CN114929891A - 样品制备系统和方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供了使用裂解、片段化和亲和纯化例如使用scodaphoresis从样品中分离或富集靶分子的方法和装置。在特定实施方案中，用于从生物样品中富集靶分子的装置的特征在于所述装置包含自动化样品制备模块，所述自动化样品制备模块包含被设置为接收可移除的盒的盒外壳。在一些实施方案中，所述方法和装置进一步涉及靶分子的检测、分析和/或测序。

Description

样品制备系统和方法
技术领域
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2019年10月29日提交的美国临时申请序列号63/101,213的申请日的权益，其全部内容通过引用并入本文。
背景技术
一种用于纯化、分离或浓缩目的分子的机制称为基于同步阻力系数变化(Synchronous Coefficient Of Drag Alteration，或“SCODA”)的纯化。SCODA，在一些实施方案中称为scodaphoresis，是一种可用于纯化、分离或浓缩粒子的方法。
基于SCODA的传输被用于通过使时变驱动力与时变阻力(或迁移率)变化同步，从而产生目的分子的净运动，否则时变驱动力将产生零净运动。如果适当协调驱动力和周期性迁移率变化的施加，则尽管时间平均强迫为零，但结果是净运动。通过仔细选择驱动场和迁移率变化场的时间和空间设置两者，可以产生独特的速度场，特别是具有非零散度的速度场，因此这种传输方法可以用于粒子的分离、纯化和/或浓缩。
发明内容
本公开的方面提供了在制备用于分析和/或分析(例如，通过测序分析)样品中的一种或多种靶分子的样品的过程中使用的方法、组合物、系统和/或装置。在一些实施方案中，靶分子是核酸(例如，DNA或RNA，包括但不限于cDNA、基因组DNA、mRNA及其衍生物和片段)。在一些实施方案中，靶分子是蛋白质或多肽。
在一些方面，本公开提供了一种用于从生物样品中富集靶分子的装置，所述装置包含自动化样品制备模块，所述自动化样品制备模块包含被设置为接收可移除的盒(cartridge)的盒外壳。
在一些实施方案中，可移除的盒是单次使用的盒或多次使用的盒。在一些实施方案中，可移除的盒被设置为接收生物样品。在一些实施方案中，可移除的盒进一步包含生物样品。在一些实施方案中，所述盒包含一个或多个微流体通道，所述微流体通道被设置为容纳和/或传输在样品制备过程中使用的流体。在一些实施方案中，所述盒包含一种或多种亲和基质，其中每种亲和基质包含对靶分子具有结合亲和性的固定化的捕获探针。
在一些实施方案中，生物样品是血液、唾液、痰液、粪便、尿液或口腔拭子样品。在一些实施方案中，靶分子是靶核酸。在一些实施方案中，靶核酸是RNA 或DNA分子。在一些实施方案中，靶分子是靶蛋白。
在一些实施方案中，固定化的捕获探针是寡核苷酸捕获探针，并且其中寡核苷酸捕获探针包含与靶核酸至少部分互补的序列。在一些实施方案中，寡核苷酸捕获探针包含与靶核酸至少80％、90％、95％或100％互补的序列。在一些实施方案中，所述装置或盒产生具有用于下游测序应用的平均读长的靶核酸，所述平均读长比使用对照方法产生的平均读长更长。
在一些实施方案中，固定化的捕获探针是与靶蛋白结合的蛋白质捕获探针。在一些实施方案中，蛋白质捕获探针是适体或抗体。在一些实施方案中，蛋白质捕获探针以10-9至10-8M、10-8至10-7M、10-7至10-6M、10-6至10-5M、10-5至10-4M、10-4至10-3M或10-3至10-2M的结合亲和力与靶蛋白结合。
在一些实施方案中，所述装置进一步包含测序模块。在一些实施方案中，自动化样品制备模块直接或间接连接至测序模块。在一些实施方案中，所述装置被设置为将靶分子从自动化样品制备模块递送至测序模块。
在一些实施方案中，测序模块执行核酸测序。在一些实施方案中，核酸测序包括单分子实时测序、边合成边测序、连接法测序、纳米孔测序和/或Sanger测序。
在一些实施方案中，测序模块执行多肽测序。在一些实施方案中，多肽测序包括埃德曼降解或质谱。在一些实施方案中，测序模块执行单分子多肽测序。
在一些方面，本公开提供了一种用于从生物样品中纯化靶分子的方法，所述方法包括：(i)裂解生物样品；(ii)将(i)的经裂解的样品片段化；和(iii)使用亲和基质富集样品，所述亲和基质包含对靶分子(例如靶核酸或靶蛋白)具有结合亲和性的固定化的捕获探针，从而纯化靶分子。
在一些实施方案中，固定化的捕获探针是寡核苷酸捕获探针，并且其中寡核苷酸捕获探针包含与靶核酸至少部分互补的序列。在一些实施方案中，寡核苷酸捕获探针包含与靶核酸至少80％、90％、95％或100％互补的序列。在其他实施方案中，固定化的捕获探针是与靶蛋白结合的蛋白质捕获探针。蛋白质捕获探针可以是适体或抗体。在一些实施方案中，蛋白质捕获探针以10-9至10-8M、 10-8至10-7M、10-7至10-6M、10-6至10-5M、10-5至10-4M、10-4至10-3M或10-3至10-2M的结合亲和力与靶蛋白结合。
在一些实施方案中，用于纯化靶分子的方法的步骤(i)包括电解法、酶促法、基于去污剂的方法和/或机械均化。在一些实施方案中，步骤(i)包括连续进行的多种裂解方法。样品可以在裂解之后和用于纯化靶分子的方法的步骤(ii)或(iii) 之前被纯化。在一些实施方案中，步骤(ii)包括机械、化学和/或酶促片段化方法。样品可以在片段化之后和步骤(iii)之前被纯化。在一些实施方案中，步骤(iii)包括使用电泳法(例如亲和SCODA、FIGE或PFGE)进行富集。
在一些实施方案中，用于从生物样品中纯化靶分子的方法进一步包括(iv)检测靶分子。在一些实施方案中，步骤(iv)包括使用吸光度、荧光、质谱和/或测序方法进行检测。
在一些实施方案中，生物样品是血液、唾液、痰液、粪便、尿液或口腔样品。生物样品可以来自人、非人灵长类动物、啮齿动物、狗、猫或马。在一些实施方案中，生物样品包含细菌细胞或细菌细胞群。
在进一步的方面，本公开提供了一种用于从生物样品中富集靶分子的装置，所述装置包含自动化样品制备模块，其中自动化样品制备模块执行以下步骤：(i) 接收生物样品；(ii)裂解生物样品；(iii)将(ii)的样品片段化；和(iv)使用亲和基质富集样品，所述亲和基质包含对靶分子(例如靶核酸或靶蛋白)具有结合亲和性的固定化的捕获探针。在一些实施方案中，所述装置进一步包含测序模块(例如，直接或间接连接至样品制备模块)。
在一些实施方案中，所述装置产生具有比使用对照方法产生的平均测序读长更长的平均测序读长的靶核酸。
除了上述示例性方面和实施方案之外，通过参考附图并通过研究以下详细描述，进一步的方面和实施方案将变得显而易见。
附图说明
示例性实施方案在附图的参考图中示出。本文所公开的实施方案和附图被认为是说明性的而不是限制性的。
图1显示了等式[10]的图，其显示了在一维中从-L延伸到+L的域上的SCODA 漂移速度。
图2显示了等式[23]在双链体熔解温度Tm附近的图，说明了迁移率随温度的相对变化。
图3显示了与固定化的探针分子具有不同结合能的两种不同分子的迁移率与温度的图。高结合能靶标的迁移率由右侧曲线显示，而低结合能靶标的迁移率由左侧曲线显示。
图4显示了施加的DC冲洗偏置对具有两种不同结合能的分子的影响。实线表示与结合探针的结合能低于虚线表示的分子的结合能的靶分子的漂移速度。
图5示出了在一些实施方案中适用于基于二维SCODA的浓缩的电场模式的实例。施加在电极A、B、C和D上的电压分别为-V、0、0和0。箭头表示带负电的分析物分子(例如DNA)的速度。颜色强度表示电场强度。
图6显示了在亲和SCODA的一个实施方案中导致迁移率随温度增加的分子聚焦的电场的逐步旋转。粒子路径由箭头表示。
图7显示了凝胶几何结构，包括用于电热建模的边界条件和主体凝胶特性。
图8显示了一个实施方案中SCODA循环的单个步骤的电热模型的结果。施加到四个电极的电压为-120V、0V、0V、0V。散布板温度设置为55℃(328K)。
图9显示了本发明的一个示例性实施方案中的SCODA速度向量图。
图10A和10B显示了在一个实施方案中在施加DC冲洗偏置下对SCODA聚焦的预测。图10A显示了完美匹配靶标的SCODA速度场。圆形点表示最终焦点位置。图10B显示了单碱基错配靶标的SCODA速度场。
图11显示了通过含有固定化的互补寡核苷酸探针的凝胶对一种示例性分离的DNA靶标迁移率的温度依赖性的测量结果。
图12显示了根据一个实施方案在施加DC偏置下的亲和SCODA聚焦的时间序列。完美匹配DNA标记为6-FAM(绿色)(聚焦到紧密的点的前导亮线)，单碱基错配DNA标记为Cy5(红色)(从凝胶中洗出的拖尾亮线)。以3分钟间隔拍摄的图像。第一张图像是在注入后立即拍摄的。
图13A、13B、13C和13D显示了在存在或不存在200mM NaCl的情况下，使用不同浓度的探针进行SCODA聚焦的结果。探针浓度分别为100μM、10μM、 1μM和100μM。图13A、13B和13C中使用的缓冲液是具有0.2M NaCl的1X TB。图13D中使用的缓冲液是1X TBE。在这些实验的每一个中注入不同数量的靶标，并调整相机增益以防止饱和。
图14显示了提供相位滞后引起的旋转的实例的实验。场旋转是逆时针的，这会导致凝胶中的靶标顺时针旋转。以5分钟的间隔拍摄图像。
图15A显示了用不同荧光标志物标记的250bp和1000bp片段在偏置下的焦点位置，正方形表示施加10V DC偏置的数据，圆圈表示施加20V DC偏置的数据。图15B显示了运行结束时亲和凝胶的图像，其中显示每个荧光标志物的位置的图像已被叠加。
图16A和16B分别显示了与根据一个实施例的靶DNA分子相比的具有单个碱基错配的100个核苷酸序列的归一化荧光信号和计算的舍弃率(rejection ratio)。
图17A、17B和17C显示了使用亲和SCODA并施加DC偏置富集从野生型和突变体扩增子的混合物的EZH2 Y641N突变获得的cDNA。在0分钟(图17A)、 10分钟(图17B)和20分钟(图17C)拍摄图像。
图18显示了测量甲基化和未甲基化的靶标的迁移率与温度的实验结果。数据点拟合至等式[23]。未甲基化的靶标的数据拟合至左侧的曲线；甲基化的靶标的数据拟合至右侧的曲线。
图19显示了与图18的数据拟合的两条迁移率与温度曲线之间的差异。该差异的最大值为69.5℃，这是施加DC偏置进行亲和力SCODA聚焦时的最大分离的温度。
图20显示了通过使用SCODA聚焦和施加的DC偏置分离甲基化(6-FAM，绿色)和未甲基化(Cy5，红色)的靶标的实验结果。
图21A-21D显示了使用亲和SCODA分离差异甲基化的寡核苷酸。图21A和 21B显示了对于10pmol未甲基化的DNA(图21A)和0.1pmol甲基化的DNA (图21B)，在从凝胶中冲洗未甲基化的靶标之前的初始聚焦的结果。图21C和 21D分别显示了对于未甲基化和甲基化的靶标，在未甲基化的序列已从凝胶中洗去之后进行的第二次聚焦的结果。
图22A-22K显示了使用不同寡核苷酸探针在相同亲和基质中差异分离两个不同序列的结果。图22A显示了上样(load)后的凝胶。图22B和22C分别显示了2分钟和4分钟后在55℃下的聚焦。图22D和22E分别显示了2分钟和4分钟后在62℃下的聚焦。图22F、22G和22H分别显示了在55℃下0.5分钟和1 分钟后以及将温度升高到62℃后3分钟时靶分子聚焦到凝胶中心的提取孔。图 22I、22J和22K分别显示了在6分钟、12分钟和18分钟后在55℃下向右施加冲洗偏置。
图23显示了用于从生物样品制备靶分子的实施例方法(例如，使用本公开的自动化样品制备模块)。
图24显示了根据一些实施方案的沿着通道102的宽度的盒100的截面视图的示意图。
图25显示了与从手动提取和纯化的DNA产生的文库相比，来自使用本公开的样品制备装置通过自动化端到端(DNA提取到完成的文库)样品制备产生的 DNA文库的测序数据输出。
图26A-26B显示了与源自使用商业和手动方法尺寸选择的样品的DNA文库相比，来自使用本公开的样品制备装置通过自动化端到端(DNA提取到完成的文库)样品制备产生的DNA文库的测序数据输出。
具体实施方式
在整个以下描述中，阐述了具体细节以便为本领域技术人员提供更透彻的理解。然而，众所周知的要素可能没有被详细示出或描述以避免不必要地模糊本公开。因此，描述和附图被认为是说明性的，而不是限制性的。
如本文所用，术语“差异性修饰”是指已经以不同方式进行化学修饰的两个相同种类的分子。差异性修饰的分子的非限制性实例包括：与未甲基化的分子相比，已经甲基化的蛋白质或核酸是差异性修饰的；与健康细胞中的核酸相比，高甲基化或低甲基化的核酸(例如，可能发生在癌细胞或癌前细胞中)是差异性修饰的；与非乙酰化的组蛋白相比，乙酰化的组蛋白是差异性修饰的；等等。
在一些实施方案中，差异性修饰的分子彼此相同，除了在分子之一上存在化学修饰。在一些实施方案中，差异性修饰的分子彼此非常相似，但不相同。例如，当分子是核酸或蛋白质时，生物分子之一可以与差异性修饰的分子具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。
SCODA
SCODA可以涉及提供一个时变驱动场分量，该分量将力施加到一些介质中的粒子上，同时提供一个时变迁移率变化场分量，该分量会影响介质中粒子的迁移率。迁移率变化场分量与驱动场分量相关，以便提供粒子的时间平均净运动。SCODA可用于使选定的粒子向焦点区域移动。
在本文描述为电泳SCODA的基于SCODA的纯化的一个实施方案中，时变电场既提供周期性驱动力又改变在介质中具有取决于电场强度的迁移率的分子 (例如核酸分子)的阻力(或等效地迁移率)。例如，DNA分子在迁移通过琼脂糖或聚丙烯酰胺等筛分基质时，其迁移率取决于所施加电场的大小。通过将适当的周期性电场模式施加于分离基质(例如琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶)，可以为凝胶中的所有分子产生收敛速度场，这些分子的迁移率取决于电场。场依赖性迁移率是重复DNA分子与筛分基质之间相互作用的结果，并且是具有高构象熵和高荷质比的带电分子在筛分基质中移动的一般特征。由于核酸往往是大多数生物样品中存在的唯一具有高构象熵和高荷质比的分子，因此基于电泳SCODA 的纯化已被证明对核酸具有高度选择性。
检测样品中特定生物分子的能力在疾病诊断和治疗领域具有广泛的应用。研究继续揭示与各种病症相关的许多生物标志物。示例性生物标志物包括基因突变、特定蛋白质的存在或不存在、特定蛋白质的升高或降低的表达、特定RNA 的升高或降低的水平、经修饰的生物分子的存在等。生物标志物和用于检测生物标志物的方法可能用于各种病症，包括癌症、疾病、感染、器官衰竭等的诊断、预后和对治疗的监测。
生物分子在体内的差异性修饰是许多生物过程，包括发育和疾病进展的重要特征。差异性修饰的一个实例是DNA甲基化。DNA甲基化涉及向核酸添加甲基。例如，可以在胞嘧啶的嘧啶环的5’位置添加甲基。CpG岛中胞嘧啶的甲基化常用于真核生物中基因表达的长期调节。异常甲基化模式与包括癌症在内的许多人类疾病有关。DNA也可以在腺嘌呤嘌呤环的6号氮上被甲基化。
分子的化学修饰，例如通过甲基化、乙酰化或其他化学改变，可以改变靶分子和结合靶分子的试剂的结合亲和力。例如，胞嘧啶残基的甲基化相对于未甲基化的双链体增加了杂交的结合能。作用很小。先前的研究报告，当比较两条链均未甲基化的双链体与两条链均被甲基化的双链体时，16个核苷酸序列中每个甲基化位点的双链体解链温度增加约0.7℃。
亲和SCODA
SCODAphoresis是一种将生物分子注入凝胶中并优先将核酸或其他目的生物分子浓缩在凝胶中心的方法。例如，SCODA可以应用于DNA、RNA和其他分子。浓缩后，可以移开经纯化的分子以用于进一步分析。在SCODAphoresis的一个具体实施方案中，对目的生物分子具有特异性的亲和SCODA结合位点可以被固定在凝胶中。这样做时，可能能够对与特定结合位点结合的生物分子的电场产生非线性动力响应。亲和SCODA的一种具体应用是序列特异性SCODA。这里寡核苷酸可以被固定在凝胶中，允许仅浓缩与结合的寡核苷酸互补的DNA 分子。所有其他不互补的DNA分子可能聚焦较弱或根本不聚焦，因此可以通过施加小的DC偏置从凝胶上洗掉。
基于SCODA的传输是一种使粒子移动通过介质的通用技术，首先施加时变强迫(即驱动)场以诱导粒子的周期性运动，并在该强迫场上叠加周期性地改变粒子的阻力(或等效地迁移率)的时变扰动场(即迁移率变化场)。迁移率变化场的施加与强迫场的施加相协调，使得粒子在强迫循环的一部分期间将比在强迫循环的其他部分期间移动得更远。具体而言，由外力F(t)和时变阻力系数ζ(t) (即变化的迁移率)影响的粒子的漂移速度υ(t)由下式给出：
Figure BDA0003720179290000091
如果外力和阻力系数周期性变化，使得
F(t)＝F0sin(ωt) [2l]
且，
Figure BDA0003720179290000092
那么在一个完整循环内平均的漂移速度由下式给出：
Figure BDA0003720179290000101
通过以与外部施加力相同的频率改变粒子的阻力(即迁移率)，可以在零时间平均强迫下引起净漂移。等式[4]的结果可以在适当选择驱动力和阻力系数时使用，这些驱动力和阻力系数在时间和空间上有所不同，以在一维或二维中产生收敛速度场。可以在实际系统中使用时变阻力系数和驱动力来专门浓缩(即优先聚焦)仅某些分子，即使靶分子与一种或多种非靶分子之间的差异非常小，例如在一个或多个位置处被差异性修饰的分子，或在一个或多个碱基处的人序列不同的核酸。
一维SCODA浓缩
通过将随时间周期性变化的空间均匀驱动力与随时间和空间变化的阻力系数相结合，可以在一维中产生收敛速度场。考虑具有迁移率μ的带电粒子在所施加电场E的影响下移动的情况；它的速度将由下式给出：
υ(x，t)＝μ(x，t)E(x，t) [5]
如果电场随时间周期性变化，使得：
E(x，t)＝E0sin(ωt) [6]
并且在域-L.ltoreq.x.ltoreq.L内提供了线性迁移率梯度，该梯度在同一周期内变化：
μ(x，t)＝μ0+(kx)sin(ωt+φ) [7]
其中k可以被认为是迁移率变化的幅度，可以实现基于SCODA的粒子分离。
有许多方法可以为在外加电场的影响下在溶液中移动的带电分子建立迁移率梯度。例如，可以如上所述提供时变电场，可以建立温度梯度，可以建立pH 梯度，可以为在存在或不存在光的情况下经历构象变化的分子建立光梯度，等等。
通过提供等式[7]的迁移率梯度，速度变为：
v(x，t)＝[μ0+(kx)sin(ωt+φ)][E0sin(ωt)] [8]。
取该速度在一个完整循环内的时间平均值，得出以下漂移速度：
Figure BDA0003720179290000111
Figure BDA0003720179290000112
该速度场在x＝0处具有平衡点，可以根据kE0 cos(φ)的符号收敛或发散。对于正值，速度场是发散的，对于负值，它是收敛的。图1显示了在kE0 cos(φ)＜0 的情况下，速度被绘制为x的函数。图1中的箭头表示漂移的方向。-L和+L之间的所有粒子将向x＝0处的零速度点漂移。在域外，时间平均速度为零，因为迁移率仅在-L和+L之间变化。
在图1所示的实施方案中，对于x的负值，速度取正值，反之，对于x的正值，导致域内的所有粒子向x＝0漂移，其中速度为零。
二维SCODA
为了将等式[10]的结果扩展到二维，在一些实施方案中，使用旋转电场作为驱动场并建立旋转迁移率梯度：
Figure BDA0003720179290000113
μ＝μ0+k[x cos(ωt+φ)-y sin(wt+φ)] [12]。
如在一维情况下{(v)上的右箭头}＝μ{(E)上的右箭头}，并且可以执行与等式[9]中相同的积分以产生二维中的时间平均漂移速度：
Figure BDA0003720179290000114
Figure BDA0003720179290000115
这导致漂移速度的以下表达：
Figure BDA0003720179290000116
用极坐标重写并简化产生：
Figure BDA0003720179290000121
这个结果突出了二维中SCODA的许多方面。它表明，尽管时间平均强迫为零，但除介质中r＝0的点外，任何地方都会出现非零漂移。它表明漂移的性质取决于两个信号的相对相位
Figure BDA0003720179290000122
聚焦强度(径向，{(r)上的音调符号},项)与电驱动场振荡和迁移率振荡之间的相位滞后的余弦成正比。对于0°相位角，有一个纯聚焦速度场，净漂移指向域中心。对于180°相位角，速度场是纯散焦的，净漂移远离凝胶中心。对于90°和270°的相位角，速度场是纯旋转的。在中间角度，所得的速度场将是旋转分量和聚焦分量的组合。为了实现有效聚焦，在一些实施方案中，驱动力和迁移率变化之间的相位差尽可能小。
时变迁移场的产生
以前基于SCODA的浓缩的应用使用了这样一个事实，即DNA在筛分基质 (如琼脂糖或聚丙烯酰胺)中的迁移率取决于所施加电场的大小。在一些应用中，目的分子可以具有通常不强烈依赖于电场的迁移率，例如少于200个碱基的短核酸、除核酸之外的生物分子(例如蛋白质或多肽)等。在一些应用中，可能需要仅纯化样品中的核酸子集，例如从基因组DNA样品中纯化或检测单个基因，或从具有相同基本结构的差异性修饰的分子(例如具有相同序列的未甲基化的DNA)中纯化或检测经化学修饰的分子(例如甲基化的DNA)，等等。
不具有强烈依赖于电场强度的迁移率的分子(即，根据电场强度的变化，其 k值较低)的基于SCODA的纯化可以通过使用对待浓缩分子具有亲和性的 SCODA基质来实现。可以通过将对靶分子具有结合亲和性的试剂(即探针)固定在介质中来产生亲和基质。使用这样的基质，可以选择靶分子与亲和基质瞬时结合的操作条件，具有降低靶分子在迁移通过亲和基质时的总体迁移率的效果。这些瞬时相互作用的强度随时间变化，其具有改变目的靶分子的迁移率的效果。因此可以产生SCODA漂移。这种技术被称为亲和SCODA，通常适用于对基质具有亲和性的任意靶分子。
