JP2021104015A - 培養デバイス、人工組織製造方法、及び人工組織を用いた薬剤評価方法 - Google Patents

Abstract

【課題】操作性に優れた培養デバイス、人工組織製造方法、及び人工組織を用いた薬剤評価方法を提供する。【解決手段】細胞を培養可能な培養空間２２及び前記培養空間２２に開口する第１開口を有する第１基材２０と、培地を灌流可能な灌流流路及び前記灌流流路に開口する第２開口を有し、前記培養空間２２と前記灌流流路とが連通するように前記第１基材２０を着脱可能に保持する第２基材３０と、前記第１開口又は前記第２開口に配置される、一つ以上の貫通孔を有する伸展可能な膜４０と、を有する本体部１２と、前記本体部１２に力を加えることにより前記膜４０を伸展させるように構成された伸展装置１４と、を備える細胞を培養するための培養デバイス１０である。【選択図】図１

Description

本発明の実施形態は、培養デバイス、人工組織製造方法、及び人工組織を用いた薬剤評価方法に関する。
本願は、２０１９年１２月２６日に出願された米国特許仮出願６２／９５３，８８５号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。

近年、細胞培養においてチップ上で生体内に類似した環境を構築することによって細胞由来の臓器や組織の機能を再現する生体機能チップ（ＯＯＣ：Ｏｒｇａｎ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐ）技術が精力的に開発されている。例えば、肺胞上皮細胞と血管内皮細胞との共培養において、伸展刺激を加えて肺の伸縮を再現するとともにせん断流れ刺激を加えて血流を再現する技術が知られている（例えば、特許文献１）。

特許第５４１５５３８号公報

しかしながら、従来の方法では、閉じた構造の流路を用いているため、細胞の観察などにおける培養デバイスの操作性のさらなる改善が望まれていた。

そこで、本発明は、操作性に優れた培養デバイス、人工組織製造方法、及び人工組織を用いた薬剤評価方法を提供することを目的とする。

本発明は、以下の態様を含む。
［１］細胞を培養可能な培養空間及び前記培養空間に開口する第１開口を有する第１基材と、培地を灌流可能な灌流流路及び前記灌流流路に開口する第２開口を有し、前記培養空間と前記灌流流路とが連通するように前記第１基材を着脱可能に保持する第２基材と、前記第１開口又は前記第２開口に配置される、一つ以上の貫通孔を有する伸展可能な膜と、を有する本体部と、前記本体部に力を加えることにより前記膜を伸展させるように構成された伸展装置と、
を備える、細胞を培養するための培養デバイス。
［２］前記伸展装置は、前記膜が伸展及び収縮を繰り返すように、前記本体部に力を反復的に加える、請求項１に記載の培養デバイス。
［３］前記伸展装置は、前記第１基材と前記第２基材とを互いに固定する、［１］又は［２］に記載の培養デバイス。
［４］前記伸展装置は、前記膜の伸展方向に沿った引張力を前記本体部に加える、［１］〜［３］のいずれか一つに記載の培養デバイス。
［５］前記第１基材及び前記第２基材は、弾性変形可能な材料から構成される、［１］〜［４］のいずれか一つに記載の培養デバイス。
［６］前記膜は、ポリジメチルシロキサンから構成される、［１］〜［５］のいずれか一つに記載の培養デバイス。
［７］前記膜は、前記第１開口に配置される、［１］〜［６］のいずれか一つに記載の培養デバイス。
［８］前記膜は、前記培養空間に対向する第１面及び前記灌流流路に対向する第２面を有し、前記第１面側で組織系細胞が培養され、前記第２面側で管腔系細胞が培養される、［１］〜［７］のいずれか一つに記載の培養デバイス。
［９］［１］〜［８］のいずれか一つに記載の培養デバイスを用いて細胞の共培養を行う人工組織製造方法であって、前記膜の第１面に組織系細胞を播種して前記培養空間で培養するステップと、前記膜の第２面に管腔系細胞を播種して前記灌流流路で培養するステップと、前記伸展装置により前記膜を伸展させるステップと、を含む、人工組織製造方法。
［１０］［１］〜［８］のいずれか一つに記載の培養デバイスを用いて人工組織を製造するステップと、薬剤を前記人工組織に接触させるステップと、前記薬剤の接触による刺激に対する前記人工組織の応答、又は前記人工組織に対する前記薬剤の浸透性を測定するステップと、を含む、人工組織を用いた薬剤評価方法。

本発明の実施形態によれば、操作性に優れた培養デバイス、人工組織製造方法、及び人工組織を用いた薬剤評価方法を提供することができる。

実施形態に係る培養デバイスを含む培養システムを示す斜視図。 実施形態に係る培養デバイスを示す分解斜視図。 実施形態に係る培養デバイスを示す平面図。 実施形態に係る培養デバイスを示す、図３のＩＶ−ＩＶ線に沿った断面図。 実施形態に係る培養デバイスを示す、図３のＶ−Ｖ線に沿った断面図。 製造した膜を通過した蛍光ビーズの数と時間との関係を表すグラフ。 製造した培養デバイスにおける１Ｈｚでの伸展動作中の膜の両端の長さと時間との関係を表すグラフ。 製造した培養デバイスにおけるせん断応力と流量との関係を表すグラフ。 製造した培養デバイスにより伸展刺激を加えた場合の細胞の明視野写真。 製造した培養デバイスにより伸展刺激を加えなかった場合の細胞の明視野写真。 図９Ａ及び図９Ｂの画像から計算した標準化輝度値。

