KR20070115966A - 유기체의 게놈 ｄｎａ를 확인하기 위한 장치 및 방법 - Google Patents

유기체의 게놈 ｄｎａ를 확인하기 위한 장치 및 방법 Download PDF

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KR20070115966A
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Abstract

본 발명은 샘플 중의 유기체를 신속하게 검출 및/또는 분류하기 위해 유기체로부터 게놈 물질을 제조, 증폭, 검출 및/또는 추가 분석용으로 임의 선별하는 [예를 들어, 유기체의 게놈 물질을 스크리닝, 확인, 정량화, 및/또는 임의로 추가 분석 (예: 서열 분석)하는] 방법에 사용될 수 있는 기구를 제공한다. 본 발명은 추가로, 예를 들어 DNA 증폭의 파형 프로파일링 방법에 개선 사용하기 위한 신규한 SGP 프라이머와 병용해서, 상기 기구를 사용하는 방법을 제공한다. 본 발명의 목적은 게놈 물질을 완전히 자동화 분석하기 위한 기구, 및 사회에 이로운, 상기 기구를 사용하는 다중법을 제공하는 것인데, 예를 들어 오염성 유기체의 존재에 대한 공급원을 모니터링하는 것과 관련해서 게놈 물질을 스크리닝, 확인, 정량화, 및/또는 추가 분석 (예: 서열 분석)용으로 선별하는 방법에 상기 기구를 사용할 수 있다.
개선된 파형 프로파일링 방법, 단일 게놈 프로파일링 (SGP), 미소유체 장치, 자동화 인라인 플랫폼

Description

유기체의 게놈 ＤＮＡ를 확인하기 위한 장치 및 방법 {DEVICES AND METHODS FOR IDENTIFYING GENOMIC DNA OF ORGANISMS}
관련 출원
본원은 2005년 2월 18일자로 출원된 미국 가특허원 제60/653,978호 (그의 전문이 본원에 참고로 도입된다)를 우선권으로 청구하고 있다.
본 발명은 샘플 중의 유기체를 신속하게 검출 및/또는 분류하기 위해 유기체로부터 게놈 물질을 제조, 증폭, 검출 및/또는 추가 분석용으로 임의 선별하는 [예를 들어, 유기체의 게놈 물질을 스크리닝, 확인, 정량화, 및/또는 임의로 추가 분석 (예: 서열 분석)하는] 방법에 사용될 수 있는 기구 (apparatus)에 관한 것이다.
최근에 기본 상의 혁신적인 개발로 인해 생명공학적 과정들은 보다 고성능이면서도 보다 복잡해졌다. 예를 들어, DNA 제조, 증폭, 검출 및 확인 (동정) 비용을 절감시키고, 이들 과정을 단순화하고 표준화시키기 위한 수 많은 유용한 기술이 개발되어 왔지만, DNA를 스크리닝, 정량화, 확인, 및/또는 추가로 분석 (예: 서열 분석)하기 위해 이들 과정을 완전 자동화시킬 수 있는 기구는 현재 시판되고 있지 않다.
생명공학 분야에서는, 각종 샘플 (에: 환경적 및 의학적) 중의 유기체 (예: 세균 및 바이러스)를 신속하게 검출 및/또는 분류하는 것이 필요하다. 예를 들어, 세균을 신속하게 검출하고, 해당 종 및/또는 균주를 후속 분류하는 것은, 예를 들어 지역 급수원 (local water supply), 병원 또는 식품 가공 공장에 대한 품질 보증을 제공하는데 필요할 수 있는데, 즉 오염성 유기체가 존재하는지를 알아보기 위해 공기, 먼지, 물, 혈액, 조직, 식물, 식료품 등의 샘플을 포함하지만 그에 제한되지 않는 각종 샘플을 모니터링하고; 일반 대중에 의해 소모, 노출 및/또는 사용되기에 앞서, 또는 일반 대중에 의해 사용되는 동안에 오염성 유기체를 분류하는 것이 필요할 수 있다.
특정 유기체를 검출 및/또는 분류하기 위한, 예를 들어 유기체를 배양 및 그람-염색하거나 기타 생화학적 특성을 시험하기 위한 표준 미생물학적 방법은 부정확하고, 종종 유기체의 상이한 균주는 말할 것도 없거니와 상이한 유기체들 간도 구별하지 못할 수 있다. 유기체를 검출하고/하거나 확인하기 위한 보다 정확한 방법은 이러한 유기체의 게놈 DNA에 의거하는 것이다. 이러한 방법중 널리 공지된 한가지 검출 및/또는 확인 (분류) 방법은 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)인데, 이에 관한 기술적 개발로 인해 그의 처리능력과 자동화 수준이 증가되었다.
PCR은 2종의 별개의 (제1 및 제2) 프라이머에 의해 수행되는데, 이들 프라이머 각각은 게놈 DNA의 두 주형 중 어느 하나에 존재하는 뉴클레오티드 서열에 상보적이다. 상기 2종의 프라이머 서열은 2종의 게놈 DNA 주형의 서열에 기초하기 때문에, 2종 프라이머는 이중 가닥 게놈 DNA의 단리된 단일 유전자좌와 결합하고 이 를 일괄해서 다룬다(각 괄호 [] 안에 둔다). 이러한 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하면, 상기 2개 프라이머에 대해 상보적인 뉴클레오티드 서열에 의해 일괄된 게놈의 단리된 단일 유전자좌, 즉 하나의 게놈 DNA 주형의 3' 말단 상의 제1 프라이머 결합 부위와, 다른 게놈 DNA 주형의 3' 말단 상의 제2 프라이머 결합 부위에 의해 플랭킹된 DNA의 유전자좌와 동일한 이중 가닥 게놈 DNA가 기하급수적으로 증폭된다.
PCR은 소량의 DNA를 검출 (탐지)하는데 유용한데, 이는 PCR을 수행하면 이중 가닥 DNA가 기하급수적으로 증폭될 뿐만 아니라 PCR 처리능력과 자동화 수준을 증가시켜 주는 새로운 기술이 개발되었기 때문이다. 이러한 기술의 한 가지 예는, 예를 들어 미국 특허 제6,500,323호 및 제6,670,153호에 기재된 바와 같은 미소유체 장치 (microfluidic device)용 제어기/검출기 계면을 포함한 미소유체 시스템을 사용하는 것이다. 이들 미소유체 시스템 [이는 본원에서 집합적으로, 자동화 인라인 PCR 플랫폼 (automated inline PCR platform)으로서 지칭된다]은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 다음에 총체적으로 기재되어 있다.
대부분의 자동화 인라인 PCR 플랫폼은 자동화 샘플 획득, 미소유체 PCR 시약 어셈블리, PCR 열 사이클링, 및 광학적 검출 분광법을 위해 제어기/검출기 계면과 함께 작동하는 미소유체 칩을 활용한다. 미소유체 칩은 일반적으로, 제2 판과 결합될 수도 있는 1개 이상의 마이크로-에칭된 유체 (미소유체) 인라인 반응 채널을 수반한 제1 판을 포함하는데, 상기 제2 판 내에서는 제1 판이 미량 금속 및 유체 저장고일 수 있다. 이러한 2개 판을 함께 결합하여 미소유체 칩을 형성시킨 경우 에는, 제1 판의 각 미소유체 반응 채널이 제2 판의 유체 저장고와 연결되어 유전자좌-특이적 시약이 상기 유체 저장고를 통하여 미소유체 인라인 반응 채널로 전달될 수 있도록 할 수 있다.
통상적으로, 미소유체 칩을 이용하는 자동화 인라인 PCR은 특정 챔버에서는 일어나지 않고; 대신, 샘플이 미소유체 인라인 반응 채널을 따라 내부로 이동함에 따라 상기 반응이 일어난다. 모세관, 또는 "시퍼 (sipper)"가 특정 샘플 소적(小滴) (이는 DNA 샘플 소적, 즉 유기체로부터 단리된 게놈 물질을 포함하는 샘플 소적이거나 아닐 수도 있다)을, 예를 들어 미소역가 판 (이는, 예를 들어 로봇을 이용한 조작기로부터 유래될 수 있다)으로부터 1개 이상의 미소유체 인라인 반응 채널 내로 흡인시킬 (빨아들일) 때 인라인 PCR이 시작된다. 샘플 소적을 미소유체 인라인 반응 채널 내로 흡인시킨 후, 시퍼를 완충제 물통으로 이동시켜 완충제가 미소유체 칩에 빨려 들어가도록 할 수 있다. 결과적으로, 각 샘플 소적은 완충제 스페이서에 의해 인접한 샘플 소적으로부터 격리되기 때문에, 샘플 소적들 간의 교차-오염이 최소화된다. 이어서, 각 샘플 소적을 미소유체 인라인 반응 채널을 따라 칩의 PCR 어셈블리 영역 내로 이동시키는데, 여기서 샘플 소적은 PCR에 필요한 시약, 예를 들어 프라이머 쌍, DNA 폴리머라제 및 dNTPs, 및 검출가능한 작용제 (예: 삽입제 등)와 혼합됨으로써 샘플 플러그 (plug)로 되었다. 임의로는, 완충제 스페이서를 PCR에 필요한 시약과 혼합하여 음성 대조군으로서 제공할 수도 있다. PCR에 필요한 시약 및 검출가능한 작용제과 혼합시킨 후, 샘플 플러그 (이는 DNA 샘플 플러그, 즉 게놈 물질을 포함하는 샘플 플러그이거나 아닐 수도 있다)를 일정 길이의 미소유체 인라인 반응 채널을 따라 칩의 상이한 영역, 예를 들어 PCR이 샘플 플러그 상에서 수행될 수 있는 증폭 영역 내로 이동시킨다.
일반적으로, 각 샘플 플러그 (예: DNA 샘플 플러그)는 미소유체 인라인 반응 채널 내로 유동하기 때문에, 이는 증폭 영역, 즉 온도-제어 영역으로 유입되는데, 이러한 영역에서는 각 미소유체 인라인 반응 채널을 국한적 방식으로 반복적이고도 신속하게 가열 및 냉각시켜서, 각 샘플 플러그가 상기 채널 내로 이동함에 따라 PCR의 변성, 어닐링 및 연장 단계가 이러한 각 샘플 플러그 상에서 수행되도록 한다. 당업자는 DNA의 증폭이 DNA 샘플 플러그, 즉 게놈 물질을 포함하는 샘플 플러그에서만 일어날 것으로 인지할 것이다. 증폭 영역 내에서 온도를 제어하는 방법은 줄 (Joule) 가열이다 [참고: 예를 들어, 미국 특허 제5,965,410호 및 제6,670,153호]. 일반적으로, 전압을 제어 및 국한적 방식으로 미량 금속에 적용하여 PCR의 각 주기 (즉, 각각의 변성, 어닐링 및 연장 주기)에 필요한 상이한 온도를 달성할 수 있다. 반응물을 냉각시키는 것은, 예를 들어 미소유체 인라인 반응 채널로부터 열 형태의 열 에너지를 가져가기 위해 코일을 통하여 이동하는 냉각 유체를 사용하거나, 또는 예를 들어, 냉수를 미소유체 칩의 바닥 표면에 적용함으로써 신속한 열 소산을 허용함으로써 달성할 수 있다. 미소유체 채널 내의 유체 용적은 작고 미량 금속은 미소유체 인라인 반응 채널과 매우 근접하여 위치하고 있기 때문에, 이러한 채널 중의 유체 (및 이에 따른, 샘플 플러그)를 가열 및 냉각하는 것은 극히 신속하게 수행된다. 결과적으로, DNA 샘플 플러그는 PCR을 진행하고, 예를 들어 30 주기가 9분 이내에 수행될 수 있도록 PCR 주기가 수행된다. 각 DNA 샘플 플러그는 칩의 온도-제어 영역 내의 미소유체 채널을 통하여 이동하기 때문에 이러한 각 DNA 샘플 플러그가 인지하는 PCR 주기 수는 1) 미량 금속에 적용된 전압 타이밍 및 2) 미소유체 채널을 통한 DNA 샘플 플러그의 유속 중의 어느 한 가지 또는 둘 다를 변화시킴으로써 다양해질 수 있다.
미소유체 칩은 미소유체 인라인 반응 채널을 갖고 있는 만큼 많은 폴리머라제 연쇄 반응을 동시에 수행할 수 있다. 예를 들어, 게놈 물질을 포함하는 샘플을 다수의 상이한 미소유체 인라인 반응 채널 내로 흡인시킬 수 있는데, 이들 각각에 상이한 유전자좌-특이적 시약 [예를 들어, 게놈 물질 (예: DNA) 상의 상이한 유전자좌를 일괄하는 상이한 프라이머 쌍]을 가한다. 이로써, 동일한 유기체로부터 단리한 게놈 물질 상의 상이한 몇개의 유전자좌를 동시에 검출할 수 있게 된다. 또다른 한편으론, 1개의 특이적 프라이머 쌍을 포함하는 시약을 다수의 상이한 미소유체 인라인 반응 채널 내로 흡인시킬 수 있다. 이로써, 상이한 유기체로부터 단리한 게놈 물질 상의 동일한 유전자좌를 동시에 검출할 수 있게 된다. 부가적으로, 다수의 샘플 소적을 동일한 미소유체 반응 채널 내로 흡인시킬 수 있다.
검출 영역은 통상적으로, 온도 제어 증폭 영역의 하류이고, 이는 일반적으로 투명한 영역이기 때문에 증폭된 DNA 생성물, 예를 들어 PCR 생성물을 관찰하고 검출할 수 있다. 검출 영역에서는, 각 미소유체 인라인 반응 채널이 통상적으로, 아주 근접하게 위치하여 검출기 아래를 통과한다. 광원이 미소유체 인라인 반응 채널을 가로질러 확산되므로, 광학 검출 영역을 관통하는 검출가능한 작용제, 예를 들어 각 채널 (예: 각 DNA 샘플 플러그)로부터 방출된 형광을 동시에 측정할 수 있 다. 검출 영역 다음에는, 각 미소유체 인라인 반응 채널이 각 샘플 플러그를 폐기용 웰로 안내한다.
3가지 상이한 방법을 통상 사용하여 미소유체 인라인 반응 채널 내에 유체 운동을 생성시키는데, 이러한 방법은 동전학 (electrokinetics), 압력, 또는 이 둘의 하이브리드와 관련이 있다 [참고: 예를 들어, 미국 특허 제6,670,153호]. 압력에 의거한 유동 시스템에서는, 내부 또는 외부 공급원을 사용하여 인라인 반응 채널에서의 유체 유동을 구동시킬 수 있다. 예를 들어, 각 미소유체 인라인 반응 채널 끝에서 폐기용 웰에 진공을 적용할 수 있고, 이를 사용하여 상기 시퍼를 활성화시키고 유체가 미소유체 인라인 반응 채널을 따라 폐기용 웰을 향해 이동할 수 있도록 한다. 또다른 한편으론, 게놈 물질이 충전되기 때문에, 동전학, 즉 전압 구배 발생 (예를 들어, 전압을 미량 금속에 적용함으로써 이루어짐)을 이용하여 미소유체 인라인 반응 채널을 따라 충전된 유체를 구동시킬 수 있다. 상기 인라인 반응 채널을 따라 유체를 구동시키는 제3의 방법은 동전학과 압력 둘 다를 이용한다. 그 결과, 미소유체 인라인 반응 채널 내에서 유체가 연속해서 유동하는데, 샘플 플러그 (예: DNA 샘플 플러그)는 지속적으로 혼합되거나 칩의 상이한 영역 (예: PCR 어셈블리 영역, 온도 제어 영역, 검출 영역 등)에 지속적으로 이동한다.
동전학 및/또는 압력-구동된 유체 이동, 가열 및 냉각 주기, 검출, 및 미소유체 칩과 관련된 데이타 획득은 칩과 연결되어 있는 기기 (instrument)에 의해 제어될 수 있다 [이는 일반적으로, 미국 특허 제6,582,576호에 기재되어 있다]. 이러한 기기의 계면은 통상적으로, 시약 웰을 칩 상에 밀봉시키는 o-링 실 (o-ring seal), 칩 상의 미량 금속과 연결될 수 있고 온도 사이클링을 위한 전압을 공급할 수 있는 포고 핀 (pogo pin), 폐기용 웰에 대한 o-링 실 (여기서, 진공을 적용하여 유체를 칩 내로 이동시킬 수 있다), 냉수가 순환하는 것에 대항하여 칩 바닥을 밀봉하고 온도 사이클링 동안 냉각을 가속시키기 위해 사용될 수 있는 대형 o-링, 및 예를 들어, 형광 검출하기 위한 검출 부위를 함유한다. 당업자는 미소유체 칩이 통상적으로 밀폐된 시스템이고, 물리적 장벽 (예: 완충제 스페이서)가 샘플 플러그 (예: DNA 샘플 플러그)를 격리시키며 지속적인 유동으로 인해 샘플 플러그가 역으로 이동하지 못하기 때문에, 상기 시스템으로 인한 오염 위험은 최소라는 것을 인식할 것이다.
PCR (및 결과적으로, 자동화 인라인 PCR 플랫폼)은 DNA를 기하급수적으로 증폭시키기 때문에, 이를 사용하여 소량의 게놈 물질을 검출할 수 있다. 그러나, PCR은 공지되어 있고 관심 유전자좌를 일괄하는 게놈 물질의 서열에 대해 특이적으로 상보적인 프라이머를 필요로 하기 때문에, 공지된 유기체의 검출과 분류를 위해서만 사용할 수 있다는 점에서 제한적이다. 달리 말하면, 연구가들은 해당 유기체를 검출하기 위한 어떠한 시도에 앞서 이러한 유기체의 실체 (즉, 사용하기에 적당한 프라이머 쌍)을 알고 있거나 짐작해야만 한다. PCR (및 결과적으로, 자동화 인라인 PCR 플랫폼)의 또다른 한계 사항은 연구가들이 분석에 사용된 2개 프라이머에 대해 상보적인 서열에 관한 정보 이외의, 증폭된 DNA에 관한 서열 정보를 얻을 수 없다는 것이다. 부가적으로, 자동화 인라인 PCR 플랫폼은, 예를 들어 DNA 샘플 플러그 중의 게놈 물질이 일정 길이의 미소유체 인라인 반응 채널을 이동한 후에, 이 러한 게놈 물질을 추가로 분석 (예: 서열 분석)하기 위한 수단을 제공하지 못한다. 게놈 물질을 추가로 분석하는 것, 예를 들어 서열을 제공하는 것은, 예를 들어 병원성 균주를 비-병원성 균주와 구별하고, 새로운 균주의 서열 등을 검출 및 제공하는데 있어 중요하고 유용할 수 있다.
이러한 PCR의 한계 사항 중의 몇 가지를 극복하기 위해 파형 프로파일링 (waveform profiling) 방법을 개발하였다 [예를 들어, 일본 특허공개공보 제2003-334082호 및 제2003-180351호에 기재된 파형 프로파일링 방법 참고]. 일본 특허공개공보 제2003-334082호 및 제2003-180351호에 기재된 바와 같은 파형 프로파일링 방법은 연구가가 검출에 앞서 유기체의 실체를 알고 있거나 짐작하는 것을 요구하지 않으면서도, 유기체 (예: 세균)로부터 단리된 게놈 물질, 예를 들어 DNA를 분석 및 프로파일링하는 방식을 제공한다. 간략하게 설명하면, 파형 프로파일링은 일반적으로, 보다 고 차수의(higher-order) 구조물, 예를 들어 삼중체, 사중체 등을 형성하는 몇개의 별개의 단일 가닥 핵산 중합체를 선형 (직선)적으로 증폭시키기 위해 주형으로서 게놈 DNA의 2개의 변성된 가닥과 독특한 프라이머(들)를 사용하여 유기체의 게놈 DNA를 분석한다. 해당 유기체의 게놈 DNA가 주형으로서 사용되기 때문에, 이로써 생성되는 단일 가닥 핵산 중합체는 별개이고 유기체에 대해 독특한 서열을 함유할 것이다. 따라서, 이러한 단일 가닥 핵산 중합체는 유기체에 대해 독특한 서열에 기초하여 보다 고 차수의 구조물을 형성할 것이다. 따라서, 검출가능한 작용제, 예를 들어 형광성 삽입제를 사용하여 달성될 수 있는, 상기와 같은 독특한 보다 고 차수의 구조물 검출은 해당 유기체를 확인시켜 줄 수 있다.
그의 구조와 길이를 특징으로 하는 단일 패턴 생성적 파형 프라이머를 사용하여 몇개의 별개의 단일 가닥 핵산 중합체를 통상 생성시킨다. 파형 프라이머 (즉, 파형-프로파일링 프라이머)는 일반적으로 2개 부분, 즉 비특이적 안정화 부분과 특이적 부분으로 이루어진다. 다음에 논의되는 바와 같이, 비특이적 안정화 부분은 보다 고 차수의 구조물 형성을 안내하는데 도움을 줄 수 있다. 이와는 달리, 특이적 부분은 파형 프라이머가 그 자신의 서열에 대해 상보적인 서열과 특이적으로 결합하도록 안내한다. 파형 프라이머의 길이 (예를 들어, 8 내지 30개 염기 길이)는 통상적으로 중요한데, 이는 프라이머의 특이적 부분이 일정 길이의 게놈 DNA 주형을 따라 몇개의 별개의 프라이머 결합 부위, 즉 파형 프라이머에 대해 상보적인 서열과 특이적으로 결합할 수 있게 해주기 때문이다. 파형 프라이머가 각 단일 가닥 게놈 DNA 주형을 따라 몇개의 프라이머-결합 부위와 결합함으로써, 몇개의 별개의 단일 가닥 핵산 중합체가 생성될 수 있고, 이의 생성은 상기 방법에 있어 통상적으로 중요하다.
파형 프라이머를 활용하는 것 이외에도, 상기 파형 프로파일링 방법은 선형 증폭 여러 주기를 활용하여 몇개의 별개의 단일 가닥 핵산 중합체 각각의 다중 카피 (copy)를 제공하기도 하므로, 선형 증폭의 제1 주기에 앞서 관심있는 게놈 DNA를 함유하는 용액에 파형 프라이머의 다중 카피를 부가한다. PCR과 (적어도 일반적으로) 유사한, 선형 증폭 1 주기는 다음 단계를 포함한다: 1) 이중 가닥 게놈 DNA의 각 카피를 2개의 단일 가닥 게놈 DNA 주형으로 변성시키는 단계, 2) 파형 프라이머를 어닐링시켜 (즉, 파형 프라이머의 결합을 허용하는 조건을 제공함) 각 단 일 가닥 게놈 DNA 주형 상에 몇개의 별개의 프라이머 결합 부위를 생성시키는 단계, 및 3) 각 게놈 DNA 주형을 따라 프라이머 결합 부위와 결합된 몇개의 파형 프라이머 각각으로부터 몇개의 별개의 단일 가닥 핵산 중합체를 연장시키는 단계.
선형 증폭 1 주기 동안, 게놈 DNA의 온도를 상승시켜 (예를 들어, 95 내지 98℃로 상승시킴) 게놈 DNA의 각 카피를 2개의 단일 가닥 게놈 DNA 주형으로 변성시킨다. 이 온도를 후속 강하시켜 (예를 들어, 25℃로 강하시킴) 파형 프라이머가 일정 길이의 각 변성된 게놈 DNA 주형을 따라 몇개의 별개의 프라이머-결합 부위와 결합할 수 있게 한다. 상기 주기의 최종 단계인, 결합된 각 파형 프라이머로부터 몇개의 별개의 단일 가닥 핵산 중합체를 연장시키는 단계는 폴리머라제, 예를 들어 Taq 폴리머라제를 사용하여 약 72℃에서 수행한다. 이러한 최종 단계 후, 상기 주기를 반복한다.
그 다음 변성 단계 동안에는, 몇개의 별개의 핵산 중합체를 게놈 DNA 주형으로부터 변성시키면 이는 단일 가닥 핵산 중합체로 되는데, 각각의 단일 가닥 핵산 중합체는 이러한 단일 가닥 핵산 중합체가 연장되는 파형 프라이머의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 5'→3' 뉴클레오티드 서열에 이어, 파형 프라이머와 결합된 게놈 DNA 서열의 하류인 게놈 DNA 주형 영역 서열에 대해 상보적인 별개의 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 각 단일 가닥 핵산 중합체는 그의 5' 말단에 파형 프라이머 서열을 포함하고 있기 때문에, 각 단일 가닥 핵산 중합체는 파형 프라이머의 비특이적 안정화 부분을 포함하기도 한다. 이러한 파형 프라이머의 비특이적 안정화 부분은 일반적으로, 각 단일 가닥 핵산 중합체가 보다 고 차수의 구조물을 형성하도록 하 고, 단일 가닥 핵산 중합체가 후속 증폭 주기에서 어떠한 파형 프라이머와도 결합하지 못하도록 효과적으로 방지시켜 준다.
달리 말하면, 단일 가닥 핵산 중합체는 후속 증폭 주기에서 주형으로서 사용되지 않고, 이러한 파형 프로파일링 방법에 있어서의 각 증폭 주기는 선형이고 기하급수적이 아닌데, 즉 각 증폭 주기에 의해서는 해당 유기체에 대해 독특한 서열, 즉 프라이머 결합 부위와 결합된 파형 프라이머의 하류인 게놈 DNA 주형의 서열에 대해 상보적인 서열을 함유하는 몇개의 별개의 단일 가닥 핵산 중합체 각각의 단일 카피 만이 생성된다. 따라서, 기하급수적 증폭을 가져다 주는 PCR과는 달리, 파형-프로파일링 방법으로는 일반적으로, 유기체에 대해 독특한 서열을 함유하는 몇개의 별개의 단일 가닥 핵산 중합체가 선형 증폭되는데, 즉 비-기하급수적으로 증폭된다.
각 단일 가닥 핵산 중합체는 프라이머-결합 부위와 결합된 파형 프라이머의 하류인 게놈 DNA 주형 서열에 대해 상보적인 염기 서열을 함유하기 때문에, 상이한 게놈 DNA의 다수 부위 상에 존재하는 염기 서열 상의 차이는 비교 및 구별될 수 있다. 상기 언급된 바와 같이, 몇개의 별개의 단일 가닥 핵산 중합체 각각의 다중 카피는 서로 상호 작용하여 보다 고 차수의 구조물, 즉 하나 이상의 별개의 단일 가닥 핵산 중합체를 포함하는 복합체 (예: 삼중체 및 사중체)를 형성할 것이다. 이러한 보다 고 차수의 핵산 구조물은 상이한 안정성을 지닐 것이고, 단일 가닥 핵산 중합체의 염기 서열에 따라서, 즉 유기체의 독특한 게놈 정보에 기초하여 상이한 융점 (Tm)에서 해리될 것이다.
파형 프로파일링을 수행하기 위해서는 일반적으로, 주형으로서 특별한 유기체의 게놈 DNA를 사용하여 생성된 각종의 상이한 보다 고 차수 구조물의 Tm이 결정되고 기록되어야만 하는데 (융점 분석); 이는 보다 고 차수의 DNA 구조물 내로 삽입되는 형광성 작용제, 즉 삽입제를 사용하여 달성할 수 있다. 파형 프로파일링에 의해 생성된 보다 고 차수의 DNA 구조물은 샘플 온도를 상승시킴으로써 해리시킬 수 있다. 보다 고 차수의 DNA 구조물이 해리됨에 따라, 이들 보다 고 차수의 구조물 내에 삽입된 형광성 작용제도 또한 해리될 것이다. 온도 상승에 따른 함수로서 이들 보다 고 차수의 구조물를 해리시킴으로써 수득된 형광 세기의 변화율을 플롯하면, 해당 유기체의 게놈 DNA에 대해 독특한 파형이 생성될 것이며, 활용된 파형 프라이머, 즉 상이한 융점 (Tm)에서 보다 고 차수의 DNA 구조물의 해리를 관찰하고 이를 기록하여 각 유기체 종 (또는 균주), 예를 들어 세균에 대해 특징적인 "파형 프로파일"을 생성시킨다. 따라서, 파형 프로파일링을 이용하여, 각 유기체에 대해 독특한 파형 프로파일을 수득하기 위해 융점 분석 및 삽입체를 사용하여 제2 유기체로부터 단리한 게놈 DNA와 제1 유기체로부터 단리한 게놈 DNA 간을 구별할 수 있다.