亲和SCODA可以根据序列内容来选择性富集核酸，具有单核苷酸分辨率。此外，对于具有相同DNA序列但化学修饰(如甲基化)略有不同的分子，亲和 SCODA可导致不同的k值。因此，亲和SCODA可用于富集(即优先聚焦)与给定探针的结合能略有不同的分子，特别是可用于富集甲基化、未甲基化、高甲基化或低甲基化的序列。
可用于进行亲和SCODA的示例性介质包括任意介质，目的分子可以移动通过该介质，并且亲和剂可以被固定在该介质中以提供亲和基质。在一些实施方案中，使用包括聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶等在内的聚合物凝胶。在一些实施方案中，使用微制造/微流体基质。
可以被改变以提供迁移率变化场的示例性操作条件包括温度、pH、盐度、变性剂浓度、催化剂浓度、施加电场以在物理上将双链体拉开等。
可以被固定在基质上以提供亲和基质的示例性亲和剂包括具有与目的核酸序列互补的序列的核酸、对差异性修饰的分子具有不同结合亲和力的蛋白质、对修饰的或未修饰的分子具有特异性的抗体、对修饰的或未修饰的分子具有特异性的核酸适体、优先与修饰的或未修饰的分子结合的其他分子或化学试剂等。
亲和剂可以以任何合适的方式被固定在介质中。例如，当亲和剂是寡核苷酸时，寡核苷酸可以共价结合到介质上，acrydite修饰的寡核苷酸可以直接掺入聚丙烯酰胺凝胶中，寡核苷酸可以共价结合到在物理上被夹带在介质中的珠粒或其他构建体上，等等。
当亲和剂是蛋白质或抗体时，在一些实施方案中，蛋白质可以在物理上被夹带在介质中(例如，蛋白质可以直接被浇注到琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶中)、与介质共价偶联(例如，通过使用溴化氰将蛋白质与琼脂糖凝胶偶联)、与夹带在介质中的珠粒共价偶联、结合到与介质或被夹带在介质中的珠粒直接偶联的第二亲和剂(例如，结合到NTA-琼脂糖上的六组氨酸标签)上等。
在亲和剂是蛋白质的情况下，应控制制备亲和基质的条件和对样品进行上样的条件以免蛋白质变性(例如，温度应保持在可能使蛋白质变性的水平以下，并且样品中或用于制备介质或进行SCODA聚焦的缓冲液中的任意变性剂的浓度应保持在可能使蛋白质变性的水平以下)。
在亲和剂是与目的分子相互作用的小分子的情况下，亲和剂可以以任何合适的方式共价偶联到介质上。
亲和SCODA的一个示例性实施方案是序列特异性SCODA。在序列特异性 SCODA中，靶分子是或包含具有特定序列的核酸分子，亲和基质包含与靶核酸分子互补的固定化的寡核苷酸探针。在一些实施方案中，序列特异性SCODA既用于从样品中分离特定核酸序列，又用于分离和/或检测该特定核酸序列是否在样品中被差异性修饰。在一些这样的实施方案中，亲和SCODA在这样的条件下进行，使得核酸序列和差异性修饰的核酸序列都通过施加SCODA场而被浓缩。在SCODA聚焦期间，污染分子，包括具有不想要的序列的核酸，可以从亲和基质中洗掉。然后可以结合SCODA聚焦场施加冲洗偏置以通过将具有更高结合能的分子优先聚焦到固定化的寡核苷酸探针来分离如下所述的差异性修饰的核酸分子。
靶标在亲和基质中的迁移率
亲和基质中靶标和固定化探针之间的相互作用可以用一级反应动力学来描述：
Figure BDA0003720179290000141
这里[T]是靶标，[P]是固定化探针，[T.P]探针-靶标双链体，kf是正向(杂交) 反应速率，kr是逆向(解离)反应速率。由于靶标在与基质结合时的迁移率为零，因此靶标的有效迁移率将降低固定在基质上的靶标的相对量：
Figure BDA0003720179290000142
其中μ0是未结合的靶标的迁移率。使用对正向反应速率6和显著高于未结合的靶标的浓度的固定化探针浓度的合理估计，可以假设杂交的时间常数应显著小于一秒。如果迁移率变化场的周期保持在超过1秒，为了分析的目的，可以假设结合动力学是快速的，并且等式[17]可以根据反应速率重写：
kf[T][P]＝kr[T…P] [19]
Figure BDA0003720179290000151
将[20]代入等式[18]并简化产生：
Figure BDA0003720179290000152
从这个结果可以看出，可以通过修饰正向或逆向反应速率来改变迁移率。正向或逆向反应速率的修饰可以以许多不同的方式来实现，例如通过调节温度、盐度、pH、变性剂浓度、催化剂浓度，通过用外部电场在物理上拉开双链体，等等。在下文更详细描述的一个示例性实施方案中，用于修饰靶分子移动通过亲和基质的迁移率的机制是控制基质温度。
为了便于分析，做一些简化的假设是有帮助的。首先假设相对于靶分子有大量固定化探针。只要这是真的，那么即使大部分靶分子与探针结合，游离探针的浓度[P]也不会发生太大变化，并且可以假设[P]是恒定的。此外，假设正反应速率kf不依赖于温度。这并不完全正确，因为正向反应速率确实依赖于温度。固定化探针或靶分子中的二级结构可导致温度依赖性的正向反应速率。然而，在接近双链解链温度的温度范围内操作的实施方案中，逆向反应速率对温度具有指数依赖性，而正向反应速率具有弱得多的温度依赖性，在解链温度附近约 30℃的范围内变化约30％。另外假设靶序列没有任何重要的二级结构。尽管这个最终假设并不总是正确的，但它简化了这个初始分析。
为了确定逆向反应速率对温度的依赖性，假设了解结合动力学的Arrhenius 模型。这一假设得到了最近在纳米孔力光谱学方面的工作的证实。
Figure BDA0003720179290000153
这里A是经验得出的常数，ΔG是探针-靶标结合能，kb是玻尔兹曼常数，T 是温度。将其代入[21]，将自由能ΔG重写为ΔH-TΔS，并且合并常数项允许迁移率被重写为：
Figure BDA0003720179290000161
等式[23]描述了S形迁移率温度依赖性。该曲线的形状如图2所示。在低温下，迁移率几乎为零。这是热激发不足以将靶分子驱离亲和基质的状态。在高温下，靶分子以未结合的迁移率移动，其中热能大于结合能。在这两个极端之间存在一个温度范围，在该范围内温度的微小变化会导致迁移率的大变化。这是利用温度作为迁移率变化参数的亲和SCODA的实施方案的操作状态。
在用于基于序列分离核酸的亲和SCODA(即序列特异性SCODA)的实施方案中，该温度范围趋向于接近探针-靶标双链体的解链温度。等式[10]和[16]表明浓缩速度与k成正比，k是在一个SCODA循环期间迁移率变化多少的量度。在将温度用作迁移率变化参数的实施方案中，在迁移率对温度曲线的斜率最陡的探针-靶标双链体解链温度附近操作，在SCODA循环期间对于给定的温度波动使k最大化。
在一些实施方案中，亲和SCODA可以在温度梯度内进行，该温度梯度在施加SCODA聚焦场期间的最大振幅在靶分子和亲和剂的解链温度的约±20℃内、约±10℃内、约±5℃内或约±2℃内变化。
通过将等式[7]的时间相关迁移率替换为等式[23]的温度依赖性迁移率和时间相关温度，可在一维中描述亲和SCODA：
Figure BDA0003720179290000162
这里，温度在探针靶标解链温度Tm附近振荡，Ta是x＝±L处温度振荡的最大幅度。为了得到漂移速度的解析表达式，υd＝μE，作为温度的函数，在Tm附近执行等式[23]的泰勒展开：
Figure BDA0003720179290000163
其可以被重写为：
μefective＝μ(Tm)+α(T-Tm)+O((T-Tm)2) [26]。
这里，泰勒展开式中的第一项已被合并到常数α中。将[24]和[26]组合成迁移率表达式会产生类似于[7]的表达式：
Figure BDA0003720179290000171
等式[27]可用于确定一维和二维情况的时间平均漂移速度，只需将k替换为：
Figure BDA0003720179290000172
漂移速度由下式给出：在一维中，
Figure BDA0003720179290000173
并且在二维中：
Figure BDA0003720179290000174
该结果表明，如果用固定化探针(即亲和基质)使二维凝胶功能化，则通过将旋转温度梯度与旋转偶极电场相结合，所有靶分子都应被迫朝向凝胶的中心区域，从而浓缩与固定化探针结合的靶分子。
使用亲和SCODA进行分子分离
在一些实施方案中，亲和SCODA用于分离对固定化探针具有不同结合亲和力的两个相似分子(例如，已被差异性修饰的相同分子，或仅在一个或几个位置处序列不同的分子)。从两个分子种类开始，每种分子对固定化探针具有不同的结合能，这两个分子种类可以通过在用于产生SCODA聚焦的驱动场和迁移率变化场上叠加冲洗动力来分离，以提供对固定化探针具有较低的结合亲和力的分子的净运动(即，对固定化探针具有较高结合亲和力的分子在施加SCODA聚焦场期间优先聚焦)。在一些实施方案中，冲洗力是小的施加的DC力，在本文中称为DC偏置。
在一维情况下，当施加小的DC力作为冲洗力或偏置力时，电场变为：
E(x，t)＝E0sin(ωt)+Eb [31]
其中Eb是施加的DC偏置。最终的漂移速度在SCODA聚焦速度上叠加了一个与偏置场强度成正比的恒定速度：
Figure BDA0003720179290000181
该漂移速度将倾向于根据偏置方向将最终焦点位置向左或向右移动。这种偏置使焦点偏离中心的量取决于靶分子和探针分子之间相互作用的强度。因此，靶标-探针相互作用的不同强度可以作为一种机制，使两个高度相似的种类能够进行分子分离。
考虑两种对固定化探针具有不同结合亲和力的分子。降低等式[23]中的探针- 靶标结合能ΔG将有助于将迁移率与温度曲线在温度标度上向左移动，如图3 所示。高结合能靶标的迁移率由右侧的曲线显示，而低结合能靶标的迁移率由左侧的曲线显示。
如果该示例性实施方案中的SCODA系统在较高结合能分子的最佳聚焦温度 (图3中的Tm)下操作，则较低结合能分子的迁移率将更高并且具有更弱的温度依赖性。根据等式[32]，结合能较低的分子将具有较大的μ(Tm)值和较小的a 值。这意味着结合能较低的分子将具有较低的SCODA漂移速度和较高的DC偏置速度，从而导致与高结合能分子不同的最终焦点位置，如图4所示。
图4显示了对于根据一个实施方案的固定化探针，施加的DC偏置对具有两种不同结合能的分子的影响。实线表示与结合的探针的结合能低于虚线表示的分子的结合能的靶分子的漂移速度。最终焦点位置是漂移速度等于零的点。与虚线表示的分子相比，实线表示的分子具有较低的SCODA漂移速度和较高的 DC速度。当SCODA聚焦与DC偏置相结合时，结合能较低的分子将在x＝0处进一步远离无偏置焦点聚焦，从而产生两个单独的焦点，每分子种类一个。高结合能分子的最终焦点位置由附图标记30指示。低结合能分子的最终焦点位置由附图标记32指示。
二维情况与一维情况相同，施加的冲洗偏置的叠加速度使最终焦点在冲洗偏置方向上偏离中心。
在一些实施方案中，如果待分离分子之间的结合能差异足够大并且施加足够高的冲洗偏置，则低结合能分子可以从亲和基质中洗掉，而具有较高结合能的分子则保留在亲和基质中，并且可以通过施加SCODA聚焦场在亲和基质内的焦点位置处被捕获(即优先聚焦)。
时变温度梯度的产生
使用温度变化作为迁移率变化场的亲和SCODA的实施方案可以使用周期性变化的温度梯度来产生收敛速度场。可以以任何合适的方式提供周期性变化的温度梯度，例如通过使用加热器或热电制冷器来周期性地加热和冷却介质区域、使用辐射加热来周期性地加热介质区域、施加光或辐射来周期性地加热介质区域、使用向介质施加电场的焦耳加热等。
可以以任何合适的方式建立周期性变化的温度梯度，使得与所需焦点相距较远距离的粒子在朝向所需焦点施加驱动场期间比在远离所需焦点施加驱动场期间经历的迁移率更大(即处于更高的温度，因此移动得更远)。在一些实施方案中，旋转温度梯度以结合时变驱动力的施加产生收敛速度场。
在一些实施方案中，使用电场的焦耳加热用于提供温度梯度。在一些实施方案中，用于提供焦耳加热以提供温度梯度的电场与提供驱动场的电场相同。在一些实施方案中，选择所施加电场的大小以在亲和基质内产生所需的温度梯度。
在一些实施方案中，使用四极电场产生空间温度梯度以提供焦耳加热。在一些这样的实施方案中，提供了具有四个电极的二维凝胶。将电压施加到四个电极上，使得凝胶中的电场是不均匀的，包含高电场(因此是高温)和低电场的区域。电场的取向使得高电场区域倾向于将带负电的分子推向凝胶中心，而低电场区域倾向于将这些分子推离凝胶中心。在一些这样的实施方案中，通过焦耳加热提供温度梯度的电场也是向凝胶中的分子施加驱动力的电场。
图5说明了这种场模式的一个实例。图5中电极A、B、C和D上施加的电压分别为-V、0、0和0。箭头表示带负电的分析物分子的速度。颜色强度代表电场强度。靠近电极A的区域具有高电场强度，其向电极C减弱。靠近电极A 的高场区域倾向于将带负电的分子推向凝胶中心，而靠近电极B、C和D的较低场区域倾向于将带负电的分子推离凝胶中心。在电场还提供温度梯度的实施方案中，由于焦耳加热，亲和基质将在较高场强度的区域中变得更热。因此，高电场强度的区域将与较高温度的区域重合，从而具有较高的迁移率。因此，靠近电极A的高电场区域中的分子倾向于向凝胶中心移动更大的距离，而靠近电极B、C和D的较低电场区域中的分子具有较低的迁移率(在较冷的温度下)，并且将背离凝胶中心移动仅一小段距离。
在一些实施方案中，图5的电场模式通过围绕四个电极旋转电压模式以逐步方式旋转，使得时间平均电场为零，如图6所示。该旋转场将导致任何带负电且迁移率随温度变化的分子向凝胶中心净迁移。在一些实施方案中，电场模式以不同于旋转的方式改变，例如通过将电压模式依次移动180°、90°、180°和90°，或通过随机切换电场方向。如上所示，移动通过亲和基质的分子的迁移率取决于温度，而不是电场强度。所施加电场将倾向于通过焦耳加热提高基质的温度；基质中任意给定点的温度升高大小将与电场大小的平方成正比。
在热梯度由还提供驱动场的电场产生的焦耳热提供的实施方案中，热梯度的振荡将具有与电场振荡相同的周期。这些振荡可以驱动二维凝胶中基于亲和 SCODA的浓缩。
图6示出了根据这样的实施方案的导致迁移率随温度或电场增加的分子的聚焦的电场的逐步旋转。显示了带负电分子的粒子路径。经过四步后，粒子向凝胶中心发生净位移。不会随着温度或电场的变化而改变迁移率的分子将在零时间平均电场中经历零净运动。
聚焦和分离的理论预测
在一些实施方案中，亲和SCODA凝胶内的电场和随后的焦耳加热由施加到源电极的电压和凝胶的形状两者控制。Marziali等人使用叠加的旋转偶极场和四极场来驱动电泳SCODA浓缩。这两个场的强度之比，即偶极子与四极子之比 (D/Q)，对SCODA聚焦的效率有影响，最大值在D/Q＝4.5左右，但最佳值相对平坦，对于1.75和1013之间的值，SCODA力保持相对恒定。D/Q的一个方便选择是2。通过这种特殊选择，只需要在源电极上施加两个不同的电位，这可以通过将一个电极连接到共同电压轨、将其他三个电极接地、并通过表1所示的四种可能的配置以逐步的方式旋转该模式来实现。尽管可以使用模拟放大器，并且在本文所述的实施例中使用了模拟放大器，但使用为2的D/Q比允许使用分离的MOSFET开关，从而简化并降低了所需的电源尺寸和复杂性。
表1.D/Q＝2时SCODA聚焦的电压模式
Figure BDA0003720179290000211
序列特异性凝胶几何结构的起点是用于电泳SCODA初始演示的四面凝胶几何结构。这种几何结构可以由两个数字定义，凝胶宽度和拐角半径。发明人开始使用具有10mm的宽度和3mm的拐角半径的几何结构。在COMSOL
Figure BDA0003720179290000212
建模软件(COMSOL,Inc,Burlington Mass.,USA)中实施了这种几何结构的电热模型，以估计凝胶内的电场和温度分布，并确定这些场和温度分布是否可以驱动具有温度依赖性迁移率的靶标的浓缩。使用的模型同时求解域内的欧姆定律和热方程，使用从欧姆定律的解算出的功率密度作为热方程的源项，并使用热方程的温度解来确定凝胶中的电解质的温度依赖性电导率。
为了获得凝胶内的温度分布的准确估计，对从凝胶顶部和底部传导出来的热量进行了建模。边界条件和其他模型参数如图7所示。使用了水的热特性和0.2M NaCl的电特性。凝胶盒放置在用作恒温储存器的铝制散布板(spreader plate)上。为了模拟流入散布板的热流，使用了由lilt给出的玻璃底部的传热系数。该模型求解的SCODA循环的单步的温度和电场分布如图8所示。施加到四个电极的电压为-120V、0V、0V、0V，散布板温度被设置为55℃(328K)。色彩图(colour map)表示凝胶温度，矢量场表示凝胶内电场的相对大小和方向。请注意，由于 DNA带负电，它的迁移方向将与电场方向相反。
使用给定分子的实验确定的迁移率与温度的值和上述热模型，可以通过对一个完整循环进行积分得到的瞬时漂移速度的时间平均值来确定该特定分子在凝胶中各处的SCODA速度：
Figure BDA0003720179290000221
其中μ是温度依赖性迁移率，E是电场，τ是SCODA循环的周期。求解SCODA 循环中四个步骤的温度和电场，并与等式[23]中的迁移率函数耦合。以这种方式，可以计算凝胶中各处的SCODA速度。由于使用了分离的步骤，如果假设周期足够长，可以忽略电场和温度之间的相位滞后，则等式[33]中的积分变为和：
Figure BDA0003720179290000222
其中速度为对循环中所有四个步骤总计。
例如，图9显示了SCODA速度的矢量图，其使用图11中所示的完美匹配靶标(实施例如下所述)的实验上确定的迁移率与温度曲线以及上面计算的温度和电场值。
图9中绘制的速度场显示了凝胶几何中心处的零速度点，凝胶中所有其他点的速度都指向中心。因此，靶分子可以收集在电场模式中心的凝胶内。
在用于基于对固定化探针的结合亲和力的差异来分离两种相似分子的实施方案中，冲洗力被叠加在上述SCODA聚焦场上。在一些实施方案中，冲洗力是 DC电场，在本文中被描述为DC偏置。对于与固定化探针有亲和力的分子，上述SCODA聚焦场施加的SCODA聚焦力将倾向于抵消由冲洗场引起的分子移动，即SCODA聚焦场将倾向于对分子施加恢复力并且与具有较小结合亲和力的分子相比，这些分子将被优先聚焦。对固定化探针具有较小结合亲和力的分子将在通过亲和基质时具有较大的迁移率，并且恢复SCODA力将较弱。结果，具有较小结合亲和力的分子的焦点将移动。在一些情况下，恢复SCODA力会非常弱，以至于具有较小结合亲和力的此类分子将完全从亲和基质中洗出。
为了使用亲和SCODA从其他类似生物分子群中富集特定的生物分子，可以使用叠加的DC偏置操作SCODA聚焦电场。DC偏置可能会使聚焦的分子偏离中心，这样与固定化的结合位点的结合能较低的分子比结合能较高的分子更远离中心，从而导致焦点分裂成多个焦点。对于具有相似结合能的分子，在偏置下冲洗时，这种分裂可能很小。DC偏置可以直接叠加在聚焦场上，或者DC场可以与聚焦场时间多路复用。
在用于分离具有相似序列的核酸的一个示例性实施方案中，DC偏置叠加在表1所示的电压模式上，产生下表2所示的电压模式。在一些实施方案中，DC 偏置与SCODA聚焦场交替施用，即SCODA聚焦场施加一段时间然后停止， DC偏置施加一段时间然后停止。
表2.用于在DC偏置下聚焦的施加电压。显示的是120V SCODA聚焦电位叠加在10V DC偏置上的值
Figure BDA0003720179290000231
图10A和10B分别显示了在所施加DC偏置的存在下，完美匹配和单碱基错配靶标的所得到的速度图。使用COMSOL计算电场和温度，使用61℃的散布板温度。使用等式[34]计算速度，实验上获得的数据如图11所示拟合(实施例如下所述)。完美匹配靶标的零速度位置已在偏置方向上稍微偏离中心(用圆形点表示)，但错配靶标在凝胶内没有零速度点。这些计算表明，可以将具有较小结合亲和力的靶标从凝胶区域的固定化探针上完全洗掉，同时捕获具有较高结合亲和力的靶标，从而能够选择性纯化、浓缩和/或检测特定序列，甚至其中核苷酸靶标的序列仅在一个位置不同。
在一些实施方案中，通过测量样品分子通过介质的速度作为迁移率变化场的函数来凭经验确定用于进行SCODA聚焦的驱动场和迁移率变化场的最佳组合，其中相似分子之间的聚焦力存在最大差异。例如，在一些实施方案中，在如上所述的亲和基质中测量所需靶分子和非所需靶分子在各种温度下的迁移率，并且选择相对迁移率差异最大的温度范围作为进行亲和SCODA的温度范围。在一些实施方案中，聚焦力与速度相对于扰动场dv/df变化下的速率成正比，其中v 是分子速度，f是场强度。本领域技术人员可以使dv/df最大化，从而使SCODA 聚焦最大化并且能够快速冲洗未聚焦的污染物。为了最大程度地分离两种相似分子，可以在使dva/df-dvb/df(其中va是分子a的速度，vb是分子b的速度)最大化的条件下进行亲和SCODA。
在一些实施方案中，计算施加到亲和基质的电场强度，使得凝胶内的最高温度大致对应于待分离的两种分子之间的结合亲和力的差异最高时的温度。
在一些实施方案中，待分离的两种分子之间的结合亲和力的差异最高时的温度对应于靶分子和亲和剂的解链温度与非靶分子和亲和剂的解链温度之间的差异最高时的温度。在一些实施方案中，靶分子和亲和剂的解链温度与非靶分子和亲和剂的解链温度之间的最大差异小于约9.3℃，在一些实施方案中小于约7.8℃，在一些实施方案中小于约5.2℃，并且在一些实施方案中小于约0.7℃。
在一些实施方案中，可以通过亲和SCODA分离的靶分子与非靶分子的比率为1:1至1:10,000的任意比率和其间的任意值，例如1:100或1:1,000。在一些实施方案中，在进行亲和SCODA之后，位于靶分子的焦点中的非靶分子与靶分子的比率以高达10,000倍的系数降低。
相位滞后引起的旋转
在一些实施方案中，为了分离对固定化的亲和剂具有不同亲和力的分子，DC 偏置被叠加在如上所述的SCODA聚焦场上。如果结合能的分离足够大，那么错配靶标可以完全从凝胶上洗掉。从凝胶中冲洗弱聚焦的污染片段的能力会受到上面讨论的相位滞后引起的旋转的影响，其中二维系统的SCODA速度由下式给出：
Figure BDA0003720179290000251
