KR20200036284A - 당을 감지하는 화학감각 수용체를 발현하는 세포를 이용한 미세유체 디바이스 기반의 시료 내 당의 진단 기기 및 진단 방법 - Google Patents

당을 감지하는 화학감각 수용체를 발현하는 세포를 이용한 미세유체 디바이스 기반의 시료 내 당의 진단 기기 및 진단 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20200036284A
KR20200036284A KR1020180115738A KR20180115738A KR20200036284A KR 20200036284 A KR20200036284 A KR 20200036284A KR 1020180115738 A KR1020180115738 A KR 1020180115738A KR 20180115738 A KR20180115738 A KR 20180115738A KR 20200036284 A KR20200036284 A KR 20200036284A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
sugar
sample
channel
cell
labeling substance
Prior art date
Application number
KR1020180115738A
Other languages
English (en)
Other versions
KR102160794B1 (ko
Inventor
이경균
송윤성
배남호
이태재
이문근
이석재
Original Assignee
한국과학기술원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한국과학기술원 filed Critical 한국과학기술원
Priority to KR1020180115738A priority Critical patent/KR102160794B1/ko
Publication of KR20200036284A publication Critical patent/KR20200036284A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102160794B1 publication Critical patent/KR102160794B1/ko

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B5/00—Measuring for diagnostic purposes; Identification of persons
    • A61B5/145—Measuring characteristics of blood in vivo, e.g. gas concentration, pH value; Measuring characteristics of body fluids or tissues, e.g. interstitial fluid, cerebral tissue
    • A61B5/14532—Measuring characteristics of blood in vivo, e.g. gas concentration, pH value; Measuring characteristics of body fluids or tissues, e.g. interstitial fluid, cerebral tissue for measuring glucose, e.g. by tissue impedance measurement
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502761—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip specially adapted for handling suspended solids or molecules independently from the bulk fluid flow, e.g. for trapping or sorting beads, for physically stretching molecules
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
    • G01N33/48707—Physical analysis of biological material of liquid biological material by electrical means
    • G01N33/48728—Investigating individual cells, e.g. by patch clamp, voltage clamp
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
    • G01N33/4875—Details of handling test elements, e.g. dispensing or storage, not specific to a particular test method
    • G01N33/48778—Containers specially adapted therefor, e.g. for dry storage
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6872—Intracellular protein regulatory factors and their receptors, e.g. including ion channels
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/06—Fluid handling related problems
    • B01L2200/0647—Handling flowable solids, e.g. microscopic beads, cells, particles
    • B01L2200/0652—Sorting or classification of particles or molecules
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/06—Fluid handling related problems
    • B01L2200/0647—Handling flowable solids, e.g. microscopic beads, cells, particles
    • B01L2200/0668—Trapping microscopic beads
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/04—Endocrine or metabolic disorders
    • G01N2800/042—Disorders of carbohydrate metabolism, e.g. diabetes, glucose metabolism

Abstract

본 개시 내용의 구체예에 따르면, 당을 감지하는 화학감각 수용체를 발현하는 유전자를 세포(동물 세포)에 주입하는 세포의 유전자 조작을 통하여 화학감각 수용체가 세포에 발현되는 현상을 이용하여 시료에 존재하는 당류를 고감도로 정성적 및/또는 정량적 검출할 수 있도록 하여 당뇨 진단에 유용하게 적용할 수 있는 진단 방법 및 관련 진단 기기가 기재된다.