상기 언급된 방법 (파형 프로파일링과 관련된 방법)은 선형 증폭에 의존하기 때문에, 이러한 방법을 사용하는 경우에 직면하게 되는 어려움 중의 하나는 검출 및/또는 확인하고자 하는 특별한 유기체 (예: 세균)로부터의 게놈 DNA가 초기에 다량으로 존재해야만 한다는 것이다. 결과적으로, 파형 프로파일링 방법은 유기체가 소정의 샘플 내에 다수 (예: 106개 이상 유기체)로 존재하는 경우에만 해당 유기체를 검출하고 확인하는데 사용할 수 있지만, 극소수의 유기체를 검출 및/또는 확인하는데 에는 효과적이지 못하다. 부가적으로, PCR과 유사하게, 상기 방법의 또다른 한계점은 게놈 물질에 관한 상세한 정보 (예를 들어, 서열 정보)를 제공할 수 없다는 것이다.
따라서, 파형 프로파일링 방법은 일반적으로, 예를 들어 오염 발생시 급수원 및 수원 (water source)으로부터 취한 샘플 중에 소량 (소수)으로 존재하는 유기체를 검출 및/또는 확인하는데 유용하지 못하거나, 또는 유기체의 게놈 물질에 관한 상세한 정보 (예를 들어, 서열 정보)를 제공하는 데에도 유용하지 못하다. PCR (및 결과적으로, 인라인 자동화 PCR 플랫폼)이 다량의 출발 샘플을 필요로 하는 파형 프로파일링 방법의 한계점을 해결해줄 수 있긴 하지만 (왜냐하면, PCR은 게놈 DNA를 기하급수적으로 증폭시켜 주고 소량으로 존재하는 유기체를 검출할 수 있게 해주기 때문이다), PCR 증폭으로부터 비롯되는 DNA의 상보적 이중 가닥 조각을 사용하여 생성된 파형 프로파일은 특별한 게놈 서열을 확인하는데 불충분하다는 것이 당해 분야에 공지되어 있다 [참고: 예를 들어, "Goodbye DNA Chip, Hello Genopattern for 21st Century," printed and distributed by Adgene Co., Ltd.]. 또한, 지금까지는 파형 프로파일을 검출할 수 있는 자동화 인라인 PCR 플랫폼이 공지되지 않았다. 달리 말하면, 선행 기술 분야에서는 표준 PCR 생성물의 융점 (Tm) 분석을 이용해서는 게놈 물질 (유기체의 각종 종 또는 균주로부터 유래됨)을 비교, 구별 및 확인하는 것이 가능하지 않다고 교시하고 있을 뿐만 아니라, 선행 기술은 파형 프로파일링 처리능력과 자동화 수준을 증가시키는 기술을 제공하지도 못하였다.
부가적으로, 파형 프로파일링 방법이 그의 게놈 DNA의 검출을 통하여 특정 유기체의 신속한 검출 및/또는 분류를 제공해줄 수 있긴 하지만, 이들 방법 뿐만 아니라 PCR 및 인라인 자동화 PCR 플랫폼 방법은 서열 분석용 칩 [참고: 미국 특허공개공보 제2005/0009022호]에 의해 제공된 바와 같은, 게놈 물질에 관한 상세한 정보 (예를 들어, 서열 정보)를 제공해주지 못하기 때문에, 모두 한계가 있다. (예를 들어, 특별한 PCR 프라이머 쌍 또는 파형 프라이머를 사용해서는 검출가능하지 않을 수 있는) 동일한 유기체의 상이한 균주들 간의 게놈 변동으로 인해 상이한 균주가 상이한 병원성을 지니는 경우에는, 공중 위생 등에 큰 위협을 가할 수도 있는 새로운 감염체 균주 (예: 인플루엔자 바이러스의 변이체 또는 생물 병기의 변이체)를 검출하는데 있어서 게놈 물질을 추가로 조사하는 것이, 예를 들어 서열 정보를 분석하는 것이 중요할 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, 많은 기본적 방법들 (예: PCR, 파형 프로파일링 등)과 혁신적 기술 개발 (예: 자동화 인라인 PCR 플랫폼)은 유기체를 검출 및/또는 분류하는 분야에서 수행될 수 있다. 이들 방법과 개발이 보다 고성능이고, 유기체의 검출 및/또는 분류를 간단하고도 표준화시키며, 보다 효율적으로 만들긴 하지만, 본 발명자들은 이들 방법과 개발 모두를 동시에 자동화시켜 줄 수 있는 기구, 즉 PCR, 파형 프로파일링, 및/또는 게놈 물질을 추가 분석 (예: 서열 분석)용으로 임 의 선별할 수 있게 해주는 자동화 인라인 플랫폼이 당해 분야에서 현재 인식되고 있지 않다는 것을 알고 있다. 본 발명은 제조 (예를 들어, 단리, 처리, 반응 시약과의 혼합 등), 증폭 (예를 들어, PCR, 파형 프로파일링 등에 의함), 검출 및/또는 추가 분석 (예: 서열 분석)용으로 임의 선별하는 자동화 방법에 의해 샘플 중의 게놈 물질 [특정 유기체 (예: 세균 또는 바이러스)로부터 단리함]을 검출 및/또는 분류 [예를 들어, 게놈 물질을 스크리닝, 정량화, 확인, 및/또는 추가 분석 (예: 서열 분석)용으로 임의 선별함]하기 위해 사용될 수 있는 미소유체 장치를 포함하는 기구를 제공함으로써 상기 한계점을 극복한다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 게놈 물질을 완전히 자동화 분석하기 위한, 즉 게놈 물질을 제조 (예를 들어, 단리, 처리, 반응 시약과의 혼합 등), 증폭 (예를 들어, PCR 및/또는 파형 프로파일링의 방법에 의함), 검출 (즉, 스크리닝, 확인 및/또는 정량화), 및 추가 분석용으로 임의 선별하기 위한 기구를 제공하는 것이다. 본 발명의 또다른 목적은 사회에 이로운, 상기 기구를 사용하는 다중법을 제공하는 것인데, 예를 들어 게놈 물질을 스크리닝, 확인, 정량화, 및/또는 추가 분석 (예: 서열 분석)용으로 선별하는 방법에 상기 기구를 사용할 수 있다.
특정 샘플을 스크리닝하고, 공지되어 있지 않지만 잠재적으로 오염성인 모든 유기체를 검출하는 것은 중요하고, 이는 특히 지속적인 (즉, 1일 24시간, 1주 7일 및 1년 365일) 조치로서, 예를 들어 공공적 공급원, 예를 들어 급수원과 공기원 (air supply)을 감시하고 안전하게 지키기 위한 반테러리즘 조치로서, 본 발명의 기구를 사용하는 첫 번째 방법이다. 공공적 공급원, 예를 들어 급수원은 안전한 것으로 예상되기 때문에, 이러한 급수원을 지속적으로 스크리닝하면 음성 데이타를 일정하게 취득할 수 있는데, 예를 들어 오염물이 전혀 검출되지 않을 수 있는데 (제로-검출), 이러한 지속적 스크리닝은 비용이 많이 들고 겉보기에도 중복된다. 게놈 물질 (즉, 오염물)의 존재 또는 부재를 검출하기 위해 본 발명의 기구를 사용하는 경우의 이점은 지속적인 스크리닝과 연관된 비용이 비교적 낮다는 것이다.
본 발명의 기구를 사용하는 또다른 방법은 확인 (동정)인데, 이는 게놈 물질을 분석하는데 있어 흔한 과정이다. 본 발명의 기구는 공지된 프라이머에 의해 발생되고/되거나 유기체의 게놈 물질에 의거한 프로파일을 형성하는 증폭된 DNA 생성물을 검출하는 방법에 사용할 수 있기 때문에, 게놈 물질의 존재 또는 부재를 검출하기 위해 본 발명의 기구를 사용하는 방법으로, 게놈 물질이 단리되는 유기체를 동시에 확인할 수 있다. 부가적으로, 본 발명의 방법 및 기구를 사용하여 증폭된 생성물의 존재 또는 부재를 검출함으로써, 1종 이상의 오염성 유기체가 샘플 중에 존재하는지 여부를 확인할 수 있을 것이다.
또다른 양태에서, 본 발명의 기구는 샘플 중에 존재하는 게놈 물질의 양을 정량화하는 방법에 사용된다. 이러한 정량화는, 예를 들어 질병의 진행, 제1 및 제2 유기체의 존재 또는 부재에 있어서의 수치적 차이 등을 측정하는데 있어 보다 깊은 분석을 위해 유용할 수 있다.
추가 분석 (예: 서열 분석)용 게놈 물질을 선별할 수 있는 능력은 본 발명의 최종 (임의) 방법이다. 당업자는 본 발명의 검출, 확인, 및/또는 정량화 방법으로 부터의 결과가 오염성 물질이 심각한 위협을 초래한다고 제안하는 경우에는 추가 분석이 요구될 수 있다는 것을 인식할 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 특정 유기체(들)가 샘플 중에 소량으로 존재하는 경우일지라도 이러한 샘플 중의 유기체로부터 단리시킨 게놈 물질을 파형 프로파일링하는 개선된 방법을 제공하는 것이다. 이러한 개선된 파형 프로파일링 방법을 본 발명의 기구와 함께 사용할 수 있다.
따라서, 본 발명은 PCR 및/또는 파형 프로파일링 (본 발명의 개선된 파형 프로파일링 방법 포함)을 통하여 증폭시킨 게놈 물질을 자동화 인라인 검출할 수 있게 해주는 기구를 제공하고, 또한 검출된 게놈 물질을 추가 분석 (예: 서열 분석)용으로 후속 선별하는 선택권을 제공하는 것이다.
특히, 본 발명은 파형 프로파일링 방법에 의해 생성시킨 증폭된 DNA 생성물을 생성 및 검출할 수 있는 미소유체 시스템, 즉 인라인 자동화 플랫폼에 관한 것이다.
본원에 기재된 미소유체 시스템은 PCR 및 파형 프로파일 중의 어느 한 가지 방법 또는 두 가지 방법 모두, 및 임의의 기타 DNA 분석 방법 (예: 스크리닝 방법)과 함께 사용할 수도 있는 신규한 인라인 자동화 플랫폼을 가져다 준다. 본 발명은 또한, 소량의 출발 게놈 물질의 파형 프로파일링을 허용하도록 변형시킨 PCR 버젼을 도입시킬 수 있는, 파형 프로파일링 방법에 대한 신규 개선안을 제공하는 것이다. 부가적으로, 본 발명은 샘플 중의 유기체로부터 단리한 게놈 물질을 제조, 증폭, 검출 (예를 들어, 스크리닝, 정량화, 확인), 및/또는 추가 분석 (예: 서열 분석)용으로 임의 선별하기 위해 본 발명의 인라인 자동화 플랫폼, 즉 본원에 제공된 장치를 포함하는 기구를 사용하는 방법을 제공한다. 당업자는 본 발명의 자동화 인라인 플랫폼, 개선된 파형 프로파일링 방법, 및 본 발명의 자동화 인라인 플랫폼을 사용하는 본원에 기재된 방법 (예를 들어, 개선된 파형 프로파일링 방법을 수반함)으로, 유기체가 소량으로 존재하는 경우, 예를 들어 급수원 또는 기타 공급원의 오염 발생시 샘플 중에 존재하는 유기체의 수가 소량인 경우일지라도, 유기체로부터의 게놈 물질을 지속적으로 검출 (예를 들어, 스크리닝, 확인, 정량화)하고/하거나, 추가 분석 (예: 서열 분석)용으로 선별할 수 있다는 것을 인식할 것이다.
따라서, 본 발명은 증폭된 DNA 생성물 (예: PCR-증폭된 생성물, 파형 프로파일의 보다 고 차수 구조물 등)을 검출할 수 있게 해주고, 이와 같이 검출된 DNA을 추가 분석 (예: 서열 분석)용으로 임의 선별할 수 있게 해주는 미소유체 장치에 관한 것이다. 본 발명의 한 양태에서, 본 발명의 인라인 자동화 미소유체 장치는, 이러한 장치의 검출 영역에 유입되기 때문에 제2 온도-제어 영역 내에 있는 미소유체 인라인 반응 채널(들)을 포함한다. 미소유체 반응 채널(들)을 이러한 제2 온도-제어 영역 내에 놓아둠으로써, PCR 증폭된 생성물 뿐만 아니라 파형 프로파일링 방법 (또는, 본원 및 본원에 참고로 도입된 미국 가특허원 제60/591,596호에 설명된 바와 같은 그의 개선 방법)을 이용하여 생성시킨 보다 고 차수의 핵산 중합체를 검출할 수 있게 되는데, 이는 상기 보다 고 차수의 핵산 구조물이 제2 온도-제어 영역 내의 상이한 융점에서 해리되기 때문인데, 즉 융점 분석할 수 있기 때문이다.
따라서 본 발명은 1개 이상의 시퍼; 1개 이상의 미소유체 인라인 반응 채널 에 연결된 1개 이상의 유체 저장고 (여기서, 1개 이상의 미소유체 인라인 반응 채널은 시약 어셈블리 영역, 제1 온도-제어 영역 내의 증폭 영역, 및 제2 온도-제어 영역 내의 검출 영역을 관류한다); 및 상기 미소유체 인라인 반응 채널 내에서의 유체 이동 및/또는 그의 가열을 위한 1종 이상의 미량 금속을 포함하는 미소유체 장치를 제공하는데, 증폭된 DNA 생성물의 검출은 하나 이상의 온도에서 일어날 수 있다 (즉, 검출은 하나 이상의 온도에서 일어난다).
본 발명의 또다른 양태에서, 미소유체 채널은 검출 영역의 하류에 "밸브"를 포함하기 때문에, 이러한 "밸브"를 관통하는 DNA 샘플 플러그를, 예를 들어 폐기용 웰 내로 흡인시킬 것인지, 아니면 DNA 서열 분석용 칩을 사용하여 추가 분석용으로 선별할 것인지에 관한 결정을 할 수 있다.
따라서 본 발명은 1개 이상의 시퍼; 1개 이상의 미소유체 인라인 반응 채널에 연결된 1개 이상의 유체 저장고 (여기서, 1개 이상의 미소유체 인라인 반응 채널은 시약 어셈블리 영역, 증폭 영역, 및 검출 영역을 관류하고, 1개 이상의 미소유체 인라인 반응 채널은 검출 영역의 하류에 밸브를 추가로 포함한다); 및 상기 미소유체 인라인 반응 채널 내에서의 유체 이동 및/또는 그의 가열을 위한 1종 이상의 미량 금속을 포함하는 미소유체 장치를 제공한다.
본 발명은 또한, 1개 이상의 시퍼; 1개 이상의 미소유체 인라인 반응 채널에 연결된 1개 이상의 유체 저장고 (여기서, 1개 이상의 미소유체 인라인 반응 채널은 시약 어셈블리 영역, 제1 온도-제어 영역 내의 증폭 영역, 및 제2 온도-제어 영역 내의 검출 영역을 관류하고, 1개 이상의 미소유체 인라인 반응 채널은 검출 영역의 하류에 밸브를 추가로 포함한다); 및 상기 미소유체 인라인 반응 채널 내에서의 유체 이동 및/또는 그의 가열을 위한 1종 이상의 미량 금속을 포함하는 미소유체 장치를 제공하는데, 증폭된 DNA 생성물의 검출은 하나 이상의 온도에서 일어날 수 있다.
부가적으로, 본 발명은 본 발명의 미소유체 장치 내에서의 유체 이동, 본 발명의 미소유체 장치의 제1 및 제2 온도-제어 영역의 가열 및 냉각, 및 본 발명의 미소유체 장치로부터의 데이타 획득을 제어할 수 있는 기기 (즉, 제어기/검출기)에 관한 것이다. 따라서 본 발명은 본 발명의 미소유체 장치와 기기 간의 계면에 있는 카트리지를 포함하는, 본 발명의 미소유체 장치 내에서의 유체 이동을 제어하고, 본 발명의 미소유체 장치의 가열 및 냉각을 제어하며, 이러한 장치로부터의 데이타 획득을 제어하는 기기를 제공한다. 한 양태에서, 상기 기기는 제2 온도-제어 영역 내의 증폭된 생성물을 확립, 모니터링, 제어 및 검출한다. 본 발명의 또다른 양태에서, 상기 기기는 밸브에 있는 샘플 플러그를 폐기용 웰로 향하게 할 것인지, 아니면 추가 분석 (예: 서열 분석)용으로 선별할 것인지를 결정할 수 있다.
당업자는 상기 언급된 장치와 기기는 고 처리능력 자동화 인라인 PCR에 유용할 뿐만 아니라 고 처리능력 자동화 인라인 파형 프로파일링 및/또는 임의의 추가 분석 방법, 예를 들어 DNA 서열 분석에 유용할 것이란 사실을 인식할 것이다.
본 발명의 미소유체 장치와 기기는 협력하여 PCR 및 파형 프로파일링 방법 중의 어느 한 가지 방법 또는 두 가지 방법 모두와, 임의로는 예를 들어, 서열 분석을 위한 자동화 인라인 플랫폼을 제공하고자 한다. 따라서 본 발명은 또한, 본 발명의 미소유체 장치와 본 발명의 기기를 포함하는 기구를 제공한다. 또한, 이러한 기구는 본 발명의 미소유체 장치와 기기 간의 계면에 있는 카트리지를 추가로 포함할 수 있는데; 이러한 카트리지는 당해 분야에 널리 공지되어 있다.
부가적으로, 본 발명은 파형 프로파일링의 개선 방법 [이는 본원에서 집합적으로 단일 게놈 프로파일링 (SGP)으로서 지칭된다]에 관한 것이다. SGP하기 위해서는, 몇개의 별개의 "SGP 핵산 중합체"를 증폭시키기 위한 프라이머 ("SGP 프라이머")를 사용해야 한다. SGP 프라이머는 일정 길이의 게놈 DNA를 따라 몇개의 별개의 부위와 특이적으로 결합할 수 있는 능력과 그들의 길이를 특징으로 한다. SGP 프라이머는 비특이적 안정화 부분을 포함하지 않기 때문에, SGP 핵산 중합체 (예를 들어, 단일 가닥 게놈 DNA 주형 상의 몇개의 별개의 SGP 프라이머 결합 부위와 결합된 본 발명의 SGP 프라이머로부터 연장됨)는 후속 증폭 반응에서 SGP 프라이머와 자유로이 결합한다. SGP 프라이머는 일정 길이의 단일 가닥 SGP 핵산 중합체를 따라서 상보적 뉴클레오티드 서열과 특이적으로 결합할 수 있기 때문에, SGP 프라이머는 몇개의 별개의 "SGP-SGP 핵산 중합체" (이들 각각은 SGP 프라이머 결합 부위에 의해 일괄되는 게놈 DNA의 몇개의 영역 중의 하나의 서열과 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는데, 즉 각 SGP-SGP 핵산 중합체 서열은 그의 5' 말단에 SGP 프라이머의 서열을 갖고 있고 그의 3' 말단에 SGP 프라이머의 역배향 상보체를 갖는다)를 증폭시킬 수 있는 (변형된 PCR 버젼, 즉 "mPCR"에서의) 정배향 프라이머와 역배향 프라이머 둘 다로서 기능하기도 한다. 결과적으로, SGP 프라이머의 뉴클레오티드 서열과 SGP 프라이머의 역배향 상보체 서열을 포함하는 몇개의 별개의 SGP- SGP 핵산 중합체의 증폭은 기하급수적 (비선형) 방식으로 일어나고, 심지어 유기체가 소량 (소수)으로 존재하는 경우일지라도 본 발명을 사용하여 이러한 유기체의 게놈 DNA를 검출 및 확인 (분류)할 수 있게 해준다. 당업자는 RNA에 의거한 게놈 (예를 들어, 레트로바이러스로부터 유래됨) 상에서 본 발명을 실시하는데 있어서, SGP 및 이와 연관된 mPCR 주기를 시작하기에 앞서 역전사 반응을 수행해야 한다는 것을 인식할 것이다.
본 발명은 또한, 최종 증폭 단계와 연관된 "하프-타임 (half-time) 연장 단계"를 제공한다. 본 발명에서 최종 증폭 단계와 연관된 연장 단계에 대한 시간의 길이는 시간 단축 (바람직하게는, 시간 길이 단축이 대략 40 내지 60％이고; 보다 바람직하게는, 시간 길이 단축이 대략 50％이다)을 포함하므로, 최종 증폭 주기에서 "하프-타임" 연장 단계가 된다. 이러한 하프-타임 연장 단계는 전형적으로, 많은 SGP-SGP 핵산 중합체의 기하급수적 증폭을 없애줄 것인데, 이는 핵산 중합체가 SGP 프라이머에서부터 SGP 프라이머의 역배향 상보체까지 연장되기에는 시간이 불충분할 것이기 때문이다. 따라서, SGP 핵산 중합체의 단축형 버젼 ("단축형 SGP 핵산 중합체")는 하프-타임 단계에서 SGP-SGP 핵산 중합체로부터 생성될 것이다. 당업자는 변형된 PCR 버젼, 즉 mPCR을 이용하여 기하급수적 증폭을 여러 주기 수행한 후 하프-타임 연장 단계를 수행함으로써, 상기 단축형 SGP 핵산 중합체 각각의 많은 카피를 생성시킬 수 있다는 것을 인식할 것이다. 부가적으로, 후속 변성 단계 동안, 단축형 SGP 핵산 중합체는 단일 가닥이 될 것이다. 궁극적으로, 상기 단축형 단일 가닥 SGP 핵산 중합체는 보다 고 차수의 구조물을 형성하는데, 이는 mPCR을 이용하여 본 발명을 실시하는 데에서 검출된다.
본 발명은 또한, 개선 방법에 사용된 프라이머, 이들 프라이머의 제조 방법 뿐만 아니라 기하급수적 증폭을 활용하고 파형 프로파일링 방법의 변동성을 저하시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 오염성 유기체의 존재 또는 부재를 알아보기 위해 특정 샘플, 또는 일련의 샘플을 지속적으로 모니터링하고, 오염성 유기체를 후속 및 임의로 분류하는 방법을 제공한다. 이러한 본 발명의 방법에서, 본 발명의 자동화 인라인 플랫폼을 사용하여 특정 유기체로부터 단리한 게놈 물질을 제조 (예를 들어, 단리, 처리, 반응 시약과의 혼합 등), 증폭 (예를 들어, PCR, 파형 프로파일링 등에 의함) 및 검출 (예를 들어, 스크리닝, 확인, 증폭)하고/하거나 추가 분석 (예: 서열 분석)용으로 임의 선별한다. 일반적으로, 본 발명의 기구를 사용하는 방법은, 존재하는 경우 샘플 중의 유기체로부터 게놈 물질을 단리하는 단계; 시퍼를 이용하여 샘플로부터의 샘플 소적을 본 발명의 장치의 미소유체 인라인 반응 채널 내로 흡인시키는 단계; 및 샘플 소적을 프라이머 플러그와 혼합하여 샘플 플러그를 형성시키는 단계를 포함한다. 이어서, 샘플 플러그는 미소유체 인라인 반응 채널을 따라 본 발명의 미소유체 장치의 증폭 영역, 즉 제1 온도-제어 영역 내로 유동하는데, 여기서 샘플 플러그를 대상으로 하여 변성, 어닐링 및 연장을 포함하는 1회 이상의 증폭 주기를 수행한다. 이어서, 샘플 플러그는 본 발명의 미소유체 장치의 검출 영역 (이는 제2 온도-제어 영역일 수도 있다)에 유입된다. 파형 프로파일링을 사용하는 양태에서는 이러한 검출 영역이 제2 온도-제어 영역이기도 하므 로, 각 샘플 플러그의 검출가능한 작용제가 제1 온도와 제2 온도 사이의 온도에서 검출됨에 따라 각각의 증폭된 DNA 샘플 플러그가 제1 온도에서부터 제2 온도로 변할 수 있게 된다. 본 발명의 몇몇 양태에서는, 샘플 플러그가 불혼화성 비수성 유체 (예: 광유)에 의해 둘러싸여 있는데, 이는 오염 (예: 교차-오염)을 추가로 방지하기 위해 흡인되기 때문이다.
따라서, 한 양태에서 본 발명은 (a) 유기체를 결정할 샘플을 획득하는 단계; (b) 상기 샘플 중에 유기체의 게놈 DNA의 1개 이상의 카피가 존재하는 경우에는 상기 카피를 단리하는 단계; (c) SGP 프라이머, 뉴클레오티드, DNA 폴리머라제 및 삽입제를 포함하는 제1 혼합물을 상기 유기체의 게놈 DNA에 도입하여 제2 혼합물을 형성시키는 단계; (d) 게놈 DNA가 존재하는 경우에는 상기 제2 혼합물을, 게놈 DNA가 제1 게놈 DNA 주형 및 제2 게놈 DNA 주형으로 변성되는 제1 온도로 가열하는 단계; (e) 상기 제2 혼합물을, 상기 프라이머가 각각의 게놈 DNA 주형과 어닐링되는 제2 온도로 냉각시키는 단계; (f) 상기 제2 혼합물을, 제1 온도와 제2 온도 사이의 제3 온도로 재가열하여 상기 프라이머가 게놈 DNA와 어닐링된 상태로 유지되고 DNA 폴리머라제가 상기 어닐링된 프라이머로부터 유래되는 핵산 중합체를 연장시키도록 하는 단계; (g) 상기 제3 온도를 제1 시간 동안 유지시키는 단계; (h) 단계 (d) 내지 (g)를 1회 이상 반복하는 단계; (i) 단계 (d) 내지 (f)를 반복하는 단계; (j) 상기 제3 온도를, 제1 시간의 약 40 내지 60％ 길이인 제2 시간 동안 유지시키는 단계; (k) 제2 혼합물을 제2 온도보다 낮거나 동일한 제4 온도로 재냉각시켜서, 삽입제를 함유하는 보다 고 차수의 구조물이 형성되도록 하는 단계; (l) 이로써 생성 되는 보다 고 차수의 구조물을 검출하는 단계; (m) 융점 분석을 수행하는 단계; (n) 파형 프로파일을 검출하는 단계; 및 (o) 샘플이 해당 유기체를 함유하는 경우에는 샘플로부터 양성 파형 프로파일을 결정하는 단계를 포함하는, 샘플 중의 유기체를 결정하는 방법을 제공한다. 또다른 양태에서, 제3 온도는 제1 시간의 약 40 내지 60％ (예: 50％) 길이인 제2 시간 동안 유지시킨다. 또다른 양태에서는, 단계 (h)에서 반복되는 단계 (d) 내지 (g)의 반복 횟수가 20 내지 50회 (예: 22 내지 24회)이다. 또다른 양태에서, 상기 방법은 단계 (k)에 앞서 단계 (i) 내지 (j)를 1회 이상 반복하는 것을 추가로 포함한다.
따라서, 본 발명은 (a) 유기체의 존재 또는 부재를 검출할 샘플을 획득하는 단계; (b) 상기 샘플 중에 유기체의 게놈 물질의 1개 이상의 카피가 존재하는 경우에는 상기 카피를 단리하는 단계; (c) 1개 이상의 샘플 소적을 미소유체 반응 채널 내로 흡인시키는 단계; (d) 1개 이상의 샘플 소적을 프라이머 플러그와 혼합하여 1개 이상의 샘플 플러그를 형성시키는 단계 (상기 프라이머 플러그는, 예를 들어 증폭 시약을 포함한다); (e) 게놈 DNA가 존재하는 경우에는 상기 1개 이상의 샘플 플러그를 게놈 DNA의 각 카피가 제1 게놈 DNA 주형 및 제2 게놈 DNA 주형으로 변성되는 제1 온도로 가열하는 단계; (f) 상기 1개 이상의 샘플 플러그를, 상기 프라이머 플러그 중의 프라이머가 각각의 게놈 DNA 주형과 어닐링되는 제2 온도로 냉각시키는 단계; (g) 상기 1개 이상의 샘플 플러그를, 제1 온도와 제2 온도 사이의 제3 온도로 재가열하여 상기 프라이머가 게놈 DNA와 어닐링된 상태로 유지되고 DNA 폴리머라제가 상기 어닐링된 프라이머로부터 유래되는 핵산 중합체를 연장시키도록 하 는 단계; (h) 상기 제3 온도를 제1 시간 동안 유지시키는 단계; (i) 단계 (e) 내지 (h)를 1회 이상 반복하는 단계; 및 (j) 이로써 생성되는 모든 증폭된 생성물을 검출하는 단계를 포함하는 [적어도 단계 (c) 내지 (j)는 본 발명의 기구 내에서 일어난다], 샘플 중의 유기체의 존재 또는 부재를 검출하는 방법을 제공한다. 또다른 양태에서, 상기 방법은 단계 (i) 이후 및 단계 (j) 이전에, (1) 단계 (e) 내지 (g)를 반복하는 단계; (2) 상기 제3 온도를, 제1 온도 길이의 약 40 내지 60％인 시간 동안 유지시키는 단계; 및 (3) 상기 1개 이상의 샘플 플러그를, 제2 온도보다 낮거나 동일한 제4 온도로 냉각시켜서, 삽입제를 함유하는 보다 고 차수의 구조물이 형성되도록 하는 단계를 추가로 포함한다. 본 발명의 또다른 양태에서, 단계 (i)의 검출 단계는 하나의 온도에서 일어난다. 본 발명의 또다른 양태에서, 단계 (i)의 검출 단계는 소정 범위의 온도에서 일어난다. 본 발명의 또다른 양태에서, 상기 방법은 추가 분석용으로 DNA 샘플 플러그를 선별하는 마지막 단계를 추가로 포함하는데, 이러한 선별 단계는 본 발명의 기구 내의 밸브에서 일어난다. 당업자는 상기 언급된 양태에서의 검출 단계로 인해, 샘플 내에 존재하는 DNA를 스크리닝, 정량화, 확인, 및/또는 추가 분석용으로 임의 선별할 수 있다는 것을 인식할 것이다.