其中φ是电场振荡和迁移率变化振荡之间的相位滞后。除了降低有助于浓缩的SCODA速度的比例之外，该结果在将弱聚焦的污染物从亲和基质中洗掉时具有额外的意义。旋转分量将增加DC偏置，并可能导致凝胶中的零速度点或低速度点，这会显著增加从凝胶中冲洗错配靶标所需的时间。
为了抵消在电场振荡和迁移率变化振荡之间存在相位滞后的实施方案中可能出现的运动的旋转分量的影响，可以周期性地旋转施加的SCODA聚焦场的方向。在一些实施方案中，SCODA聚焦场的旋转方向每周期改变一次。
光学反馈
在一个目的分子(靶分子)被浓缩在亲和基质中而第二个类似的分子(非靶分子)被从亲和基质中洗掉的一些实施方案中，光学反馈可用于确定何时冲洗完全和/或避免使靶分子跑出亲和基质。
相似分子的两个焦点可能在地理上靠近在一起，并且可以使用光学反馈来确保目的分子不会从凝胶上洗掉。例如，对目的分子或污染分子(或两者)使用荧光替代物，可以监测它们各自的位置，同时在偏置下聚焦，并使用该地理信息来调整偏置，确保目的分子被推得尽可能离凝胶边缘近，但不会被推离，而污染分子可从凝胶中去除。
在一些实施方案中，待分离的分子被差异标记，例如用不同颜色的荧光标签差异标记。使用荧光检测进行的实时监测可用于确定非靶分子何时已从亲和基质上洗掉，或确定靶分子和非靶分子的焦点何时在亲和基质内相距足够远以允许从亲和基质中分别提取两个焦点。
在一些实施方案中，与靶分子和/或非靶分子类似地聚焦的荧光替代分子可用于执行光学反馈。通过使用靶分子、非靶分子或靶分子和非靶分子两者的荧光替代物，可以在冲洗偏置下执行亲和聚焦的同时监测靶分子和/或非靶分子的各自位置。替代分子在亲和基质内的位置可用于调整冲洗偏置，以确保目的分子被推得尽可能离凝胶边缘近，但不会被推离，而污染分子可被从凝胶中洗掉。
在一些实施方案中，可以将与靶分子和/或非靶分子类似地聚焦但不会在可能进行的任意后续PCR反应中扩增的荧光替代分子添加到待纯化的样品中。荧光替代分子在亲和基质中的存在使得能够使用光学反馈来实时控制SCODA聚焦条件。荧光检测可用于使荧光替代分子在亲和基质中的位置可视化。在荧光替代物模拟靶分子的聚焦行为的实施方案中，当荧光替代物接近亲和基质的边缘时，可以减小施加的冲洗力，以避免将靶分子从亲和基质中洗出。在荧光替代物模拟将与靶分子分离的非靶分子的聚焦行为的实施方案中，在荧光替代物已从亲和基质中洗出后，或者可选地当荧光替代物的位置接近亲和基质的边缘时，可以减小或停止施加的冲洗力。
差异性修饰的分子的分离
在一些实施方案中，使用亲和SCODA分离除了存在或不存在改变分子对探针的结合亲和力的化学修饰之外相同的分子。亲和SCODA的一些实施方案对于分离两个对固定化的亲和剂的结合亲和力只有很小差异的分子是足够灵敏的。此类分子的实例包括差异性修饰的分子，例如甲基化和未甲基化的核酸、甲基化或乙酰化的蛋白质等。
例如，先前已经表明，相对于未甲基化的DNA序列，胞嘧啶残基的甲基化增加了杂交的结合能。与未甲基化的序列相比，当甲基化时，预计RNA序列会显示出相似的杂交结合能增加。发明人已经表明，亲和SCODA的一个实施方案可用于分离仅因存在单个甲基化的胞嘧啶残基而不同的核酸序列。预计其他化学修饰会以类似方式改变核酸及其互补序列的结合能。蛋白质的修饰，例如通过甲基化，也可以改变目的蛋白质与蛋白质、RNA或DNA适体、抗体或在甲基化位点处或甲基化位点附近与蛋白质结合的其他分子的结合亲和力。因此，亲和SCODA的实施方案可用于分离差异性修饰的目的分子。虽然本文的实例针对甲基化富集，但亲和SCODA也可应用于富集和选择具有其他化学差异的分子，包括例如乙酰化。
亲和SCODA和序列特异性SCODA可用于从甲基化和未甲基化的DNA的背景中富集甲基化的DNA的特定序列。在这种亲和SCODA的应用中，SCODA 聚焦力的强度可能与靶DNA与结合的寡核苷酸的结合能有关。可以使具有较高结合能的靶分子比具有较低结合能的靶标更强烈地聚焦。DNA的甲基化先前已被证明会略微增加靶DNA与其互补序列的结合能。互补寡核苷酸的结合能的微小变化可以通过亲和SCODA而发挥作用，以优先富集甲基化的DNA。可以选择SCODA操作条件，例如如上所述，使得甲基化的DNA被浓缩，而相同序列的未甲基化的DNA被从凝胶上洗掉。
一些实施方案可以分离与固定化的亲和剂的结合能的差异小于kT(靶分子的热激发能)的分子。一些实施方案可以分离与固定化的亲和剂的结合能的差异小于0.19kcal/mol的分子。一些实施方案可以分离与固定化的亲和剂的结合能的差异小于2.6kcal/mol的分子。一些实施方案可以分离与固定化的亲和剂的结合能的差异小于3.8kcal/mol的分子。一些实施方案可以分离仅因甲基的存在而不同的分子。一些实施方案可以分离仅在一个碱基处序列不同的核酸序列。
亲和SCODA的应用
如上所述的用于分离、纯化、浓缩和/或检测差异性修饰的分子的系统和方法可以应用于生物标志物、特定核苷酸序列或差异性修饰的分子的检测很重要的领域，例如表观遗传学、胎儿DNA检测、病原体检测、癌症筛查和监测、器官衰竭检测、各种疾病状态检测等。例如，在一些实施方案中，亲和SCODA用于分离、纯化、浓缩和/或检测差异甲基化的DNA，例如使用母体体液的胎儿诊断测试、体液中的病原体检测和用于检测癌症的体液中的生物标志物检测、器官衰竭或其他疾病状态等领域，并用于监测此类病况的进展或治疗。
在一些实施方案中，体液样品或组织样品从受试者获得。可以裂解细胞，剪切基因组DNA，并对样品进行亲和SCODA。在一些实施方案中，使用亲和 SCODA浓缩的分子经受进一步分析，例如DNA测序、数字PCR、荧光检测等，以测定特定生物标志物或核苷酸序列的存在。在一些实施方案中，受试者是人。
已知胎儿DNA存在于母体血浆中，母体与从母体血浆中获得的胎儿DNA的差异甲基化可用于筛查遗传病症(参见例如Poon等人，2002,Clinical Chemistry 48:1,35-41)。然而，一个难以克服的问题是胎儿和母体DNA之间的区别。如上所述的亲和SCODA可用于优先分离、纯化、浓缩和/或检测胎儿DNA与母体 DNA中差异甲基化的DNA。例如，亲和SCODA可用于浓缩或检测在胎儿DNA 中甲基化但在母体DNA中未甲基化的DNA，或在母体DNA中甲基化但在胎儿 DNA中未甲基化的DNA。在一些实施方案中，从受试者获得母体血浆样品并使用针对目的序列的寡核苷酸探针进行亲和SCODA。在施加SCODA聚焦场后检测到两个焦点可能表明在受试者和胎儿之间存在差异甲基化的DNA。与来自表现出特定遗传病症的受试者的参考样品的比较可用于确定胎儿是否可能处于患有遗传病症的风险中。通过常规方法(例如PCR、DNA测序、数字PCR、荧光检测等)对通过差异性修饰SCODA获得的DNA样品进行进一步分析，可用于评估胎儿可能患有遗传病症的风险。
本发明的系统和方法的一个实施方案用于检测胎儿DNA中的异常，包括染色体拷贝数异常。基于母体血浆样品中胎儿DNA的差异甲基化，使用亲和 SCODA浓缩已知在胎儿DNA中与母体DNA中差异甲基化的不同染色体区域，以从母体DNA中分离胎儿DNA。对分离的胎儿DNA进行进一步分析(例如使用qPCR、DNA测序、荧光检测或其他合适的方法)以计算每个染色体的拷贝数并确定拷贝数异常。
大多数癌症是遗传变化和表观遗传变化组合的结果，例如DNA甲基化的变化(例如某些区域的低甲基化和/或高甲基化，参见例如Ehrich,2002,Oncogene 21:35,5400-5413)。亲和SCODA可用于分离、纯化、浓缩和/或检测目的DNA 序列，以筛选异常甲基化的致癌基因。亲和SCODA的实施方案用于涉及在癌细胞或癌前细胞中与在健康细胞中具有不同甲基化模式的DNA的生物标志物的检测。此类生物标志物的检测可用于早期癌症筛查以及癌症发展或治疗进展的监测。在一些实施方案中，从受试者获得的样品，例如体液样品，例如血浆或活检，可以使用针对目的序列的寡核苷酸探针通过差异性修饰SCODA进行处理和分析。在施加SCODA场期间存在两个焦点可能表明在目的DNA序列上存在差异甲基化。从受试者获得的样品与参考样品(例如来自健康患者的样品和/或已知源自癌组织或癌前组织的样品)的比较可以表明受试者的细胞是否处于癌变或癌前风险中。通过常规方法(例如PCR、DNA测序、数字PCR、荧光检测等) 对通过差异性修饰SCODA获得的DNA样品进行进一步分析，可用于评估样品可能包含癌细胞或癌前细胞的风险，以评估癌症的进展或评估治疗的有效性。
在一些实施方案中，在凝胶中捕获特定核苷酸序列而不管是否甲基化(即不选择核酸的特定甲基化状态)。不需要的核苷酸序列和/或其他污染物可以从凝胶上洗掉，而特定的核苷酸序列仍然被固定在分离介质中的寡核苷酸探针结合。然后，差异甲基化SCODA用于聚焦序列的甲基化版本，同时将未甲基化的序列电冲洗到缓冲室或另一个凝胶，然后可以将其回收。在一些实施方案中，可以优先提取未甲基化的序列。
在一些实施方案中，使用亲和SCODA选择性地浓缩血液中与疾病状态或感染相关的生物分子。在一些实施方案中，所述生物分子是具有使得它们成为疾病状态或感染的有用生物标志物的序列或化学差异的独特核酸。在这样的浓缩之后，可以使用PCR、测序或类似方式检测生物标志物。在一些实施方案中，从受试者获得体液或组织样品，裂解细胞，剪切基因组DNA，并使用与目的序列互补的寡核苷酸探针进行亲和SCODA。亲和SCODA用于检测目的核酸序列的差异甲基化群体的存在。目的靶序列的差异甲基化群体的存在可能表明受试者具有特定疾病状态或感染的可能性。
在一些实施方案中，将来自受试者的通过亲和SCODA产生的靶核酸的聚焦模式与来自一个或多个参考样品(例如从健康受试者获得的等效样品和/或从已知患有特定疾病的受试者获得的等效样品)的亲和SCODA产生的靶核酸的聚焦模式进行比较。从受试者获得的样品产生的聚焦模式与从已知患有特定疾病的受试者获得的参考样品之间的相似性表明受试者患有相同疾病的可能性。从受试者获得的样品产生的聚焦模式与从健康受试者获得的参考样品之间的差异表明受试者可能患有疾病的可能性。从受试者获得的样品和从健康受试者获得的参考样品产生的聚焦模式的差异可能表明受试者与健康受试者相比存在差异性修饰或突变。
使用多种亲和剂捕获多种靶分子
在一些实施方案中，亲和SCODA用于分离、纯化、浓缩和/或检测每个样品多于一个的序列。本文所述的实例表明，可以在低至1μM的探针浓度以及高达 100μM的探针浓度下浓缩靶DNA。在一些实施方案中，通过将多种不同的亲和剂固定在介质中以提供亲和基质来进行多重浓缩。在一些实施方案中，将至少两种不同的亲和剂固定在介质中以分离、纯化、浓缩和/或检测至少两种不同的靶分子。在一些实施方案中，亲和剂中的每一种是具有不同序列的寡核苷酸探针。在一些实施方案中，将2至100个不同寡核苷酸探针固定在介质中以提供亲和基质，并且在单个亲和凝胶中同时分离、纯化、浓缩和/或检测2至100种不同的靶分子。每个靶分子可以用不同的标签标记以方便检测，例如每个靶分子可以用不同颜色的荧光标签标记。
在两种或更多种亲和剂中的每一种与两种或更多种靶分子之间的结合能不同的一些实施方案中，两种或更多种靶分子可以通过在适当温度下施加SCODA 聚焦场而在亲和基质内差异分离。在一些实施方案中，对其相应亲和剂具有较低解链温度的第一靶分子可以优先与对其相应亲和剂具有相对较高解链温度的第二靶分子分离。在一些这样的实施方案中，第一分子通过在这样的温度下进行SCODA聚焦而被优先浓缩，即温度足够低以至于对其相应亲和剂具有相对较高解链温度的第二靶分子不能有效地聚焦(即，第二靶分子在亲和基质内的迁移率相对较低的温度)，但足够高以使第一分子能够有效聚焦。在一些这样的实施方案中，第一和第二分子通过在这样的温度下施加冲洗偏置(例如DC偏置) 而不同地分离，即温度足够低以至于第二靶分子不会被冲洗偏置取代或仅被冲洗偏置缓慢地取代，但温度足够高以至于第一靶分子被冲洗偏置取代或以更高的速度被冲洗偏置取代.
执行亲和SCODA的设备
在一些实施方案中，亲和SCODA在电泳设备上进行，所述电泳设备包括用于容纳亲和基质的区域、缓冲液储存器、能够提供足够大的电压和电流以产生所需效果的电源、SCODA介质(其在一些实施方案中为凝胶)的精确温度控制以及用于监测SCODA介质中两种不同分子的双色荧光成像系统。
样品制备方法
在一些方面，本公开提供了用于制备样品(例如用于检测和/或分析)的方法。在一些实施方案中，本文所述的方法可用于鉴定样品的性质或特征，包括样品中一种或多种靶分子的序列(例如，核苷酸序列或氨基酸序列)同一性。在一些实施方案中，方法可以包括一个或多个样品转化步骤，例如样品裂解、样品纯化、样品片段化、片段化样品的纯化、文库制备(例如，核酸文库制备)、文库制备的纯化、样品富集(例如，使用亲和SCODA)和/或靶分子的检测/分析。
在一些实施方案中，样品可以是纯化的样品、细胞裂解物、单细胞、细胞群或组织。在一些实施方案中，样品是任意生物样品。在一些实施方案中，样品 (例如，生物样品)是血液、唾液、痰液、粪便、尿液或口腔拭子样品。在一些实施方案中，生物样品来自人、非人灵长类动物、啮齿动物、狗、猫、马或任意其他哺乳动物。在一些实施方案中，生物样品来自细菌细胞培养物(例如，大肠杆菌细菌细胞培养物)。细菌细胞培养物可以包括革兰氏阳性细菌细胞和/ 或革兰氏阴性细菌细胞。在一些实施方案中，样品是先前已通过用户开发的方法从宏基因组样品或环境样品中提取的核酸或蛋白质的纯化的样品。血液样品可以是来自受试者(例如，人类受试者)的新鲜抽取的血液样品或干的血液样品(例如，保存在固体介质(例如，Guthrie卡)上)。血液样品可以包括全血、血清、血浆、红细胞和/或白细胞。
在一些实施方案中，样品(例如，包含细胞或组织的样品)可以在根据本公开的方法中被裂解(例如，破坏、降解和/或以其他方式消化)。在一些实施方案中，使用任何一种已知的物理或化学方法学裂解包含细胞或组织的样品以从所述细胞或组织释放靶分子(例如，靶核酸或靶蛋白)。在一些实施方案中，可以使用电解法、酶促法、基于去污剂的方法和/或机械均化来裂解样品。在一些实施方案中，样品(例如，复杂组织、革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌)可能需要连续进行多种裂解方法。在一些实施方案中，如果样品不包含细胞或组织(例如，包含纯化的核酸的样品)，则可以省略裂解步骤。在一些实施方案中，进行样品裂解以分离靶核酸。在一些实施方案中，进行样品裂解以分离靶蛋白。在一些实施方案中，裂解方法进一步包括使用研磨机研磨样品、超声处理、表面声波(SAW)、冻融循环、加热、添加去污剂、添加蛋白质降解剂(例如酶，如水解酶或蛋白酶)和/或添加细胞壁消化酶(例如溶菌酶或酶解酶)。用于裂解的示例性去污剂(例如非离子去污剂)包括聚氧乙烯脂肪醇醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物、聚山梨醇酯和烷基酚乙氧基化物，优选壬基苯酚乙氧基化物、烷基葡糖苷和/或聚氧乙烯烷基苯基醚。在一些实施方案中，裂解方法包括在所需温度(例如，至少60℃、至少70℃、至少80℃、至少90℃或至少95℃)下将样品加热至少1-30分钟、1-25分钟、5-25分钟、5-20分钟、 10-30分钟、5-10分钟、10-20分钟或至少5分钟。
在一些实施方案中，可以在根据本公开的方法中，例如在裂解之后纯化样品 (例如，包含靶核酸或靶蛋白的样品)。在一些实施方案中，可以使用色谱(例如，选择性结合样品的亲和色谱)或电泳来纯化样品。在一些实施方案中，可以在沉淀剂的存在下纯化样品。在一些实施方案中，在纯化步骤或方法之后，可以使用洗脱缓冲液从纯化基质(例如亲和色谱基质)中冲洗和/或释放样品。在一些实施方案中，纯化步骤或方法可以包括使用可逆的可转换聚合物，例如电活性聚合物。在一些实施方案中，可以通过使样品电泳通过多孔基质(例如，醋酸纤维素、琼脂糖、丙烯酰胺)来纯化样品。
在一些实施方案中，样品(例如，包含靶核酸或靶蛋白的样品)可以在根据本公开的方法中被片段化。在一些实施方案中，核酸样品可以被片段化以产生用于序列特异性鉴定的小(<1千碱基)片段到用于长读长(read)测序应用的大(高达10+千碱基)片段。在一些实施方案中，核酸或蛋白质的片段化可以使用机械 (例如，流体剪切)、化学(例如，铁(Fe+)裂解)和/或酶促(例如，限制性酶、使用转座酶的标签化(tagmentation))方法来完成。在一些实施方案中，蛋白质样品可以被片段化以产生任意长度的肽片段。在一些实施方案中，蛋白质的片段化可以使用化学和/或酶促(例如蛋白水解酶，如胰蛋白酶)方法来完成。在一些实施方案中，平均片段长度可以通过反应时间、温度以及样品和/或酶(例如，限制酶、转座酶)的浓度来控制。在一些实施方案中，核酸可以通过标签化被片段化，使得核酸同时被片段化并用荧光分子(例如，荧光团)标记。在一些实施方案中，片段化的样品可以进行一轮纯化(例如，色谱或电泳)以去除小的和/或不需要的片段以及在片段化步骤期间使用的残留的有效载荷 (payload)、化学品和/或酶(例如，转座酶)。例如，片段化的样品(例如包含核酸的样品)可以从酶(例如，转座酶)中纯化，其中纯化包括使酶变性(例如，通过热、化学(例如，SDS)和酶促(例如，蛋白酶K)过程)。
在一些实施方案中，包含靶核酸的样品可用于在根据本公开的方法中产生核酸文库以用于后续分析(例如，基因组测序)。核酸文库可以是线性文库或环状文库。在一些实施方案中，环状文库的核酸可以包含允许下游线性化的元件(例如，核酸内切酶限制性位点、尿嘧啶的掺入)。在一些实施方案中，可以纯化(例如，使用色谱(例如亲和色谱)或电泳)核酸文库。
在一些实施方案中，使用末端修复制备核酸(例如，线性核酸)文库，在该方法中，酶(例如，Taq DNA连接酶、核酸内切酶IV、Bst DNA聚合酶、Fpg、尿嘧啶-DNA糖基化酶、T4核酸内切酶V和/或核酸内切酶VIII)的组合延伸核酸的3’端，产生5’有效载荷的互补物，并修复核酸中的任何无碱基位点或切口。在一些实施方案中，使用自引发发夹接头(self-priming hairpin adaptor)制备线性核酸文库，该方法可以避免在形成聚合酶复合物之前独特的测序引物与单个核酸片段引物退火的需要。在末端修复之后，核酸(例如线性核酸)文库可以使用固相吸附进行纯化，随后利用核酸通过尺寸选择性基质(例如琼脂糖凝胶)来洗脱到新鲜缓冲液中。尺寸选择性基质可用于去除小于靶核酸的大小的核酸片段。
在一些实施方案中，可以在根据本公开的方法中富集样品(例如，包含靶核酸或靶蛋白的样品)中的靶分子。在一些实施方案中，使用电泳法富集样品中的靶分子。在一些实施方案中，使用亲和SCODA富集样品中的靶分子。在一些实施方案中，使用场反转凝胶电泳(FIGE)富集样品中的靶分子。在一些实施方案中，使用脉冲场凝胶电泳(PFGE)富集样品中的靶分子。在一些实施方案中，在富集过程中使用的基质(例如，多孔介质、电泳聚合物凝胶)包含与样品中存在的靶分子结合的固定化的亲和剂(也称为“固定化的捕获探针”)。在一些实施方案中，在富集过程中使用的基质包含1、2、3、4、5或更多个独特的固定化的捕获探针，每个探针与独特的靶分子结合和/或以不同的结合亲和力与相同的靶分子结合。
在一些实施方案中，固定化的捕获探针是与靶核酸杂交的寡核苷酸捕获探针。在一些实施方案中，寡核苷酸捕获探针与靶核酸至少50％、60％、70％、80％、 90％、95％或100％互补。在一些实施方案中，单个寡核苷酸捕获探针可用于富集具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的序列同一性的多个相关靶核酸(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或更多个相关靶核酸)。多个相关靶核酸的富集可以允许生成宏基因组文库。在一些实施方案中，寡核苷酸捕获探针可以实现相关靶核酸的差异富集。在一些实施方案中，寡核苷酸捕获探针可以使靶核酸相对于其修饰状态(例如，单核苷酸多态性、甲基化状态、乙酰化状态)不同的具有相同序列的核酸富集。在一些实施方案中，寡核苷酸捕获探针用于富集人基因组DNA以获得特定的目的基因(例如， HLA)。特定的目的基因可以是与特定疾病状态或病症相关的基因。在一些实施方案中，寡核苷酸捕获探针用于富集宏基因组样品的核酸。
在一些实施方案中，为了富集长度为0.5-2千碱基的核酸靶分子，可以使用5’Acrydite部分将寡核苷酸捕获探针共价固定在丙烯酰胺基质中。在一些实施方案中，为了富集更大的核酸靶分子(例如，具有>2千碱基的长度)的目的，寡核苷酸捕获探针可以被固定在琼脂糖基质中。在一些实施方案中，可以使用硫醇- 环氧化物化学将寡核苷酸捕获探针固定在琼脂糖基质中(例如，通过将硫醇修饰的寡核苷酸共价连接到交联的琼脂糖珠粒)。连接到琼脂糖珠粒的寡核苷酸捕获探针可以在标准琼脂糖基质(例如，以相同的琼脂糖百分比)中组合和固化。
在一些实施方案中，使用本文所述的方法富集核酸(例如，使用SCODA富集)产生包含约0.5千碱基(kb)、约1kb、约1.5kb、约2kb、约3kb、约4kb、约5k b、约6kb、约7kb、约8kb、约9kb、约10kb、约12kb、约15kb、约 20kb或更大的长度的核酸靶分子。在一些实施方案中，使用本文所述的方法富集核酸(例如，使用SCODA富集)产生包含约0.5-2kb、0.5-5kb、1-2kb、1-3 kb、1-4kb、1-5kb、1-10kb、2-10kb、2-5kb、5-10kb、5-15kb、5-20kb、5-25 kb、10-15kb、10-20kb或10-25kb的长度的核酸靶分子。
在一些实施方案中，固定化的捕获探针是与靶蛋白或肽片段结合的蛋白质捕获探针(例如，适体或抗体)。在一些实施方案中，蛋白质捕获探针以10-9至10-8 M、10-8至10-7M、10-7至10-6M、10-6至10-5M、10-5至10-4M、10-4至10-3M 或10-3至10-2M的结合亲和力与靶蛋白或肽片段结合。在一些实施方案中，结合亲和力在皮摩尔至纳摩尔范围内(例如，在约10-12和约10-9M之间)。在一些实施方案中，结合亲和力在纳摩尔至微摩尔范围内(例如，在约10-9和约10-6 M之间)。在一些实施方案中，结合亲和力在微摩尔至毫摩尔范围内(例如，在约10-6和约10-3M之间)。在一些实施方案中，结合亲和力在皮摩尔至微摩尔范围内(例如，在约10-12和约10-6M之间)。在一些实施方案中，结合亲和力在纳摩尔至毫摩尔范围内(例如，在约10-9和约10-3M之间)。在一些实施方案中，单个蛋白质捕获探针可用于富集具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％序列同一性的多个相关靶蛋白。在一些实施方案中，单个蛋白质捕获探针可用于富集具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％序列同一性的多个相关靶蛋白(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或更多个相关靶蛋白)。多个相关靶蛋白的富集可以允许生成宏蛋白质组学文库。在一些实施方案中，蛋白质捕获探针可以实现相关靶蛋白的差异富集。
