KR101979834B1 - 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석장치 및 이의 분석방법 - Google Patents

미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석장치 및 이의 분석방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석장치 및 이의 분석방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 극미량의 병원균을 효율적으로 검출하기 위한 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석장치 및 이의 분석방법에 관한 것이다. 본 발명의 구성은 시료 및 검출대상균을 배출하는 캡슐부; 및 상기 캡슐부로부터 배출된 상기 검출대상균 내 다중유전자를 증폭하고, 증폭된 상기 다중유전자를 검출하는 증폭검출부를 포함하며, 상기 캡슐부는 상기 시료를 미세방울 형태로 배출하며, 상기 미세방울 중 일부에는 상기 검출대상균이 수용된 상태인 것을 특징으로 하는 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석장치를 제공한다.

Description

미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석장치 및 이의 분석방법{GENE DIGITAL SIGNAL ANALYZING APPARATUS USING MICROFLUIDIC DEVICE AND ANALYSIS METHOD THEREOF}
본 발명은 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석장치 및 이의 분석방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 극미량의 병원균을 효율적으로 검출하기 위한 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석장치 및 이의 분석방법에 관한 것이다.
박테리아, 병원균 감염에 의해 매년 수많은 사상자와 비용이 발생하고 있다. 이에 따라, 병원균 및 박테리아 등을 신속하고 정확하게 검출하여 분석하기 위한 다양한 분석방법의 개발이 이루어지고 있다.
구체적으로, 미생물 분석방법 중 하나인 미생물 배양법은, 미생물을 증식이 이루어질 수 있는 환경에 일정 시간동안 배양시킨 다음 현미경 분석이나 염색법을 이용하여 미생물의 종류 등을 분석하는 방법이다. 그러나, 이러한 미생물 배양법은 미생물을 증식할 수 있는 환경을 조성하고, 복잡한 실험 단계를 거쳐야만 하기 때문에 기술의 숙련이 필요하며, 미생물을 분석하기 위해 많은 시간이 소요되는 문제점이 있다.
또한, 미생물의 면역반응법은, 병원체가 증식하는 곳에서 생산되는 각종의 특이항원이나 단독독소 혹은 효소 등을 검출하는 방법으로서, 미량의 병원체에 대해서 적용이 가능한 장점이 있다. 그러나, 이러한 면역반응법은 항원이 되는 미생물 그 자체를 확인하는 것이 아니라， 그 존재를 반영하는 항체가를 보기 때문에 항체가가 상승하기까지의 시간적 차이로 인해 병원체의 존재시기를 반영할 수 없는 결점이 있다.
또한, ATP(Adensine triphonsphate)방법은, 생명체의 물질대사시 발생되는 빛을 측정하는 방법이다. 그러나, ATP 방법은 세균을 직접 측정하는 기기가 아니기 때문에 ATP측정 수치가 미생물 수에 정비례하지 않아 정확한 미생물 수 검출이 어려운 문제가 있다.
또한, 최근에는 중합효소연쇄반응(PCR) 기반의 기술을 이용하여 병원균을 배양하고, 유전자를 추출한 후 아가로스 겔(Agaros gel) 전기 영동법을 이용하여 유전자 증폭 여부를 분석하는 방법이 주로 사용되고 있다.
그러나, 이러한 아가로스 겔 전기 영동법은 병원균의 농도가 낮을 경우 육안으로 검사를 진행하여 실제 낮은 농도의 병원균 존재 유무 판독에 제한이 있는 문제가 있다.
구체적으로, 용액 대비 병원균의 농도가103 cells 이하일 때와 같이 병원균의 농도가 극미량인 경우, 병원균이 증폭되더라도 병원균이 분산되기 때문에 검출을 위한 신호가 매우 약해진다. 따라서, 병원균이 극미량인 경우, 정확하고 신속하게 병원균의 존재여무를 검출하기 어렵다는 문제가 있다.
또한, 종래의 아가로스 겔 전기 영동법을 이용한 분석방법은 병원균을 정량적으로 검출하기도 어렵다는 한계가 있다.
따라서, 보다 신속하고 효율적으로 병원균을 검출할 수 있고, 병원균을 정량적으로 검출할 수 있는 방법이 필요하다.
한국등록특허 제10-2005-0088476호
상기와 같은 문제를 해결하기 위한 본 발명의 목적은 극미량의 병원균을 효율적으로 검출하기 위한 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석장치 및 이의 분석방법을 제공하는 것이다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 기술적 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 구성은 시료 및 검출대상균을 배출하는 캡슐부; 및 상기 캡슐부로부터 배출된 상기 검출대상균 내 다중유전자를 증폭하고, 증폭된 상기 다중유전자를 검출하는 증폭검출부를 포함하며, 상기 캡슐부는 상기 시료를 미세방울 형태로 배출하며, 상기 미세방울 중 일부에는 상기 검출대상균이 2종 이상이 수용된 상태인 것을 특징으로 하는 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석장치를 제공한다.