따라서 본 발명은 샘플 공급원으로부터의 샘플 소적을 1개 이상의 미소유체 인라인 반응 채널 내로 지속적으로 흡인시키는 단계; 각 샘플 소적을 프라이머 플러그와 혼합하여 샘플 플러그를 형성시키는 단계; 게놈 물질을 포함하는 샘플 플러그 중의 DNA를 증폭시키는 단계; 및 증폭된 DNA 생성물의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함하는 (이들 단계는 본 발명의 기구 내에서 일어난다), 오염 판단을 위해 샘플 공급원을 스크리닝하는데 본 발명의 기구를 사용하는 방법을 제공한다. 이러한 본 발명의 양태에서, 증폭된 DNA 생성물이 지속적으로 부재하는 것은 (즉, 제로-검출) 깨끗한 샘플 공급원의 지표이다. 이와는 달리, 증폭된 생성물이 존재하는 것은 오염된 샘플 공급원의 지표이다.
본 발명은 또한, (a) 특정 유기체로부터 단리한 DNA 분자를 포함하는 1개 이상의 DNA 샘플 소적을 제조하는 단계; (b) 샘플로부터의 1개 이상의 DNA 샘플 소적을 1개 이상의 미소유체 반응 채널 내에 획득하는 단계; (c) 상기 1개 이상의 DNA 샘플 소적을 프라이머 플러그와 혼합하여 1개 이상의 DNA 샘플 플러그를 형성시키는 단계 (상기 프라이머 플러그는 1종 이상의 공지된 제1 프라이머를 포함한다); (d) 1개 이상의 DNA 샘플 플러그로 1회 이상의 증폭 주기를 수행하여, 1개 이상의 DNA 샘플 플러그가 검출가능한 증폭된 DNA 생성물을 갖도록 하는 단계; (e) 증폭된 DNA 생성물을 검출하는 단계; (f) 증폭된 DNA 생성물의 검출에 근거하여 유기체를 확인하는 단계; 및 (g) 유기체 확인의 정확도를 증가시키기 위해 제1 공지된 프라이머와는 상이한 공지된 프라이머를 포함하는 증폭 시약을 사용하여 단계 (a) 내지 (f)를 임의로 반복하는 단계를 포함하는 [단계 (b) 내지 (e)는 본 발명의 기구 내에서 일어난다], 본 발명의 기구를 사용하여 유기체를 확인하는 방법을 제공한다. 본 발명의 한 양태에서, 증폭된 DNA 생성물을 검출하는 것은 이러한 DNA가 단리되는 유기체를 확인시켜 주는데, 이는 특정 유기체의 실체를 확정시켜 주는 프라이머를 선택하였기 때문인데, 예를 들어 특별한 유기체의 게놈 DNA와 특이적으로 결합 하는 특이적 TAQMAN® 프라이머를 선택할 수 있기 때문에, 상기 언급된 방법(들)을 사용하여 증폭된 생성물을 검출하는 것이 해당 유기체의 실체를 확정시켜 준다. 또다른 양태에서, 본 발명의 파형 프라이머 또는 SGP 프라이머를 사용하고, 검출된 파형 프로파일은 유기체의 실체를 제공해준다.
본 발명은 또한, 샘플 공급원 중의 오염 수준, 즉 샘플 중의 게놈 물질의 농도를 정량화하는 방법을 제공한다. 본 발명의 기구를 사용하는 본 발명의 정량화 방법은 (a) 게놈 물질의 농도가 샘플 소적 당 대략 최대 1개 분자가 되도록 하는 희석 인자를 이용하여 샘플을 희석시키는 단계; (b) 샘플로부터의 샘플 소적을 1개 이상의 미소유체 반응 채널 내에 획득하는 단계; (c) 각 샘플 소적을 프라이머 플러그와 혼합하여 1개 이상의 샘플 플러그를 형성시키는 단계; (d) 각 샘플 플러그로 증폭 주기를 수행하여, DNA 분자를 포함하는 각 샘플 플러그가 검출가능한 증폭된 DNA 생성물을 갖도록 하는 단계 (DNA 분자를 포함하지 않는 각 샘플 플러그는 증폭된 DNA 생성물을 갖지 않을 것이다); (e) 각 샘플 플러그 중 증폭된 DNA 생성물의 존재 또는 부재를 검출하는 단계; (f) 증폭된 생성물을 포함하는 샘플 플러그 대 제로-검출된 샘플 플러그의 비율을 결정하는 단계; 및 (g) 상기 희석 인자를 이용하여, 샘플 중의 오염성 DNA의 본래 농도를 계산하는 단계를 포함한다 [적어도 단계 (b) 내지 (e)는 본 발명의 기구 내에서 일어난다].
게놈 물질의 서열을 분석하는 것은 특정 유기체를 분류하는 확정적 방법이다. 따라서 본 발명의 또다른 목적은, 예를 들어 상기 언급된 본 발명의 방법을 사용하여 분석한 게놈 물질에 관한 상세한 서열 정보를 제공할 수 있도록, 게놈 물질을 추가로 분석시킬 수 있는 본 발명의 기구를 사용하는 방법을 제공하는 것이다. 결과적으로, 본 발명은 본 발명의 미소유체 장치의 시약 어셈블리 영역, 증폭 영역 및/또는 검출 영역을 횡단한 DNA 샘플 플러그를, 추가 서열 분석용으로 임의 선별할 수 있는 방법을 제공한다. 선별 공정은 본 발명의 미소유체 장치의 "밸브"에서 일어날 것이다. 선별시, 본 발명의 미소유체 장치의 밸브는 선별된 DNA 샘플 플러그(들)가 서열 분석용 장치 (예: DNA 서열 분석용 칩)로 옮겨가도록 할 수 있다.
또다른 양태에서, 본 발명은 샘플 플러그(들)를 불혼화성 비수성 유체로 둘러싸는 단계를 추가로 포함하는 본 발명의 방법을 제공한다.
도 1: (A) 샘플 소적이 제조되고 (예를 들어, 여과, 추출, 희석되는 등), 본 발명의 미소유체 장치의 미소유체 인라인 반응 채널 내로 흡인되며, 증폭 시약과 혼합되어 상기 장치의 시약 어셈블리 영역 내에 샘플 플러그를 형성시키는 경로; 및 (B) 샘플 소적이 본 발명의 미소유체 장치의 증폭 영역, 즉 제1 온도-제어 영역 내에서 증폭되는 경로를 묘사한 다이아그램.
도 2: 본 발명의 미소유체 장치의 제1 온도-제어 영역을 통과한 후 (도 1B), (A) 본 발명의 미소유체 장치의 검출 영역, 즉 제2 온도-제어 영역을 관통하고 적어도 제1 및 제2 온도를 적용시킨, 미소유체 인라인 반응 채널 중의 샘플 플러그 경로; 및 (B) 폐기되든지 아니면 추가 분석용으로 선별되는, 미소유체 인라인 반응 채널 중의 샘플 플러그 경로를 묘사한 다이아그램.
도 3: 파형 프로파일링 방법 및 단일 게놈 프로파일링 방법의 단계들과, 이들 방법으로부터 생성된 핵산 중합체를 묘사한 플로우 다이아그램 (도 3A, 3B 및 3C).
도 4: 이론적 게놈 DNA의 뉴클레오티드 서열.
도 5: 각각의 변성된 단일 가닥 게놈 DNA 주형 상의 프라이머 결합 부위와 어닐링시킨 이론적 프라이머를 사용하여, 2개의 단일 가닥 게놈 DNA 주형 (도 5A 및 5B)으로 변성시킨 도시된 도 4의 게놈 DNA; 화살표는 SGP 핵산 중합체가 유래될 각 게놈 DNA의 영역을 나타낸다.
도 6: 게놈 DNA와 도 5의 프라이머를 사용하여 생성시킬 SGP 핵산 중합체 각각의 서열.
도 7: 도 6의 SGP 핵산 중합체를 mPCR 증폭시킨 후 생성될 SGP-SGP 핵산 중합체 각각의 서열.
도 8: 도 7의 SGP-SGP 핵산 중합체를 대상으로 하여 하프-타임 연장 단계를 수행한 후 생성될 단축형 SGP 핵산 중합체 (밑줄쳐져 있음)와 SGP-SGP 핵산 중합체 (밑줄쳐져 있지 않음)의 서열.
본 발명은 미소유체 장치 내에서의 유체 이동, 이의 가열 및 냉각, 및 이러한 기구로부터의 데이타 획득을 제어하는 기기와, 미소유체 장치를 포함하는 기구를 제공한다. 본 발명의 기구는 샘플 중의 유기체(들)를 검출 및/또는 분류할 목적으로 유기체로부터 게놈 물질을 제조 (예를 들어, 단리, 처리, 반응 시약과의 혼합 등), 증폭 (예를 들어, PCR 및 파형 프로파일링 방법 중의 어느 한 가지 방법 또는 두 가지 방법 모두에 의함), 검출 (즉, 스크리닝, 정량화, 확인)하고/하거나 추가 분석 (예: 서열 분석)용으로 임의 선별할 수 있는 자동화 인라인 플랫폼으로서 사용할 수 있다.
부가적으로, 본 발명은 본 발명의 기구 및 이와 함께 사용된 방법을 소량의 출발 DNA 상에서 수행할 수 있도록 하기 위한, 파형 프로파일링 방법에 대한 개선안을 제공한다. 이러한 파형 프로파일링 방법에 대한 개선안은 변형된 PCR 버젼을 달성시켜 주는, 즉 DNA를 기하급수적으로 증폭시켜 주는 개선된 프라이머를 포함한다. 파형 프로파일링 방법에 대한 개선안은 또한, 변형된 PCR 버젼 (즉, mPCR)에 의해 형성된 핵산 중합체의 일부로부터 유래된 일련의 단축형 단일 가닥 핵산 중합체를 생성시킬 수 있는 증폭 과정 중의 하프-타임 연장 단계를 포함한다. 당업자는 상기 파형 프로파일링 방법에 대한 개선안으로, 유기체가 소량으로 존재하는 경우, 예를 들어 급수원의 오염 발생시 샘플 중에 존재하는 유기체의 수가 적은 경우일지라도, 이러한 유기체를 검출 및/또는 분류할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 따라서, 본 발명은 공기, 먼지, 물, 혈액, 조직, 식물, 및 식료품을 포함하지만 그에 제한되지 않는 유기체로 오염될 수도 있는 많은 공급원 (예: 환경적 및 의학적)과 관련된 품질 보증을 제공하는 데에 있어 도움을 줄 개선된 파형 프로파일링 방법을 제공한다.
부가적으로, 본 발명은 특정 유기체의 DNA를 제조 (예를 들어, 단리, 처리, 반응 시약과의 혼합 등), 증폭 (예를 들어, PCR, 파형 프로파일링 등에 의함), 검출 (예를 들어, 스크리닝, 확인, 정량화)하고/하거나 추가 분석 (예: 서열 분석)용으로 임의 선별하기 위해 본원에 기재된 기구를 사용하는 방법을 제공한다. 한 양태에서, 본 발명은 고 처리능력 자동화 인라인 파형 프로파일링하는 방법을 제공함으로써, 파형 프로파일링 방법, 예를 들어 본원에 기재된 개선 방법을 본원에 기재된 바와 같은 자동화 인라인 파형 프로파일링 플랫폼을 이용하여 수행한다. 당업자는 본 발명이 단일 게놈, 또는 소수의 게놈을 증폭 및 검출하는 것을 포함한다는 사실을 인식할 것이다.
I. 본 발명의 자동화 인라인 플랫폼
지난 수 년간, 상기 언급된 바와 같은 자동화 인라인 PCR 플랫폼은 기존의 각종 형광성 "믹스 앤 리드 (mix-and-read)" 생화학 [예: TAQMAN®, Molecular Beacons, Epoch Eclipse Probes, and Allele Specific Amplification]과 화합성이도록 개발되어 왔다. 현재까지는, PCR과 함께 사용하도록 개발된 자동화 인라인 플랫폼이 또한 파형 프로파일링과도 함께 사용할 수 있는 것으로 공지되지 않았다. 부가적으로, DNA 샘플 증폭 후 이러한 DNA 샘플의 추가 분석 (예: 서열 분석)용으로 기존에 분석된 게놈 물질을 선별할 수 있게 해주는 자동화 인라인 플랫폼은 공지되어 있지 않다. 본 발명은 이러한 플랫폼을 제공한다. 본 발명의 자동화 인라인 플랫폼, 즉 PCR 및 파형 프로파일링 방법 중의 어느 한 가지 방법 또는 두 가지 방법 모두에 의해 증폭시킨 DNA 생성물을 생성 및 검출할 수 있는 미소유체 장치, 및 이러한 장치 내에서의 유체 이동, 이의 가열 및 냉각, 및 미소유체 장치로부터의 데이타 획득을 제어할 수 있는 기기를 포함하는 기구가 다음에 기재되어 있다. 또한, 상기 기구는 본 발명의 미소유체 장치와 기기 간의 계면에 있는 카트리지 (또는 유사한 장치, 또는 유사한 기능을 수행하는 장치)를 추가로 포함할 수 있는데; 이러한 카트리지는 당해 분야에 널리 공지되어 있다.
A. 본 발명의 미소유체 장치
도 1 및 2는 본 발명의 장치를 도식적으로 제공한 것이고, 통상적으로 몇 가지 상이한 목적, 예를 들어 게놈 DNA를 스크리닝, 확인, 정량화 및/또는 추가 분석 (예: 서열 분석)하기 위해 사용할 수 있는, 샘플 플러그 제조 (도 1A), 증폭 (도 1B), 검출 (도 2A) 및 선별 (도 2B) 공정을 묘사하고 있다.
1. 샘플 플러그 제조
도 1A는 샘플 플러그의 제조 공정을 묘사하고 있다. 간략하게 설명하면, 샘플 용기 (1)로부터 시험하고자 하는 샘플을, 유기 세포를 수집하고 잡다한 물질을 제거하기 위한 여과 기구 (2)에 송부한다. 샘플 액체 중에 수집된 유기 세포를 추출기 (3)에 송부하여, 예를 들어 바이러스, 세균, 게놈 물질 등을 단리할 수 있다 (예를 들어, 세포막, 세포 소기관, 히스톤, 부스러기 등을 제거함). 게놈 물질을 단리한 후, 샘플 액체와 분리된 모든 게놈 물질을 농도 조정기 (4)로 송부하여 게놈 물질의 농도를 조정할 수 있다. 농도 조정기 (4)로부터의 샘플 액체를 미소유체 인라인 반응 채널 (5) 내로 흡인시키고, 예를 들어 T자형 연접부 (7)에서 액체 캐리어 (6)와 혼합하여, 게놈 물질 (예를 들어, 1종 이상의 게놈 DNA 분자)를 포함하거나 포함하지 않을 수 있는 샘플 소적 (8)을 형성시킬 수 있다.
샘플 플러그 제조 공정의 일부로서, 프라이머 기구 (9)는 DNA 증폭과 임의 검출을 위해 필요한 시약을 포함하는 액체 캐리어 중에 일련의 프라이머 플러그를 생성시킨다. 각 프라이머 플러그를 또다른 연접부, 예를 들어 T자형 연접부 (10)에서 샘플 소적 (8)과 합하여 샘플 플러그를 형성시키고 샘플 플러그 제조 공정을 완료한다.
당업자는 본 발명의 자동화 인라인 플랫폼을 사용하여 많은 유형의 샘플을 시험할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 이러한 샘플에는 물, 공기, 먼지, 식품, 및 생물학적 샘플, 예를 들어 체액 (예: 타액, 전혈, 혈장, 뇨 등), 세포 (예: 완전 세포, 세포 분획 및 세포 추출물) 및 조직이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 생물학적 샘플에는 또한, 조직 박편 (예: 생검) 및 조직학적 목적을 위해 취한 동결 박편이 포함된다. 바람직한 생물학적 샘플에는 혈액, 혈장, 림프, 조직 생검, 뇨, CSF (뇌척수액), 활액, 및 BAL (기관지폐포 세척)이 포함된다.
시험하고자 하는 샘플은 수 많은 방식으로 수집할 수 있다. 예를 들어, 급수원의 순도를 모니터링하는 경우에는, 세균 등을 포획하도록 설계된 여과기로부터 모든 게놈 물질을 단리함으로써 몇몇 한정된 간격 (매시간, 12시간 마다 등)에서 급수원과 병행해서 가동하는 여과 시스템을 검사할 수 있다. 이러한 여과 시스템은 보다 민감한 검출을 위해 급수원에 존재하는 세균을 농축시킬 것이다. 또다른 한편으론, 샘플을 여과 및/또는 농축없이 급수원으로부터 직접 취할 수도 있다. 기타 샘플 공급원에 관해서는, 예를 들어 세균을 포획하는 공기 여과 시스템을 이용할 수 있는데; 이러한 여과기 상에 포획된 물질을 용액에 놓아 두어 분리 과정을 시작할 수 있을 것이다. 기타 유형의 샘플에 대해서는, 부가 단계가 필요할 것인데, 예를 들어 혈액 샘플 중의 세균을 검출하기 위해 본 발명을 사용하는 데에 관여한 초기 과정의 일부는, 게놈 물질을 함유하는 인간 혈액 성분으로부터 세균을 격리시킬 것을 요구한다. 이들 예시 샘플 및 기타 많은 샘플로부터 세균 및/또는 바이러스 게놈 물질을 단리하기 위한 많은 기술이 당해 분야에 널리 공지되어 있다.
샘플 중에 함유된 모든 게놈 물질을 단리하는 것은 당업자에게 공지된 수 많은 기술을 통하여 달성할 수 있다. 이러한 단리 과정은 게놈 물질을 단리하고 포획할 수 있는 능력이 큰 기술이어야 하는데, 이는 본 발명의 특정 양태에서는 게놈 물질을 전혀 포함하지 않는 샘플 플러그가 1개 게놈 정도로 극히 적게 포함하는 샘플 플러그와 구별되기 때문이다. 급수원에 존재하는 세균으로부터의 완전한 DNA 게놈은 당해 분야에 널리 공지된 기술 [예를 들어, 이러한 일련의 기술들 중의 한 가지가 엑스트라나, 인코포레이션 (Xtrana, Inc.; Broomfield, CO)로부터 입수 가능하다]를 사용하여 단리할 수 있다.
엑스트라나는 다음 3가지 샘플 세트에 대한 상이한 기술을 개발하였다: (A) 전혈, 연막, 볼 면봉, 및 세균 이. 콜라이 (E. coli)로부터의 게놈 DNA; (B) 조직 배양 세포로부터의 RNA; 및 (C) 조직 배양 세포, 설치류 꼬리, 완전 조직, 혈액 염색, 및 효모로부터의 게놈 DNA. 간략하게 언급하면, XtraBind (공급처: Xtrana, Inc.)로 피복시킨 플라스틱 마이크로비드 샘플에 전기양성의 친수성 매트릭스를 부가하면, 서열 비의존적이고 본질적으로 비가역적인 방식으로 RNA 또는 DNA가 흡착된다. 당업자는 본원에 기재된 방법은 DNA 증폭 공정에 관한 것이기 때문에, 단리된 게놈 물질이 RNA인 경우에는 증폭에 앞서 이를 먼저 DNA (예: cDNA)로 역전사시켜야만 한다는 것을 인식할 것이다. 역전사 기술은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 바람직한 양태에서는, 특정 유기체의 전체 게놈 DNA를 단리한다.
게놈 DNA를 단리하는데 이용 가능한 기타 기술에는 다음 공급처로부터의 기술이 포함된다 [Qiagen NA (Qiagen, Venlo, Netherlands); MagNAPure (Roche, Nutley, NJ); KingFisher (Thermo Labsystems, Helsinki, Finland); 및 RevPrep Orbit (GeneMachines, San Carlos, CA)].
일단 게놈 DNA가 샘플로부터 단리되면, 샘플 액체 중의 그의 농도를 조정할 수 있다. 본 발명의 한 양태에서는, 샘플 소적이 단지 1개의 게놈 DNA 분자 (즉, 단지 1개 유기체로부터의 게놈 물질) 만을 포함하거나 게놈 물질을 전혀 포함하지않도록 농도를 조정한다. 또다른 양태에서는, 농도가 샘플 소적 당 약 0.5개 DNA 분자일 수 있다. 또다른 한편으론, 샘플 소적이 1개 초과 DNA 분자를 포함하게 될 확률(％)로써 농도를 표현할 수도 있다. 또다른 양태에서, 샘플 소적이 2개 이상의 DNA 분자를 포함하게 될 확률은, 예를 들어 3％ 미만이다.
샘플로부터 게놈 물질의 농도를 조정할 때, 샘플 액체를 미소유체 인라인 반응 채널 내로 반복적으로 흡인시켜 액체 캐리어의 연속적 샘플 소적을 형성시킨다. 바람직하게, 각 샘플 소적은 직경이 대략 100 ㎛인 미소유체 인라인 반응 채널 중에서, 예를 들어 길이가 약 100 ㎛이거나, 또는 대략 1 내지 2 nl이다. 이들 반복적 샘플 소적은 게놈 물질 (예: 게놈 DNA)을 포함하거나 포함하지 않을 수 있고; 이들이 게놈 물질을 포함하지 않는 경우에는 DNA 샘플 소적인 것으로 간주될 수도 있다. 부가적으로, 샘플 소적은 단리 과정에 사용된 모든 비드 (예: Xtrana 비드)를 포함할 수 있다. 또다른 한편, 단리 과정에 사용된 모든 비드는 샘플 소적의 흡인에 앞서 제거할 수도 있다.
일반적으로, 미소유체 인라인 반응 채널은 직경이 50 ㎛ 내지 300 ㎛일 수 있고, 전형적으로 직경이 100 ㎛이다. 미소유체 인라인 반응 채널은 유리, 석영 또는 플라스틱으로 형성시킬 수 있다. 미소유체 인라인 반응 채널을 형성시키는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 부가적으로, 당업자는 미소유체 인라인 반응 채널이 상이한 많은 경로를 취할 수 있다는 것을 인식할 것인데, 예를 들어 이는 직선일 수 있고, 합류 연접부에서 또다른 미소유체 인라인 반응 채널과 접합물 또는 연합물을 형성할 수 있으며, 별개의 연접부에서 2개 이상의 미소유체 인라인 반응 채널로 격리될 수 있고, 내부에 있는 유체가 풀링되고/되거나 혼합되도록 할 수 있으며, 본 발명의 장치의 영역에 따라서 상이한 물질과 함께 형성될 수 있는데, 예를 들어 미소유체 장치의 검출 영역 내에 있는 경우에는 투명한 물질과 함께 형성될 수 있다.
일반적으로, 액체 캐리어 (6)는 샘플 액체와 동일한 액체인 수계 액체이다. 부가적으로, 액체 캐리어는 유기계 액체, 예를 들어 약 60 포이즈 (poise)의 실리콘 오일, 또는 몇몇 기타 불혼화성 비수성 유체일 수 있다. 본 발명의 한 양태에서는, 반복적 샘플 소적을 미소유체 인라인 반응 채널 내로 흡인시키고, 완충제 스페이서는 샘플 소적을 격리시킨다. 바람직한 양태에서는, 불혼화성 비수성 유체 (예: 광유) 또는 몇몇 기타 소수성 물질을 완충제 스페이서로서 사용하고, 이를 시퍼에 의해 빨려 들어가는 각 샘플 소적에 가하거나 각 샘플 소적 사이에 가하여, DNA를 포함하거나 또는 DNA가 없는 각 샘플 소적을 둘러싸 이들이 본 발명의 미소유체 인라인 반응 채널을 통해 이동함에 따라 이를 바로 앞의 샘플 소적이나 바로 뒤의 샘플 소적으로부터 격리시킨다. 광유는 당업자에게 반복적 DNA 샘플을 격리시키기에 적당한 물질로서 공지되어 있다. 또한, 본 발명의 미소유체 장치의 미소유체 채널의 내부 벽을 불혼화성 비수성 유체 (예: 광유) 또는 몇몇 기타 소수성 물질로 처리할 수 있다. 소수성을 이용한 이러한 일련의 개선안은 샘플 소적들 간의 교차-오염을 저하시키거나 방지시켜 줄 것이다. 달리 말하면, 미소유체공학 고유의 운동에도 불구하고, 액체 캐리어와 완충제 스페이서 간의 소수성/친수성 차이로 인해, 단일 DNA 분자가 완충제 공간이나 인접한 소적 또는 플러그와 혼합되지 않으면서 미소유체 인라인 반응 채널을 따라 이동하는 동안 이러한 분자가 상기 소적 (8) 또는 플러그 내에 유지될 수 있다.
본 발명의 미소유체 장치에서는, 각 샘플 소적이 연접부, 예를 들어 T자형 연접부 (10)에서 추가로 제조되어, 이것이 증폭 시약 (예: 프라이머(들), 뉴클레오티드, 폴리머라제 등)과 임의의 검출 시약 (예: 검출가능한 작용제, 예를 들어 표지, 형광성 프로브, 삽입제 등)을 포함하는 프라이머 플러그와 혼합됨으로서 샘플 플러그를 형성한다. 당업자는 어떤 증폭 시약을 각 샘플 소적과 혼합해야 하고 얼마만큼의 시약 농도를 사용해야 하는지를 인식할 것이다. 예를 들어, 증폭 시약에는 전형적으로 폴리머라제, dNTPs, 마그네슘, 완충제, 및 프라이머 또는 프라이머 쌍이 포함된다. 당업자는 사용할 프라이머 또는 프라이머 쌍을 결정할 수 있을 것인데, 예를 들어 PCR에 관한 것이라면 당업자는 프라이머 쌍을 사용한다는 것을 알고 있을 것이다. 이와는 달리, 파형 프로파일링 분석을 수행하고자 하는 경우에는, 파형 또는 SGP 프라이머를 선택할 것이다. 이러한 프라이머의 설계 및 선별은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 부가적으로, 검출 시약과, 증폭된 DNA 생성물을 직접 또는 간접적으로 표지시키기 위해 상기 시약을 사용하는 방법은 널리 공지되어 있다.
샘플 소적을 미소유체 인라인 반응 채널 내로 흡인시키고, 교차-오염을 방지하기 위해 기타 샘플 소적으로부터 격리시키며, 이를 증폭 시약과 혼합하여 샘플 플러그를 형성시킨 후, 이는 미소유체 인라인 반응 채널을 따라 본 발명의 장치의 증폭 영역, 즉 제1 온도-제어 영역 내로 들어간다. 당업자는 샘플 소적과 유사하게, 샘플 플러그도 게놈 물질을 포함하거나 포함하지 않을 수 있고, 이것이 게놈 물질을 포함하는 경우에는 DNA 샘플 플러그로 간주될 수도 있다는 것을 인식할 것이다. 부가적으로, 당업자는 단지 DNA 샘플 플러그 만이 본 발명의 장치의 제1 온도-제어 영역 내에서 증폭될 DNA를 포함할 것이란 사실을 인식할 것이다.