以下、実施形態の培養デバイス、人工組織製造方法、及び人工組織を用いた薬剤評価方法を、図面を参照して説明する。
なお、以下の実施形態は、本発明の一態様を示すものであり、この発明を限定するものではなく、本発明の技術的思想の範囲内で任意に変更可能である。また、以下の図面においては、各構成をわかりやすくするために、実際の構造と各構造における縮尺や数などを異ならせている場合がある。

説明のために、ｘ軸、ｙ軸、及びｚ軸から成る直交座標系を定義する。ｘ軸及びｙ軸は水平面に平行であり、ｚ軸は鉛直方向に平行である。ここで、＋ｚ方向を上向き（すなわち重力方向と反対方向）、−ｚ方向を下向き（すなわち重力方向）と定義する。ただし、上記座標系は単に説明のために便宜上設定したものであり、発明を何ら限定するものではない。

［培養システム］
本実施形態に係る培養デバイス１０及び培養デバイス１０を用いた培養システム１について、図１〜５を参照して説明する。
図１は、実施形態に係る培養デバイス１０を含む培養システム１を示す斜視図である。図２は、実施形態に係る培養デバイス１０を示す分解斜視図である。図３は、実施形態に係る培養デバイス１０を示す平面図である。図４は、実施形態に係る培養デバイス１０を示す、図３のＩＶ−ＩＶ線に沿った断面図である。図５は、実施形態に係る培養デバイス１０を示す、図３のＶ−Ｖ線に沿った断面図である。

培養システム１は、培養デバイス１０、培地供給部１００、供給管１０１、排出管１０２、及び調整部１１０を備える。

図１及び図４に示すように、培地供給部１００は、培地を貯留し培養デバイス１０へ当該培地を供給する。供給管１０１は、一端が培養デバイス１０に接続されている。供給管１０１は、培地供給部１００から供給された培地を培養デバイス１０に導入する。排出管１０２は、培養デバイス１０から培地を排出する。

調整部１１０は、培地供給部１００から供給されて培養デバイス１０に導入される培地の導入量を調整することで、培養デバイス１０における培地の流速を調整する。調整部１１０は、一例として、供給管１０１の中途に設けられたポンプである。調整部１１０としてのポンプの駆動量を調整し、培養デバイス１０に導入される培地の導入量を調整することにより、培養デバイス１０における培地の流速を制御できる。なお、調整部１１０としては、培地供給部１００から供給される培地の量を調整する構成であってもよい。

（培養デバイス）
本実施形態に係る培養デバイスは、細胞を培養可能な培養空間及び前記培養空間に開口する第１開口を有する第１基材と、培地を灌流可能な灌流流路及び前記灌流流路に開口する第２開口を有し、前記培養空間と前記灌流流路とが連通するように前記第１基材を着脱可能に保持する第２基材と、前記第１開口又は前記第２開口に配置される、一つ以上の貫通孔を有する伸展可能な膜と、を有する本体部と、前記本体部に力を加えることにより前記膜を伸展させるように構成された伸展装置と、を備える、細胞を培養するための培養デバイスである。

培養デバイス１０は、細胞の培養を行うために使用され、好ましくは複数の種類の細胞の共培養を行うために使用される。培養デバイス１０は、本体部１２及び伸展装置１４を含む。

（本体部）
図１及び図２に示すように、本体部１２は、第１基材２０、第２基材３０、及び膜４０を含む。

第１基材２０は、図２及び図３に示すように、ｘｙ平面視で矩形状の直方体形状を有する。好ましくは、第１基材２０は、少なくともｘ方向において伸展可能であり、例えば弾性変形可能な材料から構成される。第１基材２０は、例えば、ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）、シリコーンゴムなどのエラストマーから構成される。

第１基材２０は、内部に細胞を培養可能な培養空間２２を有する。本実施形態では、培養空間２２は、第１基材２０の中央部を厚さ方向（ｚ方向）に貫通する。このため、第１基材２０は、上面及び下面に培養空間２２への開口を有する。以下、第１基材２０の下面に設けられた培養空間２２への開口を第１開口２４という。

第２基材３０は、図２及び図３に示すように、ｘｙ平面視で矩形状の平板状に形成されている。好ましくは、第２基材３０は、少なくともｘ方向において伸展可能であり、例えば弾性変形可能な材料から構成される。第２基材３０は、第１基材２０と同様に、例えば、ＰＤＭＳ、シリコーンゴムなどのエラストマーから構成される。

第２基材３０は、第１基材２０を着脱可能に保持することができる。例えば、図１、図４、及び図５に示すように、第１基材２０の下面と第２基材３０の上面とを接触させた状態で第１基材２０と第２基材３０とが固定される。第１基材２０と第２基材３０との固定方法は特に限定されず、後述の第１固定部材５０及び第２固定部材６０によって機械的に締結されてもよく、クランプや３次元造形装置で製造した嵌め合い器具など別の固定部材を用いて互いに固定されてもよい。また、第１基材２０及び第２基材３０が、互いに対応する係合部や嵌合部などの結合手段を有してもよい。