본 발명의 실시예에 있어서, 상기 캡슐부는, 상기 시료 및 상기 검출대상균이 수용되는 시료저장유닛; 상기 시료저장유닛의 일단에 마련되며, 상기 시료저장유닛에 비해 상대적으로 단면적이 작게 형성된 미세방울형성유닛; 상기 미세방울형성유닛의 일측 또는 양측에 마련되며, 상기 미세방울형성유닛에 오일을 배출하는 오일배출유닛; 및 상기 미세방울형성유닛을 통과한 상기 미세방울을 상기 증폭검출부로 이송하는 미세방울이송유닛을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 실시예에 있어서, 상기 시료 및 상기 오일은 서로 다른 유속으로 상기 미세방울형성유닛을 향해 배출됨으로써, 상기 시료는 상기 미세방울형성유닛을 통과할 때 각각 독립적인 미세방울 형태를 이루는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 실시예에 있어서, 상기 시료의 유속은 0.8 내지 5 μm/min이고, 상기 오일의 유속은 8 내지 20 μm/min인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 실시예에 있어서, 상기 증폭검출부는, 상기 미세방울 내 검출대상균을 용해하여 다중유전자를 추출하고, 추출된 상기 다중유전자에 대하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하여 상기 다중유전자를 증폭시키는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 구성은 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석장치의 분석방법에 있어서, a) 상기 시료를 미세방울 형태로 배출하는 단계; b) 상기 미세방울 내 검출대상균을 용해하여 상기 다중유전자를 추출하고 추출된 상기 다중유전자를 증폭하는 단계; c) 상기 증폭된 다중유전자를 검출하는 단계를 포함하며, 상기 a) 단계에서, 상기 미세방울 중 일부에는 상기 검출대상균이 수용된 상태인 것을 특징으로 하는 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석방법을 제공한다.
본 발명의 실시예에 있어서, 상기 a) 단계는, 상기 시료의 유속은 0.8 내지 5 μm/min 이고, 상기 오일의 유속은 8 내지 20 μm/min 인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 실시예에 있어서, 상기 b) 단계는, b1) 상기 검출대상균이 용해되어 상기 다중유전자가 추출되고, 상기 다중유전자가 변성되는 단계; b2) 변성된 상기 다중유전자가 한 쌍으로 분리되고, 분리된 한 쌍의 분리유전자에 형광물질이 결합되는 단계; b3) 형광물질이 결합된 각각의 상기 분리유전자가 두가닥복원(annealing)에 의해 각각 다중유전자로 복원되어 증폭되는 단계를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 실시예에 있어서, 상기 b1) 단계에서, 상기 증폭검출부는, 상기 미세방울을 90 내지 100℃에서 15분 내지 25분간 가열하여 상기 미세방울 내 검출대상균을 용해하고, 상기 다중유전자를 변성시키는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 실시예에 있어서, 상기 b2) 단계에서, 상기 증폭검출부는, 상기 미세방울을 90 내지 100℃에서 25 내지 35 초, 60 내지 68℃에서 55초 내지 65초씩 총40회 반복 가열하여 상기 변성된 상기 다중유전자를 한 쌍으로 분리시키고, 분리된 한 쌍의 분리유전자에 형광물질을 결합시키는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 실시예에 있어서, 상기 b3) 단계에서, 상기 증폭검출부는, 상기 미세방울을 90 내지 100℃에서 290초 내지 310초간 가열하여 상기 분리유전자의 두가닥복원을 수행함으로써, 상기 다중유전자를 증폭시키는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 실시예에 있어서, 상기 a) 단계에서, 상기 시료에는 상기 검출대상균 내 다중유전자와 결합되는 형광물질이 포함된 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 실시예에 있어서, 상기 a) 단계에서, 상기 형광물질의 종류는 상기 다중유전자의 종류와 일대일 대응되도록 상기 시료에 포함되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 실시예에 있어서, 상기 a) 단계에서, 상기 검출대상균은 복수로 마련되며, 상기 형광물질을 서로 다른 형광색을 띄도록 마련되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 실시예에 있어서, 상기 c) 단계는, 상기 형광 현미경을 이용하여 상기 미세방울 내 다중유전자를 검출하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 구성은 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석장치를 적용한 다중유전자 검출기를 제공한다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 구성은 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석장치의 분석방법을 적용한 다중유전자 검출기를 제공한다.
상기와 같은 구성에 따르는 본 발명의 효과는, 용액 대비 병원균의 농도가 103 cells이하일 때에도 병원균의 존재 유무를 검출할 수 있다. 구체적으로, 종래의 PCR 방법으로는 살모넬라, 대장균과 같은 병원균의 농도가 용액 대비 103 cells 이하일 때에는 검출이 불가능한 한계가 있었다. 그러나, 본 발명에 따르면, 살모넬라, 대장균과 같은 병원균의 농도가 용액 대비 103 cells이하의 극미량일 때에도 병원균의 존재 유무를 신속하고 정확하게 검출할 수 있다.
