対する拡散や影響を組織学的に解析することも可能である。
また、構築した組織モデルに応じて、細胞層バリア９５ａ側の両面において、それぞれ液体を灌流させることもできる。
例えば、小腸上皮からなる細胞層バリア９５ａを形成することにより、小腸モデルを構築する。
第一流路ポート２１から第一流路ポート２２へ化学物資を含んだ培養液を灌流し、構築した細胞層バリア９５ａの上方側から、細胞層バリア９５ａを経由して、下方側に拡散させる。そして、第二流路ポート２３から第三流路ポート２４へ培養液を灌流して、回収する。
このようにして、化学物質の拡散の程度や構造変化の解析、および細胞観察等により収効率・代謝・毒性を評価することができる。
例えば、血管内皮細胞からなる細胞層バリア９５ａを形成することにより、血管モデルを構築する。
第一流路ポート２１から第一流路ポート２２へ化学物質を含んだ培養液を灌流し、第二流路ポート２３から第三流路ポート２４へ化学物質を含まない培養液を灌流して、回収する。
これにより、ゲル９２内に安定した化学物質の濃度勾配を生じ、化学物質に対する血管新生を評価することができる。
＜使用例２＞
（ｂ）On＆In-Gel培養
細胞バリア層を経由する生理活性物質、薬剤などの透過、吸収、代謝などを評価することができる。例えば、角膜からの透過率・毒性、腸管からの吸収効率・代謝・毒性、血管からの透過率・毒性を評価することができる。
（ｂ）On＆In-Gel培養
細胞バリア層を経由する生理活性物質、薬剤などの透過、吸収、代謝などを評価することができる。例えば、角膜からの透過率・毒性、腸管からの吸収効率・代謝・毒性、血管からの透過率・毒性を評価することができる。
i）細胞支持体の形成
初めに、図７Ａに示すように、グリセロールまたは熱相転移ヒドロゲル９１を第二流路ポート２３から注入する。このとき、注入されるグリセロールまたは熱相転移ヒドロゲル９１の量は、注入されたグリセロールまたは熱相転移ヒドロゲル９１の高さが、第二流路２６の壁面２６ｄ及び第三流路２７の壁面２７ｄよりも高く、且つ第一流路２５の壁面２５ｄよりも低くなるように設定される。
初めに、図７Ａに示すように、グリセロールまたは熱相転移ヒドロゲル９１を第二流路ポート２３から注入する。このとき、注入されるグリセロールまたは熱相転移ヒドロゲル９１の量は、注入されたグリセロールまたは熱相転移ヒドロゲル９１の高さが、第二流路２６の壁面２６ｄ及び第三流路２７の壁面２７ｄよりも高く、且つ第一流路２５の壁面２５ｄよりも低くなるように設定される。
次いで、図７Ｂに示すように、細胞９４ｂを含んだゲル９２の水溶液を第一流路ポート２１から注入し、グリセロールまたは熱相転移ヒドロゲル９１の上に展開した後、ゲル化させる。
次いで、図７Ｃに示すように、グリセロールまたは熱相転移ヒドロゲル９１を第二流路ポート２３または第三流路ポート２４から取り除く。これにより、細胞９４ｂを含むゲル９２の部分が残り、ゲル９２の層と第一基板１０の間には空隙が形成される。
ii）細胞層バリアの形成
次いで、図７Ｄに示すように、第二流路ポート２３から培養液９３を注入する。
次いで、図７Ｄに示すように、第二流路ポート２３から培養液９３を注入する。
次いで、図７Ｅに示すように、第一流路ポート２１から細胞９４ｃを含んだ培養液９３を投入し、培養する。これにより、図７Ｆに示すように、細胞層バリア９５ｃが、細胞９４ｂを含むゲル９２上に形成される。
iii）培養液の灌流・観察
次いで、図７Ｇに示すように、第二流路ポート２３、第一流路ポート２１からそれぞれ培養液、化合物質、細胞を注入し、第三流路ポート２４、第一流路ポート２２から回収する。すなわち細胞層バリア９５ｃ側の面と、細胞９４ｂを含んだゲル９２側の両面において、それぞれサンプリングすることにより、注入した化学物質や細胞の移行経路を反映した作用や動態を、生化学的、分子生物学的に解析することが可能である。また顕微鏡などを用いて、注入した化学物質や細胞の組織モデルに対する拡散や影響を組織学的に解析することも可能である。