2. DNA 샘플 플러그 중의 DNA를 증폭시킴
도 1B는 본 발명의 장치가, 샘플 플러그를 상기 언급된 바와 같이 제조한 후 이러한 샘플 플러그에 존재할 수도 있는 DNA를 어떻게 증폭시킬 수 있는지를 나타낸 비제한적 예를 제공한다. 샘플 플러그 (이는 프라이머 플러그와 합해진 샘플 소적을 포함한다)가 인라인 미소유체 반응 채널 (5)을 따라 지속적으로 빨려 들어감에 따라, 이들이 증폭 영역, 즉 예를 들어, 열 제어 판 (11)일 수도 있는 제1 온도-제어 영역 내로 도입된다. 미소유체 인라인 반응 채널의 경로 (12)는 각 샘플 플러그가 열 제어 판 (11)의 저온 영역 (13)과 고온 영역 (14) 사이를 나선식으로 왕복 운동하는 방식으로 이동하도록 해줄 수 있다.
당업자는 1) 저온 영역 (13), 고온 영역 (14), 및 저온 영역과 고온 영역 사이 영역의 온도, 2) 미소유체 인라인 반응 채널의 경로 (12), 및 3) 샘플 플러그가 미소유체 인라인 반응 채널을 통과하는 속도는 선택된 증폭 방법에 따라서 적당히 조정할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 예를 들어, 저온 영역 (13)은 어닐링을 달성하기에 적당한 온도로 설정할 수 있고, 고온 영역 (14)은 변성을 달성하기 위한 온도로 설정할 수 있다. 부가적으로, 미소유체 인라인 반응 채널의 경로 (12)는 변성, 어닐링 및 연장 대략 20 내지 40주기를 달성하기 위해 샘플 플러그가 저온 영역과 고온 영역 사이를 왕복 운동하는 방식으로 이동할 수 있도록 설계할 수 있다. 최종적으로, 샘플 플러그 (또는 DNA 샘플 플러그)가 미소유체 인라인 반응 채널 내로 유동하는 속도는 각 샘플 플러그 (또는 DNA 샘플 플러그)가 적당한 시간 동안 변성, 어닐링 또는 연장 온도에서 유지될 수 있도록 설정할 수 있다.
앞서 기재된 바와 같이, 각 미소유체 인라인 반응 채널, 또는 그의 일부를 또한, 국한되고/되거나 반복적인 방식으로 신속하게 가열 및 냉각시켜서, 샘플 플러그가 미소유체 인라인 반응 채널을 따라 본 발명의 장치의 제1 온도-제어 영역을 통하여 이동함에 따라 증폭 방법 [예를 들어, PCR, 파형 프로파일링, SGP (본원에 상세히 기재됨)]의 변성, 어닐링 및 연장 단계가 수행되도록 할 수 있다. 예를 들어, 줄 가열 방법 [참고: 예를 들어, 미국 특허 제5,965,410호 및 제6,670,153호]을 사용하여 본 발명의 장치의 각 미소유체 인라인 반응 채널과 십자로 교차하거나 또는 측면을 따라 전압을 미량 금속에 적용할 수 있다. 예를 들어, 온수, 공기 등을 사용하여 미소유체 인라인 반응 채널을 가열하는 대체 방법이 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 부가적으로, 미소유체 인라인 반응 채널 또는 그의 일부를 냉각시키는 것은 열 에너지를 가져가 버리기 위해 코일을 관통하여 이동하는 냉각 유체를 사용하거나 신속한 열 소산을 허용함으로써 달성할 수 있다. 가열 방법과 유사하게, 미소유체 인라인 반응 채널을 냉각시키는 대체 방법은 널리 공지되어 있다.
당업자는 본 발명의 기구를 사용하는 상이한 방법들, 예를 들어 스크리닝, 확인, 정량화 등에 대해 DNA의 증폭을 달성시키기 위해 DNA 샘플 플러그에 적용시켜야만 하는 온도, 이 온도에서의 유지 시간, 및 주기 수를 인식할 것이다. 예를 들어, 바람직한 양태에서는 변성 온도가 90 내지 95℃이고, 어닐링 온도가 55 내지 65℃이며, 연장 온도는 선택된 폴리머라제에 좌우된다 (예를 들어, 최적의 연장 온도는 Taq 폴리머라제의 경우에는 약 72℃이다). 또한, 당업자는 "핫 스타트 (hot start)"로 종종 PCR 증폭 방법을 시작하고, 모든 증폭 방법의 말기에 DNA 샘플 플러그를 75℃ 하에 최종적으로 항온 배양하는 것을 임의로 가할 수도 있다는 것을 인식할 것이다.
샘플 플러그는 초당 50 ㎛ 내지 초당 5000 ㎛의 범위 (예를 들어, 초당 500 ㎛)의 상이한 속도로 미소유체 인라인 반응 채널을 통해 이동할 수 있다. 당업자는 샘플 플러그가 미소유체 인라인 반응 채널을 통해 이동하는 속도를 다양하게 하여, 샘플 플러그가 특정 온도 (예를 들어, 변성, 어닐링, 연장 등에 요구되는 온도) 하에 유지되는 시간을 달성할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 예를 들어, 전형적인 사이클링 프로파일이 약 94℃ 하에서 1분, 60℃ 하에서 1분, 72℃ 하에서 1분 (72℃ 연장에 대한 전형적인 법칙은 증폭되는 각 1000개 염기 쌍에 대해 1분이다)이긴 하지만, 당업자는 샘플 플러그가 특정 온도 하에 유지되는 시간이 반응물의 용적, 게놈 DNA의 농도 등에 좌우되고, 결과적으로 타이밍은 본 발명의 미소유체 장치를 사용하는 경우의 전형적인 사이클링 프로파일과 상이할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 당업자는 각 온도에서 보다 단축된 기간도 충분할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 부가적으로, 당업자는 요구되는 증폭 주기 수를 달성하기 위해 미소유체 인라인 반응 채널에 요구되는 적당한 경로를 결정할 수 있을 것이다.
샘플 소적을 제조하고, 이를 미소유체 인라인 반응 채널 내로 흡인시키며, 교차 오염을 방지하기 위해 기타 샘플 플러그로부터 격리시키고, 증폭 시약과 혼합하여 샘플 플러그를 형성시키며, DNA 샘플 플러그 내의 DNA를 증폭시킨 후, 각 샘플 플러그를 미소유체 인라인 반응 채널을 따라 본 발명의 장치의 검출 영역 (이는 제2 온도-제어 영역일 수도 있다) 내로 구동시킨다. 당업자는 DNA 샘플 플러그 만이 검출가능한 증폭된 DNA 생성물을 포함할 것이란 사실을 인식할 것이다.
3. 증폭된 DNA 생성물의 존재 또는 부재를 검출함
본 발명의 미소유체 장치는 (1) DNA가 샘플 소적으로서 미소유체 인라인 반응 채널 내로 흡인될 수 있고, (2) 샘플 소적을, 증폭 반응 성분 및/또는 검출 성분을 포함하는 프라이머 플러그와 혼합하여 시약 어셈블리 영역에서 샘플 플러그를 형성시키며, (3) DNA 샘플 플러그가 증폭 영역, 즉 제1 온도-제어 영역을 통하여 미소유체 인라인 반응 채널을 따라 진행됨에 따라 DNA를 증폭시켜 주고, (4) DNA 샘플 플러그가 검출 영역을 관통함에 따라 증폭된 DNA 생성물을 검출할 수 있도록 설계한다. 부가적으로, 본 발명의 미소유체 장치는 2가지 혁신 사항 중의 적어도 한 가지를 수반하도록 설계한다.
본 발명의 미소유체 장치의 신규한 한 가지 국면은 제2 온도-제어 영역 내의 검출 영역을 관통하는 미소유체 인라인 반응 채널을 위치시키는 것을 포함한다. 제2 온도-제어 영역 내의 검출 영역을 관통하는 미소유체 인라인 반응 채널을 위치시킴으로써, 미소유체 인라인 반응 채널을 따라 이동하는 샘플 플러그가 검출 동안 온도 스위프 (sweep)에 적용받을 수 있을 것이다. 당업자는 샘플 플러그를 대상으로 하여 온도 스위프를 수행함에 따라 샘플 플러그를 검출하는 것은, 예를 들어 상이한 온도에서 DNA 샘플 플러그의 형광을 검출하는 것은, 예를 들어 증폭된 DNA 생성물의 융점 분석을 참작한다는 사실을 인식할 것이다. 따라서, 본 발명은 1개 이상의 시퍼; 1개 이상의 미소유체 인라인 반응 채널에 연결된 1개 이상의 유체 저장고 (여기서, 1개 이상의 미소유체 인라인 반응 채널은 시약 어셈블리 영역, 제1 온도-제어 영역 내의 증폭 영역, 및 제2 온도-제어 영역 내의 검출 영역을 관류한다); 및 상기 미소유체 인라인 반응 채널 내에서의 유체 이동 및/또는 그의 가열을 위한 1종 이상의 미량 금속을 포함하는 미소유체 장치를 제공하는데, 증폭된 DNA 생성물의 검출은 하나 이상의 온도에서 일어날 수 있다.
도 2A는 본 발명의 미소유체 장치의 검출 영역 예를 제공한다. 증폭된 DNA를 전혀 갖지 않는 샘플 플러그, 또는 증폭된 DNA를 갖는 샘플 플러그가 미소유체 인라인 반응 채널 (도 1에서와 같이 5)을 따라 빨려 들어감에 따라, 검출 영역, 즉 예를 들어 제2 열 제어 판 (16)일 수 있는 제2 온도-제어 영역으로 도입된다. 미소유체 인라인 반응 채널은 샘플 플러그가 저온 영역 (18)과 고온 영역 (19) 사이를 이동하기 때문에, 이러한 샘플 플러그에 증폭된 DNA가 존재 또는 부재하는지를 검출할 수 있게 해주는 검출 경로 (17)를 가질 수 있다. 샘플 플러그는 광학 스캐닝 영역 (20)을 횡단하기 때문에, 검출가능한 모든 시약 (예: 형광성 프로브, 삽입제 등)은, 예를 들어 삼색 레이저 빔을 이용하여 광학적으로 여기시킬 수 있고, 이로써 생성되는 모든 방출량을 측정할 수 있다.
일반적으로, 검출 영역의 저온 영역 (18)은 약 25℃ 내지 약 65℃ 범위로 설정할 수 있다. 검출 영역의 고온 영역 (19)은 약 55℃ 내지 약 95℃ 범위로 설정할 수 있다. PCR 증폭된 DNA를 검출하고자 하는 경우에는, 검출 영역 (16)의 저온 영역 (18)과 고온 영역 (19)이 하나의 온도, 예를 들어 약 25℃ 내지 약 55℃로 설정할 수 있다.
검출 영역 내의 온도를 조절하고, DNA 샘플 플러그 중의 검출가능한 시약을 여기시키며, 방출을 검출하거나 방출 상의 변화를 검출하기 위해 사용될 수 있는 각종 기기가 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 본 발명의 한 양태에서 온도는, 예를 들어 광학 스캐닝 영역 (20), 또는 이 보다 더 크거나 작은 스캐닝 영역을 커버하는 적외선 부하-커플형 장치 (CCD) (도시되지 않음)을 사용하여 측정할 수 있다. 바람직한 양태에서는, 정확한 온도 센서를 제2 열 제어 판 위에 놓아두어 적외선 CCD를 보정하는 것이, 온도 측정의 정확도를 증가시키기 위해 권장된다.
당업자는 샘플 플러그 (예: DNA 샘플 플러그)를 대상으로 하여 검출 영역에서 온도 스위프를 수행하면, 파형 프로파일링 방법, 예를 들어 상기 언급된 바와 같은 방법, 본원에 기재된 바와 같은 SGP 방법 등으로부터 비롯되는 파형 프로파일을 검출할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 달리 말하면, 샘플 플러그가 온도 사이를 횡단하기 때문에, 이로써 생성되는 모든 방출과 샘플 플러그의 온도 간의 상관 관계를 결정할 수 있다. 부가적으로, DNA 샘플 플러그에 온도 스위프를 적용함에 따라 PCR 증폭된 DNA가 검출될 수도 있긴 하지만, 방출은 단지 하나의 온도에서만 검출될 필요가 있다. 또다른 한편, 저온 영역과 고온 영역은 PCR 증폭된 DNA의 검출을 위해 하나의 온도로 설정될 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, 검출 단계에 있어서의 광학 시스템 (도 2A에 도시되지 않음)을 사용하여, 증폭된 DNA에 온도 스위프를 적용함에 따라 증폭된 DNA (예: 보다 고 차수의 구조물)로부터 방출 상의 변화를 검출할 수 있다. 달리 말하면, 검출 영역 내의 광학 시스템을 사용하여 단리된 DNA의 파형 프로파일을 측정, 검출 및 결정할 수 있다. 모든 파형 프로파일이 검출된다는 것은 스크리닝된 샘플이 오염되었다는 지표일 수 있고, 이로써 생성되는 파형 프로파일을 공지된 유기체로부터 단리한 DNA 및 공지된 프라이머를 사용하여 생성시킨 파형 프로파일의 데이타베이스와 후속 비교하여 오염성 유기체를 확인할 수 있다. 부가적으로, 단리된 게놈 물질을 샘플 액체 내에 농축시키고, 그 농도가 공지되어 있는 경우에는, 파형 프로파일 검출시 오염 수준을 정량화할 수 있다.
당업자는 게놈 물질을 제조하고, 단리된 게놈 물질을 파형 프로파일링 방법을 통하여 증폭시키며, 이로써 생성되는 파형 프로파일을 검출하기 위해 본 발명의 장치를 사용하는 것은, 특정 샘플이 오염되었는지의 여부 및/또는 샘플을 오염시키는 유기체가 무엇인지에 관한 정보가 거의 또는 전혀 공지되어 있지 않은 경우에 가장 잘 활용된다는 것을 인식할 것이다. 당업자는 또한, (예를 들어, 파형 프로파일로부터 수득된) 특정 유기체의 실체는 게놈 물질을 단리하고, 단리된 게놈 물질을 PCR을 통해 증폭시키며, 이로써 생성되는 PCR 생성물(들)을 검출하기 위해 본 발명의 미소유체 장치를 사용하여 추가로 확정할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 본 발명의 한 양태에서는, 동일한 유기체로부터 여러 개의 DNA 샘플 소적을 형성시키고, 각 DNA 샘플 플러그를, 유기체의 실체를 구체적으로 확정하기 위해 선택된 상이한 프라이머와 합하며, 상이한 프라이머 (또는 프라이머 세트)를 사용하여 PCR을 통하여 각 DNA 샘플 소적을 증폭시키며, 증폭된 생성물의 존재 또는 부재를 검출함으로써, 해당 유기체의 확인 (동정)을 추가로 한정한다. 증폭된 생성물의 존재를 사용된 특별한 프라이머(들)와 상관지음으로써 유기체의 실체를 제공할 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, 특정 유기체의 존재를 알아보기 위해 스크리닝하고/하거나, 이 유기체를 확인하고/하거나 샘플 중의 상기 유기체의 농도를 정량화하는 것은, 1개 이상의 시퍼; 1개 이상의 미소유체 인라인 반응 채널에 연결된 1개 이상의 유체 저장고 (여기서, 미소유체 인라인 반응 채널은 시약 어셈블리 영역, 제1 온도-제어 영역 내의 증폭 영역, 및 제2 온도-제어 영역 내의 검출 영역을 관류한다); 및 상기 미소유체 인라인 반응 채널 내에서의 유체 이동 및/또는 그의 가열을 위한 1종 이상의 미량 금속을 포함하는 본 발명의 미소유체 장치를 사용하여 파형 프로파일링 및/또는 PCR을 통하여 수행할 수 있다. 단리된 게놈 물질에 관한 보다 상세한 조사가 요구되는 경우에는, 본 발명의 미소유체 장치를 사용하여 추가 분석용으로 관심있는 DNA 샘플 플러그를 선별할 수 있다.
4. 추가 분석용 DNA 샘플 플러그의 선별
통상적인 DNA 칩은 그의 융통성이 뛰어나고 고 성능이기 때문에 수 많은 DNA 분석 방법, 특히 서열 분석 방법에 사용되긴 하지만, 높은 단가로 인해 이들을 오염성 유기체의 스크리닝 및 확인 방법에 사용하는 것이 제지되는데, 이는 예를 들어, 급수원에서의 오염 확률이 낮고, 결과적으로 게놈 물질을 단리할 확률이 낮기 때문이다. 부가적으로, 정량화를 위해 DNA 칩을 사용하는 것은 비용 면에서 효율적이지 못한데, 이는 다수의 오염성 유기체가 존재하는 경우 또는 PCR을 이용한 기하급수적 증폭 후에는 상기 정량화의 정확도가 충분치 못하기 때문이다. 본 발명의 기구는 특정 유기체에 의한 오염 판단을 위해 샘플을 스크리닝하고, 오염성 유기체 (존재하는 경우)를 확인하며, 오염 수준을 정량화하기 위해 사용될 수 있는, 비용 면에서 효과적인 미소유체 장치를 제공하기 때문에, 상기 문제점들을 해결해준다 (예를 들어, 본 발명의 미소유체 장치를 사용하는 경우에, DNA 샘플 플러그 중에 증폭된 DNA가 단순히 검출된다는 것은 오염성 유기체가 존재한다는 지표이고, 증폭된 DNA의 분석은 오염성 유기체를 확인시켜 줄 수 있으며, 증폭된 DNA를 전혀 수반하지 않는 샘플 플러그의 수 대 증폭된 DNA를 수반한 DNA 샘플 플러그의 수 간의 비를 결정하여 샘플 내의 오염성 유기체의 농도를 제공해줄 수 있다). 당업자는 본 발명의 장치의 정확도가 DNA 칩의 몇 배인데, 이는 본 발명의 장치가 디지털 증폭 방법을 이용하기 때문이란 사실을 인식할 것이다.
그러나, 예를 들어 DNA 칩의 서열 분석 능력은, 예를 들어 파형 프로파일의 검출을 통하여 가질 수 있는 본 발명의 미소유체 장치의 서열 분석 능력 보다 더 정확할 수 있다. 결과적으로, 본 발명의 미소유체 장치를 사용하여, 예를 들어 DNA 칩을 이용하여 추가 조사 (예: 서열 분석)하기 위한 관심있는 DNA 샘플 플러그를 선별할 수도 있다.
한 양태에서, 본 발명의 신규한 미소유체 장치는 미소유체 인라인 반응 채널(들) 내에 위치한 밸브를 포함하는데, 이러한 밸브는 검출 영역 하류에 있기 때문에 특정 DNA 샘플 플러그를 추가 분석 (예: 서열 분석)용으로 선별하는 경우에는, 밸브가 미소유체 인라인 반응 채널 내에서의 유동을 작동시키고, 이러한 DNA 샘플 플러그가 예를 들어, 폐기용 웰로부터 벗어나서 예를 들어, DNA 서열 분석용 칩을 향해 유동하도록 할 수 있다. 따라서, 본 발명은 1개 이상의 시퍼; 1개 이상의 미소유체 인라인 반응 채널에 연결된 1개 이상의 유체 저장고 (여기서, 미소유체 인라인 반응 채널은 시약 어셈블리 영역, 증폭 영역, 및 검출 영역을 관류하고, 미소유체 인라인 반응 채널은 검출 영역의 하류에 밸브를 추가로 포함한다); 및 상기 미소유체 인라인 반응 채널 내에서의 유체 이동 및/또는 그의 가열을 위한 1종 이상의 미량 금속을 포함하는 미소유체 장치를 제공한다.
도 2B는 추가 분석용 샘플 플러그 (예: DNA 샘플 플러그)를 어떻게 선별하는지를 비제한적으로 도시한 것이다. 샘플 플러그 (21)는 이들이 연접부 (예: T자 연접부)에 있는 선별 밸브 (22)에 도달할 때까지 미소유체 인라인 반응 채널을 따라 이동한다. 본 발명의 미소유체 장치의 검출 영역으로부터 수집한 데이타를 근거로 하거나 (도 2A), 또는 기타 데이타를 근거로 하여, 관심있는 DNA 샘플 플러그 (23)을, 예를 들어 DNA 칩 (24)을 사용하여 추가 분석하기 위해 선별한다.
본 발명의 한 양태에서는, 미소유체 장치가 1) 제2 온도 제어 영역으로서의 검출 영역, 및 2) 이러한 검출 영역 하류에 밸브를 포함하는 1개 이상의 미소유체 인라인 반응 채널 중의 어느 하나 또는 둘 다를 가질 수 있다. 따라서, 본 발명은 1개 이상의 시퍼; 1개 이상의 미소유체 인라인 반응 채널에 연결된 1개 이상의 유체 저장고 (여기서, 1개 이상의 미소유체 인라인 반응 채널은 시약 어셈블리 영역, 제1 온도-제어 영역 내의 증폭 영역, 및 체 구조물의 검출 영역을 관류한다); 및 상기 미소유체 인라인 반응 채널 내에서의 유체 이동 및/또는 그의 가열을 위한 1종 이상의 미량 금속을 포함하는 미소유체 장치를 제공하는데, 증폭된 DNA 생성물의 검출은 하나 이상의 온도에서 일어날 수 있고, 1개 이상의 미소유체 인라인 반응 채널은 상기 체 구조물의 검출 영역의 하류에 밸브를 추가로 포함한다.
5. 본 발명의 미소유체 장치의 제조
본 발명의 미소유체 장치는 당해 분야에 널리 공지된 방법에 의해 제조할 수 있다 [참고: 예를 들어, 미국 특허 제6,500,323호 및 제5,882,465호]. 간략하게 언급하면, 본 발명의 미소유체 장치를 설계하는데 있어서, 유체 샘플 플러그(들) (예: DNA 샘플 플러그(들))를 1개 이상의 미소유체 채널을 통하여 이동시키기 위한 구동력을 선택해야 하고, 반응 파라미터를 확인해야 하며, 채널 네트워크를 설계해야 한다. 이들 단계 각각이 다음에 간략하게 요약되어 있다.
미국 특허 제6,500,323호에 기재된 바와 같이, 미소유체 시스템, 예를 들어 본 발명의 자동화 인라인 플랫폼에 대한 전형적인 구동력은 압력에 의거한 유체 수송 시스템, 동전학적 물질 수송 시스템, 또는 이들 둘의 하이브리드로부터 선별한다. 압력에 의거한 시스템을 사용하는 것이, 예를 들어 미국 특허 제6,500,323호; 국제특허출원 PCT/US98/20195; 및 미국 특허원 제09/245,627호 (1999년 2월 5일자로 출원됨) (이들 각각이 본원에 참고로 도입된다)에 기재되어 있다. 유체를 제어 방식으로 이동시키기 위해 동전력을 사용하고, 이러한 이동을 수행하기 위한 시시스템이, 예를 들어 미국 특허 제5,800,690호 및 제5,779,868호 (이들 각각이 본원에 참고로 도입된다)에 상세히 기재되어 있다. 하이브리드 시스템의 예가, 예를 들어 국제특허출원 PCT/US98/20195에 기재되어 있다. 상기 3가지 시스템 중의 어느 한 가지를 본 발명의 기구와 함께 사용할 수 있긴 하지만, 하이브리드 시스템을 사용하여 유체를 이동시키는 것이 바람직하다.
미국 특허 제6,500,323에 기재된 바와 같이, 본 발명의 미소유체 장치를 설계하는 경우에 고려해야 할 중요한 사항으로 간주되는 것은 반응 파라미터, 예를 들어 반응 시약, 시약 농도, 시약 용적, 반응 시간, 및 반응 온도 프로파일이다. PCR 및 파형 프로파일링은 널리 공지된 방법이기 때문에, 그들의 반응 파라미터, 예를 들어 반응 시약, 시약 농도, 반응 시간, 온도 프로파일 등은 널리 확립되어 있으므로, 본 발명의 미소유체 장치의 채널 네트워크를 설계하는 데에 있어 용이하게 참작되었다. 예를 들어, PCR하고만 함께 사용하도록 설계된 미소유체 장치는 미국 특허 제6,670,153호 (이는 본원에 참고로 도입된다)에 상세히 기재되어 있다. 미국 특허 제6,670,153호에 기재된 장치의 설계는 PCR의 반응 단계, 즉 변성, 어닐링, 연장 및 "핫 스타트"를 고려한 것이다. 이들 단계는 DNA 증폭 공정 (파형 프로파일링 방법, 예를 들어 상기 언급된 파형 프로파일링 방법 포함)을 위해 명확히 정의되기 때문에, 당업자는 본 발명의 미소유체 장치가, 상기 언급된 새로운 차이점 한 가지 또는 두 가지 모두를 제외하고는, 예를 들어 미국 특허 제6,670,153호에 기재된 것과 유사할 수 있다는 것을 인식할 것인데, 이러한 차이는 모든 미소유체 반응 채널을 제2 온도 제어 영역 내의 검출 영역 내에 놓아둠으로써, 파형 프로파일을 검출할 수 있게 해주고/해주거나 검출 영역의 하류이지만 폐기용 웰의 상단에 있는 밸브를 1개 이상의 미소유체 반응 채널 내에 도입하는 것이다. 부가적으로, 당업자는 다음에 기재되는 SGP 방법의 반응 파라미터에 기초하여 본 발명의 미소유체 장치를 설계할 수 있을 것이다.
상기 언급된 바와 같이, 본 발명의 미소유체 장치는 1개 이상의 미소유체 채널 내에 도입된 1개 이상의 밸브, 예를 들어 검출 영역의 하류 및 폐기용 웰의 상단에 위치한 밸브를 가질 수 있다. 이러한 밸브는 "T" 교차점, 횡 교차점, 다중 채널의 "웨곤 휠 (wagon wheel)" 교차점, 또는 2개 이상의 채널이 유체 교통되는 기타 모든 채널 외형으로서 가시화될 수 있다. 상기 언급된 바와 같이 선택된 구동력은 교차점에서 기타 채널로부터의 유동을 억압함으로써 밸브를 통하여 샘플 플러그(들) (예: DNA 샘플 플러그)를 제어 가능한 수준으로 지시할 수 있다. 예를 들어, 도 2B에서 DNA 샘플 플러그 (23)를 추가 분석용으로 선별한 경우에는, 이러한 DNA 샘플 플러그 (23)가 좌측에서 우측, 예를 들어 DNA 칩 (24)으로 이동하고, 폐기용 웰로 선도하는 수직 채널은 가로 질러 벗어나는 것이 요망될 것이다. 본원에 참고로 도입된 미국 특허 제5,876,675호에 기재된 바와 같이, 동전학적 구동력을 사용하여, 일정 길이의 수평 채널을 가로질러 전압 구배를 적용하고 교차점에서의 물질 유동을 핀칭함으로써 DNA 샘플 플러그의 유동을 지시할 수 있다. 부가적으로, 밸브의 작동이 중지된 경우, 즉 일정 길이의 수평 채널을 가로지르는 전압 구배가 전혀 없는 경우에는, 예를 들어 전압 구배를 수직 채널을 가로질러 적용하고/하거나 수평 채널 말단에 위치한 폐기용 웰에 진공을 적용함으로써, DNA 샘플 플러그가 교차점을 통하여 좌측 암 (arm)으로부터 바닥 암 내로 이동한다.
B. 본 발명의 미소유체 장치 내에서의 유체 이동, 그의 가열 및 냉각, 및 이러한 장치로부터의 데이타 획득을 제어하기 위한 기기
제어 장치 (도 1 및 2에 도시되지 않음), 예를 들어 펌프, 밸브, 샘플 플러그 (또는 DNA 샘플 플러그) 위치 검출기, 및 제어 컴퓨터를 사용하여 각 샘플 플러그 및/또는 DNA 샘플 플러그의 이동과 타이밍을 제어하여 상기 언급된 공정들을 달성할 수 있다. 이러한 제어 장치는 당업자에게 널리 공지되어 있다.
본 발명의 기기는 본 발명의 미소유체 장치의 검출 영역 내의 제2 온도 제어 영역 (온도 스위프하기 위함)을 확립, 모니터링 및 제어할 수 있는 능력을 포함할 것이다. 이는 증폭된 DNA 생성물에 온도 구배를 적용함에 따라 이러한 증폭된 DNA 생성물을 검출할 수 있게 해주고 이러한 검출을 양성 신호, 제로-검출, 또는 파형 프로파일로 해독해줄 수 있는, 본 발명의 미소유체 장치의 검출 영역에, 예를 들어 미국 특허 제6,670,153호에 기재된 가열 영역과 유사한 온도 제어 영역, 예를 들어 고정 온도 구배를 설치함으로써 달성될 것이다. 이와 같이 변형된 시스템은 PCR (예: TAQMAN®) 및 파형 프로파일링 증폭 방법 중의 어느 한 가지 또는 두 가지 방법 모두에 의해 증폭된 DNA 생성물을 검출할 수 있을 것이다. TAQMAN® 반응 동안, 검출 영역 내의 온도 구배는 제로로 설정할 수 있다 (이로써, 검출 영역에서는 온도가 일정할 것이다).