図２〜４に示すように、第２基材３０は、第１基材２０と対向する面（上面）に開口する溝部３２を有する。溝部３２は、周囲を第２基材３０の上面に囲まれた窪みである。以下、第２基材３０の上面に設けられた溝部３２への開口を第２開口３４という。溝部３２は、ｘ方向及びｙ方向に広がっており、ｙ方向の両端部は、先端が先細る形状にそれぞれ形成されている。なお、溝部３２の形状は上記例に限定されず、先端まで同一幅で延びてもよく、他の任意の形状であってもよい。

図３及び図４に示すように、第１基材２０は、ｘ方向の中央、ｙ方向の両端において接続孔２６Ａ、２６Ｂを有する。接続孔２６Ａ、２６Ｂは、それぞれ第１基材２０を厚さ方向に貫通している。接続孔２６Ａには、供給管１０１が接続される。接続孔２６Ｂには、排出管１０２が接続される。第１基材２０が第２基材３０に取り付けられると、接続孔２６Ａ、２６Ｂの下端は、それぞれ溝部３２に開口する。

第１基材２０が第２基材３０に取り付けられると、溝部３２と第１基材２０の下面とに囲まれてｙ方向に延びる灌流流路３６が形成される。灌流流路３６は、ｙ方向の一端側に供給管１０１が接続され、他端側に排出管１０２が接続されている。第１基材２０の下面の第１開口２４と第２基材３０の上面の第２開口３４とが連通することにより、培養空間２２と灌流流路３６とが、膜４０を挟んで、膜４０の貫通孔を介して連通する。

膜４０は、一つ以上の貫通孔を有する、両面で細胞を培養可能な膜である。図１、図４、及び図５に示すように、膜４０は、第１基材２０の第１開口２４又は第２基材３０の第２開口３４に配置される。本実施形態では、膜４０は第１開口２４に配置されているが、これは第１基材２０を膜４０とともに取り外すことにより膜４０に付着した細胞の観察などが容易である点で好ましい。本実施形態では、膜４０は、共有結合で第１基材２０と結合しており、例えばプラズマボンディングにより第１基材２０と結合される。膜４０は、一つ以上の貫通孔を通して、液体や貫通孔の直径より小さな粒子などを透過することができる。例えば、膜４０は、多孔質膜であり、例えば複数の貫通孔を有する。

膜４０は、第１基材２０の培養空間２２に面する第１面４２と、第２基材３０の灌流流路３６に面する第２面４４と、を有する。第１基材２０が第２基材３０に取り付けられたとき、第２面４４は第１基材２０の下面及び第２基材３０の上面と面一であってよい。

膜４０は、ｘｙ平面において伸展可能である。例えば、膜４０は、弾性変形可能な材料から構成される。膜４０は、例えば、ＰＤＭＳ、シリコーンゴムなどのエラストマーから構成される。例えば、マイクロピラー上にＰＤＭＳなどの材料をコーティングすることにより、膜４０を製造することができる。膜４０の片面又は両面に、コラーゲンコーティングなどのコーティングが設けられてもよい。

膜４０は、任意の高分子材料から構成された高分子膜であってもよい。高分子材料の例としては、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリパラキシリレン（いわゆるパリレン）、ハイドロゲル（アルギン酸ゲル、ゼラチンなど）などが挙げられる。あるいは、膜４０は、細胞外マトリックス成分、例えばガラス化された細胞外マトリックス成分を含んでもよい。膜４０は、例えば、ハイドロゲルを乾燥させてガラス化した後に、再水和して作製される。膜４０は、例えば、コラーゲンガラス化ゲル膜であり、コラーゲン繊維が高密度で配された多孔質膜状に形成されている。

膜４０の厚さは、例えば０．１μｍ〜５０μｍであり、好ましくは０．５μｍ〜２０μｍであり、より好ましくは１μｍ〜１０μｍであり、さらに好ましくは２μｍ〜５μｍである。膜４０に設けられた貫通孔の直径は、例えば０．１μｍ〜２０μｍであり、好ましくは０．５μｍ〜１５μｍであり、より好ましくは１μｍ〜１０μｍであり、さらに好ましくは２μｍ〜５μｍである。

培養空間２２に対向する膜４０の第１面４２には、組織系細胞が播種後に培養されて組織層８０が形成される（詳細は後述する）。灌流流路３６に対向する膜４０の第２面４４には、組織系細胞が播種後に培養されて管腔層８２が形成される（詳細は後述する）。膜４０の第２面４４に播種された管腔系細胞に対して、灌流流路３６を灌流する培地による流れ刺激が付与されるように、灌流流路３６の幅は、膜４０の幅よりも大きいことが好ましい。また、管腔系細胞に対して使用する培地量を減らすため、及び層流の培地流れを作るために、灌流流路３６の厚さ（深さ）としては、１ｍｍ以下であることが好ましい。