在一些实施方案中，多个捕获探针(例如，多个捕获探针类型的群体，例如，与诸如腺病毒、葡萄球菌、肺炎或结核病等传染原的确定性靶分子结合的捕获探针类型)可被固定在富集基质中。将样品施加于具有多个确定性捕获探针的富集基质可能会导致疾病或病况的诊断(例如，传染原的存在)。
在一些实施方案中，在根据本公开的方法中，可以在去除非靶分子之后从富集基质中释放靶分子或相关靶分子。在一些实施方案中，可以通过增加富集基质的温度从富集基质中释放靶分子。调整基质的温度会进一步影响迁移速率，因为升高的温度会提供更高的捕获探针严格性，从而需要靶分子和捕获探针之间更大的结合亲和力。在一些实施方案中，在富集相关靶分子时，可以逐步提高基质温度，以逐步增加同源性的方式释放和分离靶分子。在一些实施方案中，温度在每个步骤中或在一段时间内(例如，1-10分钟、1-5分钟或4-8分钟)增加约5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％或更多。在一些实施方案中，温度在每个步骤中或在一段时间内(例如，1-10分钟、1-5分钟或4-8分钟) 增加5％-10％、5-15％、5％-20％、5％-25％、5％-30％、5％-40％、5％-50％、10％-25％、 20％-30％、30％-40％、35％-50％或40％-70％。在一些实施方案中，温度在每个步骤中或在一段时间内(例如，1-10分钟、1-5分钟或4-8分钟)增加约1℃、2℃、 3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃或10℃。在一些实施方案中，温度在每个步骤中或在一段时间内(例如，1-10分钟、1-5分钟或4-8分钟)增加1-10℃、1-5℃、2-5℃、2-10℃、3-8℃、4-9℃或5-10℃。这可以允许对与初始参考靶分子的关系越来越远的靶蛋白或靶核酸进行测序，从而能够发现新的蛋白质(例如酶)或功能(例如酶促功能或基因功能)。在一些实施方案中，当使用多个捕获探针(例如，多个确定性捕获探针)时，基质温度可以以逐步或梯度方式增加，允许不同靶分子的温度依赖性释放并导致产生一系列条形码释放带，代表存在或不存在对照分子和靶分子。
样品(例如，包含靶核酸或靶蛋白的样品)的富集使得样品的总体积减少。例如，在一些实施方案中，样品的总体积在富集后减少至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％或至少120％。在一些实施方案中，样品的总体积在富集后从1-20mL 初始体积减少到100-1000μL最终体积，从1-5mL初始体积减少到100-1000μL 最终体积，从100-1000μL初始体积减少到25-100μL最终体积，从100-500μL 初始体积减少到10-100μL最终体积，或从50-200μL初始体积减少到1-25μL 最终体积。例如，在一些实施方案中，样品的最终体积在富集后为10-100μL、 10-50μL、10-25μL、20-100μL、20-50μL、25-100μL、25-250μL、25-1000μL、 100-1000μL、100-500μL、100-250μL、200-1000μL、200-500μL、200-750μL, 500-1000μL、500-1500μL、500-750μL、1-5mL、1-10mL、1-2mL、1-3mL 或1-4mL。
在一些实施方案中，在根据本公开的方法中，可以在富集和随后释放之后检测一个或多个靶分子，以使得能够分析所述一个或多个靶分子及其上游样品。在一些实施方案中，可以使用基因测序、吸光度、荧光、电导率、电容、表面等离子共振、杂交捕获、抗体、核酸的直接标记(例如，末端标记、标记的标签化有效载荷)、用嵌入染料(例如溴化乙锭、SYBR染料)进行非特异性标记或任何其他已知的核酸检测方法学来检测靶核酸。在一些实施方案中，可以使用吸光度、荧光、质谱、氨基酸测序或用于蛋白质或肽检测的任何其他已知的方法学来检测靶蛋白或肽片段。
样品制备装置和模块
通常提供在制备用于分析的样品的方法中使用的装置或模块，其包括设备、盒(例如，包括通道(例如，微流体通道))和/或泵(例如，蠕动泵)。可以根据本公开使用装置来实现从生物样品中捕获、浓缩、操纵和/或检测靶分子。在一些实施方案中，提供了用于自动化处理样品以产生用于下一代测序和/或其他下游分析技术的材料的装置和相关方法。装置和相关方法可用于执行化学和/或生物反应，包括根据本文别处描述的样品制备或样品分析方法用于核酸和/或蛋白质处理的反应。
在一些实施方案中，样品制备装置或模块被定位成将靶分子或多个靶分子 (例如，靶核酸或靶蛋白)递送或转移至测序模块或装置。在一些实施方案中，样品制备装置或模块直接连接到(例如，物理连接到)或间接连接到测序装置或模块。
在一些实施方案中，样品制备装置或模块用于制备用于诊断目的的样品。在一些实施方案中，用于制备用于诊断目的的样品的样品制备装置被定位以将靶分子或多个分子(例如，靶核酸或靶蛋白)递送或转移至诊断模块或诊断装置。在一些实施方案中，样品制备装置或模块直接连接到(例如，物理连接到)或间接连接到诊断装置。
在一些实施方案中，装置包括被设置为接收一个或多个盒(例如，被设置为一次接收一个盒)的盒外壳。在一些实施方案中，盒包括一个或多个被设置为接收流体和/或包含在样品制备过程中使用的一种或多种试剂的储存器或反应容器。在一些实施方案中，盒包括一个或多个被设置为容纳和/或传输在样品制备过程中使用的流体(例如，包含一种或多种试剂的流体)的通道(例如，微流体通道)。试剂包括缓冲液、酶试剂、聚合物基质、捕获试剂、尺寸特异性选择试剂、序列特异性选择试剂和/或纯化试剂。在本文别处描述了用于样品制备过程的另外的试剂。
在一些实施方案中，盒包括一种或多种储存的试剂(例如，适合重构为液体形式的液体或冻干形式)。盒的储存试剂包括适合于执行所需过程的试剂和/或适合于处理所需样品类型的试剂。在一些实施方案中，盒是单次使用的盒(例如一次性盒)或多次使用的盒(例如可重复使用的盒)。在一些实施方案中，盒被设置为接收用户提供的样品。所述用户提供的样品可以在所述装置接收盒之前或之后添加到盒中，例如，由用户手动添加或在自动化过程中添加。在一些实施方案中，盒是样品制备盒。在一些实施方案中，样品制备盒能够从样品(例如，生物样品)中分离或纯化靶分子(例如，靶核酸或靶蛋白)。
在一些实施方案中，盒包含如本文所述的用于富集的亲和基质。在一些实施方案中，盒包含用于使用亲和SCODA、FIGE或PFGE进行富集的亲和基质。在一些实施方案中，盒包含亲和基质，所述亲和基质包含对靶核酸或靶蛋白具有结合亲和性的固定化的亲和剂。
在一些实施方案中，本公开的样品制备装置产生(例如，富集或纯化)靶核酸，其具有比使用对照方法(例如，Sage BluePippin方法、手动方法(例如，基于珠粒的手动尺寸选择方法))产生的平均读长长的用于下游测序应用的平均读长。在一些实施方案中，样品制备装置产生具有用于测序的平均读长的靶核酸，其包括至少700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、 1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、 2900或3000个核苷酸长度。在一些实施方案中，样品制备装置产生具有用于测序的平均读长的靶核酸，其包括700-3000、1000-3000、1000-2500、1000-2400、 1000-2300、1000-2200、1000-2100、1000-2000、1000-1900、1000-1800、1000-1700、 1000-1600、1000-1500、1000-1400、1000-1300、1000-1200、1500-3000、1500-2500、 1500-2000或2000-3000个核苷酸长度。
根据本公开的装置通常包含机械和电子和/或光学部件，其可用于操作如本文所述的盒。在一些实施方案中，装置部件运行以在盒上或在盒的特定区域上实现和维持特定温度。在一些实施方案中，装置部件运行以向盒的电极施加特定时长的特定电压。在一些实施方案中，装置部件运行以将液体移入、移出盒的储存器和/或反应容器或移至盒的储存器和/或反应容器之间。在一些实施方案中，装置部件运行以将液体移动通过盒的通道，例如，移入、移出盒的储存器和/或反应容器或移至盒的储存器和/或反应容器之间。在一些实施方案中，装置部件通过与盒的弹性体、试剂特异性储存器或反应容器相互作用的蠕动泵送机构(例如，设备)移动液体。在一些实施方案中，装置部件通过蠕动泵送机构 (例如，设备)移动液体，所述蠕动泵送机构被设置为与与盒的通道相关联的弹性体部件(例如，包括弹性体的表面层)相互作用以泵送流体通过通道。装置部件可以包括计算机资源，例如，用于驱动可以输入样品信息、可以选择特定过程以及可以报告运行结果的用户界面。
在一些实施方案中，盒能够处理小体积流体(例如，1-10μL、2-10μL、4-10 μL、5-10μL、1-8μL或1-6μL流体)。在一些实施方案中，测序盒物理嵌入样品制备装置或模块或与样品制备装置或模块相关联(例如，以允许将制备的样品递送至反应混合物以进行测序)。在一些实施方案中，物理嵌入样品制备装置或模块或与样品制备装置或模块相关联的的测序盒包括具有面密封垫圈或锥形压配合(例如鲁尔接头(Luer fitting))形式的流体界面的微流体通道。在一些实施方案中，随后可以在递送所制备的样品后打破流体界面，以便将测序盒与样品制备装置或模块物理分离。
以下非限制性实例旨在说明本文所述的装置、方法和组合物的方面。根据本公开的样品制备装置或模块的使用可以进行以下描述的步骤中的一个或多个。用户可以打开装置的盖子并插入支持所需过程的盒。然后，用户可以将可以与特定裂解溶液结合的样品添加到盒上的样品端口。然后，用户可以关闭装置盖子，通过装置上的触摸屏界面输入任何样品特定信息，选择任何过程特定参数 (例如，所需大小选择的范围、靶分子捕获所需的同源度等)，并启动样品制备过程运行。运行后，用户可能会收到相关的运行数据(例如，运行成功完成的确认、运行特定指标等)以及过程特定信息(例如，生成的样本量、特定靶序列的存在或不存在等)。通过运行生成的数据可以进行后续的生物信息学分析，该分析可以是本地的或基于云的。根据进程，可以从盒中提取完成的样品以供后续使用(例如，基因组测序、qPCR定量、克隆等)。然后可打开所述装置，然后可取出所述盒。
在一些实施方案中，样品制备模块包括泵。在一些实施方案中，泵是蠕动泵。一些这样的泵包括一种或多种用于本文所述的流体处理的本发明部件。例如，所述泵可以包括设备和/或盒。在一些实施方案中，所述泵的设备包括辊(roller)、曲柄和摇杆。在一些这样的实施方案中，曲柄和摇杆被设置为连接到辊的曲柄摇杆机构。在一些情况下，曲柄摇杆机构与设备的辊的联接可以实现本文所述的某些优点(例如，设备与盒的轻松脱离、良好计量的行程(stoke)体积)。在某些实施方案中，所述泵的盒包括通道(例如，微流体通道)。在一些实施方案中，所述盒的通道的至少一部分具有某些截面形状和/或表面层，其可能有助于本文所述的许多优点中的任意一个。
在一些情况下，可以提供某些益处的一些盒的一个非限制性方面是在所述盒中包括具有某些截面形状的通道。例如，在一些实施方案中，所述盒包括v形通道。形成这种v形通道的一种可能方便但非限制性的方式是通过将v形凹槽模制或机加工到所述盒中。在某些实施方案中包括v形通道(在本文中也称为v 形凹槽或具有基本上三角形截面的通道)的公认优点，其中设备的辊与所述盒接合以使得流体流经所述通道。例如，在一些情况下，v形通道在尺寸上对辊不敏感。换言之，在一些情况下，不存在设备的辊(例如，楔形辊)必须粘附到其上的单一尺寸以便与所述v形通道适当地接合。相反，所述通道的某些常规截面形状，例如半圆形，可能需要辊具有一定的尺寸(例如，半径)，以便与所述通道适当地接合(例如，产生流体密封以引起蠕动泵送过程中的压差)。在一些实施方案中，包括在尺寸上对辊不敏感的通道可以导致硬件部件的制造更简单且更便宜并且增加可配置性/灵活性。
在某些方面，所述盒包括表面层(例如，平坦表面层)。一个示例性方面涉及可能有利的实施方案，其涉及在v形凹槽上方对包含(例如，基本上由其组成)弹性体(例如，硅树脂)的膜(本文也称为表面层)进行分层，以有效产生一半的柔性管。图24描绘了根据某些此类实施方案的示例性盒100，并且在下文中更详细地描述。然后，在一些实施方案中，通过使包含弹性体的表面层变形到通道中以形成夹点(pinch)，然后通过平移(translate)夹点，可以在产生吸力的夹点后缘上产生负压，并且可以在夹点前缘上产生正压，从而沿夹点前缘方向泵送流体。在某些实施方案中，该泵送是通过将盒(包含具有表面层的通道)与包含辊的设备接合(interface)，所述设备被设置为执行辊的运动，包括：使辊与表面层的一部分接合(engage)，以用相关通道的壁和/或底部夹住所述表面层的一部分；使辊沿着相关通道的壁和/或底部以滚动运动平移，以将表面层的夹点平移抵靠壁和/或底部；和/或使辊与表面层的第二部分脱离。在某些实施方案中，曲柄摇杆机构被结合到设备中以执行辊的这种运动。
传统的蠕动泵通常包含已插入设备的管子，所述设备包含旋转盒上的辊，使得当泵起作用时，管子总是与设备的其余部分接合。相比之下，在某些实施方案中，本文的盒中的通道是线性的或包括至少一个线性部分，使得辊与水平表面接合。在某些实施方案中，辊连接到弹簧加压的小的辊臂，使得辊可以跟踪水平表面，同时连续地夹住表面层的一部分。在一些情况下，对设备(例如，设备的辊臂)进行弹簧加压可以帮助调节由设备(例如，辊)施加到表面层和盒的通道的力。
在某些实施方案中，连接到辊的曲柄摇杆机构中的曲柄的每次旋转提供离散的泵送体积。在某些实施方案中，将设备停放在脱离位置是简单的，在该脱离位置，辊与任何盒脱离。在某些实施方案中，向前和向后的泵送运动如本文所述的设备所提供的那样相当对称，使得向前和向后的泵送运动需要相似量的力 (扭矩)(例如，在10％以内)。
在某些实施方案中，对于特定尺寸的设备而言，具有相对高的曲柄半径(例如，大于或等于2mm，任选地包括相关联的连杆)可能是有利的。因此，在某些实施方案中，具有相对高的行程长度(例如，大于或等于10mm)以与相关联的盒接合也可能是有利的。在某些实施方案中，具有相对高的曲柄半径和行程长度确保了在相对于盒移动设备的部件时在所述设备和所述盒之间没有机械干扰。
在某些实施方案中，具有v形凹槽有利地允许与具有楔形边缘的各种尺寸的辊一起使用。相比之下，例如，具有矩形通道而不是v形凹槽导致与矩形通道相关联的辊的宽度需要相对于矩形通道的宽度进行更多控制和更精确，并导致施加到矩形通道的力需要更精确。类似地，具有半圆形截面的通道也可能需要对相关辊的宽度的尺寸进行更多控制和使其更精确。
在某些实施方案中，本文所述的设备可以包括多轴系统(例如，机器人)，所述多轴系统被设置为在多个维度(例如，二维、三维)中移动所述设备的至少一部分。例如，多轴系统可以被设置为将所述设备的至少一部分移动到相关联的盒中的任意泵送通道位置。例如，在某些实施方案中，本文的盒可以功能性地连接到多轴系统。在某些实施方案中，辊可以间接地功能性地连接到多轴系统。在某些实施方案中，包含连接到辊的曲柄摇杆机构的设备部分可以功能性地连接到多轴系统。在某些实施方案中，每个泵送通道可以通过位置定址并且使用多轴系统由本文所述的设备访问。
核酸测序方法
本公开的一些方面进一步涉及对核酸(例如，脱氧核糖核酸或核糖核酸)进行测序。在一些方面，本文所述的组合物、装置、系统和技术可用于鉴定掺入核酸中的一系列核苷酸(例如，通过检测一系列标记的核苷酸的掺入时间过程)。在一些实施方案中，本文所述的组合物、装置、系统和技术可用于鉴定掺入由聚合酶(例如，RNA聚合酶)合成的模板依赖性核酸测序反应产物中的一系列核苷酸。
因此，本文还提供了确定靶核酸的序列的方法。在一些实施方案中，富集靶核酸(例如，使用电泳法(例如亲和SCODA)富集)，然后确定靶核酸的序列。在一些实施方案中，本文提供了确定样品(例如，纯化的样品、细胞裂解物、单细胞、细胞群或组织)中存在的多个靶核酸(例如，至少2、3、4、5、10、 15、20、30、50个或更多个)的序列的方法。在一些实施方案中，如本文所述制备样品(例如，对靶核酸进行裂解、纯化、片段化和/或富集)，然后确定样品中存在的靶核酸或多个靶核酸的序列。在一些实施方案中，靶核酸是富集的靶核酸(例如，使用电泳法(例如亲和SCODA)富集)。
在一些实施方案中，测序方法包括以下步骤：(i)将靶体积中的复合物暴露于一种或多种标记的核苷酸，所述复合物包含样品中存在的靶核酸或多个核酸、至少一种引物和聚合酶；(ii)将一个或多个激发能量或一个或多个激发能量的一系列脉冲引导向靶体积附近；(iii)在顺序掺入包含至少一种引物中的一种中的核酸期间检测来自一种或多种标记的核苷酸的多个发射光子；和(iv)通过确定发射光子的一种或多种特征来鉴定掺入的核苷酸的序列。
在另一方面，本公开提供了通过对多个核酸片段进行测序来对样品中存在的靶核酸或多个靶核酸进行测序的方法，其中靶核酸包含片段。在某些实施方案中，所述方法包括组合多个片段序列以提供亲本核酸(例如亲本靶核酸)的序列或部分序列。在一些实施方案中，组合步骤由计算机硬件和软件执行。本文所述的方法可以允许对一组相关的核酸(例如，样品中存在的两种或更多种核酸)，例如对整个染色体或基因组进行测序。
在一些实施方案中，引物是测序引物。在一些实施方案中，测序引物可以与可能固定或不固定在固体支持物上的核酸(例如，靶核酸)退火。固体支持物可以包括，例如，用于核酸测序的芯片或盒上的样品孔(例如，纳米孔、反应室)。在一些实施方案中，可以将测序引物固定在固体支持物上，并且核酸(例如，靶核酸)的杂交进一步将核酸分子固定在固体支持物上。在一些实施方案中，聚合酶(例如，RNA聚合酶)被固定在固体支持物上，并且可溶性测序引物和核酸与聚合酶接触。在一些实施方案中，在溶液中形成包含聚合酶、核酸 (例如，靶核酸)和引物的复合物，并且所述复合物被固定在固体支持物(例如，通过聚合酶、引物和/或靶核酸的固定化)。在一些实施方案中，没有任何组分被固定在固体支持物上。例如，在一些实施方案中，包含聚合酶、靶核酸和测序引物的复合物原位形成，并且所述复合物未被固定在固体支持物上。
在一些实施方案中，边合成边测序方法可以包括靶核酸分子群(例如，靶核酸的拷贝)的存在和/或靶核酸的扩增(例如，聚合酶链式反应(PCR))步骤以获得靶核酸群。然而，在一些实施方案中，边合成边测序用于确定任何一个正在评估的反应中的单个核酸分子的序列，并且可能不需要核酸扩增来制备靶核酸。在一些实施方案中，根据本公开的方面，多个单分子测序反应并行进行(例如，在单个芯片或盒上)。例如，在一些实施方案中，多个单分子测序反应各自在单个芯片或盒上的单独样品孔(例如，纳米孔、反应室)中进行。
在一些实施方案中，靶核酸分子的测序包括鉴定靶核酸的至少两个(例如，至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少25个、至少 30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少60个、至少70 个、至少80个、至少90个、至少100个或更多个)核苷酸。在一些实施方案中，所述至少两个核苷酸是连续的核苷酸。在一些实施方案中，所述至少两个氨基酸是不连续的核苷酸。
在一些实施方案中，靶核酸的测序包括鉴定靶核酸中少于100％(例如，少于99％、少于95％、少于90％、少于85％、少于80％、少于75％、少于70％、少于65％、少于60％、少于55％、少于50％、少于45％、少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％、少于1％或更少)的所有核苷酸。例如，在一些实施方案中，靶核酸的测序包括鉴定靶核酸中少于100％的一种类型的核苷酸。在一些实施方案中，靶核酸的测序包括鉴定靶核酸中少于100％的每种类型的核苷酸。
蛋白质测序方法
本公开的方面还涉及蛋白质测序和鉴定的方法、多肽测序和鉴定的方法、氨基酸鉴定的方法以及用于执行此类方法的组合物、系统和装置。在一些实施方案中，使用本文中更详细描述的执行样品制备和/或基因组测序的相同仪器执行此类蛋白质测序和鉴定。在一些方面，描述了确定靶蛋白序列的方法。在一些实施方案中，富集靶蛋白(例如，使用电泳法(例如亲和SCODA)富集)，然后确定靶蛋白序列。在一些方面，本文描述了确定样品(例如，纯化的样品、细胞裂解物、单细胞、细胞群或组织)中存在的多种蛋白质(例如，至少2、3、 4、5、10、15、20、30、50种或更多种)的序列的方法。在一些实施方案中，在如本文所述制备样品(例如，对靶蛋白进行裂解、纯化、片段化和/或富集)，然后确定样品中存在的靶蛋白或多种蛋白的序列。在一些实施方案中，靶蛋白是富集的靶蛋白(例如，使用电泳法(例如亲和SCODA)富集)。
在一些实施方案中，本公开提供了通过从混合物中鉴定蛋白质的一种或多种类型的氨基酸来对包含多种蛋白质的样品中的单个蛋白质进行测序和/或鉴定的方法。在一些实施方案中，蛋白质的一种或多种氨基酸(例如末端氨基酸或内部氨基酸)被标记(例如，直接或间接，例如使用结合剂)，并且标记的氨基酸在蛋白质中的相对位置是确定的。在一些实施方案中，使用一系列氨基酸标记和裂解步骤来确定氨基酸在蛋白质中的相对位置。在一些实施方案中，可以在不从蛋白质中去除氨基酸的情况下确定标记的氨基酸在蛋白质中的相对位置，而是通过使标记的蛋白质易位通过孔(例如，蛋白质通道)并检测在易位通过孔的过程中来自标记的氨基酸的信号(例如，