당업자는 본 발명의 미소유체 장치 내에서의 유체 이동, 그의 가열 및 냉각, 및 이러한 장치로부터의 데이타 획득을 제어하는 것으로 널리 공지된 기술을 인식할 것이므로, 과도한 실험없이도 이러한 기기를 창출시킬 수 있을 것이다.
II. 단일 게놈 프로파일링
단일 게놈 프로파일링 (SGP)은 파형 프로파일링 방법에 대한 개선안을 제공함으로써, 특정 유기체가 소량으로 존재하는 경우일지라도 이러한 유기체로부터 게놈 물질을 분석하고 프로파일링할 수 있게 해준다. 이들 개선안에는 신규한 프라이머 ("SGP 프라이머") 및 변형된 버젼의 폴리머라제 연쇄 반응 (mPCR)을 포함한다. SGP는 부가적으로, 최종 "하프-타임 연장 단계"를 제공한다. 이들 개선안으로 인해, SGP (즉, SGP 프라이머, mPCR 및 하프-타임 연장 단계를 사용하는 방법)는 별개의 핵산 중합체 ("SGP 핵산 중합체")를 생성시킬 수 있는데, 이러한 중합체 각각은 SGP 프라이머의 서열에 이어, 게놈 DNA 주형의 몇개의 별개 영역 중의 하나에 대해 상보적인 서열을 포함하는 5'→3' 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 특히, SGP는 생성된 SGP 핵산 중합체, SGP 프라이머, 및 mPCR을 활용하여 "SGP-SGP 핵산 중합체"를 기하급수적으로 증폭시키는데, 이러한 중합체 각각은 SGP 프라이머의 서열, 게놈 DNA 주형의 몇개의 별개 영역 중의 하나의 서열과 동일한 서열에 이어, SGP 프라이머의 역배향 상보체를 포함하는 5'→3' 뉴클레오티드 서열을 갖는다. SGP-SGP 핵산 중합체를 기하급수적으로 증폭시킨 후, SGP는 신규한 하프-타임 연장 단계를 도입하여 SGP 핵산 중합체의 단축형 버젼, 즉 "단축형 SGP 핵산 중합체"를 생성시키는데, 이러한 중합체는 보다 고 차수의 구조물을 형성할 것이다. 유기체의 게놈 DNA를 초기 주형으로서 사용하기 때문에, SGP 핵산 중합체와 SGP-SGP 핵산 중합체는 해당 유기체에 대해 독특한 서열을 함유할 것이다. 동일한 이유로 인해, 그리고, 이로써 생성되는 SGP-SGP 핵산 중합체를 하프-타임 연장 단계 동안 단축형 SGP 핵산 중합체의 생성을 위해 사용하기 때문에, 단일 가닥의 단축형 SGP 핵산 중합체는 해당 유기체에 대해 독특한 서열을 함유할 것이다. 따라서 SGP에서는, 단일 가닥의 단축형 핵산 중합체가 해당 유기체에 대해 독특한 서열에 기초하여 보다 고 차수의 구조물을 형성한다. 따라서, 단일 가닥의 단축형 핵산 중합체에 의해 형성된 보다 고 차수의 일련의 구조물은 유기체에 대해 독특하다. 결과적으로, 형성되는 상이한 보다 고 차수의 구조물을 검출하면, 유기체를 검출 및/또는 확인할 수 있으며, 이러한 검출은, 예를 들어 형광성 삽입제를 사용하여 달성할 수 있다.
A. 단일 게놈 프로파일링의 변형된 PCR (mPCR)
당업자는 본 발명의 변형된 PCR (mPCR)을 사용하여 많은 SGP 핵산 중합체, 및 이에 따라 많은 SGP-SGP 핵산 중합체 및 단축형 SGP 핵산 중합체를 생성시킬 수 있다는 것을 인식할 것이다. 이들 중합체 각각은 SGP 프라이머로부터 유래되고 그의 5' 말단에 SGP 프라이머를 함유하고 있기 때문에, 당업자는 SGP에서 mPCR 제1 주기에 앞서 관심있는 게놈 DNA를 함유하는 용액에 많은 SGP 프라이머 카피를 부가해야만 한다는 것을 인식할 것이다. 당업자는 또한, mPCR의 물질과 조건이 PCR과 유사하다는 것을 인식할 것이다. 예를 들어, 상기 프라이머 및 DNA 주형 이외에 PCR에 부가하기 위한 dNTPs 및 반응 완충제의 적당한 농도는 당업자에게 널리 공지되어 있는데, 삽입제의 적당한 농도도 마찬가지이다. mPCR의 제1 주기에 앞서 부가되어야 하는 SGP 프라이머, 뉴클레오티드 (즉, dATP, cCTP, dTTP 및 dGTP), DNA 폴리머라제, 반응 완충제, 및/또는 마그네슘의 농도와 양은 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
SGP는 mPCR의 단계를 포함하고 있기 때문에, 엄청나게 소량으로 존재하는 유기체의 게놈 DNA를 분석할 수 있다. 본 발명의 한 양태에서, 단일 유기체의 게놈 DNA는 충분한 양의 단축형 단일 가닥 핵산 중합체 및 이와 연관된 검출을 위한 보다 고 차수의 구조물에 대한 원시 (소스) 주형을 제공할 수 있다. 이는 SGP의 mPCR 단계가, 통상적인 PCR과 다소 유사한 방식으로 특정의 SGP 핵산 중합체와 결합하여 이를 증폭시킬 수 있는 SGP 프라이머의 능력을 통하여 SGP-SGP 핵산 중합체를 기하급수적으로 증폭시키기 때문이다. 그러나, 통상적인 PCR과 비교해서 2가지 현저한 차이점이 있다. 첫째, mPCR 단계는 정배향 프라이머와 역배향 프라이머 둘 다로서 작용할 수 있는 1개의 프라이머, 즉 SGP 프라이머 만을 활용한다. 이와는 달리, 통상적인 PCR은 다음 2가지 별개의 프라이머를 이용한다: (1) 정배향 프라이머, 및 (2) 정배향 프라이머와 상이한 서열을 갖는 역배향 프라이머.
둘째, 통상적인 PCR은 게놈 DNA의 단일 영역을 증폭시키기 위해 2개의 프라이머를 활용하는 반면, mPCR은 게놈 DNA의 몇개의 별개의 영역 (이들 각각은 SGP 프라이머와 동일한 서열 및 SGP 프라이머에 대해 상보적인 서열, 즉 "SGP 프라이머 결합 부위"에 의해 일괄됨)을 증폭시키기 위해 1개의 프라이머를 사용한다. 게놈 DNA의 몇개의 별개의 영역을 증폭시킬 수 있는, SGP에서의 mPCR의 능력은 정배향 프라이머와 역배향 프라이머로서 작용할 수 있는 하나의 SGP 프라이머를 사용하는 것에 기인한다. 이러한 SGP 프라이머의 특징은 다음 2가지 주요 사건이 일어날 수 있게 해주는, 그의 길이의 함수이다:
(1) SGP 프라이머가 각 단일 가닥 게놈 DNA 주형 상의 몇개의 별개의 SGP 프라이머 결합 부위와 결합하고; (2) SGP 프라이머가, 이러한 SGP 프라이머 서열과 그의 별개의 뉴클레오티드 서열 내에 SGP 프라이머의 역배향 상보체를 포함하는 5'→3' 뉴클레오티드 서열을 갖는 SGP 핵산 중합체 (mPCR 1회 이상 주기에 의해 생성됨)와 결합한다. 역배향 상보체 서열이 SGP 핵산 중합체 내에 존재하고 SGP 프라이머가 후속 결합함으로써, 몇개의 별개의 이중 가닥 SGP-SGP 핵산 중합체가 PCR과 유사하게 (즉, mPCR) 기하급수적으로 증폭될 수 있는데, 즉 SGP 프라이머 결합 부위에 의해 일괄된 이중 가닥 게놈 DNA의 몇개의 별개 영역이 기하급수적으로 증폭될 수 있다.
SGP 프라이머는 파형 프라이머와 일부 유사한 특징을 공유하고 있는데, 후자 파형 프라이머는 예를 들어, 일본 특허공개공보 제2003-334082호 및 제2003-280351호에 상세히 기재되어 있다. SGP 프라이머는 SGP에 필수적이고, 그들의 길이를 특징으로 한다. SGP 프라이머의 길이는 중요한데, 이는 프라이머의 길이가 짧아지면 이 프라이머가 일정 길이의 각 단일 가닥 게놈 DNA 주형을 따라 몇개의 별개의 부위와 특이적으로 결합할 수 있기 때문이고, 짧아진 길이는 SGP 핵산 중합체가 그의 별개의 뉴클레오티드 서열 내에 SGP 프라이머 서열의 역배향 상보체를 포함하는 5'→3' 서열을 가질 확률을 증가시킬 수도 있기 때문이다.
SGP 프라이머의 특별한 특징은 이를 SGP 방법에 사용하여, 제1 주기 후 mPCR 각 주기 동안에 특정의 SGP 핵산 중합체로부터 SGP-SGP 핵산 중합체를 기하급수적 (즉, 비선형)으로 증폭시킬 수 있게 한다는 것이다. SGP에서의 mPCR의 제1 주기는 다음 단계들로 이루어진다: 1) 게놈 DNA의 각 카피를 2개의 단일 가닥 게놈 DNA 주형으로 변성시키는 단계, 2) SGP 프라이머를 각 단일 가닥 게놈 DNA 주형 상의 몇개의 별개의 SGP 프라이머 결합 부위와 어닐링시키는 단계, 및 3) 각 단일 가닥 게놈 DNA 주형 상의 별개의 SGP 프라이머 결합 부위와 결합된 몇개의 SGP 프라이머 각각으로부터 SGP 핵산 중합체를 연장시키는 단계 (여기서, 각 SGP 핵산 중합체는 이러한 SGP 핵산 중합체가 연장되는 결합된 SGP 프라이머에 이어, 결합된 SGP 프라이머의 하류에 게놈 DNA 주형 서열에 대해 상보적인 별개의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 5'→3' 뉴클레오티드 서열을 갖는다).
당업자는 "풀-타임 (full-time)" 연장 단계 기간이 SGP 핵산 중합체의 길이를 결정해주므로, 1 주기에서 창출된 SGP 핵산 중합체는 별개의 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있지만, 대략 동일한 길이일 수 있다는 것을 인식할 것이다. 예를 들어, SGP 프라이머가 각 단일 가닥 게놈 DNA 주형을 따라 103개 부위와 어닐링되도록 이를 설계한다고 가정하고, 길이가 대략 1 kb인 SGP 핵산 중합체를 생성하도록 연장 단계 타이밍을 조정한다고 가정하면, SGP 증폭을 1 주기 수행하면 주형당 103개의 별개의 SGP 핵산 중합체가 생성될 것인데, 이들 각각은 길이가 대략 1 kb일 것이다. 물론, 프라이머가 어닐링된 SGP 프라이머 결합 부위들 중의 하나가 게놈 DNA 주형의 3' 말단으로부터 1 kb 미만인 경우에는, 이러한 부위에서 결합된 SGP 프라이머로부터의 연장에 의해서는 길이가 1 kb 미만인 SGP 핵산 중합체가 생성될 것이다. 또한, SGP 프라이머 결합 부위 (즉, 부위 "B")가 또다른 SGP 프라이머 결합 부위 (즉, 부위 "A")의 하류에 1 kb 내인 경에는, 부위 A에서 결합된 SGP 프라이머로부터 1 kb 미만의 SGP 핵산 중합체가 생성될 것이다.
SGP에서는 mPCR 주기를 여러 차례, 예를 들어 15 내지 100회 반복할 수 있다. 당업자는 각 주기의 변성 단계 동안 SGP 핵산 중합체가 단일 가닥으로 된다는 사실, 즉 SGP 핵산 중합체가 더 이상 게놈 DNA 주형과 결합하지 않는다는 사실을 인식할 것이다. mPCR의 후속 주기에서의 어닐링 단계 동안, 그들의 별개의 뉴클레오티드 서열 내에 SGP 프라이머의 역배향 상보체를 포함하는 5'→3' 뉴클레오티드 서열을 갖는 특정의 SGP 핵산 중합체가 SGP 프라이머에 의한 결합에 여전히 접근 가능하다는 사실, 즉 이들 특정의 SGP 핵산 중합체가 보다 고 차수의 구조물을 형성하지 않는다는 사실이 SGP에서는 중요하다. SGP 핵산 중합체가 보다 고 차수의 구조물의 일부로서 결합하거나 SGP 프라이머와 결합하는 것은 몇 가지 요인, 예를 들어 어닐링 온도, SGP 핵산 중합체 및 SGP 프라이머의 길이, 및 반응 혼합물 중의 SGP 핵산 중합체 및 SGP 프라이머의 농도에 좌우된다는 것은 널리 이해되고 있다. 결과적으로, 당업자는, 예를 들어 SGP 프라이머의 농도를 증가시킴으로써 mPCR의 어닐링 단계를 조작하는 것이 SGP 핵산 중합체를 포함하는 보다 고 차수의 구조물의 형성을 방지하는데 도움을 줄 수 있다는 것을 인식할 것이다. 그러나, 이들 널리 공지된 요인을 조정하는 것이 본 발명을 실시하는데 도움을 줄 수 있긴 하지만, SGP 핵산 중합체 안정성 요인은 SGP 프라이머의 설계에 역점을 두고 있기 때문에 이러한 조정이 절대적으로 요구되는 것은 아니다. 다음에 언급되는 바와 같이, SGP 프라이머는 비특이적 안정화 부분을 수반하지 않도록 설계하므로, 각각 그의 5' 말단에 SGP 프라이머 서열을 갖는 SGP 핵산 중합체는 안정적이지 못할 것인데, 즉 프라이머와 용이하게 결합하는 경향이 있을 것이다. 결과적으로, SGP 프라이머 서열에 이어, 그들의 별개의 뉴클레오티드 서열 내에 SGP 프라이머 서열의 역배향 상보체를 포함하는 5'→3' 서열을 갖는 특정의 SGP 핵산 중합체가, 보다 고 차수의 구조물 형성에 앞서 SGP 프라이머와 선택적으로 결합할 것이다.
SGP 프라이머 서열에 이어, 그들의 별개의 뉴클레오티드 서열 내에 SGP 프라이머 서열의 역배향 상보체를 포함하는 5'→3' 서열을 갖는 특정의 SGP 핵산 중합체에 SGP 프라이머가 결합하는 것이, 제1 주기에 대한 후속 SGP mPCR 증폭 주기를 달성케 하는 것이다. SGP 프라이머가 SGP 핵산 중합체 상의 그의 상보체에 결합하는 것이 PCR 유사 반응을 증진시켜 SGP-SGP 핵산 중합체를 생성시키는데, 이러한 중합체 각각은 SGP 프라이머와 동일한 5'→3' 서열에 의해 5' 말단에서 플랭킹되고 SGP 프라이머의 역배향 상보체인 5'→3' 서열에 의해 3' 말단에서 플랭킹되는 게놈 DNA 주형의 몇개의 별개의 영역 중의 하나의 서열과 동일한 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 따라서, 각 SGP-SGP 핵산 중합체는 그의 3' 말단에 SGP 프라이머에 대해 상보적인 5'→3'서열을 갖고 있기 때문에, 각 SGP-SGP 핵산 중합체는 또한, 후속 mPCR 주기의 어닐링 단계에서 보다 고 차수의 구조물을 형성하기에 앞서 SGP 프라이머에 의해 결합될 것이다. 결과적으로, mPCR의 후속 주기는 SGP-SGP 핵산 중합체의 기하급수적 증폭을 포함할 것이다.
당업자는 모든 SGP 핵산 중합체가 그의 5' 말단에 SGP 프라이머 서열을 포함할 것이긴 하지만, 이러한 SGP 핵산 중합체의 단지 특정 비율 만이 그의 5'→3' 별개의 뉴클레오티드 서열 내에 SGP 프라이머 서열의 역배향 상보체를 포함할 것이란 사실을 인식할 것이다. SGP-SGP 핵산 증폭에 참여하는 특정의 SGP 핵산 중합체의 비율은 용이하게 결정된 몇 가지 요인, 예를 들어 mPCR의 "풀-타임 연장 단계"에 대해 사용된 "풀-타임" 길이, 및 SGP 프라이머의 설계에 좌우된다. 예를 들어, 잠재적 SGP 핵산 중합체는 5' 말단으로부터 하류에 대략 750개 염기 (0.75 kb)의 SGP 프라이머 서열의 역배향 상보체를 가질 수 있다. 이러한 예에서 상기와 같이, mPCR의 풀-타임 연장 단계가 1 kb SGP 핵산 중합체를 생성하도록 설정한다고 가정하면, 후속 mPCR 주기는 750-염기 (0.75-kb) 영역, 즉 본래의 1 kb SGP 핵산 중합체가 유래된 이중 가닥 게놈 DNA 영역의 동일한 서열을 갖는 이중 가닥 SGP-SGP 핵산 중합체가 기하급수적으로 mPCR 증폭되기 시작할 것이다. 이러한 기하급수적 증폭은 그의 5' 말단의 하류 1 kb 내에 SGP 프라이머의 역배향 상보체를 함유하는 5'→3' 서열을 갖는 기타 모든 단일 가닥의 SGP 핵산 중합체에 대해서도 일어날 것이다. 결과적으로, 연장 시간 전체 길이를 증가시키면, 보다 높은 비율의 SGP 핵산 중합체가 그의 뉴클레오티드 서열 내에 1개 이상의 SGP 프라이머 결합 부위를 포함할 확률이 증가할 것이다. 그의 반대 상황도 가능한데, 연장 시간 전체 길이를 감소시키면, 보다 높은 비율의 SGP 핵산 중합체가 그의 서열 내에 1개 이상의 SGP 프라이머 결합 부위를 포함할 확률이 감소될 것이다.
그들의 서열 내에 SGP 프라이머 결합 부위를 포함하는 특정의 SGP 핵산 중합체의 비율은, 예를 들어 100개 SGP 핵산 중합체 중의 1개 (즉, 10-2)가 그의 서열 내에 SGP 프라이머 결합 부위를 함유할 수 있도록 상기 프라이머를 설계함으로써 조작할 수도 있다 (이에 관한 보다 상세한 설명은 다음에 제공된다). 이러한 예에서는 상기에서와 같이, SGP 프라이머가 각 단일 가닥 게놈 DNA 주형을 따라 103개 부위와 어닐링될 수 있다고 가정하면, 2 x 103개 상이한 SGP 핵산 중합체가 각 유기체에 대해 생성될 것이고 (즉, 주형 당 1 x 103개 SGP 핵산 중합체 x 유기체 당 2개 주형), 대략 20개의 별개의 SGP-SGP 핵산 중합체가 증폭될 것이다. 물론, 프라이머가 초기에 결합하는 부위에 대해 상대적인 역배향 상보체의 위치가, 기하급수적으로 증폭되는 각 SGP-SGP 핵산 중합체의 길이를 결정할 것이다. 부가적으로, 모든 PCR 과정과 같이, 본 발명의 SGP-SGP 핵산의 기하급수적 증폭은 연장 (이로써 이중 가닥의 SGP-SGP 핵산 중합체가 생성된다), 변성 (이로써 SGP 프라이머와 어닐링하는데 이용 가능한 단일 가닥의 SGP-SGP 핵산 중합체가 생성된다), 및 SGP 프라이머의 어닐링 (연장 및 증폭 그 다음 주기를 설정한다)을 포함하는 mPCR 주기를 통하여 일어난다.
따라서, mPCR에서는 제1 주기 시작시 부가된 하나의 SGP 프라이머의 다중 카피가 PCR을 수행하기 위해 통상적으로 활용된 프라이머 쌍의 기능을 제공할 것이다. 달리 말하면, 본 발명의 단일 SGP 프라이머는 이중 가닥 게놈 DNA의 몇개의 별개 영역을 일괄할 것이며, 이로써 이들 영역이 몇개의 별개의 이중 가닥 SGP-SGP 핵산 중합체 형태로 mPCR 기하급수적 증폭될 것이다.
B. 하프-타임 연장 단계
상기 언급된 바와 같이, SGP에서 파형 프로파일링 방법의 최종 목표로서 제공되는 파형 분석을 위해서는, 해당 게놈의 독특함을 나타내는 몇개의 별개의 단일 가닥 핵산 중합체가 존재해야 하고; 이들 핵산 중합체를 삽입제와 합하여 보다 고 차수의 구조물을 형성시키는데, 이러한 구조물은 궁극적으로 검출되므로, 상기 파형 프로파일링 방법에 필요하다.
SGP에서는, 1) SGP-SGP 핵산 중합체의 기하급수적 증폭을, 풀-타임 연장 단계를 이용하여 mPCR 수 회 주기를 통하여 달성한 후까지, 그리고 2) 하프-타임 연장 단계의 도입을 통하여 SGP-SGP 핵산 중합체로부터 단일 가닥의 단축형 SGP 핵산 중합체를 생성시킨 후까지는 검출가능한 보다 고 차수의 구조물이 통상적으로 형성되지 않는다. 따라서, 본 발명은 "하프-타임" 증폭 주기를 mPCR 과정 내로 도입하여 (충분한 mPCR 주기로 인해, 기하급수적으로 증폭된 생성물의 충분한 카피, 예를 들어 106 내지 107개 카피가 생성된 후), 각 단축형 SGP 핵산 중합체의 몇 개 카피를 생성시킨다. 달리 말하면, 상기 mPCR 주기에 대한 연장 단계의 시간을, 예를 들어 40 내지 60％ 단축시킴으로써, SGP-SGP 핵산 중합체 일부로부터 유래되는 핵산 중합체 일부의 길이가 줄어드는데, 즉 단축형 SGP 핵산 중합체가 생성된다. 이러한 단축형 SGP 핵산 중합체는 중합체의 3' 말단 상에 프라이머 서열의 역배향 상보체를 더 이상 함유하지 않기 때문에, 단축형 SGP 핵산 중합체는 기하급수적으로 증폭되지 않을 것인데, 즉 이들 중합체는 단일 가닥을 유지할 것이며 결과적으로, 검출될 수 있는 보다 고 차수의 구조물을 형성할 것이다.
SGP 프라이머의 역배향 상보체와 동일한 5'→3' 서열을 포함하지 않는 SGP 핵산 중합체 (즉, 단축형 SGP 핵산 중합체가 아님)는 어떠한 mPCR 증폭 주기 동안에도 프라이머와 결합하지 않을 것이기 때문에, 보다 고 차수의 구조물을 형성할 수도 있다는 것을 인지해야 한다. 그러나, 다음에 설명하는 바와 같이, 하나의 하프-타임 연장 단계는 각 별개의 단축형 SGP 핵산 중합체의 몇 개 카피를 생성시킨다 (이는 이들이 기하급수적으로 증폭된 SGP-SGP 핵산 중합체로부터 유래되기 때문이다). 이와는 달리, SGP 프라이머 결합 부위를 포함하는 서열을 갖지 않는 SGP 핵산 중합체는 비교적 소량의 출발 게놈 DNA로부터 선형적으로만 증폭된다. 결과적으로, 이러한 SGP 핵산 중합체가 보다 고 차수의 구조물 형성에 기여하는 정도는 단축형 SGP 핵산 중합체가 보다 고 차수의 구조물 형성에 기여하는 정도와 비교해서 무시할 말한 수준이다.
SGP에서 생성된 보다 고 차수의 구조물은 하프-타임 연장 단계의 도입에 의해 생성되는 단축형 SGP 핵산 중합체를 대부분 함유할 것이다. 예를 들어, 상기와 같이 SGP 프라이머가 각 단일 가닥 게놈 DNA 주형 상의 대략 103개 부위와 어닐링될 수 있다고 가정하면, 제1 주기로부터의 SGP 핵산 중합체의 총 수는, 예를 들어 게놈 DNA 1개 카피당 (즉, 유기체 당) 대략 2 x 103개 SGP 핵산 중합체일 수 있다. 또한 상기에서와 같이, 100개 SGP 핵산 중합체 중의 1개가 그의 서열 내에 SGP 프라이머 결합 부위를 포함하는 서열을 갖도록 프라이머를 설계하였다고 가정하면, 대략 20개의 SGP-SGP 핵산 중합체 (이들 각각은 SGP 프라이머 결합 부위에 의해 일괄되는 각 게놈 DNA 주형의 몇개의 별개 영역 중의 하나와 동일하다)가 mPCR에 의해 기하급수적으로 증폭될 것이며, 이로써 비교적 다수의 SGP-SGP 핵산 중합체 카피 (단일 게놈 DNA로 출발한 경우에는 22 내지 24 mPCR 주기 후 대략 106 내지 107개 카피)가 생성될 것이다. 기하급수적으로 증폭된 SGP-SGP 핵산 중합체의 수와, 결과적으로 이로부터 유래된 단축형 SGP 핵산 중합체의 수는, 증폭 주기가 진행됨에 따라 선형 증폭에 의해 지속적으로 생성되는 SGP 핵산 중합체의 수를 작게할 것이다.
당업자는 SGP에 의해 생성된 SGP-SGP 핵산 중합체의 잠재적 총 수가 게놈의 크기 및 프라이머 길이와 관계가 있다는 것을 인식할 것이다. 따라서, 증폭 제1 주기시 생성된 SGP 핵산 중합체의 바람직한 수는 하프-타임 연장 단계 동안 단축형 SGP 핵산 중합체를 생성할 수 있는 SGP-SGP 핵산 중합체의 목적 수 (즉, 보다 고 차수의 구조물을 형성하는데 이용 가능한 단축형 SGP 핵산 중합체의 목적 수)의 함수로서 결정할 수 있다. 이러한 결정은 다음에 추가로 상세 기재된 본 발명의 SGP 프라이머를 설계하는데 도움을 줄 것이다.
보다 고 차수의 구조물을 형성하는데 이용 가능한 단축형 SGP 핵산 중합체의 목적 수를 결정하는데 있어서, 당업자는 mPCR에 의해 기하급수적으로 증폭된 SGP-SGP 핵산 중합체의 일부 만이 단축형 SGP 핵산 중합체의 생성에 사용되므로, 이러한 일부가 하프-타임 연장 단계에서 완전히 연장할 수 없는 보다 긴 SGP-SGP 핵산 중합체를 포함한다는 사실을 인식할 것이다. mPCR에 의해 기하급수적으로 증폭되는 SGP-SGP 핵산 중합체의 서열이 3' 말단에 프라이머의 역배향 상보체의 뉴클레오티드 서열을 포함하기 때문에, 이러한 SGP-SGP 핵산 중합체의 일부에 대한 연장을 완료시키기 위해서는 풀-타임 연장 단계가 필요하고, 하프-타임 연장 단계로는 단축형 SGP 핵산 중합체, 즉 3' 말단에 프라이머의 역배향 상보체를 함유하지 않는 핵산 중합체가 생성될 것이다. 한편, mPCR에 의해 기하급수적으로 증폭되는 SGP-SGP 핵산 중합체 중의 일부가 이들 보다 긴 SGP-SGP 핵산 중합체 보다 상당히 더 짧다. 하프-타임 연장 단계에 할당된 시간 내에 완전히 연장되는 상기 SGP-SGP 핵산 중합체는 mPCR의 모든 후속 주기에서 지속적으로 기하급수적으로 증폭될 것이므로; 다음에 기재되는 바와 같이, 이들 SGP-SGP 핵산 중합체는 통상적으로, 보다 고 차수의 구조물의 일부가 되지 못할 것이다. 당업자는 mPCR을 이용한 기하급수적 증폭을 진행하고 있는 일정 길이의 SGP-SGP 핵산 중합체 내에 SGP 프라이머의 역배향 상보체를 무작위로 위치시키는 경우에 하프-타임 연장 단계를 도입하면, 단축형 SGP 핵산 중합체를 창출시키기 위해 사용되는 SGP-SGP 핵산 중합체의 대략 절반이 생성될 것이란 사실을 인식할 것이다.