第１基材２０には、第１開口２４の周壁部などに、組織層８０を固定するアンカー（図示せず）が設けられてよい。また、第２基材３０には、第２開口３４の周壁部などに、管腔層８２を固定するアンカー（図示せず）が設けられてよい。アンカーで組織層８０や管腔層８２の端部を固定することにより、組織層８０及び管腔層８２を構成する細胞に対して伸展装置１４による伸展刺激をより効率的に加えることができる。なお、アンカーの配置や構成は上記例に限定されない。

（伸展装置）
伸展装置１４は、培養される細胞に伸展刺激を加えるために、本体部１２に力を加えることにより膜４０を伸展させる。例えば、伸展装置１４は、図３及び図５に示すように、膜４０が伸展及び収縮を繰り返すように、本体部１２に力を反復的に加える。例えば、伸展装置１４は、膜４０の伸展方向（ｘ方向）に沿った引張力を本体部１２に加える。伸展装置１４は、図１に示すように、第１固定部材５０、第２固定部材６０、及び伸展機構７０を含む。

第１固定部材５０は、本体部１２のｘ方向の一端部を固定する。本実施形態では、第１固定部材５０は、図１、図２、及び図５に示すように、第１基材２０及び第２基材３０のｘ方向の一端部を挟持して、第１基材２０と第２基材３０とを互いに固定する。第１固定部材５０は、ベース５２、支持部材５４、押さえ部材５６、及び締付部材５８を有する。

ベース５２は、第１固定部材５０の土台として機能する平板状の部材である。図５に示すように、ベース５２は、第２基材３０の下面のｘ方向の一端部を支持する。ベース５２は、第２基材３０の下面の形状に沿った溝を有してもよい。

支持部材５４は、ベース５２の上面から高さ方向（＋ｚ方向）に突出する。支持部材５４は、第１基材２０及び第２基材３０のｘ方向一端側の側面を支持する。また、支持部材５４は、ベース５２と押さえ部材５６とを結合する。

押さえ部材５６は、図２に示すように、支持部材５４を通す開口及び締付部材５８を通す孔を有する平板状の部材である。図５に示すように、押さえ部材５６は、第１基材２０の上面のｘ方向の一端部を支持する。

締付部材５８は、ベース５２と押さえ部材５６とを締結する。例えば、締付部材５８はボルトであり、対応するナットがベース５２に設けられる。締付部材５８は、ベース５２及び押さえ部材５６で第１基材２０及び第２基材３０を挟持した状態で、押さえ部材５６の孔を通ってベース５２に固定されることにより、第１基材２０及び第２基材３０のｘ方向の一端部をベース５２及び押さえ部材５６に固定させる。なお、図面には２個の締付部材５８が示されているが、締付部材５８の数や配置などはこれに限定されない。

第２固定部材６０は、第１固定部材５０と略同じ構成を備え、本体部１２のｘ方向の他端部を固定する。本実施形態では、第２固定部材６０は、図１、図２、及び図５に示すように、第１基材２０及び第２基材３０のｘ方向の他端部を挟持して、第１基材２０と第２基材３０とを互いに固定する。また、第２固定部材６０は、後述の伸展機構７０によってｘ方向に往復運動を行う。第２固定部材６０は、ベース６２、支持部材６４、押さえ部材６６、及び締付部材６８を有する。以下では、第１固定部材５０と共通する構成についての説明は適宜省略する。

ベース６２は、第２固定部材６０の土台として機能する平板状の部材である。図５に示すように、ベース６２は、第２基材３０の下面のｘ方向の他端部を支持する。支持部材６４は、第１基材２０及び第２基材３０のｘ方向他端側の側面を支持する。押さえ部材６６は、第１基材２０の上面のｘ方向の他端部を支持する。締付部材６８は、ベース６２及び押さえ部材６６で第１基材２０及び第２基材３０を挟持した状態で、押さえ部材６６の孔を通ってベース６２に固定されることにより、第１基材２０及び第２基材３０のｘ方向の他端部をベース６２及び押さえ部材６６に固定させる。

ベース６２は、伸展機構７０の連接棒７６を取り付けるための突起Ｐをさらに有する。

伸展機構７０は、第２固定部材６０に取り付けられ、膜４０を伸展させるために第２固定部材６０をｘ方向に往復運動させる。例えば、図１、図２、及び図５に示すように、伸展機構７０は、クランク機構であり、モータ７２、偏心回転盤７４、及び連接棒７６を含む。

モータ７２は、一般的な回転モータであり、回転線に沿って下方に延在する棒状の突起７２ａを有する。偏心回転盤７４は、モータ７２の突起７２ａが挿入される孔７４ａと、下方に延在する突起７４ｂと、を有する。孔７４ａ及び突起７４ｂの位置は、いずれも偏心回転盤７４の中心から（図３及び図５ではｘ方向に）ずれている。なお、各図では説明のために偏心度合いの大きい偏心回転盤７４を示しているが、偏心回転盤７４の構成や形状は図示されたものに限定されない。連接棒７６は、細長い棒状部材であり、偏心回転盤７４の突起７４ｂが挿入される孔７６ａと、第２固定部材６０のベース６２の上面から上方に突出した突起Ｐが挿入される孔７６ｂと、を有する。モータ７２が回転すると、クランク機構により、偏心回転盤７４及び連接棒７６がモータ７２の回転運動を第２固定部材６０の直線運動に変換する。ここで、第２固定部材６０は、ガイド部材（図示せず）によりｙ方向には移動せずｘ方向に沿って直線運動を行うように制限され得る。