또한, 본 발명에 따르면, 병원균을 용이하게 정량적으로 파악할 수 있다.
또한, 본 발명에 따르면, 서로 다른 종류의 유전자에 대응되도록 발색 시약을 결합시키고, 유전자가 포함된 시료를 미세방울 형태로 배출하도록 이루어짐으로써, 각 미세방울의 색상변화를 별도로 판별할 수 있으므로, 여러 종류의 유전자를 동시에 정량적으로 검출할 수 있다.
본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 특허청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석을 위한 미세방울형성장치를 나타낸 사시도이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 미세방울형성유닛을 통과하는 시료를 시간순으로 나타낸 예시도이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석장치의 예시도이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석장치의 분석방법의 순서도이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따른 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석장치의 분석방법의 증폭하는 단계를 구체화한 순서도이다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 증폭하는 단계를 나타낸 예시도이다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따른 복수의 검출대상균을 분석하기 위한 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석장치의 예시도이다.
도 8은 본 발명의 일실시예에 따른 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석장치 및 분석방법의 결과와 종래예를 대비한 예시도이다.
도 9는 본 발명의 일실시예에 따른 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석장치 및 분석방법의 검출결과를 겔 전기 영동법으로 나타낸 예시도이다.
도 10은 본 발명의 일실시예에 따른 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석장치 및 분석방법의 개별 형광신호검출결과를 형광 현미경을 이용하여 나타낸 예시도이다.
도 11은 본 발명의 일실시예에 따른 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석장치 및 분석방법의 개별형광신호 및 복합형광신호 검출결과를 형광 현미경을 이용하여 나타낸 예시도이다.
이하에서는 첨부한 도면을 참조하여 본 발명을 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 따라서 여기에서 설명하는 실시예로 한정되는 것은 아니다. 그리고 도면에서 본 발명을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.
명세서 전체에서, 어떤 부분이 다른 부분과 "연결(접속, 접촉, 결합)"되어 있다고 할 때, 이는 "직접적으로 연결"되어 있는 경우뿐 아니라, 그 중간에 다른 부재를 사이에 두고 "간접적으로 연결"되어 있는 경우도 포함한다. 또한 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 구비할 수 있다는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
이하 첨부된 도면을 참고하여 본 발명의 실시예를 상세히 설명하기로 한다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석장치의 캡슐부를 나타낸 사시도이고, 도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 미세방울형성유닛을 통과하는 시료를 시간순으로 나타낸 예시도이며, 도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석장치의 예시도이다.
도 1 내지 도 3에 도시된 바와 같이, 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석장치(100)는 캡슐부(110) 및 증폭검출부(120)를 포함한다.
상기 캡슐부(110)는 시료 및 검출대상균(10)을 배출하며, 시료저장유닛(111), 미세방울형성유닛(112), 오일배출유닛(113) 및 미세방울이송유닛(114)를 포함한다.
상기 시료저장유닛(111)은 상기 시료 및 상기 검출대상균(10)을 수용하도록 마련될 수 있다. 여기서, 상기 시료저장유닛(111)에 수용된 상기 검출대상균(10)은 살모넬라균(Salmonella), 대장균 E. coli O157:H7을 포함한 병원균을 지칭할 수 있다.
또한, 상기 시료는 중합효소연쇄반응(PCR)을 위한 PCR시약을 포함하며, 일 예로, 아가로스 겔 전기 영동법을 이용하여 상기 검출대상균(10) 내 유전자(20)를 검출하고자 할 경우, 상기 시료는 아가로스 겔(Agarose gel)일 수 있다. 형광 현미경을 이용하여 상기 검출대상균(10) 내 유전자(20)를 검출하고자 할 경우에는 상기 시료가 아가로스 겔로 한정되지 않으며, PCR시약을 모두 포함할 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 PCR 시약에는 상기 검출대상균(10)과 대응되는 순방향 및 역방향 프라이머가 포함될 수 있다. 일 예로, 상기 검출대상균(10)이 대장균 E. coli O157:H7인 경우, 순방향 프라이머는 5'-GAC CCG GCA CAA GCA TAA GC-3'이고 역방향 프라이머는 384 bp 단편을 증폭하는 5'-CCA CCT GCA GCA ACA AGA GG-3'일 수 있다. 상기 검출대상균(10)이 살모넬라균인 경우, 순방향 프라이머는 5'-AAA ACA TAT GCT GGA CCA ACT GGA AGC-3 '이고, 역방향 프라이머는 113bp 단편을 증폭하는 5'-GTT CGC TTA ACA AAC GCT GCA AAA CTT-3'일 수 있다.