次いで、図７Ｇに示すように、第二流路ポート２３、第一流路ポート２１からそれぞれ培養液、化合物質、細胞を注入し、第三流路ポート２４、第一流路ポート２２から回収する。すなわち細胞層バリア９５ｃ側の面と、細胞９４ｂを含んだゲル９２側の両面において、それぞれサンプリングすることにより、注入した化学物質や細胞の移行経路を反映した作用や動態を、生化学的、分子生物学的に解析することが可能である。また顕微鏡などを用いて、注入した化学物質や細胞の組織モデルに対する拡散や影響を組織学的に解析することも可能である。
また、構築した組織モデルに応じて、細胞層バリア９５ｃ側の面と、細胞９４ｃを含んだゲル９２側の両面において、それぞれ液体を灌流させることもできる。
例えば、腫瘍細胞を包埋した細胞外マトリックス（ECM）からなるゲル９２の上に、内皮または上皮細胞からなる細胞層バリア９５ｃを形成することにより、基底膜モデルを構築する。
第一流路ポート２１から第一流路ポート２２へ化学物資を含んだ培養液を灌流し、細胞層バリア９５ｃを経由させ、細胞外マトリックスに包埋した細胞に作用させる。
これにより、経由した化学物質が原因となる、ECM分解を伴う腫瘍細胞の細胞遊走性（浸潤活性）を評価することができる。
例えば、線維芽細胞や腫瘍細胞を包埋した細胞外マトリックス（ECM）からなるゲル９２の上に、血管内皮からなる細胞層バリア９５ｃを形成することにより、血管モデルを構築する。
第一流路ポート２１から第一流路ポート２２へ化学物資を含んだ培養液を灌流し、細胞層バリア９５ｃを経由し、細胞外マトリックスに包埋した細胞に作用させることにより、サイトカインを産生させる。
これにより、サイトカインに対する血管新生の評価を行うことができる。
＜使用例３＞
（ｃ）In-Gel培養
例えば、線維芽細胞、腫瘍細胞などの細胞周辺環境の化学誘引物質（化学信号）に対する細胞遊走性の測定をすることができる。
（ｃ）In-Gel培養
例えば、線維芽細胞、腫瘍細胞などの細胞周辺環境の化学誘引物質（化学信号）に対する細胞遊走性の測定をすることができる。
i）細胞支持体の形成
初めに、図８Ａに示すように、グリセロールまたは熱相転移ヒドロゲル９１を第二流路ポート２３から注入する。このとき、注入されるグリセロールまたは熱相転移ヒドロゲル９１の量は、注入されたグリセロールまたは熱相転移ヒドロゲル９１の高さが、第二流路２６の壁面２６ｄ及び第三流路２７の壁面２７ｄよりも高く、且つ第一流路２５の壁面２５ｄよりも低くなるように設定される。
初めに、図８Ａに示すように、グリセロールまたは熱相転移ヒドロゲル９１を第二流路ポート２３から注入する。このとき、注入されるグリセロールまたは熱相転移ヒドロゲル９１の量は、注入されたグリセロールまたは熱相転移ヒドロゲル９１の高さが、第二流路２６の壁面２６ｄ及び第三流路２７の壁面２７ｄよりも高く、且つ第一流路２５の壁面２５ｄよりも低くなるように設定される。
次いで、図８Ｂに示すように、細胞９４ｄを含んだゲル９２の水溶液を第一流路ポート２１から注入し、グリセロールまたは熱相転移ヒドロゲル９１の上に展開した後、ゲル化させる。
次いで、図８Ｃに示すように、グリセロールまたは熱相転移ヒドロゲル９１を第二流路ポート２３または第三流路ポート２４から取り除く。これにより、細胞９４ｄを含むゲル９２の部分が残り、ゲル９２の層と第一基板１０の間には空隙が形成される。
ii）培養液の灌流・観察
次いで、図８Ｄに示すように、第二流路ポート２３、第一流路ポート２１からそれぞれ培養液、化合物質、細胞を注入し、第三流路ポート２４、第一流路ポート２２から回収する。すなわち細胞９４ｄを含んだゲル９２側の両面において、それぞれサンプリングすることにより、注入した化学物質や細胞の移行経路を反映した作用や動態を、生化学的、分子生物学的に解析することが可能である。また顕微鏡などを用いて、注入した化学物質や細胞の組織モデルに対する拡散や影響を組織学的に解析することも可能である。