このようにして、伸展装置１４は、図３及び図５に示すように、モータ７２の回転によって、第２固定部材６０をｘ方向に沿って直線的に往復運動させることができる。好ましくは、第１固定部材５０の位置が固定され、第２固定部材６０は、固定された第１固定部材５０に対して相対的に往復運動を行う。これにより、伸展装置１４は、第２固定部材６０に固定された第１基材２０及び第２基材３０に対してｘ方向の引張力をモータ７２の回転周期で加えることができる。この引張力が第１基材２０又は第２基材３０を介して膜４０に伝わることにより、膜４０を周期的に伸展させることができるので、膜４０に配置された組織層８０及び管腔層８２の細胞に対して伸展刺激を与えることが可能である。また、伸展刺激の程度は、偏心回転盤７４の偏心度合いにより制御可能である。

ただし、伸展機構７０の構成や連結構造は上記例に限定されず、膜４０を伸展させることのできる任意の構成を利用可能である。

［組織層及び管腔層］
膜４０の第１面４２に形成される組織系細胞を用いた組織層８０としては、特に限定されない。組織層８０としては、例えば、神経系細胞を用いた神経組織、骨格筋細胞または心筋細胞を用いた筋組織、肝細胞を用いた肝臓組織、膵臓系細胞を用いた膵臓組織、肺胞上皮細胞を用いた肺胞上皮組織、真皮細胞を用いた真皮組織などが挙げられる。組織層としては、単層に限らず、複数の組織層を積層してもよい。また、組織層としては、複数の細胞が混合した３次元組織層でもよい。

組織系細胞を培養するための培地及び細胞外マトリックス成分としては、各種選択可能である。

膜４０の第２面４４に形成される管腔系細胞を用いた管腔層８２としては、血管系細胞を用いた血管層、尿細管系細胞を用いた尿細管層などが挙げられる。血管系細胞としては、血管内皮細胞が好ましい。血管内皮細胞としては、ヒト、マウス、ラットなど、哺乳動物由来の細胞が挙げられ、ヒト由来血管内皮細胞が好ましい。ヒト由来血管内皮細胞としては、ヒト臍帯静脈内皮細胞（Ｈｕｍａｎ Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ Ｖｅｉｎ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌｓ：ＨＵＶＥＣ）、ヒト臍帯動脈内皮細胞（Ｈｕｍａｎ Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ Ａｒｔｅｒｙ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌｓ：ＨＵＡＥＣ）、ヒト冠状動脈内皮細胞（Ｈｕｍａｎ Ｃｏｒｏｎａｒｙ Ａｒｔｅｒｙ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌｓ：ＨＣＡＥＣ）、ヒト伏在静脈内皮細胞（Ｈｕｍａｎ Ｓａｐｈｅｎｏｕｓ Ｖｅｉｎ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌｓ：ＨＳａＶＥＣ）、ヒト肺動脈内皮細胞（Ｈｕｍａｎ Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ Ａｒｔｅｒｙ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌｓ：ＨＰＡＥＣ）、ヒト大動脈内皮細胞（Ｈｕｍａｎ Ａｏｒｔｉｃ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌｓ：ＨＡｏＥＣ）、ヒト皮膚微小血管内皮細胞（Ｈｕｍａｎ Ｄｅｒｍａｌ Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌｓ：ＨＤＭＥＣ）、ヒト皮膚血管内皮細胞（Ｈｕｍａｎ Ｄｅｒｍａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌｓ：ＨＤＢＥＣ）、ヒト皮膚リンパ管内皮細胞（Ｈｕｍａｎ Ｄｅｒｍａｌ Ｌｙｍｐｈａｔｉｃ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌｓ：ＨＤＬＥＣ）、ヒト肺微小血管内皮細胞（Ｈｕｍａｎ Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌｓ：ＨＰＭＥＣ）、ヒト心臓微小血管内皮細胞（Ｈｕｍａｎ Ｃａｒｄｉａｃ Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌｓ：ＨＣＭＥＣ）、ヒト膀胱微小血管内皮細胞（Ｈｕｍａｎ Ｂｌａｄｄｅｒ Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌｓ：ＨＢｄＭＥＣ）、ヒト子宮微小血管内皮細胞（Ｈｕｍａｎ Ｕｔｅｒｉｎｅ Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌｓ：ＨＵｔＭＥＣ）、ヒト脳血管内皮細胞（Ｈｕｍａｎ Ｂｒａｉｎ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌｓ：ＨＢＥＣ）などが挙げられ、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）が好ましい。