상기 시료에는 상기 검출대상균(10) 내 다중유전자(20)와 결합되는 형광물질(F)이 더 포함될 수 있다. 그리고, 상기 형광물질(F)의 종류는 상기 다중유전자(20)의 종류와 일대일 대응되도록 상기 시료에 포함될 수 있다.
일 예로, 상기 검출대상균(10)이 살모넬라균 하나인 경우, 상기 시료에는 상기 살모넬라균의 다중유전자(20)와 결합될 수 있는 하나의 형광물질(F)만 포함될 수 있다. 그러나, 상기 검출대상균(10)이 살모넬라균 및 대장균 E. coli O157:H인 경우, 상기 시료에는 살모넬라균 및 대장균 E. coli O157:H7 각각의 다중유전자(20)와 결합될 수 있도록 두 개의 형광물질(F)이 포함될 수 있다. 이때, 복수의 종류로 마련된 상기 형광물질(F)은 서로 다른 색을 갖도록 마련될 수 있다.
상기 미세방울형성유닛(112)은 상기 시료저장유닛(111)의 일단에 마련되며, 상기 시료저장유닛(111)에 비해 상대적으로 단면적이 작게 형성될 수 있다. 구체적으로, 상기 미세방울형성유닛(112)은 상기 시료저장유닛(111)의 일단으로부터 연장되어 형성되되, 점차 단면적이 작아지도록 형성될 수 있다.
상기 오일배출유닛(113)은 상기 미세방울형성유닛(112)의 일측 또는 양측에 마련되며, 상기 미세방울형성유닛(112)에 오일을 배출하도록 마련될 수 있다.
상기 미세방울이송유닛(114)은 상기 미세방울형성유닛(112)을 통과하면서 형성된 상기 미세방울(D)을 상기 증폭검출부(120)로 이송할 수 있다.
상기 시료 및 상기 오일은 서로 다른 유속으로 상기 미세방울형성유닛(112)을 향해 배출됨으로써, 도 2에 도시된 것처럼, 상기 시료는 상기 미세방울형성유닛(112)을 통과할 때 각각 독립적인 미세방울 형태를 이룰 수 있다.
그리고, 도 3에 도시된 것처럼, 상기 미세방울(D) 중 일부에는 상기 시료에 포함되어 있던 상기 검출대상균(10)이 수용될 수 있다. 즉, 상기 검출대상균(10)이 많을수록 더 많은 미세방울(D)에 검출대상균(10)이 수용될 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 미세방울(D)은 50 내지 200 μm의 평균 직경을 갖도록 마련됨이 바람직하며, 이를 위해, 상기 미세방울형성유닛(112)으로 배출되는 상기 시료의 유속은 0.8 내지 5μm/min이고, 상기 오일의 유속은 8 내지 20μm/min일 수 있다.
상기 시료와 상기 오일의 유속이 상기 범위를 벗어날 경우, 상기 미세방울(D)의 평균 직경은 50 내지 200μm를 만족하지 못하며, 중합효소연쇄반응(PCR)이 활발히 이루어지지 못해 정확한 다중유전자(20) 검출이 이루어지지 못할 수 있다.
그리고, 상기 미세방울(D)의 평균 직경이 상술한 범위를 초과할 경우, 각 미세방울(D)에 상기 검출대상균(10)이 복수개가 포함되어 다중유전자(20)를 정량적으로 정확하게 검출하기 어려울 수 있으며, 평균 직경이 상술한 범위 미만일 경우, 각 미세방울(D)이 상기 검출대상균(10)보다 작아, 상기 검출대상균(10)의 검출이 이루어지지 않을 수도 있다.
상기 증폭검출부(120)는 상기 캡슐부(110)로부터 배출된 상기 검출대상균(10) 내 다중유전자(20)를 증폭하고, 증폭된 상기 다중유전자(20)를 검출할 수 있다.
구체적으로, 상기 증폭검출부(120)는, 상기 미세방울(D) 내 검출대상균(10)을 용해하여 다중유전자(20)를 추출하고, 추출된 상기 다중유전자(20)에 대하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하여 상기 다중유전자(20)를 증폭시킬 수 있다.
그리고, 상기 증폭검출부(120)는 증폭된 상기 다중유전자(20)를 겔 전기 영동 분석법 또는 형광 현미경을 통하여 검출할 수 있다.
이하, 상술하나 바와 같이 마련된 상기 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석장치(100)의 분석방법을 설명하도록 한다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석장치의 분석방법의 순서도이다.
도 4에 도시된 것처럼, 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석장치의 분석방법은 상기 시료를 미세방울 형태로 배출하는 단계(S110), 상기 미세방울 내 검출대상균을 용해하여 상기 다중유전자를 추출하고 추출된 상기 다중유전자를 증폭하는 단계(S120) 및 상기 증폭된 다중유전자를 검출하는 단계(S130)를 포함한다.