Description

당을 감지하는 화학감각 수용체를 발현하는 세포를 이용한 미세유체 디바이스 기반의 시료 내 당의 진단 기기 및 진단 방법{Microfluidic Device-based Apparatuses and Method for Diagnosing Sugars in Sample Using Cells Capable of Expressing Gustatory Receptors}
본 개시 내용은 당을 감지하는 화학감각 수용체를 발현하는 세포를 이용한 미세유체 디바이스 기반의 시료 내 당의 진단 기기 및 진단 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 개시 내용은 당을 감지하는 화학감각 수용체를 발현하는 유전자를 세포(동물 세포)에 주입하는 세포의 유전자 조작을 통하여 화학감각 수용체가 세포에 발현되는 현상을 이용하여 시료에 존재하는 당류를 고감도로 정성적 및/또는 정량적 검출할 수 있도록 하여 당뇨 진단에 유용하게 적용할 수 있는 진단 방법 및 관련 진단 기기에 관한 것이다.
일반적으로 "당뇨(Diabetes Mellitus)"는 전통적으로 소변이 달다는 의미로서 혈중 포도당(glucose) 수치가 높을 경우 소변으로 당이 배출되어 나타나는 현상으로서, "당뇨병"은 소변 내 당의 존재에 의하여 확인될 수 있다.
당뇨병은 크게 인슐린을 분비하는 세포가 파괴되어 인슐린의 양이 절대적으로 부족한 제1형 당뇨병(인슐린 의존형) 및 인슐린이 작용하는 장기에서 인슐린에 대한 저항성이 생긴 제2형 당뇨병(인슐린 비의존형)으로 구분된다. 당뇨병 환자의 약 90% 이상은 제2형 당뇨가 차지하고 있다. 당뇨병의 원인으로서 유전적인 요인, 연령의 증가, 비만, 약물의 복용, 임신, 고혈압, 고지혈증 등이 있는 것으로 보고되고 있으며, 국내에서도 고령화의 진행, 식습관의 변화, 및 기대 여명의 증가 등으로 당뇨병과 같은 만성 질환의 발병률이 많이 증가함에 따라 개인과 사회의 의료비 부담이 증대되고 있다.
당뇨병 및 이에 의한 합병증(예: 심근경색, 뇌졸중, 망막증, 신부전 등)을 예방하고 완화시키기 위한 대표적인 방법은 환자 스스로 혈당 수치를 자가 모니터링하는 것으로 당뇨 환자가 자신의 혈당 수치를 하루에 수차례 측정하면서 당뇨병에 따른 생체 변화를 모니터링하고 있다.
최근에는 환자로부터 입수된 시료를 통하여 신속하고 정확하게 당뇨 여부를 진단할 수 있는 바이오센서에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.
바이오센서는 유전자, 암세포, 환경호르몬 등 특정 물질의 존재 여부를 확인하거나 감지할 수 있는 바이오 소자를 지칭하는 바, 통상적으로 특정 바이오물질과 선택적으로 반응 및 결합할 수 있는 생체감지물질(bioreceptor) 및 이를 측정할 수 있는 신호로 전환하는 신호변환기(signal transducers)를 포함한다. 이러한 생체감지 물질로서 효소, 항체, 세포, DNA 등이 있으며, 신호 변환 방법에는 전기화학, 형광, SPR, FET, 열 센서 등 다양한 물리화학적 방법을 사용하고 있다. 바이오센서를 통하여 분석대상 물질을 보다 간편하고 신속 정밀한 측정이 가능하므로 의료, 환경분야 등에서 크게 주목 받고 있는 추세이다.
이러한 의료용 바이오센서로서, 혈당 센서, 그리고 DNA칩, 단백질칩 및 랩-온-어-칩과 같은 바이오칩 센서가 알려져 있으며, 현재 혈당 센서의 비중이 크다. 당뇨병 진단을 위한 혈당 센서는 이미 많은 제품이 상용화가 되었고 기술 개발이 많이 진전된 상황인 반면, 바이오칩을 기반으로 하는 당뇨 진단 센서는 여전히 기술개발 및 상용화 속도에 있어서 개선 여지가 존재한다. 특히, 기존의 혈당 센서는 혈액을 손가락 끝에서 채혈하여, 스트립을 이용하여 효소반응으로 전기화학식 또는 광학방식으로 혈액 내 글루코오스의 농도를 측정하고 있다. 이와 같이, 혈당 검사용 혈액 샘플을 채취하기 위하여 규칙적으로 피부를 찌르는 과정에서 발생하는 당뇨 환자에게 고통을 유발하고 있기 때문에 비침습 혈당 모니터링 기술에 대한 필요성이 증가하고 있다. 특히, 현장에서 신속하고 간편한 방식으로 시료 내 당에 대한 분석 및 진단이 가능한 비침습 방식의 기술이 요구되고 있다.
이와 관련하여, 최근 각광받고 있는 바이오칩 기반의 센서 기술을 기반으로 하되, 시료 내 당의 진단, 구체적으로 당뇨병의 진단에 있어서, 적은 량의 시료만으로도 보다 간편하면서도 정확한 진단이 가능한 기술 개발이 요구되고 있다.
본 개시 내용에 따른 구체예에서는 종래에 알려진 시료 내 당의 진단 기술, 특히 당뇨 진단 기술이 갖는 기술적 한계를 극복할 수 있는 진단 기기 및 진단 방법을 제공하고자 한다.
본 개시 내용의 제1 면에 따르면,
a) 당을 감지하는 화학감각 수용체를 발현하고 표지 물질을 내포하는 적어도 하나의 세포를 제공하는 단계;
b) (i) 당 및 (ii) 표지 물질의 활성화 성분을 함유하는 시료를 제공하는 단계;
c) 상기 적어도 하나의 세포와 상기 시료를 반응시켜 적어도 하나의 반응 세포를 형성하는 단계, 이때 시료의 활성화 성분이 상기 반응 세포 내에서 표지 물질을 활성화시켜 이로부터 유래된 신호를 생성함;
d) 상기 반응 세포를 미세액적 내에 포획하는 단계; 및
e) 상기 미세액적 내 반응 세포로부터 생성된 표지 물질-유래 신호를 이용하여 정성적 및/또는 정량적으로 검출하는 단계;
를 포함하는 시료 내 당의 진단 방법이 제공된다.
예시적 구체예에 따르면, 상기 단계 d)는,
상기 적어도 하나의 반응 세포를 소정 간격을 두고 세포 단위 별로 정렬시키는 단계;
상기 정렬된 반응 세포를 함유하는 수계 유체를 미세유체 디바이스에 로딩하하는 한편, 상기 수계 유체와 비혼화성을 갖는 캐리어 유체를 미세유체 디바이스에 로딩하는 단계; 및
상기 미세유체 디바이스 내에서 수계 유체와 캐리어 유체를 접촉시켜 연속 상인 캐리어 유체 내에 상기 단위 별로 정렬된 반응 세포 각각을 포획하는 수계 미세액적을 형성하는 단계;
를 포함할 수 있다.
본 개시 내용의 제2 면에 따르면,
A) 제1 채널을 통하여 당을 감지하는 화학감각 수용체를 발현하고 표지 물질을 내포하는 적어도 하나의 세포를 함유하는 수계 유체를 도입하는 한편, 이의 하류에서 상기 제1 채널과 융합되는 제2 채널을 통하여 (i) 당 및 (ii) 표지 물질의 활성화 성분을 함유하는 시료의 수계 유체를 미세유체 디바이스로 도입하는 단계;
B) 상기 제1 채널과 상기 제2 채널이 융합되어 형성된 제3 채널을 통하여 상기 적어도 하나의 세포를 함유하는 수계 유체와 상기 시료의 수계 유체를 접촉시켜 상기 적어도 하나의 세포와 상기 시료 간 반응을 수행함으로서 적어도 하나의 반응 세포를 함유하는 수계 유체를 형성하는 단계, 이때 시료의 활성화 성분이 상기 반응 세포 내에서 표지 물질을 활성화시켜 이로부터 유래된 신호를 생성함;
C) 상기 제3 채널과 접합 영역을 형성하되 상호 교차된 형태로 배열된 복수의 제4 채널을 통하여 수계 유체와 비혼화성을 갖는 캐리어 유체를 도입하여 미세유체 디바이스 내에서 상기 적어도 하나의 반응 세포를 포함하는 수계 유체와 비혼화성을 갖는 캐리어 유체를 접촉시킴으로써 연속 상인 캐리어 유체 내에 상기 반응 생성물을 함유하는 수계 미세액적을 형성하는 단계; 및
D) 상기 접합 영역과 연통된 제5 채널을 통하여 상기 캐리어 유체 내에 형성된 수계 미세액적을 배출하는 단계; 및
E) 상기 미세액적 내 반응 세포로부터 생성된 표지 물질-유래 신호를 이용하여 정성적 및/또는 정량적으로 검출하는 단계;
를 포함하는 시료 내 당의 진단 방법이 기재된다.
본 개시 내용의 제3 면에 따르면,
당을 감지하는 화학감각 수용체를 발현하고 표지 물질을 내포하는 적어도 하나의 세포(I)와 (i) 당 및 (ii) 표지 물질의 활성화 성분을 함유하는 시료(II) 간 반응에 의하여 얻어진 반응 세포를 미세액적 내에 포획하기 위한 미세유체 디바이스를 포함하는 바이오센서; 및
상기 적어도 하나의 세포와 상기 시료 간 반응에 의하여 활성화된 표지 물질로부터 유래된 신호를 이용하여 정성적 및/또는 정량적으로 검출하는 판독기;
를 포함하는 시료 내 당의 진단 기기가 제공된다.
예시적 구체예에 따르면, 상기 시료 내 당의 진단 기기는 당뇨 진단 기기일 수 있다.
예시적 구체예에 따르면, 상기 당을 감지하는 화학감각 수용체를 발현하고 표지 물질을 내포하는 적어도 하나의 세포는 동물 세포에 당을 감지하는 화학 감각 수용체를 발현하는 유전자를 주입하여 형질 도입된 세포일 수 있다.
예시적 구체예에 따르면, 상기 당을 감지하는 화학감각 수용체를 발현하고 표지 물질을 내포하는 적어도 하나의 세포는 당을 감지하는 화학감각 수용체의 단백질이 세포 표면에 과발현되어 있는 것일 수 있다.
예시적 구체예에 따르면, 상기 당을 감지하는 화학감각 수용체의 단백질은 꿀벌의 AmGr1 단백질일 수 있다.
예시적 구체예에 따르면, 상기 제1 채널은 수계 유체의 주입구 또는 이에 근접한 영역에 나선형 패턴의 영역을 구비하여 상기 제1 채널을 통하여 도입되는 수계 유체 내 적어도 하나의 반응 세포를 소정 간격을 두고 세포 단위 별로 정렬시킴으로써 단일 미세액적 내에 단일 반응 세포를 포획할 수 있다.
본 개시 내용의 구체예에 따라 제공되는 바이오센서는 당에 민감하게 반응하는 화학감각 수용체를 발현하는 세포를 포함하고 있어 시료 내에 함유된 당, 구체적으로 글루코오스와 선택적으로 반응하거나 이를 수용하게 되는 바, 이때 해당 세포에 내포된 표지 물질(구체적으로 형광 염료)로부터 기인하는 신호(구체적으로 형광 세기)를 측정하는 간편한 방법에 의하여 높은 정확도로 정성적 및/또는 정량적으로 진단할 수 있다. 특히, 균일한 사이즈의 미세액적 내에 단일 세포 수준에서 세포를 포획하여 분석할 수 있기 때문에 종래의 혈당 센서 또는 바이오칩 센서에 비하여 오신호를 억제하면서 고감도로 시료 내 당 검출 또는 진단을 수행할 수 있고, 특히 진단 과정에서 증폭 반응을 수반하지 않는 등의 장점을 제공한다. 따라서, 향후 광범위한 활용이 기대된다.
도 1은 일 구체예에 따라 꿀벌(Apis mellifera)로부터 당을 감지하는 화학감각 수용체를 추출한 후에 이를 HEK-293 세포에 주입하여 형질 전환시키고, 시료 내에 함유된 표적 물질인 글루코오스와 반응시킴에 따라 생성되는 신호를 측정하여 시료 내 글루코오스를 정성적 및/또는 정량적으로 진단하는 일련의 과정, 그리고 시료 내 글루코오스의 농도에 따른 측정 결과를 나타내는 도면이고;
도 2a은 미세유체 디바이스 내 미세액적을 형성하기 위한 미세채널의 예시적 구조를 보여주는 도면이고;
도 2b는 미세유체 디바이스 내에서 미세액적이 형성되는 것을 보여주는 도면이고;
도 2c는 미세액적 내에 반응 세포를 세포 단위로 효과적으로 포획하도록 캐리어 유체와 접촉하기에 앞서 반응 세포-함유 수계 유체를 주입하는 미세유로(제1 채널)의 예시적 패턴을 보여주는 도면이고;
도 3은 다양한 농도의 글루코오스 함유 시료를 특정 시점(10초)에서 주입하여 AmGr1으로 형질 전환되고 Fluo-4 형광 염료를 함유하는 HEK-293 세포와 반응시킴으로써 얻은 RFU(relative fluorescence units) 측정 결과를 나타내는 그래프(각각의 포인트는 평균 값이며, 오차구간(error bar)은 SEM(n=5)임)이고;
도 4는 시료 내 글루코오스 농도 변화에 따라 미세유체 디바이스에 의하여 형질전환된 세포가 포획된 미세액적 내 형광이 발생되는 정도를 보여주는 공초점 현미경 사진이고; 그리고
도 5는 시료 내 글루코오스의 농도에 따라 미세액적에 구획화된 세포의 형광 세기에 대한 분석 결과를 나타내는 그래프이다.
본 발명은 하기의 설명에 의하여 모두 달성될 수 있다. 하기의 설명은 본 발명의 바람직한 구체예를 기술하는 것으로 이해되어야 하며, 본 발명이 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 첨부된 도면은 이해를 돕기 위한 것으로, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니며, 개별 구성에 관한 세부 사항은 후술하는 관련 기재의 구체적 취지에 의하여 적절히 이해될 수 있다
본 명세서에서 사용되는 용어는 하기와 같이 정의될 수 있다.
"당(sugar)"는 포괄적인 의미로 이해될 수 있으며, 구체적으로 6탄당(글루코오스 및 프럭토오스) 및 이의 이당류(disaccharide)인 수크로오스를 포함할 수 있다.