次いで、図８Ｄに示すように、第二流路ポート２３、第一流路ポート２１からそれぞれ培養液、化合物質、細胞を注入し、第三流路ポート２４、第一流路ポート２２から回収する。すなわち細胞９４ｄを含んだゲル９２側の両面において、それぞれサンプリングすることにより、注入した化学物質や細胞の移行経路を反映した作用や動態を、生化学的、分子生物学的に解析することが可能である。また顕微鏡などを用いて、注入した化学物質や細胞の組織モデルに対する拡散や影響を組織学的に解析することも可能である。
また、構築した組織モデルに応じて、細胞９４ｄを含んだゲル９２側の両面において、それぞれ液体を灌流させることもできる。
例えば、線維芽細胞、腫瘍細胞などをゲル９２に包埋する。第一流路ポート２１から第一流路ポート２２へ化学誘引物質を含んだ培養液を灌流し、第二流路ポート２３から第三流路ポート２４へ化学誘引物質を含まない培養液を灌流して、回収する。
これにより、ゲル９２内に安定した化学誘引物質の濃度勾配を生じ、化学誘引物質に対する細胞遊走性を測定できる。
以上のように、両面灌流培養において、人工的なメンブレンを使用せずとも、細胞層バリアを形成することが可能となる。
（２）片面灌流
＜使用例４＞
（ａ）On-Gel培養
例えば、血管内皮を媒介する化学誘引物質に対する白血球、腫瘍細胞の細胞遊走性の測定をすることができる。
＜使用例４＞
（ａ）On-Gel培養
例えば、血管内皮を媒介する化学誘引物質に対する白血球、腫瘍細胞の細胞遊走性の測定をすることができる。
i）細胞支持体の形成
初めに、図９Ａに示すように、ゲル９２の水溶液を第一流路ポート２１から注入し、ゲル化させる。注入されたゲル９２は、毛細管力、表面張力により、概ね第一流路ポート２１，２２間の範囲に留まる。このとき、注入されるゲル９２の量は、注入されたゲル９２の高さが、第二流路２６の壁面２６ｄ及び第三流路２７の壁面２７ｄよりも高く、且つ第一流路２５の壁面２５ｄよりも低くなるように設定される。
初めに、図９Ａに示すように、ゲル９２の水溶液を第一流路ポート２１から注入し、ゲル化させる。注入されたゲル９２は、毛細管力、表面張力により、概ね第一流路ポート２１，２２間の範囲に留まる。このとき、注入されるゲル９２の量は、注入されたゲル９２の高さが、第二流路２６の壁面２６ｄ及び第三流路２７の壁面２７ｄよりも高く、且つ第一流路２５の壁面２５ｄよりも低くなるように設定される。
ii）細胞層バリアの形成
次いで、図９Ｂに示すように、第二流路ポート２３、及び／又は第一流路ポート２１から培養液９３を注入する。
次いで、図９Ｂに示すように、第二流路ポート２３、及び／又は第一流路ポート２１から培養液９３を注入する。
次いで、図９Ｃに示すように、第一流路ポート２１から細胞９４ｅを投入し、培養する。これにより、図９Ｄに示すように、細胞層バリア９５ｅがゲル９２上に形成される。
iii）培養液の灌流・観察
次いで、図９Ｅに示すように、第二流路ポート２３、第一流路ポート２１からそれぞれ培養液、化学物質、細胞を注入し、第三流路ポート２４、第一流路ポート２２から回収する。すなわち細胞層バリア９５ｅのApical側（図９Ｅでは細胞層バリア９５ｅの上側）、Basal側（図９Ｅでは細胞層バリア９５ｅの下側）の両面において、それぞれサンプリングすることにより、注入した化学物質や細胞の移行経路を反映した作用や動態を、生化学的、分子生物学的に解析することが可能である。また顕微鏡などを用いて、注入した化学物質や細胞の組織モデルに対する拡散や影響を組織学的に解析することも可能である。