상기 시료를 미세방울 형태로 배출하는 단계(S110)에서, 상기 시료는 중합효소연쇄반응(PCR)을 위한 PCR시약을 포함하며, 일 예로, 아가로스 겔 전기 영동법을 이용하여 상기 검출대상균(10) 내 유전자(20)를 검출하고자 할 경우, 상기 시료는 아가로스 겔(Agarose gel)일 수 있다. 형광 현미경을 이용하여 상기 검출대상균(10) 내 유전자(20)를 검출하고자 할 경우에는 상기 시료가 아가로스 겔로 한정되지 않으며, PCR시약을 모두 포함할 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 PCR 시약에는 상기 검출대상균(10)과 대응되는 순방향 및 역방향 프라이머가 포함될 수 있다. 일 예로, 상기 검출대상균(10)이 대장균 E. coli O157:H인 경우, 순방향 프라이머는 5'-GAC CCG GCA CAA GCA TAA GC-3'이고 역방향 프라이머는 384 bp 단편을 증폭하는 5'-CCA CCT GCA GCA ACA AGA GG-3일 수 있다. 상기 검출대상균(10)이 살모넬라균인 경우, 순방향 프라이머는 5'-AAA ACA TAT GCT GGA CCA ACT GGA AGC-3 '이고, 역방향 프라이머는 113bp 단편을 증폭하는 5'-GTT CGC TTA ACA AAC GCT GCA AAA CTT-3'일 수 있다.
상기 시료에는 상기 검출대상균(10) 내 다중유전자(20)와 결합되는 형광물질(F)이 더 포함될 수 있다. 그리고, 상기 형광물질(F)의 종류는 상기 다중유전자(20)의 종류와 일대일 대응되도록 상기 시료에 포함될 수 있다.
상기 시료를 미세방울 형태로 배출하는 단계(S110)에서, 상기 캡슐부(110)는 상기 시료를 미세방울(D)형태로 상기 증폭검출부(120)를 향해 배출할 수 있다. 여기서, 미세방울(D)을 형성하기 위해 상기 미세방울형성유닛(112)으로 배출되는 상기 시료의 유속은 0.8 내지 5μm/min이고, 상기 오일의 유속은 8 내지 20μm/min일 수 있다.
상기와 같이, 상기 시료 및 상기 오일은 서로 다른 유속으로 상기 미세방울형성유닛(112)을 향해 배출됨으로써, 상기 시료는 상기 미세방울형성유닛(112)을 통과할 때 각각 독립적인 미세방울 형태를 이룰 수 있다.
그리고, 상기 미세방울(D) 중 일부에는 상기 시료에 포함되어 있던 상기 검출대상균(10)이 수용될 수 있다. 즉, 상기 검출대상균(10)이 많을수록 더 많은 미세방울(D)에 검출대상균(10)이 수용될 수 있다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따른 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석장치의 분석방법의 증폭하는 단계를 구체화한 순서도이고, 도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 증폭하는 단계를 나타낸 예시도이다.
상기 미세방울 내 검출대상균을 용해하여 상기 다중유전자를 추출하고 추출된 상기 다중유전자를 증폭하는 단계(S120)는 상기 검출대상균이 용해되어 상기 다중유전자가 추출되고, 상기 다중유전자가 변성되는 단계(S121), 변성된 상기 다중유전자가 한 쌍으로 분리되고, 분리된 한 쌍의 분리유전자에 형광물질이 결합되는 단계(S122) 및 형광물질이 결합된 각각의 상기 분리유전자가 두가닥복원(annealing)에 의해 각각 다중유전자로 복원되어 증폭되는 단계(S123)를 포함한다.
상기 검출대상균이 용해되어 상기 다중유전자가 추출되고, 상기 다중유전자가 변성되는 단계(S121)에서, 상기 증폭검출부(120)는, 상기 미세방울(D)을 90 내지 100℃에서 15분 내지 25분간 가열하여 상기 미세방울 내 검출대상균(10)을 용해하여 상기 다중유전자(20)를 추출할 수 있다.
그리고, 도 6의 (a), (b)에 도시된 것처럼, 추출된 상기 다중유전자(20)는 열에 의해 변성되며, 변성된 상기 다중유전자(20)의 내부로 상기 시료에 포함되있던 형광물질(F)이 침투할 수 있다.
변성된 상기 다중유전자가 한 쌍으로 분리되고, 분리된 한 쌍의 분리유전자에 형광물질이 결합되는 단계(S122)에서, 상기 증폭검출부(120)는, 상기 미세방울을 90 내지 100℃에서 25 내지 35 초, 60 내지 68℃에서 55초 내지 65초씩 총40회 반복 가열하여 상기 변성된 상기 다중유전자(20)를 한 쌍으로 분리시킬 수 있다. 그리고, 분리된 한 쌍의 분리유전자(30)에는 도 6의 (b) 및 (c)에 도시된 것처럼 상기 형광물질(F)이 결합될 수 있다.