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共振能量转移(FRET)信号)，来确定标记的氨基酸在蛋白质分子中的相对位置。
在一些实施方案中，确定末端氨基酸(例如，N末端或C末端氨基酸)的身份，然后去除末端氨基酸并鉴定被评估的末端的下一个氨基酸；可以重复该过程直到评估蛋白质中的多个连续氨基酸。在一些实施方案中，评估氨基酸的身份包括确定存在的氨基酸的类型。在一些实施方案中，确定氨基酸的类型包括确定实际氨基酸身份(例如，确定氨基酸是天然存在的20种氨基酸中的哪一个，例如，使用对单个末端氨基酸具有特异性的结合剂)。然而，在一些实施方案中，评估末端氨基酸类型的身份可包括确定可存在于蛋白质末端的可能的氨基酸的子集。在一些实施方案中，这可以通过确定氨基酸不是一个或多个特定氨基酸 (即，因此可以是任何其他氨基酸)来实现。在一些实施方案中，这可以通过确定哪一个氨基酸的特定子集(例如，基于大小、电荷、疏水性、结合特性) 可以在蛋白质末端(例如，使用与两个或多个末端氨基酸的特定子集结合的结合剂)。
在一些实施方案中，可以将蛋白质或多肽消化成多个较小的蛋白质或多肽，并且可以从这些较小的蛋白质或多肽中的一种或多种获得序列信息(例如，使用涉及依次评估蛋白质的末端氨基酸并去除该氨基酸以在末端暴露下一个氨基酸的方法)。
在一些实施方案中，蛋白质从其氨基(N)末端开始测序。在一些实施方案中，蛋白质从其羧基(C)末端开始测序。在一些实施方案中，蛋白质的第一末端(例如，N末端或C末端)是固定的，并且如本文所述对其他末端(例如，C末端或N末端)进行测序。
如本文所用，对蛋白质进行测序是指确定蛋白质的序列信息。在一些实施方案中，这可以涉及确定蛋白质的一部分(或全部)的每个连续氨基酸的身份。在一些实施方案中，这可以涉及确定片段(例如，靶蛋白的片段或包含多种蛋白质的样品的片段)的同一性。在一些实施方案中，这可以涉及评估蛋白质内氨基酸子集的同一性(例如，并确定一种或多种氨基酸类型的相对位置而无需确定蛋白质中每个氨基酸的同一性)。在一些实施方案中，可以从蛋白质中获得氨基酸含量信息，而无需直接确定蛋白质中不同类型氨基酸的相对位置。单独的氨基酸含量可用于推断存在的蛋白质的同一性(例如，通过将氨基酸含量与蛋白质信息数据库进行比较并确定哪些蛋白质具有相同的氨基酸含量)。
在一些实施方案中，可以分析从靶蛋白或包含多种蛋白质的样品(例如，通过酶促和/或化学裂解)获得的多个蛋白质片段的序列信息，以重建或推断所述靶蛋白或所述样品中存在的多种蛋白质的序列。因此，在一些实施方案中，通过检测一种或多种标记的亲和试剂的发光来鉴定一种或多种类型的氨基酸，所述标记的亲和试剂选择性地结合一种或多种类型的氨基酸。在一些实施方案中，所述一种或多种类型的氨基酸通过检测标记的蛋白质的发光来鉴定。
在一些实施方案中，本公开提供了用于通过鉴定随时间存在于蛋白质末端的一系列氨基酸(例如，通过末端氨基酸的迭代检测和裂解)来对蛋白质进行测序的组合物、装置和方法。在其他实施方案中，本公开提供了用于通过鉴定蛋白质的标记氨基含量并与参考序列数据库比较来对蛋白质进行测序的组合物、装置和方法。
在一些实施方案中，本公开提供了用于通过对蛋白质的多个片段进行测序来对蛋白质进行测序的组合物、装置和方法。在一些实施方案中，对蛋白质进行测序包括组合多个蛋白质片段的序列信息以鉴定和/或确定蛋白质的序列。在一些实施方案中，组合序列信息可以由计算机硬件和软件来执行。本文所述的方法可以允许对一组相关蛋白质，例如对生物体的整个蛋白质组进行测序。在一些实施方案中，根据本公开的方面，多个单分子测序反应并行进行(例如，在单个芯片或盒上)。例如，在一些实施方案中，多个单分子测序反应各自在单个芯片或盒上的单独样品孔中进行。
在一些实施方案中，本文提供的方法可用于对包含多种蛋白质的样品中的单个蛋白质进行测序和鉴定。在一些实施方案中，本公开提供了在包含多种蛋白质的样品中独特地鉴定单个蛋白质的方法。在一些实施方案中，通过确定蛋白质的部分氨基酸序列来检测混合样品中的单个蛋白质。在一些实施方案中，蛋白质的部分氨基酸序列在大约5-50、10-50、25-50、25-100或50-100个氨基酸的连续区段内。
不希望囿于任何特定理论的，预计大多数人类蛋白质可以参考蛋白质组数据库使用不完整的序列信息来鉴定。例如，人类蛋白质组的简单建模表明，大约 98％的蛋白质可以通过检测6到40个氨基酸的区段中的仅四种类型的氨基酸来独特地鉴定(参见例如Swaminathan等人，PLoS Comput Biol.2015, 11(2):e1004080；和Yao等人，Phys.Biol.2015,12(5):055003)。因此，包含多种蛋白质的样品可以被片段化(例如，化学降解、酶促降解)成大约6到40个氨基酸的短蛋白质片段，并且该基于蛋白质的文库的测序将揭示原始样品中存在的每种蛋白质的同一性和丰度。用于通过确定部分序列信息来选择性标记氨基酸和鉴定多肽的组合物和方法在2015年9月15日提交的名称为“SINGLEMOLECULE PEPTIDE SEQUENCING”的美国专利申请号15/510,962中进行了详细描述，其全部内容通过引用的方式并入本文。
在一些方面，根据本公开的测序可包括将蛋白质(例如，靶蛋白)固定在基质(例如，固体支持物，例如芯片或盒，例如在本文所述的测序装置或模块中) 的表面上。在一些实施方案中，蛋白质可以被固定在基质上的样品孔的表面上 (例如样品孔的底部表面上)。在一些实施方案中，蛋白质的N末端氨基酸是固定化的(例如连接至表面)。在一些实施方案中，蛋白质的C末端氨基酸是固定化的(例如，连接至表面)。在一些实施方案中，一种或多种非末端氨基酸是固定化的(例如，连接至表面)。固定化的氨基酸可以使用任何合适的共价键或非共价键连接，例如如本公开中所述。在一些实施方案中，多种蛋白质连接至多个样品孔(例如，一种蛋白质连接至每个样品孔的表面，例如底部表面)，例如在基质上的样品孔阵列中。
在一些实施方案中，确定末端氨基酸(例如，N末端或C末端氨基酸)的身份，然后去除末端氨基酸，并且确定在末端的下一个氨基酸的身份。可以重复该过程直到确定蛋白质中的多个连续氨基酸。在一些实施方案中，确定氨基酸的身份包括确定存在的氨基酸的类型。在一些实施方案中，确定氨基酸的类型包括确定实际氨基酸身份，例如，通过确定末端氨基酸是天然存在的20种氨基酸中的哪一个(例如，使用对单个末端氨基酸具有特异性的结合剂)。在一些实施方案中，氨基酸类型选自丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、硒代半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。在一些实施方案中，确定末端氨基酸类型的身份可以包括确定可存在于蛋白质末端的可能的氨基酸的子集。在一些实施方案中，这可以通过确定氨基酸不是一个或多个特定氨基酸(因此可以是任何其他氨基酸)来实现。在一些实施方案中，这可以通过确定氨基酸的特定子集中的哪一个(例如，基于大小、电荷、疏水性、翻译后修饰、结合特性)可以在蛋白质末端(例如，使用与两个或更多个末端氨基酸的特定子集结合的结合剂)来完成。
在一些实施方案中，评估末端氨基酸类型的同一性包括确定氨基酸包含翻译后修饰。翻译后修饰的非限制性实例包括乙酰化、ADP-核糖基化、半胱天冬酶连接、瓜氨酸化、甲酰化、N连接糖基化、O连接糖基化、羟基化、甲基化、肉豆蔻酰化、类泛素化、硝化、氧化、棕榈酰化、磷酸化、异戊二烯化、S亚硝基化、硫酸化、苏素化和泛素化。
在一些实施方案中，一种或多种蛋白质可以被消化成多种较小的蛋白质，并且可以从这些较小蛋白质中的一种或多种获得序列信息(例如，使用包括依次评估蛋白质的末端氨基酸并去除该氨基酸以在末端暴露下一个氨基酸的方法)。
在一些实施方案中，蛋白质分子的测序包括鉴定蛋白质分子中的至少两个 (例如，至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少 15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少25 个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个或更多个)氨基酸。在一些实施方案中，所述至少两个氨基酸是连续氨基酸。在一些实施方案中，所述至少两个氨基酸是非连续氨基酸。
在一些实施方案中，蛋白质分子的测序包括鉴定蛋白质分子中少于100％(例如，少于99％、少于95％、少于90％、少于85％、少于80％、少于75％、少于 70％、少于65％、少于60％、少于55％、少于50％、少于45％、少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％、少于1％或更少)的所有氨基酸。例如，在一些实施方案中，蛋白质分子的测序包括鉴定蛋白质分子中少于100％的一种类型的氨基酸(例如鉴定蛋白质分子中一种类型的所有氨基酸的一部分)。在一些实施方案中，蛋白质分子的测序包括鉴定蛋白质分子中少于100％的每种类型的氨基酸。
在一些实施方案中，蛋白质分子的测序包括鉴定蛋白质中至少1个、至少5 个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少55个、至少60个、至少65个、至少70个、至少75个、至少80个、至少85个、至少90个、至少95个、至少 100个或更多类型的氨基酸。
测序装置或模块
在一些方面，可以使用允许单分子分析的系统进行根据本公开的核酸或蛋白质的测序。所述系统可以包括测序装置或模块以及被设置为与测序装置或模块接合的仪器。测序装置或模块可以包括像素(pixel)阵列，其中各个像素包括样品孔和至少一个光电探测器。测序装置或模块的样品孔可以在测序装置或模块的表面上形成或穿过测序装置或模块的表面形成，并且被设置为接收放置在测序装置或模块的表面上的样品。在一些实施方案中，样品孔是可插入装置中的盒 (例如，一次性或单次使用的盒)的部件。总的来说，样品孔可以被认为是样品孔的阵列。多个样品孔可以具有合适的尺寸和形状，使得样品孔的至少一部分接收单个靶分子或包含多个分子(例如，靶核酸或靶蛋白)的样品。在一些实施方案中，样品孔内的分子数量可以分布在测序装置或模块的样品孔中，使得一些样品孔含有一个分子(例如，靶核酸或靶蛋白)而其他样品含有零个、两个或多个分子。
在一些实施方案中，放置测序装置或模块以从样品制备装置或模块接收靶分子或包含多个分子(例如，靶核酸或靶蛋白)的样品。在一些实施方案中，测序装置或模块直接连接到(例如，物理连接到)或间接连接到样品制备装置或模块。
从测序装置或模块外部的一个或多个光源向测序装置或模块提供激发光。测序装置或模块的光学部件可以接收来自光源的激发光并将光引导到测序装置或模块的样品孔阵列并照亮样品孔内的照明区域。在一些实施方案中，样品孔可以具有允许靶分子或包含多个分子的样品保持在样品孔表面附近的构造，这可以容易地将激发光递送到样品孔和检测来自靶分子或包含多个分子的样品的发射光。位于照明区域内的靶分子或包含多个分子的样品可以响应于被激发光照亮而发射光。例如，可以用荧光标志物标记核酸或蛋白质(或多个核酸或蛋白质)，所述荧光标志物响应于通过激发光的照射实现激发态而发射光。由靶分子或包含多个分子的样品发射的发射光然后可以由对应于样品孔的像素内的一个或多个光检测器检测，其中样品被分析。根据一些实施方案，当在数量范围可以在大约10,000像素到1,000,000像素之间的样品孔阵列上执行时，可以并行分析多个样品孔。
测序装置或模块可以包括用于接收激发光并将激发光引导到样品孔阵列之间的光学系统。光学系统可以包括一个或多个被设置为将激发光耦合到测序装置或模块并将激发光引导到其他光学部件的光栅耦合器。光学系统可以包括将来自光栅耦合器的激发光引导到样品孔阵列的光学部件。这样的光学部件可以包括分光器、光学组合器和波导。在一些实施方案中，一个或多个分光器可以耦合来自光栅耦合器的激发光并将激发光递送到至少一个波导。根据一些实施方案，分光器可以具有允许激发光的传递基本上均匀通过所有波导的构造，使得每个波导接收基本相似量的激发光。这样的实施方案可以通过提高测序装置或模块的样品孔接收的激发光的均匀性来提高测序装置或模块的性能。例如，用于将激发光耦合到样品孔和/或将发射光引导到光检测器以包括在测序装置或模块中的合适部件的实例在2015年8月7日提交的标题为“INTEGRATED DEVICE FOR PROBING,DETECTING ANDANALYZING MOLECULES”的美国专利申请号14/821,688以及2014年11月17日提交的标题为“INTEGRATED DEVICE WITH EXTERNAL LIGHT SOURCE FOR PROBING,DETECTING, ANDANALYZING MOLECULES”的美国专利申请号14/543,865中进行了描述，两者的全部内容均通过引用的方式并入本文。可以在测序装置或模块中实施的合适的光栅耦合器和波导的实例在2017年12月15日提交的标题为“OPTICAL COUPLER AND WAVEGUIDE SYSTEM”的美国专利申请号15/844,403中进行了描述，其全部内容通过引用的方式并入本文。
另外的光激性结构可以定位在样品孔和光检测器之间，并且被设置为减少或防止激发光到达光检测器，否则这可能会导致检测发射光时的信号噪声。在一些实施方案中，可以充当测序装置或模块的电路的金属层也可以充当空间滤光器。合适的光激性结构的实例可以包括光谱滤光器、偏振滤光器和空间滤光器，并且在2018年7月23日提交的标题为“OPTICAL REJECTION PHOTONIC STRUCTURES”的美国专利申请号16/042,968中进行了描述，其全部内容通过引用的方式并入本文。
位于测序装置或模块之外的部件可用于将激发源定位和对准到测序装置或模块。这样的部件可以包括光学部件，包括透镜、镜子、棱镜、窗口、孔径、衰减器和/或光纤。仪器中可以包括另外的机械部件，以允许控制一个或多个对准部件。这样的机械部件可以包括致动器、步进电机和/或旋钮。合适的激发源和对准机构的实例在2016年5月20日提交的标题为“PULSED LASER AND SYSTEM”的美国专利申请号15/161,088中进行了描述，其全部内容通过引用的方式并入本文。光束控制模块的另一个实例在2017年12月14日提交的标题为“COMPACT BEAM SHAPING AND STEERING ASSEMBLY”的美国专利申请号 15/842,720中进行了描述，其全文内容通过引用的方式并入本文。合适的激发源的另外的实例在2015年8月7日提交的标题为“INTEGRATED DEVICE FOR PROBING,DETECTING AND ANALYZINGMOLECULES”的美国专利申请号 14/821,688中进行了描述，其全部内容通过引用的方式并入本文。
与测序装置或模块的单个像素一起定位的光检测器可以被设置和定位以检测来自像素的相应样品孔的发射光。合适的光检测器的实例在2015年8月7日提交的标题为“INTEGRATED DEVICE FOR TEMPORAL BINNING OF RECEIVED PHOTONS”的美国专利申请号14/821,656中进行了描述，其全部内容通过引用的方式并入本文。在一些实施方案中，样品孔及其相应的光检测器可以沿着公共轴线对齐。以这种方式，光检测器可以与像素内的样品孔重叠。
检测到的发射光的特性可以提供用于鉴定与发射光相关的标志物的指示。这样的特性可以包括任何合适类型的特性，包括由光检测器检测到的光子的到达时间、由光检测器随时间累积的光子量和/或跨两个或更多个光检测器的光子分布。在一些实施方案中，光检测器可以具有允许检测与样品的发射光(例如，发光寿命)相关的一个或多个时序特性的构造。在激发光脉冲传播通过测序装置或模块之后，光检测器可以检测光子到达时间的分布，并且到达时间的分布可以提供样品发射光的时序特性的指示(例如，发光寿命的代表)。在一些实施方案中，一个或多个光检测器提供由标志物发射的发射光的概率(例如，发光强度)的指示。在一些实施方案中，多个光检测器的尺寸和布置可被设置为捕获发射光的空间分布。然后来自一个或多个光检测器的输出信号可用于将标志物与多个标志物区分开来，其中多个标志物可用于鉴定样品内的样品。在一些实施方案中，样品可以被多种激发能量激发，并且样品响应于多种激发能量而发射的发射光和/或发射光的时序特性可以将标志物与多个标志物区分开来。
在操作中，样品孔内的样品的并行分析是通过使用激发光激发孔内的一些或所有样品并用光检测器检测来自样品发射的信号来进行的。来自样品的发射光可以由相应的光检测器检测并转换为至少一个电信号。电信号可以沿着测序装置或模块的电路中的导线传输，所述导线可以连接到与测序装置或模块接合的仪器。随后可以处理和/或分析电信号。电信号的处理和/或分析可以在位于仪器上或仪器外的合适的计算设备上进行。
所述仪器可以包括用于控制仪器和/或测序装置或模块的操作的用户界面。用户界面可以被设置为允许用户将信息输入到仪器中，例如用于控制仪器功能的命令和/或设置。在一些实施方案中，用户界面可以包括用于语音命令的按钮、开关、拨号盘和/或麦克风。用户界面可以允许用户接收关于仪器和/或测序装置或模块的性能的反馈，例如同轴度(proper alignment)和/或通过来自测序装置或模块上的光检测器读出信号获得的信息。在一些实施方案中，用户界面可以使用扬声器提供听觉反馈来提供反馈。在一些实施方案中，用户界面可以包括用于向用户提供视觉反馈的指示灯和/或显示屏。
在一些实施方案中，本文所述的仪器或装置可以包括被设置为与计算设备连接的计算机接口。计算机接口可以是USB接口、火线接口或任何其他合适的计算机接口。计算设备可以是任何通用计算机，例如膝上型计算机或台式计算机。在一些实施方案中，计算设备可以是经由合适的计算机接口在无线网络上可访问的服务器(例如，基于云的服务器)。计算机接口可以方便仪器和计算设备之间的信息通信。用于控制和/或配置仪器的输入信息可以被提供给计算设备并通过计算机接口传输给仪器。由仪器生成的输出信息可以通过计算机接口由计算设备接收。输出信息可以包括关于仪器性能、测序装置或模块的性能和/或从光检测器的读出信号产生的数据的反馈。
在一些实施方案中，所述仪器可以包括被设置为分析从测序装置或模块的一个或多个光检测器接收的数据和/或将控制信号传输到激发源的处理装置。在一些实施方案中，处理装置可以包括通用处理器和/或专门适配的处理器(例如，中央处理单元(CPU)，例如一个或多个微处理器或微控制器内核、现场可编程门阵列(FPGA)、专用集成电路(ASIC)、定制集成电路、数字信号处理器(DSP)或其组合)。在一些实施方案中，来自一个或多个光检测器的数据的处理可以由仪器的处理装置和外部计算设备两者来执行。在其他实施方案中，可以省略外部计算设备，并且可以仅由测序装置或模块的处理装置执行来自一个或多个光检测器的数据处理。
根据一些实施方案，被设置为基于发光发射特性来分析靶分子或包含多个分子的样品的仪器可以检测不同发光分子之间的发光寿命和/或强度的差异，和/或相同发光分子在不同环境中的寿命和/或强度之间的差异。发明人已经认识到并理解，发光发射寿命的差异可用于辨别不同发光分子的存在与否和/或辨别发光分子所经受的不同环境或条件。在一些情况下，根据寿命(而不是例如发射波长)辨别发光分子可以简化系统的方面。作为实例，当基于寿命辨别发光分子时，波长区分光学器件(例如波长过滤器、每个波长的专用检测器、不同波长的专用脉冲光源和/或衍射光学器件)可以在数量上减少或被消除。在一些情况下，以单一特征波长操作的单一脉冲光源可用于激发在光谱的相同波长区域内发射但具有可测量的不同寿命的不同发光分子。使用单个脉冲光源而不是在不同波长下工作的多个光源来激发和辨别在相同波长范围内发射的不同发光分子的分析系统操作和维护的复杂度可能更低，可能更紧凑，并且可能以更低的成本制造。
尽管基于发光寿命分析的分析系统可能具有某些好处，但通过允许另外的检测技术可以增加由分析系统获得的信息量和/或检测精度。例如，系统的一些实施方案可以另外被设置成基于发光波长和/或发光强度来辨别样品的一种或多种特性。在一些实施方式中，发光强度可以另外地或替代地用于区分不同的发光标记。例如，一些发光标记可以以显著不同的强度发射或在它们的激发概率上有显著差异(例如，至少约35％的差异)，即使它们的衰减率可能相似。通过将分箱信号参考测量的激发光，可以根据强度水平区分不同的发光标记。
根据一些实施方案，不同的发光寿命可以用被设置为在发光标记激发之后对发光发射事件进行时间分箱(time-bin)的光检测器来区分。时间分箱可以发生在光检测器的单个电荷累积周期期间。电荷累积周期是读出事件之间的间隔，在该期间光生载流子累积在时间分箱的光检测器的仓中。时间分箱的光检测器的实例在2015年8月7日提交的标题为“INTEGRATED DEVICE FOR TEMPORAL BINNING OF RECEIVED PHOTONS”的美国专利申请号14/821,656中进行了描述，其全部内容通过引用的方式并入本文。在一些实施方案中，时间分箱的光检测器可以在光子吸收/载流子产生区域中产生电荷载流子并且将电荷载流子直接转移到电荷载流子存储仓中的电荷载流子存储仓。在这样的实施方案中，时间分箱的光检测器可以不包括载流子行进/捕获区域。这样的时间分箱的光检测器可以被称为“直接分箱像素”。包括直接分箱像素的时间分箱的光检测器的实例在2017年12月22日提交的标题为“INTEGRATED PHOTODETECTOR WITH DIRECT BINNING PIXEL”的美国专利申请号15/852,571中进行了描述，其全部内容通过引用的方式并入本文。
在一些实施方案中，相同类型的不同数量的荧光团可以与靶分子(例如，靶核酸或靶蛋白)或样品中存在的多个分子(例如，多个核酸或多个蛋白)的不同组分连接，从而可以基于发光强度来鉴定每个单独分子。例如，两个荧光团可以连接到第一标记的分子，四个或更多个荧光团可以连接到第二标记的分子。由于不同数量的荧光团，可能存在与不同分子相关的不同激发和荧光团发射概率。例如，在信号累积间隔期间，第二标记的分子可能有更多的发射事件，因此仓的表观强度明显高于第一标记的分子。