次いで、図９Ｅに示すように、第二流路ポート２３、第一流路ポート２１からそれぞれ培養液、化学物質、細胞を注入し、第三流路ポート２４、第一流路ポート２２から回収する。すなわち細胞層バリア９５ｅのApical側（図９Ｅでは細胞層バリア９５ｅの上側）、Basal側（図９Ｅでは細胞層バリア９５ｅの下側）の両面において、それぞれサンプリングすることにより、注入した化学物質や細胞の移行経路を反映した作用や動態を、生化学的、分子生物学的に解析することが可能である。また顕微鏡などを用いて、注入した化学物質や細胞の組織モデルに対する拡散や影響を組織学的に解析することも可能である。
また、構築した組織モデルに応じて、細胞層バリア９５ｅのApical側の液体を灌流させることもできる。
例えば、血管内皮細胞からなる細胞層バリア９５ｅを形成することにより、血管モデルを構築する。
第一流路ポート２１から第一流路ポート２２へ化学誘引物質（例えばTNα）を含んだ培養液を灌流し、血管内皮を活性化させる。その後、第一流路ポート２１（または第一流路ポート２２）から、白血球や腫瘍細胞を投入する。
これにより、投入した細胞の、細胞層バリア９５ｅへの接着や、細胞層バリア９５ｅからの遊走を評価することができる。
＜使用例５＞
（ｂ）On＆In-Gel培養
細胞バリア層を経由する生理活性物質、薬剤などの透過、吸収、代謝などを評価することができる。例えば、角膜からの透過率・毒性、腸管からの吸収効率・代謝・毒性、血管からの透過率・毒性を評価することができる。
（ｂ）On＆In-Gel培養
細胞バリア層を経由する生理活性物質、薬剤などの透過、吸収、代謝などを評価することができる。例えば、角膜からの透過率・毒性、腸管からの吸収効率・代謝・毒性、血管からの透過率・毒性を評価することができる。
i）細胞支持体の形成
初めに、図１０Ａに示すように、細胞９４ｆを含んだゲル９２の水溶液を第一流路ポート２１から注入し、ゲル化させる。注入されたゲル９２は、毛細管力、表面張力により、概ね第一流路ポート２１，２２間の範囲に留まる。このとき、注入されるゲル９２の量は、注入されたゲル９２の高さが、第二流路２６の壁面２６ｄ及び第三流路２７の壁面２７ｄよりも高く、且つ第一流路２５の壁面２５ｄよりも低くなるように設定される。
初めに、図１０Ａに示すように、細胞９４ｆを含んだゲル９２の水溶液を第一流路ポート２１から注入し、ゲル化させる。注入されたゲル９２は、毛細管力、表面張力により、概ね第一流路ポート２１，２２間の範囲に留まる。このとき、注入されるゲル９２の量は、注入されたゲル９２の高さが、第二流路２６の壁面２６ｄ及び第三流路２７の壁面２７ｄよりも高く、且つ第一流路２５の壁面２５ｄよりも低くなるように設定される。
ii）細胞層バリアの形成
次いで、図１０Ｂに示すように、第二流路ポート２３、及び／又は第一流路ポート２１から培養液９３を注入する。
次いで、図１０Ｂに示すように、第二流路ポート２３、及び／又は第一流路ポート２１から培養液９３を注入する。
次いで、図１０Ｃに示すように、第一流路ポート２１から細胞９４ｇを投入し、培養する。これにより、図１０Ｄに示すように、細胞層バリア９５ｇがゲル９２上に形成される。
iii）培養液の灌流・観察
次いで、図１０Ｅに示すように、第二流路ポート２３、第一流路ポート２１からそれぞれ培養液、化合物質、細胞を注入し、第三流路ポート２４、第一流路ポート２２から回収する。すなわち細胞層バリア９５ｇ側の面と、細胞９４ｆを含んだゲル９２側の両面において、それぞれサンプリングすることにより、注入した化学物質や細胞の移行経路を反映した作用や動態を、生化学的、分子生物学的に解析することが可能である。また顕微鏡などを用いて、注入した化学物質や細胞の組織モデルに対する拡散や影響を組織学的に解析することも可能である。