형광물질이 결합된 각각의 상기 분리유전자가 두가닥복원(annealing)에 의해 각각 다중유전자로 복원되어 증폭되는 단계(S123)에서, 상기 증폭검출부(120)는, 도 6의 (c) 및 (d)에 도시된 것처럼, 상기 미세방울(D)을 90 내지 100℃에서 290초 내지 310초간 가열하여 상기 분리유전자(30)의 두가닥복원을 수행함으로써, 상기 다중유전자(20)를 증폭시킬 수 있다.
상기 증폭된 다중유전자를 검출하는 단계(S130)에서는 상기 미세방울(D) 내 상기 다중유전자(20)를 검출할 수 있다.
구체적으로, 상기 시료에 아가로스 겔이 포함된 경우, 상기 증폭된 다중유전자를 검출하는 단계(S130)에서, 상기 다중유전자(20)는 아가로스 겔 전기 영동 분석법에 의해 검출이 이루어질 수 있다.
상기 시료에 형광물질이 포함된 경우, 상기 증폭된 다중유전자를 검출하는 단계(S130)에서, 도 3에 도시된 것처럼, 상기 다중유전자(20)는 형광 현미경을 이용하여 검출이 이루어질 수 있다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따른 복수의 검출대상균을 분석하기 위한 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석장치의 예시도이다.
도 7에 도시된 것처럼, 상기 시료에 복수의 종류의 검출대상균(10)이 포함된 경우, 상기 다중유전자(20)의 종류와 대응되는 종류의 형광물질(F)이 시료에 포함되어 상기 다중유전자(20)의 종류에 따른 형광물질이 검출될 수 있다. 즉, 본 발명에 따르면, 여러 종류의 검출대상균(10)의 존재 유무를 동시에 검출하는 것이 가능하다.
도 8 은 본 발명의 일실시예에 따른 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석장치 및 분석방법의 결과와 종래예를 대비한 예시도이다. 도 8의 (a)는 종래예에 따른 중합효소연쇄반응을 통한 다중유전자 분석방법 결과를 나타낸 예시도이고, 도 8의 (b)는 일실시예에 따른 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석장치 및 분석방법의 결과를 나타낸 예시도이다.
도 8의 (a)에 도시된 것처럼, 종래예에 따른 중합효소연쇄반응은 용액 대비 병원균의 농도가103 cells 이하일 때는 증폭이 이루어지지 않아 병원균의 검출이 이루어지지 못했다.
또한, 종래예에 따른 병원균 검출 방법은, 극미량의 병원균에 대해서 검출이 불가능할 뿐만 아니라, 병원균이 극미량이 아닐 때에도, 동시에 여러 종류의 병원균을 신속하고 정확하게 검출하기 어려웠다.
구체적으로, 증폭된 병원균이 포함된 시료에 형광물질을 넣은 후에 이를 분석할 경우, 각 병원균이 서로 무질서하게 섞여 있기 때문에 각 병원균에 결합된 형광색이 뚜렷하게 구분되지 않았다. 일 예로, 병원균 A 및 병원균B와 결합되는 각각의 형광물질이 빨간색과 노란색인 경우, 병원균 A와 B가 섞여서 위치한 부분은 빨간색과 노란색이 검출되지 않고 주황색이 검출될 수 있다. 또한, 병원균 A와 병원균 B가 섞여있는 비율에 따라 주황색의 명도도 달라지게 된다.
즉, 종래의 병원균 검출 방법은, 서로 다른 종류의 병원균이 각각 분리되어 위치하지 않고 섞여있는 상태에서 검출이 이루어지도록 마련되기 때문에 각 병원균을 정량적으로 신속하게 분석하기 어려웠다.
반면에, 도 8의 (b)에 도시된 것처럼, 본 발명에 따르면 각 미세방울(D)에 상기 검출대상균(10)을 수용시키고, 각 미세방울(D) 내에서 상기 검출대상균(10) 내 상기 다중유전자(20)의 증폭을 수행함으로써, 신속한 증폭이 이루어질 수 있다. 그리고, 특히, 특정 영역에 증폭된 다중유전자(20)가 밀집하여 위치하기 때문에 상기 다중유전자(20)의 위치에 따른 신호가 증폭되어 겔 전기 영동법 또는 형광 현미경을 이용한 분석시 다중유전자(20)의 검출이 용이하다.
또한, 본 발명에 따르면, 상기 다중유전자(20)의 종류와 대응되는 종류의 형광물질(F)이 시료에 포함될 경우, 상기 다중유전자(20)의 종류에 따른 형광물질이 검출될 수 있음을 알 수 있다. 그리고, 복수의 종류가 동시에 미세방울(D) 내에 존재할 경우에도, 이에 대응되는 색으로 형광색이 나타나기 때문에 복수의 다중유전자(20)를 검출하기 용이하다.