기하급수적으로 증폭된 SGP-SGP 핵산 중합체의 대략 50％가 하프-타임 연장 단계에 의해 연장된 부분 내에 SGP 프라이머 결합 부위를 함유하지 않을 것이기 때문에, 이는단축형 SGP 핵산 중합체의 생성에 참여할 것이다. 이러한 단축형 SGP 핵산 중합체는 SGP 프라이머와 결합할 수 있는 서열을 포함하지 않을 것이기 때문에, 이들은 보다 고 차수의 구조물을 형성할 것이다.
mPCR에 의해 기하급수적으로 증폭된 SGP-SGP 핵산 중합체의 기타 대략 50％는 SGP 프라이머 결합 부위를 여전히 함유할 것이다. 부가적으로, SGP-SGP 중합체를 상보적 서열과 함께 어닐링시켜 이중 가닥의 SGP-SGP 중합체를 창출시키는 것은 안정적이고 신속하게 일어나는 경향이 있기 때문에, SGP-SGP 핵산 중합체는 보다 고 차수의 구조물을 형성하는데 통상 활용되지 않을 것이다.
예를 들어, 길이가 9개 염기인 SGP 프라이머를 7,000개 부위와 어닐링시킬 수 있고, 이로써 생성되는 SGP 핵산 중합체를 길이 2,000개 염기로 연장시킬 수 있다고 가정하면, 게놈 DNA의 1.4 x 107개 염기, 즉 예를 들어, 길이 2 x 109개 염기의 단일 가닥 게놈 DNA 주형의 1/142가 SGP 핵산 중합체로서 카피될 것이다. SGP에서는, 이들 7,000개 SGP 핵산 중합체의 대략 50 내지 70개가 SGP 결합 부위를 포함할 것이다 (상기에서와 같이, 100개 SGP 핵산 중합체 중의 대략 1개가 SGP 프라이머 결합 부위를 함유하도록 SGP 프라이머를 설계하였다고 가정하였다). 이들 대략 50 내지 70개의 SGP 핵산 중합체는 SGP의 mPCR 단계 동안 기하급수적으로 증폭될 SGP-SGP 핵산 중합체를 효과적으로 생성시킬 것이다. mPCR 22 내지 24주기 후, 및 하프-타임 연장 단계 후, 대략 25 내지 35개 별개의 단축형 SGP 핵산 중합체의 몇 개 카피 (예를 들어, 106 내지 107) (이는 보다 고 차수의 구조물을 형성할 것이다)는 상기 기하급수적으로 증폭된 SGP-SGP 핵산 중합체로부터 비롯되는 것으로 예상된다. 따라서, 하프-타임 연장 단계는 보다 고 차수의 구조물을 형성하기 위한 단축형 SGP 핵산 중합체를 생성시킬 뿐만 아니라 상이한 길이의 SGP-SGP 핵산 중합체들 간을 구별시켜 준다.
추가의 예로서, SGP에서 풀-타임 mPCR 주기 동안 기하급수적으로 증폭되는 몇개의 SGP-SGP 중합체가 1 kb, 0.8 kb, 0.6 kb, 0.4 kb 및 0.2 kb의 SGP-SGP 핵산 중합체라고 가정하고, 또한 이들 반복적 mPCR 주기에서 연장 단계의 타이밍이 1 kb 중합체를 연장시키기에만 충분하다고 가정한다. 당업자는 후속 "하프-타임" 연장 단계 동안에 생성되는 중합체가 각각 대략 0.5 kb, 0.5 kb, 0.5 kb, 0.4 kb 및 0.2 kb일 것으로 이해할 것이다. 이러한 mPCR 주기가 진행되고, 새로이 연장된 DNA의 중합체가 그들 개개의 상보적 주형 가닥으로부터 변성됨에 따라, 처음 열거된 3개의 중합체 [즉, 본래 보다 큰 길이 (1 kb, 0.8 kb 및 0.6 kb)인 개개의 주형 가닥으로부터 카피된, 길이 0.5 kb의 중합체들]은 그들의 3' 말단에 프라이머 서열의 역배향 상보체를 갖지 않을 것이고, 이들은 모두 대략 동일한 길이 (즉, 0.5 kb)일 것이다. 이들 단일 가닥의 단축형 SGP 핵산 중합체는 파형 프로파일의 생성에 필수적인 보다 고 차수의 구조물을 형성하는데 이용 가능할 것이다. 그러나, 0.4 kb 및 0.2 kb 길이의 개개의 주형 가닥으로부터 연장된 중합체는 완전한 길이일 것인데, 즉 프라이머 서열의 역배향 상보체가 이들 카피의 3' 말단에 존재할 것이고, PCR 증폭의 후속 주기가 SGP-SGP 핵산 중합체를 지속적으로 생성시켜 이들이 보다 고 차수의 구조물 형성에 참여하는데 이용 가능하지 않도록 할 것이다.
C. 단일 게놈 프로파일을 검출함
기하급수적 증폭, 즉 mPCR이 SGP 방법에 사용되기 때문에, 관심있는 게놈 DNA의 다중 카피로 반드시 시작할 필요는 없다. 예를 들어, (비-SGP) 파형 프라이머가 각 단일 가닥 게놈 DNA 주형을 따라 103개 부위와 결합할 수 있고, (기타 파형 프로파일링 방법은 일반적으로, 상기 언급된 바와 같이 106개 이상 유기체를 이용하여 해당 과정을 시작해야 하기 때문에) 선형 증폭 주기당 생성된 핵산 중합체의 총 수는 대략 2 x 109개 (게놈 DNA 주형당 103개 핵산 중합체 x 유기체당 2개 게놈 DNA 주형 x 106개 유기체)라고 추정한다. 기타 파형 프로파일링 방법에서는, 선형 증폭 주기를, 예를 들어 22 내지 24회 반복할 수 있다 (즉, 2 x 103개 상이한 단일 가닥 22 내지 24 세트가 생성된다). 이와는 달리, 본 발명의 한 양태는 SGP 방법을 이용한 파형 프로파일링이 잠재적으로, 증폭 공정 시작시 단지 단일 카피의 게놈 서열 만이 샘플에 존재하는 경우에 (효율적인 추출로 가정함) 달성될 수 있다는 사실에 관한 것이다. 게놈 1개 카피로부터 시작하여 mPCR 증폭을 여러 주기 (예를 들어, 22 내지 24 주기) 수행한 후, SGP 프라이머 결합 부위에 의해 일괄되는 게놈 DNA의 각각의 별개 영역, 즉 각 별개의 SGP-SGP 핵산은 106 내지 107배 정도로 카피될 것이다 (즉, 대략 106 내지 107개 카피가 존재할 것이다). 기타 파형 프로파일링 방법에 비해 상기와 같이 개선된 것은, 예를 들어 SGP 방법을 사용하여 샘플 중의 세균의 존재를 검출 및 확인하는데 있어서의 민감도가 훨씬 더 크기 때문이다.
상기 언급된 바와 같이 연장된 단축형 SGP 핵산 중합체는 SGP 프라이머 결합 부위에 의해 일괄되는 게놈 DNA 영역과 동일한 SGP-SGP 핵산 중합체로부터 유래되기 때문에, 이러한 단축형 SGP 핵산 중합체는 검출되는 유기체의 독특한 서열 차이를 포함할 것이다. SGP에서는, 하프-타임 연장 단계 동안 생성된 몇개의 단일 가닥의 단축형 SGP 핵산 중합체 각각의 카피가 서로 반응하여 보다 고 차수의 구조물, 즉 수 많은 단축형 SGP 핵산 중합체를 포함하는 복합체를 형성할 것이다. 이러한 보다 고 차수의 구조물은 상이한 안정성을 지닐 것이고, 단축된 단일 가닥의 염기 서열에 따라서, 즉 유기체의 독특한 게놈 정보에 근거하여 상이한 융점 (Tm)에서 해리될 것이다. 특정 유기체로부터 유래된 보다 고 차수의 구조물을 결정하고 기록할 수 있으며; 이는 보다 고 차수의 DNA 구조물 내로 삽입되는 형광성 작용제, 즉 삽입제를 사용하여 달성한다. 따라서, SGP를 사용하여 파형 프로파일 분석을 통하여, 즉 보다 고 차수의 구조물의 해리를 검출 및 기록함으로써 상이한 유기체의 게놈 DNAs를 검출, 비교 및 구별할 수 있다.
특별한 샘플의 보다 고 차수의 구조물은 샘플 온도를 상승시킴으로써 해리된다. 보다 고 차수의 DNA 구조물이 해리됨에 따라, 이들 보다 고 차수의 구조물에 삽입된 형광성 작용제 또한 해리된다. 상승 온도의 함수로서, 이들 보다 고 차수의 구조물의 해리에 의해 수득된 형광 세기 변화율을 플롯하면, 해당 유기체의 게놈 DNA에 대해 독특한 파형이 생성되는데, 즉 상이한 융점 (Tm)에서 보다 고 차수의 DNA 구조물을 관찰하고 기록하여 특징적인 파형 프로파일을 생성시킨다. 샘플 중에 유기체가 존재한다는 것을 표시하는 파형 프로파일은 양성 파형 프로파일로 지칭되고; 유기체가 샘플에 전혀 존재하지 않는 경우에는 음성 파형 프로파일이 생성된다.
본 발명의 몇몇 양태에서, 적당한 (양성) 파형 프로파일의 존재는 샘플 중에 특정 유기체가 존재한다는 지표이다. 기타 양태에서, 특징적인 파형 프로파일은 유기체의 특별한 종 (또는 균주), 예를 들어 세균 종 또는 균주의 지표이다. 따라서, SGP 방법은 파형 프로파일링 방법을 사용하여 각 유기체에 대한 독특한 파형 프로파일을 수득하기 위해 삽입제를 사용하여 제1 유기체로부터의 게놈 DNA와 제2 유기체로부터의 게놈 DNA 간을 구별시켜 줄 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, SGP의 mPCR 단계는 다수 증폭 주기, 즉 다음 단계들의 다수 주기를 포함한다: 1) 각 게놈 DNA를 게놈 DNA 주형으로 변성시키는 단계; 2) SGP 프라이머를 각 게놈 DNA 주형 및 앞서 생성된 모든 SGP 핵산 중합체 및 SGP-SGP 핵산 중합체를 따라 몇개의 별개의 SGP 프라이머 결합 부위와 어닐링시키는 단계; 및 3) SGP 프라이머 결합 부위와 어닐링시킨 각 프라이머로부터 SGP 핵산 중합체와 SGP-SGP 핵산 중합체를 연장시키는 단계. 특히, 증폭 1 주기 동안 샘플 온도를 상승시켜 (예를 들어, 95 내지 98℃) 모든 이중 가닥 핵산 중합체 (게놈 DNA 포함)를 변성시킨다. 온도를 후속 강하시켜 (예를 들어, 25℃) SGP 프라이머가 이용 가능한 모든 SGP 프라이머 결합 부위와 어닐링될 수 있도록 한다. 상기 프라이머로부터 SGP 핵산 중합체와 SGP-SGP 핵산 중합체를 연장시키는, 주기 최종 단계는, 예를 들어 Taq 폴리머라제를 사용하여 대략 72℃ 하에 수행한다. 최종적으로, 증폭 마지막 주기 중의 하나에서는 연장 단계 시간을, 예를 들어 40 내지 60％ (예를 들어, 50％) 감소시켜 단축형 SGP 핵산 중합체를 생성시킨다. 당업자는 부가의 하프-타임 연장 단계를 도입하는 부가의 주기를 본 발명에 포함시켜 보다 정확하고/하거나 강건한 파형 프로파일을 생성시킬 수 있다는 사실과, 이들 주기에 이어, 해당 생성물 (예를 들어, 본 발명의 SGP-SGP 핵산 중합체)를 증폭시키기 위해 포함된 부가의 풀-타임 연장 단계를 도입하는 부가의 주기를 수행할 수 있다는 것을 인지할 것이다.
당업자는 증폭 과정 고유의 변성, 어닐링 및 연장 단계에 필수적인 온도 상의 변경을 포함하는 반복적 사이클링 단계를 수행할 수 있는 기구 또는 기계를 이용하는 것을 알고 있을 것이며; 이러한 기계에는 본 발명의 기구, 당해 분야에 공지된 PCR 기계, 및 "제노패턴 (Genopattern) 분석기 GPlOOO" 기계 (공급처: Adgene)가 포함되지만, 그에 제한되지 않는다. 본 발명에 필요한 mPCR 사이클링 단계를 수행할 수 있는 장치를 생산하는 기타 업체에는 퍼킨-엘머 (Perkin-Elmer; Wellesley, MA), 어플라이드 바이오시스템즈 (Applied Biosystems; Foster City, CA), 또는 MJ 리서치 (MJ Research; Waltham, MA)가 포함되지만, 그에 제한되지 않는다. 이러한 기계들은 온도를 변화시키고 재설정하는 각종 단계의 타이밍과 기간을 변경시킬 수 있으므로, 상기 기계들은 풀-타임 연장 단계와 본 발명의 본질적 하프-타임 연장 단계 둘 다를 생성시키는데 있어 유용할 것이다. 또한, 당업자는 유기체의 게놈 DNA를 검출하기 위해 SGP를 사용하는 각종 국면에 도움을 주는 부가의 물질을 이용할 수도 있는데; 이에는 추출용 시약 키트 [이들 중 몇 가지가 당해 분야에 공지되어 있는데, 예를 들어 Xtrana technologies, 예를 들면 XTRA AMP® 추출 시스템 (공급처: Xtrana Inc., Broomfield, CO)이다]; 파형 프로파일링에 의해 생성된 결과를 해석하기 위한 분석용 소프트웨어 [예: GenoMaster (공급처: Adgene)]; 및 프라이머-설계 지지용 도구 [예를 들어, 기타 파형 프로파일링 방법에 사용된 "Design Support Tool for Genopattern Primer", 및 GenoSequenceAnalyzer 소프트웨어 (공급처: Adgene)]가 포함되지만, 그에 제한되지 않는다. 당업자는 상기 소프트웨어 및/또는 도구의 파라미터 및/또는 프로토콜을 SGP에 유용하도록 조정할 수 있을 것이다.
D. 단일 게놈 프로파일링 프라이머
당해 분야에 널리 공지된 방법을 사용하여, SGP 프라이머가 각 단일 가닥 게놈 DNA 주형을 따라 몇개의 별개의 부위와 결합하도록 SGP 프라이머를 설계한다. 본 발명의 한 양태에서는, SGP 프라이머를 사용하여 특정 유기체, 예를 들어 세균 및 바이러스로부터의 모든 게놈 DNA의 존재 여부를 검출한다. 본 발명의 또다른 양태에서는, SGP 프라이머를 특별한 유기체, 예를 들어 세균의 특별한 종 또는 균주를 검출하는데 사용하도록 맞춘다. 당업자는 게놈 DNA의 길이와 서열을 고려함으로써 일반적으로 세균, 또는 세균의 특별한 종 또는 균주의 게놈 DNA를 검출하기 위해 사용되는 SGP 프라이머의 길이와 서열을 결정할 수 있다. 당업자는 그들 게놈 DNAs의 서열에 관하여 몇 가지 세균 종을 조사할 것이고, 이들 종 대부분 또는 전부를 검출할 수 있는 프라이머의 서열을 추론할 것인데; 이러한 유형의 프라이머는 종종 "만능" 프라이머로서 지칭된다. 만능 SGP 프라이머, 및 특별한 종 또는 균주에 대해 특이적인 SGP 프라이머는 당업자에 의해 시행된 간단한 실험 시도 후에 결정한다.
당업자는 SGP 프라이머의 길이와, SGP 프라이머가 게놈 DNA 주형을 따라 몇개의 SGP 프라이머 결합 부위, 즉 상보적 서열과 결합할 수 있는 능력은 반비례한다는 것을 인지할 것인데, 즉 프라이머 길이가 더 짧을 수록, 게놈 DNA 주형을 따라 프라이머와 결합될 별개의 SGP 프라이머 결합 부위 수가 더 많아진다. 이와 반대로, 프라이머 길이가 더 길수록, 게놈 DNA 주형을 따라 프라이머와 결합될 별개의 SGP 프라이머 결합 부위 수가 더 적어진다. 또한, 프라이머 길이에 관한 동일한 분석이, SGP 프라이머의 상보적 서열과 SGP 프라이머의 역배향 상보적 서열이 일정 길이의 게놈 DNA 주형을 따라 미리 조절한 거리 (즉, 미리 조절한 SGP 핵산 중합체의 최대 길이) 내에서 일어날 확률에도 적용된다. 따라서, 프라이머 길이가 더 짧을 수록, SGP 프라이머 결합 부위의 역배향 상보체가 SGP 프라이머 결합 부위로부터의 하류에 미리 조절한 거리 내에 존재할 확률이 더 커진다. 당업자는 미리 조절한 거리는 풀-타임 연장 단계를 포함하는 시간에 의해 결정할 것이고, 상기 프라이머 결합 부위의 역배향 상보체가 이러한 미리 조절한 거리 내에 존재하는 경우에는, 기하급수적 증폭이 일어난다는 것을 인식할 것이다. 최종적으로, 당업자는 또한 서열 함량이 프라이머를 설계하는데 있어 일정 역할을 한다는 사실을 인식할 것이다. 일반적으로 이들 요인을 이용하여 프라이머를 설계하는 것은 당해 분야에서 통상적인 방법이 되었다 [참고: 예를 들어, Burpo (2001) "A critical review of PCR primer design algorithms and cross-hybridization case study," available in "Computational Molecular Biology" course materials, Stanford University (cmgm.stanford.edu/biochem218/Projects％202001/Burpo.pdf)].
결과적으로, 당업자는 게놈 DNA의 길이와 서열, 및 프라이머의 목적하는 길이와 특이성을 고려함으로써 적당한 SGP 프라이머를 설계할 수 있을 것이다. 본 발명의 한 양태에서, 소정 주파수를 이용하여 SGP 프라이머가 각 단일 가닥의 게놈 DNA 주형과 결합하도록 SGP 프라이머를 설계한다. 본 발명의 또다른 양태에서는, 소정 주파수를 이용하여 SGP 프라이머가 SGP 핵산 중합체의 기하급수적 증폭에서 정배향 프라이머와 역배향 프라이머로서 작용할 수 있도록 SGP 프라이머를 설계한다.
당업자는 SGP하기 위한 프라이머 (이에는 "만능" 프라이머, 및 예를 들어, 세균의 특별한 종 및 균주를 검출하기 위한 프라이머가 포함된다)를 설계하는데 있어서의 보조로서 파형 프라이머의 발생과 기타 파형 프로파일링 방법과 관련된 물질 및 소프트웨어 프로그램 (예를 들어, Adgene로부터 입수 가능함)을 기대할 것이다. 그러나, 당업자는 SGP에 정확히 기능하는 프라이머를 생성하기 위해 프라이머들을 설계하기 위한 기타 파형 프로파일링 방법에 관한 기술과 파라미터들을 정련시킬 필요가 있다는 것을 인식할 것이다. 예를 들어, 기타 파형 프로파일링 방법은 특이적 부분과 비특이적 안정화 부분 (상기 언급된 바와 같음) 둘 다를 함유하는 프라이머를 활용하는데; 본 발명의 SGP 프라이머는 비특이적 안정화 부분을 함유하지 않는다. 또한, 당업자는 SGP 프라이머가 (기타 파형 프로파일링 방법에서의 프라이머와 비교해서) 각 단일 가닥의 게놈 DNA 주형을 따라 보다 많은 수의 결합 부위와 결합하는 것이 필요하다는 것을 인식할 것인데, 이는 적어도 부분적으로는 SGP 핵산 중합체의 특정 비율 만이 프라이머 결합 부위의 하류에 있는 미리 조절한 거리 내에 프라이머의 역배향 상보체를 포함하는 서열을 가질 것이기 때문인데, 즉 단지 특정 비율 만이 기하급수적 증폭을 진행할 것이고, 이로써 SGP-SGP 핵산 중합체가 생성될 것이기 때문이다. 추가로, 기하급수적 증폭을 진행하는 SGP-SGP 핵산 중합체의 특정 비율 (예를 들어, 대략 50％) 만이 하프-타임 연장 단계 동안 단축형 SGP 핵산 중합체를 생성시킬 것이다.
SGP하기 위한 프라이머는 기타 파형 프로파일링 방법에 사용된 프라이머 보다 더 짧도록 (보다 적은 염기) 설계하는데, 이는 SGP-SGP 핵산 중합체가 생성되는 확률은 프라이머 길이가 감소함에 따라 증가하기 때문이다. 이러한 이유로 인해, 당업자는 기타 파형 프로파일링 방법에 대해 제안/권장된 것 보다 더 짧은 길이의 프라이머를 설계할 것이다. 예를 들어, 아드젠 (Adgene)은 한 도면 (즉, 도 4)에 파형 프라이머의 한 예를 제시한다 [참고: "A Method for Comparison and Identification of DNAs and RNAs by Pattern Analysis: Genopattern Method" (available from Adgene)]. 이러한 파형 프라이머는 11개 염기 비특이적 안정화 부분과 8개 염기 특이적 부분을 함유한다. 당업자는 비특이적 부분을 제외시키고, 총 SGP 프라이머 내의 염기 수를, 아드젠의 파형 프라이머의 특이적 부분 내의 염기 수보다 적은 수로 감소시킴으로써 SGP용 프라이머를 설계할 것이다. 예를 들어, 길이가 6개 또는 7개 염기인 프라이머를 SGP용으로 설계할 수 있다. 특별한 파형 프라이머의 특이적 부분이 보다 많은 염기를 함유하는 한 양태에서는, 상응하는 SGP 프라이머에 관한 설계 또한, 보다 많은 염기를 함유할 수 있다.
SGP 방법에 의해 검출될 수 있는 세균은 이미 설계된 만능 파형 프라이머에 의해 검출되는 것들이고; 이러한 프라이머는 당해 분야에 공지되어 있으며 비브리오 파라해모리티쿠스 (Vibrio parahaemolyticus); 슈도모나스 애루기노사 (Pseudomonas aeruginosa); 살모넬라 티피무륨 (Salmonella typhimurium); 클랩시엘라 뉴모니애 (Klebsiella pneumoniae); 캄필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni); 쉬겔라 손네이 (Shigella sonnei); 엔테로코쿠스 패칼리스 (Enterococcus faecalis); 해모필루스 인플루엔재 (Haemophilus influenzae); 헬리코박터 필로리 (Helicobacter pylori); 스트렙토코쿠스 피요게네스 (Streptococcus pyogenes); 미코박테륨 보비스 (Mycobacterium bovis); 에스케리챠 콜라이 (Escherichia coli); 바실루스 세레우스 (Bacillus cereus); 스타필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus); 및 바실루스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)를 검출하는데 유용하다. 기타 프라이머 (이들 중 몇 가지는 세균의 개개 종 및 균주를 구별하기 위해 사용될 수 있다) 또한, 기타 파형 프로파일링 방법에 사용하기 위해 아드젠으로부터 입수 가능하다. 상기 언급된 바와 같이, 당업자는 공지된 파형 프라이머에 기초하여 SGP에 유용한 프라이머를 생성하기 위해, 프라이머의 설계를 변경시키거나 또는 프라이머의 설계 방법을 변화시킬 것이다. 또한, 당업자는 관심있는 유기체(들)의 게놈 물질을 분석하고 일련의 간단한 실험 시도를 수행함으로써, 그에 대한 파형 프라이머를 설계한 적이 전혀 없는 유기체 (예를 들어, 기타 세균 및 바이러스)에 대한 적당한 SGP 프라이머를 설계할 것이다.
당업자는 특정 샘플, 예를 들어 수 샘플을 시험하는데 SGP를 적용할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 유기체를 단리하고, 결과적으로 이러한 유기체의 게놈을 단리하는 방법은 샘플에 좌우될 것이며, 이는 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 일단 잠재적 게놈 DNA가 단리되면, SGP 방법을 사용하여 게놈 DNA의 존재를 검출할 수 있고, 따라서 유기체의 존재를 검출할 수 있다. 특정 상황, 예를 들어 샘플이 멸균성이어야 하거나 샘플에 오염물이 비교적 없어야 하는 경우에는 (예: 수 샘플), 특정 유기체에 의한 오염을 검출하는 데에 상기 검출이면 충분하다. 유기체를 확인할 필요가 있는 경우에는, 보다 특이적인 기타 SGP 프라이머를 사용할 수 있다.
III. 본 발명의 자동화 인라인 플랫폼을 이용하는 방법
본 발명은 또한, 샘플 중의 유기체의 존재를 검출하고, 연속해서 임의로 오염성 유기체를 분류하기 위해 본 발명의 기구를 사용하는 방법, 즉 특정 유기체로부터 단리한 게놈 물질을 제조 (예를 들어, 단리, 처리, 반응 시약과의 혼합), 증폭 (예를 들어, PCR, 파형 프로파일링 등에 의함) 및 검출 (예를 들어, 스크리닝, 정량화, 확인)하고/하거나 이러한 게놈 물질을 추가 분석 (예: 서열 분석)용으로 임의 선별하기 위해 본 발명의 미소유체 장치 및 기기를 사용하는 방법을 제공한다. 일반적으로, 본 발명의 방법은 1) 1개 이상의 DNA 샘플 소적을 본 발명의 미소유체 장치의 미소유체 인라인 반응 채널 내로 흡인시키는 단계; 2) 1개 이상의 DNA 샘플 소적을 프라이머 플러그와 혼합하여 1개 이상의 DNA 샘플 플러그를 형성시키는 단계; 3) 1개 이상의 DNA 샘플 플러그를 미소유체 반응 채널을 따라 본 발명의 미소유체 장치의 제1 온도-제어 영역 내로 구동시키는 단계 (여기서, DNA 샘플 플러그를 대상으로 하여 변성, 어닐링 및 연장을 포함한 1회 이상의 증폭 주기를 수행한다); 4) DNA 샘플 플러그에 제1 온도와 제2 온도 사이의 온도를 적용함에 따라 제2 온도-제어 영역에서 증폭된 DNA 생성물을 검출하는 단계; 및 5) 추가 분석 (예: 서열 분석)용 DNA 샘플 플러그를 임의 선별하는 단계를 포함한다. 본원에 기재된 방법으로, 당업자는 오염성 유기체가 단지 소량으로만 존재하는 경우에도 오염에 대해 스크리닝하기 위해 지속적으로 모니터링할 수 있고, 이러한 오염 수준을 정량화할 수 있고/있거나 오염성 유기체를 확인할 수 있다.
A. DNA 샘플을 증폭시킴
상기 언급된 바와 같이, 증폭 공정은 증폭 영역, 즉 본 발명의 미소유체 장치의 제1 온도-제어 영역 내에서 일어난다. 칩의 제1 온도-제어 영역 내에서는, 각 미소유체 인라인 반응 채널을 국한적 방식으로 반복적이고도 신속하게 가열 및 냉각시켜서, DNA 증폭 방법, 예를 들어 PCR, 파형 프로파일링, SGP 등의 변성, 어닐링 및 연장 단계가, 각 샘플 플러그가 일정 길이의 미소유체 반응 채널을 따라 이동함에 따라 이러한 각 샘플 플러그 상에서 수행되도록 한다. 당업자는 1개 이상의 DNA 분자를 포함하는 샘플 플러그, 즉 DNA 샘플 플러그 만이 증폭된 DNA 생성물을 산출할 것으로 인식할 것이다. 본 발명의 한 양태에서는, PCR을 증폭 공정으로서 선택한다. 또다른 양태에서는, 파형 프로파일링을 본원에 기재된 자동화 인라인 플랫폼 상에서 수행한다. 또다른 양태에서는, 파형 프로파일링 방법이 SGP 방법 (이에는 SGP 프라이머의 도입, mPCR 사이클링, 보다 고 차수의 구조물 형성, 및 증폭된 단축형 SGP 핵산 중합체의 검출 및 분석이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다)이고, 이러한 SGP 파형 프로파일링 방법은 본원에 기재된 자동화 인라인 파형 프로파일링 장치를 사용하여 수행한다.