［培養システムの製造方法］
上記の培養システム１においては、まず、第２基材３０をベース５２及びベース６２上に載置し、第１基材２０と第２基材３０とを上下方向に重ねて本体部１２を形成する（図２参照）。第１基材２０を第２基材３０に取り付けることにより、灌流流路３６が形成される（図４参照）。次いで、第１基材２０及び第２基材３０のｘ方向の一端部をベース５２と押さえ部材５６とで挟むように、ベース５２上の支持部材５４に押さえ部材５６を取り付け、締付部材５８でベース５２と押さえ部材５６とを固定する。同様に、第１基材２０及び第２基材３０のｘ方向の他端部をベース６２と押さえ部材６６とで挟むように、ベース６２上の支持部材６４に押さえ部材６６を取り付け、締付部材６８でベース６２と押さえ部材６６とを固定する。これにより、第１基材２０及び第２基材３０が第１固定部材５０及び第２固定部材６０により挟持されて互いに固定される（図１参照）。

第２固定部材６０の突起Ｐに連接棒７６を取り付け、連接棒７６に偏心回転盤７４を取り付け、偏心回転盤７４にモータ７２を取り付けることにより、伸展機構７０を第２固定部材６０に組み付ける（図５参照）。

さらに、調整部１１０を介して培地供給部１００に接続された供給管１０１を接続孔２６Ａに接続し、排出管１０２を接続孔２６Ｂに接続することにより、培養システム１が製造される（図４参照）。

［培養システム１を用いた人工組織製造方法］
上記の培養システム１を用いた細胞の共培養方法（人工組織製造方法）について説明する。
本実施形態に係る人工組織製造方法は、培養デバイスを用いて細胞の共培養を行う人工組織製造方法であって、前記膜の第１面に組織系細胞を播種して前記培養空間で培養するステップと、前記膜の第２面に管腔系細胞を播種して前記灌流流路で培養するステップと、前記伸展装置により前記膜を伸展させるステップと、を含む。

まず、膜４０が設けられた第１開口２４が上向きになるように第１基材２０を裏返し、膜４０の第２面４４に管腔系細胞を播種し、播種した細胞が膜４０の第２面４４に接着するまで培養を行う。

次いで、第１開口２４が下向きになるように第１基材２０を再度裏返し、第１基材２０を第２基材３０に取り付ける。これにより、膜４０の第２面４４及び第２面４４上の管腔系細胞は、灌流流路３６に面する。その後、第１基材２０の培養空間２２の底部に露出する膜４０の第１面４２に組織系細胞を播種し、培養空間２２に培地を導入して組織系細胞を培養する。なお、第１基材２０を第２基材３０に取り付ける前に第１面４２に組織系細胞を播種して培養し、組織系細胞が第１面４２に接着した後で第１基材２０を第２基材３０に取り付けてもよい。

その後、培地供給部１００から供給され調整部１１０で調整された量の培地を、供給管１０１から灌流流路３６に導入する（図４参照）。灌流流路３６は、図３に示すように、ｙ方向の端部から中央側に幅が漸次広がっているため、供給管１０１から灌流流路３６に導入された培地は、円滑に灌流流路３６に充填されて灌流する。灌流流路３６を灌流する培地は、排出管１０２から排出される。

その結果、膜４０の第１面４２に播種された組織系細胞は、培養空間２２に導入された培地により培養され、膜４０の第２面４４に接着された管腔系細胞は、灌流流路３６に導入されて灌流する培地により培養される（図４参照）。すなわち、培養システム１においては、流れ刺激を付与した状態で組織系細胞（組織層８０）と管腔系細胞（管腔層８２）とが共培養される。さらに、上記の伸展装置１４によって膜４０を伸展させることにより、膜４０の第１面４２の組織系細胞及び第２面４４の管腔系細胞に対して伸展刺激を加えることができる（図５参照）。すなわち、培養システム１においては、流れ刺激及び伸展刺激を付与した状態で組織系細胞と管腔系細胞とが共培養され、例えば、実際の血管周辺などの環境を再現することができる。これにより、培養された人工細胞又は人工組織を製造することができる。

また、本実施形態の培養システム１では、調整部１１０を調整することにより、灌流流路３６に培地が灌流する状態で共培養する場合と、灌流流路３６に培地が灌流せず充填された状態で共培養する場合とを比較・評価することも可能である。また、灌流流路３６に培地が灌流する状態で共培養する場合についても、調整部１１０を調整して灌流流路３６への培地の導入量を異ならせ、灌流流路３６における培地の流速を異ならせた場合を比較・評価することも可能である。さらに、伸展装置１４のモータ７２を作動させるか否かによって、伸展刺激が与えられている状態で共培養する場合と、伸展刺激が与えられない状態で共培養する場合とを比較・評価することも可能である。また、モータ７２の回転速度を変更することによって、伸展動作の周期を異ならせた場合を比較・評価することも可能である。また、偏心度合いの異なる偏心回転盤７４を使い分けることによって、伸展の大きさを異ならせた場合を比較・評価することも可能である。

［薬剤評価方法］
本発明は、さらにその他の態様として、本発明に係る培養デバイスを用いて製造された人工組織における薬剤の接触による刺激性を評価する方法に関する。本発明における薬剤とは、医薬品などの薬物、化粧品や医薬部外品などを含む。本発明の評価方法によれば、例えば、従来の方法と比較して、せん断流れ刺激や伸展刺激が存在する実際の管腔層周辺などに近い環境で薬剤の評価を行うことができる。また、本発明の評価方法は、例えば、新薬の創出（スクリーニング）などにおける各種分子量の薬物の動態評価、化粧品や医薬部外品などの開発における評価において極めて有用である。