"액적(droplet)"은 전형적으로 구형 형상을 갖는 적은 체적의 액체로서 에멀션의 연속 상과 같은 비혼화성 유체에 의하여 둘러싸여 있다.
"미세액적"은 액적의 체적이 약 1 마이크로리터 이하, 약 1 마이크로리터와 1 나노리터 사이, 또는 약 1 마이크로리터와 1 피코리터 사이의 값을 가질 수 있다. 택일적으로, 미세액적은 약 200 마이크로미터 미만의 직경을 갖는 분산 상(dispersed phase)를 의미할 수도 있다.
"캐리어 유체"는 물(또는 수용액)과 비혼화성인 임의의 액체 화합물 또는 이의 혼합물일 수 있으며, 전형적으로는 탄소 함량이 높은 오일을 의미할 수 있다.
"시료"는 검출하고자 하는 검체를 함유할 수 있는 한, 특별히 한정되는 것은 아니다. 예시적으로, 샘플은 생물학적 샘플, 예를 들면 생물학적 유체(fluid) 또는 생물학적 조직일 수 있다. 생물학적 유체의 예로서, 뇨, 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 정액, 대변, 가래, 뇌척수액, 눈물, 점액, 양수, 땀 등을 들 수 있다. 생물학적 조직은 세포의 집합으로서, 대체적으로 인간, 동물, 식물, 세균, 진균 또는 바이러스 구조물의 구조적 물질의 하나를 형성하는 세포 내 물질들과 특정 종류의 집합으로서 연결 조직, 상피 조직, 근육 조직 및 신경 조직 등이 이에 해당될 수 있다.
"채널"은 유체가 이동하는 통로를 의미하며, 예를 들면 튜브(예를 들면, 모세관), 평면 구조 내 또는 그 위(예를 들면, 칩) 또는 이의 조합에 의하여 형성될 수 있다. 본 명세서에서 채널은 평면 흐름 경로를 따라 연장되는 채널(예를 들면, 2차원적으로 형성된 임의의 직선 또는 곡선 채널) 또는 비평면 흐름 채널(예를 들면, 3차원적으로 형성된 임의의 채널)일 수 있다.
"나선형 패턴"은 2차원적 스파이럴(spiral) 패턴 및 3차원적 헬리컬(helical) 패턴을 모두 포함하는 개념일 수 있다.
"이형 단백질(heterologous protein)"은 이러한 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 삽입하여 형질 전환체에서 발현이 가능한 모든 단백질을 의미할 수 있다.
"발현 벡터"는 발현 벡터의 전사에 제공되는 추가 단편에 작동 가능하게 연결된 관심의 폴리펩티드를 암호화하는 단편으로 구성되는 선형 또는 원형의 DNA 분자일 수 있는 바, 이러한 추가 단편은 프로모터 및 종료암호 서열을 포함한다. 발현 벡터는 1 이상의 복제 개시점, 1 이상의 선택 마커, 폴리아데닐화 신호 등을 포함할 수 있다. 발현 벡터는 일반적으로 플라스미드 또는 바이러스 DNA로부터 유도되거나, 또는 이들 모두를 포함할 수 있다.
"형질 전환(transfection)"은 표적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 암호화하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미할 수 있다. 형질 전환된 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내에 발현될 수 있는 것이면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하든지 상관없이 이들 모두를 포함한다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 표적 단백질을 암호화하는 DNA 및/또는 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 무방하다. 또한, 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어, 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되는 것일 수도 있다.
"과발현"은 원래 세포가 발현하는 량의 적어도 약 2배, 구체적으로 적어도 약 3배, 보다 구체적으로 적어도 약 5배로 발현하는 것을 의미한다.
"반응"은 화학적 반응으로 한정 해석되기 보다는 세포가 특정 성분 또는 물질에 특이적으로 상호 작용하는 개념을 포함하는 것으로 해석될 수 있다.
본 명세서에서 임의의 구성 요소 또는 부재가 다른 구성 요소 또는 부재와 "연결된다" 또는 "연통된다"고 기재되어 있는 경우, 달리 언급되지 않는 한, 상기 다른 구성 요소 또는 부재와 직접 연결 또는 연통되어 있는 경우뿐만 아니라, 다른 구성 요소 또는 부재의 개재 하에서 연결 또는 연통되어 있는 경우도 포함되는 것으로 이해될 수 있다.
본 개시 내용의 전체적인 내용
본 개시 내용의 일 구체예에 따르면, 시료 내 당을 검출하기 위하여, 당에 대하여 특이적으로 반응하는 화학감각 수용체를 이용한다. 이러한 화학감각 수용체의 대표적인 예로서 꿀벌(Apis mellifera)로부터 당을 감지하는 화학감각 수용체를 들 수 있다. 꿀벌은 후각 및 미각 감각수용체가 잘 발달되어 있고, 이의 유전 정보가 널리 알려져 있다. 전형적으로 곤충의 미각 뉴런 내에서 발현된 미각 감각수용체는 탄수화물, 당 알코올 등의 존재를 감지하는 특성을 갖는다.
꿀벌은 유전 정보가 확보된 곤충 중 가장 작은 유전 셋의 미각 감각수용체를 갖고 있는 바, 통상적으로 꽃가루 및 꿀을 채집하여 생존에 필요한 단백질 및 탄수화물을 얻고 있다. 특히, 꿀은 지질 및 미네랄뿐만 아니라 수크로오스, 글루코오스, 및 프럭토오스와 같은 당으로 이루어져 있다.
도 1에 도시된 바와 같이 꿀벌은 더듬이(antenna)를 이용하여 미각 자극 성분을 스캐닝하며, 이때 더듬이의 선단(tip)은 미각모(taste hairs)로 알려진 상이한 타입의 화학적 및 기계적 감각 기관(sensilla)을 함유한다. 더듬이 위의 모(hairs) 또는 페그(pegs) 형태를 갖는 미각 감각기관의 밀도는 말단 마디(antennomere) 상에서 가장 높다.
이와 관련하여, 꿀벌(Apis mellifera)의 미각 감각수용체로서 대표적으로 2 종류, 즉 AmGr1 및 AmGr2가 존재한다. 이중 AmGr1은 당, 구체적으로 수크로오스, 글루코오스, 트레할로오스 및 말토오스에 대하여 응답성을 나타낼 수 있고, 다른 미각 감각수용체인 AmGr2와 달리 단독으로도 완전한 기능성을 발휘할 수 있다. 한편, AmGr2는 당에 대한 미각 반응의 기작을 정밀하게 조절하는 기능을 담당한다.
상기의 점을 고려하여, 본 구체예에 있어서는 시료 내 당(당류)을 검출하기 위하여 당을 감지하는 화학감각 수용체를 발현하고 표지 물질을 내포하는 적어도 하나의 세포를 이용하는 바, 이러한 세포는 동물 세포에 당을 감지하는 화학 감각 수용체를 발현하는 유전자를 주입하여 형질 도입된 세포일 수 있다. 이때, 시료 내 당을 감지하는 화학감각 수용체의 단백질(또는 유전자)로서 AmGr1을 적용할 수 있다. 구체적으로, 당을 감지하는 화학감각 수용체를 발현하는 적어도 하나의 세포는 당을 감지하는 화학감각 수용체의 단백질이 세포 표면에 과발현되어 있는 것일 수 있다.
이러한 당을 감지하는 화학감각 수용체 유전자(gene)를 발현하는 세포를 얻기 위하여 형질 전환(transfection) 기술을 적용할 수 있는 바, 구체적으로 당을 감지하는 화학감각 수용체를 발현하는 단백질(또는 유전자)를 발현 벡터(expression vector)에 의하여 동물 세포에 주입하여 형질 전환시킬 수 있다. 이러한 형질 전환 기술은 당업계에서 알려진 만큼, 구체적인 기술은 생략하기로 한다.
또한, 당을 감지하는 화학감각 수용체를 발현하는 세포(즉, 형질 전환된 세포)는 내부로 표지 물질을 도입할 수 있다. 이를 위하여, 예시적 구체예에 따르면, 표지 물질을 함유하는 배지 내에 형질 전환된 세포를 배양하는 방식으로 표지 물질을 세포 내로 혼입할 수 있다. 이때, 배양은, 예를 들면 약 30 내지 40℃(구체적으로 약 35 내지 38℃)에서 약 30 내지 90분(구체적으로 약 40 내지 60분) 동안 수행될 수 있다.
이러한 표지 물질로서 대표적으로 형광 염료를 예시할 수 있는 바, 구체적으로 형광 염료는, 예를 들면 Fluo-4, Fluo-3, Rhod-2 또는 이의 조합일 수 있는 바, 특히 Fluo-4는 칼슘 이온과 결합할 경우, 현저한 형광 증가 특성(대략 100배 이상)을 나타낼 수 있는 바, 예시적으로 시판 중인 Fluo-4 DirectTM Calcium Assay Kit (Invitrogen , 캘리포니아, 미국)를 사용할 수 있다.
도 1을 참조하면, 당을 감지하는 화학감각 수용체가 발현되도록 형질 전환된(transfected) 세포는 시료 내 당(당류)과 반응하게 된다. 특히, 시료 내 당류로서 글루코오스, 프록토스, 수크로오스, 트레할로오스, 말토오스 등을 예시할 수 있으며, 구체적으로 글루코오스를 예시할 수 있는 바, 이는 세포벽에 구현된 AmGR1 수용체가 외부에 존재하는 글루코오스와 효과적으로 반응하기 때문이다.
또한, 시료는 혈액, 땀, 타액, 소변, 눈물 등으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있는 바, 표지 물질을 활성화하는 성분을 함유할 수 있다. 이러한 표지 물질의 활성화 성분으로서, 특히 칼슘(Ca2+ 이온)을 예시할 수 있다. 이러한 활성화 성분은 형질 전환된 세포 내에 함유되어 있는 표지 물질과 결합하여 검출 가능한 신호를 생성 또는 발현할 수 있다.
구체적으로 설명하면, 세포 외액 및 혈액 내에서 칼슘 농도는 대략 1.2 mM 수준으로서 0.1 μM 수준인 세포기질 내 농도보다 현저히 높다. 따라서, 형질 전환된 세포(구체적으로, AmGr1 단백질이 표면에 과발현된 세포)가 시료 내 당류와 반응하면, 표면(구체적으로 세포막)의 Ca 채널이 개방되고, 칼슘 농도의 차이에 의하여 Ca2+ 이온이 세포 내로 유입될 수 있다. 이때, 형질 전환된 세포 내 칼슘 의존성 표지 물질(구체적으로 형광 염료)을 주입한 상태에서 해당 세포 내로 유입된 Ca2+ 이온이 세포 내 표지 물질과 결합함에 따라 형광을 발생시킨다. 따라서, 시료 내 당류의 농도가 증가하여 이와 당을 감지하는 화학감각 수용체를 발현하는 세포 간의 반응 세포의 수가 증가할수록 강한 형광 세기가 발생한다.
이처럼, 형질 전환된 세포 표면에 존재하는 당을 감지하는 화학감각 수용체가 당류, 특히 글루토오스에 민감하게 반응하기 때문에 이러한 유전자, 단백질, 및/또는 세포를 당류의 센싱 물질로 적용할 경우, 시료 내 당의 검출 시 민감도 및 선택성을 높일 수 있다.
미세액적 형성용 미세유체 디바이스
본 개시 내용의 일 구체예에 따르면, 당을 감지하는 화학감각 수용체를 발현하고 표지 물질을 내포하는 적어도 하나의 세포는 미세유체 디바이스 내에서 시료 내 당류(시료 내에 당류가 함유되어 있는 경우)와 접촉하여 반응함으로써 표지 물질로부터 유래하는 신호를 발생시키고, 또한 미세액적에 포획된 형태로 진단 또는 검출 과정을 거침으로써 정확도를 높이도록 구성할 수 있다.
일반적으로, 미세유체 반응 디바이스는 크게 2가지 방식으로 구분되는 바, 미세채널을 이용하여 반응물 등을 지속적으로 이동시키면서 반응을 수행하는 연속 반응 방식에서는 미세채널에 반응물 등이 지속적으로 미세채널을 통과하면서 혼합되어 반응이 일어난다. 반면, 미세 액적을 형성하여 액적 내부에서 반응이 일어나는 미세액적 방식에서는 물과 오일이 혼화성이 없다는 점을 이용하여 적어도 2종의 유체가 미세채널을 통하여 접촉하고 도입된 오일의 전단력에 의하여 액적이 생성된다. 특히, 미세액적 방식은 작은 반응 체적(피코리터에서 나노리터)이 이용되어 반응 속도를 증가시키고, 보다 농축된 생성물을 형성함으로써 초기 검출을 가능케 하고, 또한 종래의 벌크 체적 반응에 비하여 보다 많은 수의 독립된 측정이 가능하다는 장점을 갖는다. 그 결과, 시료에 대한 검출 신뢰성이 높고, 보다 적은 량의 반응 시약을 사용하므로 테스트 비용을 절감할 수 있다. 특히, 단일 세포와 같이 적은 수의 세포를 포획할 수 있는 미세액적 시스템을 기반으로 할 경우, 시료 내 미량의 표적 성분(본 구체예에서는 당류)이 함유되어 있더라도 효율적인 정성적 및/또는 정량적 분석을 수행할 수 있다.
도 2a은 미세유체 디바이스 내 미세액적을 형성하기 위한 미세채널의 예시적 구조를 보여준다.