이처럼, 본 발명에 따르면, 상기 미세방울(D)에 각 검출대상균(10)이 수용되기 때문에 미세방울(D) 수에 따른 검출대상균(10)의 정량적 검출이 가능하며, 여러 종류의 검출대상균(10)이 포함된 경우에도 정량적 검출이 가능하다.
도 9는 본 발명의 일실시예에 따른 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석장치 및 분석방법의 검출결과를 겔 전기 영동법으로 나타낸 예시도이다.
도 9의 (a)는 종래의 방법으로 증폭을 수행한 대장균 E. coli O157:H7의 겔 전기 영동법 결과이고, 도 9의 (b)는 일실시예에 따른 방법으로 증폭을 수행한 대장균 E. coli O157:H7의 겔 전기 영동법 결과를 나타낸 것이다.
도 9의 (c)는 종래의 방법으로 증폭을 수행한 살모넬라균의 겔 전기 영동법 결과이고, 도 9의 (d)는 일실시예에 따른 방법으로 증폭을 수행한 살모넬라균의 겔 전기 영동법 결과를 나타낸 것이다.
도 9에 도시된 것처럼, 종래의 방법에 비해 본 발명에 따른 방법이 신호가 더 강함을 확인할 수 있다.
도 10 은 본 발명의 일실시예에 따른 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석장치 및 분석방법의 개별 형광신호검출결과를 형광 현미경을 이용하여 나타낸 예시도이다.
구체적으로, 도 10의 (a)는 E. coli O157:H7의 형광신호검출 결과를 나타낸 것이고, 도 10의 (b)는 살모넬라균의 형광신호검출 결과를 나타낸 것이다.
도 10에 도시된 것처럼, 본 발명에 따르면 상기 다중유전자(20)가 특정 위치에 밀집되어 신호를 발산하기 때문에 다중유전자(20)가 흩어져 있을 때는 검출되지 않는 형광신호도 분명하게 검출할 수 있다. 즉, 본 발명에 따르면 보다 신속하고 정확하게 검출대상균(10)의 존재 유무를 분석할 수 있다.
또한, 본 발명에 따르면, 각 미세방울(D)에 각 검출대상균(10)이 위치하기 때문에 형광신호가 나타나는 각 미세방울(D)의 숫자를 헤아림으로써, 정량적으로 검출대상균(10)의 숫자를 파악할 수 있다. 즉, 검출대상균(10)의 양에 따른 균 감염 위험도를 보다 정확하게 파악할 수 있다.
도 11은 본 발명의 일실시예에 따른 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석장치 및 분석방법의 개별형광신호 및 복합형광신호 검출결과를 형광 현미경을 이용하여 나타낸 예시도이다
도 11의 (a) 는 E. coli O157:H7의 형광신호를 검출한 것이고, 도 11의 (b)는 살모넬라균의 형광신호를 검출한 것이며, 도 11의 (c)는 E. coli O157:H7과 살모넬라균이 혼합된 상태의 시료에 대한 형광신호를 검출한 것이다.
도 11의 (c)에 도시된 것처럼, 본 발명에 따르면, 여러 종류의 검출대상균이 혼합된 경우에도 개별적으로 존재할 때의 형광색과, 복수의 검출대상균이 동일 미세방울내에 존재할 때의 형광색이 다르기 때문에 정확하게 정량적으로 검출대상균을 검출할 수 있다.
전술한 바와 같이 마련된 본 발명은 다중유전자 검출기에 적용될 수 있다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
100: 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석장치
110: 캡슐부
111: 시료저장유닛
112: 미세방울형성유닛
113: 오일배출유닛
114: 미세방울이송유닛
120: 증폭검출부
10: 검출대상균
20: 다중유전자
30: 분리유전자

Claims (17)

  1. 시료 및 검출대상균을 배출하는 캡슐부; 및
    상기 캡슐부로부터 배출된 상기 검출대상균 내 다중유전자를 증폭하고, 증폭된 상기 다중유전자를 검출하는 증폭검출부를 포함하며,
    상기 캡슐부는 상기 시료를 미세방울 형태로 배출하며, 상기 미세방울 중 일부에는 상기 검출대상균이 수용된 상태인 것을 특징으로 하고,
    상기 캡슐부는,
    상기 시료 및 상기 검출대상균이 수용되는 시료저장유닛;
    상기 시료저장유닛의 일단에 마련되며, 상기 시료저장유닛에 비해 상대적으로 단면적이 작게 형성된 미세방울형성유닛;
    상기 미세방울형성유닛의 일측 또는 양측에 마련되며, 상기 미세방울형성유닛에 오일을 배출하는 오일배출유닛; 및
    상기 미세방울형성유닛을 통과한 상기 미세방울을 상기 증폭검출부로 이송하는 미세방울이송유닛을 포함하며,
    각각의 상기 미세방울의 내부에 단일개의 검출대상균이 수용되도록 하기 위해, 상기 시료의 유속은 0.8 내지 5μm/min, 상기 오일의 유속은 8 내지 20μm/min로 제어됨으로써, 상기 미세방울의 평균직경이 50 내지 200 μm를 만족하도록 마련되며,
    상기 형광물질은 상기 검출대상균 내 다중유전자의 종류와 일대일 대응되어 결합되도록 마련되고, 서로 다른 종류의 다중유전자와 대응되는 서로 다른 종류의 형광물질은 서로 다른 색이 발현되도록 마련됨으로써, 서로 다른 종류의 다중유전자를 서로 다른 미세방울에서 각각 검출하거나 또는, 하나의 미세방울에서 혼합된 다중유전자를 동시에 검출 가능하도록 이루어진 것을 특징으로 하는 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석장치.