따라서, 본 발명은 (a) 1종 이상의 유기체를 포함하는 샘플을 획득하는 단계; (b) 상기 샘플 중에 상기 유기체의 게놈 물질의 1개 이상의 카피가 존재하는 경우에는 상기 카피를 단리하는 단계; (c) 1개 이상의 샘플 소적을 미소유체 반응 채널 내로 흡인시키는 단계; (d) 1개 이상의 샘플 소적을 프라이머 플러그와 혼합하여 1개 이상의 샘플 플러그를 형성시키는 단계 (상기 프라이머 플러그는 1종 이상의 프라이머, 뉴클레오티드, DNA 폴리머라제 및 삽입제를 포함한다); (e) 상기 1개 이상의 샘플 플러그를, DNA의 각 카피를 제1 및 제2 DNA 주형으로 변성시킬 제1 온도로 가열하는 단계; (f) 상기 1개 이상의 샘플 플러그를, 상기 프라이머가 각각의 게놈 DNA 주형과 어닐링되는 제2 온도로 냉각시키는 단계; (g) 상기 1개 이상의 샘플 플러그를, 제1 온도와 제2 온도 사이의 제3 온도로 재가열하여 상기 프라이머가 게놈 DNA와 어닐링된 상태로 유지되고 DNA 폴리머라제가 상기 어닐링된 프라이머로부터 유래되는 핵산 중합체를 연장시키도록 하는 단계; (h) 상기 제3 온도를 제1 시간 동안 유지시키는 단계 (즉, 풀-타임 연장); (i) 단계 (e) 내지 (h)를 1회 이상 반복하는 단계; 및 (j) 이로써 생성되는 증폭된 생성물을 검출하는 단계를 포함하는 [적어도 단계 (c) 내지 (j)는 본 발명의 기구 내에서 일어난다], 샘플 중의 유기체의 존재 또는 부재를 검출하는 방법을 제공한다. 당업자는 이러한 양태가 선택된 프라이머(들)에 따라서 PCR과 파형 증폭 방법 둘 다를 유효하게 한다는 것을 인식할 것이다. SGP 방법의 하프-타임 연장 단계를 달성하기 위해, 상기 언급된 방법을 변형시켜, 단계 (i) 이후 및 단계 (j) 이전에, (1) 단계 (e) 내지 (g)를 반복하는 단계; (2) 상기 제3 온도를, 제1 시간의 약 40 내지 60％ (바람직하게는, 약 50％) 길이의 시간 동안 유지시키는 단계; 및 (3) 상기 1개 이상의 샘플 플러그를, 제2 온도보다 낮거나 동일한 제4 온도로 냉각시켜서, 삽입제를 함유하는 보다 고 차수의 구조물이 형성되도록 하는 단계를 추가로 포함할 수 있도록 한다. 당업자는 증폭 공정이 PCR인 경우에는 단계 (j)의 검출 단계가 하나의 온도에서 일어날 수 있다는 것을 인식할 것이다. 이와는 달리, 파형 프로파일링이 증폭 공정으로 선택된 경우에는, 단계 (j)의 검출 단계가 소정 범위의 온도에서 일어나야 한다. 상기 언급된 바와 같이, 각 샘플 플러그에 적용되는 증폭 주기 수는 1) 미량 금속에 적용된 전압의 타이밍, 및 2) 샘플의 유속 중의 어느 한 가지 또는 둘 다를 변화시킴으로써 제어할 수 있다. 각 샘플 플러그에 적용되는 증폭 주기 수와, 각 주기 타이밍은 긍극적으로는, 선택된 증폭 공정 [예: PCR, 파형 프로파일링 방법 (예: SGP 방법)], DNA 샘플 플러그당 DNA 분자의 수, 및/또는 PCR이 선택된 경우에는 증폭되는 DNA 영역의 길이에 좌우될 것이다. 각 주기 타이밍과, 시험된 각 샘플 플러그에 대한 주기 수는 과도한 부하없이 당업자에 의해 결정될 수 있는 실험적 조건이다. 당업자는 본원에 기재된 검출 단계를 사용하여 오염성 유기체(들)에 대해 스크리닝할 수 있고, 샘플의 오염 수준을 정량화할 수 있고/있거나 오염성 유기체(들)를 확인할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 이러한 검출 방법은 다음에 보다 상세히 기재되어 있다.
B. DNA 샘플을 검출함
본 발명의 미소유체 장치의 검출 영역은 증폭된 DNA 생성물로부터의 신호를 모니터링할 수 있게 해준다. 검출은 증폭된 DNA 생성물의 광학적, 화학적, 전기화학적, 열적 또는 기타 특성에 근거하여 이루어질 수 있다. 한 양태에서, 증폭된 DNA 생성물로부터의 신호를 검출하는 것은 광학 검출 시스템을 사용하여 달성하는데, 예를 들어 증폭된 DNA 생성물이 형광성인 경우에, 검출기는 전형적으로, 형광성 생성물을 활성화시키기에 적당한 파장에서 빛을 생성하는 광원 뿐만 아니라 광원이 검출 영역을 통하여 미소유체 반응 채널 내의 DNA 샘플 플러그에 함유된 생성물을 향하도록 지시하기 위한 광학 장치를 포함할 것이다.
당업자는, 예를 들어 증폭된 형광성 DNA 생성물을 여기시키는데 적당한 파장을 고려함으로써 증폭된 DNA 생성물을 검출하는데 필요한 광원을 결정할 수 있을 것이다. 레이저, 레이저 다이오드 및 LEDs를 포함하지만 그에 제한되지 않는, 적당한 파장을 제공하는 모든 광원을 사용할 수 있다.
형광 검출은 적당한 검출기, 예를 들어 광전자증배관 (photomultiplier tube)을 사용하여 달성한다. 본 발명의 방법에 의해 생성된 증폭된 DNA 생성물은, 예를 들어 증폭된 DNA 생성물을 단지 하나의 온도에서만 검출할 필요가 있는 경우 (예를 들어, PC 증폭된 DNA 생성물)에는 이들 생성물이 검출기를 통과함에 따라 검출할 수 있다. 또다른 한편, 검출기는 고정되거나 (같은 상태를 유지함) 또는 예를 들어, 파형 프로파일링 방법 (예: SGP 방법)에 의해 증폭된 DNA 생성물의 Tm 분석을 수행하기 위해, 예를 들어 증폭된 DNA 생성물에 상이한 융점을 적용시킴에 따라 형광을 검출하기 위해 증폭된 DNA 생성물과 함께 움직일 수도 있다.
증폭된 DNA 생성물을 검출하기 위해서는, 적어도 DNA를 포함하는 샘플 플러그에 검출가능한 시약을 부가해야만 한다. 각종 형태의 검출, 예를 들어 광학적, 화학적, 전기화학적 및 열적 검출을 위한 검출가능한 작용제는 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 바람직한 검출가능한 작용제는 증폭된 DNA 생성물의 존재에서만 검출될 수 있는 것이다. 이러한 검출가능한 작용제는 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 이에는 형광성 삽입제가 포함되지만, 그에 제한되지 않는다. 본 발명의 방법에서는 검출가능한 작용제를, DNA의 증폭 동안에는 검출 영역의 하류에 있는 각 샘플 플러그에 가할 수 있고 (예를 들어, 샘플 제조시 반응 시약으로서 가함), 검출가능한 작용제를 검출 영역의 하류에 있는 샘플 플러그에 부가하는 한은 이러한 샘플 플러그에 증폭 주기를 적용한 직후이다. 본 발명의 방법에서, 검출가능한 작용제를 포함하는 샘플 플러그가 제2 온도-제어 영역으로 이동함에 따라, 증폭된 DNA 생성물 (예: PCR 증폭된 생성물, 예를 들어 SGP 방법에서 파형 프로파일링 방법에 의해 생성된 보다 고 차수의 DNA 구조물의 해리)을 검출할 수 있다. 당업자는 PCR 증폭된 생성물의 검출은 하나의 온도에서 일어날 수 있는 반면, 파형 프로파일링 방법 (SGP 방법 포함)에 의해 생성된 보다 고 차수의 구조물의 해리를 검출하기 위해서는 2가지 이상의 상이한 온도가 필요하다는 것을 인식할 것이다. PCR 증폭된 생성물을 검출할 수 있는 온도 (예: 실온)는 사용된 검출가능한 작용제에 의해 좌우된다. 부가적으로, 파형 프로파일링 방법 (예: SGP)에 의해 생성된 보다 고 차수의 구조물의 해리를 검출하는 것, 즉 융점 곡선 분석은 소정 범위의 온도, 예를 들어 65 내지 95℃에 걸쳐 일어나는데, 종종 특정 온도 구배 범위 형태로 일어난다 (예를 들어, 열 제어 판을 가로질러 적용됨).
당업자는 본원에 기재된 방법의 검출 단계를 사용하여 오염에 대해 스크리닝할 수 있고, 오염에 대해 책임이 있는 유기체를 확인할 수 있고/있거나 이러한 오염 수준을 정량화할 수 있다. 이들 특별한 양태 각각이 다음에 보다 상세히 기재되어 있다. 부가적으로, 상기 언급된 바와 같이 본 발명의 장치를 사용하여, 검출된 DNA 생성물을 추가 분석 (예: 서열 분석)용으로 선별할 수 있다.
1. 스크리닝
본 발명의 목적은 오염성 유기체를 알아보기 위해 샘플을 지속적으로 스크리닝하는 저렴한 방법을 제공하는 것이다. 오염성 유기체의 존재 또는 부재를 알아보기 위해 특정 샘플을 스크리닝하는 것 (예를 들어, 증폭된 DNA 생성물의 존재 또는 부재를 검출하는 것), 즉 1일 24시간, 1주 7일 및 1년 365일간 공공적 샘플 (예: 물 및 공기)을 모니터링하고, 오염성 유기체가 없도록 하고/하거나 테러리스트 공격을 모니터링하는 것은 본 발명의 기구의 중요한 기능일 수 있다. 따라서, 본 발명은 샘플 공급원으로부터의 샘플 소적을 1개 이상의 미소유체 반응 채널 내로 지속적으로 획득하는 단계; 각 샘플 소적을 프라이머 플러그와 혼합하여 샘플 플러그를 형성하는 단계 (여기서, 각 프라이머 플러그는 증폭 시약을 포함한다); 게놈 물질을 포함하는 샘플 플러그로부터 DNA를 증폭시키는 단계; 및 증폭된 생성물의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함하는 (이들 단계는 본 발명의 기구 내에서 일어난다), 오염에 대해 알아보기 위해 샘플 공급원을 스크리닝하기 위해 본 발명의 기구를 사용하는 방법을 제공한다. 이러한 본 발명의 양태에서, 증폭된 DNA 생성물이 존재하지 않는 것이 (즉, 제로-검출) 깨끗한 샘플 공급원 (예: 급수원)의 지표이다. 이와는 달리, 증폭된 생성물이 존재하는 것은 오염된 샘플 공급원의 지표일 수 있다. 특정 샘플을 스크리닝하기 위해 본 발명의 기구를 사용하는 것은 비교적 저렴한데, 이는 통상적인 스크리닝 및 모니터링 방법을 사용하는 경우에 시간과 돈에 있어 부가 비용을 지출하지 않고서도 다수의 시험을 행할 수 있기 때문이다. 부가적으로, 불변의 제로-검출은 과도한 것으로 보일 수도 있지만, 이러한 증폭된 생성물의 부재는 해당 샘플 공급원이 안전하다는 지표이다. 이는 샘플 공급원의 오염을 즉시 검출하기 때문에, 중요하고도 절대 필요한 목표이다. 최종적으로, 본원에 기재된 방법을 사용하여 오염성 유기체에 대해 스크리닝하고, 이를 확인하며, 이의 수준을 정량화하는 것은 동시에 수행할 수 있다.
2. 정량화
본 발명의 또다른 양태에서는, 본 발명의 기구를 사용하여 오염 수준, 즉 샘플 중의 게놈 물질의 농도를 정량화할 수 있다. 본 발명의 기구를 사용하는 본 발명의 정량화 공정은 (a) 게놈 물질의 농도가 샘플 소적 당 대략 최대 1개 분자, 예를 들어 1000개 샘플 소적 당 3개 분자가 되도록 하는 희석 인자를 이용하여 샘플을 희석시키는 단계; (b) 샘플로부터의 샘플 소적을 1개 이상의 미소유체 반응 채널 내에 획득하는 단계; (c) 각 샘플 소적을 프라이머 플러그와 혼합하여 샘플 플러그를 형성시키는 단계 (여기서, 프라이머 플러그는 증폭 시약을 포함한다); (d) 각 샘플 플러그로 증폭 주기를 수행하여, DNA 분자를 포함하는 각 샘플 플러그가 검출가능한 증폭된 DNA 생성물을 갖도록 하는 단계 (DNA 분자를 포함하지 않는 각 샘플 플러그는 증폭된 DNA 생성물을 갖지 않을 것이다); (e) 각 샘플 플러그 중 증폭된 DNA 생성물의 존재 또는 부재를 검출하는 단계; (f) 증폭된 생성물을 함유하는 샘플 플러그 대 제로-검출된 샘플 플러그의 비율을 결정하는 단계; 및 (g) 상기 희석 인자를 이용하여, 샘플 중 오염성 게놈 물질의 본래 농도를 계산하는 단계를 포함한다. 이러한 방법을 이용하는 정량화는 1개의 게놈 DNA 분자로부터 생기는 증폭된 DNA 생성물을 포함하는 샘플 플러그 대 제로-검출된 샘플 플러그의 비에 기초하는데; 이러한 방법은 증폭된 생성물의 형광 세기에 기초하지 않기 때문에, PCR에 의거한 정량화 도식에 내재된 문제점을 해결해준다.
3. 확인
본원에 제공된 확인 (동정) 방법은 샘플 공급원 (예: 급수원)이 본 발명의 스크리닝 및/또는 정량화 방법에서 검출되는 게놈 물질에 오염되는 경우에만 필요하다. 따라서, 본 발명의 또다른 목적은 샘플 중의 유기체를 확인하기 위한 저렴한 방법을 제공하는 것이다. 본 발명은 (a) 특정 유기체로부터 단리한 게놈 물질을 포함하는 1개 이상의 DNA 샘플 소적을 제조하는 단계; (b) 샘플로부터의 1개 이상의 DNA 샘플 소적을 1개 이상의 미소유체 반응 채널 내에 획득하는 단계; (c) 상기 1개 이상의 DNA 샘플 소적을 프라이머 플러그와 혼합하여 1개 이상의 DNA 샘플 플러그를 형성시키는 단계 (상기 프라이머 플러그는 1종 이상의 공지된 제1 프라이머를 포함한다); (d) 1개 이상의 DNA 샘플 플러그로 1회 이상의 증폭 주기를 수행하여, 1개 이상의 DNA 샘플 플러그가 검출가능한 증폭된 DNA 생성물을 갖도록 하는 단계; (e) 증폭된 DNA 생성물을 검출하는 단계; (f) 증폭된 DNA 생성물의 검출에 근거하여 유기체를 확인하는 단계; 및 (g) 유기체 확인의 정확도를 증가시키기 위해 제1 공지된 프라이머와는 상이한 공지된 프라이머를 포함하는 증폭 시약을 사용하여 단계 (a) 내지 (f)를 임의로 반복하는 단계를 포함하는, 본 발명의 기구를 사용하여 유기체를 확인하는 방법을 제공한다. 본 발명의 한 양태에서, 증폭된 DNA 생성물을 검출하는 것은 (예를 들어, 샘플을 대상으로 하여 오염에 대해 스크리닝하고/하거나 오염 수준을 정량화하는 경우) 이러한 DNA가 단리되는 유기체를 확인시켜 주는데, 이는 특정 유기체의 실체를 확정시켜 주는 프라이머를 선택하였기 때문인데, 예를 들어 특별한 유기체의 게놈 DNA와 특이적으로 결합하는 특이적 TAQMAN® 프라이머를 선택할 수 있기 때문에, 상기 언급된 방법(들)을 사용하여 증폭된 생성물을 검출하는 것이 해당 유기체의 실체를 확정시켜 준다. 또다른 양태에서, 본 발명의 SGP 프라이머 또는 파형 프라이머를 사용하고, 검출된 파형 프로파일은 유기체의 실체를 제공해준다.
증폭된 생성물의 검출이 (예를 들어, 본 발명의 스크리닝 또는 정량화 방법 동안) 오염된 샘플 중의 오염성 유기체의 특별한 종 (또는 균주)을 확정적으로 확인시켜 주지 못하는 경우에는, 예를 들어 본 발명의 스크리닝 및/또는 정량화 방법에서 초기 검출에 의해 생성된 증폭된 DNA 생성물이, 샘플 내에 존재할 것으로 추정되는 유기체 유형의 예비 지표/제안으로서 사용될 수 있다 [즉, 스크리닝 또는 정량화 방법은 확인 방법의 임의 단계 (상기 단계 g)에 사용될 프라이머(들)에 대한 선택의 범위을 줄일 수 있다]. 이러한 임의 단계에 프라이머 라이브러리를 이용할 수 있다. 초기 검출에 의해 제안된 유기체의 유형에 기초하여, 이들 프라이머 중의 하나 (또는 그 이상)를 활용하여 이차 증폭된 DNA 생성물을 생성시킬 수 있고, 이어서 이를 사용하여 본래 샘플을 오염시키는 유기체의 종 및 균주를 확인할 수 있다.
게놈 물질의 한 가지 이상 공급원이 급수원과 같은 공급원을 동시에 오염시키는 상황 하에서는, (상기) 정량화에 사용된 희석 방법을 변경시켜 이용할 수도 있다. 따라서, 게놈 물질의 2가지 오염 공급원이 존재하는 경우에는, 대부분의 샘플 소적이 게놈 물질을 함유하지 않고 몇몇 샘플 소적이 이중 한 가지 또는 다른 게놈 물질을 함유하는 일련의 샘플 소적을 생성시키기에 충분히 샘플을 희석시킴으로써, 각 샘플 소적 또는 후속 샘플 플러그 내의 가능한 구성분 어레이가 0 (DNA가 없음); X (한 가지 게놈 DNA 공급원); 및 Y (제2 게놈 DNA 공급원)로서 나타낼 수 있다. 당업자는 이러한 희석 도식이, 존재하는 경우 샘플 소적 당 게놈 물질 1개 분자를 정상적으로 단리한다고 이해할 것이다. 그러나, 2가지 상이한 DNA 분자가 단일 샘플 소적에 존재하는 (예: XY) 드문 경우에도, 상기 방법이 여전히 유용할 것인데; 예를 들어, 양 유기체 (즉, XY)의 존재에 대한 파형 프로파일은 모든 단일 세균 공급원에 대한 정상적인 파형 프로파일을 갖지 않을 것이다.
당업자는 일련의 이들 샘플 플러그 (예를 들어, 1천개의 샘플 플러그)를 모니터링함으로써, 각 별개의 공급원으로부터의 게놈 물질을 함유하는 샘플 플러그를 검출 및 확인할 수 있다는 것을 용이하게 인식할 것이다. 예를 들어, SGP 방법에서는 SGP 프라이머를 사용하여 (1) 유기체 X에 대한 게놈 DNA와 (2) 유기체 Y에 대한 게놈 DNA를 함유하는 샘플 플러그에 대한 파형 프로파일을 검출할 것이다. X 및 Y 유기체를 추가로 확인하기 위한 한 양태에서는, 이들 유기체에 상응하는 샘플 플러그를 분리하고, 추가 분석용으로 선별하는데, 예를 들어 본 발명의 밸브 장치를 통하여 DNA 서열 분석용 칩에 의해 분석하기 위해 선별한다. 당업자는 또한, 본 발명의 장치와 관련된 방법에 대한 상기 변동을, 2가지 이상의 게놈 물질 오염 공급원이 존재하는 상황까지 확대하고 외삽할 수 있다는 것을 알고 있을 것이다. 당업자는 게놈 물질의 다중 공급원을 확인하기 위한 상기 방법이 독이 없는, 또는 비교적 독이 없는 배경에 대항한 위험한 오염원, 급수원과 같은 공급원에서의 오염원을 검출 및 식별하는데 유용하다는 것을 인식할 것이다.
4. 선별
본 발명의 기구를 사용하여 게놈 물질을 분석하는데 있어 또다른 이득을 제공하는데; 본 발명의 기구는 증폭된 DNA 생성물을 추가 분석 (예: 서열 분석)용으로 선별할 수 있게 해준다. 서열 분석은 최종적이고도 확정적인 DNA 분석 방법이다. 따라서, 본 발명의 또다른 목적은 상기 언급된 방법들을 이용하여 분석한 DNA에 관한 상세한 정보, 예를 들어 서열 정보를 제공하기 위해 본 발명의 기구를 사용하는 방법을 제공하는 것이다. 결과적으로, 본 발명은 본 발명의 미소유체 장치 내의 일정 길이의 미소유체 인라인 반응 채널을 횡단한 DNA 샘플 플러그를 추가 분석용으로 임의 선별할 수 있는 방법을 제공한다. 이러한 선별 공정은 본 발명의 미소유체 장치의 "밸브"에서 일어날 수 있다. 선별시, 본 발명의 미소유체 장치의 밸브는 이와 같이 선별된 DNA 샘플 플러그(들)가, 예를 들어 서열 분석하기 위한 또다른 장치 (예: DNA 서열 분석용 칩)으로 추가로 진행될 수 있도록 해줄 것이다. 이러한 칩은 당해 분야에 공지되어 있다 [참고: 예를 들어, 미국 특허공개공보 제2005/0009022호].
본원 전반에 걸쳐 인용된 모든 참고 문헌, 특허 및 특허원의 전문이 본원에 참고로 도입된다.
본 발명의 양태들이 본원에 논의된다. 본 발명의 한 가지 양태의 기준, 즉 샘플 중의 오염성 유기체의 존재 또는 부재를 검출하기 위한 시스템의 기준이 실시예 1에 기재되었다. 당업자는 이러한 시스템을 각종 샘플의 품질 보증, 예를 들어 급수원 중의 세균의 존재 또는 부재를 검출하는데 활용할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 또한, 당업자는 본 발명을 사용하여 상이한 샘플 중의 유전자 및 기타 길이의 뉴클레오티드의 존재 또는 부재를 분석할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 예를 들어, 당업자는 공기원으로부터 여과시킨 샘플 또는 혈액 샘플 중의 안트락스 (anthrax)를 검출 및 확인하기 위해, 또는 각종 식료품 상에 도포된 바이러스를 검출 및 확인하기 위해 본 발명의 사용할 수 있었다. 본 발명은 다음에 기재된 구체적인 실시예들로 그 범위가 제한되지 않는다.
실시예 1
변형된 PCR (mPCR) 및 하프-타임 연장 단계를 포함하는 단일 게놈 프로파일 (SGP) 방법
본원에 제공된 실시예들과 도면은 당업자가 본 발명을 이해하는 것을 돕기 위해 제공될 뿐만 아니라 본원에 기재된 개선안을 묘사하기 위해 제공된 이론적 구조물이다. 도 3은 SGP 방법을 포함한 파형 프로파일링 방법의 제1 주기 (도 3A)를 묘사하고, SGP 방법의 후속 주기 (도 3B) 결과와, 기타 파형 프로파일링 방법의 후속 주기 (도 3C) 결과를 비교한 플로우 다이아그램이다. 이러한 플로우 다이아그램은 검출하고자 하는 게놈 DNA의 1개 카피의 사용을 나타낸다는 것을 인지해야 한다. 그러나 상기 논의된 바와 같이, SGP 방법 만을 사용하는 경우에는 검출가능한 보다 고 차수의 구조물을 형성하는데 있어 이러한 양의 게놈 DNA이 충분할 것이다.
본 발명의 추가로 입증하기 위해, 충분히 짧은 길이의 프라이머가 일정 길이의 각 단일 가닥 게놈 DNA 주형을 따라 몇개의 별개의 프라이머 결합 부위와 어떻게 결합할 수 있었는지를 증명하기 위해, 이론적 프라이머 서열과 이론적 게놈 서 열을 실시예 1.1 및 실시예 1.2에 각각 제공하였다. 실시예 1.3은 당업자에게 본원에 제공된 SGP 공정을 안내하고, SGP 방법의 각 단계 후에 예상되는 각 핵산 중합체의 서열을 제공하며, 본 발명의 개선안을 묘사하는데 도움을 준다. 본원에 제시된 실시예가 본 발명의 범위를 제한하는 것으로서 간주되어서는 안된다.
실시예 1.1: 이론적 프라이머 서열
본원에 제공된 모델에서, 프라이머는 5'-AGC-3'이다.
실시예 1.2: 이론적 게놈 서열
4개의 DNA 뉴클레오티드 염기 (아데닌 "A", 구아닌 "G", 티미딘 "T" 및 시토신 "C")을 무작위 순서 및 횟수로 함유하는 1001 bp 게놈 서열을, 컴퓨터 프로그램을 사용하여 생성시켰다. 이와 같이 무작위로 생성시킨 이론적 서열의 수 개 염기를 변경시켜, SGP 방법을 보다 명확하게 입증해주는 서열을 수득하였다. 이중 가닥 게놈 DNA의 각 단일 가닥 게놈 DNA 주형의 서열이 도 4에 제시되었다. 단일 가닥 게놈 DNA 주형 중의 하나의 서열이 5'→3'로 제시되었고, 뉴클레오티드 염기에 상응하는 대문자로 나타내었고 (서열 1); 상보적 단일 가닥 게놈 DNA 주형은 3'→5'로 제시되었고, 뉴클레오티드 염기에 상응하는 소문자로 나타내었다 (서열 2). 각 게놈 DNA 주형 상에 진하게 표시한 문자는 실시예 1.1의 이론적 프라이머가 어닐링되는 것으로 예상되는 부위, 즉 프라이머 결합 부위를 나타낸다. 도 4에서 괄호로 표시된 영역은 프라이머 결합 부위에 의해 일괄되는 이론적 게놈 DNA의 몇개의 별개의 영역을 입증하며, 이들 각각은 SGP-SGP 핵산 중합체 형태로 기하급수적으로 증폭될 것이다 (예를 들어, 도 7 참고).
실시예 1.3: 변형된 PCR 및 하프-타임 연장 단계를 포함하는 SGP 방법
실시예 1.1의 프라이머는 실시예 1.2의 게놈 DNA를 따라 각 프라이머 결합 부위와 어닐링되는 것으로 예상되었다. mPCR의 제1 주기는 게놈 DNA를 2개의 게놈 DNA 주형으로 변성시키면서 시작하였는데, 이는 약 95 내지 98℃ 하에 대략 2분 동안 수행하였다. 변성에 이어, 상기 프라이머를 각 단일 가닥 게놈 DNA 주형 상의 몇개의 별개의 상보적 부위, 즉 프라이머 결합 부위와 어닐링시켰다. 어닐링은 약 25℃ 하에 대략 2분 동안 일어났다. 프라이머를 각 단일 가닥 게놈 DNA 주형 상의 몇개의 별개의 상보적 부위와 어닐링시킨 후, Taq 폴리머라제와 같은 폴리머라제는 프라이머의 3' 말단에서 시작하여 5'→3' 방향으로 연장하면서 별개의 핵산 중합체, 즉 SGP 핵산 중합체를 연장시킨다. 연장은 약 72℃ 하에 대략 2분 동안 일어났으므로, mPCR의 이론적 제1 주기에서는 대략 21개 염기 이하의 SGP 핵산 중합체가 생성되었다.
실시예 1.1 및 1.2의 이론적 프라이머 및 게놈 DNA 서열을 이용한 mPCR의 제1 주기의 대표적인 예가 도 5 및 6에 제시되었다. 도 5는 2개의 변성된 단일 가닥 DNA 주형으로서의 이론적 게놈 DNA 서열 (도 4에 도시되기도 함)을 나타낸다. 단일 가닥 DNA 주형 중의 하나의 서열이 5'→3'로 제시되었고, 대문자로 나타내었으며 (도 5A; 서열 1); 상보적 단일 가닥 DNA 주형의 서열은 3'→5'로 제시되었고, 소문자로 나타내었다 (도 5B; 서열 2). 또한, 진하게 표시한 문자는 예상된 프라이머 결합 부위를 표시한다. SGP 핵산 중합체가 증폭 제1 주기 동안 유래되는 것으로 예상되는 게놈 DNA 영역은 각 게놈 DNA 주형 아래에, 1) 프라이머 결합 부위 에 대한 프라이머의 결합을 묘사하기 위해 각 프라이머 결합 부위 아래에 이론적 프라이머 서열에 상응하는 문자, 2) SGP 핵산 중합체의 연장 방향을 표시하는 화살표, 및 3) 연장된 SGP 핵산 중합체의 예상 길이를 입증하는 크로스-해치 (cross-hatch)로써 나타내었다. 증폭 제1 주기 후에 각 게놈 DNA 주형으로부터 생성될 것으로 예상되는 SGP 핵산 중합체의 서열이 도 6에 열거되었다 (서열 3-34). 제시된 바와 같이, 몇몇 SGP 핵산 중합체의 서열은 SGP 프라이머 결합 부위 (진하게 표시된 서열로써 나타냄)를 포함한다.