发明人已经认识到并理解，基于荧光团衰减率和/或荧光团强度区分核酸或蛋白质可以简化光学激发和检测系统。例如，可以用单波长源(例如，产生一个特征波长而不是多个源的源或以多个不同特征波长操作的源)来执行光激发。此外，检测系统中可能不需要波长识别光学器件和滤光器。此外，每个样品孔可以使用单个光检测器来检测来自不同荧光团的发射。短语“特征波长”或“波长”用于指代有限辐射带宽内的中心或主要波长。例如，有限辐射带宽可以包括脉冲光源输出的20nm带宽内的中心或峰值波长。在一些情况下，“特征波长”或“波长”可用于指代源辐射输出的总带宽内的峰值波长。
组合的样品制备和测序装置
在一些实施方案中，本文的装置包含样品制备模块和测序模块。在一些实施方案中，包含样品制备模块和测序模块的装置包含嵌入样品制备盒中的测序芯片或盒，使得两个盒包含单个不可分离的消耗品。在一些实施方案中，测序芯片或盒需要消耗性支持电子设备(例如，具有引线键合、电接触的PCB基质)。消耗性支持电子设备可以与测序芯片或盒直接物理接触。在一些实施方案中，测序芯片或盒需要用于蠕动泵、温度控制和/或电泳接触的接口。这些接口可以允许对许多电接触和激光对准进行精确的几何配准。在一些实施方案中，芯片或盒的不同部分可以包括不同的温度、物理力、不同电压和电流的电接口、振动和/或竞争对准要求。在一些实施方案中，与样品制备或测序模块相关联的不同仪器子系统必须非常接近以便共享资源。在一些实施方案中，包含样品制备模块和测序模块的装置是免持的(即，可以在不使用手的情况下使用)。
在一些实施方案中，包含样品制备模块和测序模块的装置产生(例如，富集或纯化)靶核酸，其具有比使用对照方法(例如，Sage BluePippin方法、手动方法(例如，基于珠粒的手动尺寸选择方法))产生的平均读长长的用于下游测序应用的平均读长。在一些实施方案中，样品制备装置产生具有用于测序的平均读长的靶核酸，其包括至少700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、 1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、 2700、2800、2900或3000个核苷酸长度。在一些实施方案中，样品制备装置产生具有用于测序的平均读长的靶核酸，其包括700-3000、1000-3000、1000-2500、 1000-2400、1000-2300、1000-2200、1000-2100、1000-2000、1000-1900、1000-1800、 1000-1700、1000-1600、1000-1500、1000-1400、1000-1300、1000-1200、1500-3000、 1500-2500、1500-2000或2000-3000个核苷酸长度。
在一些实施方案中，包含样品制备模块和测序模块的装置允许比对照或传统方法(例如，Sage BluePippin方法后测序)缩短样品制备开始与检测样品中包含的靶分子之间的时间。在一些实施方案中，包含样品制备模块和测序模块的装置能够在比对照或传统方法(例如，Sage BluePippin方法后测序)更短的时间内(例如，2倍、3倍、4倍、5倍或10倍更短的时间)使用测序检测靶分子。
在一些实施方案中，包含样品制备模块和测序模块的装置能够以低于对照或传统方法(例如，Sage BluePippin方法后测序)的样品输入量检测靶分子。在一些实施方案中，本公开的装置需要低至0.1μg、0.2μg、0.3μg、0.4μg、0.5μg、 0.6μg、0.7μg、0.8μg、0.9μg或1μg的样品(例如，生物样品)。在一些实施方案中，本公开的装置需要低至10μL、20μL、30μL、40μL、50μL、60μL、 70μL、80μL、90μL、100μL、110μL、130μL、150μL、175μL、200μL、225 μL或250μL的样品(例如，生物样品，如血液)。
装置或模块
在一些实施方案中，装置或模块(例如，样品制备装置；测序装置；组合的样品制备和测序装置)被设置为在一些情况下以明确的流体流动分辨率和明确的流速精确地输送小体积的流体。在一些实施方案中，装置或模块被设置为以大于或等于0.1μL/s、大于或等于0.5μL/s、大于或等于1μL/s、大于或等于2μL/s、大于或等于5μL/s或更高的流速输送流体。在一些实施方案中，本文的装置或模块被设置为以小于或等于100μL/s、小于或等于75μL/s、小于或等于50μL/s、小于或等于30μL/s、小于或等于20μL/s、小于或等于15μL/s或更低的流速输送流体。这些范围的组合是可能的。例如，在一些实施方案中，本文的装置或模块被设置为以大于或等于0.1μL/s且小于或等于100μL/s、或大于或等于5 μL/s且小于或等于15μL/s的流速输送流体。例如，在某些实施方案中，本文的系统、装置和模块具有数十微升或数百微升数量级的流体流动分辨率。流体流动分辨率的进一步描述在本文别处描述。在某些实施方案中，系统、装置和模块被设置为输送小体积的流体通过盒的至少一部分。
一些方面涉及包含辊(例如，与曲柄摇杆机构结合)的泵和装置的构造。其他方面涉及包含具有截面形状(例如，基本上三角形的形状)、阀门、深部和/ 或表面层(例如，平坦的弹性体膜)的通道(例如，微通道)的盒。某些方面涉及蠕动泵的某些部件(例如，辊)与泵的其他部件(例如，泵送通道)的分离。在一些情况下，设备的某些元件(例如，辊的边缘)被设置为与盒的元件 (例如，表面层和通道的某些形状)以实现多种优点中的任意一种的方式(例如，通过接合和脱离)相互作用。在一些非限制性实施方案中，本文所述的设备、盒和泵的某些发明特征和构造有助于提高流体泵送过程的自动化(例如，由于使用可平移辊和包含多种不同可以由辊索引的流体通道的单独盒)。在一些情况下，本文所述的特征有助于使用相对较少数量的硬件部件(例如，由于使用具有多个不同通道的单独盒，每个通道都可以被辊进入)处理具有相对较多数量的构造的相对较多数量的不同流体(例如，用多重样品进行多重化)。作为一个实例，在一些情况下，本文所述的特征允许多于一个设备与盒配对以同时泵送多于一个通道或在一个通道中使用两个泵用于其他功能。在一些情况下，这些特征有助于减少所需的流体体积和/或降低辊/通道相互作用的严格公差(例如，由于通道和/或辊边缘的本发明截面形状，和/或由于使用了本发明的阀门和 /或通道的深部)。在一些情况下，本文所述的特征导致硬件部件所需的冲洗减少 (例如，由于设备和蠕动泵的盒的分离)。在一些实施方案中，本文所述的设备、盒和泵的方面可用于制备样品。例如，一些这样的方面可以结合到检测模块上游的样品制备模块中(例如，用于生物衍生样品的分析/测序/鉴定)。
在另一方面，提供了蠕动泵。在一些实施方案中，蠕动泵包含辊和盒，其中所述盒包含基层，所述基层具有包含通道的表面，其中至少一些通道的至少一部分(1)具有基本上三角形的截面，其在通道的底部具有单个顶点并且在基层的表面具有两个其他顶点，以及(2)具有包含弹性体的表面层，其被设置为基本上密封通道的表面开口。蠕动泵的实施方案在本文别处进一步描述。
在一些实施方案中，本文所述的系统(例如，泵、装置)经历泵循环。在一些实施方案中，泵循环对应于所述系统的曲柄的一个旋转。在一些实施方案中，每个泵循环可输送大于或等于1μL、大于或等于2μL、大于或等于4μL、小于或等于10μL、小于或等于8μL和/或小于或等于6μL的液体。上述范围的组合也是可能的(例如，介于或等于1μL至10μL)。其他范围的流体体积也是可能的。
在一些实施例中，本文所述的系统具有特定的行程长度。在某些实施方案中，假设每个泵循环可以传输约介于或等于1μL至10μL的流体，和/或假设通道尺寸可以优选为约1mm宽和约1mm深(例如，取决于可以加工或模制什么以减少通道体积并保持合理的公差)，行程长度可以大于或等于10mm、大于或等于12mm、大于或等于14mm、小于或等于20mm、小于或等于18mm和/或小于或等于16mm。上述范围的组合也是可能的(例如，介于或等于10mm至20mm)。其他范围也是可能的。如本文所用，“行程长度”是指辊在与基质接合时行进的距离。在某些实施方案中，基质包含盒。
在另一方面，提供了盒。在一些实施方案中，盒包含具有包含通道的表面的基层，并且至少一些通道的至少一部分(1)具有基本上三角形的截面，其在通道的底部具有单个顶点并且在基层的表面具有两个其他顶点，并且(2)具有包含弹性体的表面层，其被设置为基本上密封通道的表面开口。盒的实施方案在本文别处进一步描述。
在一些实施方案中，盒包括基层。在一些实施方案中，基层具有包含一个或多个通道的表面。例如，图24是根据一些实施方案的沿着通道102的宽度的盒 100的截面图的示意图。所描绘的盒100包括具有表面111的基层104，该表面 111包含通道102。在某些实施方案中，至少一些通道是微通道。例如，在一些实施方案中，至少一些通道102是微通道。在某些实施方案中，所有通道都是微通道。例如，再次参考图24，在某些实施方案中，所有通道102都是微通道。
如本文所用，术语“通道”对于本领域普通技术人员将是已知的并且可以指代被设置成容纳和/或输送流体的结构。通道一般包括：壁；底部(例如，连接到所述壁和/或由所述壁形成的底部)；以及可以在通道的一个或多个部分处打开、覆盖和/或密封的表面开口。
如本文所用，术语“微通道”是指包括至少一个尺寸小于或等于1000微米的维度的通道。例如，微通道可以包括至少一个尺寸小于或等于1000微米(例如，小于或等于100微米、小于或等于10微米、小于或等于5微米)的维度(例如宽度、高度)。在一些实施方案中，微通道包括至少一个大于或等于1微米(例如，大于或等于2微米、大于或等于10微米)的维度。上述范围的组合也是可能的(例如，大于或等于1微米且小于或等于1000微米、大于或等于10微米且小于或等于100微米)。其他范围也是可能的。在一些实施方案中，微通道具有小于或等于1000微米的水力直径。如本文所用，术语“水力直径”(DH)对于本领域普通技术人员来说是已知的并且可以确定为：DH＝4A/P，其中A是流体流过通道的截面积，P是截面的润湿周长(与流体接触的通道的截面的周长)。
在一些实施方案中，至少一些通道的至少一部分具有基本上三角形的截面。在一些实施方案中，至少一些通道的至少一部分具有基本上三角形的截面，该截面在通道的底部具有单个顶点并且在基层的表面具有两个其他顶点。再次参考图24，在一些实施方案中，至少一些通道102的至少一部分具有基本上三角形的截面，该截面在通道的底部具有单个顶点并且在基层的表面具有两个其他顶点。
如本文所使用的，术语“三角形”用于指代其中可以内接或外接三角形以近似或等于实际形状的形状，并且不仅仅限于三角形。例如，三角形截面可以在一个或多个部分包括非零曲率。
三角形截面可以包括楔形。如本文所用，术语“楔形”将为本领域普通技术人员所知并且指具有厚端并且向薄端逐渐变细的形状。在一些实施方案中，楔形具有从厚端到薄端的对称轴。例如，楔形可以具有厚端(例如，通道的表面开口)并且向薄端(例如，通道的底部)逐渐变细，并且可以具有从厚端到薄端的对称轴。
此外，在某些实施方案中，基本上三角形的截面(即，“v形凹槽”)可以具有多种纵横比。如本文所用，用于v形凹槽的术语“纵横比”是指高宽比。例如，在一些实施方案中，v形凹槽可以具有小于或等于2、小于或等于1、或小于或等于0.5、和/或大于或等于0.1、大于或等于0.2、或大于或等于0.3的纵横比。上述范围的组合也是可能的(例如，介于或等于0.1至2，介于或等于0.2 至1)。其他范围也是可能的。
在一些实施方案中，至少一些通道的至少一部分具有包括基本上三角形的部分和第二部分的截面，该第二部分开口到基本上三角形的部分中并且相对于通道的表面在基本上三角形的部分下方延伸。在一些实施方案中，第二部分的直径(例如，平均直径)明显小于基本上三角形的部分的平均直径。再次参考图 24，在一些实施方案中，至少一些通道102的至少一部分具有包括基本上三角形的部分101和第二部分103的截面，该第二部分103开口到基本上三角形的部分101中并且相对于通道的表面105在基本上三角形的部分101下方延伸，其中第二部分103的直径107明显小于基本上三角形的部分101的平均直径109。在一些这样的情况下，通道的第二部分的直径明显小于通道的基本上三角形的部分的平均直径，可以导致所述基本上三角形的部分可接近设备的辊和表面层的变形部分，但所述第二部分不可接近辊和表面层的变形部分。例如，再次参考图24，根据某些实施方案，通道102的基本上三角形的部分101可被辊(未图示)和表面层106的变形部分接近，而第二部分103不可被辊和表面层106 的变形部分接近。在一些这样的情况下，不能在具有第二部分103的通道102 的部分中实现与表面层106的密封，因为流体仍然可以在第二部分103中自由移动，即使当表面层106被辊变形使得它填充基本上三角形的部分101而不是第二部分103时。在一些实施方案中，沿着通道长度的部分可以具有基本上三角形的部分和第二部分(“深部”)，而沿着通道长度的不同部分仅具有基本上三角形的部分。在一些这样的实施方案中，当设备(例如，辊)与具有基本三角形的部分和第二部分(深部)的部分接合时，泵作用没有开始，因为没有实现与表面层的密封。然而，当设备沿着通道的长度方向接合时，当设备使通道的仅具有基本上三角形的部分的部分处的表面层变形时，泵作用开始，因为在该部分缺少第二部分(深部)允许产生密封(并因此产生压力差)。因此，在一些情况下，沿着盒的通道长度存在和不存在深部可以允许控制通道的哪些部分在与设备接合时能够受到泵作用。
包含这样的“深部”作为盒的至少一些通道的第二部分可以有助于多种潜在益处中的任意一种。例如，在一些情况下，这样的深部(例如，第二部分103) 可能有助于蠕动泵送过程中泵体积的减少。在一些此类情况下，泵体积可以减少两倍或更多，以获得更高的体积分辨率。在一些情况下，这样的深部还可以为泵体积提供明确的起点，该起点不是由辊在通道上的着陆位置确定的。例如，在一些情况下，通道的具有基本上三角形部分和第二部分(深部)的部分与通道的仅具有基本上三角形部分的部分之间的界面可以用作明确的泵体积的起点，因为只有占据后一个通道部分的体积的流体才能被泵送。在一些情况下，辊落在通道上的位置可能会出现一些错误，这取决于多种因素中的任意一个，例如盒对准。在一些情况下，包含深部可以减少或消除与此类误差相关的泵体积的变化。
如本文所用，通道的基本上三角形部分的平均直径可以被测量为在z轴上从基本上三角形部分的顶点到通道表面的平均值。
实施例
参考以下实施例进一步描述本发明的实施方案，这些实施例在本质上是说明性的而不是限制性的。尽管参考DNA寡核苷酸和甲基化的DNA寡核苷酸的分离描述了以下实施例，但是本发明的实施方案也可用于纯化和分离对固定在介质中的试剂具有亲和力的其他分子，包括其他差异性修饰的分子。此类分子的实例包括多肽或蛋白质、差异性修饰的多肽或蛋白质、差异性修饰的核酸(包括差异甲基化的DNA或RNA)等。在本发明的实施方案中，可以作为探针固定的试剂的实例包括DNA、RNA、抗体、多肽、蛋白质、核酸适体和对目的分子具有亲和力的其他试剂。
实施例1.0-具有单碱基错配的亲和SCODA
为了验证等式[23]中表达的预测的温度依赖性迁移率，进行了实验以测量靶 DNA速度对温度变化的响应。最初的实验是用100个核苷酸寡核苷酸作为靶 DNA进行的。寡核苷酸是单链的，因此不需要变性即可与亲和凝胶相互作用。寡核苷酸也足够短，以至于它们具有可忽略的场依赖性迁移率。较长的核酸分子，例如长度大于约1000个核苷酸，可能难以基于序列分离，因为在使用由电场提供的焦耳热来提供温度梯度的实施方案中，较长的分子具有以非序列特异性方式从电泳的SCODA效应聚焦的趋势。
为了进行这些测量，将含有0.2M NaCl和10μM acrydite探针(SEQ ID NO.1) 的1XTB(89mM tris，89mM硼酸)中的聚丙烯酰胺凝胶(4％T，2％C)浇注在一个仅包含两个进入端口的一维凝胶盒中。通过添加2μl 10％w/v APS和 0.2μl TEMED/ml凝胶开始聚合。
迁移率测量是在两种不同的100个核苷酸寡核苷酸上进行的，这些核苷酸寡核苷酸的区别在于包含与探针完美匹配(PM)(SEQ ID NO.2)和单碱基错配 (sbMM)(SEQ IDNO.3)的序列。这些靶寡核苷酸末端用6-FAM或Cy5(IDT DNA) 标记。用于这些实验的探针和靶序列显示在表3中。与固定化探针互补的PM和 sbMM靶寡核苷酸区域以比这些寡核苷酸的其他部分更深的字体显示。单碱基错配的位置在sbMM靶序列中带有下划线。
表3.用于序列特异性SCODA的探针和靶寡核苷酸序列。
Figure BDA0003720179290000651
选择与pUC19互补的探针序列，用于如下所述的后续更长靶标的实验。100 个核苷酸靶标包含与探针互补的序列(完美匹配：PM)或与探针具有单碱基错配(sbMM)的序列，侧翼序列构成100个核苷酸长度。设计侧翼序列以最小化二级结构和自杂交的影响。随机选择探针结合位点侧翼区域的初始序列。然后使用Mfold计算折叠和自杂交能量，并且一次改变一个碱基序列以最小化这些影响，确保主要相互作用将在靶标链和探针之间。
表4显示了使用Mfold计算的表3中所示序列的结合能和解链温度。结合能ΔG以ΔH-TΔS的形式给出，其中ΔH是焓，ΔS是熵，分别以kcal/mol和kcal/mol K为单位。以下参数值用于计算表2中的值：温度＝50℃，[Na+]＝0.2M，[Mg++] ＝0M，链浓度＝10μM。非探针-靶标杂交的最大T.为23.9℃，最大二级结构 T.为38.1℃。这两个值都远远低于sbMM靶标-探针Tm，因此预计它们不会干扰靶标-探针相互作用。
表4.表3序列的结合能和解链温度。
Figure BDA0003720179290000661
为了测量随温度变化的速度响应，首先将荧光标记的靶标在高温(70℃)下注入凝胶中，并在恒定电场下驱动其进入凝胶的成像区域。一旦看到注入的条带，散布板的温度就下降到55℃。将25V/cm的电场施加到凝胶盒上，同时温度从40℃上升到70℃，速率为0.5℃/分钟。每20秒拍摄一次凝胶图像。使用
Figure BDA0003720179290000671
(National Instruments,Austin Tex.)编写的图像处理软件来确定每个图像中条带中心的位置，然后使用该位置数据来计算速度。
图11显示了靶DNA迁移率随温度变化的曲线。使用表3中所示的探针和靶序列的ΔG值，将速度与温度曲线拟合到等式[23]以确定两个自由参数：迁移率μ0和取决于杂交反应的动力学的常数β。
图11中显示的数据拟合显示出与上述迁移理论的良好一致性。错配迁移率的数据显示为左侧的曲线，完美匹配迁移率的数据显示为右侧的曲线。PM拟合和MM拟合的R2值分别为0.99551和0.99539。完美匹配靶标和单碱基错配靶标之间的分离支持存在一个工作温度，其中完美匹配靶标的聚焦速度显著大于错配靶标的聚焦速度，从而能够通过施加DC偏置场将两种物质分离，如图4 所示。
实施例2.0-使用亲和SCODA选择性分离分子
将含有10μM经acrydite修饰的探针寡核苷酸(Integrated DNA Technologies，www.idtdna.com)的4％聚丙烯酰胺凝胶注入凝胶盒中以提供亲和基质。
在30℃下将等摩尔量的完美匹配靶标和单碱基错配靶标注入亲和凝胶中，并在凝胶上施加100V/cm的电场，这样两种靶标分子将最初被捕获并固定在凝胶缓冲液界面上。然后将温度升高到70℃，并将20V/cm的恒定电场施加到凝胶上，以将靶标移动到凝胶的成像区域中。然后将温度降至62℃，并且如表2所示将叠加在8V/cm DC偏置上的108V/cm SCODA聚焦场施加到四个源电极上，周期为5秒。SCODA聚焦场的旋转方向每个周期都改变。
表5.施加的聚焦加偏置电位
Figure BDA0003720179290000672
Figure BDA0003720179290000681
图12显示了每2分钟拍摄的浓缩图像。完美匹配靶标标有6-FAM并显示为绿色(聚焦到紧密的点的前导亮点)，错配靶标标有Cy5并显示为红色(从凝胶中洗出的拖尾亮线)。拍摄第一张图像后，绿色通道上的相机增益降低。将DNA 注入凝胶的右侧并施加聚焦场加偏置场。完美匹配靶标(绿色)经历类似于图 10A中所示的漂移速度，并向中心焦点位置移动。较弱的聚焦错配靶标(红色) 经历类似于图10B中所示的速度场，并被偏置场推离凝胶边缘。施加的冲洗场的施加方向由白色箭头指示。
该实验验证了图10A和10B的预测，表明两个仅相差单个碱基的DNA靶标可以产生两个不同的速度分布，从而使具有较高结合能的靶标优先聚焦到凝胶上。图12中的图像证实，在SCODA聚焦场和DC偏置的施加下，两个不同的靶DNA序列移动通过亲和基质产生了两个不同的速度分布。单碱基错配靶标产生色散速度场，完美匹配靶标产生非色散速度场。该实施例表明，即使样品中存在大量过量的错配靶标，也可以有效地富集具有单碱基特异性的靶标，并任选地从亲和基质上洗掉不需要的靶标。
实施例3.0-操作条件的优化
可以优化SCODA方法的不同参数，以在合理的产量下实现良好的样品富集。在凝胶中具有固定化的(和带负电的)DNA的实施方案中，发现相对高盐度的运行缓冲液提供有效和稳定的聚焦，以及使将靶DNA从相邻样品室电动注入 SCODA凝胶所需的时间最小化。
实施例3.1-缓冲液盐度的优化
测量亲和凝胶中分子的温度依赖性迁移率的早期尝试以及序列特异性 SCODA的首次演示是在用于电泳SCODA的缓冲液中进行的。这些通常是标准电泳缓冲液，例如三硼酸盐EDTA(TBE)，通常稀释4到6倍以降低凝胶电导率，从而能够在焦耳加热施加的热限制内施加高电场，从而缩短浓缩时间。虽然可以在1X TBE缓冲液(89mM tris、89mM硼酸、2mM EDTA二钠)中实现基于序列特异性SCODA的浓缩，但由于在1X TBE缓冲液中处于平衡状态的相对较低浓度的解离离子，可以进一步优化序列特异性SCODA的性能条件。低浓度的解离离子导致杂交动力学缓慢，加剧了与凝胶中固定电荷(寡核苷酸探针) 相关的离子消耗，并增加了将靶DNA电动注入凝胶所需的时间。使用89mM tris 碱和89mM硼酸进行计算，其中硼酸的pKa为9.24，tris的pKa为8.3，显示了在1X TBE缓冲液中解离的tris和解离的硼酸各自的浓度为1.49mM。