  2. 삭제
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 시료 및 상기 오일은 서로 다른 유속으로 상기 미세방울형성유닛을 향해 배출됨으로써, 상기 시료는 상기 미세방울형성유닛을 통과할 때 각각 독립적인 미세방울 형태를 이루는 것을 특징으로 하는 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석장치.
  4. 삭제
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 증폭검출부는,
    상기 미세방울 내 검출대상균을 용해하여 다중유전자를 추출하고, 추출된 상기 다중유전자에 대하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하여 상기 다중유전자를 증폭시키는 것을 특징으로 하는 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석장치.
  6. 제 1 항에 따른 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석장치의 분석방법에 있어서,
    a) 상기 시료를 미세방울 형태로 배출하는 단계;
    b) 상기 미세방울 내 검출대상균을 용해하여 상기 다중유전자를 추출하고 추출된 상기 다중유전자를 증폭하는 단계; 및
    c) 상기 증폭된 다중유전자를 검출하는 단계를 포함하며,
    상기 a) 단계에서,
    상기 미세방울 중 일부에는 상기 검출대상균이 수용된 상태인 것을 특징으로 하는 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석방법.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 a) 단계에서,
    상기 시료의 유속은 0.8 내지 5μm/min이고, 상기 시료와 함께 배출되는 오일의 유속은 8 내지 20μm/min인 것을 특징으로 하는 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석방법.
  8. 제 6 항에 있어서,
    상기 b) 단계는,
    b1) 상기 검출대상균이 용해되어 상기 다중유전자가 추출되고, 상기 다중유전자가 변성되는 단계;
    b2) 변성된 상기 다중유전자가 한 쌍으로 분리되고, 분리된 한 쌍의 분리유전자에 형광물질이 결합되는 단계;
    b3) 형광물질이 결합된 각각의 상기 분리유전자가 두가닥복원(annealing)에 의해 각각 다중유전자로 복원되어 증폭되는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석방법.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 b1) 단계에서,
    상기 증폭검출부는, 상기 미세방울을 90 내지 100℃에서 15분 내지 25분간 가열하여 상기 미세방울 내 검출대상균을 용해하고, 상기 다중유전자를 변성시키는 것을 특징으로 하는 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석방법.
  10. 제 8 항에 있어서,
    상기 b2) 단계에서,
    상기 증폭검출부는, 상기 미세방울을 90 내지 100℃에서 25 내지 35 초, 60 내지 68℃에서 55초 내지 65초씩 총40회 반복 가열하여 상기 변성된 상기 다중유전자를 한 쌍으로 분리시키고, 분리된 한 쌍의 분리유전자에 형광물질을 결합시키는 것을 특징으로 하는 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석방법.
  11. 제 8 항에 있어서,
    상기 b3) 단계에서,
    상기 증폭검출부는, 상기 미세방울을 90 내지 100℃에서 290초 내지 310초간 가열하여 상기 분리유전자의 두가닥복원을 수행함으로써, 상기 다중유전자를 증폭시키는 것을 특징으로 하는 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석방법.
  12. 제 6 항에 있어서,
    상기 a) 단계에서,
    상기 시료에는 상기 검출대상균 내 다중유전자와 결합되는 형광물질이 포함된 것을 특징으로 하는 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석방법.
  13. 제 12 항에 있어서,
    상기 a) 단계에서, 상기 형광물질의 종류는 상기 다중유전자의 종류와 일대일 대응되도록 상기 시료에 포함되는 것을 특징으로 하는 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석방법.
  14. 제 13 항에 있어서,
    상기 a) 단계에서,
    상기 검출대상균은 복수로 마련되며, 상기 형광물질을 서로 다른 형광색을 띄도록 마련되는 것을 특징으로 하는 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석방법.
  15. 제 12 항에 있어서,
    상기 c) 단계는,
    상기 형광 현미경을 이용하여 상기 미세방울 내 다중유전자를 검출하는 것을 특징으로 하는 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석방법.
  16. 제 1 항에 따른 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석장치를 적용한 다중유전자 검출기.
  17. 제 6 항에 따른 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석방법을 적용한 다중유전자 검출기.
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