本実施形態に係る薬剤評価方法は、培養デバイスを用いて人工組織を製造するステップと、薬剤を前記人工組織に接触させるステップと、前記薬剤の接触による刺激に対する前記人工組織の応答、又は前記人工組織に対する前記薬剤の浸透性を測定するステップと、を含む。応答の測定は、例えば、経皮及び経内皮電気抵抗（バリア機能）を測定することなどによって行うことができる。薬剤は、評価対象となる物質のことをいい、例えば、無機化合物や有機化合物などが挙げられる。

薬剤を人工組織に接触させることについては、例えば、組織層８０に薬剤を塗布し、当該薬剤の灌流流路３６への取り込みを評価したり、灌流流路３６に導入される培地中に薬剤を混入させ、灌流流路３６から組織層８０への当該薬剤の拡散・透過を評価することができる。

［変形例］
上記実施形態では、伸展装置１４が第１基材２０及び第２基材３０を引っ張って伸展させることで膜４０に伸展刺激を加えているが、膜４０が伸展しさえすれば、必ずしも第１基材２０及び第２基材３０を伸展させなくともよい。

上記実施形態では、膜４０の伸展方向（ｘ方向）と灌流流路３６の灌流方向（ｙ方向）とが互いに略直交しているが、同じ方向であってもよく、９０°以外の角度で交差してもよい。

上記実施形態では、第１基材２０及び第２基材３０の両方に引張力を加えて伸展を行ったが、第１基材２０及び第２基材３０のうち膜４０が設けられている一方のみに対して伸展を行ってもよい。

［実験例１］
（培養デバイスの製造）
光造形装置により製造したモールドにＰＤＭＳを流し込み、熱硬化させることにより、第１基材２０及び第２基材３０を製造した。伸展装置１４（すなわち第１固定部材５０、第２固定部材６０、及び伸展機構７０）は、光造形装置により製造した。多孔質膜４０は、フォトリソグラフィによりシリコン基板上にマイクロピラーを製造し、ここにＰＤＭＳをスピンコーティングして多孔質膜４０を製膜した後、上記のＰＤＭＳ製の第１基材２０を多孔質膜４０に接触させた状態でＨ_２Ｏプラズマを照射することにより、第１基材２０と多孔質膜４０とを接着させた。その後、反応性イオンエッチング（ＲＩＥ：Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｉｏｎ Ｅｔｃｈｉｎｇ）により多孔質膜４０に多数の貫通孔を形成した。多孔質膜４０の厚さは約３．５μｍ、貫通孔の直径は約３μｍであった。

製造した培養デバイス１０により、マイクロピペットを用いて細胞播種及び培地交換を容易に行うことができることを確認した。

製造した多孔質膜４０の物質透過性能を評価するために、多孔質膜４０が接着された第１基材２０を液体に浸し、直径１μｍの蛍光ビーズを培養空間２２内に投入して、多孔質膜４０を通過した液滴をサンプリングすることにより、多孔質膜４０を通過したビーズの数を測定した。図６は、多孔質膜４０を通過した蛍光ビーズの数と時間との関係を表すグラフである。５分後には平均約２６０個／μＬのビーズが多孔質膜４０を透過し、１０分後には平均６３０個／μＬのビーズが多孔質膜４０を透過したことが確認された。すなわち、製造した多孔質膜４０は、貫通孔の直径以下の物質を透過させることができた。

［実験例２］
（伸展刺激による伸展率の計測）
伸展装置１４により伸展刺激を加えたときの多孔質膜４０の伸展率を調べるために、製造した培養デバイス１０の本体部１２を１Ｈｚで２．５秒間繰り返し伸展させている様子を動画撮影し、多孔質膜４０の両端間の長さを計測した。図７は、製造した培養デバイス１０における１Ｈｚでの伸展動作中の多孔質膜４０の両端の長さと時間との関係を表すグラフである。多孔質膜４０の両端間の長さに対して１０％の伸展率において、１Ｈｚで多孔質膜４０が伸展していることが確認された。生体内における血管などの伸展率は１０％程度であるので、培養デバイス１０を用いることで生体内環境と類似した伸展刺激を加えることができるといえる。

［実験例３］
（せん断応力の測定）
灌流時のせん断応力を測定するために、伸展刺激を与えた場合と与えなかった場合との各々について、灌流流路３６に蛍光ビーズを流して灌流の様子を撮影し、画像解析により粒子の移動速度を算出して流体の最大流速ｕ_ｍａｘを測定した。多孔質膜４０の第２面４４に加わるせん断応力τ_{ｍｅｍｂｒａｎｅ}は、以下の式により算出した。

ここで、μは流体の粘性係数であり、ａは流路の高さの１／２であり、ｕ_{ａｖｅｒａｇｅ}は流体の平均流速である。図８は、製造した培養デバイス１０におけるせん断応力と流量との関係を表すグラフである。伸展刺激の有無にかかわらず、測定されたせん断応力は同程度であったことから、伸展を行った場合でも同等のせん断応力を与えることが可能であることが確認された。また、培養デバイス１０によって多孔質膜４０の第２面４４に対し８ｄｙｎｅ／ｃｍ^２〜１７ｄｙｎｅ／ｃｍ^２のせん断応力を加えることができることが確認された。生体内の毛細血管においては１０ｄｙｎｅ／ｃｍ^２〜２０ｄｙｎｅ／ｃｍ^２のせん断応力が働いているとされているので、培養デバイス１０によって生体内環境と類似したせん断刺激を加えることができるといえる。