实施例3.2-盐浓度对DNA杂交的影响
在用于分离核酸的实施方案中，正抗衡离子(positive counter ion)的存在屏蔽了带负电的核酸互补链的静电排斥，导致杂交速率增加。例如，已知增加Na+ 离子的浓度会以非线性方式影响DNA杂交速率(参见Tsuruoka等人， Optimization of the rateofDNAhybridization and rapid detection of methicillin resistantStaphylococcus aureus DNA using fluorescence polarization.Journal ofBiotechnology 1996；48(3):201-208.，其通过引用的方式并入本文)。当[NaCl]从 10mM增加到1M[NaCl]时，杂交速率增加约10倍，大部分增益在达到约200 mM时实现。在低于约10mM的低浓度正抗衡离子下，杂交速率更强烈地依赖于盐浓度，大致与盐浓度的立方6成正比。理论计算表明1X TBE的总正抗衡离子浓度为约5.5mM(1.5mM的解离tris和4mM的Na+来自EDTA二钠)。在该离子浓度下，可以实现聚焦，但是缓慢的杂交速率导致弱聚焦和大的最终焦点尺寸。
通过增加电场变化和迁移率变化之间的相位滞后，慢速率杂交会导致弱聚焦。等式[16]将SCODA速度描述为与
Figure BDA0003720179290000691
成正比，其中
Figure BDA0003720179290000692
表示迁移率振荡和电场振荡之间的相位滞后。在ssSCODA的情况下，相位滞后可能来自缓慢的热响应以及缓慢的杂交动力学。
这种相位滞后导致较慢的聚焦时间和较大的点尺寸，因为最终点尺寸是向内SCODA驱动的漂移和向外扩散驱动的漂移之间的平衡。总是需要更快的聚焦时间，因为这往往会减少从复杂混合物中富集靶标的总时间。较小的点尺寸也是可取的，因为它提高了区分不同分子种类的能力。如上所述，当在施加DC偏置下执行SCODA聚焦时，最终焦点将会偏离中心的量取决于靶标的迁移率和聚焦速度，这两者都取决于靶标和凝胶结合探针之间的相互作用的强度。因此，在偏置下聚焦时区分两个相似分子所需的分离量取决于最终焦点直径。较小的点直径应提高区分与凝胶结合探针具有相似亲和力的两个靶标的能力。
在使用1X TBE缓冲液实现的低杂交速率下，只有在探针浓度接近100μM 时才能实现可靠的聚焦。通过添加NaCl将盐浓度从大约5mM增加到200mM，同时将探针浓度保持在100μM具有减小最终焦点尺寸的效果，如图13A-D所示。图13A-D中的所有图像都是在相似的聚焦时间量(大约5分钟)后拍摄的，但是盐度增加导致焦耳加热增加，当用200mM NaCl聚焦时，需要将场强度降低四倍以防止沸腾。在图13A、13B、13C和13D中，探针浓度分别为100μM、10μM、1μM和100μM。图13A、13B和13C中使用的缓冲液是具有0.2M NaCl 的1X TB和。图13D中使用的缓冲液是1X TBE。在1X TBE中，10μM和1μM 探针的聚焦是不可靠的，这些结果未示出。在本实施例中的同等条件下，向凝胶中添加200mM NaCl还允许以低100倍的探针浓度聚焦互补靶标。
等式[30]表明聚焦速度与电场强度成正比，因此在电场强度降低四倍的情况下实现相当的聚焦时间这一事实表明，在高盐度条件下，场归一化聚焦速度要快得多。
尽管添加200mM NaCl并没有减少聚焦的总时间，但在一些实施方案中可能希望在较低的电场强度下聚焦，因为在一些实施例中，较低的场强度可以限制可能出现在亲和基质中的非特异性电泳SCODA的程度。例如，在由电泳SCODA 引起的电场建立热梯度的实施方案中，所有靶核酸分子将不管它们的序列而在用于序列特异性SCODA的亲和凝胶中聚焦。电泳SCODA聚焦的速度随着电场的增加而增加，因此降低场强度将具有降低非特异性SCODA聚焦速度的效果，从而可以通过施加DC偏置更容易地从凝胶中冲洗非靶DNA分子。
实施例3.3-离子消耗和束缚电荷
离子在边界处消耗(或积累)的速率随着固定电荷比例的增加而增加。当使用20个核苷酸的探针时，在1X TBE中实现有效浓度所需的100μM探针浓度会导致凝胶内的束缚负电荷为2mM，这与凝胶内溶解的负离子总量(约5.5mM) 相当。当在凝胶上放置恒定电场时，这种高比例的束缚电荷会导致凝胶内形成离子消耗的区域，就像在注入期间和在DC偏置下的SCODA聚焦期间一样。
因此，高盐度运行缓冲液可以帮助减少与固定ssSCODA凝胶中的电荷相关的许多离子消耗问题，因为它可以在较低的探针浓度下聚焦，以及通过添加额外的自由电荷来减少束缚电荷的比例。
实施例3.4-双链DNA的变性
靶DNA不会与凝胶固定化的探针相互作用，除非它是单链的。从双链DNA 生成单链DNA的最简单方法是在注入前煮沸样品。这种方法的一个潜在问题是样品可以在注入之前重新退火，从而降低了该方法的产量，因为重新退火的双链靶标不会与探针相互作用，并且可以通过偏置场从凝胶上洗掉。理论计算表明，样品的复性率与变性的单链DNA的浓度成正比。如果靶标浓度和样品盐度都保持在较低水平，则可以最大限度地减少样品的复性。
为了测量靶标浓度对复性和整体效率的影响，将与凝胶结合探针互补的荧光标记的双链PCR扩增子稀释到含有约2mM NaCl的250μl体积中，煮沸5分钟使其变性，然后在冰浴中冷却5分钟。然后将样品置于凝胶盒的样品室中，注入聚焦凝胶并浓缩至凝胶中心。浓缩完成后，测量最终焦点的荧光，并与手动移液到空凝胶盒中心的相同数量靶标的荧光进行比较。该实验使用100ng(2X 1011个拷贝)和10ng(2X1010个拷贝)的双链PCR扩增子进行。100ng样品的产率为40％，10ng样品的产率为80％。该实施例证实了较低的样品DNA浓度将导致更高的产量。
实施例3.5-相位滞后引起的旋转
如上所述，在电场振荡和迁移率变化振荡之间存在相位滞后的实施方案中，将向移动通过亲和基质的分子的速度添加旋转分量。图14显示了这个问题的一个实施例。图14中显示的靶标在SCODA场下聚焦较弱，当施加小的偏置以从凝胶中冲洗它们时，由SCODA场引起的冲洗场和旋转速度总和在凝胶左下角附近为零。这导致冲洗时间长，并且在极端情况下，污染物碎片的捕获能力较弱。用于产生SCODA聚焦的电场的旋转方向由箭头34表示。所施加的冲洗力的方向由箭头36表示。
为了克服这个问题，可以周期性地改变场旋转的方向。在本文所述的其他实施例中，每个周期改变场旋转的方向。这导致更清洁的冲洗和聚焦，并且死区 (dead zone)最小。该方案在上述聚焦和冲洗演示期间应用，如图12所示，这是一个实施例，其中错配靶标从凝胶中干净地冲洗而无需旋转。在这些条件下，由于相位滞后，SCODA聚焦速度降低，但SCODA速度没有额外的旋转分量。
实施例3.6-二级结构的影响
靶DNA中的二级结构会降低靶标与固定化探针的杂交速率。这将通过增加等式[16]中描述的相位滞后来降低聚焦速度。二级结构降低杂交速率的量取决于二级结构的细节。例如，使用简单的发夹，茎的长度和环的长度都会影响杂交速率9。对于序列特异性SCODA的大多数实际应用，在人们希望富集与污染背景DNA相差单个碱基的靶分子的应用中，靶标和背景都将具有相似的二级结构。在这种情况下，区分靶标和背景的能力不会受到影响，只会影响整个处理时间。通过增加固定化探针浓度和电场旋转周期，可以补偿降低的杂交速率。
可能存在二级结构能够影响将靶分子与背景分子区分开来的能力的情况。靶标和背景之间的单个碱基差异可能以这样的方式影响二级结构，即与靶标相比，背景DNA的二级结构减少并且杂交速率增加，并且背景DNA是单链构象多态性(SSCP)突变分析的基础。这种效应有可能降低或增强成功富集靶DNA的能力，并且在设计靶标和探针序列时必须小心，以最大限度减少二级结构的影响。一旦选择了靶分子，探针位置就可以在突变位点附近移动。可以调整探针分子的长度。在一些情况下，寡核苷酸可以与探针退火区域侧翼的序列杂交以进一步抑制二级结构。
实施例4.0-序列特异性SCODA性能的定量
测量了在DC偏置下聚焦时最终焦点位置的长度依赖性，并显示其与长度范围为200nt至1000nt的片段的长度无关；这是一个重要的结果，意味着ssSCODA 能够仅通过序列区分核酸靶标，而无需确保所有靶标具有相似的长度。测量值证实了富集靶序列同时舍弃(reject)与靶标仅相差单个碱基的污染序列的能力，以及富集与污染背景DNA分子仅相差单个甲基化的胞嘧啶残基的靶DNA的能力。
实施例4.1-聚焦的长度独立性
无论片段长度如何，仅基于序列纯化核酸的能力消除了在富集之前确保所有靶标片段具有相似长度的需要。上文提出的序列特异性SCODA理论预测，序列特异性SCODA富集应该与靶标长度无关。然而，上文未建模的效果可能导致长度依赖性，因此进行了实验以确认序列特异性SCODA的长度独立性。
根据上文开发的热驱动序列特异性SCODA的理论，偏置下的最终焦点位置不应取决于靶标链的长度。最终焦点位置的长度依赖性通过不受阻碍的靶标μ0的迁移率的长度依赖性进入该表达式。但是，由于μ(Tm)和a都与μ0成正比，因此长度依赖性将从该表达式中消除。因此，使用热驱动ssSCODA浓缩的靶标的最终焦点位置不应取决于靶标的长度，即使存在偏置。
在最终焦点位置有两个可能的长度依赖性来源，其在上文没有建模，这也必须考虑：在温度梯度由电场建立的实施方案中的电泳SCODA，以及探针靶标双链体的基于力的解离。足够长度(>200个核苷酸)的DNA靶标在用于序列特异性SCODA的聚丙烯酰胺凝胶中具有场依赖性迁移率，因此当将聚焦场施加到凝胶时将经历与序列无关的聚焦力。因此，靶分子所经历的总聚焦力将是电泳 SCODA和序列特异性SCODA贡献的总和。在电泳SCODA下，较长分子的聚焦速度趋于增加，而DC速度趋于降低，因此在偏置下，最终焦点位置取决于长度。最终焦点位置中长度依赖性的第二个可能来源是基于力的解离。上文提出的亲和SCODA理论假设探针-靶标解离完全由热激发驱动。然而，可以通过施加的力解离双链DNA。具体而言，外部电场拉动靶标链的带电主链可用于解离探针-靶标双链体。施加的电场将趋于将等式[22]中的自由能项ΔG减少的量等于带电分子在电场中移动所获得的能量。该力将与靶DNA的长度成正比，因为对于更长的靶分子，电场将存在更多的电荷，因此对于给定的电场强度，解离速率应随着靶标的长度而增加.
为了测量这两种效应是否对最终焦点位置的长度依赖性有显著影响，将两种不同长度的靶DNA(每个都包含与凝胶固定化探针互补的序列)在偏置下聚焦，并测量和比较最终焦点位置。靶DNA是通过pUC19区域的PCR扩增产生的，该区域包含与表3中的探针序列互补的序列。使用共同的正向引物进行两个反应，并选择反向引物以产生250bp的扩增子和1000bp的扩增子。正向引物分别用6-FAM和Cy5荧光标记250bp和1000bp片段。将靶标注入亲和凝胶并聚焦到中心，然后施加偏置场。10V/cm的偏置场叠加在120V/cm的聚焦场上10 分钟，此时偏置增加至20V/cm再持续7分钟。每20秒拍摄一次凝胶图像，在 6-FAM通道和Cy5通道之间有1秒的延迟。场旋转周期为5秒。图像经过后处理以确定每个片段的焦点位置。图15A和15B显示了250bp(绿色)和1000bp (红色)片段的焦点位置与时间的关系。图15B是实验结束时两个片段的最终焦点图像。
最终位置存在微小差异，这可归因于这两个图像不是在SCODA循环的同一阶段拍摄的事实。该实施例表明最终焦点位置不依赖于长度。因此，在这些操作条件下，电泳SCODA聚焦比亲和SCODA聚焦弱得多，并且亲和SCODA主要由热解离而不是基于力的解离驱动。该结果证实，亲和SCODA能够仅通过序列区分核酸靶标，而无需确保所有靶标具有相似的长度。
实施例4.2-单碱基错配舍弃率
为了证明ssSCODA对舍弃单个碱基不同序列的特异性，将含有完美匹配(PM) 或单碱基错配(sbMM)的合成的100nt靶DNA与凝胶结合探针的不同比率注入亲和凝胶。在存在DC冲洗场的情况下进行SCODA聚焦以去除过量的sbMM DNA。PM靶序列用6-FAM标记，sbMM用Cy5标记；在从凝胶上冲洗sbMM 靶标后，对每种染料在焦点位置处的荧光量进行定量，并与校准运行进行比较。对于校准运行，将等摩尔量的6-FAM标记的PM和Cy5标记的PM靶DNA聚焦到凝胶中心，并在每个通道上对焦点位置处的荧光信号进行定量。因此，在此校准期间测量的信号Cy5通道与6-FAM通道上的信号的比率是当两种染料分子以等摩尔浓度存在时的信号比率。通过比较从凝胶中冲洗过量的sbMM后的荧光比率与校准运行，可以确定通过冲洗从凝胶中舍弃的sbMM DNA的量。
将包含表3中所示靶序列的样品添加到样品室中，并在45℃下在样品室中施加50V/cm的电场，以将样品注入含有10μM固定化探针的凝胶中。将样品注入凝胶后，用干净的缓冲液替换样品室中的液体，并使用叠加的DC冲洗场进行 SCODA聚焦。60V/cm的聚焦场与7V/cm的DC冲洗场相结合，后者施加在与注入场相反的方向上。发现冲洗场的这个方向导致在最短的时间量内完全舍弃错配的靶DNA。下面的表6显示了每次实验注入凝胶中的DNA量。
表6.为测量亲和SCODA相对于单碱基差异的舍弃率而运行的靶标列表。
Figure BDA0003720179290000751
在从凝胶上洗掉错配的靶标后，关闭聚焦场并将凝胶的温度降低到25℃，然后拍摄凝胶图像以进行定量。确保用于定量的所有图像均在相同温度下拍摄是非常重要的，因为Cy5荧光高度依赖于温度，荧光在较高温度下会降低。将Cy5 和6-FAM通道上的荧光比率与1:1校准运行进行比较，以确定每次运行的舍弃率。图16A和16B显示了这些实验的结果。将四种不同比率的sbMM:PM注入凝胶中并在偏置下聚焦以去除过量的sbMM。PM DNA用6-FAM标记，sbMM DNA用Cy5标记。图16A显示了从凝胶中洗掉过量sbMM DNA后来自最终焦点的荧光信号。荧光信号被归一化为在初始校准运行中测量的荧光，其中1:1比率的PM-FAM:PMCy5DNA被注入并聚焦到凝胶中心。图16B显示了通过将 sbMM:PM的初始比率除以冲洗后的最终比率计算的舍弃率。
发现可以实现约10,000倍的舍弃率。然而，应该注意的是，在聚焦和冲洗过程中以高sbMM:PM比率拍摄的图像表明存在具有两种不同速度分布的sbMM 分子。大部分错配靶标从凝胶上干净地洗掉，而少量在焦点处被捕获。这些在Cy5通道上可见的最终焦点可能由Cy5标记的靶标组成，其被错误地合成，具有为它们提供了PM序列的单碱基替换错误。这里测量的10,000:1舍弃率对应于对单碱基替换的寡核苷酸合成错误率的估计，这意味着IDT合成的错配分子可能包含大约10,000个完美匹配分子中的一部分。这意味着在Cy5通道上检测到的残留荧光，而不是未解决的错配，实际上可能是从错配样品中富集的Cy5 标记的完美匹配。因此，ssSCODA的舍弃率实际上可能高于10,000:1。
实施例4.3-临床相关突变的突变富集
上述实施例中使用的合成的寡核苷酸经过专门设计，以使完美匹配-探针双链体和错配-探针双链体之间的结合能差异最大化。亲和SCODA富集生物学相关序列的能力也已得到证实。在该实施例中，从含有野生型EZH2基因或Y641N 突变体的细胞系中分离出cDNA，该Y641N突变体先前已被证明与B细胞非霍奇金淋巴瘤有关。使用荧光引物对包含突变位点的EZH2 cDNA的460bp区域进行PCR扩增，以产生可在浓缩和冲洗过程中可视化的荧光标记的靶分子。突变体-探针双链体和野生型-探针双链体之间在60℃的结合能差异为2.6kcal/mol，而之前实施例中使用的合成的寡核苷酸为3.8kcal/mol。这对应于突变体与野生型相比的解链温度差异为5.2℃。表7显示了野生型和突变体与探针序列的杂交自由能和解链温度。
表7.EZH2靶标与凝胶结合探针的结合能和解链温度
Figure BDA0003720179290000771
两个等位基因的1:1混合物混合在一起，并用亲和SCODA分离。将30ng 的每个靶标扩增子添加到300μl 0.01X序列特异性SCODA运行缓冲液中。将靶标溶液浸入沸水浴中5分钟，然后置于冰浴中5分钟，然后上样到凝胶盒上以使双链靶标变性。在55℃下以4mA的注入电流注入样品7分钟。注入后，在 55℃下施加150V/cm的聚焦场和10V/cm DC偏置20分钟。
该实验的结果如图17A、17B和17C所示。这些序列的行为在质量上类似于上述实施例中所示的较高Tm的差异序列。野生型(错配)靶标从凝胶上完全洗掉(图右侧的图像)，而突变体(完美匹配)被驱向凝胶中心(图左侧的图像)。在这种情况下，聚焦效率降低，因为一些靶标重新退火形成不与凝胶结合探针相互作用的双链DNA。
所用光学系统的检测下限为约10ng的单标记的460bp DNA。
实施例5.0-甲基化富集
通过在具有相同序列的甲基化和未甲基化的靶标的混合群体中富集甲基化的DNA，证明了基于亲和SCODA的纯化选择性富集具有相似结合能的分子的能力。
通过IDT合成具有在表3中列出的序列(SEQ ID NO.2)的荧光标记的PM寡核苷酸，在捕获探针区域内具有单个甲基化的胞嘧啶残基(表3的PM序列中的残基50)。对甲基化和未甲基化的PM链进行DC迁移率测量以生成如上所述的速度与温度曲线；该曲线如图18所示。
将这些曲线拟合到等式[23]表明，在69℃时结合能的差异为约0.19kcal/mol，约为热能FN1的三分之一。该曲线进一步表明，两个靶标的分离在69℃左右的操作温度下将最为有效，此时两个片段的迁移率差异最大，如图19所示。在该实施例中，该差异的最大值为69.5℃，这是在施加DC偏置下进行SCODA聚焦时最大分离的温度。在69℃时，kbT＝0.65kcal/mol。
该温度略高于上述实施例中使用的温度，虽然它应该导致更好的区分，但聚焦时间更长，因为更高的温度限制了在不使凝胶沸腾的情况下可以操作的最大电场强度。
最初的聚焦测试表明，可以通过使用叠加的DC偏置执行亲和SCODA聚焦来分离两个靶标。图20显示了将等摩尔比的甲基化和未甲基化的靶标注入凝胶中的实验结果，在69℃在75V/cm的聚焦场强度和14V/cm的偏置下以5秒的周期聚焦。甲基化的靶标用6-FAM(绿色，右侧斑点)标记，未甲基化的靶标用Cy5(红色，左侧斑点)标记。更换染料重复实验，结果相同。
对于上述实施例，使用相同的凝胶几何结构从凝胶中完全冲洗未甲基化的靶标来实现富集被证明是困难的，因为凝胶缓冲液界面被缓冲液孔遮蔽，阻止了使用视觉反馈来控制DC偏置场，同时试图从凝胶中冲洗未甲基化的靶标。为了克服这个问题，凝胶分两步浇注：首先将不含探针寡核苷酸的凝胶浇注在凝胶的一个臂中，一旦第一个凝胶聚合，凝胶区域的其余部分就充满了含有探针寡核苷酸的凝胶。凝胶被浇注，使得两者之间的界面在荧光成像系统中是可见的。该系统允许对偏置电压进行实时调整，以便未甲基化的靶标在没有固定化的探针的情况下进入凝胶并从凝胶中快速洗掉，而甲基化的靶标可以保留在聚焦凝胶中。图21A-21D显示了该实验的结果。图21A和21B显示了对于10pmol未甲基化的DNA(图21A)和0.1pmol甲基化的DNA(图21B)，在从凝胶中冲洗未甲基化的靶标之前的初始聚焦结果。图21C和21D分别显示了对于未甲基化和甲基化的靶标，在未甲基化的序列已从凝胶中洗去之后进行的第二次聚焦的结果。所有图像均使用相同的增益和快门设置拍摄。
在该实验中，将100倍过量的未甲基化的靶标注入凝胶中，在没有施加任何冲洗场的情况下聚焦于中心。然后用偏置场聚焦靶标以去除未甲基化的靶标，最后再次聚焦到凝胶中心进行荧光定量。这些图像的荧光定量表明，富集因子为102倍，在冲洗过程中甲基化靶标的损失为20％。用交换的染料分子(甲基化的Cy5和未甲基化的6-FAM)重复该实验，结果相似。
实施例6.0-多重亲和SCODA
将上述两种不同的寡核苷酸探针，一种对EZH2具有亲和力，一种对pUC具有亲和力，以各自10μM的浓度浇注在凝胶中，以提供包含两种不同固定化探针的亲和基质。对EZH2探针具有亲和力且理论解链温度为62.3℃的100个核苷酸的靶序列用Cy5标记。对pUC探针具有亲和力且理论解链温度为70.1℃的 100个核苷酸的靶序列用FAM标记。两个靶分子之间的理论解链温度差异为 7.8℃。
将靶分子上样到亲和凝胶上(图22A)，并在凝胶舟(boat)下方的温度保持在 55℃的情况下进行聚焦(图22B，两分钟后聚焦，图22C，四分钟后聚焦)。EZH2 靶标在这些条件下聚焦(四个红点)，而pUC靶标在这些条件下只有很弱的聚焦 (凝胶上可见三个漫射绿点)。在该实验的初始部分期间，中心提取孔不包含缓冲液，导致产生四个焦点，而不是单个中心焦点。然后凝胶下方的温度升高到 62℃，温度升高7℃(图22D，温度升高后聚焦两分钟，图22E，四分钟后聚焦)，导致形成四个清晰的pUC靶标的焦点。在此较高温度下，EZH2靶标仍然聚焦在四个紧密的点中。
凝胶下方的温度降低到55℃，并将缓冲液添加到中心提取孔中。在此温度下施加SCODA聚焦场导致EZH2靶标被选择性地浓缩到中心提取孔中(在图22F 的中心处可见漫射红点，0.5分钟，在图22G中，1分钟)，而pUC靶标仍然主要集中在中心提取孔外的四个点中。凝胶下方的温度升高到62℃，温度升高7℃。在两分钟内，pUC靶标已经聚焦到中心提取孔中(图22H，在凝胶中心可见的漫射红色和绿色荧光)。
第二个实验在与第一个相似的条件下进行。在如上所述将EZH2靶标聚焦在55℃并将pUC靶标聚焦在62℃之后，将DC冲洗偏置施加到凝胶上，凝胶下方的温度保持在55℃。在这些条件下，EZH2靶标经历比pUC靶标更大的偏置速度。在施加偏置场后，EZH2靶标的焦点移动得更快(在施加偏置场后6分钟，图22I中的红点移动到凝胶的右侧，在图22J中，在12分钟后，在图22K中，在18分钟后)。EZH2靶标的焦点也在凝胶内向右移动了更远的距离。相比之下， pUC靶标的焦点移动更慢(最初的绿色焦点在6分钟后在图22I中仍然大部分可见，向右移动通过图22J，12分钟和图22K，18分钟)，并且pUC靶标的焦点向右移动不如冲洗偏置下的EZH2靶标的焦点移动得远。