상기 도시된 구체예에 있어서, 미세유체 디바이스를 구성하는 재질의 대표적인 예는 폴리에스테르(구체적으로, 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET)), 폴리에틸렌(PE), 폴리프로필렌(PP), 폴리이미드(PI), 폴리스틸렌(PS), 폴리카보네이트(PC), 폴리우레탄, 폴리비닐리덴플루오라이드, 나일론, 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 폴리비닐클로라이드(PVC), 사이클릭올레핀 공중합체(COC), 액정 고분자(LCP), 폴리아미드(PA), 폴리이미드(PI), 폴리(페닐렌 에테르) (PPE), 폴리옥시메틸렌(POM), 폴리에테르 에테르 케톤(PEEK), 폴리에테르 설폰(PES), 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE), 아크릴 계통의 수지, 실리콘 계열 폴리머인 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane, PDMS) 등일 수 있다. 보다 구체적으로는 폴리디메틸실록산(PDMS)일 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
도시된 구체예에 따르면, 미세유체 디바이스(10)에 3개의 주입구 및 형질 전환 세포를 주입하기 위한 주입구(A), 시료(구체적으로 당류를 함유하는 시료)를 주입하기 위한 주입구(B), 캐리어 유체를 주입하기 위한 주입구(C), 그리고 미세액적을 배출하기 위한 배출구(D)가 형성될 수 있다. 이때, 배출구(D)는 접합 영역에서 형성된 에멀션 유체(수계 미세액적을 함유하는 캐리어 유체)를 미세유체 디바이스(10)의 외부로 배출하는 배출구로서 기능하거나, 또는 후술하는 바와 같이 형광 염료 등의 표지 물질로부터 유래하는 신호를 판독하기 위한 장치와 직접적으로 또는 다른 구성 요소의 개재 하에 연결되거나 연통될 수 있다. 상기 주입구 및 배출구 각각은, 예를 들면 기계적 천공, 레이저 천공, 화학적 에칭, 플라즈마 식각 등과 같이 당업계에서 공지된 방법을 이용하여 형성될 수 있다. 경우에 따라서는 미세유체 디바이스 제작용 기판 제조 시 주입구 및 배출구가 일체적으로 형성(예를 들면, 사출 성형)된 기판을 사용하는 방식으로 형성할 수도 있다.
또한, 미세유체 디바이스 내로 수계 유체(형질 전환된 세포-함유 수계 유체 및 시료 수계 유체) 및 캐리어 유체 각각을 도입하기 위하여, 시린지 펌프(syringe) 펌프 또는 마이크로펌프(도시되지 않음)를 사용할 수 있다.
도시된 미세액적 형성용 미세유체 디바이스(10)에 있어서, 제1 채널(11)을 통하여 당을 감지하는 화학감각 수용체를 발현하고 표지 물질을 내포하는 적어도 하나의 세포, 전형적으로 이러한 세포를 함유하는 수계 유체가 도입된다. 이와 별도로, 제1 채널(11)의 하류(downstream)에서 제1 채널(11)과 융합되는 제2 채널(12)이 형성되어 있다. 제2 채널(12)을 통하여 당(당류) 및 표지 물질의 활성화 성분을 함유하는 시료가 도입된다. 이때, 시료는 전형적으로 수계 유체일 수 있다.
예시적 구체예에 따르면, 제1 채널(11) 및 제2 채널(12) 각각의 폭은, 예를 들면 약 10 내지 100 ㎛(구체적으로 약 30 내지 70 ㎛) 및 약 10 내지 100 ㎛(구체적으로 약 30 내지 70 ㎛) 범위 내일 수 있고, 또한 각각의 높이는, 예를 들면 약 10 내지 100 ㎛(구체적으로 약 30 내지 70 ㎛) 범위 내일 수 있는 바, 이러한 치수는 수계 유체의 주입 용이성, 후술하는 형질 전환된 세포와 시료 간의 반응에 적합한 비율 등을 고려하여 정하여질 수 있다. 다만, 미세유체 디바이스 내 채널의 높이가 지나치게 작은 경우에는 채널 상면과 하면 사이에서 발생되는 정전기로 인하여 수계 액체 또는 후술하는 캐리어 유체의 주입이 용이하지 않을 수 있는 만큼, 상술한 범위 내에서 적절히 조절하는 것이 유리할 수 있다.
이와 관련하여, 전술한 바와 같이 당을 감지하는 화학감각 수용체 단백질 등으로 형질 전환된 세포와 시료 내 당류가 반응할 경우, 시료 내 표지 물질의 활성화 성분이 반응 세포에 내포된 표지 물질을 활성화시켜 이로부터 유래된 신호를 생성할 수 있다. 구체적으로, 형질 전환된 세포와 시료 내 당류가 반응함에 따라 일어나는 채널 개방에 의하여 세포 내로 도입되어 세포에 내포된 표지 물질(형광 염료)과 결합되어 표지 물질로부터 유래하는 신호를 발생시키는 것이다. 앞서 설명한 바와 같이, 인체의 혈액, 땀, 타액, 소변, 눈물 등의 시료에 함유된 칼슘 이온(Ca2+)을 이용하여 형질 전환된 세포와 시료가 반응함에 따라 세포 표면의 Ca 채널이 개방되고, 농도 차에 의하여 세포 외부의 칼슘 이온이 형질 전환된 세포에 내포된 표지 물질인 형광 염료와 결합하여 이를 활성화시킴으로써 형광을 발현하게 된다.
도시된 구체예에 있어서, 제1 채널(11) 및 제2 채널(12) 각각을 통하여 도입된 형질 전환된 세포 및 시료는 제1 채널(11)과 제2 채널(12)이 융합되어 형성된 제3 채널(13)에서 상호 접촉하여 세포와 시료 간 반응을 수행함으로써 반응 세포(시료 내에 당류가 존재하는 경우)를 형성하는 바, 제1 채널 및 제2 채널 각각을 흐르는 유체가 수계 유체인 만큼, 반응 세포를 함유하는 수계 유체가 제3 채널(13)을 통과하게 된다. 이때, 제3 채널(13)의 폭 및 높이는 전술한 제1 채널 및/또는 제2 채널의 폭 및 높이의 범위 내에서 적절히 선정될 수 있다.
예시적 구체예에 따르면, 제1 채널(11)을 흐르는 반응 세포를 함유하는 수계 유체, 그리고 제2 채널(12)을 흐르는 시료의 수계 유체 각각의 주입 속도는, 예를 들면 약 5 내지 50 μl/min(구체적으로 약 8 내지 30 μl/min, 보다 구체적으로 약 10 내지 20 μl/min) 및 약 5 내지 50 μl/min(구체적으로 약 8 내지 30 μl/min, 보다 구체적으로 약 10 내지 20 μl/min) 범위 내에서 적절히 선정할 수 있는 바, 각각의 수계 유체에 대한 주입 압력은 원하는 주입 속도를 고려하여 설정될 수 있다. 예시적으로, 형질 전환된 세포(즉, 당을 감지하는 화학감각 수용체가 발현되는 세포)를 함유하는 수계 유체 : 시료의 수계 유체의 유속 비는 예를 들면 약 1 : 0.5 내지 1 : 10 (구체적으로 약 1 : 1 내지 1 : 8, 보다 구체적으로 약 1 : 3 내지 1 : 5) 범위에서 조절될 수 있다.
한편, 제3 채널(13)의 말단은 상호 교차된 형태로 배열된 복수의, 구체적으로 한 쌍의 제4 채널(14, 14')과 접합될 수 있는 바, 이러한 제4 채널을 통하여 캐리어 유체가 도입된다. 이때, 교차된 형태는 한 쌍의 제2 채널이 서로 다른 위치로부터 연장되어 만나면서 제3 채널(13)과 접합 영역을 형성할 수 있는 배열을 의미할 수 있는 바, 예를 들면 Y자 형, T자 형(즉, 제3 채널에 대하여 수직이면서 서로 대향하는 방향으로 캐리어 유체가 도입됨) 등의 기하학적 형태를 갖도록 배열될 수 있다. 도시된 예에서는 한 쌍의 제4 채널(14, 14')은 캐리어 유체가 서로 대향하며(약 180ㅀ의 각을 형성함) 흐르면서 합쳐지도록 구성되고 제3 채널(13)은 상기 한 쌍의 제4 채널 각각에 대하여 수직을 형성하고 있다.
예시적 구체예에 따르면, 제4 채널(14, 14')의 폭 및 높이는, 예를 들면 약 10 내지 100 ㎛(구체적으로 약 30 내지 70 ㎛) 및 약 10 내지 100 ㎛(구체적으로 약 30 내지 70 ㎛) 범위 내에서 정하여질 수 있다.
한편, 수계 유체와 비혼화성을 갖는 캐리어 유체는 전형적으로 탄소계 오일일 수 있는 바, 몇몇 경우에 있어서는 불소, 실리콘, 산소 또는 이의 조합과 같은 이종 원소를 함유할 수 있다. 예시적 구체예에서, 상기 오일은 식물유(예를 들면, 포도씨유, 올리브유, 콩기름, 캐놀라유 등) 및 공업용 오일(예를 들면, 실리콘 오일, 광물유, 불화탄소유 등)로부터 1 또는 2 이상 선택될 수 있다. 보다 구체적으로, 에테르 결합을 통하여 탄화수소와 불화 알킬 사슬이 커플링되어 있는 하이드로플루오로에테르를 사용할 수 있는 바, 이러한 오일 성분은 당업계에서 HFE-시리즈로 시판되고 있다. 일 예로서, 3M에서 시판 중인 상품명 HFE-7100, HFE-7200, HFE-7500, HFE-7600 등을 예시할 수 있는 바, 이러한 오일 성분은 그 자체로 사용하거나 에멀션 특성 및 성능을 최적화하기 위하여 오일 혼합물의 일 성분으로 사용 가능하다. 특정 구체예에 따르면, HFE-7500(화학식: C7F15OC2H5) 오일을 사용할 수 있다.
또한, 예시적 구체예에 따르면, 형성되는 미세액적의 특성을 조절하거나 최적화할 목적으로, 그리고/또는 생성된 미세액적의 안정성을 유지할 목적으로, 다양한 종류의 계면활성제를 추가적으로 사용할 수 있다. 전자의 경우에는 접합 영역 내로 액적을 압출하는데 요구되는 전단력을 감소시킴으로써 미세액적의 사이즈, 흐름 및 균일성을 조절하기 위하여 사용되는 한편, 후자의 경우에는 미세액적의 상호 뭉침 현상을 방지하기 위하여 사용된다. 이와 관련하여, 계면활성제는 전형적으로는 캐리어 유체 내에 첨가될 수 있다. 비록 수계 유체에 계면활성제를 함유하는 경우를 배제하는 것은 아니지만, 보다 다양한 종류의 계면활성제를 사용하는 것을 허용하고 계면활성제가 세포에 미치는 영향을 최소화하기 위하여 캐리어 유체에 첨가하는 것이 유리할 수 있다.
이러한 계면활성제는 친수성 영역 및 소수성 영역을 모두 포함한다. 계면활성제는 HLB(hydrophile-lipophile balance) 값으로 특성을 나타낼 수 있는 바, 이는 물 및 오일에 대한 상대적 친화성을 나타낸다. 사용 가능한 계면활성제로서 대표적으로 상품명 Tween, Triton, Span, Krytox, Pluronic F68, Neat 008-FluoroSurfactant(RAN biotechnologies사) 등을 예시할 수 있는 바, 이때 캐리어 유체가 실리콘 및 광물유인 경우에는 Tween, Triton 및 Span 계열의 계면활성제를 사용하는 한편, 캐리어 유체가 불화탄소 오일인 경우에는 Krytox, Pluronic F68 등을 사용하는 것이 유리할 수 있다. 상기 나열된 계면 활성제 대부분은 액적 내 세포에 대하여 생체적합성(biocompatibility)을 나타내므로 본 구체예에 적용하는데 유리할 수 있다. 이와 관련하여, Fluka사에서 시판 중인 Span 계면활성제는 소르비탄계 카르복시산 에스테르 화합물로서, 소르비탄 모노라우레이트, 소르비탄 모노팔미테이트, 소르비탄 모노스테아레이트, 소르비탄 모노올레이트 등을 포함한다. 또한, DuPont사에서 시판 중인 Krytox 계면활성제는 과불화 폴리에테르 화합물이다. 예시적 구체예에서 계면활성제는 약 0.2 내지 10 중량%, 구체적으로 약 1 내지 7 중량%, 보다 구체적으로 약 3 내지 6 중량%로 캐리어 유체 내에 함유될 수 있다.
도 2b는 미세유체 디바이스 내에서 미세액적이 형성되는 것을 보여준다. 구체적으로, 연속 상인 캐리어 유체 내에 액적(미세액적)이 형성되는 원리는 하기와 같다: 제3 채널(13)을 통하여 흐르는 수계 유체 및 이와 실질적으로 혼화성이 없거나 혼화성이 낮은 캐리어 유체는 접합 영역에서 서로 만나는데, 이때 접합 영역의 표면에 대한 2가지 유체의 젖음성 차이, 그리고 오일의 전단력(shear force)에 의하여 수계 액체가 절단되고, 주변의 캐리어 유체와 수계 액체의 표면 장력에 의하여 절단된 수계 액체는 구형을 유지함으로써 마이크로미터 사이즈의 액적을 형성할 수 있는 것으로 판단된다.
특히, 캐리어 유체 내에 형성된 수계 분산 상은 접합 영역에서 점차적으로 집중(focusing)되거나 스퀴징(squeezing)되는데, 이때 접합 영역의 내벽이 수계 분산 상의 사이즈를 제한하면서 연속 상인 캐리어 유체를 블로킹함과 동시에 캐리어 유체 흐름으로 인한 압력 빌드-업(build-up) 및 접합 영역에서 수계 분산 상의 급격한 연신(elongation)에 의하여 미세액적이 형성되는 것으로 볼 수 있다.
이처럼, 미세액적은 분산된 상(dispersed phase) 또는 에멀션(emulsion)으로 존재하며, 액적 내부를 구성하는 상(phase)은 수계인 반면, 미세액적을 둘러싸는 연속 상은 캐리어 유체일 수 있다.