［実験例４］
（伸展刺激に対する細胞応答評価）
培養デバイス１０による伸展刺激に対する細胞応答を評価するために、培養デバイス１０でＨＵＶＥＣｓを培養し、１０％の伸展を１Ｈｚで２４時間行った細胞と伸展を行わずに培養した細胞とを顕微鏡で観察した。図９Ａは、製造した培養デバイス１０により伸展刺激を加えた場合の細胞の明視野写真である。図９Ｂは、製造した培養デバイス１０により伸展刺激を加えなかった場合の細胞の明視野写真である。これらの写真において、左右方向が伸展方向である。

観察された細胞の配向を定量化するために、これらの画像の高速フーリエ変換を行い、画像に内接する円を書き込んで円の中心から０°〜３５９°までの輝度値を計算した。ここで、画像の内接円の中心から右方向に延ばした直線を基準（０°）とした。０°〜１７９°の輝度値とそれぞれに１８０°足し合わせたもので平均化して０°〜１７９°の輝度値に変換し、各々の値を全体の平均値で割ることにより、０°〜１７９°に対する標準化輝度値を得た。この標準化輝度値が角度により異なる場合、細胞は輝度値が大きい角度に配向しているといえる。図９Ｃは、図９Ａ及び図９Ｂの画像から計算した標準化輝度値である。図９Ａ（伸展あり）の写真では輝度値が約９０°で極大値を取ったのに対し、図９Ｂ（伸展なし）の写真では輝度値の角度依存性は確認されなかった。したがって、伸展刺激を加えた場合、細胞が伸展方向に対して垂直な方向に配向するという応答性が確認された。

１…培養システム、１０…培養デバイス、１２…本体部、１４…伸展装置、２０…第１基材、２２…培養空間、２４…第１開口、３０…第２基材、３２…溝部、３４…第２開口、３６…灌流流路、４０…膜、４２…第１面、４４…第２面、５０…第１固定部材、６０…第２固定部材、５２、６２…ベース、５４、６４…支持部材、５６、６６…押さえ部材、５８、６８…締付部材、７０…伸展機構、７２…モータ、７４…偏心回転盤、７６…連接棒、８０…組織層、８２…管腔層、１００…培地供給部、１０１…供給管、１０２…排出管、１１０…調整部。

Claims (10)

1. 細胞を培養可能な培養空間及び前記培養空間に開口する第１開口を有する第１基材と、培地を灌流可能な灌流流路及び前記灌流流路に開口する第２開口を有し、前記培養空間と前記灌流流路とが連通するように前記第１基材を着脱可能に保持する第２基材と、前記第１開口又は前記第２開口に配置される、一つ以上の貫通孔を有する伸展可能な膜と、を有する本体部と、
   前記本体部に力を加えることにより前記膜を伸展させるように構成された伸展装置と、
   を備える、
   細胞を培養するための培養デバイス。
2. 前記伸展装置は、前記膜が伸展及び収縮を繰り返すように、前記本体部に力を反復的に加える、
   請求項１に記載の培養デバイス。
3. 前記伸展装置は、前記第１基材と前記第２基材とを互いに固定する、
   請求項１又は２に記載の培養デバイス。
4. 前記伸展装置は、前記膜の伸展方向に沿った引張力を前記本体部に加える、
   請求項１〜３のいずれか一項に記載の培養デバイス。
5. 前記第１基材及び前記第２基材は、弾性変形可能な材料から構成される、
   請求項１〜４のいずれか一項に記載の培養デバイス。
6. 前記膜は、ポリジメチルシロキサンから構成される、
   請求項１〜５のいずれか一項に記載の培養デバイス。
7. 前記膜は、前記第１開口に配置される、
   請求項１〜６のいずれか一項に記載の培養デバイス。
8. 前記膜は、前記培養空間に対向する第１面及び前記灌流流路に対向する第２面を有し、前記第１面側で組織系細胞が培養され、前記第２面側で管腔系細胞が培養される、
   請求項１〜７のいずれか一項に記載の培養デバイス。
9. 請求項１〜８のいずれか一項に記載の培養デバイスを用いて細胞の共培養を行う人工組織製造方法であって、
   前記膜の第１面に組織系細胞を播種して前記培養空間で培養するステップと、
   前記膜の第２面に管腔系細胞を播種して前記灌流流路で培養するステップと、
   前記伸展装置により前記膜を伸展させるステップと、
   を含む、
   人工組織製造方法。
10. 請求項１〜８のいずれか一項に記載の培養デバイスを用いて人工組織を製造するステップと、
    薬剤を前記人工組織に接触させるステップと、
    前記薬剤の接触による刺激に対する前記人工組織の応答、又は前記人工組織に対する前記薬剤の浸透性を測定するステップと、
    を含む、
    人工組織を用いた薬剤評価方法。

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