次いで、図１０Ｅに示すように、第二流路ポート２３、第一流路ポート２１からそれぞれ培養液、化合物質、細胞を注入し、第三流路ポート２４、第一流路ポート２２から回収する。すなわち細胞層バリア９５ｇ側の面と、細胞９４ｆを含んだゲル９２側の両面において、それぞれサンプリングすることにより、注入した化学物質や細胞の移行経路を反映した作用や動態を、生化学的、分子生物学的に解析することが可能である。また顕微鏡などを用いて、注入した化学物質や細胞の組織モデルに対する拡散や影響を組織学的に解析することも可能である。
また、構築した組織モデルに応じて、細胞層バリア９５ｇのApical側の液体を灌流させることもできる。
なお、本実施例では、両面灌流のOn&In-Gelの実施例と同様に、基底膜モデルや血管モデルを構築し、評価を行うことが可能である。
＜使用例６＞
（ｃ）In-Gel培養
例えば、線維芽細胞、腫瘍細胞、などの細胞周辺環境の化学誘引物質（化学信号）に対する細胞遊走性の測定をすることができる。
（ｃ）In-Gel培養
例えば、線維芽細胞、腫瘍細胞、などの細胞周辺環境の化学誘引物質（化学信号）に対する細胞遊走性の測定をすることができる。
i）細胞支持体の形成
初めに、図１１Ａに示すように、細胞９４ｈを含んだゲル９２の水溶液を第一流路ポート２１から注入し、ゲル化させる。注入されたゲル９２は、毛細管力、表面張力により、概ね第一流路ポート２１，２２間の範囲に留まる。このとき、注入されるゲル９２の量は、注入されたゲル９２の高さが、第二流路２６の壁面２６ｄ及び第三流路２７の壁面２７ｄよりも高く、且つ第一流路２５の壁面２５ｄよりも低くなるように設定される。
初めに、図１１Ａに示すように、細胞９４ｈを含んだゲル９２の水溶液を第一流路ポート２１から注入し、ゲル化させる。注入されたゲル９２は、毛細管力、表面張力により、概ね第一流路ポート２１，２２間の範囲に留まる。このとき、注入されるゲル９２の量は、注入されたゲル９２の高さが、第二流路２６の壁面２６ｄ及び第三流路２７の壁面２７ｄよりも高く、且つ第一流路２５の壁面２５ｄよりも低くなるように設定される。
次いで、図１１Ｂに示すように、第二流路ポート２３、及び／又は第一流路ポート２１から培養液９３を注入する。
ii）培養液の灌流・観察
次いで、図１１Ｃに示すように、第二流路ポート２３、第一流路ポート２１からそれぞれ培養液、化合物質、細胞を注入し、第三流路ポート２４、第一流路ポート２２から回収する。すなわち細胞９４ｈを含んだゲル９２側の両面において、それぞれサンプリングすることにより、注入した化学物質や細胞の移行経路を反映した作用や動態を、生化学的、分子生物学的に解析することが可能である。また顕微鏡などを用いて、注入した化学物質や細胞の組織モデルに対する拡散や影響を組織学的に解析することも可能である。
次いで、図１１Ｃに示すように、第二流路ポート２３、第一流路ポート２１からそれぞれ培養液、化合物質、細胞を注入し、第三流路ポート２４、第一流路ポート２２から回収する。すなわち細胞９４ｈを含んだゲル９２側の両面において、それぞれサンプリングすることにより、注入した化学物質や細胞の移行経路を反映した作用や動態を、生化学的、分子生物学的に解析することが可能である。また顕微鏡などを用いて、注入した化学物質や細胞の組織モデルに対する拡散や影響を組織学的に解析することも可能である。
また、構築した組織モデルに応じて、細胞９４ｈを含んだゲル９２側の上面において、液体を灌流させることもできる。
以上のように、片面灌流培養において、人工的なメンブレンを使用せずとも、細胞層バリアを形成することが可能となる。
（３）気液界面培養
細胞バリア層として、ケラチノサイト、線維芽細胞を形成し、経皮からの吸収効率・毒性を評価することができる。
細胞バリア層として、ケラチノサイト、線維芽細胞を形成し、経皮からの吸収効率・毒性を評価することができる。
＜使用例７＞
i）細胞支持体の形成