한편, 미세액적의 외관 특성(예를 들면, 사이즈)은 전단력, 접합 영역에서의 치수(dimension), 계면 간 표면 장력, 점도, 유속 등의 다양한 요인에 의존할 수 있다. 전형적으로, 미세유체 디바이스 내 유체의 유속은 해당 유체에 가해지는 압력(즉, 주입 압력)이 클수록 미세액적의 사이즈가 증가하는 바, 도시된 구체예에서 제3 채널(13)을 흐르는 반응 세포(시료 내 당류가 존재하지 않을 경우에는 형질 전환된 세포 및 시료의 혼합물)를 함유하는 수계 유체 및 캐리어 유체 각각의 주입 속도는, 예를 들면 약 10 내지 100 μl/min(구체적으로 약 20 내지 60 μl/min, 보다 구체적으로 약 30 내지 40 μl/min) 및 약 5 내지 50 μl/min(구체적으로 약 10 내지 40 μl/min, 보다 구체적으로 약 15 내지 30 μl/min) 범위 내에서 적절히 선정할 수 있고, 각각의 유체에 대한 주입 압력은 원하는 주입 속도를 고려하여 설정될 수 있다.
예시적으로, 반응 세포를 함유하는 수계 유체(제3 채널을 흐르는 수계 유체) : 캐리어 유체(한 쌍의 제4 채널을 통하여 도입되는 캐리어 유체)의 유속 비는 예를 들면 약 1 : 0.1 내지 1 : 10 (구체적으로 약 1 : 0.5 내지 1 : 5, 보다 구체적으로 약 1 : 1 내지 1 : 2) 범위에서 조절될 수 있다. 이와 관련하여, 접합 영역 내 수계 유체에 대한 캐리어 유체의 유속이 클수록 액적 사이즈는 감소하는 경향을 나타낼 수 있다. 예시적 구체예에 따르면, 미세액적의 사이즈는, 예를 들면 약 20 내지 200 ㎛, 구체적으로 약 40 내지 100 ㎛, 보다 구체적으로 약 50 내지 70 ㎛ 범위일 수 있다. 또한, 미세유체 디바이스에 의하여 형성된 미세액적은 높은 단분산도(monodispersity), 예를 들면 약 4% 미만, 구체적으로 약 3% 미만, 보다 구체적으로 약 2% 미만의 분산도를 나타낼 수 있다(즉, 균일한 미세액적의 크기(사이즈) 분포를 나타냄).
상기와 같이 형성된 미세액적은 제5 채널(15)을 통하여 배출되는데, 이때 수계 유체의 구성 성분, 즉 당을 감지하는 화학감각 수용체가 발현되도록 형질 전환된 세포와 시료 내 당류가 반응하여 얻어진 반응 세포가 미세액적 내에 함유될 수 있다. 예시적 구체예에 따르면, 제5 채널(15)의 폭 및 높이는 각각 예를 들면 약 70 내지 250 ㎛(구체적으로 약 100 내지 200 ㎛) 및 약 10 내지 100 ㎛(구체적으로 약 30 내지 70 ㎛) 범위 내에서 정하여질 수 있다.
본 구체예에 있어서, 개별 미세액적 내에 함유되는 반응 세포의 개수는 1 이하인 것이 유리할 수 있다. 이때, 미세액적 내에 단일의 반응 세포를 포획할 경우의 장점은 미세액적 내에 단일 세포를 포획하여 분석할 경우, 복수의 세포가 포획될 때 야기될 수 있는 분석 오차를 낮출 수 있다는 것이다. 특히, 본 구체예에 따른 시료 내 당류의 진단 플랫폼에서는 증폭 과정을 거치지 않는 바, 단일 미세액적 내 복수의 반응 세포가 포획될 경우에 표지 물질로부터 유래하는 신호를 검출하여 판독하는 과정에서 발생하는 분석 오차를 최소화할 수 있다.
이와 관련하여, 미세액적 내에 반응 세포를 세포 단위로 효과적으로 포획하도록 캐리어 유체와 접촉하기에 앞서 반응 세포-함유 수계 유체를 주입하는 미세유로(제1 채널)의 예시적 패턴을 도 2c에 나타내었다.
상기 도면을 참조하면, 도시된 제1 채널(11) 구조는 미세채널 내에 반응 세포가 일정 간격을 두고 정렬되도록 하여 미세액적 내에 세포 단위로 반응 세포를 포획하는데 특히 적합하다.
구체적으로, 일정한 크기를 갖는 반응 세포의 채널 내 유동 환경에서 세포의 크기, 채널 직경, 유속, 세포 농도, 세포와 채널 내 벽과의 상호 작용 등이 특정 조건을 만족할 때 세포가 하나의 유선(streamline)을 따라 일정한 간격을 유지하며 정렬되어 흐르도록 유도할 수 있다. 이때, 채널 내 유체는 채널 벽과의 상호 작용(예를 들면, 전단력)에 의하여 유체의 진행 방향으로 포물선 형태의 속도 분포를 나타내는데, 채널 내 중앙에서 속도가 가장 빠르며, 벽면으로 가까울수록 속도가 감소한다. 즉, 전단력은 채널 중심에서 실질적으로 0이며, 반경에 비례하면서 채널 벽까지 직선적으로 증가하며 채널 벽에서 최대가 된다. 이때, 유체(상기 구체예에서는 수계 유체)와 함께 이동하는(흐르는) 세포는 각 지점에서 유체의 유속 차이로 인하여 채널 벽면으로부터 힘을 받게 되며, 채널의 단면 기준으로 세포에 작용하는 힘이 0이 되는 지점에서 정렬한 상태로 흐르게 된다. 예시적 구체예에 있어서, 채널의 단면이 정사각형(또는 원형)인 직선 채널인 경우, 반응 세포가 하나의 유선을 따라 정렬한다고 할 때, 전형적으로 채널 내 중심을 따라 정렬하면서 흐르게 된다.
도시된 바와 같이, 세포-함유 유체를 회전하는 곡선 채널(즉, 나선형(스파이럴 또는 헬리컬) 패턴으로 형성된 채널)을 통하여 흐르도록 하면, 곡면의 외부 방향으로 작용하는 원심력을 받게 되며, 이러한 원심력과 기존에 반응 세포에 작용하던 힘이 조합되어 보다 빠른 시간 내에 세포의 표면에 작용하는 힘이 평형을 이루면서 정렬된 상태로 흐르게 된다. 그 결과, 개별 미세액적 내에 단일 반응 세포를 보다 용이하게 포획할 수 있다.
상술한 원리를 이용하여, 분산 상에 상당하는 수계 유체(형질 전환된 세포 함유)의 주입구부터 미세 액적이 형성되는 접합 영역에 이르는 지점까지의 경로에 세포가 일정 간격을 두고 정렬될 수 있는 조건을 만족하는 회전형의 미세채널 구조를 설계할 수 있다.
또한, 분산 상의 유속을 조절함으로써 정렬된 세포가 흐르는 속도 역시 조절할 수 있다. 또한, 접합 영역을 통과하는 세포(반응 세포)의 주기에 맞추어 미세액적이 생성되도록 연속 상(캐리어 유체)의 유속을 조절할 경우, 개별 미세 액적 내에 용이하게 단일 세포를 포획할 수 있다.
상술한 구체예에 따라 형질 전환된 세포는 나선형 패턴의 미세 채널을 거쳐 일정 간격을 두고 정렬된 상태로 배열되며, 이후 제1 채널(11)의 나머지 구간(도시된 예에서는 직선 형)을 통과하면서 제2 채널(12)을 통하여 유입되는 시료와 접촉하여 반응할 수 있다. 그 결과, 반응 세포를 함유하는 수계 유체는 일정한 간격을 두고 정렬된 상태에서 제3 채널(13)을 통과하고, 제4 채널(14, 14')을 통하여 유입되는 캐리어 유체와 접합 영역에서 만나게 된다.
한편, 특정 구체예에 있어서, 도시된 설계도에 따라 당업계에서 공지된 방법을 통하여 미세액적 생성부를 구비한 미세유체 디바이스를 제작할 수 있다. 예를 들면, 별도로 제작된 2개의 기판(2개의 기판 중 하나 또는 모두가 패턴화됨)을 서로 결합(접합)하여 디바이스를 제작할 수 있다. 이때, 2개의 기판은 각각 상부 기판 및 하부 기판을 형성할 수 있는 바, 이중 적어도 하나가 패턴화된 형태일 수 있다. 이와 관련하여, 미세유체 디바이스를 구성하는 개별 기판에 채널 형성을 위한 특정 패턴을 제공하는 일련의 예시적인 공정은 당업계에 공지된 포토리소그래피 테크닉을 이용하여 구현할 수 있다.
특정 구체예에 있어서, 주형용 기판(예를 들면, 글라스, 투명 플라스틱, 실리콘 웨이퍼 등) 상에 포토레지스트 층(예를 들면, SU-8(에폭시계 네거티브 포토레지스트의 일종))을 형성하고, 도포된 포토레지스트 층에 대하여 선택적 제거 과정(패턴화 과정)을 거치게 된다. 이와 같이 패턴화된 구조물을 주형으로 사용한 몰드 내로, 예를 들면 액상 고분자를 부어 냉각시킨 후에 이를 분리하여 패턴화된 고분자 층을 형성하는 방식으로 미세유체 디바이스 제작을 위한 상부 기판 및/또는 하부 기판으로 사용할 수 있다. 이때, 패턴화된 고분자 층(예를 들면, PDMS 재질)을 제조하기 위하여, 단량체 : 경화제(예를 들면, Sylgard 184A, Sylgard 184A 등)를 약 5 : 1 내지 10 : 1의 중량비로 혼합한 다음, 상기 몰드 내로 부은 다음, 예를 들면 약 1 내지 5 시간, 구체적으로 2 내지 3 시간 동안 전형적으로는 약 50 내지 80℃, 구체적으로는 약 60 내지 70℃에서 중합시킨 다음, 몰드로부터 고분자 층을 분리한다. 이때, 패턴이 형성된 기판의 두께(패턴을 구성하는 요철부 아래의 기판 두께)는, 예를 들면 약 0.1 내지 30 mm 범위일 수 있다.
이와 같이 2개의 기판(상부 기판 및 하부 기판)을 결합(접합)하면 원하는 패턴의 채널(유로)이 형성된 미세유체 디바이스를 제작할 수 있다. 이때, 채널 내에 형성된 공간을 통하여 유체의 이송, 혼합 등의 기본적인 현상이 일어나며, 미세액적 역시 형성될 수 있다. 다만, 상부 기판과 하부 기판은 서로 동일하거나 또는 상이한 재질(예를 들면, 상부 기판은 고분자 재질이고 하부 기판은 글라스 재질)일 수 있으며, 동일 또는 동종 플라스틱 재질이라 해도 상부 기판과 하부 기판 각각의 개별 물성이 상이할 수 있다. 또한, 상부 기판 및 하부 기판의 결합(접합)을 위하여, 상부 기판과 하부 기판을 열로 이용하여 융착하는 열 융착법, 초음파를 이용한 융착법, 코로나 방전 또는 플라즈마를 이용하여 결합하는 방법 등을 이용할 수 있다.
구체적으로, 상부 기판과 하부 기판의 결합 과정에서, 예를 들면 약 50 내지 130 ℃, 보다 구체적으로 약 80 내지 130 ℃ 범위에서 결합(접합)을 실시할 수 있다. 초음파를 이용한 융착법의 경우, 상부 기판과 하부 기판을 위치시키고 지그를 사용하여 고정시킨 후에 순간적으로 초음파를 조사하여 2개의 기판을 결합할 수 있다. 코로나 방전법의 경우, 상부 기판 및 하부 기판의 결합 면에 코로나 방전을 노출시켜 표면을 순간적으로 개질시킨 후 접착하는 방식으로서, 예를 들면 약 50 내지 80 ℃, 보다 구체적으로 약 60 내지 80 ℃의 온도에서 약 5분 내지 1시간 동안 결합을 수행할 수 있다.
또한, 채널 내 표면 특성 역시 액적 형성에 영향을 미칠 수 있는 바, 미세유체 디바이스를 구성하는 고분자(예를 들면, PDMS) 기판은 선택적으로 실란화 처리 등을 통하여 탄화수소기 또는 불화탄소기로 관능화될 수 있다. 이러한 관능화 처리에 의하여, 디바이스가 비교적 장기간의 작동 중에도 성능을 유지할 수 있다.
시료 내 당류의 검출(진단) 및 판독
본 개시 내용의 일 구체예에 따르면, 미세액적 내 반응 세포로부터 생성된 표지 물질-유래 신호를 이용하여 정성적 및/또는 정량적으로 검출하는 단계가 수행된다.
앞서 설명한 바와 같이, 당을 감지하는 화학감각 수용체 단백질 등으로 형질 전환된 세포와 시료 내 당류가 반응하여 얻어진 반응 세포는 미세액적 내에 포획된 상태로 배출되어 검출 과정을 거치게 된다. 이때, 검출 장치는 광학 또는 전기적 검출기 또는 이들의 조합일 수 있다. 적절한 검출 장치로서 광도파관, 현미경, 다이오드, 레이저 등, 당업계에서 공지된 검출 장치를 사용할 수 있는 바, 이러한 장치를 이용하여 미세액적 내 반응세포로부터 발생하는 일련의 신호(signal)를 검출한다. 예를 들면 공초점 현미경(confocal microscope), 형광 현미경(fluorescence microscope), 형광계(fluorometer), 형광 스캐너(fluorescence scanner), 플로우사이토메터(flow cytometer) 등과 같은 당업계에 알려진 검출 장치를 이용할 수 있다.
특히, 종래 기술의 경우에는 타겟 물질의 검출을 위하여 증폭 반응을 수행하는 것이 일반적이나, 본 구체예에서는 당을 감지하는 화학감각 수용체를 발현하고 표지 물질을 내포하는 적어도 하나의 세포를 이용하고, 미세유체 디바이스 내에서 이를 시료 내 당류와 반응시키는 간단한 과정을 통하여 증폭 과정을 거치지 않고도 시료 내 당류에 대한 정성적 및/또는 정량적 검출(진단)을 수행할 수 있다는 점은 주목할 만하다. 전술한 기술 원리에 의하여, 개별 미세액적을 대상으로 표지 물질로부터의 신호 유무 및 신호 정도(즉, 표지 물질이 형광 염료인 경우에는 형광 발현 여부 및 형광 정도)를 통계학적 기법을 이용하여 시료 내 당류의 존재 여부 및 농도를 검출할 수 있다. 이때, 시료에 대한 정확한 판독이 가능하도록 처리용 소프트웨어(예를 들면, LabVIEW software)가 구비된 장치를 이용할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해 바람직한 실시예를 제시하지만, 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