증폭 제2 주기 및 후속 주기의 변성 단계 동안, SGP 프라이머 결합 부위를 포함하는 서열을 갖는 SGP 핵산 중합체 (도 6에 제시된 바와 같음)를 각 게놈 DNA 주형으로부터 격리시키면, 이들은 후속 어닐링 및 연장 단계에 참여할 것인데, 즉 이들은 보다 고 차수의 구조물을 형성하지 않을 것이다. 결과적으로, 증폭 제2 주 기 및 후속 주기에서는 도 6에 기재된 SGP 핵산 중합체 이외에도, 도 7에 기재된 일련의 SGP-SGP 핵산 중합체 (서열 35-42)가 합성되고 증폭될 것이다.
당업자는 도 7에 기재된 각 서열, 즉 각 SGP-SGP 핵산 중합체 서열이, 프라이머 결합 부위에 의해 일괄되는 (도 4에서 괄호로 표시한 바와 같음), 즉 SGP 프라이머 서열과 상기 SGP 프라이머 서열의 역배향 상보체에 의해 일괄되는 게놈 DNA 주형의 몇개의 영역 중 하나와 동일하다는 것을 용이하게 인식할 것이다. 당업자는 또한, 증폭 후속 주기로 인해, 도 7에 기재된 서열이 기하급수적으로 배가된다는 것을 인식할 것이다. 22 내지 24 주기 후에, 도 7에 기재된 각 별개의 SGP-SGP 핵산 중합체의 대략 106 내지 107개 카피가 게놈 1개 카피로부터 생성될 것으로 추정된다.
"하프-타임" 연장 단계는, 풀-타임 연장 단계를 함유하는 mPCR 여러 주기, 예를 들어 22 내지 24 주기 후에 포함되기 때문에, 도 7에 기재된 SGP-SGP 핵산 중합체 중의 몇몇의 3' 말단은 연장 시간 단축으로 인해 카피되지 않을 것이다. 이러한 "하프-타임" 연장 단계는 기존의 풀-타임 연장 단계에 사용된 시간의 대략 40 내지 60％ 길이일 것이며, 예를 들어 상기 사용된 연장 단계의 시간의 50％ 길이일 것이다.
본 실시예에서는, 하프-타임 단계 동안의 연장이 약 72℃ 하에 대략 1분 동안 일어났다. 이러한 연장 시간으로, 대략 10개 염기 쌍이 중합 반응될 수 있다. 따라서, 다음 서열들 (도 7에 기재된 바와 같음) 중의 하나를 갖는 SGP-SGP 핵산 중합체로부터 유래되는 핵산 중합체 만이 완전히 연장되어 프라이머 결합 부위를 포함할 것이다: 3'-tcga-5' (서열 36으로서 제시됨), 3'-tcgcccccga-5' (서열 37로서 제시됨), 5'-AGCT-3' (서열 40으로서 제시됨), 또는 5'-AGCGGGGGCT-3' (서열 41로서 제시됨). 이러한 SGP-SGP 핵산 중합체는 보다 고 차수의 구조물을 형성하는데 참여하지 않을 것이다.
이와는 달리, 다음 서열들 (도 7에 기재된 바와 같음) 중의 하나를 갖는 SGP-SGP 핵산 중합체로부터 하프-타임 연장 단계에서 카피된 핵산 중합체는 단축형 SGP 핵산 중합체일 것인데, 즉 이는 프라이머 결합 부위를 포함하는 서열을 갖지 않을 것이다: 3'-tcgggtttcccggaagccga-5' (서열 35로서 제시됨), 3'-tcggctactacggaacga-5' (서열 38로서 제시됨), 5'-AGCCCAAAGGGCCTTCGGCT-3' (서열 39로서 제시됨), 또는 5'-AGCCGATGATGCCTTGCT-3' (서열 42로서 제시됨). 하프-타임 연장 단계 후에 도 7에 기재된 SGP-SGP 핵산 중합체로부터 유래될 것으로 예상되는 단축형 SGP 핵산 중합체와 SGP-SGP 핵산 중합체의 서열이 도 8에 기재되었다. 이러한 단축형 SGP 핵산 중합체, 즉 SGP 프라이머 결합 부위를 갖고 있지 않고 보다 고 차수의 구조물을 형성하는데 참여할 핵산 중합체는 도 8에 밑줄쳐져 있고, 다음과 같은 서열을 갖는다: 5'-AGCCCAAAGG-3' (서열 43으로서 제시됨), 5'-AGCCGATGAT-3' (서열 46으로서 제시됨), 3'-cggaagccga-5' (서열 47로서 제시됨) 및 3'-tacggaacga-5' (서열 50으로서 제시됨).
풀-타임 연장 단계 대신 하프-타임 연장 단계를 포함하는 후속 mPCR 주기로 인해, 단일 가닥의 단축형 SGP 핵산 중합체가 생성되는데, 이는 상보적 가닥을 갖지 않으므로 보다 고 차수의 구조물을 형성할 것이다. 이들 보다 고 차수의 구조물은 Tm 분석 (파형 프로파이링)을 수행함으로써 검출할 수 있다. 이와는 달리, 보다 짧은 SGP-SGP 핵산 중합체, 예를 들어 5'-AGCT-3'은 하프-타임 연장 단계를 수반한 mPCR 동안 완전히 연장될 것이다. 따라서, 완전히 상보적 SGP-SGP 핵산 중합체는 하프-타임 연장 단계 동안 항상 형성될 것이기 때문에, 이들 보다 짧은 SGP-SGP 핵산 중합체는 그들의 상보적 핵산 중합체와 결합할 것이며, 보다 고 차수의 구조물 형성에 참여하지 않을 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> Canon U.S. Life Sciences, Inc. <120> DEVICES AND METHODS FOR MONITORING GENOMIC DNA OF ORGANISMS <130> 03582.000200 <150> US 60/653,978 <151> 2005-02-18 <160> 50 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 1001 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Theoretical single-strand DNA template <400> 1 tcttgcactt tgggtaacgc acgtgtggct gcgcttcaag tcataccgcg aactattatg 60 cgcagccgac agcaactatc tgaacgagcg agggccatca agcctggcat atcgtcaggt 120 caccacgtgg gtgcaatgcg cgtcactctc ttccaccctt gtgtaataat tgtacaaaca 180 tccactgttc tctcagagaa catatgtccc cggcgctcta agtaacaccg gcaaaatttt 240 tgaagcccaa agggccttcg gctgccaact ctcggaggat cgccgttcaa ccgccggtag 300 agacagtata caaattatac agagtcctat ggcaggattg ttctccagta tgcaaccgtg 360 aggcacgcca gaagcagtct gtctttcctg ggacgtgaat ttgctttgat tgcatgctca 420 gtacgcgagg cttctccgca agattcacaa aagcaacgcg gtttgccaac gtagggattg 480 agaccaaatc ccatcggtaa ttgaggcaaa gattccgcca gccatggtaa attacccttc 540 tacctgggga gctagcgatt gcgtggacaa agcgcatgtg cgagcggacg ttgggcagtc 600 cagaaagagg tagcgggggc tatctattag taacgacata ggaggtccga gataggtacc 660 caatttcttt atattgttag ggattccccg tactctcctt tcaggggcct aaggaccctt 720 tcttccgacg tttactatac ctagcatggt cttaagggat ccatttatct gtatgtagta 780 ttacgttggt gctgatcagt ttatactccg ctgtgaccat cgttaagtat accaccggct 840 aactccgcgc ttatggggga cttatggctt catggcccac ttacaagatg ggtgagttcg 900 tgttccacca cctgtccggg gtgctgaggc agatgtgatc gttggtaggc ccaagttcag 960 ccgatgatgc cttgctcctc gcagtagatg cagcactctt c 1001 <210> 2 <211> 1001 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Theoretical single-strand DNA template <220> <221> misc_feature <223> This sequence is in 3' to 5' direction. <400> 2 agaacgtgaa acccattgcg tgcacaccga cgcgaagttc agtatggcgc ttgataatac 60 gcgtcggctg tcgttgatag acttgctcgc tcccggtagt tcggaccgta tagcagtcca 120 gtggtgcacc cacgttacgc gcagtgagag aaggtgggaa cacattatta acatgtttgt 180 aggtgacaag agagtctctt gtatacaggg gccgcgagat tcattgtggc cgttttaaaa 240 acttcgggtt tcccggaagc cgacggttga gagcctccta gcggcaagtt ggcggccatc 300 tctgtcatat gtttaatatg tctcaggata ccgtcctaac aagaggtcat acgttggcac 360 tccgtgcggt cttcgtcaga cagaaaggac cctgcactta aacgaaacta acgtacgagt 420 catgcgctcc gaagaggcgt tctaagtgtt ttcgttgcgc caaacggttg catccctaac 480 tctggtttag ggtagccatt aactccgttt ctaaggcggt cggtaccatt taatgggaag 540 atggacccct cgatcgctaa cgcacctgtt tcgcgtacac gctcgcctgc aacccgtcag 600 gtctttctcc atcgcccccg atagataatc attgctgtat cctccaggct ctatccatgg 660 gttaaagaaa tataacaatc cctaaggggc atgagaggaa agtccccgga ttcctgggaa 720 agaaggctgc aaatgatatg gatcgtacca gaattcccta ggtaaataga catacatcat 780 aatgcaacca cgactagtca aatatgaggc gacactggta gcaattcata tggtggccga 840 ttgaggcgcg aataccccct gaataccgaa gtaccgggtg aatgttctac ccactcaagc 900 acaaggtggt ggacaggccc cacgactccg tctacactag caaccatccg ggttcaagtc 960 ggctactacg gaacgaggag cgtcatctac gtcgtgagaa g 1001 <210> 3 <211> 7 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SGP nucleic acid polymer derived from SEQ ID NO:2 <400> 3 agccgac 7 <210> 4 <211> 16 <212> DNA <213> 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SGP nucleic acid polymer derived from SEQ ID NO:2 <400> 11 agct 4 <210> 12 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SGP nucleic acid polymer derived from SEQ ID NO:2 <400> 12 agcgattgcg tggacaa 17 <210> 13 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SGP nucleic acid polymer derived from SEQ ID NO:2 <400> 13 agcgcatgtg cg 12 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SGP nucleic acid polymer derived from SEQ ID NO:2 <400> 14 agcggacgtt gggcagtcca g 21 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SGP nucleic acid polymer derived from SEQ ID NO:2 <400> 15 agcgggggct atctattagt a 21 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SGP nucleic acid polymer derived from SEQ ID NO:2 <400> 16 agcatggtct taagggatcc a 21 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SGP nucleic acid polymer derived from SEQ ID NO:2 <400> 17 agccgatgat gccttgctcc t 21 <210> 18 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SGP nucleic acid polymer derived from SEQ ID NO:2 <400> 18 agcactcttc 10 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SGP nucleic acid polymer derived from SEQ ID NO:1 <220> <221> misc_feature <223> This sequence is in 3' to 5' direction. <400> 19 aacccattgc gtgcacaccg a 21 <210> 20 <211> 5 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SGP nucleic acid polymer derived from SEQ ID NO:1 <220> <221> misc_feature <223> This sequence is in 3' to 5' direction. <400> 20 cgcga 5 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SGP nucleic acid polymer derived from SEQ ID NO:1 <220> <221> misc_feature <223> This sequence is in 3' to 5' direction. <400> 21 tcttgtatac aggggccgcg a 21 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SGP nucleic acid polymer derived from SEQ ID NO:1 <220> <221> misc_feature <223> This sequence is in 3' to 5' direction. <400> 22 ttcgggtttc ccggaagccg a 21 <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SGP nucleic acid polymer derived from SEQ ID NO:1 <220> <221> misc_feature <223> This sequence is in 3' to 5' direction. <400> 23 aaggaccctg cacttaaacg a 21 <210> 24 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SGP nucleic acid polymer derived from SEQ ID NO:1 <220> <221> misc_feature <223> This sequence is in 3' to 5' direction. <400> 24 aactaacgta cga 13 <210> 25 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SGP nucleic acid polymer derived from SEQ ID NO:1 <220> <221> misc_feature <223> This sequence is in 3' to 5' direction. <400> 25 gtcatgcgct ccga 14 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SGP nucleic acid polymer derived from SEQ ID NO:1 <220> <221> misc_feature <223> This sequence is in 3' to 5' direction. <400> 26 atgggaagat ggacccctcg a 21 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SGP nucleic acid polymer derived from SEQ ID NO:1 <220> <221> misc_feature <223> This sequence is in 3' to 5' direction. <400> 27 gtctttctcc atcgcccccg a 21 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SGP nucleic acid polymer derived from SEQ ID NO:1 <220> <221> misc_feature <223> This sequence is in 3' to 5' direction. <400> 28 tacatcataa tgcaaccacg a 21 <210> 29 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SGP nucleic acid polymer derived from SEQ ID NO:1 <220> <221> misc_feature <223> This sequence is in 3' to 5' direction. <400> 29 ctagtcaaat atgaggcga 19 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SGP nucleic acid polymer derived from SEQ ID NO:1 <220> <221> misc_feature <223> This sequence is in 3' to 5' direction. <400> 30 agcaattcat atggtggccg a 21 <210> 31 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SGP nucleic acid polymer derived from SEQ ID NO:1 <220> <221> misc_feature <223> This sequence is in 3' to 5' direction. <400> 31 ttgaggcgcg a 11 <210> 32 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SGP nucleic acid polymer derived from SEQ ID NO:1 <220> <221> misc_feature <223> This sequence is in 3' to 5' direction. <400> 32 ataccccctg aataccga 18 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SGP nucleic acid polymer derived from SEQ ID NO:1 <220> <221> misc_feature <223> This sequence is in 3' to 5' direction. <400> 33 ggtggtggac aggccccacg a 21 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SGP nucleic acid polymer derived from SEQ ID NO:1 <220> <221> misc_feature <223> This sequence is in 3' to 5' direction. <400> 34 aagtcggcta ctacggaacg a 21 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SGP-SGP nucleic acid polymer derived from SEQ ID NO:2 <220> <221> misc_feature <223> This sequence is in 3' to 5' direction. <400> 35 tcgggtttcc cggaagccga 20 <210> 36 <211> 4 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SGP-SGP nucleic acid polymer derived from SEQ ID NO:2 <220> <221> misc_feature <223> This sequence is in 3' to 5' direction. <400> 36 tcga 4 <210> 37 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SGP-SGP nucleic acid polymer derived from SEQ ID NO:2 <220> <221> misc_feature <223> This sequence is in 3' to 5' direction. <400> 37 tcgcccccga 10 <210> 38 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SGP-SGP nucleic acid polymer derived from SEQ ID NO:2 <220> <221> misc_feature <223> This sequence is in 3' to 5' direction. <400> 38 tcggctacta cggaacga 18 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SGP-SGP nucleic acid polymer derived from SEQ ID NO:1 <400> 39 agcccaaagg gccttcggct 20 <210> 40 <211> 4 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SGP-SGP nucleic acid polymer derived from SEQ ID NO:1 <400> 40 agct 4 <210> 41 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SGP-SGP nucleic acid polymer derived from SEQ ID NO:1 <400> 41 agcgggggct 10 <210> 42 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SGP-SGP nucleic acid polymer derived from SEQ ID NO:1 <400> 42 agccgatgat gccttgct 18 <210> 43 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> shortened SGP nucleic acid polymer derived from SEQ ID NO:2 <400> 43 agcccaaagg 10 <210> 44 <211> 4 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SGP-SGP nucleic acid polymer derived from SEQ ID NO:2 <400> 44 agct 4 <210> 45 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SGP-SGP nucleic acid polymer derived from SEQ ID NO:2 <400> 45 agcgggggct 10 <210> 46 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Shortened SGP nucleic acid polymer derived from SEQ ID NO:2 <400> 46 agccgatgat 10 <210> 47 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Shortened SGP nucleic acid polymer derived from SEQ ID NO:1 <220> <221> misc_feature <223> This sequence is in 3' to 5' direction. <400> 47 cggaagccga 10 <210> 48 <211> 4 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SGP-SGP nucleic acid polymer derived from SEQ ID NO:1 <220> <221> misc_feature <223> This sequence is in 3' to 5' direction. <400> 48 tcga 4 <210> 49 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SGP-SGP nucleic acid polymer derived from SEQ ID NO:1 <220> <221> misc_feature <223> This sequence is in 3' to 5' direction. <400> 49 tcgcccccga 10 <210> 50 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Shortened SGP nucleic acid polymer derived from SEQ ID NO:1 <220> <221> misc_feature <223> This sequence is in 3' to 5' direction. <400> 50 tacggaacga 10

Claims (24)

1개 이상의 시퍼(sipper),
1개 이상의 미소유체 인라인 반응 채널에 연결된 1개 이상의 유체 저장고, 및
상기 미소유체 인라인 반응 채널 내에서의 유체 이동 및/또는 그의 가열을 위한 1종 이상의 미량 금속
을 포함하며, 여기서, 1개 이상의 미소유체 인라인 반응 채널은 시약 어셈블리 영역, 제1 온도-제어 영역 내의 증폭 영역, 및 제2 온도-제어 영역 내의 검출 영역을 관류하고, 증폭된 DNA 생성물의 검출은 하나 이상의 온도에서 수행되는 것인 미소유체 장치.
제1항에 있어서, 1개 이상의 미소유체 인라인 반응 채널이 검출 영역의 하류에 밸브를 추가로 포함하는 것인 미소유체 장치.
1개 이상의 시퍼,
1개 이상의 미소유체 인라인 반응 채널에 연결된 1개 이상의 유체 저장고, 및
상기 미소유체 인라인 반응 채널 내에서의 유체 이동 및/또는 그의 가열을 위한 1종 이상의 미량 금속
을 포함하고, 여기서, 1개 이상의 미소유체 인라인 반응 채널은 시약 어셈블리 영역, 증폭 영역, 및 검출 영역을 관류하고, 미소유체 인라인 반응 채널은 검출 영역의 하류에 밸브를 추가로 포함하는 것인 미소유체 장치.
제1항의 미소유체 장치와의 계면에 카트리지를 포함하는, 제1항의 미소유체 장치 내에서의 유체 이동을 제어하고, 상기 미소유체 장치의 가열 및 냉각을 제어하며, 상기 미소유체 장치로부터의 데이타 획득을 제어하는 기기.
제3항의 미소유체 장치와의 계면에 카트리지를 포함하는, 제3항의 미소유체 장치 내에서의 유체 이동을 제어하고, 상기 미소유체 장치의 가열 및 냉각을 제어하며, 상기 미소유체 장치로부터의 데이타 획득을 제어하는 기기.
제3항의 미소유체 장치, 및
상기 미소유체 장치 내에서의 유체 이동을 제어하고, 상기 미소유체 장치의 가열 및 냉각을 제어하며, 상기 미소유체 장치로부터의 데이타 획득을 제어하는 기기
를 포함하는 기구.
제6항에 있어서, 미소유체 장치와 상기 기기 사이의 계면에 카트리지를 추가로 포함하는 기구.
(a) 유기체를 결정할 샘플을 획득하는 단계,
(b) 상기 샘플 중 유기체의 게놈 DNA의 1개 이상의 카피가 존재하는 경우에는 상기 카피를 단리하는 단계,
(c) 단일 게놈 프로파일링 (SGP, Single Genome Profiling) 프라이머, 뉴클레오티드, DNA 폴리머라제 및 삽입제를 포함하는 제1 혼합물을 상기 유기체의 게놈 DNA에 도입하여 제2 혼합물을 형성하는 단계,
(d) 게놈 DNA가 존재하는 경우에는 상기 제2 혼합물을, 게놈 DNA가 제1 게놈 DNA 주형 및 제2 게놈 DNA 주형으로 변성되는 제1 온도로 가열하는 단계,
(e) 상기 제2 혼합물을, 상기 프라이머가 각각의 게놈 DNA 주형과 어닐링되는 제2 온도로 냉각시키는 단계,
(f) 상기 제2 혼합물을, 상기 프라이머가 게놈 DNA와 어닐링된 상태로 유지되고 DNA 폴리머라제가 상기 어닐링된 프라이머로부터 유래되는 핵산 중합체를 연장시키는, 제1 온도와 제2 온도 사이의 제3 온도로 재가열하는 단계,
(g) 상기 제3 온도를 제1 시간 동안 유지시키는 단계,
(h) 단계 (d) 내지 (g)를 1회 이상 반복하는 단계,
(i) 단계 (d) 내지 (f)를 반복하는 단계,
(j) 상기 제3 온도를, 제1 시간의 약 40 내지 60％ 길이인 제2 시간 동안 유지시키는 단계,
(k) 제2 혼합물을 제2 온도보다 낮거나 동일한 제4 온도로 재냉각시켜서, 삽 입제를 함유하는 보다 고 차수의(higher-order) 구조물이 형성되도록 하는 단계,
(l) 이로써 생성되는 보다 고 차수의 구조물을 검출하는 단계,
(m) 융점 분석을 수행하는 단계,
(n) 파형 프로파일을 검출하는 단계, 및
(o) 샘플이 유기체를 함유하는 경우에는 샘플로부터 양성 파형 프로파일을 결정하는 단계
를 포함하는, 샘플 중의 유기체 결정 방법.
제8항에 있어서, 제3 온도가 제1 시간의 약 50％ 길이인 제2 시간 동안 유지되는 것인 방법.
제8항에 있어서, 단계 (h)에서 반복되는 단계 (d) 내지 (g)의 반복 횟수가 20 내지 50회인 방법.
제10항에 있어서, 단계 (h)에서 반복되는 단계 (d) 내지 (g)의 반복 횟수가 22 내지 24회인 방법.
제8항에 있어서, 단계 (k) 이전에 단계 (i) 내지 (j)를 1회 이상 반복하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
(a) 유기체의 존재 또는 부재를 검출할 샘플을 획득하는 단계,
(b) 상기 샘플 중 유기체의 게놈 물질의 1개 이상의 카피가 존재하는 경우에는 상기 카피를 단리하는 단계,
(c) 1개 이상의 샘플 소적(小滴)을 미소유체 반응 채널 내로 흡인시키는 단계,
(d) 1개 이상의 샘플 소적을 프라이머 플러그와 혼합하여 1개 이상의 샘플 플러그를 형성시키고, 이때의 프라이머 플러그가 1종 이상의 프라이머, 뉴클레오티드, DNA 폴리머라제 및 삽입제를 포함하는 증폭 시약을 포함하는 것인 단계,
(e) 게놈 DNA가 존재하는 경우에는 상기 1개 이상의 샘플 플러그를 게놈 DNA의 각 카피가 제1 게놈 DNA 주형 및 제2 게놈 DNA 주형으로 변성되는 제1 온도로 가열하는 단계,
(f) 상기 1개 이상의 샘플 플러그를, 상기 프라이머가 각각의 게놈 DNA 주형과 어닐링되는 제2 온도로 냉각시키는 단계,
(g) 상기 1개 이상의 샘플 플러그를, (1) 상기 프라이머가 게놈 DNA와 어닐링된 상태로 유지되고 (2) DNA 폴리머라제가 상기 어닐링된 프라이머로부터 유래되는 핵산 중합체를 연장시키는, 제1 온도와 제2 온도 사이의 제3 온도로 재가열하는 단계,
(h) 상기 제3 온도를 제1 시간 동안 유지시키는 단계,
(i) 단계 (e) 내지 (h)를 1회 이상 반복하는 단계, 및
(j) 이로써 생성되는 증폭된 생성물을 검출하는 단계
를 포함하며, 적어도 단계 (c) 내지 (j)가 제6항의 기구 내에서 수행되는 것인, 샘플 중 유기체의 존재 또는 부재의 검출 방법.
제13항에 있어서, 프라이머 플러그가 PCR 프라이머 쌍을 포함하는 것인 방법.
제14항에 있어서, 단계 (j)의 검출 단계가 하나의 온도에서 수행되는 것인 방법.
제13항에 있어서, 프라이머 플러그가 파형 프로파일링 프라이머를 포함하는 것인 방법.
제16항에 있어서, 단계 (j)의 검출 단계가 소정 범위의 온도에서 수행되는 것인 방법.
제17항에 있어서, 단계 (i) 이후 및 단계 (j) 이전에,
(1) 단계 (e) 내지 (g)를 반복하는 단계,
(2) 상기 제3 온도를, 제1 시간의 약 40 내지 60％ 길이의 시간 동안 유지시키는 단계, 및
(3) 상기 1개 이상의 샘플 플러그를, 제2 온도보다 낮거나 동일한 제4 온도 로 냉각시켜서, 삽입제를 함유하는 보다 고 차수의 구조물이 형성되도록 하는 단계
를 추가로 포함하는 것인 방법.
제13항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 추가 분석을 위한 샘플 플러그를 선별하는 마지막 단계를 추가로 포함하며, 상기 선별 단계가 상기 기구 내의 밸브에서 수행되는 것인 방법.
(a) 오염을 판단할 샘플 공급원으로부터의 샘플 소적을 1개 이상의 미소유체 반응 채널 내에 지속적으로 획득하는 단계,
(b) 각 샘플 소적을 프라이머 플러그와 혼합하여 샘플 플러그를 형성시키고, 이때의 프라이머 플러그가 증폭 시약을 포함하는 것인 단계,
(c) 게놈 물질을 포함하는 샘플 플러그 중의 DNA를 증폭시키는 단계, 및
(d) 증폭된 생성물의 존재 또는 부재를 검출하는 단계
를 포함하며, 단계 (a) 내지 (d)가 제6항의 기구 내에서 수행되는 것인, 오염 판단을 위한 샘플 공급원의 스크리닝 방법.
(a) 확인할 유기체로부터 단리한 DNA 분자를 포함하는 1개 이상의 DNA 샘플 소적을 제조하는 단계,
(b) 1개 이상의 DNA 샘플 소적을 1개 이상의 미소유체 반응 채널 내에 획득하는 단계,
(c) 1개 이상의 DNA 샘플 소적을 프라이머 플러그와 혼합하여 1개 이상의 DNA 샘플 플러그를 형성시키고, 이때의 프라이머 플러그가 1종 이상의 제1의 공지된 프라이머를 포함하는 증폭 시약을 포함하는 것인 단계,
(d) 1개 이상의 DNA 샘플 플러그로 1회 이상의 증폭 주기를 수행하여, 1개 이상의 DNA 샘플 플러그가 검출가능한 증폭된 DNA 생성물을 갖도록 하는 단계,
(e) 증폭된 DNA 생성물을 검출하는 단계,
(f) 증폭된 생성물의 검출을 기초로 하여 유기체를 확인하는 단계, 및
(g) 유기체 확인의 정확도를 증가시키기 위해 제1의 공지된 프라이머와는 상이한 공지된 프라이머를 포함하는 증폭 시약을 사용하여 단계 (a) 내지 (f)를 임의로 반복하는 단계
를 포함하며, 적어도 단계 (b) 내지 (e)가 제6항의 기구 내에서 수행되는 것인 유기체의 확인 방법.
(a) 게놈 물질의 농도가 샘플 소적 당 대략 최대 1개 분자가 되도록 하는 희석 인자를 이용하여 샘플을 희석시키는 단계,
(b) 샘플 소적을 1개 이상의 미소유체 반응 채널 내에 획득하는 단계,
(c) 각 샘플 소적을 프라이머 플러그와 혼합하여 1개 초과의 샘플 플러그를 형성시키고, 이때의 프라이머 플러그가 증폭 시약을 포함하는 것인 단계,
(d) 각 샘플 플러그로 증폭 주기를 수행하여, 1개 이상의 DNA 분자를 포함하는 각 샘플 플러그가 검출가능한 증폭된 DNA 생성물을 갖도록 하며, 이때 DNA 분자 를 포함하지 않는 각 샘플 플러그에서는 증폭된 DNA 생성물이 제로-검출(zero-detection)되는 단계,
(e) 각 샘플 플러그 중 증폭된 DNA 생성물의 존재 또는 부재를 검출하는 단계,
(f) 검출가능한 증폭된 DNA 생성물을 함유하는 샘플 플러그 대 제로-검출된 샘플 플러그의 비율을 결정하는 단계, 및
(g) 상기 희석 인자를 이용하여, 샘플 중 게놈 물질의 본래 농도를 계산하는 단계
를 포함하며, 적어도 단계 (b) 내지 (e)가 제6항의 기구 내에서 수행되는 것인, 샘플 중 게놈 물질의 농도 정량화 방법.
제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 추가 분석을 위한 샘플 플러그를 선별하는 마지막 단계를 추가로 포함하며, 상기 선별 단계가 상기 기구 내의 밸브에서 수행되는 것인 방법.
제13항 내지 제18항 및 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플 플러그(들)가 불혼화성 비수성 유체로 둘러싸이는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
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