初めに、図１２Ａに示すように、細胞９４ｉを含んだゲル９２の水溶液を第一流路ポート２１から注入し、ゲル化させる。注入されたゲル９２は、毛細管力、表面張力により、概ね第一流路ポート２１，２２間の範囲に留まる。このとき、注入されるゲル９２の量は、注入されたゲル９２の高さが、第二流路２６の壁面２６ｄ及び第三流路２７の壁面２７ｄよりも高く、且つ第一流路２５の壁面２５ｄよりも低くなるように設定される。
i）細胞支持体の形成
初めに、図１２Ａに示すように、細胞９４ｉを含んだゲル９２の水溶液を第一流路ポート２１から注入し、ゲル化させる。注入されたゲル９２は、毛細管力、表面張力により、概ね第一流路ポート２１，２２間の範囲に留まる。このとき、注入されるゲル９２の量は、注入されたゲル９２の高さが、第二流路２６の壁面２６ｄ及び第三流路２７の壁面２７ｄよりも高く、且つ第一流路２５の壁面２５ｄよりも低くなるように設定される。
ii）細胞層バリアの形成
次いで、図１２Ｂに示すように、第二流路ポート２３、及び／又は第一流路ポート２１から培養液９３を注入する。
次いで、図１２Ｂに示すように、第二流路ポート２３、及び／又は第一流路ポート２１から培養液９３を注入する。
次いで、図１２Ｃに示すように、第一流路ポート２１から細胞９４ｊを投入し、培養する。これにより、図１２Ｄに示すように、細胞層バリア９５ｊがゲル９２上に形成される。
次いで、図１２Ｅに示すように、細胞層バリア９５ｊ側の培養液を除去し、空気へ暴露する。細胞層バリア９５ｊとして、ケラチノサイトを培養した場合に、ケラチノサイト重層化による重層扁平上皮への増殖分化を発現させることができる。
以上のように、本実施形態に係るマイクロ流体デバイス１の使用方法は、第二流路ポート２３または第三流路ポート２４からグリセロールまたは熱相転移ヒドロゲル９１を注入し、グリセロールまたは熱相転移ヒドロゲル９１の高さを第二流路２６の主面２０ｂ側の壁面２６ｄ及び第三流路２７の主面２０ｂ側の壁面２７ｄよりも高く且つ第一流路２５の主面２０ｂ側の壁面２５ｄよりも低くする第一ステップと、第一流路ポート２１からゲル９２の水溶液を注入する第二ステップと、ゲル９２の水溶液をゲル化させる第三ステップと、第三流路ポート２４または第二流路ポート２３からグリセロールまたは熱相転移ヒドロゲル９１を排出する第四ステップと、を有するものでよい。
ゲル９２の土台になる材料としては、比重がゲル９２よりも高いことを要する。ゲル９２の比重のほうが高いと、ゲル９２の土台の中にゲル９２が沈み込んで、ゲル９２の層を形成できないためである。具体的な材料としては、グリセロールや熱相転移ヒドロゲルが利用可能である。熱相転移ヒドロゲルとしては、４～３７℃で液化することが好ましい。
使用可能なゲル９２の条件として、生理的条件下(３７℃)でゲル化すること、細胞毒性がないことが挙げられる。具体的には、天然物由来高分子のゲルと合成高分子のゲルとがある。
天然物由来高分子のゲルとしては、コラーゲン（I型、II型、III型、V型、XI型など）、マウスＥＨＳ腫瘍抽出物（IV型コラーゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカンなどを含む）より再構成された基底膜成分（商品名：マトリゲル）、ゼラチン、寒天、アガロース、フィブリン、グリコサミノグリカン、ヒアルロン酸、プロテオグリカ、等があげられる。
合成高分子のゲルとしては、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、メチルセルロース、ポリエチレンオキシド、ポリ(II-ヒドロキシエチルメタクリレート)／ポリカプロラクトン（poly(II-hydroxyethyl methacrylate)/polycaprolactone）、および、これらの混合物、等があげられる。
以上のように、気液界面培養において、人工的なメンブレンを使用せずとも、細胞層バリアを形成することが可能となる。