당을 감지하는(인식하는) 화학감각수용체 발현 세포의 제조
당을 감지하는 화학감각 수용체 발현 세포주 제작
- RNA 추출, cDNA 합성 및 클로닝
양봉 꿀벌(Western Honey bee)인 Apis mellifera를 인천대학교 캠퍼스 내 양봉장에서 사육하였다. cDNA 합성을 위하여, 나이에 상관없이 3개의 하이브로부터 일벌을 직접 포획하였다. 그 다음, 포획한 일벌을 글라스 바이얼 내에 넣고 움직임을 중단할 때까지 냉각하였다. Qiagen RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA)를 이용하여 꿀벌의 더듬이로부터 전체 RNA를 단리하였다. 1 μg의 전체 RNA를 사용하였고, Superscript III 효소 (Invitrogen, Carlsbad, CA)와 함께 oligo-dT 프라이머를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 이후, TaKaRa Ex-Taq (Takara Shuzou, Kyoto, Japan)를 이용하여 전체 cDNA로부터 A. mellfiera의 미각 감각 수용체 1 (AmGr1, XM_006567730.2)의 전체 길이의 코딩 시퀀스(full-length coding sequence)를 PCR 증폭하였다. 증폭 반응물(25 μl)은 0.3 μl의 TaKaRa Ex-Taq, 2.5 μl의 10X Ex-Taq 버퍼(buffer), 2 μl의 2.5 mM dNTP 혼합물, 각각 2 μl의 프라이머 10 pmol, 1 μl의 주형 cDNA, 및 17.2 μl의 살균된 증류수를 함유하였다. 모든 증폭 반응은 하기의 조건 하에서 96 Well Thermal Cycler (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA.)를 이용하여 수행하였다: 94 ㅀC에서 3 min; 30초 동안 94 ㅀC의 35 사이클, 30초 동안 62 ㅀC, 1분 동안 72 ㅀC; 그리고 10분 동안 72 ㅀC. PCR 증폭 생성물을 1.0% 아카로오스 겔 상에서 전개시켰고 예상된 사이즈(1401bp)의 밴드에 의하여 확인하였다. 그 다음, QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen, Valencia, CA)를 이용하여 PCR 증폭 생성물을 정제하였다. 정제된 시료를 pGEM-t-easy 벡터 내로 클로닝하였다.
- 세포 배양
5% CO2 및 37℃ 조건 하에서 HEK-293(human embryonic kidney) 세포를 배양하였다. HEK-293 세포를 배양하기 위하여 10% 소태아 혈청(Fetal Bovine Serum) 및 0.5% 페니실린스트렙토마이신(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 함유하는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium, Invitrogen, Carlsbad, CA)를 사용하였다.
- HEK-293 세포 내 이형 단백질인 AmGr1의 발현
pGEM 내 AmGr1의 cDNA를 pcDNA3.1 포유류 발현 벡터의 다중 클로닝 사이트 내로 절단 효소 EcoRI 및 NotI (Koscamco, Anyang, Korea)를 이용하여 프라이머로 증폭하였다. Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA)를 사용함으로써 조합체로서 2.5 ㎍의 AmGr1 벡터를 HEK-293 세포로 형질 전환시켰다. 125 μl의 Opti-MEM 내에서 6 μl의 속도로 Opti-MEM (Invitrogen, Carlsbad, CA)를 Lipofectamine 2000과 혼합하였고, 이를 상온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 또한, 플라스미드 DNA (2.5μg)를 125 μl의 Opti-MEM 배지와 블렌딩하였다. 2개의 혼합된 배지를 조합하여 상온에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 전체 용액(250 μl)을 HEK-293 세포 상에 도포하였다. 48 시간 후, 50 내지 100 μg/μl 농도의 항생제(zeocin antibiotics)를 이용하여 세포를 선택하였다.
화학감각 수용체의 발현 및 신호 전달 확인
AmGr1로 형질 전환된(transfected) HEK-293 세포를 96 웰(well) 플레이트로 이송하였다. 24 시간 후, 각각의 웰 내에서의 배지를 99 μl의 Fluo-4 NW 염료 혼합 용액 (Invitrogen, Carlsbad, CA)로 변경하였다.
그 다음, 플레이트를 40분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. Synergy HTX Multi-Reader (Bio-Tek, Winooski, VT)를 이용하여 초당 형광 변화를 485 nm의 여기에 의하여 528 nm에서 측정하였다. 각각의 측정에 있어서, 애세이 버퍼(1X HBSS, 20 mM HEPES) 내에서 희석된 글루코오스(Sigma-Ardrich, St. Louis, MO)를 최종 농도 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 및 500 mM로 주입하였다. 상기 실험을 3회에 걸쳐 수행하였다.
AmGr1으로 형질 전환되고 Fluo-4 형광 염료를 함유하는 HEK-293 세포를 글루코오스-함유 시료와 반응시켜 형광을 나타내는지 유무, 그리고 시료 내 글루코오스 농도를 변화시킴에 따른 형광 세기를 평가하였다. 이때, x축이 10초가 되는 시점에서 시료를 주입하였다. 도 3에서는 시료 주입 후 글루코오스를 함유하지 않은 경우(Negative), 글루코오스를 함유한 경우(Positive; 농도: 500 mM), 그리고 글루코오스 농도를 40 mM로 변화시킨 경우의 RFU(relative fluorescence units)를 나타낸다.
상기 도면에 따르면, Negative인 경우에는 약 5초 경과 후 최대 형광 세기를 나타낸 후 감퇴하는 반면, Positive의 경우에는 30초까지 지수 함수적으로 증가한 후에 수렴하였다. 한편, 글루코오스 농도가 40 mM인 경우에는 주입 후 약 5초 경과 후에 최대 형광 세기를 나타내었다.
상술한 결과로부터, AmGr1으로 형질 전환되고 Fluo-4 형광 염료를 함유하는 HEK-293 세포는 시료 내 글루코오스와 반응하여 형광을 발현함을 알 수 있다.
실시예 2
미세액적 생성을 위한 디바이스 제작 및 미세액적 내 화학감각 수용체 발현 세포의 담지
하기의 절차를 따라 미세액적 내 화학감각수용체 발현 세포 담지를 위한 미세액적 생성용 디바이스를 제작하였다.
미세액적 형성용 미세유체 디바이스를 스탠더드 소프트 리소그래피(standard soft lithography)를 이용하여 제작하였다. 이와 관련하여, 마스터 몰드로서 포토레지스트 SU-8 2050, 그리고 현상액(developer)은 MicroChem사(메사츄세츠, 뉴턴)로부터 구입하였으며, PDMS 프리폴리머 혼합물(Sylgard 184)은 Dow Corning(미주리, 미들랜드)사로부터 구입하였다.
이후, 도 2a 및 도 2c에 나타난 설계도에 따라 상부 기판 및 하부 기판을 각각 제조하여 접합하였다. 상기 설계된 바에 따라 기판에 채널을 형성하기 위하여, 먼저 SU-8 2050을 4-인치 실리콘 웨이퍼(LG 실트론사) 상에 스핀코팅하였고, 통상의 포토리소그래피 테크닉에 따라 마스터 몰드를 제작하였다(패턴 높이: 50 ㎛).
그 다음, 가스가 제거된 PDMS 프리폴리머 혼합물(베이스 : 경화제의 중량비는 10:1임)인 마스터 몰드 상에 캐스팅(몰딩)하여 PDMS 리플리카를 제조한 후, 70 ℃에서 2시간 동안 경화시킨 다음, 분리하였다. 경화를 거친 PDMS를 마스터 몰드로부터 분리하고 주입구 및 배출구를 위한 홀을 형성하였다.
이와 같이 제작된 PDMS 리플리카를 공기 플라즈마(10.5 W, 60초)로 산화시켰다(상부 기판). 이와 별도로, 패턴이 형성되지 않은 PDMS 재질의 기판(하부 기판, 두께: 0.2 mm)을 상기 상부 기판과 60 ℃에서 1 시간 동안 접합(bonding)시켰고, 상기 접합체를 오븐 내에 80 ℃에서 30분 동안 유지시킴으로써 결합 강도를 증가시켰다. 이후, 코팅 용액을 형성된 채널에 충진하여 채널이 세포 시딩에 적합하도록 하였다. 그 다음, 채널 내에 살균수를 흡입하여 세척하여 최종적으로 미세유체 채널이 형성된 미세유체 디바이스를 제작하였다.
상기 제작된 디바이스에서, 제1 채널(Ch 1), 제2 채널(Ch 2), 제3 채널(Ch 3) 및 제4 채널(Ch 4) 각각의 폭은 50 ㎛이었고, 제5 채널(Ch 5)의 폭은 150 ㎛이었다. 모든 채널의 높이는 50 ㎛이었다.
상기 제작된 미세유체 디바이스에 형성된 2개의 주입구(A 및 B)에 앞서 제조된 화학감각 수용체 발현 세포 및 글루코스를 각각 로딩(loading)한 다음, 시린지 펌프를 이용하여 각각 10 μl/min 및 10 μl/min의 속도로 조절하여 흘려주었다.
캐리어 유체로서 HFE-7500 불화탄소(fluorocarbon) 오일(3M사에서 시판 중)을 사용하였으며, 계면활성제(RAN biotechonlogies사의 제품명 008-FluoroSurfactant)를 5 중량%로 첨가하여 사용하였다. 오일을 한 쌍의 대향하는 주입구(C)에 투입하고 시리진 펌프를 이용하여 10 μl/min의 유속으로 흘려주었다.
미세유체 디바이스의 제3 채널(Ch 3)에서 상기 주입된 형질 전환된 세포 및 글루코오스가 접촉하여 반응하였고, 이의 반응 생성물은 제4 채널(Ch 4)을 통하여 흐르는 오일과 접합 영역에서 접촉한 결과, 제5 채널(Ch 5)을 통하여 미세액적으로 배출되었다(액적 사이즈: 약 50 ㎛).
형광 분석을 통한 진단
공초점 현미경을 사용하여 형광을 이미징함으로서 각각의 미세액적 내 형광 변화를 관찰하였는 바, 도 4에 시료 내 글루코오스 농도 변화에 따라 미세유체 디바이스에 의하여 형질 전환된 세포가 포획된 미세액적 내 형광이 발생되는 정도를 나타내었다.
상기 도면을 참조하면, 시료 내 글루코오스를 함유하지 않는 경우(Negative)에는 형광을 나타내는 미세액적은 관찰되지 않았다. 반면, 시료 내 글루코오스의 농도가 증가할수록 형광을 나타내는 미세액적의 수가 증가함을 알 수 있다.
이처럼, AmGr1 유전자로 형질 전환된 세포가 수크로오스와 반응한 반응 세포를 포획하고 있는 미세액적이 녹색 형광을 발현함을 알 수 있다. 따라서, 본 실시예에 따른 진단 플랫폼은 별도의 증폭 과정 없이도 시료 내 당을 진단할 수 있음을 확인하였다.
판독 장치를 이용한 시료 내 글루코오스의 진단
상기 제작된 미세유체 디바이스를 판독 장치와 결합시킨 다음, 대물렌즈로 초점을 맞추어 원하는 감지부에 광원이 조사하도록 조절하였다. 소프트웨어 제어부의 조절을 통하여 원하는 파장과 형광 세기를 통제한 후에 발생된 미세액적의 형광의 세기를 측정하였다. 이때, 시료 내 글루코오스의 농도에 따라 미세액적에 구획화된 세포의 형광 세기를 분석하기 위하여, 각각의 시료 당 형광 세기를 총 4가지 (0.025 내지 0.05 mV, 0.05 내지 0.075 mV, 0.075 내지 0.1 mV, 그리고 0.1 초과)로 구분하여 population을 분석하였고, 시료 당 100개의 데이터를 수집하였다.
진단 결과는 실시 간 그래프로부터 소프트웨어를 통하여 확인하였는 바, 그 결과를 도 5에 나타내었다.
상기 도면에 따르면, 시료 내 글루코오스의 농도가 증가함에 따라 가장 낮은 신호(0.025 내지 0.05 mV)의 비율이 감소하는 한편, 높은 신호(즉, 0.075 내지 0.1 mV 및 0.1 mV 초과)에서는 이의 비율이 증가하였다. 이와 같이 글루코오스의 농도가 증가함에 따라 높은 신호의 비율이 증가한다는 점은 미세액적에 구획화된 세포의 형광 세기가 글루코오스의 농도에 비례함을 지시한다.
본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 용이하게 이용될 수 있으며, 이러한 변형이나 변경은 모두 본 발명의 영역에 포함되는 것으로 볼 수 있다.