亲和SCODA产量与纯度
因为亲和SCODA依赖于靶标和探针之间的重复相互作用来为靶分子生成非色散速度场，同时为污染物生成色散场(只要施加冲洗偏置)，可以在不牺牲产量的情况下实现高特异性。如果假设最终焦点是高斯分布的，这可以通过计算与扩散平衡的径向速度场的点尺寸来证明，那么点将一直延伸到凝胶的边缘。在这里，扩散可以将靶标从没有恢复聚焦力的凝胶中驱赶出去，并且施加的DC 偏置会将靶标从凝胶中扫出，从而使其丢失。以这种方式，ssSCODA的损失可以随着施加冲洗场的时间量而改变；然而，用于生成图13A-13D的图像表明，在该实施例中，焦点的半峰全宽(FWHM)为300μm，并且在偏置下，它位于距凝胶中心约1.0mm处。如果假设焦点中有10fmol的靶标，那么在施加偏置的凝胶边缘的浓度为1e-352M；凝胶边缘存在的靶分子基本上为零，在DC偏置下它们可能会丢失。这意味着由于施加的偏置(即冲洗步骤)而累积的损失率基本上为零。虽然所需的靶标可能会以其他方式从系统中丢失，例如通过在注入前吸附到样品孔中、在注入期间从凝胶边缘流出、在聚焦之前或期间或在提取过程中重新退火(在双链靶分子的情况下)，所有这些损失都与纯化靶标的纯度无关。
实施例7.0-样品制备装置的使用
将本公开的自动化样品制备装置用于制备从人血液中提取的DNA样品。
样品制备装置包括流体模块(包括蠕动泵系统)、温度控制模块(以提供温度和机械精度)、装置上允许用户选择任何方法特异性的参数(例如，核酸的所需大小范围、靶分子捕获所需的同源性程度等)的触摸屏界面、以及用户能够打开以插入本公开的样品制备盒的盖子。所述装置由1000伏电极电源供电。样品制备盒包含13个离散的微流体通道(或泵送通道)，并且被制造使其可以进行端到端的样品制备。微流体通道被设计用于以自动连续的方式操作试剂和所述盒，以实现：(1)使用裂解+裂解缓冲液用移液管引入组合样品裂解，随后提取靶DNA；(2)DNA纯化；(3)利用转座酶Tn5进行DNA标签化，DNA修复成功； (4)使用核酸捕获探针和SCODA选择特定大小范围的DNA片段；和(5)DNA清理。
将100μL人全血与裂解缓冲液混合，将蛋白酶K在55℃下孵育10分钟，然后与异丙醇混合；随后将裂解物混合物添加到样品制备盒中的样品端口，将上样后的盒插入样品制备装置中，并提取DNA。如上所述，自动化装置产生了 1.2μg提取的DNA；使用上述连续步骤进一步处理1μg提取的DNA，以生成 530ng浓度为6.5nM的DNA文库。然后使用玻璃测序芯片对由样品制备装置产生的纯化的DNA文库进行测序。
作为对照实验，使用传统的DNA提取和纯化技术手动处理100μL人全血(来自与上述相同的样品)以生成用于测序的DNA文库。
发明人发现，相对于使用传统DNA提取和纯化技术手动制备的DNA获得的测序数据，使用自动化样品制备装置制备的DNA文库获得的测序数据在质量上 (例如，通过平均读长评估)相似。如表8所示，自动化装置产生了比手动方法更多的总读数(使用自动化方法的72个总读数，对比使用手动方法的27个总读数)和更长的读长(使用自动化方法的1989.0±760.1个碱基对读长，对比使用手动方法的1132.1±324.5个碱基对读长)，在结果读数的准确性和GC含量方面没有观察到两种方法之间的显著差异。
表8.从人全血产生的DNA文库的测序结果
Figure BDA0003720179290000821
实施例8.0-使用样品制备装置富集DNA以进行测序
将本公开的自动化样品制备装置用于制备从培养的大肠杆菌细胞中提取的 DNA样品。
样品制备装置包括流体模块(包括蠕动泵系统)、温度控制模块(以提供温度和机械精度)、装置上允许用户选择任何方法特异性的参数(例如，核酸的所需大小范围、靶分子捕获所需的同源性程度等)的触摸屏界面、以及用户能够打开以插入本公开的样品制备盒的盖子。所述装置由1000伏电极电源供电。样品制备盒包含13个离散的微流体通道(或泵通道)，并且被制造使其可以进行端到端的样品制备。微流体通道被设计用于以自动连续的方式操作试剂和所述盒，以实现：(1)用移液管引入组合样品+裂解缓冲液，随后提取靶DNA；(2)DNA 纯化；(3)利用转座酶Tn5进行DNA标签化，DNA修复成功；(4)使用SCODA 选择特定大小范围的DNA片段；和(5)DNA清理。
将来自与裂解缓冲液和蛋白酶K混合的过夜培养物中的7亿个大肠杆菌细胞的样品在55℃下孵育10分钟，然后与异丙醇混合；将裂解物混合物添加到样品制备盒的样品端口，将上样后的盒插入样品制备装置中，并提取DNA。自动化处理继续使DNA进入DNA文库，准备好进行测序，在DNA修复步骤之前短暂暂停，用户将DNA修复酶和DNA修复缓冲液混合物添加到盒中。自动化装置将DNA修复酶和DNA修复缓冲液混合物运输到盒中的反应位置。如上所述，自动化装置产生了0.96μg提取的DNA；随后的自动化步骤产生了279ng浓度为2.89nM的DNA文库。
作为对照实验，使用传统的DNA提取和纯化技术手动处理了7亿个大肠杆菌细胞的样品(来自与上述相同的样品)以产生DNA。这种手动制备的DNA 在自动化装置上进行相同的自动化文库制备过程，产生199ng浓度为2.65nM 的DNA文库。
由样品制备装置产生的纯化的DNA文库使用Aline珠粒浓缩，然后在Pacific
Figure BDA0003720179290000832
RSII DNA测序仪上进行测序。
发明人发现，相对于使用由传统的DNA提取和纯化技术手动制备然后由自动化DNA文库制备的DNA获得的测序数据，使用由自动化样品制备装置纯化并制备成文库格式的DNA获得的测序数据产生的测序读长略短，但质量相似(通过Rsq评分评估)(图25)。
如表9所示，全自动化文库生成的读数与手动DNA提取生成的读数具有相同的读数质量(Rsq 0.82)，长度大致相同(851个碱基平均读长，手动为922个)。
表9.经自动化样品制备设备提取和纯化的对比手动提取和纯化的从大肠杆菌细 胞产生的DNA文库在相同自动化装置上运行的DNA的测序结果。
Figure BDA0003720179290000831
实施例9.0-使用样品制备装置富集DNA以进行测序
本公开的自动化样品制备装置用于使用SCODA为从大肠杆菌培养细胞手动制备的DNA文库选择特定大小范围的DNA片段。
对四微克手动纯化的大肠杆菌DNA进行Tn5a标签化，然后分成四个单独的样品，每个样品由1μg组成。通过以下四种不同的方法分别选择特定大小的DNA 片段：(1)SageBluePippin，具有收集3kb到10kb大小的片段的程序，(2)Sage BluePippin，具有收集大于4kb到10kb的片段的程序，(3)手动Aline珠粒大小选择，添加0.45x珠粒，或(4)自动化样品制备装置中的SCODA技术(如实施例 8.0中所述)。
大小选择后，将每个样品分别制备到DNA文库中，并在Pacific
Figure BDA0003720179290000841
RSII DNA测序仪上进行测序。
发明人发现，使用自动化样品制备装置使用DNA文库大小选择获得的测序数据优于或等同于通过标准手动的基于珠粒的方法或自动化Sage BluePippin大小选择方法选择大小的复制DNA文库(图26)。
如表10(见下)所示，自动化装置生成的读长比手动大小选择方法的更长，并且与BluePippin方法相当，在生成的读数的准确性和GC含量方面没有观察到方法之间的显著差异。
表10.与通过商业和手动方法选择的样本大小衍生的那些相比，来自DNA文库生成 的自动化大小选择的测序指标
大小选择 读数 中间值读长
Sage BluePippin，选择3-10kb范围 675 2389
Sage BluePippin，选择>4-10kb高通 2253 2409
手动基于珠粒的大小选择(Aline) 2296 1478
自动化大小选择(本公开的样品制备装置) 18707 2358
附加实施方案
本发明的实施方案涉及诸如核酸、蛋白质和其他分子的粒子通过诸如凝胶和其他基质的介质的诱导运动。一些实施方案提供了用于选择性地纯化、分离、浓缩和/或检测目的粒子的方法和设备。一些实施方案提供了用于选择性地纯化、分离、浓缩和/或检测差异性修饰的目的粒子的方法和设备。一些实施方案提供了用于选择性纯化、分离、浓缩和/或检测差异甲基化的DNA的方法和设备。一些实施方案用于诸如表观遗传学、肿瘤学或各种医学领域的领域。一些实施方案用于检测胎儿遗传病症、指示癌症或癌症风险的生物标志物、器官衰竭、疾病状态、感染等。
结合旨在示例性和说明性而非限制范围的系统、工具和方法来描述和说明以下实施方案及其方面。在各种实施方案中，已经减少或消除了一个或多个上述问题，而其他实施方案涉及其他改进。
一个实施方案提供了一种用于从生物样品中浓缩目的分子的方法。从受试者获得生物样品并上样到亲和基质上。亲和基质具有固定化的亲和剂，该亲和剂对目的分子具有第一结合亲和力，对生物样品中的至少一些其他分子具有第二结合亲和力。第一结合亲和力高于第二结合亲和力。进行亲和SCODA以将目的分子选择性地浓缩到焦点中，其中焦点中目的分子的浓度相对于生物样品中其他分子的浓度增加。分子可以是核酸。目的分子可以具有与生物样品中至少一些其他分子相同的序列。与生物样品中的至少一些其他分子相比，目的分子可以被差异性修饰。与生物样品中的至少一些其他分子相比，目的分子可以被差异甲基化。生物样品可以是母体血浆，而目的分子可以是与母体DNA相比差异甲基化的胎儿DNA。生物样品可以是组织样品，而目的分子可以是与健康受试者中的基因相比差异甲基化的与癌症有关的基因。
一个实施方案提供了一种用于将样品中的第一分子与第二分子分离的方法。亲和基质配备有与第一和第二分子结合的固定化探针。第一分子与探针之间的结合能大于第二分子与探针之间的结合能。在亲和基质内提供空间梯度，该空间梯度是改变第一和第二分子对探针的亲和力的迁移率变化场。施加了影响亲和基质内分子运动的驱动场。空间梯度和驱动场的方向随时间变化，以影响第一分子向焦点的净运动。施加冲洗场并定位成影响第一和第二分子两者通过亲和基质的净运动。第一和第二分子可以是核酸。第一和第二分子可以被差异性修饰。第一和第二分子可以被差异甲基化。第一分子可以是胎儿DNA，第二分子可以是与胎儿DNA具有相同序列但与胎儿DNA相比差异甲基化的母体 DNA。第一分子和第二分子可以是与癌症有关的基因，并且与第二分子相比，第一分子可以被差异甲基化。
一个实施方案提供了将时变驱动场与时变迁移率变化场组合以分离第一和第二差异甲基化的核酸分子的用途，其中第一和第二核酸分子具有相同的DNA 序列。将时变驱动场和时变迁移率变化场施加到包括与所述DNA序列至少部分互补的寡核苷酸探针的基质。第一核酸分子对寡核苷酸探针具有第一结合能，第二核酸分子对寡核苷酸探针具有第二结合能，并且第一结合能高于第二结合能。第一核酸分子可以是胎儿DNA，第二核酸分子可以是母体DNA，并且第一和第二核酸分子可以从母体血液样品中获得。第一和第二核酸分子可以是与胎儿病症有关的基因。第一和第二分子可以是与癌症有关的基因的差异甲基化形式。第一和第二分子可以从受试者的组织样品中获得。
一个实施方案提供了使用同步阻力改变系数(SCODA)来检测受试者中生物标志物的存在。
本发明的进一步方面
上述示例性实施方案和实施例的方面可以以各种组合和子组合进行组合，以产生本发明的进一步实施方案。在上文描述的示例性实施方案和实施例的方面不相互排斥的范围内，旨在所有这样的组合和子组合都在本发明的范围内。对本领域技术人员来说显而易见的是，本发明的实施方案包括多个方面。因此，权利要求的范围不应受描述和实施例中阐述的优选实施方案的限制，而应给予与整个描述一致的最广泛的解释。
序列表
<110> 宽腾矽公司
<120> 样品制备系统和方法
<130> R0708.70068WO00
<140> 未指定
<141> 与此同时
<150> US 63/101,213
<151> 2019-10-29
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 1
actggccgtc gttttact 18
<210> 2
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 2
cgattaagtt gagtaacgcc actattttca cagtcataac catgtaaaac gacggccagt 60
gaattagcga tgcatacctt gggatcctct agaatgtacc 100
<210> 3
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 3
cgattaagtt gagtaacgcc actattttca cagtcataac catgtaaaac tacggccagt 60
gaattagcga tgcatacctt gggatcctct agaatgtacc 100

Claims (63)

1.一种用于从生物样品中富集靶分子的装置，所述装置包含自动化样品制备模块，所述自动化样品制备模块包含被设置为接收可移除的盒的盒外壳。
2.根据权利要求1所述的装置，其中所述可移除的盒是单次使用的盒或多次使用的盒。
3.根据权利要求1或2所述的装置，其中所述可移除的盒被设置为接收所述生物样品。
4.根据权利要求3所述的装置，其中所述可移除的盒进一步包含所述生物样品。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的装置，其中所述盒包含一个或多个微流体通道，所述微流体通道被设置为容纳和/或传输在样品制备过程中使用的流体。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的装置，其中所述盒包含一种或多种亲和基质，其中每种亲和基质包含对所述靶分子具有结合亲和性的固定化的捕获探针。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的装置，其中所述生物样品是血液、唾液、痰液、粪便、尿液或口腔拭子样品。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的装置，其中所述靶分子是靶核酸。
9.根据权利要求8所述的装置，其中所述靶核酸是RNA或DNA分子。
10.根据权利要求3-9中任一项所述的装置，其中所述固定化的捕获探针是寡核苷酸捕获探针，并且其中所述寡核苷酸捕获探针包含与所述靶核酸至少部分互补的序列。
11.根据权利要求10所述的装置，其中所述寡核苷酸捕获探针包含与所述靶核酸至少80％、90％、95％或100％互补的序列。
12.根据权利要求8-11中任一项所述的装置，其中所述装置产生具有用于下游测序应用的平均读长的靶核酸，所述平均读长比使用对照方法产生的平均读长更长。
13.根据权利要求1-7中任一项所述的装置，其中所述靶分子是靶蛋白。
14.根据权利要求1-7或13中任一项所述的装置，其中所述固定化的捕获探针是与所述靶蛋白结合的蛋白质捕获探针。
15.根据权利要求13所述的装置，其中所述蛋白质捕获探针是适体或抗体。
16.根据权利要求14或15所述的装置，其中所述蛋白质捕获探针以10-9至10-8M、10-8至10-7M、10-7至10-6M、10-6至10-5M、10-5至10-4M、10-4至10-3M或10-3至10-2M的结合亲和力与所述靶蛋白结合。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的装置，其中所述装置进一步包含测序模块。
18.根据权利要求17所述的装置，其中所述自动化样品制备模块直接或间接连接到所述测序模块。
19.根据权利要求17或18所述的装置，其中所述装置被设置为将所述靶分子从所述自动化样品制备模块递送至所述测序模块。
20.根据权利要求17-19中任一项所述的装置，其中所述测序模块执行核酸测序。
21.根据权利要求20所述的装置，其中所述核酸测序包括单分子实时测序、边合成边测序、连接法测序、纳米孔测序和/或Sanger测序。
22.根据权利要求17-19中任一项所述的装置，其中所述测序模块执行多肽测序。
23.根据权利要求22所述的装置，其中所述多肽测序包括埃德曼降解或质谱。
24.根据权利要求17-19中任一项所述的装置，其中所述测序模块执行单分子多肽测序。
25.一种用于从生物样品中纯化靶分子的方法，所述方法包括：
(i)裂解所述生物样品；
(ii)将(i)的经裂解的样品片段化；和
(iii)使用亲和基质富集样品，所述亲和基质包含对所述靶分子具有结合亲和性的固定化的捕获探针，
从而纯化所述靶分子。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述靶分子是靶核酸分子。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述靶核酸是RNA或DNA分子。
28.根据权利要求25-27中任一项所述的方法，其中所述固定化的捕获探针是寡核苷酸捕获探针，并且其中所述寡核苷酸捕获探针包含与所述靶核酸至少部分互补的序列。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述寡核苷酸捕获探针包含与所述靶核酸至少80％、90％、95％或100％互补的序列。
30.根据权利要求28所述的方法，其中所述靶分子是靶蛋白。
31.根据权利要求25或30所述的方法，其中所述固定化的捕获探针是与所述靶蛋白结合的蛋白质捕获探针。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述蛋白质捕获探针是适体或抗体。
33.根据权利要求31或32所述的方法，其中所述蛋白质捕获探针以10-9至10-8M、10-8至10-7M、10-7至10-6M、10-6至10-5M、10-5至10-4M、10-4至10-3M或10-3至10-2M的结合亲和力与所述靶蛋白结合。
34.根据权利要求25-33中任一项所述的方法，其中步骤(i)包括电解法、酶促法、基于去污剂的方法和/或机械均化。
35.根据权利要求25-34中任一项所述的方法，其中步骤(i)包括连续进行的多种裂解方法。
36.根据权利要求25-35中任一项所述的方法，其中所述样品在裂解之后和步骤(ii)或(iii)之前被纯化。
37.根据权利要求25-36中任一项所述的方法，其中步骤(ii)包括机械、化学和/或酶促片段化方法。
38.根据权利要求25-37中任一项所述的方法，其中在片段化之后和步骤(iii)之前纯化所述样品。
39.根据权利要求25-38中任一项所述的方法，其中步骤(iii)包括使用电泳法进行富集。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述电泳法是亲和SCODA、FIGE或PFGE。
41.根据权利要求25-40中任一项所述的方法，进一步包括：
(iv)检测所述靶分子。
42.根据权利要求41的方法，其中步骤(iv)包括使用吸光度、荧光、质谱和/或测序方法进行检测。
43.根据权利要求25-42中任一项所述的方法，其中所述生物样品是血液、唾液、痰液、粪便、尿液或口腔样品。
44.根据权利要求25-43中任一项所述的方法，其中所述生物样品来自人、非人灵长类动物、啮齿动物、狗、猫或马。
45.根据权利要求25-44中任一项所述的方法，其中所述生物样品包含细菌细胞或细菌细胞群。
46.一种用于从生物样品中富集靶分子的装置，所述装置包含自动化样品制备模块，其中所述自动化样品制备模块执行以下步骤：
(i)接收生物样品；
(ii)裂解所述生物样品；
(iii)将(ii)的样品片段化；和
(iv)使用亲和基质富集样品，所述亲和基质包含对所述靶分子具有结合亲和性的固定化的捕获探针。
47.根据权利要求46所述的装置，其中所述靶分子是靶核酸分子。
48.根据权利要求46所述的装置，其中所述靶核酸是RNA或DNA分子。
49.根据权利要求46-48中任一项所述的装置，其中所述固定化的捕获探针是寡核苷酸捕获探针，并且其中所述寡核苷酸捕获探针包含与所述靶核酸至少部分互补的序列。
50.根据权利要求49所述的装置，其中所述寡核苷酸捕获探针包含与所述靶核酸至少80％、90％、95％或100％互补的序列。
51.根据权利要求46所述的装置，其中所述靶分子是靶蛋白。
52.根据权利要求46或51所述的装置，其中所述固定化的捕获探针是与所述靶蛋白结合的蛋白质捕获探针。
53.根据权利要求52所述的装置，其中所述蛋白质捕获探针是适体或抗体。
54.根据权利要求52或53所述的装置，其中所述蛋白质捕获探针以10-9至10-8M、10-8至10-7M、10-7至10-6M、10-6至10-5M、10-5至10-4M、10-4至10-3M或10-3至10-2M的结合亲和力与所述靶蛋白结合。
55.根据权利要求46-54中任一项所述的装置，其中所述装置进一步包含测序模块。
56.根据权利要求55所述的装置，其中所述自动化样品制备模块直接连接或间接连接至所述测序模块。
57.根据权利要求55或56所述的装置，其中所述装置被设置为将所述靶分子从所述自动化样品制备模块递送至所述测序模块。
58.根据权利要求55-57中任一项所述的装置，其中所述测序模块执行核酸测序。
59.根据权利要求58所述的装置，其中所述核酸测序包括单分子实时测序、边合成边测序、连接法测序、纳米孔测序和/或Sanger测序。
60.根据权利要求55-57中任一项所述的装置，其中所述测序模块执行多肽测序。
61.根据权利要求60所述的装置，其中所述多肽测序包括埃德曼降解或质谱。
62.根据权利要求55-57中任一项所述的装置，其中所述测序模块执行单分子多肽测序。
63.根据权利要求55-59中任一项所述的装置，其中所述装置产生具有比使用对照方法产生的平均测序读长更长的平均测序读长的靶核酸。
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