以上、本発明の実施形態について図面に基づいて説明したが、具体的な構成は、これらの実施形態に限定されるものでないと考えられるべきである。本発明の範囲は、上記した実施形態の説明だけではなく特許請求の範囲によって示され、さらに特許請求の範囲と均等の意味及び範囲内でのすべての変更が含まれる。
上記の各実施形態で採用している構造を他の任意の実施形態に採用することは可能である。各部の具体的な構成は、上記した実施形態のみに限定されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で種々変形が可能である。
（１）上記実施形態に係るマイクロ流体デバイス１においては、第二流路２６が第一流路２５の端部に接続されているが、第二流路２６は、第一流路２５の中途部に接続されてもよい。図１３の例では、屈曲して形成された第一流路２５の屈曲部に第二流路２６が接続されている。
（２）第二流路２６は複数設けられてもよい。図１４の例では、２つの第二流路２６が第一流路２５に接続されている。なお、この例では２つの第二流路２６の壁面２６ｄの高さが異なっているが、同じでもよい。
（３）図１５に示すように、マイクロ流体デバイス１は、第二流路２６に接続され、主面２０ａに沿う方向に延在する第四流路２８と、第三流路２７に接続され、主面２０ａに沿う方向に延在する第五流路２９と、第四流路２８に接続され、主面２０ｂに向かって、第二基板２０を貫通して形成される少なくとも一つの第四流路ポート３０と、第五流路２９に接続され、主面２０ｂに向かって、第二基板２０を貫通して形成される少なくとも一つの第五流路ポート３１と、を備え、第四流路２８の主面２０ｂ側の壁面２８ｄ及び第五流路２９の主面２０ｂ側の壁面２９ｄは、第二流路２６の主面２０ｂ側の壁面２６ｄ及び第三流路２７の主面２０ｂ側の壁面２７ｄよりも主面２０ａに近いものでもよい。
（４）上記実施形態に係るマイクロ流体デバイス１は、第二基板２０の主面２０ａに形成した凹部（第一凹部２５ａ、第二凹部２６ａ、及び第三凹部２７ａ）のみにより、流路（第一流路２５、第二流路２６、及び第三流路２７）を構成していたが、これに限定されない。例えば図１６に示すように、第一基板１０の主面１０ａに形成された凸部１１と第二基板２０の第一凹部２５ａとにより第一流路２５を構成してもよい。この場合であっても、第一流路２５の主面２０ｂ側の壁面２５ｄは、第二流路２６の主面２０ｂ側の壁面２６ｄ及び第三流路２７の主面２０ｂ側の壁面２７ｄよりも主面２０ｂに近い。
（５）図１７に示すように、複数のマイクロ流体デバイス１が、１枚のプレート上に構成されていてもよい。
（６）上記実施形態に係るマイクロ流体デバイス１においては、第一流路２５の幅がＺ方向に一定であるが、これに限定されない。図１８に示すように、第一流路２５の幅は、第二主面２０ｂに向かって拡がっていてもよい。これにより、第一流路２５に生じる毛細管力を緩和することができる。図１８は、図５のＣ－Ｃ線断面図に対応する。図１８（ａ）に示す例では、第一流路２５は、幅がＺ方向に一定の定幅部２５１と、幅が定幅部２５１の幅から第二主面２０ｂへ向かうにつれて徐々に拡がる拡幅部２５２と、を有する。また、図１８（ｂ）に示す例では、第一流路２５は、幅がＺ方向に一定の定幅部２５１と、幅が定幅部２５１の幅よりも広く且つＺ方向に一定の拡幅部２５３と、を有する。
１ ：マイクロ流体デバイス
１０ ：第一基板
２０ ：第二基板
２０ａ ：主面
２０ｂ ：主面
２１ ：第一流路ポート
２２ ：第一流路ポート
２３ ：第二流路ポート
２４ ：第三流路ポート
２５ ：第一流路
２５ａ ：第一凹部
２５ｄ ：壁面
２６ ：第二流路
２６ａ ：第二凹部
２６ｄ ：壁面
２７ ：第三流路
２７ａ ：第三凹部
２７ｄ ：壁面
２８ ：第四流路
２８ｄ ：壁面
２９ ：第五流路