Claims (16)

  1. a) 당을 감지하는 화학감각 수용체를 발현하고 표지 물질을 내포하는 적어도 하나의 세포를 제공하는 단계;
    b) (i) 당 및 (ii) 표지 물질의 활성화 성분을 함유하는 시료를 제공하는 단계;
    c) 상기 적어도 하나의 세포와 상기 시료를 반응시켜 적어도 하나의 반응 세포를 형성하는 단계, 이때 시료의 활성화 성분이 상기 반응 세포 내에서 표지 물질을 활성화시켜 이로부터 유래된 신호를 생성함;
    d) 상기 반응 세포를 미세액적 내에 포획하는 단계; 및
    e) 상기 미세액적 내 반응 세포로부터 생성된 표지 물질-유래 신호를 이용하여 정성적 및/또는 정량적으로 검출하는 단계;
    를 포함하는 시료 내 당의 진단 방법.
  2. A) 제1 채널을 통하여 당을 감지하는 화학감각 수용체를 발현하고 표지 물질을 내포하는 적어도 하나의 세포를 함유하는 수계 유체를 도입하는 한편, 이의 하류에서 상기 제1 채널과 융합되는 제2 채널을 통하여 (i) 당 및 (ii) 표지 물질의 활성화 성분을 함유하는 시료의 수계 유체를 미세유체 디바이스로 도입하는 단계;
    B) 상기 제1 채널과 상기 제2 채널이 융합되어 형성된 제3 채널을 통하여 상기 적어도 하나의 세포를 함유하는 수계 유체와 상기 시료의 수계 유체를 접촉시켜 상기 적어도 하나의 세포와 상기 시료 간 반응을 수행함으로서 적어도 하나의 반응 세포를 함유하는 수계 유체를 형성하는 단계, 이때 시료의 활성화 성분이 상기 반응 세포 내에서 표지 물질을 활성화시켜 이로부터 유래된 신호를 생성함;
    C) 상기 제3 채널과 접합 영역을 형성하되 상호 교차된 형태로 배열된 복수의 제4 채널을 통하여 수계 유체와 비혼화성을 갖는 캐리어 유체를 도입하여 미세유체 디바이스 내에서 상기 적어도 하나의 반응 세포를 포함하는 수계 유체와 비혼화성을 갖는 캐리어 유체를 접촉시킴으로써 연속 상인 캐리어 유체 내에 상기 반응 생성물을 함유하는 수계 미세액적을 형성하는 단계; 및
    D) 상기 접합 영역과 연통된 제5 채널을 통하여 상기 캐리어 유체 내에 형성된 수계 미세액적을 배출하는 단계; 및
    E) 상기 미세액적 내 반응 세포로부터 생성된 표지 물질-유래 신호를 이용하여 정성적 및/또는 정량적으로 검출하는 단계;
    를 포함하는 시료 내 당의 진단 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 당을 감지하는 화학감각 수용체를 발현하고 표지 물질을 내포하는 적어도 하나의 세포는 동물 세포에 당을 감지하는 화학 감각 수용체를 발현하는 유전자를 주입하여 형질 도입된 세포인 것을 특징으로 하는 시료 내 당의 진단 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 당을 감지하는 화학감각 수용체를 발현하고 표지 물질을 내포하는 적어도 하나의 세포 중 표지 물질은 당을 감지하는 화학감각 수용체를 발현하는 적어도 하나의 세포를 상기 표지 물질을 함유하는 배지 내에서 배양하여 수득한 것을 특징으로 하는 시료 내 당의 진단 방법.
  5. 제3항에 있어서, 상기 당을 감지하는 화학감각 수용체를 발현하고 표지 물질을 내포하는 적어도 하나의 세포는 당을 감지하는 화학감각 수용체의 단백질이 세포 표면에 과발현되어 있는 것을 특징으로 하는 시료 내 당의 진단 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 당을 감지하는 화학감각 수용체의 단백질은 꿀벌의 AmGr1 단백질인 것을 특징으로 하는 시료 내 당의 진단 방법.
  7. 제2항에 있어서, 상기 제1 채널은 상기 당을 감지하는 화학감각 수용체를 발현하고 표지 물질을 내포하는 적어도 하나의 세포를 함유하는 수계 유체의 주입구 또는 이에 근접한 영역에 나선형 또는 나팔관 패턴의 영역을 구비하여 상기 제1 채널을 통하여 도입되는 수계 유체 내 상기 적어도 하나의 세포를 소정 간격을 두고 세포 단위 별로 정렬시킴으로써 단일 미세액적 내에 단일 세포를 포획하도록 구성되는 것을 특징으로 하는 시료 내 당의 진단 방법.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 표지 물질은 형광 염료로서 Fluo-4, Fluo-3, Rhod-2 또는 이의 조합인 것을 특징으로 하는 시료 내 당의 진단 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 표지 물질의 활성화 성분은 칼슘 이온인 것을 특징으로 하는 시료 내 당의 진단 방법.
  10. 제2항에 있어서, 상기 제1 채널, 제2 채널, 제3 채널 및 제4 채널 각각의 폭 및 높이는 각각 10 내지 100 ㎛ 범위 내에서 선정되고,
    상기 제5 채널의 폭 및 높이는 각각 70 내지 250 ㎛ 및 10 내지 100 ㎛ 범위 내에서 선정되는 것을 특징으로 하는 시료 내 당의 진단 방법.
  11. 제2항에 있어서, 상기 제3 채널을 흐르는 적어도 하나의 반응 세포를 포함하는 수계 유체, 및 상기 제4 채널을 통하여 도입되는 캐리어 유체 각각의 주입 속도는 10 내지 100 μl/min 및 5 내지 50 μl/min 범위인 것을 특징으로 하는 시료 내 당의 진단 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 제3 채널을 흐르는 적어도 하나의 반응 세포를 포함하는 수계 유체, 및 상기 제4 채널을 통하여 도입되는 캐리어 유체의 유속 비는 1 : 0.1 내지 1 : 10 범위에서 조절되는 것을 특징으로 하는 시료 내 당의 진단 방법.
  13. 제2항에 있어서, 상기 제1 채널을 통하여 도입되는 당을 감지하는 화학감각 수용체를 발현하고 표지 물질을 내포하는 적어도 하나의 세포를 함유하는 수계 유체, 그리고 상기 제2 채널을 통하여 도입되는 시료의 수계 유체 각각의 주입 속도는 5 내지 50 μl/min 및 5 내지 50 μl/min 범위 내에서 선정되는 것을 특징으로 하는 시료 내 당의 진단 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 제1 채널을 통하여 도입되는 당을 감지하는 화학감각 수용체를 발현하고 표지 물질을 내포하는 적어도 하나의 세포를 함유하는 수계 유체 : 상기 제2 채널을 통하여 도입되는 시료의 수계 유체의 유속 비는 1 : 0.5 내지 1 : 10 범위에서 조절되는 것을 특징으로 하는 시료 내 당의 진단 방법.
  15. 당을 감지하는 화학감각 수용체를 발현하고 표지 물질을 내포하는 적어도 하나의 세포(I)와 (i) 당 및 (ii) 표지 물질의 활성화 성분을 함유하는 시료(II) 간 반응에 의하여 얻어진 반응 세포를 미세액적 내에 포획하기 위한 미세유체 디바이스를 포함하는 바이오센서; 및
    상기 적어도 하나의 세포와 상기 시료 간 반응에 의하여 활성화된 표지 물질로부터 유래된 신호를 이용하여 정량적 및/또는 정성적으로 검출하는 판독기;
    를 포함하는 시료 내 당의 진단 기기.
  16. 제15항에 있어서, 상기 시료 내 당의 진단 기기는 당뇨 진단 기기인 것을 특징으로 하는 당의 진단 기기.
KR1020180115738A 2018-09-28 2018-09-28 당을 감지하는 화학감각 수용체를 발현하는 세포를 이용한 미세유체 디바이스 기반의 시료 내 당의 진단 기기 및 진단 방법 KR102160794B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020180115738A KR102160794B1 (ko) 2018-09-28 2018-09-28 당을 감지하는 화학감각 수용체를 발현하는 세포를 이용한 미세유체 디바이스 기반의 시료 내 당의 진단 기기 및 진단 방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020180115738A KR102160794B1 (ko) 2018-09-28 2018-09-28 당을 감지하는 화학감각 수용체를 발현하는 세포를 이용한 미세유체 디바이스 기반의 시료 내 당의 진단 기기 및 진단 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20200036284A true KR20200036284A (ko) 2020-04-07
KR102160794B1 KR102160794B1 (ko) 2020-09-28