２９ｄ ：壁面
３０ ：第四流路ポート
３１ ：第五流路ポート
９１ ：グリセロールまたは熱相転移ヒドロゲル
９２ ：ゲル
１０ ：第一基板
２０ ：第二基板
２０ａ ：主面
２０ｂ ：主面
２１ ：第一流路ポート
２２ ：第一流路ポート
２３ ：第二流路ポート
２４ ：第三流路ポート
２５ ：第一流路
２５ａ ：第一凹部
２５ｄ ：壁面
２６ ：第二流路
２６ａ ：第二凹部
２６ｄ ：壁面
２７ ：第三流路
２７ａ ：第三凹部
２７ｄ ：壁面
２８ ：第四流路
２８ｄ ：壁面
２９ ：第五流路
２９ｄ ：壁面
３０ ：第四流路ポート
３１ ：第五流路ポート
９１ ：グリセロールまたは熱相転移ヒドロゲル
９２ ：ゲル
Claims (6)
- 第一基板と、
前記第一基板に対して部分的に接合された第二基板と、
前記第一基板と前記第二基板の間で前記第二基板の第一主面に沿う方向に延在する第一流路と、
前記第一流路に接続され、前記第一主面に沿う方向に延在する第二流路と、
前記第一流路に接続され、前記第一主面に沿う方向に延在する第三流路と、
前記第一流路に接続され、前記第二基板の前記第一主面とは反対側に位置する第二主面に向かって、前記第二基板を貫通して形成される複数の第一流路ポートと、
前記第二流路に接続され、前記第二主面に向かって、前記第二基板を貫通して形成される少なくとも一つの第二流路ポートと、
前記第三流路に接続され、前記第二主面に向かって、前記第二基板を貫通して形成される少なくとも一つの第三流路ポートと、を備え、
前記第一流路の前記第二主面側の壁面は、前記第二流路の前記第二主面側の壁面及び前記第三流路の前記第二主面側の壁面よりも前記第二主面に近い、マイクロ流体デバイス。 - 前記第二流路は、前記第一流路の中途部に接続される、請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。
- 前記第二流路は複数設けられる、請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。
- 前記第二流路に接続され、前記第一主面に沿う方向に延在する第四流路と、前記第三流路に接続され、前記第一主面に沿う方向に延在する第五流路と、前記第四流路に接続され、前記第二主面に向かって、前記第二基板を貫通して形成される少なくとも一つの第四流路ポートと、前記第五流路に接続され、前記第二主面に向かって、前記第二基板を貫通して形成される少なくとも一つの第五流路ポートと、を備え、
前記第四流路の前記第二主面側の壁面及び前記第五流路の前記第二主面側の壁面は、前記第二流路の前記第二主面側の壁面及び前記第三流路の前記第二主面側の壁面よりも前記第一主面に近い、請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。 - 前記第一流路の幅は、前記第二主面に向かって拡がる、請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。
- 請求項１に記載のマイクロ流体デバイスの使用方法であって、
前記第二流路ポートまたは前記第三流路ポートからグリセロールまたは熱相転移ヒドロゲルを注入し、前記グリセロールまたは熱相転移ヒドロゲルの高さを前記第二流路の前記第二主面側の壁面及び前記第三流路の前記第二主面側の壁面よりも高く且つ前記第一流路の前記第二主面側の壁面よりも低くする第一ステップと、
前記第一流路ポートからゲル水溶液を注入する第二ステップと、
前記ゲル水溶液をゲル化させる第三ステップと、
前記第三流路ポートまたは前記第二流路ポートから前記グリセロールまたは熱相転移ヒドロゲルを排出する第四ステップと、を有するマイクロ流体デバイスの使用方法。
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