Family

ID=70290983

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020180115738A KR102160794B1 (ko) 2018-09-28 2018-09-28 당을 감지하는 화학감각 수용체를 발현하는 세포를 이용한 미세유체 디바이스 기반의 시료 내 당의 진단 기기 및 진단 방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102160794B1 (ko)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101605701B1 (ko) * 2015-09-07 2016-04-01 한국과학기술원 미세액적 기반 바이오물질의 분석 장치 및 방법
JP2016533164A (ja) * 2013-09-24 2016-10-27 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア バイオアッセイと診断のためのカプセル化センサー及びセンシングシステム、及びその作製及び使用方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016533164A (ja) * 2013-09-24 2016-10-27 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア バイオアッセイと診断のためのカプセル化センサー及びセンシングシステム、及びその作製及び使用方法
KR101605701B1 (ko) * 2015-09-07 2016-04-01 한국과학기술원 미세액적 기반 바이오물질의 분석 장치 및 방법

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
M.J.Lee et al., ACS NANO, Vol. 9, No. 12, 2015, pp. 11728-11736. *
정제원, 서울대학교 대학원 박사학위 논문, 2015.* *

Also Published As

Publication number Publication date
KR102160794B1 (ko) 2020-09-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Narayanamurthy et al. Advances in passively driven microfluidics and lab-on-chip devices: A comprehensive literature review and patent analysis
Kovarik et al. Micro total analysis systems: fundamental advances and applications in the laboratory, clinic, and field
Kovarik et al. Micro total analysis systems for cell biology and biochemical assays
Liu et al. Microfluidic systems for biosensing
Hemmig et al. Transposing lateral flow immunoassays to capillary-driven microfluidics using self-coalescence modules and capillary-assembled receptor carriers
US10900896B2 (en) Flow cells utilizing surface-attached structures, and related systems and methods
Li et al. An on-chip, multichannel droplet sorter using standing surface acoustic waves
Huang et al. Transport, location, and quantal release monitoring of single cells on a microfluidic device
Burklund et al. Advances in diagnostic microfluidics
Tachi et al. Simultaneous separation, metering, and dilution of plasma from human whole blood in a microfluidic system
CN102879453B (zh) 基于电泳来操控液体中的带电粒子的方法及器件
Farshchi et al. Microfluidic biosensing of circulating tumor cells (CTCs): Recent progress and challenges in efficient diagnosis of cancer
Akceoglu et al. A snapshot of microfluidics in point‐of‐care diagnostics: multifaceted integrity with materials and sensors
US20100003666A1 (en) Microfluidic Methods for Diagnostics and Cellular Analysis
Park et al. Finger-actuated microfluidic display for smart blood typing
Kim et al. Microfluidic pipette tip for high-purity and high-throughput blood plasma separation from whole blood
Qi et al. Probing single cells using flow in microfluidic devices
US20150076049A1 (en) Microfilter and apparatus for separating a biological entity from a sample volume
Liu et al. Advances in microfluidic strategies for single-cell research
Zhou et al. based acoustofluidics for separating particles and cells
Rosen et al. MEMS and microfluidics for diagnostics devices
Chiu et al. 3 Electrochemical Sensors for Organs-on-a-Chip
US10919036B2 (en) Flow cells utilizing surface-attached structures, and related systems and methods
Verma et al. An introduction to microfluidics and their applications
WO2017123855A1 (en) Microfluidic sample devices and uses thereof

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant