JP2023501224A - サンプル調製のためのシステムおよび方法 - Google Patents
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Abstract
溶解、断片化およびアフィニティー精製を用いて、例えばスコダフォレシスを用いて、サンプルから標的分子を単離または濃縮するための方法およびデバイスが本明細書で提供される。特定の実施形態において、生物学的サンプルから標的分子を濃縮するためのデバイスは、同デバイスが取り外し可能なカートリッジを受承するように構成されたカートリッジハウジングを含む自動サンプル調製モジュールを含むことを特徴とする。いくつかの実施形態において、方法およびデバイスは、標的分子の検出、分析、および/または配列決定をさらに含む。
Description
本発明は、サンプル調製のためのシステムおよび方法に関する。
目的の分子を精製する、分離する、または集中させるための1つのメカニズムは、Synchronous Coefficient Of Drag Alteration(抗力変化の同期係数)(または「SCODA」)に基づく精製と呼ばれている。いくつかの実施形態ではスコダフォレシス(scodaphoresis)として知られているSCODAは、粒子を精製する、分離する、または集中させるために適用され得るアプローチである。
SCODAベースの輸送は、時間変動する駆動力であって、それはそうでなければ真運動を与えない駆動力と、時間変動する抗力(または移動度)変動とを、同期させることにより、目的の分子の真運動を作り出すために使用される。駆動力の印加と周期的な移動度変動が適切に調整されている場合、時間平均力がゼロであっても、結果は真運動となる。駆動場および移動度変動場の時間的かつ空間的配置を慎重に選択することで、独特の速度場、特に発散がゼロでない速度場を生成することができ、結果として、この輸送方法を粒子の分離、精製および/または集中に利用することが可能である。
本開示の態様は、分析用のサンプルを調製するプロセスおよび/またはサンプル中の1つまたは複数の標的分子を分析する(例えば、配列決定によって分析する)プロセスで使用するための方法、組成物、システムおよび/またはデバイスを提供する。いくつかの実施形態において、標的分子は、核酸(例えば、cDNA、ゲノムDNA、mRNA、ならびにそれらの誘導体およびフラグメントを含むがこれらに限定されない、DNAまたはRNA)である。いくつかの実施形態において、標的分子は、タンパク質またはポリペプチドである。
いくつかの態様において、本開示は、生物学的サンプルから標的分子を濃縮するためのデバイスを提供し、同デバイスは、取り外し可能なカートリッジを受承するように構成されたカートリッジハウジングを含む自動サンプル調製モジュールを含む。
いくつかの実施形態において、取り外し可能なカートリッジは、単回使用カートリッジまたは複数回使用カートリッジである。いくつかの実施形態において、取り外し可能なカートリッジは、生物学的サンプルを受承するように構成されている。いくつかの実施形態において、取り外し可能なカートリッジは、生物学的サンプルをさらに含む。いくつかの実施形態において、カートリッジは、サンプル調製プロセスで使用される流体を収容および/または輸送するように構成された1つまたは複数のマイクロ流体チャネルを含む。いくつかの実施形態において、カートリッジは、1つまたは複数のアフィニティーマトリックスを含み、各アフィニティーマトリックスは、標的分子に対して結合親和性を有する固定化(immobilized)捕捉プローブを含む。
いくつかの実施形態において、生物学的サンプルは、血液、唾液、喀痰、糞便、尿または頬スワブサンプルである。いくつかの実施形態において、標的分子は標的核酸である。いくつかの実施形態において、標的核酸は、RNAまたはDNA分子である。いくつかの実施形態において、標的分子は標的タンパク質である。
いくつかの実施形態において、固定化捕捉プローブはオリゴヌクレオチド捕捉プローブであり、オリゴヌクレオチド捕捉プローブは標的核酸に対して少なくとも部分的に相補的である配列を含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド捕捉プローブは、標的核酸に対して少なくとも80%、90%、95%、または100%相補的である配列を含む。いくつかの実施形態において、デバイスまたはカートリッジは、下流配列決定(downstream sequencing)用途のための平均リード長であって制御方法を使用して作製される平均リード長よりも長い平均リード長を有する標的核酸を作製する。
いくつかの実施形態において、固定化捕捉プローブは、標的タンパク質に結合するタンパク質捕捉プローブである。いくつかの実施形態において、タンパク質捕捉プローブは、アプタマーまたは抗体である。いくつかの実施形態において、タンパク質捕捉プローブは、10-9~10-8M、10-8~10-7M、10-7~10-6M、10-6~10-5M、10-5~10-4M、10-4~10-3M、または10-3~10-2Mの結合親和性で標的タンパク質に結合する。
いくつかの実施形態において、デバイスは、配列決定モジュールをさらに含む。いくつかの実施形態において、自動化サンプル調製モジュールは、配列決定モジュールに直接または間接的に連結されている。いくつかの実施形態において、デバイスは、自動化サンプル調製モジュールから配列決定モジュールに標的分子を送達するように構成されている。
いくつかの実施形態において、配列決定モジュールは核酸の配列決定を実行する。いくつかの実施形態において、核酸の配列決定は、単一分子リアルタイム配列決定、合成による配列決定、ライゲーションによる配列決定、ナノポア配列決定、および/またはサンガー配列決定を含む。
いくつかの実施形態において、配列決定モジュールはポリペプチドの配列決定を実行する。いくつかの実施形態では、ポリペプチド配列決定は、エドマン分解または質量分析を含む。いくつかの実施形態において、配列決定モジュールは単一分子ポリペプチドの配列決定を実行する。
いくつかの態様において、本開示は、生物学的サンプルから標的分子を精製するための方法を提供し、この方法は、(i)生物学的サンプルを溶解すること、(ii)(i)の溶解したサンプルを断片化すること、(iii)標的分子(例えば、標的核酸または標的タンパク質)に対して結合親和性を有する固定化捕捉プローブを含むアフィニティーマトリックスを用いてサンプルを濃縮し、それによって標的分子を精製すること、を含む。
いくつかの実施形態において、固定化捕捉プローブはオリゴヌクレオチド捕捉プローブであり、オリゴヌクレオチド捕捉プローブは標的核酸に対して少なくとも部分的に相補的である配列を含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド捕捉プローブは、標的核酸に対して少なくとも80%、90%、95%、または100%相補的である配列を含む。その他の実施形態において、固定化捕捉プローブは、標的タンパク質に結合するタンパク質捕捉プローブである。タンパク質捕捉プローブは、アプタマーまたは抗体であり得る。いくつかの実施形態において、タンパク質捕捉プローブは、10-9~10-8M、10-8~10-7M、10-7~10-6M、10-6~10-5M、10-5~10-4M、10-4~10-3M、または10-3~10-2Mの結合親和性で標的タンパク質に結合する。
いくつかの実施形態において、標的分子を精製するための方法のステップ(i)は、電解法、酵素法、界面活性剤に基づく方法、および/または機械的ホモジナイゼーションを含む。いくつかの実施形態において、ステップ(i)は、連続して実施される複数の溶解方法を含む。サンプルは、溶解後かつ標的分子を精製するための方法のステップ(ii)または(iii)の前に精製することができる。いくつかの実施形態において、ステップ(ii)は、機械的、化学的および/または酵素的断片化法を含む。サンプルは、断片化後かつステップ(iii)の前に精製することができる。いくつかの実施形態において、ステップ(iii)は、電気泳動法(例えば、アフィニティーSCODA、FIGE、またはPFGE)を使用して濃縮することを含む。
いくつかの実施形態において、生物学的サンプルから標的分子を精製するための方法は、(iv)標的分子を検出することをさらに含む。いくつかの実施形態において、ステップ(iv)は、吸光度法、蛍光法、質量分析法、および/または配列決定法を使用する検出を含む。
いくつかの実施形態において、生物学的サンプルは、血液、唾液、喀痰、糞便、尿または頬のサンプルである。生物学的サンプルは、ヒト、非ヒト霊長類、齧歯動物、イヌ、ネコ、またはウマからのものであり得る。いくつかの実施形態において、生物学的サンプルは、細菌細胞または細菌細胞の集団を含む。
さらなる態様において、本開示は、生物学的サンプルから標的分子を濃縮するためのデバイスを提供し、同デバイスは、自動化サンプル調製モジュールを含み、同自動化サンプル調製モジュールは以下のステップ:(i)生物学的サンプルを受承するステップ;(ii)生物学的サンプルを溶解するステップ;(iii)(ii)のサンプルを断片化するステップ;および(iv)標的分子(例えば、標的核酸またはタンパク質)に対する結合親和性を有する固定化捕捉プローブを含むアフィニティーマトリックスを用いてサンプルを濃縮するステップ、を実行する。いくつかの実施形態において、デバイスはさらに配列決定モジュール(例えば、サンプル調製モジュールに直接または間接的に連結されている配列決定モジュール)を含む。
いくつかの実施形態において、デバイスは、制御方法を使用して作製される平均配列決定リード長(average sequencing read-length)よりも長い平均配列決定リード長を有する標的核酸を作製する。
上記の例示的な態様および実施形態に加えて、さらなる態様および実施形態は、図面を参照し、以下の詳細な説明を検討することによって明らかになるであろう。
例示的な実施形態は、図面の参照図に示されている。本明細書に開示される実施形態および図面は、限定的ではなく例示的であると見なされるべきであることが意図されている。
以下の説明を通じて、当業者により徹底した理解を与えるために、特定の詳細が記載されている。しかしながら、よく知られている要素は、本開示を不必要に不明瞭にすることを避けるために、詳細に示されたり説明されたりしていない場合がある。したがって、本明細書および図面は、制限的な意味ではなく、例示的な意味でみなされるべきである。
本明細書で使用される場合、用語「示差的に修飾された(differentially modified)」は、異なる方法で化学的に修飾された同種の2つの分子を意味する。示差的に修飾された分子の非限定的な例としては、メチル化されたタンパク質または核酸が、非メチル化分子と比較して示差的に修飾される例;(例えば、癌性または前癌性細胞で生じ得るように)高メチル化または低メチル化された核酸が、健康な細胞中の核酸と比較して示差的に修飾される例;アセチル化されたヒストンが非アセチル化ヒストンと比較して示差的に修飾される例;などを挙げることができる。
いくつかの実施形態において、示差的に修飾される分子は、分子の1つに化学修飾が存在することを除いて、互いに同一である。いくつかの実施形態において、示差的に修飾される分子は、互いに非常に類似しているが、同一ではない。例えば、分子が核酸またはタンパク質である場合、生体分子の1つは、示差的に修飾された分子と少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を共有することができる。
SCODA
SCODAは、ある媒体中の粒子に力を加える時間変動駆動場成分(time-varying driving field component)と、媒体中の粒子の移動度に影響を与える時間変動移動度変動場成分(time-varying mobility-altering field component)とを組み合わせて提供することを含むことができる。移動度変動場成分は、粒子の時間平均的な真運動(net motion)を提供するように、駆動場成分と相関される。SCODAは、選択された粒子を集束領域に向かって移動させるために適用され得る。
SCODAは、ある媒体中の粒子に力を加える時間変動駆動場成分(time-varying driving field component)と、媒体中の粒子の移動度に影響を与える時間変動移動度変動場成分(time-varying mobility-altering field component)とを組み合わせて提供することを含むことができる。移動度変動場成分は、粒子の時間平均的な真運動(net motion)を提供するように、駆動場成分と相関される。SCODAは、選択された粒子を集束領域に向かって移動させるために適用され得る。
本明細書において電気泳動SCODAとして記載されるSCODAに基づく精製の一実施形態において、時間変動する電場は、周期的な駆動力を提供するとともに、電場強度に依存する媒体中の移動度を有する分子、例えば核酸分子の抗力(または同等的に移動度)を変化させる。例えば、DNA分子は、アガロースやポリアクリルアミドなどのふるいマトリックス中を移動しながら、印加された電場の大きさに依存する移動度を有する。分離マトリックス(例えばアガロースやポリアクリルアミドゲル)に適切な周期的電場パターンを印加すると、電場に移動度が依存するゲル内のすべての分子に対して収束速度場(convergent velocity field)を発生させることが可能である。この電場依存性の移動度は、反復するDNA分子とふるいマトリックスとの間の相互作用の結果であり、高い構造エントロピーと高い電荷質量比を持つ荷電分子がふるいマトリックス中を移動するときの一般的な特徴である。核酸は、高い構造エントロピーと高い電荷質量比の両方を有する、ほとんどの生物学的サンプルに存在する唯一の分子である傾向があるため、電気泳動SCODAに基づく精製は核酸に対して高い選択性を示すことが示されている。
サンプル中の特定の生体分子を検出する能力は、病気の診断と治療の分野で幅広く応用されている。研究により、様々な疾患と関連する数多くのバイオマーカーが明らかにされつつある。バイオマーカーの例としては、遺伝子変異、特定のタンパク質の有無、特定のタンパク質の発現量の上昇または低下、特定のRNAのレベルの上昇または低下、修飾された生体分子の存在、などが挙げられる。バイオマーカーおよびバイオマーカーを検出するための方法は、癌、疾患、感染症、臓器不全などを含む様々な疾患の診断、予後、治療のモニタリングに有用である可能性がある。
インビボにおける生体分子の示差的な修飾は、発生や疾患の進行を含む多くの生物学的プロセスにおいて重要な特徴である。示差的修飾の一例として、DNAメチル化が挙げられる。DNAのメチル化は、核酸にメチル基を付加することを含む。例えば、メチル基はシトシンのピリミジン環の5’位に付加される。真核生物では、CpGアイランドにおけるシトシンのメチル化は、遺伝子発現の長期的な制御のためによく利用されている。メチル化パターンの異常は、癌を含む多くのヒトの病気に関与していると言われている。DNAはまた、アデニンプリン環の6番目の窒素でメチル化されることがある。
分子の化学修飾、例えばメチル化、アセチル化、その他の化学修飾は、標的分子と標的分子を結合する薬剤の結合親和性を変化させることがある。例えば、シトシン残基のメチル化は、メチル化されていない二本鎖と比較して、ハイブリダイゼーションの結合エネルギーを増加させる。その効果は小さい。以前の研究では、両鎖がメチル化されていない二本鎖と両鎖がメチル化された二本鎖とを比較した場合、16ヌクレオチド配列のメチル化部位あたり約0.7℃の二本鎖融解温度の上昇が報告されている。
アフィニティーSCODA(Affinity SCODA)
スコダフォレシス(SCODAphoresis)は、ゲル中に生体分子を注入し、核酸または目的とするその他の生体分子をゲルの中心に優先的に集中させる(concentrating)方法である。SCODAは、例えば、DNA、RNA、その他の分子に適用することができる。集中(concentration)後、精製された分子はさらなる解析のために除去されてもよい。SCODAphoresisの1つの具体的な実施形態では、目的の生体分子に特異的なアフィニティーSCODA結合部位がゲル内に固定化されてもよい。そうすることで、特異的結合部位に結合する生体分子に対して電場に対する非線形運動応答を発生させることができるかもしれない。アフィニティーSCODAの具体的な応用の1つは配列特異的SCODAである。ここでは、オリゴヌクレオチドがゲル内に固定化され、結合したオリゴヌクレオチドに相補的なDNA分子のみを集中させることができる。相補的でないその他のDNA分子は、弱く集束するか、あるいは全く集束しないので、小さなDCバイアスを印加することによりゲルから洗い落とすことができる。
スコダフォレシス(SCODAphoresis)は、ゲル中に生体分子を注入し、核酸または目的とするその他の生体分子をゲルの中心に優先的に集中させる(concentrating)方法である。SCODAは、例えば、DNA、RNA、その他の分子に適用することができる。集中(concentration)後、精製された分子はさらなる解析のために除去されてもよい。SCODAphoresisの1つの具体的な実施形態では、目的の生体分子に特異的なアフィニティーSCODA結合部位がゲル内に固定化されてもよい。そうすることで、特異的結合部位に結合する生体分子に対して電場に対する非線形運動応答を発生させることができるかもしれない。アフィニティーSCODAの具体的な応用の1つは配列特異的SCODAである。ここでは、オリゴヌクレオチドがゲル内に固定化され、結合したオリゴヌクレオチドに相補的なDNA分子のみを集中させることができる。相補的でないその他のDNA分子は、弱く集束するか、あるいは全く集束しないので、小さなDCバイアスを印加することによりゲルから洗い落とすことができる。
SCODAに基づく輸送は、まず粒子の周期的な運動を誘発する時間変動する強制(すなわち駆動)場を適用し、この強制場に、粒子の抗力(または同等的に移動度)を周期的に変化させる時間変動する摂動場(すなわち移動度変動場)を重ね合わせることによる、媒体を通って粒子を移動させる一般的な技術である。移動度変動場の適用は、粒子が強制サイクルの他の部分よりも強制サイクルのある部分の間にさらに移動するように、強制場の適用とともに調整される。具体的には、時間的に変動する抗力係数ζ(t)(すなわち、変動移動度)で外力F(t)によって駆動される粒子のドリフト速度υ(t)は、次式で与えられる。
外力および抗力係数が:
および
となるように周期的に変動する場合、1回の完全なサイクルにわたる平均したドリフト速度は次式で与えられる。
粒子の抗力(すなわち移動度)を外力と同じ周波数で変動させることにより、時間平均した強制力をゼロにして真のドリフトを誘導することができる。式[4]の結果は、1次元または2次元において収束速度場を生成するために、時間的および空間的に変動する駆動力および抗力係数の適切な選択と共に使用することができる。時間的に変動する抗力係数および駆動力は、標的分子と1つまたは複数の非標的分子との間の差が非常に小さい場合であっても、特定の分子のみを特異的に集中させる(すなわち優先的に集束させる)ために実際のシステムにおいて利用することができ、例えば、同分子は、1つまたは複数の位置で示差的に修飾された分子、または1つまたは複数の塩基で配列が異なる核酸である。
一次元SCODA集中(Concentration)
時間的に周期的に変動する空間的に一様な駆動力と、時間的にも空間的にも変動する抗力係数とを組み合わせることによって、一次元の収束速度場を生成することが可能である。印加された電場Eの影響下で移動する移動度μの荷電粒子の場合を考える。その速度は次の式で与えられる。
時間的に周期的に変動する空間的に一様な駆動力と、時間的にも空間的にも変動する抗力係数とを組み合わせることによって、一次元の収束速度場を生成することが可能である。印加された電場Eの影響下で移動する移動度μの荷電粒子の場合を考える。その速度は次の式で与えられる。
電場が:
となるように周期的に変動する場合、同じ周期で変動する領域-L.ltoreq.x.ltoreq.L内に直線性移動度勾配が存在する:
ここで、kは移動度変動の振幅と考えることができ、SCODAに基づく粒子の分離を達成することができる。
印加された外部電場の影響下で溶液中を移動する荷電分子の移動度勾配を確立する方法はいくつかある。例えば、上記のように時間変動電場を設ける方法、温度勾配を設ける方法、pH勾配を設ける方法、光の有無で構造変化を起こす分子に対して光勾配を設ける方法等がある。
印加された外部電場の影響下で溶液中を移動する荷電分子の移動度勾配を確立する方法はいくつかある。例えば、上記のように時間変動電場を設ける方法、温度勾配を設ける方法、pH勾配を設ける方法、光の有無で構造変化を起こす分子に対して光勾配を設ける方法等がある。
式[7]の移動度勾配を与えると、速度は次のようになる。
完全な1サイクル全体にわたるこの速度の時間平均を取ると、次のようなドリフト速度が得られる。
この速度場はx=0で平衡点を有し、kE0cos(φ)の符号に依存して収束または発散させることができる。正の値の場合、速度場は発散し、負の値の場合、収束する。図1は、kE0cos(φ)<0の場合の速度をxの関数としてプロットしたものである。図1の矢印はドリフトの方向を示している。-Lと+Lとの間のすべての粒子は、x=0でゼロ速度点に向かってドリフトする。移動度は-Lと+Lとの間でのみ変動するため、領域外では時間平均速度はゼロである。
図1に示す実施形態において、速度は、xの負の値に対しては正の値をとり、xの正の値に対しては逆になり、その結果、領域内のすべての粒子は、速度がゼロであるx=0に向かってドリフトすることになる。
二次元SCODA
式[10]の結果を二次元に展開するために、いくつかの実施形態では、回転電場が駆動電場として使用され、回転移動度勾配が確立される。
式[10]の結果を二次元に展開するために、いくつかの実施形態では、回転電場が駆動電場として使用され、回転移動度勾配が確立される。
一次元の場合と同様に{(υ)の右矢印}=μ{(E)の右矢印}となり、式[9]と同様の積分を行うことにより、二次元の時間平均ドリフト速度を求めることができる。
この結果、ドリフト速度は次のような式になる。
極座標に書き換えて単純化すると次のようになる:
この結果は、2次元におけるSCODAの多くの側面を強調する。これは、時間平均した強制力がゼロであるにもかかわらず、r=0である媒体(medium)中の点を除くすべての場所で非ゼロのドリフトが発生することを示している。ドリフトの性質は2つの信号の相対位相φに依存し、集束(focusing)の強さ(半径方向、{circumflex over(r)},term)は電気駆動場振動と移動度振動との間の位相遅れの余弦に比例することを示している。位相角が0°の場合、純粋に集束した速度場が存在し、領域の中心に向かって真のドリフトが発生する。位相角が180°の場合、速度場はゲルの中心から離れた真のドリフトを伴う純粋な脱集束(de-focusing)である。位相角が90°と270°の場合、速度場は純粋に回転場である。中間の角度では、得られる速度場は、回転成分と集束成分の両方の組み合わせとなる。効率的な集束を達成するために、いくつかの実施形態では、駆動力と移動度変動との間の位相差は、可能な限り小さい。
時間変動移動度場の生成
これまでのSCODAに基づく集中の適用では、アガロースまたはポリアクリルアミドのようなふるいマトリックス中のDNAの移動度が印加電場の大きさに依存するという事実を使用した。いくつかの用途では、200塩基以下の短い核酸、核酸以外の生体分子(タンパク質やポリペプチドなど)など、通常は電場に強く依存しない移動度を有する分子が対象となることがある。いくつかの用途において、サンプル中の核酸のサブセットのみを精製すること、例えば、ゲノムDNAのサンプルから単一の遺伝子を精製または検出すること、または同じ基本構造を有する示差的に修飾された分子(例えば、同じ配列を有する非メチル化DNA)から化学的に修飾された分子(例えばメチル化DNA)を精製または検出することなど、が望ましい場合がある。
これまでのSCODAに基づく集中の適用では、アガロースまたはポリアクリルアミドのようなふるいマトリックス中のDNAの移動度が印加電場の大きさに依存するという事実を使用した。いくつかの用途では、200塩基以下の短い核酸、核酸以外の生体分子(タンパク質やポリペプチドなど)など、通常は電場に強く依存しない移動度を有する分子が対象となることがある。いくつかの用途において、サンプル中の核酸のサブセットのみを精製すること、例えば、ゲノムDNAのサンプルから単一の遺伝子を精製または検出すること、または同じ基本構造を有する示差的に修飾された分子(例えば、同じ配列を有する非メチル化DNA)から化学的に修飾された分子(例えばメチル化DNA)を精製または検出することなど、が望ましい場合がある。
電場強度に強く依存する移動度を持たない分子(すなわち、電場強度の変動に基づくkの値が小さい分子)のSCODAベースの精製は、集中されるべき分子に親和性を有するSCODAマトリックスを用いることによって達成することができる。アフィニティーマトリックスは、媒体中で標的分子(すなわちプローブ)に結合親和性を有する薬剤を固定化することによって生成することができる。そのようなマトリックスを使用して、標的分子がアフィニティーマトリックスを通って移動するときに同標的分子の全体的な移動度を低下させる効果を伴って、標的分子がアフィニティーマトリックスに一時的に結合する操作条件を選択することができる。これらの一時的な相互作用の強さは時間とともに変動し、これは、目的の標的分子の移動度を変動させる効果を有する。したがって、SCODAドリフトを発生させることができる。この技術はアフィニティーSCODAと呼ばれ、一般に、マトリックスに親和性を有する任意の標的分子に適用可能である。
アフィニティーSCODAは、配列含有量に基づいて、単一ヌクレオチド分解能(resolution)で核酸を選択的に濃縮することができる。さらに、アフィニティーSCODAは、同一のDNA配列を有するが、メチル化のような微妙に異なる化学修飾を有する分子に対して異なるk値をもたらすことができる。したがって、アフィニティーSCODAは、所与のプローブへの結合エネルギーが微妙に異なる分子を濃縮する(すなわち優先的に集束させる)ために使用することができ、具体的には、メチル化、非メチル化、過剰メチル化、または低メチル化配列を濃縮するために使用することができる。
アフィニティーSCODAを実施するために使用することができる例示的な媒体としては、目的の分子がそれを通って移動することができ、アフィニティー剤(affinity agent)を固定化してアフィニティーマトリックスを提供することができる任意の媒体が挙げられる。いくつかの実施形態において、ポリアクリルアミドゲル、アガロースゲルなどを含むポリマーゲルが使用される。いくつかの実施形態において、微細加工/微小流体マトリックスが使用される。
移動度変動場を提供するために変化させることができる例示的な操作条件には、温度、pH、塩分濃度、変性剤の濃度、触媒の濃度、二本鎖を物理的に引き離すための電場の印加などが含まれる。
アフィニティーマトリックスを提供するためにマトリックス上に固定化することができる例示的なアフィニティー剤としては、目的の核酸配列に相補的な配列を有する核酸、示差的に修飾された分子に対して異なる結合親和性を有するタンパク質、修飾されたまたは修飾されていない分子に特異的な抗体、修飾されたまたは修飾されていない分子に特異的な核酸アプタマー、修飾されたまたは修飾されていない分子に優先的に結合する他の分子または化学剤などが挙げられる。
アフィニティー剤は、任意の適切な方法で媒体(medium)内に固定化することができる。例えば、アフィニティー剤がオリゴヌクレオチドである場合、オリゴヌクレオチドは、媒体に共有結合されてもよく、アクリダイト修飾オリゴヌクレオチドは、ポリアクリルアミドゲルに直接取り込まれてもよく、オリゴヌクレオチドは、ビーズまたは媒体内に物理的に取り込まれた他の構築物などに共有結合されてもよい。
アフィニティー剤がタンパク質または抗体である場合、いくつかの実施形態において、タンパク質は、物理的に媒体内に取り込まれる(例えば、タンパク質を直接アガロースまたはポリアクリルアミドゲルに流し込むことができる)、媒体に共有結合される(例えば、タンパク質をアガロースゲルに結合させるための臭化シアンの使用を介して)、媒体内に取り込まれるビーズに共有結合される、媒体に直接結合される第2のアフィニティー剤または媒体内に取り込まれるビーズに結合される(例えば、NTA-アガロースに結合したヘキサヒスチジンタグ)、などであり得る。
アフィニティー剤がタンパク質である場合には、アフィニティーマトリックスを調製する条件およびサンプルをロードする条件は、タンパク質が変性しないように制御されるべきである(例えば、温度はタンパク質を変性させると思われるレベル以下に維持されるべきであり、また、サンプル中または媒体の調製またはSCODA集束の実施に使用される緩衝液中の変性剤の濃度は、タンパク質を変性させると思われるレベル以下に維持されるべきである。)。
アフィニティー剤が目的の分子と相互作用する小分子である場合、アフィニティー剤は、任意の適切な方法で媒体に共有結合され得る。
アフィニティーSCODAの1つの例示的な実施形態は、配列特異的SCODAである。配列特異的SCODAにおいて、標的分子は、特定の配列を有する核酸分子であるか、またはそれを含み、アフィニティーマトリックスは、標的核酸分子に相補的な固定化オリゴヌクレオチドプローブを含む。いくつかの実施形態において、配列特異的SCODAは、サンプルから特定の核酸配列を分離するため、およびその特定の核酸配列がサンプル内で示差的に修飾されるかどうかを分離および/または検出するための両方に使用される。いくつかのそのような実施形態において、アフィニティーSCODAは、核酸配列および示差的に修飾された核酸配列の両方が、SCODA場の適用によって集中されるような条件下で実施される。望ましくない配列を有する核酸を含む汚染分子は、SCODA集束時にアフィニティーマトリックスから洗浄することができる。その後、SCODA集束場と連動して洗浄バイアスを印加し、固定化オリゴヌクレオチドプローブへの結合エネルギーが高い分子を優先的に集束することにより、後述のように示差的修飾核酸分子を分離することが可能である。
アフィニティーSCODAの1つの例示的な実施形態は、配列特異的SCODAである。配列特異的SCODAにおいて、標的分子は、特定の配列を有する核酸分子であるか、またはそれを含み、アフィニティーマトリックスは、標的核酸分子に相補的な固定化オリゴヌクレオチドプローブを含む。いくつかの実施形態において、配列特異的SCODAは、サンプルから特定の核酸配列を分離するため、およびその特定の核酸配列がサンプル内で示差的に修飾されるかどうかを分離および/または検出するための両方に使用される。いくつかのそのような実施形態において、アフィニティーSCODAは、核酸配列および示差的に修飾された核酸配列の両方が、SCODA場の適用によって集中されるような条件下で実施される。望ましくない配列を有する核酸を含む汚染分子は、SCODA集束時にアフィニティーマトリックスから洗浄することができる。その後、SCODA集束場と連動して洗浄バイアスを印加し、固定化オリゴヌクレオチドプローブへの結合エネルギーが高い分子を優先的に集束することにより、後述のように示差的修飾核酸分子を分離することが可能である。
アフィニティーマトリックス中の標的の移動度
アフィニティーマトリックス中の標的と固定化プローブとの間の相互作用は、一次反応速度論によって説明することができる:
アフィニティーマトリックス中の標的と固定化プローブとの間の相互作用は、一次反応速度論によって説明することができる:
ここで、[T]は標的、[P]は固定化プローブ、[T.P]はプローブ-標的二本鎖、kfは順方向(ハイブリダイゼーション)反応速度、krは逆方向(解離)反応速度である。標的の移動度は、それがマトリックスに結合されている間はゼロであるので、標的の有効移動度は、マトリックス上に固定化されている標的の相対量によって減少する。
ここでμ0は非結合標的の移動度である。順方向反応速度6および非結合標的の濃度よりも有意に高い固定化プローブ濃度に対する合理的な推定値を使用すると、ハイブリダイゼーションの時定数は1秒よりかなり小さくなると仮定することができる。移動度変動場の周期が1秒より長く維持されている場合、解析の目的上、結合速度(binding kinetics)は高速であると仮定することができ、式[17]は反応速度で書き換えることが可能である:
式[18]に[20]を挿入して単純化すると、次のようになる。
この結果から、順方向または逆方向の反応速度を変更することにより、移動度を変動させることができることがわかる。順方向または逆方向の反応速度の変更は、例えば、温度、塩分濃度、pH、変性剤の濃度、触媒の濃度を調整することによって、あるいは外部電場によって二本鎖を物理的に引き離すことによって、など、多くの異なる方法で達成することができる。以下により詳細に説明される1つの例示的な実施形態において、アフィニティーマトリックスを通って移動する標的分子の移動度を変更するための機構は、マトリックス温度の制御である。
解析を容易にするために、いくつかの単純化した仮定を立てることが有効である。まず、標的分子に対して固定化プローブが多数存在すると仮定する。このことが真実である限り、たとえ標的分子の大部分がプローブに結合したとしても、遊離プローブの濃度[P]はあまり変化せず、[P]は一定であると仮定することができる。また、順方向反応速度kfは温度に依存しないと仮定する。順方向反応速度は温度に依存するので、これは厳密には当てはまらない。固定化プローブまたは標的分子中の二次構造は、温度依存性の順方向反応速度をもたらすことができる。しかしながら、二本鎖の融解温度付近の温度範囲で動作する実施形態では、逆方向反応速度は温度に対する指数関数的依存性を有し、順方向反応速度ははるかに弱い温度依存性を有し、融解温度付近の30℃の範囲にわたって約30%変化する。さらに、標的配列には重要な二次構造がないと仮定している。この最終的な仮定は常に正しいとは限らないが、この最初の解析を単純化するものである。
逆方向反応速度の温度依存性を決定するために、結合解除の動力学(unbinding kinetics)についてアレニウスモデルを仮定した。この仮定はナノ細孔力分光法における最近の研究によって正当化されている。
ここで、Aは経験的に導かれた定数、ΔGはプローブと標的との結合エネルギー、kbはボルツマン定数、Tは温度である。これを[21]に挿入し、自由エネルギーΔGをΔH-TΔSと書き換え、定数項を集めると、移動度は次のように書き換えることができる。
式[23]は、シグモイド移動度温度依存性を示す。この曲線の形状は、図2に示すとおりである。低温では、移動度はほぼゼロである。これは、熱励起が標的分子をアフィニティーマトリックスから追い出すのに十分でない領域である。高温では、熱エネルギーが結合エネルギーより大きいため、標的分子は非結合移動度で移動する。これらの両極端の間には、温度の小さな変化が移動度の大きな変化をもたらす温度範囲が存在する。これが、移動度変動パラメータとして温度を利用するアフィニティーSCODAの実施形態のための動作領域である。
配列に基づいて核酸を分離するために使用されるアフィニティーSCODA、すなわち配列特異的SCODAの実施形態では、この温度範囲は、プローブ-標的二本鎖の融解温度付近に存在する傾向がある。式[10]および[16]は、集中の速度(speed of concentration)が、SCODAの1サイクル中に移動度がどの程度変化するかの尺度であるkに比例することを述べている。移動度対温度曲線の勾配が最も急であるプローブ-標的二本鎖の融解温度付近で動作することは、温度が移動度変更パラメータとして使用される実施形態において、SCODAサイクル中の所与の温度スイングに対してkを最大にする。
いくつかの実施形態において、アフィニティーSCODAは、標的分子およびアフィニティー剤の融解温度の約±20℃以内、約±10℃以内、約±5℃以内、または約±2℃以内で変動するSCODA集束場の印加中に最大振幅を有する温度勾配の中で実施されてもよい。
式[7]の時間依存性移動度を式[23]の温度依存性移動度および時間依存性温度で置き換えることによって、アフィニティーSCODAを一次元で記載することが可能である:
ここで、温度はプローブ標的の融解温度Tm付近で振動し(oscillates)、Taはx=±Lにおける温度振動の最大振幅である。ドリフト速度υd=μEの解析式を温度の関数として求めるために、式[23]のTaylor展開をTm付近で行う:
これは次のように書き直すことができる:
ここでは、Taylor展開における第1項を定数αに収集した。移動度の式に[24]および[26]を組み合わせると、[7]に類似する式が得られる。
式[27]は、kを単純に次式に置き換えることによって、一次元および二次元の場合の時間平均ドリフト速度を求めるために使用することができる。
ドリフト速度は一次元では:
で与えられ、二次元では:
で与えられる。この結果は、固定化プローブで官能化された二次元ゲル(すなわちアフィニティーマトリックス)の場合、回転する温度勾配と回転する双極子電場とを組み合わせることによって、すべての標的分子がゲルの中央領域に向かって強制され、それにより固定化プローブに結合する標的分子が集中されるべきであることを示す。
アフィニティーSCODAによる分子分離
いくつかの実施形態において、アフィニティーSCODAは、固定化プローブに対して異なる結合親和性を有する2つの類似の分子(例えば、示差的に修飾された、または1つまたは少数の位置でのみ配列が異なる同一の分子)を分離するために使用される。固定化プローブに対する結合エネルギーがそれぞれ異なる2つの分子種から始めて、これらの2つの分子種は、SCODA集束を生成するために使用される駆動および移動度変動場に洗浄推進力(washing motive force)を重ね合わせることによって分離され、固定化プローブに対するより低い結合親和性を有する分子の真運動を提供する(すなわち、固定化プローブに対してより高い結合親和性を有する分子は、SCODA集束場の印加中に優先的に集束される)。いくつかの実施形態において、洗浄力は、本明細書ではDCバイアス(bias)と呼ばれる、小さな印加DC力である。
いくつかの実施形態において、アフィニティーSCODAは、固定化プローブに対して異なる結合親和性を有する2つの類似の分子(例えば、示差的に修飾された、または1つまたは少数の位置でのみ配列が異なる同一の分子)を分離するために使用される。固定化プローブに対する結合エネルギーがそれぞれ異なる2つの分子種から始めて、これらの2つの分子種は、SCODA集束を生成するために使用される駆動および移動度変動場に洗浄推進力(washing motive force)を重ね合わせることによって分離され、固定化プローブに対するより低い結合親和性を有する分子の真運動を提供する(すなわち、固定化プローブに対してより高い結合親和性を有する分子は、SCODA集束場の印加中に優先的に集束される)。いくつかの実施形態において、洗浄力は、本明細書ではDCバイアス(bias)と呼ばれる、小さな印加DC力である。
一次元の場合、洗浄力またはバイアス力として小さなDC力を印加すると、電場は次のようになる:
ここで、Ebは印加されたDCバイアスである。最終ドリフト速度は、バイアス場の強度に比例する一定速度でSCODA集束速度に重畳される。
このドリフト速度は、バイアスの方向に応じて、最終集束位置(focus location)を左または右に移動させる傾向がある。このバイアスが集束点を中心からずらす量は、標的分子とプローブ分子との間の相互作用の強さに依存する。したがって、標的-プローブ相互作用の示差的強度は、2つの非常に類似した種の分子分離を可能にする機構として働くことができる。
固定化プローブに対して異なる結合親和性を有する2つの分子を考える。式[23]におけるプローブ-標的結合エネルギーΔGを減少させると、図3に示されるように、移動度対温度の曲線が温度スケールで左側にシフトするようになる。高結合エネルギー標的の移動度は右の曲線で示され、低結合エネルギー標的の移動度は左の曲線で示される。
この例示的な実施形態におけるSCODAシステムが、図3における高結合エネルギー分子に対して最適な集束温度Tmで操作される場合、低結合エネルギー分子の移動度はより高くなり、より弱い温度依存性を有することになる。式[32]によれば、結合エネルギーの低い分子ほどμ(Tm)の値は大きくなり、aの値は小さくなる。これは、より低い結合エネルギー分子は、DCバイアス下でより低いSCODAドリフト速度およびより高い速度を有することを意味し、その結果、図4に示されるように、高結合エネルギー分子とは異なる最終集束位置となる。
図4は、一実施形態による、固定化プローブについての2つの異なる結合エネルギーを有する分子に対する印加DCバイアスの影響を示す。実線の曲線は、破線の曲線で表される分子よりも結合プローブに対する結合エネルギーが低い標的分子のドリフト速度を表している。最終集束位置は、ドリフト速度がゼロに等しい点である。実線で示される分子は、破線で示される分子と比較して、より低いSCODAドリフト速度およびより高いDC速度の両方を有する。SCODA集束をDCバイアスと組み合わせると、低結合エネルギー分子はx=0での非バイアス集束点から遠く離れて集束し、各分子種に1つずつの2つの別々の集束点を生じる。高結合エネルギー分子の最終集束位置は、符号30によって示される。低結合エネルギー分子の最終集束位置は、符号32によって示される。
二次元の場合は一次元の場合と同じであり、印加された洗浄バイアスからの重畳速度は最終集束点を洗浄バイアスの方向に中心から外れて移動させる。
いくつかの実施形態において、分離されるべき分子間の結合エネルギーの差が十分に大きく、十分に高い洗浄バイアスが印加される場合、低結合エネルギー分子は、アフィニティーマトリックスから洗い流され、一方、より高い結合エネルギーを有する分子は、アフィニティーマトリックス内に保持され、SCODA集束場の印加によってアフィニティーマトリックス内の集束位置で捕捉され得る(すなわち優先的に集束される)。
いくつかの実施形態において、分離されるべき分子間の結合エネルギーの差が十分に大きく、十分に高い洗浄バイアスが印加される場合、低結合エネルギー分子は、アフィニティーマトリックスから洗い流され、一方、より高い結合エネルギーを有する分子は、アフィニティーマトリックス内に保持され、SCODA集束場の印加によってアフィニティーマトリックス内の集束位置で捕捉され得る(すなわち優先的に集束される)。
時間変動温度勾配の生成
移動度変動場として温度の変化を使用するアフィニティーSCODAの実施形態は、収束速度場を生成するために周期的に変動する温度勾配を使用することができる。周期的に変動する温度勾配は、例えば、媒体の領域を周期的に加熱および冷却するためのヒータまたは熱電冷却器の使用、媒体の領域を周期的に加熱するための放射加熱の使用、媒体の領域を周期的に加熱するための光または放射の適用、媒体への電場の印加を用いたジュール加熱など、任意の適切な方法で提供することができる。
移動度変動場として温度の変化を使用するアフィニティーSCODAの実施形態は、収束速度場を生成するために周期的に変動する温度勾配を使用することができる。周期的に変動する温度勾配は、例えば、媒体の領域を周期的に加熱および冷却するためのヒータまたは熱電冷却器の使用、媒体の領域を周期的に加熱するための放射加熱の使用、媒体の領域を周期的に加熱するための光または放射の適用、媒体への電場の印加を用いたジュール加熱など、任意の適切な方法で提供することができる。
周期的に変動する温度勾配は任意の適切な方法で確立することができ、それにより、所望の集束スポットから遠く離れた距離にある粒子は、所望の集束スポットから離れる駆動場を印加する時間よりも所望の集束スポットに向かう駆動場を印加する時間の間、より大きな移動度を経験する(すなわち、より高い温度にあり、したがってより遠くに移動する)。いくつかの実施形態では、温度勾配を回転させて、時間変動駆動力の印加と併せて収束速度場を生成する。
いくつかの実施形態において、電場を用いたジュール加熱を用いて温度勾配が提供される。いくつかの実施形態において、温度勾配を提供するべくジュール加熱を提供するために使用される電場は、駆動場を提供する電場と同じである。いくつかの実施形態において、印加される電場の大きさは、アフィニティーマトリックス内に所望の温度勾配を生成するように選択される。
いくつかの実施形態において、ジュール加熱を提供するために、四極電場を使用して空間温度勾配が生成される。いくつかのそのような実施態様において、4つの電極を有する二次元ゲルが提供される。電圧を4つの電極に印加し、それによりゲル中の電場が不均一になり、高電場(結果として高温)および低電場の領域を含むようにする。電場は、高い電場の領域がゲルの中心に向かって負に荷電した分子を押し出す傾向があり、一方、低い電場の領域はゲルの中心からそのような分子を押し出す傾向があるように配向される。いくつかのそのような実施形態において、ジュール加熱によって温度勾配を提供する電場は、ゲル中の分子に駆動力を加える電場でもある。
このような場のパターンの例を図5に示す。図5の電極A、B、CおよびDに印加される電圧は、それぞれ-V、0、0および0である。矢印は負に荷電した分析物分子の速度を表す。色の濃さは電場の強さを表す。電極Aの近くの領域は高い電場強度を有し、電極Cに向かって減少する。電極Aの近くの高電場領域は負に荷電した分子をゲルの中心に向かって押し出す傾向があり、電極B、C、Dの近くの低電場領域は負に荷電した分子をゲルの中心から遠ざける傾向がある。電場が温度勾配も提供する実施形態において、アフィニティーマトリックスは、ジュール加熱により、より高い電場強度の領域でより高温になる。したがって、高い電場強度の領域は、より高い温度の領域と一致し、したがってより高い移動度となる。したがって、電極Aの近くのより高い電場領域の分子は、ゲルの中心に向かってより大きな距離を移動する傾向があり、一方、電極B、C、およびDの近くのより低い電場領域の分子は、より低い移動度を有し(より低い温度にある)、ゲルの中心からほんの短い距離だけ移動する。
いくつかの実施形態において、図5の電場パターンは、4つの電極の周りで電圧パターンを回転させることによって段階的に回転させ、それにより図6に示すように、時間平均電場がゼロになる。この回転磁場は、負に帯電し、温度によって移動度が変動する分子に対しては、ゲルの中心に向かって真の(net)移動をもたらす。いくつかの実施形態において、電場パターンは、例えば、電圧パターンを180°、90°、180°、および90°ずつ順次シフトすることによって、または電場の方向をランダムに切り替えることによって、回転以外の方法で変動される。上に示したように、アフィニティーマトリックス中を移動する分子の移動度は、電場強度ではなく温度に依存する。印加された電場は、ジュール加熱によってマトリックスの温度を上昇させる傾向があり、マトリクス内の任意の点における温度上昇の大きさは、電場の大きさの2乗に比例するであろう。
温度勾配が、駆動場も提供する電場によって生成されるジュール加熱によって提供される実施形態では、温度勾配における振動は、電場の振動と同じ周期を有する。これらの振動は二次元ゲル中のアフィニティーSCODAに基づく集中を駆動することができる。
図6は、そのような実施形態による、温度または電場とともに移動度が増加する分子の集束に至る電場の段階的な回転を示す。負に帯電した分子の粒子経路を示す。4つのステップの後、粒子はゲルの中心に向かって真の変位を示す。温度または電場の変化に伴う移動度の変化を経験しない分子は、ゼロ時間平均電場においてゼロ真運動を経験する。
集束および分離の理論的予測
いくつかの実施形態において、アフィニティーSCODAゲル内の電場およびその後のジュール加熱は、ソース電極に印加される電圧およびゲルの形状の両方によって制御される。マルツィアリ(Marziali)らは、回転する二極場と四極場を重ね合わせ、電気泳動によるSCODA集中を駆動させた。これら二つの場の強度比、二極対四極比(D/Q)はSCODA集束の効率に影響を及ぼし、D/Q=4.5付近で最大となるが、最適は比較的平坦であり、SCODA力が1.75から10の間の値では比較的一定のままである13。D/Qの1つの便利な選択肢は2である。この特定の選択肢では、2つの異なる電位のみをソース電極に印加する必要があり、これは、1つの電極を共通する電圧レールに接続し、他の3つを接地し、このパターンを、表1に示す4つの可能な構成を介して段階的に回転させることによって達成することができる。アナログ増幅器を使用することができ、本明細書に記載される例で使用したが、2のD/Q比を使用することにより、個別のMOSFETスイッチを使用することができ、これにより、電源の必要なサイズおよび複雑さが簡素化および低減される。
いくつかの実施形態において、アフィニティーSCODAゲル内の電場およびその後のジュール加熱は、ソース電極に印加される電圧およびゲルの形状の両方によって制御される。マルツィアリ(Marziali)らは、回転する二極場と四極場を重ね合わせ、電気泳動によるSCODA集中を駆動させた。これら二つの場の強度比、二極対四極比(D/Q)はSCODA集束の効率に影響を及ぼし、D/Q=4.5付近で最大となるが、最適は比較的平坦であり、SCODA力が1.75から10の間の値では比較的一定のままである13。D/Qの1つの便利な選択肢は2である。この特定の選択肢では、2つの異なる電位のみをソース電極に印加する必要があり、これは、1つの電極を共通する電圧レールに接続し、他の3つを接地し、このパターンを、表1に示す4つの可能な構成を介して段階的に回転させることによって達成することができる。アナログ増幅器を使用することができ、本明細書に記載される例で使用したが、2のD/Q比を使用することにより、個別のMOSFETスイッチを使用することができ、これにより、電源の必要なサイズおよび複雑さが簡素化および低減される。
配列特異的ゲル構造の出発点は、電気泳動SCODAの最初の実証に用いた4面ゲル構造であった。この構造はゲル幅と角半径(corner radius)の2つの数値で定義できる。本願の発明者らは、10mmの幅および3mmの角半径を有する構造を用いることから始めた。この幾何形状の電気-熱モデルをCOMSOL Multiphysics(登録商標)モデリングソフトウェア(COMSOL,Inc.(米国マサチューセッツ州バーリントン))に実装して、ゲル内の電場および温度プロファイルを推定し、これらの電場および温度プロファイルが温度依存性移動度を有する標的の集中を駆動できるかどうかを確立した。使用したモデルはOhmの法則と領域内の熱方程式を同時に解き、Ohmの法則の解から計算したパワー密度を熱方程式のソースタームとして用い、熱方程式からの温度解を用いてゲル中の電解質の温度依存電気伝導率を決定した。
ゲル内の温度プロファイルを正確に推定するために、ゲルの上部と下部から伝導する熱をモデル化した。境界条件と他のモデルパラメータを図7に示す。水の熱的性質と0.2MのNaClの電気的性質を用いた。ゲルカセットは、恒温槽として作用するアルミニウムスプレッダープレート上に配置される。スプレッダプレートへの熱の流れをモデル化するために、liltで与えられるガラス底部の熱伝達係数を用いた。SCODAサイクルの1ステップについて、このモデルで解析した温度プロファイルと電場プロファイルを図8に示す。4つの電極に印加された電圧は-120V、0V、0V、0Vであり、スプレッダプレート温度は55℃(328K)に設定された。カラーマップはゲル温度を示し、ベクトル場はゲル内の電場の相対的な大きさと方向とを示す。DNAは負に帯電しているので、その移動方向は電場の方向と反対になることに注意されたい。
所与の分子の移動度対温度の実験的に決定された値と上記の熱モデルを使用して、1つの完全なサイクルにわたって積分された瞬間的なドリフト速度の時間平均を取ることによって、その特定の分子についてゲル内の至る所でのSCODA速度を決定することが可能である:
ここで、μは温度依存移動度、Eは電場、τはSCODAサイクルの周期である。温度と電場をSCODAサイクルの4つのステップで解き、方程式[23]の移動度関数と結合した。このようにしてゲル中の至る場所のSCODA速度を計算することができる。離散的なステップが使用されているので、電場と温度との間の位相遅れを無視できるほど期間が十分に長いと仮定すると、式[33]の積分は合計になる:
ここで、速度はサイクルの4つのステップすべてにわたって合計される。
一例として、図9は、図11に示された完全一致標的について実験的に決定された移動度対温度曲線(以下に説明される実施例)および上記で計算された温度および電場値を用いたSCODA速度のベクトルプロットを示す。
一例として、図9は、図11に示された完全一致標的について実験的に決定された移動度対温度曲線(以下に説明される実施例)および上記で計算された温度および電場値を用いたSCODA速度のベクトルプロットを示す。
図9にプロットされた速度場は、ゲルの幾何学的中心におけるゼロ速度点を示し、ゲル中の他のすべての点における速度は中心に向かっている。このようにして、標的分子を電場パターンの中心のゲル内に集めることができる。
固定化プローブに対する結合親和性の差に基づいて2つの類似の分子を分離するために使用される実施形態において、洗浄力は、上述のSCODA集束場に重ね合わされる。いくつかの実施形態において、洗浄力は、本明細書ではDCバイアスとして記載されるDC電場である。固定化プローブに親和性を有する分子の場合、上述のSCODA集束場によって印加されるSCODA集束力は、洗浄場によって引き起こされる分子の運動を打ち消す傾向があり、すなわち、SCODA集束場は、分子に復元力を及ぼす傾向があり、より小さい結合親和性を有する分子と比較して、分子は優先的に集束される。固定化プローブへの結合親和性がより小さい分子は、アフィニティーマトリックスを通るより大きな移動度を有し、復元SCODA力はより弱くなる。その結果、結合親和性の低い分子の集束点はシフトするであろう。場合によっては、復元SCODA力は非常に弱く、結合親和性の低い分子はアフィニティーマトリックスから完全に洗い流される。
アフィニティーSCODAを用いて他の同様の生体分子の集団から特定の生体分子を濃縮するために、重畳されたDCバイアスを備えたSCODA集束電場を動作させることができる。DCバイアスは、固定化された結合部位に対してより低い結合エネルギーを有する分子がより高い結合エネルギーを有する分子よりも中心からさらに離れて移動し、したがって集束点を複数の集束点に分割させるように、集束した分子を中心からずれるように移動させ得る。同じ結合エネルギーを有する分子では、この分割はバイアス下で洗浄している間は小さいかもしれない。DCバイアスは、集束場に直接重ね合わせてもよく、あるいはDC場は、集束場と時間多重化されてもよい。
類似の配列を有する核酸を分離するために使用される1つの例示的な実施形態において、DCバイアスが表1に示される電圧パターンで重ね合わせられ、その結果、表2に示される電圧パターンが得られる。いくつかの実施形態において、DCバイアスは、SCODA集束場と交互に印加される、すなわち、SCODA集束場は、ある期間印加され、次いで停止され、DCバイアスは、ある期間印加され、次いで停止される。
印加されたDCバイアスの存在下で得られた完全一致標的および一塩基不一致標的の両方の速度プロットを、それぞれ図10Aおよび10Bに示す。電場および温度は、61℃のスプレッダプレート温度を使用してCOMSOLを使用して計算した。速度は、式[34]を使用して計算し、実験的に得られたデータは、図11に示すように適合した(以下に説明する実施例)。完全一致標的の速度ゼロの位置は、バイアスの方向(円形スポットで示される)の中心からわずかにずれているが、不一致標的にはゲル内に速度ゼロの点がない。これらの計算は、より高い結合親和性の標的を捕捉しながら、固定化プローブからのより小さい結合親和性の標的をゲル領域から完全に洗浄することが可能であり、ヌクレオチド標的が1つの位置のみで配列が異なる場合であっても、特定の配列の選択的な精製、集中および/または検出を可能にすることを示す。
いくつかの実施形態において、類似の分子の間で集束力に最大の差があるSCODA集束を行うために使用される駆動場および移動度変動場の最適な組み合わせは、移動度変動場の関数として媒体を通るサンプル分子の速度を測定することによって経験的に決定される。例えば、いくつかの実施形態において、種々の温度における所望の標的分子および所望ではない標的分子の移動度が、上述のようにアフィニティーマトリックス中で測定され、相対的な移動度の差が最大となる温度範囲が、アフィニティーSCODAを実施するための温度範囲として選択される。いくつかの実施形態において、集束力は、速度が摂動磁場dv/df(ここで、vは分子速度であり、fは磁場強度である)に関して変化する速度に比例する。当業者は、SCODA集束を最大にし、集束しない汚染物質の迅速な洗浄を可能にするために、dv/dfを最大にすることができる。2つの類似分子を最大限に分離するために、dva/df-dvb/df(ここで、vaは分子aの速度、vbは分子bの速度である)が最大になるような条件下でアフィニティーSCODAを実施してもよい。
いくつかの実施形態において、アフィニティーマトリックスに印加される電場の強度は、ゲル内の最高温度が分離される2つの分子間の結合親和性の差が最も高い温度にほぼ対応するように計算される。
いくつかの実施形態において、分離される2つの分子間の結合親和性の差が最も高い温度は、標的分子とアフィニティー剤の融解温度と、非標的分子とアフィニティー剤の融解温度との差が最も高い温度に対応する。いくつかの実施形態において、標的分子およびアフィニティー剤の融解温度と非標的分子およびアフィニティー剤の融解温度との間の最大差は、約9.3℃未満、いくつかの実施形態においては約7.8℃未満、いくつかの実施形態においては約5.2℃未満、およびいくつかの実施形態においては約0.7℃未満である。
いくつかの実施形態において、親和性SCODAによって分離することができる非標的分子に対する標的分子の比は、1:1から1:10000までの任意の比、およびそれらの間の任意の値、例えば、1:100または1:1000である。いくつかの実施形態において、アフィニティーSCODAを行った後、標的分子の集束スポットに位置する標的分子に対する非標的分子の比は、10000倍まで減少した。
位相遅れによる回転
いくつかの実施形態において、固定化アフィニティー剤に対する異なる親和性を有する分子を分離するために、DCバイアスが、上述のようにSCODA集束場に重ね合わされる。結合エネルギーの分離が十分に大きければ、不一致の標的をゲルから完全に洗い流すことができる。弱く集束する汚染フラグメントをゲルから洗浄する能力は、上述した位相遅れによる回転(phase lag induced rotation)によって影響され得る。ここで、二次元系のSCODA速度は、次式によって与えられる:
いくつかの実施形態において、固定化アフィニティー剤に対する異なる親和性を有する分子を分離するために、DCバイアスが、上述のようにSCODA集束場に重ね合わされる。結合エネルギーの分離が十分に大きければ、不一致の標的をゲルから完全に洗い流すことができる。弱く集束する汚染フラグメントをゲルから洗浄する能力は、上述した位相遅れによる回転(phase lag induced rotation)によって影響され得る。ここで、二次元系のSCODA速度は、次式によって与えられる:
ここで、φは電場振動と移動度変動振動との間の位相遅れである。集中に寄与するSCODA速度の割合を減少させることに加えて、この結果は、アフィニティーマトリックスから弱く集束する汚染物質を洗浄する場合に、付加的な意味を有する。回転成分は、DCバイアスに加えられ、ゼロまたは低速度点をゲル中に生じ得、これは、不一致標的をゲルから洗浄するのに必要な時間を著しく増加させ得る。
電場振動と移動度変動振動との間に位相の遅れがある実施形態で生じる運動の回転成分の影響を打ち消すために、SCODA集束場が印加される方向を周期的に回転させることができる。いくつかの実施形態において、SCODA集束場が回転される方向は、周期毎に1回変更される。
光フィードバック
目的とする1つの分子(標的分子)がアフィニティーマトリックス中に集中され、他方、第2の類似の分子(非標的分子)がアフィニティーマトリックスから洗い流されるいくつかの実施形態では、洗浄が完了した時点を決定するため、および/または標的分子がアフィニティーマトリックスから流出するのを回避するために、光フィードバックを使用することができる。
目的とする1つの分子(標的分子)がアフィニティーマトリックス中に集中され、他方、第2の類似の分子(非標的分子)がアフィニティーマトリックスから洗い流されるいくつかの実施形態では、洗浄が完了した時点を決定するため、および/または標的分子がアフィニティーマトリックスから流出するのを回避するために、光フィードバックを使用することができる。
類似した分子の2つの集束点は地理的に近接していてもよく、光フィードバックを用いて、目的の分子がゲルから洗い流されないようにしてもよい。例えば、目的の分子または汚染分子(またはその両方)のための蛍光代用物を使用して、バイアス下で集束しながら、それらのそれぞれの位置をモニターすることができ、そしてその地理的情報を使用してバイアスを調整することにより、汚染した分子がゲルから除去され得る一方で、目的の分子が可能な限りゲルの縁部に押し出されるが縁部からは押し出されないことを確実にする。
いくつかの実施形態において、分離されるべき分子は、例えば、異なる色の蛍光タグで異なるように標識される。蛍光検出を用いたリアルタイムモニタリングを使用して、いつ非標的分子がアフィニティーマトリックスから洗い流されたかを決定することができ、または標的分子および非標的分子の集束点がアフィニティーマトリックス内で十分に離れていて、両方の集束点をアフィニティーマトリックスから別々に抽出することができるかを決定することができる。
いくつかの実施形態において、標的および/または非標的分子と同様に集束する蛍光代用分子を使用して、光フィードバックを行うことができる。標的分子、非標的分子、または標的分子と非標的分子の両方の蛍光代用品を使用することにより、洗浄バイアス下でアフィニティー集束を行いながら、標的分子および/または非標的分子のそれぞれの位置をモニターすることができる。アフィニティーマトリックス内の代用分子の位置を使用して洗浄バイアスを調整し、目的の分子がゲルの縁部にできるだけ近く押し出されるが、縁部からは押し出されないようにする一方で、汚染分子をゲルから洗い流すことができる。
いくつかの実施形態において、標的および/または非標的分子と同様に集束するが、実施され得るその後のいかなるPCR反応においても増幅しない蛍光代用分子を、精製されるサンプルに添加することができる。アフィニティーマトリックス内に蛍光代用分子が存在すると、SCODA集束条件をリアルタイムで制御するための光フィードバックの利用が可能になる。蛍光検出を用いて、アフィニティーマトリックス中の蛍光代用分子の位置を可視化することができる。蛍光代用品が標的分子の集束挙動を模倣する実施形態において、蛍光代用品がアフィニティーマトリックスの縁部に接近したときに、印加された洗浄力を減少させて、アフィニティーマトリックスから標的分子が洗い流されることを回避することができる。蛍光代用品が標的分子から分離されるべき非標的分子の集束挙動を模倣する実施形態では、蛍光代用品がアフィニティーマトリックスから洗い流された後、または代替的に蛍光代用品の位置がアフィニティーマトリックスの縁部に近づいたときに、印加される洗浄力を減少または停止させることができる。
示差的に修飾された分子の分離
いくつかの実施形態において、プローブに対する分子の結合親和性を変化させる化学修飾の有無を除いて同一である分子は、アフィニティーSCODAを用いて分離される。アフィニティーSCODAのいくつかの実施形態は、固定化アフィニティー剤に対する結合親和性のわずかな差を有する2つの分子を分離するのに十分に感受性である。このような分子の例には、メチル化および非メチル化核酸、メチル化またはアセチル化タンパク質などのような示差的に修飾された(differentially modified)分子が含まれる。
いくつかの実施形態において、プローブに対する分子の結合親和性を変化させる化学修飾の有無を除いて同一である分子は、アフィニティーSCODAを用いて分離される。アフィニティーSCODAのいくつかの実施形態は、固定化アフィニティー剤に対する結合親和性のわずかな差を有する2つの分子を分離するのに十分に感受性である。このような分子の例には、メチル化および非メチル化核酸、メチル化またはアセチル化タンパク質などのような示差的に修飾された(differentially modified)分子が含まれる。
例えば、シトシン残基のメチル化は、非メチル化DNA配列と比較してハイブリダイゼーションの結合エネルギーを増加させることが以前に示されている。RNA配列は、メチル化されていない配列と比較して、メチル化されている場合にハイブリダイゼーションの結合エネルギーの同様の増加を示すと予想される。本願の発明者らは、アフィニティーSCODAの一実施形態を用いて、1つのメチル化シトシン残基の存在によってのみ異なる核酸配列を分離することができることを示した。他の化学修飾は、同様の方法で核酸およびその相補的配列の結合エネルギーを変化させることが予想される。メチル化などによるタンパク質の修飾はまた、メチル化部位またはその近傍でタンパク質に結合するタンパク質、RNAまたはDNAアプタマー、抗体、または他の分子と目的とするタンパク質との結合親和性を変化させることができる。従って、アフィニティーSCODAの実施形態を用いて、示差的に修飾された目的の分子を分離することができる。本明細書における実施例はメチル化濃縮に向けられているが、アフィニティーSCODAは、例えばアセチル化を含む他の化学的差異を有する分子の濃縮および選択にも適用することができる。
アフィニティーSCODA、および配列特異的SCODAを用いて、メチル化および非メチル化DNAのバックグラウンドからメチル化DNAの特定の配列を濃縮することができる。アフィニティーSCODAのこの適用において、SCODA集束力の強度は、標的DNAの結合オリゴヌクレオチドへの結合エネルギーに関連し得る。より高い結合エネルギーを有する標的分子は、より低い結合エネルギーを有する標的よりも強く集束させることができる。DNAのメチル化は、標的DNAの相補的配列への結合エネルギーをわずかに増加させることが以前に報告されている。相補的オリゴヌクレオチドの結合エネルギーの小さな変化は、メチル化されたDNAを優先的に濃縮するアフィニティーSCODAによって利用され得る。SCODA動作条件は、例えば上述のように、メチル化DNAを集中させ、同じ配列の非メチル化DNAがゲルから洗い流されるように選択することができる。
いくつかの実施形態は、標的分子の熱励起エネルギーであるkT未満の固定化アフィニティー剤への結合エネルギーの差で分子を分離することができる。いくつかの実施形態は、0.19kcal/mol未満の固定化アフィニティー剤への結合エネルギーの差で分子を分離することができる。いくつかの実施形態は、2.6kcal/mol未満の固定化アフィニティー剤への結合エネルギーの差で分子を分離することができる。いくつかの実施形態は、3.8kcal/mol未満の固定化アフィニティー剤への結合エネルギーの差で分子を分離することができる。いくつかの実施形態は、メチル基の存在によってのみ異なる分子を分離することができる。いくつかの実施形態は、1つの塩基においてのみ配列が異なる核酸配列を分離することができる。
アフィニティーSCODAの応用
上述のように、示差的に修飾された分子を分離する、精製する、集中させる、および/または検出するためのシステムおよび方法は、バイオマーカー、特異的ヌクレオチド配列または示差的に修飾された分子の検出が重要である分野、例えば、エピジェネティクス、胎児DNAの検出、病原体の検出、癌のスクリーニングおよびモニタリング、臓器不全の検出、様々な疾患状態の検出などに応用することができる。例えば、いくつかの実施形態において、アフィニティーSCODAは、癌、臓器不全、または他の疾患状態を検出し、そのような状態の進行または治療をモニタリングするために、母体の体液を利用する胎児診断試験、体液中の病原体検出、および体液中のバイオマーカー検出などの分野において、示差的にメチル化されたDNAを分離する、精製する、集中させる、および/または検出するために使用される。
上述のように、示差的に修飾された分子を分離する、精製する、集中させる、および/または検出するためのシステムおよび方法は、バイオマーカー、特異的ヌクレオチド配列または示差的に修飾された分子の検出が重要である分野、例えば、エピジェネティクス、胎児DNAの検出、病原体の検出、癌のスクリーニングおよびモニタリング、臓器不全の検出、様々な疾患状態の検出などに応用することができる。例えば、いくつかの実施形態において、アフィニティーSCODAは、癌、臓器不全、または他の疾患状態を検出し、そのような状態の進行または治療をモニタリングするために、母体の体液を利用する胎児診断試験、体液中の病原体検出、および体液中のバイオマーカー検出などの分野において、示差的にメチル化されたDNAを分離する、精製する、集中させる、および/または検出するために使用される。
いくつかの実施形態において、体液のサンプルまたは組織サンプルが対象から得られる。細胞を溶解し、ゲノムDNAを剪断し、サンプルをアフィニティーSCODAに付すことができる。いくつかの実施形態において、アフィニティーSCODAを用いて集中させた分子は、さらなる分析、例えばDNA配列決定、デジタルPCR、蛍光検出などに供され、特定のバイオマーカーまたはヌクレオチド配列の存在についてアッセイされる。いくつかの実施形態において、対象はヒトである。
胎児DNAは母体血漿中に存在し、母体血漿から得られた母体対胎児DNAの示差的メチル化は遺伝性疾患のスクリーニングに使用できることが知られている(例えば、プーン(Poon)他、2002、Clinical Chemistry、48:1、35-41を参照)。しかしながら、克服することが困難な1つの問題は、胎児と母体のDNA間の識別である。上述のアフィニティーSCODAは、胎児DNA対母体DNAにおいて示差的にメチル化されるDNAを優先的に分離する、精製する、集中させる、および/または検出するために使用され得る。例えば、アフィニティーSCODAを用いて、胎児DNAではメチル化されているが母体DNAではメチル化されていないDNA、または母体DNAではメチル化されているが胎児DNAではメチル化されていないDNAを集中させる、または検出することができる。いくつかの実施形態において、母体血漿のサンプルは、対象から得られ、目的の配列に向けられたオリゴヌクレオチドプローブを用いてアフィニティーSCODAにかけられる。SCODA集束場を印加した後の2つの集束点の検出は、対象と胎児との間で示差的にメチル化されるDNAの存在を示し得る。特定の遺伝的障害を示す対象由来の参照サンプルとの比較を用いて、胎児が遺伝的障害を有するリスクにあるかどうかを決定することができる。PCR、DNA配列決定、デジタルPCR、蛍光検出などの従来の方法を介して、示差的修飾SCODAによって得られたDNAのサンプルのさらなる解析を用いて、胎児が遺伝的障害を有する可能性があるリスクを評価することができる。
本発明のシステムおよび方法の一実施形態は、染色体コピー数異常を含む胎児DNAにおける異常を検出するために使用される。母体DNAとは対照的に胎児DNAにおいて示差的にメチル化されることが知られている異なる染色体の領域を、アフィニティーSCODAを用いて集中させ、母体血漿サンプル中の胎児DNAの示差的メチル化に基づいて胎児DNAを母体DNAから分離する。分離された胎児DNAをさらに分析し(例えば、qPCR、DNA配列決定、蛍光検出、または他の適切な方法を用いて)、各染色体からのコピー数をカウントし、コピー数異常を決定する。
ほとんどの癌は、遺伝的変化と、DNAメチル化における変化(例えば、特定の領域の低メチル化および/または高メチル化、例えば、エルリッヒ(Ehrich)、2002、Oncogene、21:35、5400-5413を参照)などのエピジェネティックな変化との組み合わせの結果である。アフィニティーSCODAは、異常にメチル化された癌遺伝子をスクリーニングするために、目的のDNA配列を分離する、精製する、集中させる、および/または検出するために使用することができる。アフィニティーSCODAの実施形態は、健康な細胞と比較して、癌性または前癌性細胞において異なるメチル化パターンを有するDNAを含むバイオマーカーの検出に使用される。このようなバイオマーカーの検出は、早期癌スクリーニングおよび癌の発生または治療進行のモニタリングの両方に有用である。いくつかの実施形態において、対象から得られたサンプル、例えば、血漿または生検のような体液のサンプルは、目的の配列に向けられたオリゴヌクレオチドプローブを用いた示差的修飾SCODAによって処理および分析され得る。SCODA場の印加中の2つの集束点の存在は、目的のDNA配列における示差的メチル化の存在を示している可能性がある。対象から得られたサンプルを参照サンプル(例えば、健康な患者からのサンプルおよび/または癌性または前癌性組織に由来することが知られているサンプル)と比較することにより、対象の細胞が癌性または前癌性であるリスクがあるかどうかを示すことができる。PCR、DNA配列決定、デジタルPCR、蛍光検出などの従来の方法を介して、示差的修飾SCODAによって得られたDNAのサンプルのさらなる解析は、サンプルが癌性または前癌性であり得る細胞を含むリスクを評価するために、癌の進行を評価するために、または治療の有効性を評価するために使用され得る。
いくつかの実施形態において、特定のヌクレオチド配列は、メチル化に関係なく(すなわち、核酸の特定のメチル化状態を選択せずに)ゲル中に捕捉される。特定のヌクレオチド配列が分離媒体内に固定化されたオリゴヌクレオチドプローブによって結合されたままで、望ましくないヌクレオチド配列および/または他の混入物はゲルから洗い流され得る。次いで、示差的メチル化SCODAを用いて、配列のメチル化されたバージョンを集束させる一方で、メチル化されていない配列を緩衝液チャンバまたは別のゲルに向かって電気的に洗浄し、そこで回収することができる。いくつかの実施形態において、メチル化されていない配列を優先的に抽出することができる。
いくつかの実施形態において、疾患状態または感染に関連する血液中の生体分子は、アフィニティーSCODAを用いて選択的に集中される。いくつかの実施形態において、生体分子は、それらを疾患状態または感染の有用なバイオマーカーとする配列または化学的差異を有するユニークな核酸である。そのような集中に続いて、バイオマーカーは、PCR、配列決定、または同様の手段を用いて検出することができる。いくつかの実施形態において、体液または組織のサンプルは、対象から得られ、細胞は溶解され、ゲノムDNAは剪断され、アフィニティーSCODAは、目的とする配列に対して相補的なオリゴヌクレオチドプローブを用いて実施される。アフィニティーSCODAは、目的の核酸配列の示差的にメチル化された集団の存在を検出するために使用される。目的の標的配列の示差的にメチル化された集団の存在は、対象が特定の病態または感染に罹患する可能性を示し得る。
いくつかの実施形態において、対象由来のアフィニティーSCODAによって生成された標的核酸の集束パターンを、1つまたは複数の参照サンプル(例えば、健康な対象から得られた同等のサンプル、および/または特定の疾患を患っていることが知られている対象から得られた同等のサンプル)由来のアフィニティーSCODAによって生成された標的核酸の集束パターンと比較する。対象から得られたサンプルによって生成された集束パターンと、特定の疾患に罹患していることが知られている対象から得られた参照サンプルとの間の類似性は、対象が同じ疾患に罹患している可能性を示す。対象から得られたサンプルと健康な対象から得られた参照サンプルとの間の集束パターンの差は、対象が疾患に罹患している可能性を示す。対象から得られたサンプルと健康な対象から得られた参照サンプルから得られた集束パターンの差は、健康な対象と比較して、対象における示差的改変または突然変異の存在を示し得る。
複数の標的分子を捕捉するための複数のアフィニティー剤の使用
いくつかの実施形態において、アフィニティーSCODAは、サンプルあたり1つ以上の配列を分離する、精製する、集中させる、および/または検出するために使用される。本明細書中に記載される実施例は、1μM程度の低いプローブ濃度、ならびに100μM程度の高いプローブ濃度で標的DNAを集中させることが可能であることを実証する。いくつかの実施形態において、多重化された集中は、複数の異なる、アフィニティー剤を媒体に固定化して、アフィニティーマトリックスを提供することによって行われる。いくつかの実施形態において、少なくとも2つの異なる標的分子を分離する、精製する、集中させる、および/または検出するために、少なくとも2つの異なる、アフィニティー剤を媒体内に固定化する。いくつかの実施形態において、アフィニティー剤の各々は、異なる配列を有するオリゴヌクレオチドプローブである。いくつかの実施形態において、2~100の間の任意の異なるオリゴヌクレオチドプローブを媒体内に固定して、アフィニティーマトリックスを提供し、2~100の間の任意の異なる標的分子を単一の親和性ゲル内で分離する、精製する、集中させる、および/または同時に検出する。標的分子の各々は、検出を容易にするために異なるタグで標識されてもよく、例えば、標的分子の各々は、異なる色の蛍光タグで標識されてもよい。
いくつかの実施形態において、アフィニティーSCODAは、サンプルあたり1つ以上の配列を分離する、精製する、集中させる、および/または検出するために使用される。本明細書中に記載される実施例は、1μM程度の低いプローブ濃度、ならびに100μM程度の高いプローブ濃度で標的DNAを集中させることが可能であることを実証する。いくつかの実施形態において、多重化された集中は、複数の異なる、アフィニティー剤を媒体に固定化して、アフィニティーマトリックスを提供することによって行われる。いくつかの実施形態において、少なくとも2つの異なる標的分子を分離する、精製する、集中させる、および/または検出するために、少なくとも2つの異なる、アフィニティー剤を媒体内に固定化する。いくつかの実施形態において、アフィニティー剤の各々は、異なる配列を有するオリゴヌクレオチドプローブである。いくつかの実施形態において、2~100の間の任意の異なるオリゴヌクレオチドプローブを媒体内に固定して、アフィニティーマトリックスを提供し、2~100の間の任意の異なる標的分子を単一の親和性ゲル内で分離する、精製する、集中させる、および/または同時に検出する。標的分子の各々は、検出を容易にするために異なるタグで標識されてもよく、例えば、標的分子の各々は、異なる色の蛍光タグで標識されてもよい。
2つ以上のアフィニティー剤の各々と2つ以上の標的分子との間の結合エネルギーが異なるいくつかの実施形態において、2つ以上の標的分子は、適切な温度でSCODA集束場を印加することによって、アフィニティーマトリックス内で示差的に分離され得る。いくつかの実施形態において、その対応するアフィニティー剤についてより低い融点を有する第1の標的分子は、その対応するアフィニティー剤について比較的高い融点を有する第2の標的分子から優先的に分離され得る。いくつかのそのような実施形態において、第1の分子は、対応するアフィニティー剤に対して比較的高い融点を有する第2の標的分子が効率的に集束しないように十分に低く(すなわち、アフィニティーマトリックス内の第2の標的分子の移動度が比較的低くなる温度)、第1の分子の効率的な集束を可能にするのに十分に高い温度でSCODA集束を行うことによって優先的に集中される。いくつかのそのような実施形態において、第1および第2の分子は、洗浄バイアス、例えばDCバイアスを印加することによって、第2の標的分子が洗浄バイアスによって変位しないか、またはゆっくりしか変位しないほど十分に低いが、第1の標的分子が洗浄バイアスによって変位するか、またはより速い速度で変位するほど十分に高い温度で示差的に分離される。
アフィニティーSCODAを実施するための装置
いくつかの実施形態において、アフィニティーSCODAは、アフィニティーマトリックスを含むための領域、緩衝液リザーバ、所望の効果を引き起こすのに十分な大きな電圧および電流を送達することができる電源、SCODA媒体(いくつかの実施形態ではゲルである)の正確な温度制御、およびSCODA媒体中の2つの異なる分子のモニタリングのための2色蛍光イメージングシステムを含む電気泳動装置上で実施される。
いくつかの実施形態において、アフィニティーSCODAは、アフィニティーマトリックスを含むための領域、緩衝液リザーバ、所望の効果を引き起こすのに十分な大きな電圧および電流を送達することができる電源、SCODA媒体(いくつかの実施形態ではゲルである)の正確な温度制御、およびSCODA媒体中の2つの異なる分子のモニタリングのための2色蛍光イメージングシステムを含む電気泳動装置上で実施される。
サンプル調製プロセス
いくつかの態様において、本開示は、例えば検出および/または分析のために、サンプルを調製するためのプロセスを提供する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるプロセスは、サンプル中の1以上の標的分子の同一性または配列(例えば、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列)を含む、サンプルの特性または特徴を同定するために使用され得る。いくつかの実施形態において、プロセスは、サンプル溶解、サンプル精製、サンプル断片化、断片化されたサンプルの精製、ライブラリー調製(例えば、核酸ライブラリー調製)、ライブラリー調製の精製、サンプル濃縮(例えば、アフィニティーSCODAの使用)、および/または標的分子の検出/分析などの1つ以上のサンプル変換ステップを含み得る。
いくつかの態様において、本開示は、例えば検出および/または分析のために、サンプルを調製するためのプロセスを提供する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるプロセスは、サンプル中の1以上の標的分子の同一性または配列(例えば、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列)を含む、サンプルの特性または特徴を同定するために使用され得る。いくつかの実施形態において、プロセスは、サンプル溶解、サンプル精製、サンプル断片化、断片化されたサンプルの精製、ライブラリー調製(例えば、核酸ライブラリー調製)、ライブラリー調製の精製、サンプル濃縮(例えば、アフィニティーSCODAの使用)、および/または標的分子の検出/分析などの1つ以上のサンプル変換ステップを含み得る。
いくつかの実施形態において、サンプルは、精製されたサンプル、細胞溶解物、単一細胞、細胞の集団、または組織であり得る。いくつかの実施形態において、サンプルは任意の生物学的サンプルである。いくつかの実施形態において、サンプル(例えば、生物学的サンプル)は、血液、唾液、喀痰、糞便、尿または頬スワブサンプルである。いくつかの実施形態において、生物学的サンプルは、ヒト、非ヒト霊長類、齧歯類、イヌ、ネコ、ウマ、または任意の他の哺乳動物に由来する。いくつかの実施形態において、生物学的サンプルは、細菌細胞培養物(例えば、E.coli細菌細胞培養物)に由来する。細菌細胞培養物は、グラム陽性細菌細胞および/またはグラム陰性細菌細胞を含み得る。いくつかの実施形態において、サンプルは、メタゲノムサンプルまたは環境サンプルからユーザが開発した方法を介して以前に抽出された核酸またはタンパク質の精製されたサンプルである。血液サンプルは、対象(例えば、ヒト対象)から新たに採取された血液サンプルであってもよく、または乾燥血液サンプル(例えば、固体媒体(例:ガスリーカード)上で保存される)であってもよい。血液サンプルは、全血、血清、血漿、赤血球、および/または白血球を含み得る。
いくつかの実施形態において、サンプル(例えば、細胞または組織を含むサンプル)は、本開示に従うプロセスで溶解(例えば、破壊された、分解された、および/または他の方法で消化された)され得る。いくつかの実施形態において、細胞または組織を含むサンプルは、既知の物理的または化学的方法のいずれか1つを用いて溶解され、標的分子(例えば、標的核酸または標的タンパク質)を該細胞または組織から放出する。いくつかの実施形態において、サンプルは、電解法、酵素法、界面活性剤に基づく方法、および/または機械的均質化を用いて溶解され得る。いくつかの実施形態において、サンプル(例えば、複合組織、グラム陽性またはグラム陰性細菌)は、連続して実施される複数の溶解方法を必要とし得る。いくつかの実施形態において、サンプルが細胞または組織(例えば、精製された核酸を含むサンプル)を含まない場合、溶解ステップを省略することができる。いくつかの実施形態において、サンプルの溶解を行って、標的核酸を単離する。いくつかの実施形態において、サンプルの溶解を実施して、標的タンパク質を単離する。いくつかの実施形態において、溶解方法は、サンプルを粉砕するためのミルの使用、超音波処理、表面音波(SAW)、凍結-解凍サイクル、加熱、界面活性剤の添加、タンパク質分解物(例えば、ヒドロラーゼまたはプロテアーゼなどの酵素)の添加、および/または細胞壁消化酵素(例えば、リゾチームまたはザイモラーゼ)の添加をさらに含む。溶解用の代表的な洗浄剤(例えば、非イオン性界面活性剤)としては、ポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン-ポリオキシプロピレンブロックコポリマー、ポリソルベートおよびアルキルフェノールエトキシレート、好ましくはノニルフェノールエトキシレート、アルキルグルコシドおよび/またはポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルが挙げられる。いくつかの実施形態において、溶解方法は、所望の温度(例えば、少なくとも60℃、少なくとも70℃、少なくとも80℃、少なくとも90℃、または少なくとも95℃)で、サンプルを少なくとも1~30分、1~25分、5~25分、5~20分、10~30分、5~10分、10~20分、または少なくとも5分間加熱することを含む。
いくつかの実施形態において、サンプル(例えば、標的核酸または標的タンパク質を含むサンプル)は、本開示に従うプロセスにおいて、例えば、溶解後に精製され得る。いくつかの実施形態において、サンプルは、クロマトグラフィー(例えば、サンプルを選択的に結合するアフィニティークロマトグラフィー)または電気泳動を使用して精製され得る。いくつかの実施形態において、サンプルは、沈殿剤の存在下で精製され得る。いくつかの実施形態において、精製ステップまたは方法の後、サンプルは、溶出緩衝液を用いて、精製マトリックス(例えば、アフィニティークロマトグラフィーマトリックス)から洗浄および/または放出され得る。いくつかの実施形態において、精製ステップまたは方法は、電気活性ポリマーなどの可逆的に切り替え可能なポリマーの使用を含み得る。いくつかの実施形態において、サンプルは、多孔性マトリックス(例えば、酢酸セルロース、アガロース、アクリルアミド)を通過するサンプルの電気泳動通過によって精製され得る。
いくつかの実施形態において、サンプル(例えば、標的核酸または標的タンパク質を含むサンプル)は、本開示に従うプロセスにおいて、断片化され得る。いくつかの実施形態において、核酸サンプルは、配列特異的同定のための小さな(<1キロベース)フラグメントを、長い読み取り配列決定用途のための大きな(10+キロベースまで)フラグメントに対して生成するように断片化され得る。核酸またはタンパク質の断片化は、いくつかの実施形態において、機械的(例えば、流体剪断)、化学的(例えば、鉄(Fe+)開裂)および/または酵素的(例えば、制限酵素、トランスポザーゼを用いたタグ付け)方法を用いて達成され得る。いくつかの実施形態において、タンパク質サンプルは、任意の長さのペプチドフラグメントを生成するために断片化され得る。タンパク質の断片化は、いくつかの実施形態において、化学的および/または酵素的(例えば、トリプシンのようなタンパク質分解酵素)方法を用いて達成され得る。いくつかの実施形態において、平均フラグメント長は、反応時間、温度、およびサンプルおよび/または酵素(例えば、制限酵素、トランスポザーゼ)の濃度によって制御され得る。いくつかの実施形態において、核酸は、核酸が同時に断片化され、蛍光分子(例えば、フルオロフォア)で標識されるように、タグ付けによって断片化され得る。いくつかの実施形態において、断片化されたサンプルは、断片化ステップの間に使用される小さいおよび/または望ましくないフラグメント、ならびに残留ペイロード、化学物質および/または酵素(例えば、トランスポザーゼ)を除去するために、1回の精製(例えば、クロマトグラフィーや電気泳動)に供され得る。例えば、断片化されたサンプル(例えば、核酸を含むサンプル)は、酵素(例えばトランスポザーゼ)から精製することができ、ここで、精製は、酵素(例えば、熱、化学物質(例えばSDS)、および酵素(例えばプロテイナーゼK)プロセスの組み合わせによって)を変性させることを含む。
いくつかの実施形態において、標的核酸を含むサンプルを使用して、本発明の開示に従ったプロセスにおけるその後の分析(例えば、ゲノム配列決定)のための核酸ライブラリーを作製することができる。核酸ライブラリーは、直鎖ライブラーまたは環状ライブラリーであり得る。いくつかの実施形態において、環状ライブラリーの核酸は、下流の線形化を可能にする要素(例えば、エンドヌクレアーゼ制限部位、ウラシルの取り込み)を含み得る。いくつかの実施形態において、核酸ライブラリーは、精製されてもよく(例えば、クロマトグラフィー、例えば、アフィニティークロマトグラフィーを使用して)、または電気泳動されてもよい。
いくつかの実施形態において、核酸のライブラリー(例えば、直鎖の核酸)は、末端修復、すなわち、酵素(例えば、Taq DNAリガーゼ、エンドヌクレアーゼIV、Bst DNAポリメラーゼ、Fpg、ウラシル-DNAグリコシラーゼ、T4エンドヌクレアーゼVおよび/またはエンドヌクレアーゼVIII)の組み合わせが核酸の3’末端を伸長し、5’ペイロードに対する補体を生成し、核酸における任意の非塩基部位またはニックを修復するプロセスを用いて調製される。いくつかの実施形態において、直鎖の核酸ライブラリーは、セルフプライミングヘアピンアダプターを用いて調製され、このプロセスは、ポリメラーゼ複合体の形成の前に、ユニークな配列決定プライマーを個々の核酸フラグメントプライマーにアニーリングする必要性を排除し得るプロセスである。末端修復に続いて、核酸ライブラリー(例えば、直鎖核酸)を、固相吸着を用いて精製し、次いで、サイズ選択的マトリックス(例えば、アガロースゲル)を介した核酸の通過を用いて、新鮮な緩衝液中への溶出を行うことができる。サイズ選択的マトリックスは、標的核酸のサイズよりも小さい核酸フラグメントを除去するために使用され得る。
いくつかの実施形態において、サンプル(例えば、標的核酸または標的タンパク質を含むサンプル)は、本開示に従うプロセスにおいて標的分子について濃縮され得る。いくつかの実施形態において、サンプルは、電気泳動法を用いて標的分子に対して濃縮される。いくつかの実施形態において、サンプルは、アフィニティーSCODAを用いて標的分子に対して濃縮される。いくつかの実施形態において、サンプルは、場反転ゲル電気泳動(FIGE)を用いて標的分子に対して濃縮される。いくつかの実施形態において、サンプルは、パルス場ゲル電気泳動(PFGE)を用いて標的分子に対して濃縮される。いくつかの実施形態において、濃縮中に使用されるマトリックス(例えば、多孔質媒体、電気泳動ポリマーゲル)は、サンプル中に存在する標的分子に結合する固定化アフィニティー剤(「固定化捕捉プローブ」としても知られる)を含む。いくつかの実施形態において、濃縮中に使用されるマトリックスは、1、2、3、4、5、またはそれ以上のユニークな固定化捕捉プローブを含み、これらの各々は、ユニークな標的分子に結合し、および/または異なる結合親和性で同じ標的分子に結合する。
いくつかの実施形態において、固定化捕捉プローブは、標的核酸にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド捕捉プローブである。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド捕捉プローブは、標的核酸に対して少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、または100%相補的である。いくつかの実施形態において、単一のオリゴヌクレオチド捕捉プローブを使用して、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、または99%の配列同一性を共有する複数の関連標的核酸(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50またはそれ以上の関連標的核酸)を濃縮することができる。複数の関連する標的核酸の濃縮は、メタゲノムライブラリーの作製を可能にし得る。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド捕捉プローブは、関連する標的核酸の示差的濃縮を可能にし得る。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド捕捉プローブは、その修飾状態が異なる(例えば、一塩基多型、メチル化状態、アセチル化状態)同一配列の核酸に対する標的核酸の濃縮を可能にし得る。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド捕捉プローブは、目的の特定の遺伝子(例えばHLA)についてヒトゲノムDNAを濃縮するために使用される。目的の特定の遺伝子は、特定の病態または障害に関連する遺伝子であり得る。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド捕捉プローブは、メタゲノムサンプルの核酸を濃縮するために使用される。
いくつかの実施形態において、0.5~2キロベースの長さを有する核酸標的分子を濃縮する目的で、オリゴヌクレオチド捕捉プローブを、5’アクリダイト部分を用いてアクリルアミドマトリックス中に共有結合的に固定化することができる。いくつかの実施形態において、より大きな核酸標的分子(例えば、長さが2キロベースを超える)を濃縮する目的で、オリゴヌクレオチド捕捉プローブをアガロースマトリックス中に固定化することができる。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド捕捉プローブは、チオール-エポキシド化学を用いて(例えば、チオール修飾オリゴヌクレオチドを架橋アガロースビーズに共有結合的に結合させることによって)、アガロースマトリックス中に固定化され得る。アガロースビーズに連結されたオリゴヌクレオチド捕捉プローブを、標準的なアガロースマトリックス内で組み合わせて固化させることができる(例えば、同じアガロース率で)。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている方法(例えば、SCODAを用いた濃縮)を用いて核酸を濃縮することにより、約0.5キロベース(kb)、約1kb、約1.5kb、約2kb、約3kb、約4kb、約5kb、約6kb、約7kb、約8kb、約9kb、約10kb、約12kb、約15kb、約20kb、またはそれ以上の長さを含む核酸標的分子が生成される。いくつかの実施形態において、本明細書中に記載される方法(例えば、SCODAを用いた濃縮)を用いて核酸を濃縮することにより、約0.5~2kb、0.5~5kb、1~2kb、1~3kb、1~4kb、1~5kb、1~10kb、2~10kb、2~5kb、5~10kb、5~15kb、5~20kb、5~25kb、10~15kb、10~20kb、または10~25kbの長さを含む核酸標的分子が生成される。
いくつかの実施形態において、固定化捕捉プローブは、標的タンパク質またはペプチドフラグメントに結合するタンパク質捕捉プローブ(例えば、アプタマーまたは抗体)である。いくつかの実施形態において、タンパク質捕捉プローブは、10-9~10-8M、10-8~10-7M、10-7~10-6M、10-6~10-5M、10-5~10-4M、10-4~10-3M、または10-3~10-2Mの結合親和性で標的タンパク質またはペプチドフラグメントに結合する。いくつかの実施形態において、結合親和性は、ピコモル~ナノモルの範囲(例えば、約10-12~約10-9M)である。いくつかの実施形態において、結合親和性は、ナノモル~マイクロモルの範囲(例えば、約10-9から約10-6Mの間)である。いくつかの実施形態において、結合親和性は、マイクロモル~ミリモルの範囲(例えば、約10-6~約10-3M)である。いくつかの実施形態において、結合親和性は、ピコモル~マイクロモルの範囲(例えば、約10-12~約10-6M)である。いくつかの実施形態において、結合親和性は、ナノモル~ミリモルの範囲(例えば、約10-9~約10-3M)である。いくつかの実施形態において、単一のタンパク質捕捉プローブを用いて、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%95%、または99%の配列同一性を共有する複数の関連標的タンパク質を濃縮することができる。いくつかの実施形態において、単一のタンパク質捕捉プローブを使用して、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%95%、または99%の配列相同性を共有する複数の関連標的タンパク質(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50またはそれ以上の関連標的タンパク質)を濃縮することができる。複数の関連標的タンパク質の濃縮は、メタプロテオミクスライブラリーの作製を可能にし得る。いくつかの実施形態において、タンパク質捕捉プローブは、関連する標的タンパク質の異なる濃縮を可能にし得る。
いくつかの実施形態において、複数の捕捉プローブ(例えば、アデノウイルス、ブドウ球菌、肺炎、または結核などの感染因子の決定論的標的分子に結合する、複数の捕捉プローブ型の集団)を濃縮マトリックス中に固定化することができる。複数の決定論的捕捉プローブを用いて濃縮マトリックスにサンプルを適用すると、疾患または状態(例えば、感染因子の存在)の診断をもたらし得る。
いくつかの実施形態において、本開示に従ったプロセスにおいて、標的分子または関連する標的分子は、非標的分子の除去後に濃縮マトリックスから放出され得る。いくつかの実施形態において、標的分子は、濃縮マトリックスの温度を上昇させることによって、濃縮マトリックスから放出され得る。マトリックスの温度を調節することは、温度の上昇により、より高い捕捉プローブのストリンジェンシーを提供し、標的分子と捕捉プローブとの間のより大きな結合親和性を必要とするので、移動速度にさらに影響を及ぼす。いくつかの実施形態において、関連する標的分子を濃縮する場合、マトリックス温度を段階的に徐々に上昇させて、標的分子を放出させ、相同性が絶えず増大する段階で単離することができる。いくつかの実施形態において、温度は、各ステップにおいて、またはある期間(例えば、1~10分、1~5分、または4~8分)にわたって、約5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、またはそれ以上、上昇する。いくつかの実施形態において、温度は、各ステップにおいて、または一定期間(例えば、1~10分、1~5分、または4~8分)にわたって、5%~10%、5~15%、5%~20%、5%~25%、5%~30%、5%~40%、5%~50%、10%~25%、20%~30%、30%~40%、35%~50%、または40%~70%だけ上昇する。いくつかの実施形態において、温度は、各ステップにおいて、または一定期間(例えば、1~10分、1~5分、または4~8分)にわたって、約1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、または10℃だけ上昇する。いくつかの実施形態において、温度は、各ステップにおいて、または一定期間(例えば、1~10分、1~5分、または4~8分)にわたって、1~10℃、1~5℃、2~5℃、2~10℃、3~8℃、4~9℃、または5~10℃だけ上昇する。これにより、最初の参照標的分子との関係においてますます離れている標的タンパク質または標的核酸の配列決定が可能となり、新規タンパク質(例えば、酵素)または機能(例えば、酵素機能や遺伝子機能)の発見が可能となる。いくつかの実施形態において、複数の捕捉プローブ(例えば、複数の決定論的捕捉プローブ)を使用する場合、マトリクス温度は、段階的または勾配様式に上昇させ、異なる標的分子の温度依存性放出を可能にし、結果として、制御および標的分子の存在または非存在を表す一連のバーコード化された放出バンドの生成をもたらす。
サンプル(例えば、標的核酸または標的タンパク質を含むサンプル)を濃縮することにより、サンプルの総量を減少させることができる。例えば、いくつかの実施形態において、サンプルの総量は、濃縮後に、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも100%、または少なくとも120%、減少される。いくつかの実施形態において、サンプルの総量は、濃縮後に、1~20mLの初期容量から100~1000μLの最終容量へ、1~5mLの初期容量から100~1000μLの最終容量へ、100~1000μLの初期容量から25~100μLの最終容量へ、100~500μLの初期容量から10~100μLの最終容量へ、または50~200μLの初期容量から1~25μLの最終容量へと減少する。例えば、いくつかの実施形態において、濃縮後のサンプルの最終容量は、10~100μL、10~50μL、10~25μL、20~100μL、20~50μL、25~100μL、25~250μL、25~1000μL、100~1000μL、100~500μL、100~250μL、200~1000μL、200~500μL、200~750μL、500~1000μL、500~1500μL、500~750μL、1~5mL、1~10mL、1~2mL、1~3mL、または1~4mLである。
いくつかの実施形態において、1つまたは複数の標的分子は、濃縮およびその後の放出後に検出されて、本開示に従ったプロセスにおいて、前記標的分子およびその上流のサンプルの解析を可能にすることができる。いくつかの実施形態において、標的核酸は、遺伝子配列決定、吸光度、蛍光、電気伝導度、キャパシタンス、表面プラズモン共鳴、ハイブリッド捕捉、抗体、核酸の直接標識(例えば、末端ラベリング、標識されたタグ付けペイロード)、インターカレーション色素による非特異的標識(例えば、臭化エチジウム、SYBR色素)、または核酸検出のための任意の他の公知の方法を用いて検出され得る。いくつかの実施形態において、標的タンパク質またはペプチドフラグメントは、吸光度、蛍光、質量分析、アミノ酸配列決定、またはタンパク質またはペプチド検出のための任意の他の公知の方法を用いて検出され得る。
サンプル調製用デバイスおよびモジュール
分析用のサンプルを調製するステップで使用する装置、カートリッジ(例えば、チャネル(例えば、マイクロ流体チャネル)を含む)、および/またはポンプ(例えば蠕動ポンプ)を含むデバイスまたはモジュールが一般に提供される。本開示に従ってデバイスを使用して、生物学的サンプルからの標的分子の捕捉、集中(concentration)、操作および/または検出を可能にすることができる。いくつかの実施形態において、次世代シークエンシングおよび/または他の下流分析技術のための材料を生成するためのサンプルの自動処理のためのデバイスおよび関連する方法が提供される。デバイスおよび関連する方法は、本明細書の他の箇所に記載されるサンプル調製またはサンプル分析プロセスに従って、核酸および/またはタンパク質プロセシングのための反応を含む、化学的および/または生物学的反応を実施するために使用され得る。
分析用のサンプルを調製するステップで使用する装置、カートリッジ(例えば、チャネル(例えば、マイクロ流体チャネル)を含む)、および/またはポンプ(例えば蠕動ポンプ)を含むデバイスまたはモジュールが一般に提供される。本開示に従ってデバイスを使用して、生物学的サンプルからの標的分子の捕捉、集中(concentration)、操作および/または検出を可能にすることができる。いくつかの実施形態において、次世代シークエンシングおよび/または他の下流分析技術のための材料を生成するためのサンプルの自動処理のためのデバイスおよび関連する方法が提供される。デバイスおよび関連する方法は、本明細書の他の箇所に記載されるサンプル調製またはサンプル分析プロセスに従って、核酸および/またはタンパク質プロセシングのための反応を含む、化学的および/または生物学的反応を実施するために使用され得る。
いくつかの実施形態において、サンプル調製デバイスまたはモジュールは、標的分子または複数の標的分子(例えば、標的核酸または標的タンパク質)を配列決定モジュールまたはデバイスに送達または移送するように配置される。いくつかの実施形態において、サンプル調製デバイスまたはモジュールは、配列決定デバイスまたはモジュールに、直接(例えば、物理的に付着している)、または間接的に連結される。
いくつかの実施形態において、サンプル調製デバイスまたはモジュールは、診断目的のためにサンプルを調製するために使用される。いくつかの実施形態において、診断目的のためにサンプルを調製するために使用されるサンプル調製デバイスは、標的分子または複数の分子(例えば、標的核酸または標的タンパク質)を診断モジュールまたは診断デバイスに送達または移送するように配置される。いくつかの実施形態において、サンプル調製デバイスまたはモジュールは、診断デバイスに、直接(例えば、物理的に付着している)、または間接的に連結される。
いくつかの実施形態において、デバイスは、1つ以上のカートリッジを受承するように構成された(例えば、一度に1つのカートリッジを受承するように構成された)カートリッジハウジングを含む。いくつかの実施形態において、カートリッジは、流体を受承するように構成された、および/またはサンプル調製プロセスで使用される1つ以上の試薬を含有するように構成された1つ以上のリザーバまたは反応容器を含む。いくつかの実施形態において、カートリッジは、サンプル調製プロセスにおいて使用される流体(例えば、1つ以上の試薬を含む流体)を含有および/または輸送するように構成された1つ以上のチャネル(例えば、マイクロ流体チャネル)を含む。試薬には、緩衝液、酵素試薬、ポリマーマトリックス、捕捉試薬、サイズ特異的選択試薬、配列特異的選択試薬、および/または精製試薬が含まれる。サンプル調製プロセスで使用するためのさらなる試薬は、本明細書の別の箇所に記載されている。
いくつかの実施形態において、カートリッジは、1以上の貯蔵試薬(例えば、液体または液体形態への再構成に適した凍結乾燥形態のもの)を含む。カートリッジの貯蔵試薬は、所望のプロセスを実行するのに適した試薬および/または所望のサンプルタイプを処理するのに適した試薬を含む。いくつかの実施形態において、カートリッジは、単回使用カートリッジ(例えば、使い捨てカートリッジ)または複数回使用カートリッジ(例えば、再使用可能なカートリッジ)である。いくつかの実施形態において、カートリッジは、ユーザが供給するサンプルを受承するように構成される。ユーザが供給するサンプルは、カートリッジがデバイスによって受承される前または後に、例えば、ユーザによって手動で、または自動化されたプロセスで、カートリッジに加えられてもよい。いくつかの実施形態において、カートリッジは、サンプル調製カートリッジである。いくつかの実施形態において、サンプル調製カートリッジは、サンプル(例えば、生物学的サンプル)から標的分子(例えば、標的核酸または標的タンパク質)を単離または精製することができる。
いくつかの実施形態において、カートリッジは、本明細書に記載されるような濃縮のためのアフィニティーマトリックスを含む。いくつかの実施形態において、カートリッジは、アフィニティーSCODA、FIGE、またはPFGEを使用する濃縮のためのアフィニティーマトリックスを含む。いくつかの実施形態において、カートリッジは、標的核酸または標的タンパク質に対する結合親和性を有する固定化アフィニティー剤を含むアフィニティーマトリックスを含む。
いくつかの実施形態において、本開示のサンプル調製デバイスは、制御方法(例えば、Sage BluePippin法、手動法(例えば、ビーズベースの手動サイズ選択方法))を用いて作製された平均リード長よりも長い下流配列決定用途のための平均リード長を有する標的核酸を作製する(例えば、濃縮する、または精製する)。いくつかの実施形態において、サンプル調製デバイスは、少なくとも700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、または3000個の長さのヌクレオチドを含む配列決定のための平均リード長を有する標的核酸を作製する。いくつかの態様において、サンプル調製デバイスは、長さが700~3000、1000~3000、1000~2500、1000~2400、1000~2300、1000~2200、1000~2100、1000~2000、1000~1900、1000~1800、1000~1700、1000~1600、1000~1500、1000~1400、1000~1300、1000~1200、1500~3000、1500~2500、1500~2000、または2000~3000個のヌクレオチドを含む配列決定のための平均リード長を有する標的核酸を作製する。
本開示によるデバイスは、一般に、本明細書に記載されるようにカートリッジを動作させるために使用することができる機械的および電子的および/または光学的構成要素を含む。いくつかの実施形態において、デバイス構成要素は、カートリッジ上またはカートリッジの特定の領域上で特定の温度を達成および維持するように動作する。いくつかの実施形態において、デバイス構成要素は、カートリッジの電極に特定の時間の間、特定の電圧を印加するように動作する。いくつかの実施形態において、デバイス構成要素は、液体を、カートリッジのリザーバおよび/または反応容器へ、リザーバおよび/または反応容器から、またはリザーバおよび/または反応容器の間を移動させるように動作する。いくつかの実施形態において、デバイス構成要素は、液体をカートリッジのチャネルを通って、例えば、カートリッジのリザーバおよび/または反応容器へ、リザーバおよび/または反応容器から、またはリザーバおよび/または反応容器の間を移動させるように動作する。いくつかの実施形態において、デバイス構成要素は、カートリッジのエラストマー、試薬特異的リザーバまたは反応容器と相互作用する蠕動ポンプ機構(例えば、装置)を介して液体を移動させる。いくつかの実施形態において、デバイス構成要素は、カートリッジのチャネルに関連するエラストマー構成要素(例えば、エラストマーを含む表面層)と相互作用してチャネルを通して流体をポンピングするように構成された蠕動ポンプ機構(例えば、装置)を介して液体を移動させる。デバイス構成要素は、例えば、サンプル情報を入力することができ、特定のプロセスを選択することができ、実行結果を報告することができるユーザインターフェースを駆動するためのコンピュータリソースを含むことができる。
いくつかの実施形態において、カートリッジは、少量の流体(例えば、1~10μL、2~10μL、4~10μL、5~10μL、1~8μL、または1~6μLの流体)を取り扱うことができる。いくつかの実施形態において、配列決定カートリッジは、サンプル調製デバイスまたはモジュール(例えば、調製されたサンプルが配列決定のために反応混合物に送達されることを可能にするために)に物理的に埋め込まれるか、または関連付けられる。いくつかの実施形態において、サンプル調製デバイスまたはモジュールに物理的に埋め込まれるか、または関連付けられる配列決定カートリッジは、表面シーリングガスケットまたは円錐形プレスフィット(例:ルアーフィッティング)の形態の流体界面を有するマイクロ流体チャネルを含む。いくつかの実施形態において、次いで、サンプル調製デバイスまたはモジュールから配列決定カートリッジを物理的に分離するために、調製されたサンプルの送達後に流体界面を破壊することができる。
以下の非限定的な例は、本明細書に記載されるデバイス、方法、および組成物の態様を例示することを意味する。本開示に従うサンプル調製デバイスまたはモジュールの使用は、以下に記載されたステップの1つ以上を進めてもよい。ユーザは、デバイスの蓋を開け、所望のプロセスを支持するカートリッジを挿入することができる。次いで、ユーザは、特定の溶解溶液と組み合わせることができるサンプルをカートリッジ上のサンプルポートに加えることができる。次いで、ユーザは、デバイス蓋を閉じ、デバイス上のタッチスクリーンインターフェースを介して任意のサンプル特定情報を入力し、任意のプロセス特定パラメータ(例えば、所望のサイズ選択の範囲、標的分子捕捉のための所望の相同性の程度など)を選択し、サンプル調製プロセスの実行を開始することができる。実行に続いて、ユーザは、関連する実行データ(たとえば、実行が正常に完了したことの確認、特定のメトリックの実行など)、並びにプロセス固有の情報(例えば、生成されたサンプルの量、特定の標的配列の有無など)を受け取ることができる。実行によって作製されたデータは、その後のバイオインフォマティクス分析に供され得、これは、ローカルまたはクラウドベースのいずれかであり得る。プロセスに応じて、完成したサンプルは、その後の使用(例えば、ゲノム配列決定、qPCR定量化、クローニングなど)のためにカートリッジから抽出され得る。次に、デバイスを開いて、カートリッジを取り外すことができる。
いくつかの実施形態において、サンプル調製モジュールは、ポンプを含む。いくつかの実施形態において、ポンプは蠕動ポンプである。このようなポンプのいくつかは、本明細書に記載された流体取り扱いのための本発明の構成要素の1つ以上を含む。例えば、ポンプは、装置および/またはカートリッジを備え得る。いくつかの実施形態において、ポンプの装置は、ローラ、クランク、およびロッカーを含む。いくつかのそのような実施形態において、クランクおよびロッカーは、ローラに連結されたクランク・ロッカー・機構(crank-and-rocker mechanism)として構成される。クランク・ロッカー・機構と装置のローラとの結合は、場合によっては、本明細書に記載される利点のいくつかを達成することを可能にする(例えば、カートリッジからの装置の容易な離脱、十分に計量されたストローク体積)。特定の実施形態において、ポンプのカートリッジは、チャネル(例えば、マイクロ流体チャネル)を含む。いくつかの実施形態において、カートリッジのチャネルの少なくとも一部は、本明細書に記載されるいくつかの利点のいずれかに寄与し得る特定の断面形状および/または表面層を有する。
場合によっては、特定の利点を提供し得るいくつかのカートリッジの1つの非限定的な態様は、カートリッジ内に特定の断面形状を有するチャネルを含むことである。例えば、いくつかの実施形態において、カートリッジは、V形チャネルを含む。このようなV形チャネルを形成するための潜在的に便利であるが限定的ではない1つの方法は、カートリッジ内にV形溝を成形または機械加工することである。装置のローラがカートリッジと係合してチャネルを通って流体の流れを生じさせる特定の実施形態において、V形チャネル(本明細書では、V溝または実質的に三角形の断面を有するチャネルとも呼ばれる)を含むことの認識された利点。例えば、いくつかの例では、V形チャネルは、ローラに対して寸法の影響的に鈍感である。言い換えれば、場合によっては、装置のローラ(例えば、くさび形ローラ)がV形チャネルと適切に係合するために接着しなければならない単一の寸法が存在しない。対照的に、半円形のようなチャネルの特定の従来の断面形状は、チャネルと適切に係合するため(例えば、蠕動ポンピングプロセスにおいて圧力差を生じさせるための流体シールを形成するため)に、ローラが特定の寸法(例えば、半径)を有することを必要とし得る。いくつかの実施形態において、ローラに対して寸法的に鈍感なチャネルを含めることにより、ハードウェア構成要素のより単純で安価な製造が可能となり、構成可能性/柔軟性が向上する。
ある態様において、カートリッジは、表面層(例えば、平坦な表面層)を含む。1つの例示的な態様は、実質的に可撓性チューブの半分を製造するために、V溝の上にエラストマー(例えば、シリコーン)を含む(例えば、エラストマーから本質的になる)膜(本明細書においては表面層とも称される)を積層することを含む、潜在的に有利な実施形態に関する。図24は、特定のそのような実施形態による例示的なカートリッジ100を示しており、以下により詳細に説明されている。次に、いくつかの実施形態では、エラストマーを含む表面層をチャネル内に変形させてピンチを形成し、次にピンチを並進させることによって、ピンチの後縁に負圧を発生させて吸引し、ピンチの前縁に正圧を発生させてピンチの前縁方向に流体をポンプで送ることができる。特定の実施形態において、このポンピングは、カートリッジ(表面層を有するチャネルを含む)をローラを含む装置とインターフェースすることによって行われ、この装置は、ローラを表面層の一部と係合させて表面層の一部を関連チャネルの壁および/または基部に挟み、ローラを回転運動で関連チャネルの壁および/または基部に沿って並進させて表面層のピンチを壁および/または基部に対して並進させること、および/またはローラを表面層の第2の部分と係合解除する(disengaging)ことを含む。特定の実施形態において、クランク・ロッカー・機構が、ローラのこの運動を実行するために装置に組み込まれる。
従来の蠕動ポンプは、一般に、回転キャリッジ上のローラを含む装置内に挿入されたチューブを含み、その結果、ポンプが機能するとき、チューブは常に装置の残りの部分と係合する。対照的に、特定の実施形態において、本明細書に記載されるカートリッジ内のチャネルは、ローラが水平面と係合するように、直線状であるか、または少なくとも1つの直線部分を含む。特定の実施形態において、ローラはバネ負荷された小さなローラアームに連結され、それにより、同ローラは表面層の一部を連続的に挟持しながら水平表面を追跡することができる。装置(例えば、装置のローラアーム)にばねを負荷することは、場合によっては、装置(例えば、ローラ)によってカートリッジの表面層およびチャネルに加えられる力を調整するのを助けることができる。
特定の実施形態において、ローラに連結されたクランク・ロッカー・機構におけるクランクの各回転は、別個のポンピング容積を提供する。特定の実施形態において、ローラがいずれのカートリッジからも係合解除される係合解除位置に装置を駐車する(park)ことは容易である。特定の実施形態において、前方および後方のポンピング運動は、本明細書に記載される装置によって提供されるようにかなり対称的であり、その結果、前方および後方のポンピング運動には、同程度の力(トルク)(例えば10%以内)が必要とされる。
特定の実施形態において、特定のサイズの装置に対して、比較的高いクランク半径(例えば、2mm以上、任意で関連するリンケージを含む)を有することが有利であり得る。したがって、特定の実施形態において、関連するカートリッジと係合するための比較的高いストローク長(例えば、10mm以上)を有することも有利であり得る。比較的高いクランク半径およびストローク長を有することは、特定の実施形態では、装置の構成要素をカートリッジに対して移動させるときに、装置とカートリッジとの間に機械的干渉がないことを保証する。
特定の実施態様において、V形溝を有することは、有利には、くさび形の縁部を有する種々のサイズのローラとの使用を可能にする。これとは対照的に、例えば、V溝ではなく矩形チャネルを有することは、矩形チャネルに関連するローラの幅を矩形チャネルの幅に関してより制御しかつ正確にする必要があり、かつ矩形チャネルに加えられる力をより正確にする必要がある。同様に、半円形断面を有するチャネルもまた、関連するローラの幅について、より制御された正確な寸法を必要とし得る。
特定の実施形態において、本明細書に記載される装置は、装置の少なくとも一部を複数の次元(dimension)(例えば、2次元、3次元)で移動させるように構成された多軸システム(例えばロボット)を含むことができる。例えば、多軸システムは、関連するカートリッジ間の任意のポンピングレーン位置に装置の少なくとも一部を移動させるように構成することができる。例えば、特定の実施形態において、本明細書に記載されるキャリッジは、多軸システムに機能的に連結されてもよい。例えば、特定の実施形態において、ローラは、多軸システムに間接的に機能的に連結されてもよい。特定の実施形態において、ローラに連結されたクランク・ロッカー・機構を含む装置部分を多軸システムに機能的に連結することができる。特定の実施形態において、各ポンピングレーンは、位置によってアドレス指定され、多軸システムを用いて本明細書に記載される装置によってアクセスされ得る。
核酸配列決定プロセス
本開示のいくつかの態様は、核酸(例えば、デオキシリボ核酸またはリボ核酸)の配列を決定することをさらに含む。いくつかの態様において、本願明細書に記載される組成物、デバイス、システム、および技術を用いて、核酸に組み込まれた一連のヌクレオチドを(例えば、標識された一連のヌクレオチドの取り込みの経時変化を検出することによって)同定することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される組成物、デバイス、システム、および技術を用いて、重合酵素(例えば、RNAポリメラーゼ)によって合成される鋳型依存性核酸配列決定反応生成物に組み込まれる一連のヌクレオチドを同定することができる。
本開示のいくつかの態様は、核酸(例えば、デオキシリボ核酸またはリボ核酸)の配列を決定することをさらに含む。いくつかの態様において、本願明細書に記載される組成物、デバイス、システム、および技術を用いて、核酸に組み込まれた一連のヌクレオチドを(例えば、標識された一連のヌクレオチドの取り込みの経時変化を検出することによって)同定することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される組成物、デバイス、システム、および技術を用いて、重合酵素(例えば、RNAポリメラーゼ)によって合成される鋳型依存性核酸配列決定反応生成物に組み込まれる一連のヌクレオチドを同定することができる。
従って、本明細書では、標的核酸の配列を決定する方法も提供される。いくつかの実施形態において、標的核酸は、標的核酸の配列を決定する前に、濃縮される(例えば、電気泳動法、例えば、アフィニティーSCODAを使用して濃縮される)。いくつかの実施形態において、本明細書では、サンプル(例えば、精製されたサンプル、細胞溶解物、単一細胞、細胞の集団、または組織)中に存在する複数の標的核酸(例えば、少なくとも2、3、4、5、10、15、20、30、50またはそれ以上の標的核酸)の配列を決定する方法が提供される。いくつかの実施形態において、サンプルは、サンプル中に存在する標的核酸または複数の標的核酸の配列を決定する前に、本明細書中に記載されるように調製される(例えば、標的核酸に対して溶解され、精製され、断片化され、および/または濃縮される)。いくつかの実施形態において、標的核酸は、濃縮された(例えば、電気泳動法、例えばアフィニティーSCODAを用いて濃縮された)標的核酸である。
いくつかの実施形態において、配列決定の方法は、以下のステップを含む:(i)標的体積中の複合体であって、サンプル中に存在する標的核酸または複数の核酸、少なくとも1つのプライマー、および重合酵素を含む複合体を1つまたは複数の標識ヌクレオチドに曝露すること;(ii)1つもしくは複数の励起エネルギーまたは1つもしくは複数の励起エネルギーの一連のパルスを標的体積の近傍に指向させること;(iii)少なくとも1つのプライマーのうちの1つを含む核酸への逐次的組み込み中に、1つまたは複数の標識ヌクレオチドから放出された複数の光子を検出すること;および(iv)放出された光子の1つまたは複数の特徴を決定することによって組み込まれたヌクレオチドの配列を同定すること。
別の態様において、本開示は、複数の核酸フラグメントを配列決定することによって、サンプル中に存在する標的核酸または複数の標的核酸を配列決定する方法を提供し、ここで、1つまたは複数の標的核酸はフラグメントを含む。特定の実施形態において、方法は、複数のフラグメント配列を組み合わせて、親核酸(例えば、親標的核酸)の配列または部分配列を提供することを含む。いくつかの実施形態において、組み合わせるステップは、コンピュータのハードウェアおよびソフトウェアによって実行される。本明細書中に記載される方法は、全染色体またはゲノムのような一組の関連核酸(例えば、サンプル中に存在する2つ以上の核酸)の配列決定を可能にし得る。
いくつかの実施形態において、プライマーは、配列決定プライマーである。いくつかの実施形態において、配列決定プライマーは、固体支持体に固定化されていてもされていなくてもよい核酸(例えば、標的核酸)にアニーリングされ得る。固体支持体は、例えば、核酸配列決定に使用されるチップまたはカートリッジ上のサンプルウェル(例えば、ナノアパーチャ、反応チャンバ)を含むことができる。いくつかの実施形態において、配列決定プライマーを固体支持体に固定化することができ、核酸(例えば、標的核酸)のハイブリダイゼーションは、核酸分子を固体支持体にさらに固定化する。いくつかの実施形態において、ポリメラーゼ(例えば、RNAポリメラーゼ)を固体支持体に固定化し、可溶性配列決定プライマーおよび核酸をポリメラーゼに接触させる。いくつかの実施形態において、ポリメラーゼ、核酸(例えば、標的核酸)およびプライマーを含む複合体が溶液中で形成され、複合体が固体支持体に(例えば、ポリメラーゼ、プライマー、および/または標的核酸の固定化を介して)固定化される。いくつかの実施形態において、いずれの成分も固体支持体に固定化されない。例えば、いくつかの実施形態において、ポリメラーゼ、標的核酸、および配列決定プライマーを含む複合体は、in situで形成され、複合体は、固体支持体に固定化されない。
いくつかの実施形態において、合成法による配列決定は、標的核酸分子の集団(例えば、標的核酸のコピー)の存在および/または標的核酸の集団を達成するための標的核酸の増幅(例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR))のステップを含み得る。しかしながら、いくつかの実施形態において、合成による配列決定は、評価されている任意の1つの反応における単一の核酸分子の配列を決定するために使用され、核酸増幅は、標的核酸を調製するために必要とされないかもしれない。いくつかの実施形態において、複数の単一分子配列決定反応は、本開示の態様に従って並行して(例えば、単一のチップまたはカートリッジ上で)行われる。例えば、いくつかの実施形態において、複数の単一分子配列決定反応は、それぞれ、単一のチップまたはカートリッジ上の別個のサンプルウェル(例えば、ナノアパーチャ、反応チャンバ)において実施される。
いくつかの実施形態において、標的核酸分子の配列決定は、標的核酸の少なくとも2個(例えば、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、少なくとも14個、少なくとも15個、少なくとも16個、少なくとも17個、少なくとも18個、少なくとも19個、少なくとも20個、少なくとも25個、少なくとも30個、少なくとも35個、少なくとも40個、少なくとも45個、少なくとも50個、少なくとも60個、少なくとも70個、少なくとも80個、少なくとも90個、少なくとも100個、またはそれ以上)のヌクレオチドを同定することを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも2つのヌクレオチドは連続したヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、少なくとも2つのアミノ酸は非連続ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、標的核酸の配列決定は、標的核酸における全ヌクレオチドの100%未満(例えば、99%未満、95%未満、90%未満、85%未満、80%未満、75%未満、70%未満、65%未満、60%未満、55%未満、50%未満、45%未満、40%未満、35%未満、30%未満、25%未満、20%未満、15%未満、10%未満、5%未満、1%未満)の同定を含む。例えば、いくつかの実施形態において、標的核酸の配列決定は、標的核酸における1つの型のヌクレオチドの100%未満の同定を含む。いくつかの実施形態において、標的核酸の配列決定は、標的核酸における各型のヌクレオチドの100%未満の同定を含む。
タンパク質配列決定プロセス
本開示の態様はまた、タンパク質の配列決定および同定の方法、ポリペプチドの配列決定および同定の方法、アミノ酸同定の方法、ならびにかかる方法を実施するための組成物、システム、およびデバイスを含む。このようなタンパク質の配列決定および同定は、いくつかの実施形態において、本明細書にさらに詳細に記載されるサンプル調製および/またはゲノム配列決定を実施するのと同じ機器を用いて行われる。いくつかの態様において、標的タンパク質の配列を決定する方法が記載される。いくつかの実施形態において、標的タンパク質は、標的タンパク質の配列を決定する前に、濃縮される(例えば、電気泳動法、例えば、アフィニティーSCODAを使用して濃縮される)。いくつかの態様において、サンプル(例えば、精製されたサンプル、細胞溶解物、単一細胞、細胞の集団、または組織)中に存在する複数のタンパク質(例えば、少なくとも2、3、4、5、10、15、20、30、50またはそれ以上)の配列を決定する方法が記載される。いくつかの実施形態において、サンプルは、サンプル中に存在する標的タンパク質または複数の標的タンパク質の配列を決定する前に、本明細書中に記載されるように調製される(例えば、標的タンパク質について溶解され、精製され、断片化され、および/または濃縮される)。いくつかの実施形態において、標的タンパク質は、濃縮された(例えば、電気泳動法、例えばアフィニティーSCODAを用いて濃縮された)標的タンパク質である。
本開示の態様はまた、タンパク質の配列決定および同定の方法、ポリペプチドの配列決定および同定の方法、アミノ酸同定の方法、ならびにかかる方法を実施するための組成物、システム、およびデバイスを含む。このようなタンパク質の配列決定および同定は、いくつかの実施形態において、本明細書にさらに詳細に記載されるサンプル調製および/またはゲノム配列決定を実施するのと同じ機器を用いて行われる。いくつかの態様において、標的タンパク質の配列を決定する方法が記載される。いくつかの実施形態において、標的タンパク質は、標的タンパク質の配列を決定する前に、濃縮される(例えば、電気泳動法、例えば、アフィニティーSCODAを使用して濃縮される)。いくつかの態様において、サンプル(例えば、精製されたサンプル、細胞溶解物、単一細胞、細胞の集団、または組織)中に存在する複数のタンパク質(例えば、少なくとも2、3、4、5、10、15、20、30、50またはそれ以上)の配列を決定する方法が記載される。いくつかの実施形態において、サンプルは、サンプル中に存在する標的タンパク質または複数の標的タンパク質の配列を決定する前に、本明細書中に記載されるように調製される(例えば、標的タンパク質について溶解され、精製され、断片化され、および/または濃縮される)。いくつかの実施形態において、標的タンパク質は、濃縮された(例えば、電気泳動法、例えばアフィニティーSCODAを用いて濃縮された)標的タンパク質である。
いくつかの実施形態において、本開示は、混合物からタンパク質の1つまたは複数の型のアミノ酸を同定することによって、複数のタンパク質を含むサンプル中の個々のタンパク質を配列決定および/または同定する方法を提供する。いくつかの実施形態において、タンパク質の1つまたは複数のアミノ酸(例えば、末端アミノ酸または内部アミノ酸)が(例えば、直接的または間接的に、例えば、結合剤を使用することにより)標識され、タンパク質における標識されたアミノ酸の相対位置が決定される。いくつかの実施形態において、タンパク質中のアミノ酸の相対位置は、一連のアミノ酸標識および切断ステップを用いて決定される。いくつかの実施形態において、タンパク質中の標識されたアミノ酸の相対位置は、タンパク質からアミノ酸を除去することなく決定され得るが、それは、タンパク質分子中の標識されたアミノ酸の相対位置を決定するために、標識されたタンパク質を孔(例えば、タンパク質チャネル)を介して移動させ、孔を介した移動の間に標識されたアミノ酸からの信号(例えば、フェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)信号)を検出することによってである。
いくつかの実施形態において、末端アミノ酸(例えば、N末端またはC末端アミノ酸)の同一性は、末端アミノ酸が除去され、末端の次のアミノ酸の同一性が評価される前に決定され;このプロセスは、タンパク質中の複数の連続したアミノ酸が評価されるまで繰り返すことができる。いくつかの実施形態において、アミノ酸の同一性を評価することは、存在するアミノ酸の型を決定することを含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸の型を決定することは、実際のアミノ酸同一性を決定すること(例えば、天然に存在する20個のアミノ酸のうちのどのアミノ酸であるかを、例えば、個々の末端アミノ酸に特異的な結合剤を使用して決定すること)を含む。しかしながら、いくつかの実施形態において、末端アミノ酸型の同一性を評価することは、タンパク質の末端に存在し得る潜在的なアミノ酸のサブセットを決定することを含み得る。いくつかの実施形態において、これは、アミノ酸が1つまたは複数の特定のアミノ酸ではないこと(すなわち、したがって、他のアミノ酸のいずれであってもよい)を決定することによって達成することができる。いくつかの実施形態において、これは、アミノ酸の特定のサブセット(例えば、サイズ、電荷、疎水性、結合特性に基づく)のどれがタンパク質の末端にあり得るかを(例えば、2つ以上の末端アミノ酸の特定のサブセットに結合する結合剤を使用して)決定することによって達成することができる。
いくつかの実施形態において、タンパク質またはポリペプチドは、複数のより小さなタンパク質またはポリペプチドに消化され得、配列情報は、これらのより小さなタンパク質またはポリペプチドの1つ以上から得ることができる(例えば、タンパク質の末端アミノ酸を連続的に評価し、そのアミノ酸を除去して末端の次のアミノ酸を露出させることを含む方法を用いて)。
いくつかの実施形態において、タンパク質は、そのアミノ(N)末端から配列決定される。いくつかの実施形態において、タンパク質は、そのカルボキシ(C)末端から配列決定される。いくつかの実施形態において、タンパク質の第1の末端(例えば、NまたはC末端)は固定化され、他の末端(例えば、CまたはN末端)は、本明細書に記載されるように配列決定される。
本明細書で使用される場合、タンパク質の配列決定は、タンパク質の配列情報を決定することを指す。いくつかの実施形態において、これは、タンパク質の一部(またはすべて)についての各連続するアミノ酸の同一性を決定することを含み得る。いくつかの実施形態において、これは、フラグメント(例えば、標的タンパク質のフラグメントまたは複数のタンパク質を含むサンプルのフラグメント)の同一性を決定することを含み得る。いくつかの実施形態において、これは、タンパク質内のアミノ酸のサブセットの同一性を評価することを含み得る(例えば、タンパク質中の各アミノ酸の同一性を決定することなく、1つまたは複数のアミノ酸型の相対位置を決定する)。いくつかの実施形態において、アミノ酸含有量情報は、タンパク質中の異なる型のアミノ酸の相対的位置を直接決定することなく、タンパク質から得ることができる。アミノ酸含有量のみを使用して、存在するタンパク質の同一性を推測することができる(例えば、アミノ酸含有量をタンパク質情報のデータベースと比較し、どのタンパク質が同じアミノ酸含有量を有するかを決定することによって)。
いくつかの実施形態において、(例えば、酵素的および/または化学的開裂を介して)複数のタンパク質を含む標的タンパク質またはサンプルから得られた複数のタンパク質フラグメントの配列情報を解析して、サンプル中に存在する標的タンパク質または複数のタンパク質の配列を再構築または推定することができる。したがって、いくつかの実施形態において、1つまたは複数の型のアミノ酸を選択的に結合する1つまたは複数の標識親和性試薬の発光を検出することによって、1つまたは複数の型のアミノ酸が同定される。いくつかの実施形態において、1つまたは複数の型のアミノ酸は、標識タンパク質の発光を検出することによって同定される。
いくつかの実施形態において、本開示は、経時的に(例えば、反復検出および末端でのアミノ酸の切断によって)タンパク質の末端に存在する一連のアミノ酸を同定することによってタンパク質を配列決定するための組成物、デバイス、および方法を提供する。さらに他の実施形態において、本開示は、タンパク質の標識されたアミノ含量を同定し、参照配列データベースと比較することによってタンパク質を配列決定するための組成物、デバイス、および方法を提供する。
いくつかの実施形態において、本開示は、タンパク質の複数のフラグメントを配列決定することによってタンパク質を配列決定するための組成物、デバイス、および方法を提供する。いくつかの実施形態において、タンパク質を配列決定することは、タンパク質の配列を同定および/または決定するために、複数のタンパク質フラグメントの配列情報を組み合わせることを含む。いくつかの実施形態において、配列情報を組み合わせることは、コンピュータハードウェアおよびソフトウェアによって実行され得る。本明細書に記載される方法は、生物の全プロテオームのような一組の関連タンパク質を配列決定することを可能にし得る。いくつかの実施形態において、複数の単一分子配列決定反応は、本開示の態様に従って並行して(例えば、単一のチップまたはカートリッジ上で)行われる。例えば、いくつかの実施形態において、複数の単一分子配列決定反応は、それぞれ、単一のチップまたはカートリッジ上の別個のサンプルウェルにおいて実施される。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される方法は、複数のタンパク質を含むサンプル中の個々のタンパク質の配列決定および同定のために使用され得る。いくつかの実施形態において、本開示は、複数のタンパク質を含むサンプル中の個々のタンパク質を一意的に同定する方法を提供する。いくつかの実施形態において、個々のタンパク質は、タンパク質の部分的なアミノ酸配列を決定することによって、混合サンプル中で検出される。いくつかの実施形態において、タンパク質の部分的なアミノ酸配列は、約5~50、10~50、25~50、25~100、または50~100アミノ酸の連続した範囲(stretch)内にある。
特定の理論に拘束されることを望まないが、大部分のヒトタンパク質は、プロテオミクスデータベースを参照した不完全な配列情報を用いて同定できることが期待される。例えば、ヒトプロテオームの単純なモデル化により、6~40アミノ酸の範囲内でわずか4種類のアミノ酸を検出するだけで、約98%のタンパク質をユニークに同定できることが示されている(スワミナサン(Swaminathan)他、PLoS Comput Biol.、2015、11(2):e1004080;およびヤオ(Yao)他、Phys.Biol.、2015、12(5):055003を参照されたい)。したがって、複数のタンパク質を含むサンプルは、約6~40アミノ酸の短いタンパク質フラグメントに断片化(例えば、化学的に分解される、酵素的に分解される)することができ、このタンパク質ベースのライブラリーの配列決定は、元のサンプル中に存在するタンパク質の各々の同一性および存在量を明らかにするであろう。部分的配列情報を決定することによる選択的アミノ酸標識およびポリペプチドを同定するための組成物および方法は、発明の名称が「単一分子ペプチド配列決定(SINGLE MOLECULE PEPTIDE SEQUENCING)」である2015年9月15日に出願された米国特許出願第15/510962号に詳細に記載されており、同特許出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
本開示に従う配列決定は、いくつかの態様において、タンパク質(例えば、標的タンパク質)を基板(substrate)(例えば、本明細書に記載される配列決定デバイスまたはモジュールにおける、例えばチップまたはカートリッジなどの固体支持体)の表面に固定化することを含んでもよい。いくつかの実施形態において、タンパク質は、基板上のサンプルウェルの表面(例えば、サンプルウェルの底面)に固定化されてもよい。いくつかの実施形態において、タンパク質のN末端アミノ酸は固定化されている(例えば、表面に付着している)。いくつかの実施形態において、タンパク質のC末端アミノ酸は固定化されている(例えば、表面に付着している)。いくつかの実施形態において、1つまたは複数の非末端アミノ酸が固定化されている(例えば、表面に付着している)。1つまたは複数の固定化アミノ酸は、例えば本開示に記載されるような、任意の適切な共有結合または非共有結合を用いて付着させることができる。いくつかの実施形態では、複数のタンパク質は、例えば、基板上のサンプルウェルのアレイにおいて、複数のサンプルウェルに付着される(例えば、1つのタンパク質が各サンプルウェルの表面、例えば、底面に付着された状態で)。
いくつかの実施形態において、末端アミノ酸(例えば、N末端またはC末端アミノ酸)の同一性(identity)が決定され、次いで、末端アミノ酸が除去され、末端における次のアミノ酸の同一性が決定される。このプロセスは、タンパク質中の複数の連続するアミノ酸が決定されるまで、繰り返されてもよい。いくつかの実施形態において、アミノ酸の同一性を決定することは、存在するアミノ酸の型を決定することを含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸の型を決定することは、例えば、天然に存在する20個のアミノ酸のうちのどれが末端アミノ酸であるかを決定することによって(例えば、個々の末端アミノ酸に特異的である結合剤を用いて)、実際のアミノ酸の同一性を決定することを含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸の種類は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セレノシステイン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンから選択される。いくつかの実施形態において、末端アミノ酸の型の同一性を決定することは、タンパク質の末端に存在し得る潜在的なアミノ酸のサブセットを決定することを含み得る。いくつかの実施形態において、これは、アミノ酸が1つまたは複数の特定のアミノ酸ではないこと(したがって、他のアミノ酸のいずれであってもよい)を決定することによって達成することができる。いくつかの実施形態において、これは、アミノ酸の特定のサブセット(例えば、サイズ、電荷、疎水性、翻訳後修飾、結合特性に基づく)のどれがタンパク質の末端にあり得るかを(例えば、2つ以上の末端アミノ酸の特定のサブセットに結合する結合剤を使用して)決定することによって達成することができる。
いくつかの実施形態において、末端アミノ酸の型の同一性を評価することは、アミノ酸が翻訳後修飾を含んでいることを決定することを含む。翻訳後修飾の非限定的な例としては、アセチル化、ADPリボシル化、カスパーゼ切断、シトルリン化、ホルミル化、N結合グリコシル化、O結合グリコシル化、ヒドロキシル化、メチル化、ミリストイル化、ネディル化(neddylation)、ニトロ化、酸化、パルミトイル化、リン酸化、プレニル化、S-ニトロシル化、硫酸化、スモイ化(sumoylation)およびユビキチン化などが挙げられる。
いくつかの実施形態において、タンパク質またはタンパク質は、複数のより小さいタンパク質に消化することができ、配列情報は、これらのより小さいタンパク質の1つまたは複数から得ることができる(例えば、タンパク質の末端アミノ酸を順次評価し、そのアミノ酸を除去して末端の次のアミノ酸を露出する方法を使用して)。
いくつかの実施形態において、タンパク質分子の配列決定は、タンパク質分子中の少なくとも2個(例えば、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、少なくとも14個、少なくとも15個、少なくとも16個、少なくとも17個、少なくとも18個、少なくとも19個、少なくとも20個、少なくとも25個、少なくとも30個、少なくとも35個、少なくとも40個、少なくとも45個、少なくとも50個、少なくとも60個、少なくとも70個、少なくとも80個、少なくとも90個、少なくとも100個、またはそれ以上)のアミノ酸を同定することを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも2つのアミノ酸は、連続したアミノ酸である。いくつかの実施形態において、少なくとも2つのアミノ酸は、非連続アミノ酸である。
いくつかの実施形態において、タンパク質分子の配列決定は、タンパク質分子中の全アミノ酸の100%未満(例えば、99%未満、95%未満、90%未満、85%未満、80%未満、75%未満、70%未満、65%未満、60%未満、55%未満、50%未満、45%未満、40%未満、35%未満、30%未満、25%未満、20%未満、15%未満、10%未満、5%未満、1%未満)の同定を含む。例えば、ある態様において、タンパク質分子の配列決定は、タンパク質分子中の1つの型のアミノ酸の100%未満の同定(例えば、タンパク質分子中の1つの型の全てのアミノ酸の一部の同定)を含む。いくつかの実施形態において、タンパク質分子の配列決定は、タンパク質分子中の各型のアミノ酸の100%未満の同定を含む。
いくつかの実施形態において、タンパク質分子の配列決定は、タンパク質中の少なくとも1種類、少なくとも5種類、少なくとも10種類、少なくとも15種類、少なくとも20種類、少なくとも25種類、少なくとも30種類、少なくとも35種類、少なくとも40種類、少なくとも45種類、少なくとも50種類、少なくとも55種類、少なくとも60種類、少なくとも65種類、少なくとも70種類、少なくとも75種類、少なくとも80種類、少なくとも85種類、少なくとも90種類、少なくとも95種類、少なくとも100種類以上のアミノ酸の同定を含む。
配列決定デバイスまたはモジュール
本開示に従う核酸またはタンパク質の配列決定は、いくつかの態様において、単一分子解析を可能にするシステムを使用して実施され得る。システムは、配列決定デバイスまたはモジュールと、配列決定デバイスまたはモジュールとインターフェースするように構成された機器と、を含み得る。配列決定デバイスまたはモジュールは、ピクセルのアレイを含み得、個々のピクセルは、サンプルウェルおよび少なくとも1つの光検出器を含む。配列決定デバイスまたはモジュールのサンプルウェルは、配列決定デバイスまたはモジュールの表面上または表面を通して形成され得、配列決定デバイスまたはモジュールの表面に配置されたサンプルを受承するように構成され得る。いくつかの実施形態において、サンプルウェルは、デバイスに挿入することができるカートリッジ(例えば、使い捨てまたは単回使用用カートリッジ)の構成要素である。全体として、サンプルウェルはサンプルウェルのアレイと見なすことができる。複数のサンプルウェルは、サンプルウェルの少なくとも一部が単一の標的分子または複数の分子(例えば、標的核酸または標的タンパク質)を含むサンプルを受承するように、適切なサイズおよび形状を有し得る。いくつかの実施形態において、サンプルウェル内の分子の数は、いくつかのサンプルウェルが1つの分子(例えば、標的核酸または標的タンパク質)を含み、他のサンプルウェルが0個、2個、または複数の分子を含むように、配列決定デバイスまたはモジュールのサンプルウェル間に分配されてもよい。
本開示に従う核酸またはタンパク質の配列決定は、いくつかの態様において、単一分子解析を可能にするシステムを使用して実施され得る。システムは、配列決定デバイスまたはモジュールと、配列決定デバイスまたはモジュールとインターフェースするように構成された機器と、を含み得る。配列決定デバイスまたはモジュールは、ピクセルのアレイを含み得、個々のピクセルは、サンプルウェルおよび少なくとも1つの光検出器を含む。配列決定デバイスまたはモジュールのサンプルウェルは、配列決定デバイスまたはモジュールの表面上または表面を通して形成され得、配列決定デバイスまたはモジュールの表面に配置されたサンプルを受承するように構成され得る。いくつかの実施形態において、サンプルウェルは、デバイスに挿入することができるカートリッジ(例えば、使い捨てまたは単回使用用カートリッジ)の構成要素である。全体として、サンプルウェルはサンプルウェルのアレイと見なすことができる。複数のサンプルウェルは、サンプルウェルの少なくとも一部が単一の標的分子または複数の分子(例えば、標的核酸または標的タンパク質)を含むサンプルを受承するように、適切なサイズおよび形状を有し得る。いくつかの実施形態において、サンプルウェル内の分子の数は、いくつかのサンプルウェルが1つの分子(例えば、標的核酸または標的タンパク質)を含み、他のサンプルウェルが0個、2個、または複数の分子を含むように、配列決定デバイスまたはモジュールのサンプルウェル間に分配されてもよい。
いくつかの実施形態において、配列決定デバイスまたはモジュールは、サンプル調製デバイスまたはモジュールから複数の分子(例えば、標的核酸または標的タンパク質)を含む標的分子またはサンプルを受承するように配置される。いくつかの実施形態において、配列決定デバイスまたはモジュールは、サンプル調製デバイスまたはモジュールに直接(例えば、物理的に付着して)または間接的に連結される。
励起光は、配列決定デバイスまたはモジュールの外部の1つまたは複数の光源から配列決定デバイス装置またはモジュールに提供される。配列決定デバイスまたはモジュールの光学部品は、光源から励起光を受け取り、その光を配列決定デバイスまたはモジュールのサンプルウェルのアレイに向け、サンプルウェル内の照明領域を照明することができる。いくつかの実施形態において、サンプルウェルは、複数の分子を含む標的分子またはサンプルがサンプルウェルの表面に近接して保持されることを可能にする構成を有することができ、これにより、サンプルウェルへの励起光の送達および複数の分子を含む標的分子またはサンプルからの放出光の検出を容易にすることができる。照射領域内に配置された複数の分子を含む標的分子またはサンプルは、励起光によって照射されることに応答して放出光を放出することができる。例えば、核酸またはタンパク質(またはそれらの複数個)は、励起光の照射によって励起状態となることに応答して光を発する蛍光マーカーで標識することができる。次に、複数の分子を含む標的分子またはサンプルによって放出される放出光は、分析される複数の分子を含む標的分子またはサンプルを備えたサンプルウェルに対応するピクセル内の1つまたは複数の光検出器によって検出され得る。いくつかの実施形態によれば、約10,000ピクセル~1,000,000ピクセルの間の数の範囲であり得るサンプルウェルのアレイ全体にわたって実行される場合、複数のサンプルウェルを並行して分析することができる。
配列決定デバイスまたはモジュールは、励起光を受け取り、励起光をサンプルウェルアレイの間に導くための光学システムを含むことができる。光学システムは、励起光を配列決定デバイスまたはモジュールに結合し、励起光を他の光学部品に向けるように構成された1つまたは複数の格子カプラを含むことができる。光学システムは、励起光を格子カプラからサンプルウェルアレイに向ける光学部品を含むことができる。そのような光学部品は、光スプリッタ、光結合器、および導波路を含むことができる。いくつかの実施形態において、1つまたは複数の光スプリッタは、格子カプラからの励起光を結合し、励起光を少なくとも1つの導波路に送達することができる。いくつかの実施形態によれば、光スプリッタは、導波路の各々が実質的に同量の励起光を受け取るように、全ての導波路にわたって実質的に均一な励起光の送達を可能にする構成を有することができる。そのような実施形態は、配列決定デバイスまたはモジュールのサンプルウェルによって受承される励起光の均一性を改善することによって、配列決定デバイスまたはモジュールの性能を改善することができる。励起光をサンプルウェルに結合するため、および/または放出光を光検出器に指向させるための、配列決定デバイスまたはモジュールに含めるための適切な構成要素の例は、2015年8月7日に出願された発明の名称が「分子を探査し、検出し、分析するための統合された装置(INTEGRATED DEVICE FOR PROBING,DETECTING AND ANALYZING MOLECULES)」である米国特許出願第14/821,688号および2014年11月17日に出願された発明の名称が「分子を探査し、検出し、分析するための外部光源を備えた統合された装置(INTEGRATED DEVICE WITH EXTERNAL LIGHT SOURCE FOR PROBING,DETECTING,AND ANALYZING MOLECULES)」である米国特許出願第14/543,865号に記載されており、これらはいずれも参照により本明細書に組み込まれる。配列決定デバイスまたはモジュールに実装され得る適切な格子カプラおよび導波路の例は、2017年12月15日に出願された発明の名称が「光カプラおよび導波路システム(OPTICAL COUPLER AND WAVEGUIDE SYSTEM)」である米国特許出願第15/844,403号に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
追加のフォトニック構造は、サンプルウェルと光検出器との間に配置されてもよく、そうでなければ、発光する光を検出する際の信号ノイズに寄与する励起光が光検出器に到達するのを低減または防止するように構成されてもよい。いくつかの実施形態において、配列決定デバイスまたはモジュールのための回路として作用し得る金属層は、空間フィルタとしても作用し得る。適切なフォトニック構造の例は、スペクトルフィルタ、偏光フィルタおよび空間フィルタを含むことができ、2018年7月23日に出願された発明の名称が「光拒絶光構造(OPTICAL REJECTION PHOTONIC STRUCTURES)」である米国特許出願第16/042,968号に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
配列決定デバイスまたはモジュールから離れて配置された構成要素を使用して、励起源を配列決定デバイスまたはモジュールに位置決めする、および整列させることができる。そのような構成要素は、レンズ、ミラー、プリズム、窓、アパーチャ、減衰器、および/または光ファイバを含む光学構成要素を含み得る。1つまたは複数の位置合わせ構成要素の制御を可能にするために、追加の機械的構成要素を機器に含めることができる。そのような機械的構成要素は、アクチュエータ、ステッパモータ、および/またはノブを含むことができる。適切な励起源および整列機構の例は、2016年5月20日に出願された発明の名称が「パルスレーザおよびシステム(PULSED LASER AND SYSTEM)」である米国特許出願第15/161,088号に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。ビームステアリングモジュールの別の例は、2017年12月14日に出願された発明の名称が「コンパクトビーム成形およびステアリングアセンブリ(COMPACT BEAM SHAPING AND STEERING ASSEMBLY)」である米国特許出願第15/842,720号に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。適切な励起源のさらなる例は、2015年8月7日に出願された発明の名称が「分子を探査し、検出し、分析するための統合された装置(INTEGRATED DEVICE FOR PROBING,DETECTING AND ANALYZING MOLECULES)」である米国特許出願第14/821,688号に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
配列決定デバイスまたはモジュールの個々のピクセルとともに配置された光検出器は、ピクセルの対応するサンプルウェルからの放出光を検出するように構成および配置され得る。適切な光検出器のさらなる例は、2015年8月7日に出願された発明の名称が「分子を探査し、検出し、分析するための統合された装置(INTEGRATED DEVICE FOR PROBING,DETECTING AND ANALYZING MOLECULES)」である米国特許出願第14/821,656号に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。いくつかの実施形態において、サンプルウェルおよびそのそれぞれの光検出器は、共通の軸に沿って整列され得る。このようにして、光検出器は、ピクセル内でサンプルと十分に重なる可能性がある。
検出された放出光の特性は、放出光に関連するマーカーを識別するための指標を提供し得る。そのような特性は、光検出器によって検出された光子の到着時間、光検出器によって経時的に蓄積された光子の量、および/または2つ以上の光検出器にわたる光子の分布を含む、任意の適切なタイプの特性を含み得る。いくつかの実施形態において、光検出器は、サンプルの発光に関連する1つまたは複数のタイミング特性(例えば、発光寿命)の検出を可能にする構成を有し得る。光検出器は、励起光のパルスが配列決定デバイスまたはモジュールを通って伝播した後の光子到着時間の分布を検出することができ、到着時間の分布は、サンプルの放出光のタイミング特性(例えば、発光寿命のプロキシ(proxy))の指標を提供することができる。いくつかの実施形態において、1つまたは複数の光検出器は、マーカー(例えば、発光強度)によって放出される放出光の確率の指標を提供する。いくつかの実施形態において、複数の光検出器は、放出光の空間分布を捕捉するようにサイズ設定および配置され得る。次に、1つまたは複数の光検出器からの出力信号を使用して、複数のマーカーの中から1つのマーカー区別することができ、複数のマーカーを使用して、サンプル内の1つのサンプルを識別することができる。いくつかの実施形態において、サンプルは、複数の励起エネルギーによって励起されてもよく、複数の励起エネルギーに応答してサンプルによって放出される放出光および/または放出光のタイミング特性は、1つのマーカーを複数のマーカーから区別し得る。
動作中、励起光を用いてウェル内のサンプルの一部または全部を励起し、光検出器でサンプル放出からの信号を検出することによって、サンプルウェル内のサンプルの並列分析を行う。サンプルからの放出光は、対応する光検出器によって検出され、少なくとも1つの電気信号に変換され得る。電気信号は、配列決定デバイスまたはモジュールとインターフェースされた機器に連結され得る、配列決定デバイスまたはモジュールの回路内の導線に沿って送信され得る。電気信号は、続いて処理および/または解析され得る。電気信号の処理および/または解析は、機器の内外に配置された適切なコンピューティングデバイス上で行われ得る。
機器は、機器および/または配列決定デバイスまたはモジュールの動作を制御するためのユーザインターフェースを含み得る。ユーザインターフェースは、ユーザが、機器の機能を制御するために使用されるコマンドおよび/または設定などの情報を機器に入力できるように構成されてもよい。いくつかの実施形態において、ユーザインターフェースは、音声コマンド用のボタン、スイッチ、ダイヤル、および/またはマイクロフォンを含み得る。ユーザインターフェースは、ユーザが、適切な位置合わせおよび/または配列決定デバイスまたはモジュール上の光検出器からの読み出し信号によって得られる情報など、機器および/または配列決定デバイスまたはモジュールの性能に関するフィードバックを受信することを可能にし得る。いくつかの実施形態において、ユーザインターフェースは、可聴フィードバックを提供するためにスピーカーを使用してフィードバックを提供することができる。いくつかの実施形態において、ユーザインターフェースは、ユーザに視覚的なフィードバックを提供するための表示灯および/または表示スクリーンを含み得る。
いくつかの実施形態において、本明細書で説明される機器またはデバイスは、コンピューティングデバイスと接続するように構成されたコンピュータインターフェースを含み得る。コンピュータインターフェースは、USBインターフェース、FireWire(登録商標)インターフェース、または他の任意の適切なコンピュータインターフェースとすることができる。コンピューティングデバイスは、ラップトップまたはデスクトップコンピュータなどの任意の汎用コンピュータであり得る。いくつかの実施形態において、コンピューティングデバイスは、適切なコンピュータインターフェースを介して無線ネットワークを介してアクセス可能なサーバ(例えば、クラウドベースのサーバ)であり得る。コンピュータインターフェースは、機器とコンピューティングデバイスとの間の情報の通信を容易にすることができる。機器を制御および/または構成するための入力情報は、コンピューティングデバイスに提供され、コンピュータインターフェースを介して機器に送信され得る。機器によって作製された出力情報は、コンピュータインターフェースを介してコンピューティングデバイスによって受信され得る。出力情報には、機器の性能、配列決定デバイスまたはモジュールの性能、および/または光検出器の読み出し信号から作製されたデータに関するフィードバックが含まれていてもよい。
いくつかの実施形態において、機器は、配列決定デバイスまたはモジュールの1つまたは複数の光検出器から受信したデータを分析し、および/または制御信号を励起源に送信するように構成された処理デバイスを含み得る。いくつかの実施形態において、処理デバイスは、汎用プロセッサ、および/または特別に適合されたプロセッサ(例えば、1つまたは複数のマイクロプロセッサまたはマイクロコントローラコアなどの中央処理装置(CPU)、フィールドプログラマブルゲートアレイ(FPGA)、特定用途向け集積回路(ASIC)、カスタム集積回路、デジタル信号プロセッサ(DSP)、またはこれらの組み合わせ)を含むことができる。いくつかの実施形態において、1つまたは複数の光検出器からのデータの処理は、機器の処理デバイスおよび外部コンピューティングデバイスの両方によって実行され得る。その他の実施形態において、外部コンピューティングデバイスを省略して、1つまたは複数の光検出器からのデータの処理は、配列決定デバイスまたはモジュールの処理デバイスによってのみ実行されてもよい。
いくつかの実施形態によれば、ルミネッセンス発光特性に基づいて複数の分子を含む標的分子またはサンプルを分析するように構成された機器は、異なるルミネッセンス分子間のルミネッセンス寿命および/または強度における差異、および/または異なる環境における同じルミネッセンス分子の寿命および/または強度における差異を検出することができる。本発明者らは、ルミネッセンス発光寿命の差を用いて、異なるルミネッセンス分子の存在または非存在を識別すること、および/またはルミネッセンス分子がさらされる異なる環境または条件を識別することができることを認識し、評価した。場合によっては、(例えば発光波長ではなく)寿命に基づいて発光分子を識別することにより、システムの態様を単純化することができる。一例として、波長識別光学系(例えば、波長フィルタ、各波長用の専用検出器、異なる波長における専用パルス光源、および/または回折光学系)は、寿命に基づいてルミネッセンス分子を識別するときに、数を減らしてもよく、または排除してもよい。場合によっては、単一の特徴的な波長で動作する単一のパルス光源を使用して、光学スペクトルの同じ波長領域内で発光するが、測定可能な異なる寿命を有する異なる発光分子を励起することができる。同じ波長領域で発光する異なる発光分子を励起および識別するために、異なる波長で動作する複数の光源ではなく、単一のパルス光源を使用する分析システムは、動作および維持するための複雑さが少なく、よりコンパクトであり、より低コストで製造することができる。
ルミネッセンス寿命分析に基づく分析システムは、ある種の利点を有し得るが、分析システムによって得られる情報の量および/または検出精度は、追加の検出技術を許容することによって増加され得る。例えば、システムのいくつかの実施形態は、さらに、ルミネッセンス波長および/またはルミネッセンス強度に基づいてサンプルの1つまたは複数の特性を識別するように構成されてもよい。いくつかの実装形態において、ルミネッセンス強度は、異なるルミネッセンス標識を区別するために追加的にまたは代替的に使用され得る。例えば、いくつかの発光標識は、それらの減衰速度が類似していても、有意に異なる強度で発光するか、または励起の確率に有意差(例えば、少なくとも約35%の差)を有し得る。測定された励起光に対してビニングされた信号を参照することによって、強度レベルに基づいて異なる発光標識を区別することが可能であり得る。
いくつかの実施形態によれば、異なるルミネッセンス寿命は、ルミネッセンス標識の励起に続くタイムビン(time-bin)ルミネッセンス発光事象を行うように構成された光検出器によって区別することができる。時間ビニングは、光検出器に対する単一の電荷蓄積サイクルの間に生じ得る。電荷蓄積サイクルは、光発生キャリアが時間ビニング光検出器のビン内に蓄積される読み出しイベント間の間隔である。時間ビニング光検出器の例は、2015年8月7日に出願された発明の名称が「受信した光子の一時的ビニングのための統合されたデバイス(INTEGRATED DEVICE FOR TEMPORAL BINNING OF RECEIVED PHOTONS)」である米国特許出願第14/821,656号に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。いくつかの実施形態において、時間ビニング光検出器は、光子吸収/キャリア生成領域内に電荷キャリアを生成し、電荷キャリア格納領域内の電荷キャリア格納ビンに電荷キャリアを直接転送することができる。そのような実施形態において、時間ビニング光検出器は、キャリア移動/捕捉領域を含まなくてもよい。このような時間ビニング光検出器は、「直接ビニングピクセル」と呼ばれることがある。時間ビニング光検出器の例は、2017年12月22日に出願された発明の名称が「直接ビニングピクセルを備えた統合光検出器(INTEGRATED PHOTODETECTOR WITH DIRECT BINNING PIXEL)」である米国特許出願第15/852,571号に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
いくつかの実施形態において、同じ型の異なる数のフルオロフォアを、標的分子の異なる成分(例えば、標的核酸または標的タンパク質)またはサンプル中に存在する複数の分子(例えば、複数の核酸または複数のタンパク質)に連結することができ、その結果、各個々の分子を発光強度に基づいて同定することができる。例えば、2つのフルオロフォアが第1の標識分子に連結されてもよく、4つ以上のフルオロフォアが第2の標識分子に連結されてもよい。異なる数のフルオロフォアのために、異なる分子に関連する異なる励起およびフルオロフォア放出確率が存在し得る。例えば、信号蓄積間隔の間に、第2の標識分子についてより多くの発光事象が存在することがあり、その結果、ビンの見かけの強度は、第1の標識分子の場合よりも有意に高くなる。
本発明者らは、フルオロフォアの崩壊速度および/またはフルオロフォアの強度に基づいて核酸またはタンパク質を区別することが、光励起および検出システムの簡略化を可能にし得ることを認識し、評価した。例えば、光励起は、単一波長源(例えば、複数の光源ではなく1つの特徴的な波長を生成する光源、または複数の異なる特徴的な波長で動作する光源)を用いて行うことができる。さらに、波長識別光学系およびフィルタは、検出システムにおいて必要とされない場合がある。また、単一の光検出器を各サンプルウェルに使用して、異なるフルオロフォアからの発光を検出してもよい。「特徴的な波長(characteristic wavelength)」または「波長」という語句は、限定された放射帯域幅内の中心波長または優勢な波長を指すために使用される。例えば、限られた帯域幅の放射は、パルス光源によって出力される20nm帯域幅内の中心波長またはピーク波長を含むことができる。場合によっては、「特徴的な波長」または「波長」を使用して、ソースによる放射出力の全帯域幅内のピーク波長を参照することができる。
サンプル調製と配列決定デバイスの組み合わせ
いくつかの実施形態において、本明細書におけるデバイスは、サンプル調製モジュールおよび配列決定モジュールを含む。いくつかの実施形態において、サンプル調製モジュールおよび配列決定モジュールを含むデバイスは、2つのカートリッジが単一の分離不可能な消耗品を含むように、サンプル調製カートリッジに埋め込まれた配列決定チップまたはカートリッジを含む。いくつかの実施形態において、配列決定チップまたはカートリッジは、消耗品支持電子機器(例えば、ワイヤ結合点、電気接点を備えたPCB基板)を必要とする。消耗品支持電子機器は、配列決定チップまたはカートリッジと直接物理的に接触してもよい。いくつかの実施形態において、配列決定チップまたはカートリッジは、蠕動ポンプ、温度制御および/または電気泳動コンタクトのためのインターフェースを必要とする。これらのインターフェースは、多くの電気接点およびレーザ位置合わせについて正確な幾何学的位置合わせを可能にすることができる。いくつかの実施形態において、チップまたはカートリッジの異なる部分は、異なる温度、物理的力、異なる電圧および電流の電気的インターフェース、振動、および/または競合する位置合わせ要件を含むことができる。いくつかの実施形態において、サンプル調製モジュールまたは配列決定モジュールのいずれかに関連する別個の機器サブシステムは、リソースを共有するために近接していなければならない。いくつかの実施形態において、サンプル調製モジュールおよび配列決定モジュールを含むデバイスは、ハンズフリーである(即ち、手を使わずに使用できる)。
いくつかの実施形態において、本明細書におけるデバイスは、サンプル調製モジュールおよび配列決定モジュールを含む。いくつかの実施形態において、サンプル調製モジュールおよび配列決定モジュールを含むデバイスは、2つのカートリッジが単一の分離不可能な消耗品を含むように、サンプル調製カートリッジに埋め込まれた配列決定チップまたはカートリッジを含む。いくつかの実施形態において、配列決定チップまたはカートリッジは、消耗品支持電子機器(例えば、ワイヤ結合点、電気接点を備えたPCB基板)を必要とする。消耗品支持電子機器は、配列決定チップまたはカートリッジと直接物理的に接触してもよい。いくつかの実施形態において、配列決定チップまたはカートリッジは、蠕動ポンプ、温度制御および/または電気泳動コンタクトのためのインターフェースを必要とする。これらのインターフェースは、多くの電気接点およびレーザ位置合わせについて正確な幾何学的位置合わせを可能にすることができる。いくつかの実施形態において、チップまたはカートリッジの異なる部分は、異なる温度、物理的力、異なる電圧および電流の電気的インターフェース、振動、および/または競合する位置合わせ要件を含むことができる。いくつかの実施形態において、サンプル調製モジュールまたは配列決定モジュールのいずれかに関連する別個の機器サブシステムは、リソースを共有するために近接していなければならない。いくつかの実施形態において、サンプル調製モジュールおよび配列決定モジュールを含むデバイスは、ハンズフリーである(即ち、手を使わずに使用できる)。
いくつかの実施形態において、サンプル調製モジュールおよび配列決定モジュールを含むデバイスは、制御方法(例えば、Sage BluePippin法、手動法(例えば、ビーズベースの手動サイズ選択方法))を用いて作製された平均リード長よりも長い下流配列決定用途のための平均リード長を有する標的核酸を作製する(例えば、濃縮する、または精製する)。いくつかの実施形態において、サンプル調製デバイスは、少なくとも700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、または3000個の長さのヌクレオチドを含む配列決定のための平均リード長を有する標的核酸を作製する。いくつかの態様において、サンプル調製デバイスは、長さが700~3000、1000~3000、1000~2500、1000~2400、1000~2300、1000~2200、1000~2100、1000~2000、1000~1900、1000~1800、1000~1700、1000~1600、1000~1500、1000~1400、1000~1300、1000~1200、1500~3000、1500~2500、1500~2000、または2000~3000個のヌクレオチドを含む配列決定のための平均リード長を有する標的核酸を作製する。
いくつかの実施形態では、サンプル調製モジュールおよび配列決定モジュールを含むデバイスは、対照または従来の方法(例えば、Sage BluePippin法とそれに続く配列決定)よりも、サンプル調製の開始とサンプル内に含まれる標的分子の検出との間の時間を短縮することを可能にする。いくつかの実施形態において、サンプル調製モジュールおよび配列決定モジュールを含む装デバイスは、対照または従来の方法(例えば、Sage BluePippin法とそれに続く配列決定)よりも短い時間(例えば、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍の時間短縮)で配列決定を用いて標的分子を検出することができる。
いくつかの実施形態において、サンプル調製モジュールおよび配列決定モジュールを含む装デバイスは、対照または従来の方法(例えば、Sage BluePippin法とそれに続く配列決定)よりもサンプルの入力値が低い標的分子を検出することができる。いくつかの実施形態において、本開示のデバイスは、わずか0.1μg、0.2μg、0.3μg、0.4μg、0.5μg、0.6μg、0.7μg、0.8μg、0.9μg、または1μg程度のサンプル(例えば、生物学的サンプル)を必要とする。いくつかの実施形態において、本開示のデバイスは、わずか10μL、20μL、30μL、40μL、50μL、60μL、70μL、80μL、90μL、100μL、110μL、130μL、150μL、175μL、200μL、225μL、または250μLのサンプル(例えば、血液などの生物学的サンプル)を必要とする。
デバイスまたはモジュール
いくつかの実施形態において、デバイスまたはモジュール(例えば、サンプル調製デバイス;配列決定デバイス;サンプル調製および配列決定デバイスの組み合わせ)は、少量の流体を、場合によっては、明確な流体流解像度(resolution)および明確な流量で正確に輸送するように構成される。いくつかの実施形態において、デバイスまたはモジュールは、0.1μL/秒以上、0.5μL/秒以上、1μL/秒以上、2μL/秒以上、5μL/秒以上、またはそれ以上の流量で流体を輸送するように構成される。いくつかの実施形態において、本明細書におけるデバイスまたはモジュールは、100μL/s以下、75μL/s以下、50μL/s以下、30μL/s以下、20μL/s以下、15μL/s以下、またはそれ以下の流量で流体を輸送するように構成される。これらの範囲の組み合わせが可能である。例えば、いくつかの実施形態において、本明細書におけるデバイスまたはモジュールは、0.1μL/s以上100μL/s以下、または5μL/s以上15μL/s以下の流量で流体を輸送するように構成される。例えば、特定の実施形態において、本明細書におけるシステム、デバイス、およびモジュールは、数十マイクロリットルまたは数百マイクロリットルのオーダーの流体流解像度を有する。流体流解像度のさらなる説明は、本明細書の他の場所で説明されている。特定の実施形態において、システム、デバイス、およびモジュールは、カートリッジの少なくとも一部を通して少量の流体を輸送するように構成される。
いくつかの実施形態において、デバイスまたはモジュール(例えば、サンプル調製デバイス;配列決定デバイス;サンプル調製および配列決定デバイスの組み合わせ)は、少量の流体を、場合によっては、明確な流体流解像度(resolution)および明確な流量で正確に輸送するように構成される。いくつかの実施形態において、デバイスまたはモジュールは、0.1μL/秒以上、0.5μL/秒以上、1μL/秒以上、2μL/秒以上、5μL/秒以上、またはそれ以上の流量で流体を輸送するように構成される。いくつかの実施形態において、本明細書におけるデバイスまたはモジュールは、100μL/s以下、75μL/s以下、50μL/s以下、30μL/s以下、20μL/s以下、15μL/s以下、またはそれ以下の流量で流体を輸送するように構成される。これらの範囲の組み合わせが可能である。例えば、いくつかの実施形態において、本明細書におけるデバイスまたはモジュールは、0.1μL/s以上100μL/s以下、または5μL/s以上15μL/s以下の流量で流体を輸送するように構成される。例えば、特定の実施形態において、本明細書におけるシステム、デバイス、およびモジュールは、数十マイクロリットルまたは数百マイクロリットルのオーダーの流体流解像度を有する。流体流解像度のさらなる説明は、本明細書の他の場所で説明されている。特定の実施形態において、システム、デバイス、およびモジュールは、カートリッジの少なくとも一部を通して少量の流体を輸送するように構成される。
いくつかの態様は、(例えば、クランク・ロッカー・機構と組み合わせて)ローラを含むポンプおよび装置の構成に関する。他の態様は、断面形状(例えば、実質的に三角形の形状)、弁、深いセクション(section)、および/または表面層(例えば、平坦なエラストマー膜)を有するチャネル(例えばマイクロチャネル)を含むカートリッジに関する。特定の態様は、蠕動ポンプの特定の構成要素(例えば、ローラ)をポンプの他の構成要素(例えば、ポンプレーン)から分離することに関する。場合によっては、装置のある要素(例えば、ローラの縁部)は、様々な利点のいずれかが達成されるような方法(例えば、係合と離脱を介して)でカートリッジの要素(例えば、表面層およびチャネルの特定の形状)と相互作用するように構成される。いくつかの非限定的な実施形態において、本明細書に記載される装置、カートリッジ、およびポンプの特定の進歩性を有する特徴および構成は、(例えば、並進可能なローラおよびローラによってインデックス付けされ得る複数の異なる流体チャネルを含む別個のカートリッジの使用により)流体ポンピングプロセスの自動化の改善に寄与する。場合によっては、本明細書に記載される特徴は、比較的少数のハードウェア構成要素(例えば、複数の異なるチャネルを有する個別のカートリッジが使用されており、その各々がローラにアクセス可能であり得るため)を用いて比較的多数の構成で比較的多数の異なる流体(例えば、複数のサンプルで多重化する場合)を処理する能力に寄与する。一例として、場合によっては、本明細書に記載された特徴は、複数の装置をカートリッジと対にして、複数のレーンを同時にポンピングするか、または他の機能のために1つのレーンで2つのポンプを使用することを可能にする。場合によっては、この特徴は、必要とされる流体体積の減少および/またはローラ/チャネル相互作用(例えば、チャネルおよび/またはローラの縁部の進歩性を有する断面形状によるもの、および/またはチャネルの進歩性を有する弁および/または深いセクションの使用によるもの)におけるより厳しい公差の減少に寄与する。場合によっては、本明細書に記載される特徴は、(例えば、蠕動ポンプの装置とカートリッジの分離により)ハードウェア構成要素の洗浄の必要性を低減する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるデバイス、カートリッジ、およびポンプの態様は、サンプルを調製するために有用である。例えば、いくつかのそのような態様を、検出モジュール(例えば、生物由来サンプルの分析/配列決定/同定のための)の上流でサンプル調製モジュールに組み込むことができる。
別の態様において、蠕動ポンプが提供される。いくつかの実施形態において、蠕動ポンプは、ローラとカートリッジとを含み、カートリッジは、チャネルを含む表面を有するベース層を含み、少なくともいくつかのチャネルの少なくとも一部は、(1)チャネルの基部に単一の頂点を有し、ベース層の表面に2つの他の頂点を有する実質的に三角形の断面を有し、(2)チャネルの表面開口部を実質的に密封するように構成されたエラストマーを含む表面層を有する。蠕動ポンプの実施形態は、本明細書の他の場所でさらに説明される。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるシステム(例えば、ポンプ、デバイス)は、ポンプサイクルを受ける。いくつかの実施形態において、ポンプサイクルは、システムのクランクの1回転に対応する。いくつかの実施形態において、各ポンプサイクルは、1μL以上、2μL以上、4μL以上、10μL以下、8μL以下、および/または6μL以下の流体を輸送することができる。上記の範囲の組み合わせも可能である(例えば、1μL~10μL)。他の範囲の流体量も可能である。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるシステムは、特定のストローク長を有する。特定の実施形態において、各ポンプサイクルが1μL~10μLのオーダーの流体を輸送することができ、および/またはチャネル寸法が好ましくは1mm幅のオーダーおよび1mm深さのオーダー(例えば、チャネル体積を減少させ、妥当な公差を維持するために、何を機械加工または成形することができるかに応じて)であり得ることを前提として、ストローク長は、10mm以上、12mm以上、14mm以上、20mm以下、18mm以下、および/または16mm以下であり得る。上記の範囲の組み合わせも可能である(例えば、10mmと20mmとの間、または10mmおよび20mmに等しい)。他の範囲も可能である。本明細書で使用される場合、「ストローク長」は、ローラが基板と係合している間に移動する距離を指す。特定の実施形態において、基板はカートリッジを含む。
別の態様において、カートリッジが提供される。いくつかの実施形態において、カートリッジは、チャネルを含む表面を有するベース層を含み、かつ少なくともいくつかのチャネルの少なくとも一部は、(1)チャネルの基部に単一の頂点を有し、ベース層の表面に2つの他の頂点を有する実質的に三角形の断面を有し、(2)チャネルの表面開口部を実質的に密封するように構成されたエラストマーを含む表面層を有する。カートリッジの実施形態は、本明細書の他の場所でさらに説明される。
いくつかの実施形態において、カートリッジはベース層(base layer)を含む。いくつかの実施形態において、ベース層は、1つまたは複数のチャネルを含む表面を有する。例えば、図24は、いくつかの実施形態に従う、チャネル102の幅に沿ったカートリッジ100の断面図の概略図である。図示のカートリッジ100は、チャネル102を含む表面111を有するベース層104を含む。特定の実施形態において、チャネルの少なくとも一部はマイクロチャネルである。例えば、いくつかの実施形態において、チャネル102の少なくともいくつかはマイクロチャネルである。特定の実施形態において、チャネルのすべてがマイクロチャネルである。例えば、再び図24を参照すると、特定の実施形態において、チャネル102の全てがマイクロチャネルである。
本明細書で使用される場合、「チャネル」という用語は、当技術分野の通常の当業者に知られており、流体を収容および/または輸送するように構成された構造を指す場合がある。チャネルは、一般に、壁;ベース(例えば、壁に連結されたベースおよび/または壁から形成されたベース);チャネルの1つまたは複数の部分で開口し、覆われ、および/または密封されていてもよい表面開口部、を含む。
本明細書で使用される場合、「マイクロチャネル」という用語は、サイズが1000ミクロン以下の少なくとも1つの寸法を含むチャネルを指す。例えば、マイクロチャネルは、サイズが1000ミクロン(μm)(例えば、100ミクロン(μm)以下、10ミクロン(μm)以下、5ミクロン(μm)以下)以下の少なくとも一つの寸法(例えば、幅、高さ)を含むことができる。いくつかの実施形態において、マイクロチャネルは、1ミクロン(μm)(例えば、2ミクロン(μm)以上、10ミクロン(μm)以上)以上の少なくとも1つの寸法を含む。上記の範囲の組み合わせも可能である(例えば、1ミクロン(μm)以上1000ミクロン(μm)以下、10ミクロン(μm)以上100ミクロン(μm)以下)。他の範囲も可能である。いくつかの実施形態でにおいて、マイクロチャネルは、1000ミクロン(μm)以下の水力直径を有する。本明細書中で使用されるように、用語「水力直径(hydraulic diameter)」(DH)は、当業者に知られており、DH=4A/Pとして決定することができ、ここで、Aは、チャネルを通る流体の流れの断面積であり、Pは、断面の濡れた周囲長(perimeter)(流体が接触するチャネルの断面の周囲長)である。
いくつかの実施態様において、少なくともいくつかのチャネルの少なくとも一部は、実質的に三角形の断面を有する。いくつかの実施態様において、少なくともいくつかのチャネルの少なくとも一部は、チャネルの基部に単一の頂点を有し、ベース層の表面に他の2つの頂点を有する実質的に三角形の断面を有する。再び図24を参照すると、いくつかの実施形態において、少なくともいくつかのチャネル102の少なくとも一部は、チャネルの基部に単一の頂点を有し、ベース層の表面に他の2つの頂点を有する実質的に三角形の断面を有する。
本明細書で使用される「三角形」という用語は、三角形が実際の形状に近似または等しくなるように内接または外接され得る形状を指すために使用され、純粋に三角形に限定されるものではない。例えば、三角形断面は、1つまたは複数の部分で非ゼロ曲率を含むことができる。
三角形断面は、くさび形を含むことができる。本明細書で使用される「くさび形」という用語は、当業者に知られており、厚い端部を有し、薄い端部に先細になっている形状を指す。いくつかの実施形態において、くさび形は、厚い端部から薄い端部まで対称の軸を有する。例えば、くさび形は、厚い端部(例えば、チャネルの表面開口部)を有し、薄い端部(例えば、チャネルの基部)までテーパ形状であってもよく、厚い端部から薄い端部まで対称軸を有してもよい。
さらに、特定の実施形態において、実質的に三角形の断面(すなわち「V溝」)は、様々なアスペクト比を有することができる。本明細書で使用される場合、V溝の「アスペクト比」という用語は、高さ対幅の比を指す。例えば、いくつかの実施形態において、V溝は、2以下、1以下、または0.5以下、および/または0.1以上、0.2以上、または0.3以上のアスペクト比を有することができる。上記の範囲の組み合わせも可能である(例えば、0.1と2との間、または0.1および2に等しい)。他の範囲も可能である。
いくつかの実施態様において、少なくともいくつかのチャネルの少なくとも一部は、実質的に三角形の部分と、実質的に三角形の部分に開口し、チャネルの表面に対して実質的に三角形の部分の下に延びる第2の部分とを含む断面を有する。いくつかの実施形態において、第2の部分は、実質的に三角形の部分の平均直径よりも著しく小さい直径(例えば、平均直径)を有する。図24を再度参照すると、いくつかの実施形態において、少なくともいくつかのチャネル102の少なくとも一部は、実質的に三角形の部分101と、実質的に三角形の部分101に開口し、チャネルの表面105に対して実質的に三角形の部分101の下に延びる第2の部分103とを含む断面を有し、第2の部分103は、実質的に三角形の部分101の平均直径109よりも著しく小さい直径107を有する。このような場合には、チャネルの第2の部分がチャネルの実質的に三角形の部分の平均直径のそれよりも著しく小さい直径を有することは、実質的に三角形の部分が装置のローラおよび表面層の変形部分に対してアクセス可能であるが、第2の部分がローラおよび表面層の変形部分にアクセス不可能であるという結果になり得る。例えば、再び図24を参照すると、特定の実施形態に従って、チャネル102の実質的に三角形の部分101は、ローラ(図示せず)および表面層106の変形部分にアクセス可能であり、一方、第2の部分103は、ローラおよび表面層106の変形部分にアクセス不可能である。いくつかのこのような場合において、第2の部分103を有するチャネル102の部分において、表面層106とのシールを達成することができない。その理由は、表面層106がローラによって変形され、流体が第2の部分103ではなく実質的に三角形の部分101を満たす場合であっても、同流体は第2の部分103内を自由に移動することができるからである。いくつかの実施形態では、チャネルの長さに沿った部分は、実質的に三角形の部分と第2の部分(「深いセクション」)の両方を有することができ、チャネルの長さに沿った異なる部分は、実質的に三角形の部分のみを有する。いくつかのそのような実施形態において、装置(例えばローラ)が、実質的に三角形の部分および第2の部分(深いセクション)の両方を有する部分と係合する場合、表面層とのシールが達成されないため、ポンプ動作は開始されない。しかしながら、装置がチャネルの長さ方向に沿って係合するとき、装置が実質的に三角形の断面のみを有するチャネルの部分で表面層を変形させると、ポンプ作用が開始されるが、これは、その部分に第2の部分(深いセクション)が欠如しているために、シール(結果として圧力差)が形成されることが可能になるからである。したがって、場合によっては、カートリッジのチャネルの長さに沿った深いセクションの有無によって、チャネルのどの部分が装置との係合時にポンプ作用を受けることができるかを制御することができる。
カートリッジの少なくともいくつかのチャネルの第2の部分としてそのような「深いセクション」を含むことは、様々な潜在的利益のいずれかに寄与し得る。例えば、そのような深いセクション(例えば、第2の部分103)は、場合によっては、蠕動ポンププロセスにおけるポンプ容積の減少に寄与し得る。このような場合には、より高い容積分解能(resolution)のためにポンプ容積を2倍以上減少させることができる。場合によっては、このような深いセクションは、ローラがチャネル上のどこに着地するかによって決定されないポンプ容積の明確に定義された開始点を提供することもできる。例えば、実質的に三角形の部分と第2の部分(深いセクション)の両方を有するチャネルの部分と、実質的に三角形の部分のみを有するチャネルの部分との間の界面は、場合によっては、後者のチャネル部分の体積を占める流体のみをポンプすることができるので、ポンプ容積の明確に定義された開始点として使用することができる。場合によっては、ローラがチャネル上に着地すると、カートリッジの位置合わせなどの様々な要因のいずれかに応じて、何らかのエラーが生じることがある。深いセクションを含めることは、場合によっては、このようなエラーに関連するポンプ容積の変動を低減または排除することができる。
本明細書で使用されるように、チャネルの実質的に三角形の部分の平均直径は、実質的に三角形の部分の頂点からチャネルの表面までのz軸にわたる平均として測定され得る。
本発明の実施形態は、以下の実施例を参照してさらに説明されるが、これらの実施例は例示的なものであり、本質的に限定的なものではない。以下の実施例は、DNAオリゴヌクレオチドおよびメチル化DNAオリゴヌクレオチドの分離に関して記載されているが、本発明の実施形態は、他の示差的に修飾された分子を含む、媒体内に固定化された薬剤に対する親和性を有する他の分子の精製および分離にも適用される。このような分子の例としては、ポリペプチドまたはタンパク質、示差的に修飾されたポリペプチドまたはタンパク質、示差的にメチル化されたDNAまたはRNAを含む示差的に修飾された核酸などが挙げられる。本発明の実施形態においてプローブとして固定化することができる薬剤の例としては、DNA、RNA、抗体、ポリペプチド、タンパク質、核酸アプタマー、および目的の分子に対して親和性を有する他の薬剤が挙げられる。
実施例1.0:一塩基の不一致でのアフィニティーSCODA
式[23]で表される予測された温度依存性移動度を検証するために、温度変化に対する標的DNA速度の応答を測定するための実験を実施した。最初の実験は100ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを標的DNAとして用いて実施した。オリゴヌクレオチドは一本鎖であるので、アフィニティーゲルと相互作用させるために変性する必要はない。また、オリゴヌクレオチドは、それらが無視できる場依存性移動度を有するように十分に短い。より長い核酸分子、例えば、約1000ヌクレオチド長よりも長い核酸分子は配列に基づいて分離することは困難であり得る。なぜならば、より長い分子は、温度勾配を提供するために電場により提供されるジュール加熱を用いる実施形態において、電気泳動SCODA効果から、配列に特異的な様式で集束する(focus)傾向を有するからである。
式[23]で表される予測された温度依存性移動度を検証するために、温度変化に対する標的DNA速度の応答を測定するための実験を実施した。最初の実験は100ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを標的DNAとして用いて実施した。オリゴヌクレオチドは一本鎖であるので、アフィニティーゲルと相互作用させるために変性する必要はない。また、オリゴヌクレオチドは、それらが無視できる場依存性移動度を有するように十分に短い。より長い核酸分子、例えば、約1000ヌクレオチド長よりも長い核酸分子は配列に基づいて分離することは困難であり得る。なぜならば、より長い分子は、温度勾配を提供するために電場により提供されるジュール加熱を用いる実施形態において、電気泳動SCODA効果から、配列に特異的な様式で集束する(focus)傾向を有するからである。
これらの測定を行うために、0.2MのNaClおよび10μMアクリダイトプローブ(acrydite probe)(配列番号1)オリゴを含む1X TB(89mMトリス、89mMホウ酸)中のポリアクリルアミドゲル(4%T、2%C)を、2つのアクセスポートのみを含む一次元ゲルカセット中に流し込んだ(cast)。ゲル1ml当たり2μlの10w/v%APSおよび0.2μlのTEMEDの添加により重合を開始した。
プローブに対する完全一致(perfect match)(PM)(配列番号2)および一塩基不一致(single base mismatch)(sbMM)(配列番号3)を有する配列を含む、一塩基が異なる2つの異なる100ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド上で移動度測定を実施した。これらの標的オリゴヌクレオチドを、6-FAMまたはCy5(IDT DNA)のいずれかで末端標識した。これらの実験に用いたプローブおよび標的配列を表3に示す。固定化プローブに相補的なPMおよびsbMM標的オリゴヌクレオチドの領域は、これらのオリゴヌクレオチドの他の部分よりも暗い字体(darker typeface)で示されている。sbMMの標的配列では、一塩基不一致の位置に下線が引かれている。
プローブ配列は、後述するより長い標的を用いたその後の実験のためにpUC19に相補的であるように選択された。100ヌクレオチド標的は、プローブに相補的な配列(完全一致:PM)、または100ヌクレオチド長を構成するフランキング(flanking)配列を有するプローブに対して一塩基不一致(sbMM)を含む。フランキング配列は二次構造と自己ハイブリダイゼーションの影響を最小限にするように設計した。プローブ結合部位にフランキングする領域の最初の配列をランダムに選択した。次いで、折り畳みおよび自己ハイブリダイゼーションエネルギーをMfoldを用いて計算し、配列を一度に1塩基ずつ変化させて、これらの影響を最小化し、支配的相互作用が標的鎖とプローブとの間にあることを確実にした。
表4は、Mfoldを用いて計算した表3に示される配列の結合エネルギーおよび融解温度を示す。結合エネルギーΔGはΔH-TΔSとして与えられる。ここで、ΔHはエンタルピー、ΔSはエントロピーであり、単位はそれぞれ、kcal/mol、kcal/molKである。表2の値の算出には、以下のパラメータ値:温度=50℃、[Na+]=0.2M、[Mg++]=0M、ストランド濃度=10μM、を用いた。非プローブ-標的ハイブリダイゼーションの最大T.は23.9℃であり、最大二次構造T.は38.1℃である。これらの値はいずれも、sbMM標的-プローブTmよりもはるかに低く、標的-プローブ相互作用を干渉しないと予想される。
温度の関数として速度応答を測定するために、蛍光標識された標的をまず高温(70℃)でゲルに注入し、ゲルのイメージング領域内に、一定の電場の下で駆動させた。注入されたバンドが見えるようになったら、スプレッダプレートの温度を55℃まで下げた。25V/cmの電場をゲルカセットに印加し、温度を40℃から70℃まで0.5℃/分の速度で上昇させ、ゲルの画像を20秒ごとに撮影した。LabView(登録商標)(ナショナル・インスツルメンツ(National Instruments)、テキサス州オースチン)で書かれた画像処理ソフトウェアを用いて、各画像におけるバンドの中心の位置を決定し、この位置データを用いて速度を計算した。
図11は、温度の関数としての標的DNAの移動度のプロットを示す。表3に示されたプローブおよび標的配列についてのΔGの値を用いて、速度対温度曲線を式[23]に適合させ、2つの自由パラメータ、すなわちハイブリダイゼーション反応の速度論に依存する移動度μ0およびβa定数を決定した。
図11に示したデータを当てはめると、上に示した移行の理論との良好な一致が示されている。不一致の移動度のデータは左の曲線で示され、完全一致の移動度のデータは右の曲線で示される。PMフィット(fit)とMMフィットのR2値はそれぞれ0.99551および0.99539であった。完全一致標的と一塩基不一致標的との間の分離は、完全一致標的の集束速度が、図4に示されるように、DCバイアス場の印加によって2つの種の分離を可能にする、不一致標的のそれよりも著しく大きい動作温度が存在することを支持する。
実施例2.0:アフィニティーSCODAを用いた分子の選択的分離
10μMのアクリダイト修飾プローブオリゴ(Integrated DNA Technologies,www.idtdna.com)を含有する4%ポリアクリルアミドゲルをゲルカセット中に流し込み、アフィニティーマトリックスを得た。
10μMのアクリダイト修飾プローブオリゴ(Integrated DNA Technologies,www.idtdna.com)を含有する4%ポリアクリルアミドゲルをゲルカセット中に流し込み、アフィニティーマトリックスを得た。
等モル量の完全一致標的および一塩基不一致標的を、両方の標的分子が最初に捕捉され、ゲル緩衝液界面で固定化されるように、ゲルを横切って印加される100V/cmの電場で30℃にてアフィニティーゲルに注入した。次いで、温度を70℃に上昇させ、20V/cmの一定電場をゲルに印加して、標的をゲルの撮像領域内に移動させた。次いで、温度を62℃に下げ、表2に示すように8V/cmのDCバイアス上に重ねた108V/cmのSCODA集束場を、5秒間で4つのソース電極に印加した。SCODA集束場の回転方向は周期ごとに変更した。
図12に2分ごとに撮影した集中(concentration)の画像を示す。完全一致標的を6-FAMでタグ付けし、緑色で示し(タイトなスポットに集束する先行する明るいスポット)、不一致標的をCy5でタグ付けし、赤色で示す(ゲルから洗浄される後方の明るい線)。最初の画像を撮影した後、緑のチャネルでカメラのゲインが減少した。DNAをゲルの右側に注入し、集束+バイアス場を印加した。完全一致標的(緑)は、図10Aに示されるものと同様のドリフト速度を経験し、中央の集束位置に向かって移動する。より弱く集束する不一致標的(赤色)は、図10Bに示されるものと同様の速度場を経験し、バイアス場によってゲルの縁部から押し出される。印加された洗浄場の印加方向は、白い矢印で示される。
この実験は、ゲルに対してより高い結合エネルギーを有する標的の優先的な集束を可能にする、一塩基のみが異なる2つのDNA標的について2つの異なる速度プロファイルを生成することが可能であることを示す、図10Aおよび10Bの予測を検証する。図12の画像は、SCODA集束場とDCバイアスの両方の印加下で、アフィニティーマトリックスを通って移動する2つの異なる配列の標的DNAについて生成された2つの異なる速度プロファイルがあることを裏付ける。一塩基不一致標的に対しては分散速度場を生成し、完全一致標的に対しては非分散速度場を生成する。この実施例は、一塩基特異性を有する標的について効率的に濃縮することが可能であり、任意選択的に望ましくない標的をアフィニティーマトリックスから洗い落とすことが可能であり、たとえサンプル中に非常に過剰の不一致標的が存在する場合であっても、それが可能であることを示す。
実施例3.0:動作条件の最適化
SCODAプロセスの種々のパラメータを、妥当な収率で良好なサンプル濃縮を達成するために最適化した。ゲル中に固定化された(および負に荷電された)DNAを有する実施形態において、比較的高い塩分濃度のランニング緩衝液は、効率的かつ安定した集束を提供するとともに、隣接するサンプルチャンバからSCODAゲルに標的DNAを電気運動学的に注入するために必要な時間を最小限にすることが見出された。
SCODAプロセスの種々のパラメータを、妥当な収率で良好なサンプル濃縮を達成するために最適化した。ゲル中に固定化された(および負に荷電された)DNAを有する実施形態において、比較的高い塩分濃度のランニング緩衝液は、効率的かつ安定した集束を提供するとともに、隣接するサンプルチャンバからSCODAゲルに標的DNAを電気運動学的に注入するために必要な時間を最小限にすることが見出された。
実施例3.1:緩衝液の塩分濃度の最適化
アフィニティーゲル中の分子の温度依存性移動度を測定する初期の試みと配列特異的SCODAの最初の実証は電気泳動SCODAに用いた緩衝液中で実施した。これらは、典型的には、トリス-ホウ酸EDTA(TBE)のような標準的な電気泳動緩衝液であり、多くの場合、ゲル伝導性を減少させるために4~6倍に希釈され、ジュール加熱によって課される熱制限内で高電場の印加を可能にし、その結果、より短い集中時間をもたらす。1× TBE緩衝液(89mMトリス、89mMホウ酸、2mM EDTA二ナトリウム)中で配列特異的SCODAベースの集中を達成することは可能であるが、1× TBE緩衝液中で平衡状態にある解離イオンの比較的低い濃度に起因する配列特異的SCODAの性能のために、条件をさらに最適化することができる。低濃度の解離イオンは、ハイブリダイゼーション速度を遅くし、ゲル中の電荷の固定化(オリゴヌクレオチドプローブ)に関連するイオン枯渇を悪化させ、標的DNAをゲル中に電気力学的に注入するのに必要な時間を増加させる。89mMのトリス塩基および89mMのホウ酸を用い、ホウ酸について9.24のpKaおよびトリスについて8.3のpKaで計算すると、1× TBE緩衝液中で解離したトリスおよび解離したホウ酸のそれぞれ1.49mMの濃度が示される。
アフィニティーゲル中の分子の温度依存性移動度を測定する初期の試みと配列特異的SCODAの最初の実証は電気泳動SCODAに用いた緩衝液中で実施した。これらは、典型的には、トリス-ホウ酸EDTA(TBE)のような標準的な電気泳動緩衝液であり、多くの場合、ゲル伝導性を減少させるために4~6倍に希釈され、ジュール加熱によって課される熱制限内で高電場の印加を可能にし、その結果、より短い集中時間をもたらす。1× TBE緩衝液(89mMトリス、89mMホウ酸、2mM EDTA二ナトリウム)中で配列特異的SCODAベースの集中を達成することは可能であるが、1× TBE緩衝液中で平衡状態にある解離イオンの比較的低い濃度に起因する配列特異的SCODAの性能のために、条件をさらに最適化することができる。低濃度の解離イオンは、ハイブリダイゼーション速度を遅くし、ゲル中の電荷の固定化(オリゴヌクレオチドプローブ)に関連するイオン枯渇を悪化させ、標的DNAをゲル中に電気力学的に注入するのに必要な時間を増加させる。89mMのトリス塩基および89mMのホウ酸を用い、ホウ酸について9.24のpKaおよびトリスについて8.3のpKaで計算すると、1× TBE緩衝液中で解離したトリスおよび解離したホウ酸のそれぞれ1.49mMの濃度が示される。
実施例3.2:DNAハイブリダイゼーションにおける塩濃度の影響
核酸を分離するために使用される実施形態において、正の対イオンの存在は、核酸の負に荷電した相補鎖の静電的反発を遮蔽し、ハイブリダイゼーションの速度を増加させる。例えば、Na+イオンの濃度を増加させると、DNAハイブリダイゼーションの速度が非線形的に影響を受けることが知られている(ツルオカ(Tsuruoka)他、DNAハイブリダイゼーションの速度の最適化および蛍光偏光を用いたメチシリン耐性黄色ブドウ球菌DNAの迅速検出(Optimization of the rate of DNA hybridization and rapid detection of methicillin resistant Staphylococcus aureus DNA using fluorescence polarization)、Journal of Biotechnology、1996;48(3):201-208(参照により本明細書中に組み込まれている)を参照)。ハイブリダイゼーション速度は、[NaCl]が10mMから1Mの[NaCl]に増加すると約10倍増加し、その増加のほとんどは約200mMに達するまでに達成される。約10mM以下の低濃度の正の対イオンでは、ハイブリダイゼーションの速度は塩濃度に強く依存し、塩濃度の三乗にほぼ比例する6。理論計算は、1× TBEの全正対イオン濃度が約5.5mM(EDTA二ナトリウムからの1.5mMの解離トリスおよび4mMのNa+)であることを示唆する。このイオン濃度では集束が可能であったが、ハイブリダイゼーション速度が遅いと、集束が弱くなり、最終的な集束スポットサイズが大きくなった。
核酸を分離するために使用される実施形態において、正の対イオンの存在は、核酸の負に荷電した相補鎖の静電的反発を遮蔽し、ハイブリダイゼーションの速度を増加させる。例えば、Na+イオンの濃度を増加させると、DNAハイブリダイゼーションの速度が非線形的に影響を受けることが知られている(ツルオカ(Tsuruoka)他、DNAハイブリダイゼーションの速度の最適化および蛍光偏光を用いたメチシリン耐性黄色ブドウ球菌DNAの迅速検出(Optimization of the rate of DNA hybridization and rapid detection of methicillin resistant Staphylococcus aureus DNA using fluorescence polarization)、Journal of Biotechnology、1996;48(3):201-208(参照により本明細書中に組み込まれている)を参照)。ハイブリダイゼーション速度は、[NaCl]が10mMから1Mの[NaCl]に増加すると約10倍増加し、その増加のほとんどは約200mMに達するまでに達成される。約10mM以下の低濃度の正の対イオンでは、ハイブリダイゼーションの速度は塩濃度に強く依存し、塩濃度の三乗にほぼ比例する6。理論計算は、1× TBEの全正対イオン濃度が約5.5mM(EDTA二ナトリウムからの1.5mMの解離トリスおよび4mMのNa+)であることを示唆する。このイオン濃度では集束が可能であったが、ハイブリダイゼーション速度が遅いと、集束が弱くなり、最終的な集束スポットサイズが大きくなった。
ハイブリダイゼーションの速度が遅いと、電場の変化と移動度の変化との間の位相遅れが増大し、集束が弱くなることがある。式[16]は、SCODA速度がcos(φ)に比例するものとして記述され、ここで、φは移動度振動(oscillations)と電場振動との間の位相遅れを表す。ssSCODAの場合、位相遅れは、遅い熱応答ならびに遅いハイブリダイゼーション速度論の両方に起因し得る。
最終的なスポットサイズは、内向きSCODA駆動ドリフトと外向き拡散駆動ドリフトとの間のバランスであるため、この位相の遅れにより、集束時間が遅くなり、スポットサイズが大きくなる。より速い集束時間は、複雑な混合物から標的を濃縮するための全体の時間を短縮する傾向があるので、常に望ましい。異なる分子種を識別する能力を向上させるために、スポットサイズをより小さくすることも望ましい。上述のように、DCバイアスの印加下でSCODA集束を行う場合、最終的な集束スポットは、標的の移動度および集束の速度の両方に依存する量だけ中心からずれ、その両方は、標的とゲルに結合したプローブとの間の相互作用の強度に依存する。したがって、バイアス下で集束するときに、2つの類似した分子を区別するために必要な分離の量は、最終的な集束スポットの直径に依存する。スポット径が小さいほど、ゲルに結合したプローブと類似の親和性を有する2つの標的を識別する能力が向上するはずである。
1× TBE緩衝液で達成された低い速度のハイブリダイゼーションでは、100μM付近のプローブ濃度でのみ信頼できる集束が達成された。NaClの添加によって塩濃度を約5mMから200mMに増加させる一方で、プローブ濃度を100μMに維持することは、図13A~Dに示されるように、最終的な集束スポットサイズを減少させる効果を有した。図13A~Dのすべての画像は、類似した量の集束時間(約5分)の後に撮影されたが、塩分濃度の増加は、ジュール加熱の増加をもたらし、200mMのNaClで集束する場合、沸騰を防ぐために電場強度の4倍の減少を必要とした。プローブ濃度は、図13A、13B、13Cおよび13Dにおいて、それぞれ100μM、10μM、1μMおよび100μMである。図13A、13Bおよび13Cで使用した緩衝液は、0.2MのNaClを含む1X TBであった。図13Dで使用した緩衝液は1X TBEであった。集束は、1X TBE中の10μMおよび1μMプローブについては信頼できるものではなく、これらの結果は示されていない。この実施例における同等の条件下で、ゲルへの200mMのNaClの添加はまた、100倍低いプローブ濃度での相補的標的の集束を可能にした。
式[30]は、集束速度が電場強度に比例することを示しており、したがって、電場強度の4倍の減少によって同等の集束時間が達成されるという事実は、場正規化集束速度が高い塩分濃度条件下でかなり速いことを示唆している。
集束のための合計時間は、200mMのNaClの添加によって減少しなかったが、より低い電場強度での集束は、いくつかの実施形態において、より低い電場強度が、いくつかの実施形態においてアフィニティーマトリックス中で生じ得る非特異的電気泳動SCODAの程度を制限し得るので、望ましいことがある。例えば、全ての標的核酸分子は、電気泳動SCODAに起因する電場によって熱勾配が確立される実施形態において、配列特異的SCODAに使用されるアフィニティーゲル中のそれらの配列に関係なく集束するであろう。電気泳動SCODA集束の速度は電場と共に増加するので、電場強度を減少させることは、非特異的SCODA集束速度を減少させる効果を有し、DCバイアスを印加することによって、非標的DNA分子をゲルからより容易に洗浄することを可能にする。
実施例3.3:イオンの枯渇と結合電荷
イオンが境界で枯渇(または蓄積)する速度は、固定電荷の割合が増加するにつれて増加する。1× TBE中で効率的な集中を達成するために必要な100μMのプローブ濃度は、20ヌクレオチドのプローブを使用した場合、ゲル内に2mMの結合した負電荷を生じ、これは、ゲル内に溶解した負イオンの総量(約5.5mM)に相当する。この高い割合の結合電荷は、注入中およびDCバイアス下でのSCODA集束中に、一定の電場がゲルを横切るように配置されたときに、ゲル内のイオンを枯渇させる領域の形成をもたらし得る。
イオンが境界で枯渇(または蓄積)する速度は、固定電荷の割合が増加するにつれて増加する。1× TBE中で効率的な集中を達成するために必要な100μMのプローブ濃度は、20ヌクレオチドのプローブを使用した場合、ゲル内に2mMの結合した負電荷を生じ、これは、ゲル内に溶解した負イオンの総量(約5.5mM)に相当する。この高い割合の結合電荷は、注入中およびDCバイアス下でのSCODA集束中に、一定の電場がゲルを横切るように配置されたときに、ゲル内のイオンを枯渇させる領域の形成をもたらし得る。
したがって、高塩分濃度のランニング(running)緩衝液は、より低いプローブ濃度での集束を可能にすることによってssSCODAゲルにおける電荷の固定化に関連するイオン枯渇問題の多くを最小限とするのに役立ち、ならびに追加の自由電荷を加えることによって結合電荷の割合を減少させる。
実施例3.4:二本鎖DNAの変性
標的DNAは、一本鎖でない限り、ゲル固定化プローブと相互作用しない。二本鎖DNAから一本鎖DNAを生成する最も簡単な方法は、注入前にサンプルを煮沸することである。この方法の潜在的な問題の1つは、注入前にサンプルを再アニーリングするとプロセスの収率が低下することである。その理由は再アニールされた二本鎖標的がプローブと相互作用せず、バイアス場によってゲルから洗い流される可能性があるからである。理論計算によれば、サンプルの復元速度は変性した一本鎖DNAの濃度に比例する。目標濃度とサンプルの塩分濃度を低く維持すれば、サンプルの復元(renaturation)を最小限に抑えることができる。
標的DNAは、一本鎖でない限り、ゲル固定化プローブと相互作用しない。二本鎖DNAから一本鎖DNAを生成する最も簡単な方法は、注入前にサンプルを煮沸することである。この方法の潜在的な問題の1つは、注入前にサンプルを再アニーリングするとプロセスの収率が低下することである。その理由は再アニールされた二本鎖標的がプローブと相互作用せず、バイアス場によってゲルから洗い流される可能性があるからである。理論計算によれば、サンプルの復元速度は変性した一本鎖DNAの濃度に比例する。目標濃度とサンプルの塩分濃度を低く維持すれば、サンプルの復元(renaturation)を最小限に抑えることができる。
復元および全体の効率に対する標的濃度の影響を測定するために、ゲルに結合したプローブに相補的な蛍光標識した二本鎖PCRアンプリコンを約2mMのNaClを含む250μlの容量に希釈し、5分間煮沸した後に氷浴中で5分間冷却して変性させた。サンプルをゲルカセットのサンプルチャンバに入れ、集束ゲルに注入し、ゲルの中心に集中させた。が完了した後、最終的な集束スポットの蛍光を測定し、空のゲルカセットの中央に手動でピペットで注入した同じ量の標的の蛍光と比較した。この実験は、100ng(2×1011コピー)および10ng(2×1010コピー)の二本鎖PCRアンプリコンを用いて実施した。100ngサンプルの収率は40%であり、10ngサンプルの収率は80%であった。この例は、より低いサンプルDNA濃度がより高い収率をもたらすことを裏付けるものである。
実施例3.5:位相遅れ誘起回転
上述したように、電場の振動と移動度変動の振動との間に位相遅れがある実施形態では、回転成分がアフィニティーマトリックスを移動する分子の速度に加えられるであろう。この問題の例を図14に示す。図14に示された標的は、SCODA場の下で弱く集束し、ゲルからそれらを洗い流すために小さなバイアスが印加されると、洗浄場およびSCODA場によって誘導される回転速度は、ゲルの左下隅付近で合計がゼロになる。この結果、洗浄時間が長くなり、極端な場合には汚染物質フラグメントの捕捉が弱くなる。SCODA集束を生成するために使用される電場の回転方向は、矢印34によって示される。加えられた洗浄力の方向は、矢印36によって示される。
上述したように、電場の振動と移動度変動の振動との間に位相遅れがある実施形態では、回転成分がアフィニティーマトリックスを移動する分子の速度に加えられるであろう。この問題の例を図14に示す。図14に示された標的は、SCODA場の下で弱く集束し、ゲルからそれらを洗い流すために小さなバイアスが印加されると、洗浄場およびSCODA場によって誘導される回転速度は、ゲルの左下隅付近で合計がゼロになる。この結果、洗浄時間が長くなり、極端な場合には汚染物質フラグメントの捕捉が弱くなる。SCODA集束を生成するために使用される電場の回転方向は、矢印34によって示される。加えられた洗浄力の方向は、矢印36によって示される。
この問題を克服するために、場の回転の方向を周期的に変えることができる。本明細書に記載される他の例では、場の回転方向は、周期毎に変更した。これにより、デッドゾーンが最小限に抑えられ、よりクリーンな洗浄と集束が可能になる。このスキームは、上述し、かつ図12に示すように、集束および洗浄の実施中に適用され、不一致標的が回転なしでゲルからきれいに洗浄された例である。これらの条件下では、位相遅れに起因してSCODA集束速度が減少するが、SCODA速度の付加的な回転成分は存在しない。
実施例3.6:二次構造の効果
標的DNAの二次構造は、固定化プローブに対する標的のハイブリダイゼーション速度を低下させるであろう。これは、式[16]に記載される位相遅れを増加させることによって集束速度を減少させる効果を有するであろう。二次構造がハイブリダイゼーション速度を減少させる量は二次構造の細部に依存する。たとえば、単純なヘアピンでは、ステムの長さとループの長さの両方がハイブリダイゼーション速度に影響する9。配列特異的SCODAのほとんどの実際的な応用では、汚染しているバックグラウンドDNAとは1塩基だけ異なる標的分子を濃縮したい場合、標的とバックグラウンドの両方が類似した二次構造を有するであろう。この場合、標的とバックグラウンドとを区別する能力は影響を受けず、全体の処理時間のみが影響を受けるであろう。固定化プローブ濃度および電場回転時間を増加させることにより、減少したハイブリダイゼーション速度を補償することができる。
標的DNAの二次構造は、固定化プローブに対する標的のハイブリダイゼーション速度を低下させるであろう。これは、式[16]に記載される位相遅れを増加させることによって集束速度を減少させる効果を有するであろう。二次構造がハイブリダイゼーション速度を減少させる量は二次構造の細部に依存する。たとえば、単純なヘアピンでは、ステムの長さとループの長さの両方がハイブリダイゼーション速度に影響する9。配列特異的SCODAのほとんどの実際的な応用では、汚染しているバックグラウンドDNAとは1塩基だけ異なる標的分子を濃縮したい場合、標的とバックグラウンドの両方が類似した二次構造を有するであろう。この場合、標的とバックグラウンドとを区別する能力は影響を受けず、全体の処理時間のみが影響を受けるであろう。固定化プローブ濃度および電場回転時間を増加させることにより、減少したハイブリダイゼーション速度を補償することができる。
二次構造が、標的分子をバックグラウンド分子から区別する能力に影響を与える可能性がある場合がある。標的とバックグラウンドとの間の一塩基の違いは、バックグラウンドDNAが標的と比べ二次構造を低下させ、ハイブリダイゼーション速度を増加させ、一本鎖立体配座多型(SSCP)変異分析の基礎になるように、二次構造に影響を与えることができる。この影響は、標的DNAを首尾よく濃縮する能力を低下させるか、または増強する可能性があり、二次構造の影響を最小限に抑えるために標的およびプローブの配列を設計する際には注意が必要である。標的分子が選択されると、プローブの位置を変異部位の周囲に移動させることができる。プローブ分子の長さを調節することができる。場合によっては、オリゴヌクレオチドを、プローブがアニーリングする領域にフランキングする配列にハイブリダイズさせて、二次構造をさらに抑制することができる。
実施例4.0:配列特異的SCODAパフォーマンスの定量化
DCバイアス下での集束中の最終的な集束位置の長さ依存性を測定し、長さが200nt~1000ntの範囲のフラグメントに対して長さに依存しないことが示された。これは重要な結果であり、ssSCODAはすべての標的が同じ長さであることを保証する必要なしに、配列のみで核酸標的を区別することができることを意味する。測定により、標的とは一塩基だけ異なる汚染した配列を排除しながら標的配列を濃縮する能力、および汚染したバックグラウンドDNA分子に関しては1つのメチル化シトシン残基だけ異なる標的DNAを濃縮する能力が裏付けられた。
DCバイアス下での集束中の最終的な集束位置の長さ依存性を測定し、長さが200nt~1000ntの範囲のフラグメントに対して長さに依存しないことが示された。これは重要な結果であり、ssSCODAはすべての標的が同じ長さであることを保証する必要なしに、配列のみで核酸標的を区別することができることを意味する。測定により、標的とは一塩基だけ異なる汚染した配列を排除しながら標的配列を濃縮する能力、および汚染したバックグラウンドDNA分子に関しては1つのメチル化シトシン残基だけ異なる標的DNAを濃縮する能力が裏付けられた。
実施例4.1:集束の長さ独立性
フラグメントの長さに関係なく、配列のみに基づいて核酸を精製する能力により、濃縮前にすべての標的フラグメントが同様の長さであることを保証する必要性を排除することができる。上述の配列特異的SCODAの理論は、配列特異的SCODA濃縮が標的の長さに依存しないことを予測する。しかしながら、上記でモデル化されていない効果は長さ依存性をもたらす可能性があるため、配列特異的SCODAの長さ非依存性を確認するために実験を実施した。
フラグメントの長さに関係なく、配列のみに基づいて核酸を精製する能力により、濃縮前にすべての標的フラグメントが同様の長さであることを保証する必要性を排除することができる。上述の配列特異的SCODAの理論は、配列特異的SCODA濃縮が標的の長さに依存しないことを予測する。しかしながら、上記でモデル化されていない効果は長さ依存性をもたらす可能性があるため、配列特異的SCODAの長さ非依存性を確認するために実験を実施した。
上記で開発した熱駆動配列特異的SCODAの理論によれば、バイアス下の最終的な集束位置は標的鎖の長さに依存しない。最終的な集束位置の長さ依存性は、標的の妨害されない移動度μ0の長さ依存性によってこの式に入る。ただし、μ(Tm)およびaは共にμ0に比例するので、長さ依存性はこの式から相殺される。したがって、熱駆動ssSCODAで集中させた標的の最終的な集束位置は、バイアスが存在する場合でも、標的の長さに依存させるべきではない。
最終的な集束位置における長さ依存性の2つの潜在的な原因があり、上ではモデル化していないが、これも考慮しなければならない:それは、温度勾配が電場によって確立される実施形態における電気泳動SCODA、およびプローブ標的二本鎖の力に基づく解離、である。十分な長さ(>200ヌクレオチド)のDNA標的は、配列特異的SCODAに使用されるポリアクリルアミドゲル中で場に依存した移動度を有し、したがって、集束場がゲルに印加される場合、配列に依存しない集束力を経験する。したがって、標的分子が受ける全集束力は、電気泳動SCODAおよび配列特異的SCODAからの寄与の合計となるであろう。電気泳動SCODA下では、集束速度は長い分子に対して増加する傾向があるが、DC速度は減少する傾向があり、バイアス下では最終的な集束位置は長さに依存する。最終的な集束位置における長さ依存性の第2の潜在源は力に基づく解離である。上記のアフィニティーSCODAの理論は、プローブ-標的解離が熱励起によってのみ駆動されると仮定した。しかしながら、加えられた力で二本鎖DNAを解離させることは可能である。具体的には、標的鎖の荷電バックボーンを引っ張る外部電場を用いて、プローブ-標的二本鎖を解離させることができる。印加された電場は、式[22]の自由エネルギー項ΔGを、電場中を移動する荷電分子によって得られるエネルギーに等しい量だけ減少させる傾向がある。この力は標的DNAの長さに比例する。その理由は、より長い標的分子を引き寄せるために電場にはより多くの電荷が存在するだろうからである。したがって、所与の電場強度では、解離速度は標的の長さとともに増加するはずである。
これらの2つの効果が最終的な集束位置の長さ依存性に有意に寄与するか否かを測定するために、それぞれがゲル固定化プローブに相補的な配列を含む2つの異なる長さの標的DNAをバイアス下で集束させ、最終的な集束位置を測定して比較した。標的DNAは、表3のプローブ配列に相補的な配列を含むpUC19の領域のPCR増幅によって作製した。共通する順方向プライマーを用いて2つの反応を行い、逆方向プライマーを選択して、250bpアンプリコンおよび1000bpアンプリコンを作製した。順方向プライマーは250bpおよび1000bpフラグメントに対してそれぞれ6-FAMおよびCy5で蛍光標識した。標的をアフィニティーゲルに注入し、バイアス場を印加する前に中心に集束させた。10V/cmのバイアス場を120V/cmの集束場上に10分間重ね合わせ、この時点でバイアスをさらに7分間20V/cmに増加させた。ゲルの画像を20秒ごとに撮影し、6-FAMチャンネルとCy5チャンネルとの間に1秒の遅延を設けた。場の回転期間は5秒であった。各フラグメントの集束位置を決定するために画像を後処理した。図15Aおよび図15Bは、250bp(緑色)および1000bp(赤色)のフラグメントの集束位置と時間との関係を示す。図15Bは、実験終了時の2つのフラグメントの最終的な集束の画像である。
最終的な位置にはわずかな差があり、これはSCODAサイクルの同じ位相(phase)で2つの画像が撮影されなかったことに起因すると考えられる。この例は、最終的な集束位置が長さに依存しないことを示している。したがって、これらの動作条件下では、電気泳動SCODA集束はアフィニティーSCODA集束よりもはるかに弱く、アフィニティーSCODAは力ベースの(force-based)解離よりもむしろ熱解離によって大きく駆動される。この結果は、アフィニティーSCODAはすべての標的が同じ長さであることを保証する必要なしに、配列のみで核酸標的を区別することができることを裏付けるものである。
実施例4.2:一塩基不一致排除率
一塩基が異なる配列の排除(rejection)に関してssSCODAの特異性を示すために、ゲル結合プローブに対して完全一致(PM)または一塩基不一致(sbMM)のいずれかを含む異なる比率の合成100nt標的DNAをアフィニティーゲルに注入した。DC洗浄場の存在下でSCODA集束を実施し、過剰のsbMM DNAを除去した。PM標的配列を6-FAMで標識し、sbMMをCy5で標識した;ゲルからsbMM標的を洗浄した後、集束位置における蛍光の量を各色素について定量し、キャリブレーションランと比較した。キャリブレーションランのために、等モル量の6-FAM標識PMおよびCy5標識PM標的DNAをゲルの中心に集束させ、集束位置での蛍光信号を各チャネルで定量化した。従って、このキャリブレーション時に測定された6-FAMチャネル上の信号に対する信号Cy5チャネルの比は、2つの色素分子が等モル濃度で存在する場合の信号比である。ゲルから過剰sbMMを洗浄した後の蛍光比をキャリブレーションランと比較することによって、洗浄によってゲルから排除されたsbMM DNAの量を決定することが可能であった。
一塩基が異なる配列の排除(rejection)に関してssSCODAの特異性を示すために、ゲル結合プローブに対して完全一致(PM)または一塩基不一致(sbMM)のいずれかを含む異なる比率の合成100nt標的DNAをアフィニティーゲルに注入した。DC洗浄場の存在下でSCODA集束を実施し、過剰のsbMM DNAを除去した。PM標的配列を6-FAMで標識し、sbMMをCy5で標識した;ゲルからsbMM標的を洗浄した後、集束位置における蛍光の量を各色素について定量し、キャリブレーションランと比較した。キャリブレーションランのために、等モル量の6-FAM標識PMおよびCy5標識PM標的DNAをゲルの中心に集束させ、集束位置での蛍光信号を各チャネルで定量化した。従って、このキャリブレーション時に測定された6-FAMチャネル上の信号に対する信号Cy5チャネルの比は、2つの色素分子が等モル濃度で存在する場合の信号比である。ゲルから過剰sbMMを洗浄した後の蛍光比をキャリブレーションランと比較することによって、洗浄によってゲルから排除されたsbMM DNAの量を決定することが可能であった。
表3に示される標的配列を含有するサンプルをサンプルチャンバに添加し、50V/cmの電場を45℃でサンプルチャンバにわたって印加し、10μMの固定化プローブを含有するゲルにサンプルを注入した。サンプルをゲルに注入した後、サンプルチャンバ内の液体を清浄な緩衝液で置換し、重ね合わせたDC洗浄場でSCODA集束を実施した。60V/cmの集束場を7V/cmのDC洗浄場と組み合わせ、後者を注入場と反対方向に印加した。洗浄場に対するこの方向は、最短時間での不一致標的DNAの完全な排除につながることがわかった。以下の表6は、各実験でゲルに注入されたDNAの量を示す。
不一致標的をゲルから洗浄した後、集束場をオフにし、ゲルの温度を25℃に下げてから、定量のためにゲルの画像を撮影した。Cy5蛍光は温度依存性が高く、高温では蛍光が減少するので、定量に用いた全ての画像が同じ温度で撮影されたことを確認することが重要であった。Cy5および6-FAMチャネル上の蛍光の比を1:1キャリブレーションランと比較して、各ラン(run)についての排除率を決定した。図16Aおよび16Bは、これらの実験の結果を示す。4つの異なる比のsbMM:PMをゲルに注入し、バイアス下で集束させて過剰なsbMMを除去した。PM DNAを6-FAMでタグ付けし、sbMM DNAをCy5でタグ付けした。図16Aは、過剰なsbMM DNAがゲルから洗浄された後の最終的な集束スポットの蛍光信号を示す。蛍光信号は、PM-FAM:PMCy5 DNAの1:1比を注入し、ゲルの中心に集束させた最初のキャリブレーションランで測定された蛍光に対して正規化した。図16Bは、sbMM:PMの最初の比を洗浄後の最終的な比で割って計算した排除率(rejection ratios)を示す。
約10000倍の排除率が達成可能であることが分かった。しかしながら、高いsbMM:PM比で集束および洗浄中に撮影された画像は、2つの異なる速度プロファイルを有するsbMM分子が存在することを示唆することに留意されたい。不一致標的の大部分はゲルからきれいに洗浄され、少量が集束点で捕捉された。Cy 5チャネル上に見られるこれらの最終的な集束スポットは、PM配列を与える一塩基置換エラーによって誤って合成されたCy5標識標的から構成されている可能性が高い。ここで測定された10000:1の排除率は、一塩基置換に関するオリゴヌクレオチド合成エラー率の推定値に対応しており、これは、IDTによって合成される不一致分子が、10000個の完全一致分子中に約1部を含む可能性が高いことを意味する。これは、解像されていない不一致というよりはむしろ、Cy5チャネル上で検出された残留蛍光が、実際には不一致サンプルから濃縮されたCy5標識完全一致であり得ることを意味する。その結果、ssSCODAの排除率は、実際には10000:1よりも高くなる可能性がある。
実施例4.3:臨床的に関連する突然変異についての突然変異濃縮
上記の実施例で使用された合成オリゴヌクレオチドは、完全一致プローブ二本鎖と不一致プローブ二本鎖との間の結合エネルギーの差を最大にするように意図的に設計した。生物学的に関連する配列を濃縮するアフィニティーSCODAの能力も実証されている。この実施例では、EZH2遺伝子の野生型バージョンまたはB細胞非ホジキンリンパ腫に関係することが以前に示されているY641N変異体(mutant)のいずれかを含む細胞株からcDNAを単離した。突然変異部位を含むEZH2 cDNAの460bp領域を、蛍光プライマーを用いてPCR増幅し、集中および洗浄中に視認できる蛍光標識標的分子を生成した。変異プローブ二本鎖と野生型プローブ二本鎖の間の60℃における結合エネルギーの差は、前の実施例で使用した合成オリゴヌクレオチドの3.8kcal/molと比較して、2.6kcal/molであった。これは野生型と比較した変異体の融解温度差5.2℃に相当する。表7は、プローブ配列に対する野生型および変異体のハイブリダイゼーションの自由エネルギーおよび融解温度を示す。
上記の実施例で使用された合成オリゴヌクレオチドは、完全一致プローブ二本鎖と不一致プローブ二本鎖との間の結合エネルギーの差を最大にするように意図的に設計した。生物学的に関連する配列を濃縮するアフィニティーSCODAの能力も実証されている。この実施例では、EZH2遺伝子の野生型バージョンまたはB細胞非ホジキンリンパ腫に関係することが以前に示されているY641N変異体(mutant)のいずれかを含む細胞株からcDNAを単離した。突然変異部位を含むEZH2 cDNAの460bp領域を、蛍光プライマーを用いてPCR増幅し、集中および洗浄中に視認できる蛍光標識標的分子を生成した。変異プローブ二本鎖と野生型プローブ二本鎖の間の60℃における結合エネルギーの差は、前の実施例で使用した合成オリゴヌクレオチドの3.8kcal/molと比較して、2.6kcal/molであった。これは野生型と比較した変異体の融解温度差5.2℃に相当する。表7は、プローブ配列に対する野生型および変異体のハイブリダイゼーションの自由エネルギーおよび融解温度を示す。
2つの対立遺伝子の1:1混合物を一緒に混合し、アフィニティーSCODAで分離した。30ngの各標的アンプリコンを300μlの0.01X配列特異的SCODAランニング緩衝液に添加した。二本鎖標的を変性させるために、標的溶液を沸騰水浴中に5分間浸漬し、次いで氷浴中に5分間置いた後、ゲルカセットにロードした。サンプルに4mAの注入電流を55℃で7分間注入した。注入後、10V/cmのDCバイアスを有する150V/cmの集束場を55℃で20分間印加した。
この実験結果を、図17A、17Bおよび17Cに示す。これらの配列の挙動は、上記の実施例で示したより高いTm差の配列と定性的に類似している。野生型(不一致)標的をゲルから完全に洗浄し(図の右側の画像)、変異体(完全一致)はゲルの中心に向かって駆動される(図の左側の画像)。この場合、標的の一部が再アニールされ、ゲルに結合したプローブと相互作用しない二本鎖DNAが形成されたため、集束効率が低下した。
光学系による検出下限は約10ngの単一標識460bpDNAであった。
実施例5.0:メチル化濃縮
類似の結合エネルギーを有する分子を選択的に濃縮するアフィニティーSCODAに基づく精製の能力を、同一配列を有するメチル化および非メチル化標的の混合集団におけるメチル化DNAについての濃縮によって実証した。
実施例5.0:メチル化濃縮
類似の結合エネルギーを有する分子を選択的に濃縮するアフィニティーSCODAに基づく精製の能力を、同一配列を有するメチル化および非メチル化標的の混合集団におけるメチル化DNAについての濃縮によって実証した。
表3に示される配列(配列番号2)を有する蛍光標識されたPMオリゴヌクレオチドを、捕捉プローブ領域内に1つのメチル化シトシン残基を(表3のPM配列における残基50)を用いてIDTによって合成した。メチル化および非メチル化PM鎖の両方のDC移動度測定を行い、上述のような速度対温度曲線を生成した;この曲線を図18に示す。
これらの曲線を式[23]に当てはめると、結合エネルギーの差は69℃で約0.19kcal/molであり、これは熱エネルギーFN1の約1/3である。この曲線はさらに、2つの標的の分離が約69℃の動作温度で最も効果的であることを示唆しており、そこでは2つのフラグメントは図19に示すように移動度の差が最も大きい。この例では、この差の最大値は69.5℃であり、これは、69℃でkbT=0.65kcal/molのDCバイアス印加下でSCODA集束を行っているときの最大分離温度である。
この温度は上記の実施例で用いた温度よりもわずかに高く、より良好な識別をもたらすはずであるが、温度が高いほどゲルを沸騰させずに操作できる最大電場強度が制限されるため、集束時間は長くなる。
最初の集束試験は、重ね合わせたDCバイアスでアフィニティーSCODA集束を行うことにより2つの標的を分離できることを示した。図20は、等モル比のメチル化および非メチル化標的をゲルに注入し、69℃で、集束電場強度75V/cmおよびバイアス14V/cmで5秒間集束させた実験の結果を示す。メチル化標的を6-FAM(緑色、右側のスポット)で標識し、非メチル化標的をCy5(赤色、左側のスポット)で標識した。色素を切り替えて実験を繰り返し、同じ結果を得た。
ゲルからメチル化されていない標的を完全に洗浄することによって濃縮を達成することは、ゲルからメチル化されていない標的を洗浄しようとしている間、DCバイアス場を制御するための視覚的フィードバックの使用を妨げる緩衝ウェルによってゲル緩衝液界面が隠されているので、上記の実施例について同じゲル幾何学を用いては困難であることが判明した。この問題を解決するために、ゲルを2つのステップで流し込んだ:まず、プローブオリゴヌクレオチドを含まないゲルをゲルの一方のアームに流し込み、最初のゲルが重合したら、ゲル領域の残りを、プローブオリゴヌクレオチドを含むゲルで満たした。ゲルは、2つの間の界面が蛍光イメージングシステムで視認できるように流し込んだ。この系はバイアス電圧のリアルタイムでの調整を可能にし、メチル化されていない標的は固定化プローブなしでゲルに入り、ゲルから迅速に洗浄され、メチル化された標的は集束ゲルに保持された。図21A~21Dは、この実験の結果を示す。図21Aおよび21Bは、10pmolの非メチル化DNA(図21A)および0.1pmolのメチル化DNA(図21B)についてのゲルから非メチル化標的を洗浄する前の最初の集束の結果を示している。図21Cおよび図21Dは、それぞれ非メチル化標的とメチル化標的について、非メチル化配列をゲルから洗浄した後に行った2回目の集束の結果を示している。すべての画像は同じゲインとシャッター設定で撮影した。
この実験では、100倍過剰の非メチル化標的をゲルに注入し、洗浄場を印加せずに中央に集束させた。次に、標的をバイアス場で集束させて非メチル化標的を除去し、最後に蛍光定量化のために再びゲルの中心に集束させた。これらの画像の蛍光定量は、濃縮係数が102倍であり、洗浄中にメチル化標的の損失が20%であったことを示す。この実験を、交換した色素分子(メチル化Cy5および非メチル化6-FAM)を用いて繰り返し、同様の結果を得た。
実施例6.0:多重(Multiplexed)アフィニティーSCODA
EZH2に対する親和性を有するものおよびpUCに対する親和性を有するものの、上記の2つの異なるオリゴヌクレオチドプローブを、各々10μMの濃度でゲル中に流し込み、2つの異なる固定化プローブを含有するアフィニティーマトリックスを得た。EZH2プローブに対する親和性および62.3℃の理論的融解温度を有する100ヌクレオチド標的配列を、Cy5で標識した。pUCプローブに対する親和性および70.1℃の理論的融解温度を有する100ヌクレオチド標的配列をFAMで標識した。2つのターゲット分子間の融解温度の理論上の差は7.8℃であった。
EZH2に対する親和性を有するものおよびpUCに対する親和性を有するものの、上記の2つの異なるオリゴヌクレオチドプローブを、各々10μMの濃度でゲル中に流し込み、2つの異なる固定化プローブを含有するアフィニティーマトリックスを得た。EZH2プローブに対する親和性および62.3℃の理論的融解温度を有する100ヌクレオチド標的配列を、Cy5で標識した。pUCプローブに対する親和性および70.1℃の理論的融解温度を有する100ヌクレオチド標的配列をFAMで標識した。2つのターゲット分子間の融解温度の理論上の差は7.8℃であった。
標的分子をアフィニティーゲル上にロードし(図22A)、ゲルボート下の温度を55℃に維持して集束を実施した(図22B、2分後の集束、および22C、4分後の集束)。EZH2標的はこれらの条件下で集束した(4つの赤色スポット)が、pUC標的はこれらの条件下で弱く集束したのみであった(ゲル上で視認できる3つの拡散した緑色のスポット)。中央抽出ウェルは、この実験の最初の部分の間に緩衝液を含まず、単一の中央集束スポットよりもむしろ4つの集束スポットの生成をもたらした。次いで、ゲルの下の温度を62℃、即ち温度を7℃上昇させ(図22D、温度上昇の2分後での集束、および22E、4分後での集束)、pUC標的のための4つの明確な集束スポットの形成をもたらした。EZH2標的はこの高温で4つのタイトなスポットに集束したままであった。
ゲルの下の温度を55℃に下げて、緩衝液を中央抽出ウェルに加えた。この温度でSCODA集束場を印加すると、EZH2標的は中央抽出ウェルに選択的に集中した(図22F:0.5分での、および図22G:1分での、中心にある視認できる拡散した赤色スポット)が、pUC標的は主に中央抽出ウェルの外側の4つのスポットに集束したままであった。ゲルの下の温度を62℃、即ち温度を7℃上昇させた。2分以内にpUC標的を中央抽出ウェルに集束させた(図22H、ゲルの中心に視認できる赤色および緑色の拡散した蛍光)。
第2の実験は第1の実験と同様の条件下で行った。上述したように、EZH2標的を55℃で、pUC標的を62℃で集束させた後、DC洗浄バイアスを、ゲル下の温度を55℃に維持した状態でゲルに印加した。これらの条件下では、EZH2標的は、pUC標的よりも大きなバイアス速度を経験した。EZH2標的の集束スポットはバイアス場の印加後に急速にシフトした(図22I:バイアス印加6分後に、22J:バイアス印加12分後に、22K:バイアス印加18分後に、ゲルの右側に移動する赤色スポット)。EZH2標的の集束スポットもゲル内で右にさらなる距離をシフトした。対照的に、pUC標的の集束スポットはよりゆっくりとシフトし(最初の緑色の集束スポットは、6分後には主に依然として図22Iに視認でき、図22Jでは12分に、および図22Kでは18分に、右側にシフトした)、洗浄バイアスによるEZH2標的の集束スポットほど右にはシフトしなかった。
アフィニティーSCODAの収量対純度
アフィニティーSCODAは標的とプローブとの間の反復する相互作用に依存して標的分子のための非分散速度場を生成する一方で、汚染物質のための分散場を生成するので(洗浄バイアスが印加される限り)、収率を犠牲にすることなく高い特異性を達成できる。もし、最終的な集束スポットがガウス分布であると仮定すれば、それは拡散と釣り合った径方向速度場のスポットサイズを計算することによって正当化され、スポットはゲルの縁部までずっと広がっていくことになる。ここで、拡散は、集束力が回復しない標的をゲルから追い出すことができ、印加されたDCバイアスは標的をゲルから押し流し、標的は失われることになる。このようにして、ssSCODAの損失は、洗浄場を印加する時間の量に応じて計ることができる;しかしながら、図13A~図13Dを生成するために使用される画像は、その実施例において、集束スポットが300μmの半値全幅(FWHM)を有し、バイアス下で、それがゲル中心から約1.0mmに位置することを示す。集束スポットに10fmolの標的があると仮定すると、バイアスを印加したゲルの縁部の濃度は1e-352Mとなり;ゲルの縁部に存在するDCバイアス下で失われ得る標的分子は実質的にゼロであることになる。これは、印加されたバイアス(すなわち洗浄ステップ)による損失の蓄積率が実質ゼロであることを意味する。所望の標的は、他の方法、例えば、注入前にサンプルウェルに吸着すること、注入中にゲルの縁部から流出すること、集束前または集束中(二本鎖標的分子の場合)にあるいは抽出中に再アニーリングすること、によってシステムから損失され得るが、これらのすべての損失は、精製された標的の純度から切り離される(decoupled)。
アフィニティーSCODAは標的とプローブとの間の反復する相互作用に依存して標的分子のための非分散速度場を生成する一方で、汚染物質のための分散場を生成するので(洗浄バイアスが印加される限り)、収率を犠牲にすることなく高い特異性を達成できる。もし、最終的な集束スポットがガウス分布であると仮定すれば、それは拡散と釣り合った径方向速度場のスポットサイズを計算することによって正当化され、スポットはゲルの縁部までずっと広がっていくことになる。ここで、拡散は、集束力が回復しない標的をゲルから追い出すことができ、印加されたDCバイアスは標的をゲルから押し流し、標的は失われることになる。このようにして、ssSCODAの損失は、洗浄場を印加する時間の量に応じて計ることができる;しかしながら、図13A~図13Dを生成するために使用される画像は、その実施例において、集束スポットが300μmの半値全幅(FWHM)を有し、バイアス下で、それがゲル中心から約1.0mmに位置することを示す。集束スポットに10fmolの標的があると仮定すると、バイアスを印加したゲルの縁部の濃度は1e-352Mとなり;ゲルの縁部に存在するDCバイアス下で失われ得る標的分子は実質的にゼロであることになる。これは、印加されたバイアス(すなわち洗浄ステップ)による損失の蓄積率が実質ゼロであることを意味する。所望の標的は、他の方法、例えば、注入前にサンプルウェルに吸着すること、注入中にゲルの縁部から流出すること、集束前または集束中(二本鎖標的分子の場合)にあるいは抽出中に再アニーリングすること、によってシステムから損失され得るが、これらのすべての損失は、精製された標的の純度から切り離される(decoupled)。
実施例7.0:サンプル調製デバイスの使用
本開示の自動化サンプル調製デバイスを用いて、ヒト血液から抽出されたDNAのサンプルを調製した。
本開示の自動化サンプル調製デバイスを用いて、ヒト血液から抽出されたDNAのサンプルを調製した。
サンプル調製デバイスは、流体モジュール(蠕動ポンプシステムを含む)、温度制御モジュール(温度および機械的精度を提供するため)、ユーザが任意のプロセス固有のパラメータ(例えば、核酸の所望のサイズの範囲、標的分子捕捉のための所望の程度の相同性など)を選択することを可能にするデバイス上のタッチスクリーンインターフェース、および開示のサンプル調製カートリッジを挿入するためにユーザが開けることができる蓋を含む。デバイスには1000ボルトの電極電源を供給した。サンプル調製カートリッジは、13個の別個のマイクロ流体チャネル(またはポンピングレーン)を含み、エンドツーエンドのサンプル調製を行うことができるように製造された。マイクロ流体チャネルは、試薬を操作するように設計され、カートリッジは、自動化され、連続して以下を可能にする:(1)溶解+溶解緩衝液を用いて組み合わせたサンプル溶解をピペットで導入し、続いて標的DNAの抽出;(2)DNA精製;(3)DNA修復により成功したトランスポザーゼTn5を用いたDNAタグ形成;(4)核酸捕捉プローブおよびSCODAを用いた特定のサイズ範囲のDNAフラグメントの選択;および(5)DNAクリーンアップ。
ヒト全血100μLを溶解緩衝液と混合し、プロテイナーゼKを55℃で10分間インキュベートした後、イソプロパノールと混合した;次に溶解物(lysate)混合物をサンプル調製カートリッジのサンプルポートに加え、ロードしたカートリッジをサンプル調製デバイスに挿入し、DNAを抽出した。上記のような自動化デバイスにより、1.2μgの抽出DNAが得られた;その抽出されたDNAの1μgを、上記の連続ステップを用いてさらに処理し、6.5nMの濃度で530ngのDNAライブラリーを作製した。次に、サンプル調製デバイスによって作製されたこの精製DNAライブラリーを、ガラス製の配列決定チップを用いて配列決定した。
対照実験として、(上記と同じサンプルからの)100μLのヒト全血を手作業で処理し、従来のDNA抽出および精製技術を用いて配列決定のためのDNAライブラリーを作製した。
本発明者らは、自動化サンプル調製デバイスを用いて調製されたDNAライブラリーを用いて取得された配列決定データが、従来のDNA抽出および精製技術を用いて手動で調製されたDNAを用いて取得された配列決定データと比較して、(例えば、平均リード長によって評価されるように)品質が類似していることを見出した。表8に示すように、自動化されたデバイスは、手動プロセスよりも多くの合計リード(手動プロセスを使用した合計リード27に対して自動プロセスを使用した合計リード72)と長いリード長(手動プロセスを使用した塩基対リード長1132.1±324.5に対して自動プロセスを使用した塩基対リード長1989.0±760.1)を作製したが、結果として得られたリードの精度とGC含量に関して、プロセス間で有意な差は観察されなかった。
実施例8.0:配列決定用にDNAを濃縮するためのサンプル調製デバイスの使用
本開示の自動化サンプル調製デバイスを用いて、培養したE.coli細胞から抽出されたDNAのサンプルを調製した。
本開示の自動化サンプル調製デバイスを用いて、培養したE.coli細胞から抽出されたDNAのサンプルを調製した。
サンプル調製デバイスは、流体モジュール(蠕動ポンプシステムを含む)、温度制御モジュール(温度および機械的精度を提供するため)、ユーザが任意のプロセス固有のパラメータ(例えば、核酸の所望のサイズの範囲、標的分子捕捉のための所望の程度の相同性など)を選択することを可能にするデバイス上のタッチスクリーンインターフェース、および開示のサンプル調製カートリッジを挿入するためにユーザが開けることができる蓋を含む。デバイスには1000ボルトの電極電源を供給した。サンプル調製カートリッジは、13個の別個のマイクロ流体チャネル(またはポンピングレーン)を含み、エンドツーエンドのサンプル調製を行うことができるように製造された。マイクロ流体チャネルは、試薬を操作するように設計され、カートリッジは、自動化され、連続して以下を可能にする:(1)サンプル+溶解緩衝液の組み合わせをピペッドで導入し、続いて標的DNAの抽出;(2)DNA精製;(3)DNA修復により成功したトランスポザーゼTn5を用いたDNAタグ形成;(4)SCODAを用いた特定のサイズ範囲のDNAフラグメントの選択;および(5)DNAクリーンアップ。
溶解緩衝液とプロテイナーゼKを混合した一晩おいた培養物から得た7億個の大腸菌細胞のサンプルを55℃で10分間インキュベートし、次いでイソプロパノールを混合し;溶解物混合物をサンプル調製カートリッジのサンプルポートに加え、ロードしたカートリッジをサンプル調製デバイスに挿入し、DNAを抽出した。自動化処理を続け、DNAをDNAライブラリーに配列決定の準備ができた状態にし、ユーザがDNA修復ステップの直前にDNA修復酵素およびDNA修復緩衝液混合物をカートリッジに加えるための短い一時停止を伴う。自動化デバイスは、DNA修復酵素およびDNA修復緩衝液混合物をカートリッジ内の反応位置に輸送した。上記のような自動化デバイスにより、0.96μgの抽出DNAが得られた;その後の自動化ステップで、2.89nMの濃度で279ngのDNAライブラリーを作製した。
対照実験として、(上記と同じサンプルからの)7億個の大腸菌細胞のサンプルを、従来のDNA抽出および精製技術を用いて、DNAを作製するために手動で処理した。この手動で調製したDNAを、2.65nMの濃度で199ngのDNAライブラリーを作製する自動化デバイス上で同じ自動化ライブラリー調製プロセスにかけた。
サンプル調製デバイスにより作製した精製DNAライブラリーを、Alineビーズを用いて集中させ、次いでPacific Biosciences(登録商標)RSII DNA Sequencerでの配列決定に供した。
本発明者らは、自動化サンプル調製デバイスを用いて精製され、ライブラリーフォーマットに調製されたDNAを用いて取得された配列決定データが、従来のDNA抽出および精製技術とその後の自動化DNAライブラリー調製により手動で調製されたDNAを用いて取得された配列決定データと比較して、長さにおいてはわずかに短いが、品質においては類似している(Rsqスコアによって評価されるように)配列決定リードを作製できたことを見出した(図25)。
表9に示すように、完全に自動化されたライブラリーは、手動DNA抽出で作製されたものと同じリード品質(Rsq0.82)でリードを作製し、リード長はほぼ同じであった(851の塩基平均リード長に対して、手動では922)。
実施例9.0:配列決定用にDNAを濃縮するためのサンプル調製デバイスの使用
本開示の自動化サンプル調製デバイスを用いて、大腸菌培養細胞から手動で調製されたDNAライブラリーについて、SCODAを用いて特定のサイズ範囲のDNAフラグメントを選択した。
本開示の自動化サンプル調製デバイスを用いて、大腸菌培養細胞から手動で調製されたDNAライブラリーについて、SCODAを用いて特定のサイズ範囲のDNAフラグメントを選択した。
手動で精製した4マイクログラムの大腸菌DNAをTn5a標識し、次いで、それぞれ1μgからなる4つの別個のサンプルに分割した。特定のサイズのDNAフラグメントの選択は、4つの異なる方法:(1)Sage BluePippin(サイズ3kb~10kbのフラグメントを収集するプログラム付き);(2)Sage BluePippin(サイズ4kb~10kbのより大きいフラグメントを収集するプログラム付き);(3)手動によるAlineビーズサイズ選択と0.45×のビーズ添加;または(4)自動サンプル調整デバイスにおけるものとしてのSCODA技術(実施例8.0にて説明した)、によって別々に実施した。
サイズ選択後、各サンプルを別々にDNAライブラリーに調製し、Pacific Biosciences(登録商標)RSII DNA Sequencerで配列決定した。
本発明者らは、自動化サンプル調製デバイスを用いたDNAライブラリーサイズ選択を用いて得られた配列決定データが、標準的な手動ビーズベースのプロセスまたは自動化Sage BluePippinサイズ選択法によってサイズについて選択されたDNAライブラリーの複製よりも優れているか、または同等であることを見出した(図26)。
表10(以下)に示すように、自動化されたデバイスは、手動サイズ選択プロセスよりも長く、BluePippin法と同等のリード長を作製し、結果として得られたリードの精度およびGC含量に関してはプロセス間で有意差は観察されなかった。
さらなる実施形態
本発明の実施形態は、ゲルおよび他のマトリックスなどの媒体を介した、核酸、タンパク質、および他の分子などの粒子の誘導された動きに関する。いくつかの実施形態は、目的の粒子を選択的に精製する、分離する、集中させる、および/または検出するための方法および装置を提供する。いくつかの実施形態は、目的の示差的に修飾された粒子を選択的に精製する、分離する、集中させる、および/または検出するための方法および装置を提供する。いくつかの実施形態は、示差的にメチル化されたDNAを選択的に精製する、分離する、集中させる、および/または検出するための方法および装置を提供する。いくつかの実施形態は、エピジェネティクス、腫瘍学、または様々な医学分野などの分野で使用されている。いくつかの実施形態は、胎児の遺伝的障害、癌または癌のリスクを示すバイオマーカー、臓器不全、病状、感染症などを検出するために使用される。
本発明の実施形態は、ゲルおよび他のマトリックスなどの媒体を介した、核酸、タンパク質、および他の分子などの粒子の誘導された動きに関する。いくつかの実施形態は、目的の粒子を選択的に精製する、分離する、集中させる、および/または検出するための方法および装置を提供する。いくつかの実施形態は、目的の示差的に修飾された粒子を選択的に精製する、分離する、集中させる、および/または検出するための方法および装置を提供する。いくつかの実施形態は、示差的にメチル化されたDNAを選択的に精製する、分離する、集中させる、および/または検出するための方法および装置を提供する。いくつかの実施形態は、エピジェネティクス、腫瘍学、または様々な医学分野などの分野で使用されている。いくつかの実施形態は、胎児の遺伝的障害、癌または癌のリスクを示すバイオマーカー、臓器不全、病状、感染症などを検出するために使用される。
以下の実施形態およびその態様は、範囲を限定するものではなく、例示的かつ図示的であることを意図するシステム、ツール、および方法と併せて説明および図示されている。様々な実施形態において、上記の問題のうちの1つ以上が低減または排除されているが、他の実施形態は、他の改善に向けられている。
一実施形態は、生物学的サンプルから目的の分子を集中させるための方法を提供する。生物学的サンプルは対象から取得され、アフィニティーマトリックスにロードされる。アフィニティーマトリックスは、目的の分子に対する第1の結合親和性および生物学的サンプル中の他の分子の少なくともいくつかに対する第2の結合親和性を有する固定化アフィニティー剤を有する。第1の結合親和性は、第2の結合親和性よりも高い。アフィニティーSCODAは、目的の分子を集束スポットに選択的に集中させる(concentrate)ために行なわれ、集束スポット内の目的の分子の濃度は、生物学的サンプル内の他の分子の濃度よりも増加している。分子は核酸であり得る。目的の分子は、生物学的サンプル中の他の分子の少なくともいくつかと同じ配列を有し得る。目的の分子は、生物学的サンプル中の他の分子の少なくともいくつかと比較して、示差的に修飾され得る。目的の分子は、生物学的サンプル中の他の分子の少なくともいくつかと比較して、示差的にメチル化され得る。生物学的サンプルは母体の血漿であってもよく、目的の分子は母体のDNAと比較して示差的にメチル化されている胎児DNAであってもよい。生物学的サンプルは組織サンプルであってもよく、目的の分子は、健康な対象における遺伝子と比較して示差的にメチル化される癌に関係する遺伝子であってもよい。
一実施形態は、サンプル中の第1の分子を第2の分子から分離する方法を提供する。アフィニティーマトリックスは、第1および第2の分子に結合する固定化プローブを備える。第1の分子とプローブとの間の結合エネルギーは、第2の分子とプローブとの間の結合エネルギーよりも大きい。プローブに対する第1および第2の分子の親和性を変化させる移動度変動場である空間勾配が、アフィニティーマトリックス内に提供される。アフィニティーマトリックス内の分子の運動に影響を与える駆動場が印加される。空間勾配および駆動場の両方の配向は、集束スポットに向かう第1の分子の真運動をもたらすように、時間とともに変動させる。洗浄場が印加され、アフィニティーマトリックスを介して第1および第2の分子の両方の真運動をもたらすように配置される。第1および第2の分子は核酸であり得る。第1および第2の分子は、示差的に修飾されてもよい。第1および第2の分子は、示差的にメチル化されてもよい。第1の分子は胎児DNAであってもよく、第2の分子は、胎児DNAと同じ配列を有するが、胎児DNAと比較して示差的にメチル化される母体DNAであってもよい。第1の分子および第2の分子は、癌に関与する遺伝子であり得、第1の分子は、第2の分子と比較して、示差的にメチル化され得る。
一実施形態は、時間変動駆動場を、時間変動移動度変動場と組み合わせて使用して、第1および第2の示差的にメチル化された核酸分子を分離することを提供し、ここで、第1および第2の核酸分子は同じDNA配列を有する。前記DNA配列に少なくとも部分的に相補的なオリゴヌクレオチドプローブを含むマトリックスに、時間変動駆動場および時間変動移動度変動場を印加する。第1の核酸分子は、オリゴヌクレオチドプローブに対する第1の結合エネルギーを有し、第2の核酸分子は、オリゴヌクレオチドプローブに対する第2の結合エネルギーを有し、第1の結合エネルギーは、第2の結合エネルギーよりも高い。第1の核酸分子は胎児DNAであってもよく、第2の核酸分子は母体DNAであってもよく、第1および第2の核酸分子は母体血液のサンプルから得られてもよい。第1および第2の核酸分子は、胎児疾患に関与する遺伝子であり得る。第1および第2の分子は、癌に関係する遺伝子の示差的にメチル化された形態であり得る。第1および第2の分子は対象の組織サンプルから得ることができる。一実施形態は、対象におけるバイオマーカーの存在を検出するために、抗力変化の同期係数(SCODA)の使用を提供する。
発明のさらなる態様
上記の例示的な実施形態および実施例の態様は、本発明のさらなる実施形態をもたらすために、様々な組み合わせおよびサブコンビネーションで組み合わせることができる。上記の例示的な実施形態および実施例の態様が相互に排他的でない限り、そのようなすべての組み合わせおよびサブコンビネーションが本発明の範囲内にあることが意図される。本発明の実施形態がいくつかの態様を含むことは当業者には明らかであろう。したがって、特許請求の範囲は、明細書および実施例に記載された好ましい実施形態によって制限されるべきではなく、全体として明細書と一致する最も広い解釈が与えられるべきである。
上記の例示的な実施形態および実施例の態様は、本発明のさらなる実施形態をもたらすために、様々な組み合わせおよびサブコンビネーションで組み合わせることができる。上記の例示的な実施形態および実施例の態様が相互に排他的でない限り、そのようなすべての組み合わせおよびサブコンビネーションが本発明の範囲内にあることが意図される。本発明の実施形態がいくつかの態様を含むことは当業者には明らかであろう。したがって、特許請求の範囲は、明細書および実施例に記載された好ましい実施形態によって制限されるべきではなく、全体として明細書と一致する最も広い解釈が与えられるべきである。
Claims (63)
- 生物学的サンプルから標的分子を濃縮するためのデバイスであって、前記デバイスは、取り外し可能なカートリッジを受承するように構成されたカートリッジハウジングを含む自動サンプル調製モジュールを含む、デバイス。
- 前記取り外し可能なカートリッジは、単回使用カートリッジまたは複数回使用カートリッジである、請求項1に記載のデバイス。
- 前記取り外し可能なカートリッジは、前記生物学的サンプルを受承するように構成される、請求項1または請求項2に記載のデバイス。
- 前記取り外し可能なカートリッジは、前記生物学的サンプルをさらに含む、請求項3に記載のデバイス。
- 前記カートリッジは、サンプル調製プロセスで使用される流体を収容および/または輸送するように構成された1つまたは複数のマイクロ流体チャネルを含む、請求項1~4のいずれか一項に記載のデバイス。
- 前記カートリッジは、1つまたは複数のアフィニティーマトリックスを含み、各アフィニティーマトリックスは、前記標的分子に対して結合親和性を有する固定化捕捉プローブを含む、請求項1~5のいずれか一項に記載のデバイス。
- 前記生物学的サンプルは、血液、唾液、喀痰、糞便、尿または頬スワブサンプルである、請求項1~6のいずれか一項に記載のデバイス。
- 前記標的分子は標的核酸である、請求項1~7のいずれか一項に記載のデバイス。
- 前記標的核酸はRNAまたはDNA分子である、請求項8に記載のデバイス。
- 前記固定化捕捉プローブはオリゴヌクレオチド捕捉プローブであり、前記オリゴヌクレオチド捕捉プローブは前記標的核酸に対して少なくとも部分的に相補的である配列を含む、請求項3~9のいずれか一項に記載のデバイス。
- 前記オリゴヌクレオチド捕捉プローブは、前記標的核酸に対して少なくとも80%、90%、95%、または100%相補的である配列を含む、請求項10に記載のデバイス。
- 前記デバイスは、下流配列決定用途のための平均リード長であって制御方法を使用して作製される平均リード長よりも長い平均リード長を有する標的核酸を作製する、請求項8~11のいずれか一項に記載のデバイス。
- 前記標的分子は標的タンパク質である、請求項1~7のいずれか一項に記載のデバイス。
- 前記固定化捕捉プローブは、前記標的タンパク質に結合するタンパク質捕捉プローブである、請求項1~7または13のいずれか一項に記載のデバイス。
- 前記タンパク質捕捉プローブは、アプタマーまたは抗体である、請求項13に記載のデバイス。
- 前記タンパク質捕捉プローブは、10-9~10-8M、10-8~10-7M、10-7~10-6M、10-6~10-5M、10-5~10-4M、10-4~10-3M、または10-3~10-2Mの結合親和性で前記標的タンパク質に結合する、請求項14または請求項15に記載のデバイス。
- 前記デバイスが配列決定モジュールをさらに含む、請求項1~16のいずれか一項に記載のデバイス。
- 前記自動化サンプル調製モジュールは、前記配列決定モジュールに直接または間接的に連結されている、請求項17に記載のデバイス。
- 前記デバイスは、前記自動化サンプル調製モジュールから前記配列決定モジュールに前記標的分子を送達するように構成されている、請求項17または請求項18に記載のデバイス。
- 前記配列決定モジュールが核酸の配列決定を行う、請求項17~19のいずれか一項に記載のデバイス。
- 前記核酸の配列決定は、単一分子リアルタイム配列決定、合成による配列決定、ライゲーションによる配列決定、ナノポア配列決定、および/またはサンガー配列決定を含む、請求項20に記載のデバイス。
- 前記配列決定モジュールがポリペプチドの配列決定を行う、請求項17~19のいずれか一項に記載のデバイス。
- 前記ポリペプチドの配列決定はエドマン分解または質量分析を含む、請求項22に記載のデバイス。
- 前記配列決定モジュールが単一分子ポリペプチドの配列決定を行う、請求項17~19のいずれか一項に記載のデバイス。
- 生物学的サンプルから標的分子を精製するための方法であって、前記方法は:
(i)前記生物学的サンプルを溶解すること;
(ii)(i)の溶解したサンプルを断片化すること;
(iii)前記標的分子に対して結合親和性を有する固定化捕捉プローブを含むアフィニティーマトリックスを使用して前記サンプルを濃縮すること;
それにより前記標的分子を精製すること、
を含む方法。 - 前記標的分子が標的核酸である分子である、請求項25に記載の方法。
- 前記標的核酸がRNAまたはDNA分子である、請求項26に記載の方法。
- 前記固定化捕捉プローブはオリゴヌクレオチド捕捉プローブであり、前記オリゴヌクレオチド捕捉プローブは前記標的核酸に対して少なくとも部分的に相補的である配列を含む、請求項25~27のいずれか一項に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチド捕捉プローブは、前記標的核酸に対して少なくとも80%、90%、95%、または100%相補的である配列を含む、請求項28に記載の方法。
- 前記標的分子が標的タンパク質である、請求項28に記載の方法。
- 前記固定化捕捉プローブは、前記標的タンパク質に結合するタンパク質捕捉プローブである、請求項25または30に記載の方法。
- 前記タンパク質捕捉プローブは、アプタマーまたは抗体である、請求項31に記載の方法。
- 前記タンパク質捕捉プローブは、10-9~10-8M、10-8~10-7M、10-7~10-6M、10-6~10-5M、10-5~10-4M、10-4~10-3M、または10-3~10-2Mの結合親和性で前記標的タンパク質に結合する、請求項31または請求項32に記載の方法。
- ステップ(i)は、電解法、酵素法、界面活性剤ベースの方法、および/または機械的ホモジナイゼーションを含む、請求項25~33のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(i)は、連続して実施される複数の溶解方法を含む、請求項25~34のいずれか一項に記載の方法。
- 溶解後、かつステップ(ii)または(iii)の前に前記サンプルが精製される、請求項25~35のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(ii)が、機械的、化学的および/または酵素的断片化方法を含む、請求項25~36のいずれか一項に記載の方法。
- 断片化後、かつステップ(iii)の前に前記サンプルが精製される、請求項25~37のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(iii)が電気泳動法を使用する濃縮を含む、請求項25~38のいずれか一項に記載の方法。
- 前記電気泳動法が、アフィニティーSCODA、FIGE、またはPFGEである、請求項39に記載の方法。
- (iv)前記標的分子を検出することをさらに含む、請求項25~40のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(iv)は、吸光度、蛍光、質量分析、および/または配列決定法を使用する検出を含む、請求項41に記載の方法。
- 前記生物学的サンプルは、血液、唾液、喀痰、糞便、尿または頬スワブサンプルである、請求項25~42のいずれか一項に記載の方法。
- 前記生物学的サンプルは、ヒト、非ヒト霊長類、齧歯動物、イヌ、ネコ、またはウマからのものである、請求項25~43のいずれか一項に記載の方法。
- 前記生物学的サンプルは、細菌細胞または細菌細胞の集団を含む、請求項25~44のいずれか一項に記載の方法。
- 生物学的サンプルから標的分子を濃縮するためのデバイスであって、前記デバイスは自動サンプル調製モジュールを含み、前記自動サンプル調製モジュールは以下のステップ:
(i)生物学的サンプルを受承すること;
(ii)前記生物学的サンプルを溶解すること;
(iii)(ii)のサンプルを断片化すること;および
(iv)前記標的分子に対して結合親和性を有する固定化捕捉プローブを含むアフィニティーマトリックスを使用して前記サンプルを濃縮すること;
を実行する、デバイス。 - 前記標的分子が標的核酸である分子である、請求項46に記載のデバイス。
- 前記標的核酸はRNAまたはDNA分子である、請求項46に記載のデバイス。
- 前記固定化捕捉プローブはオリゴヌクレオチド捕捉プローブであり、前記オリゴヌクレオチド捕捉プローブは前記標的核酸に対して少なくとも部分的に相補的である配列を含む、請求項46~48のいずれか一項に記載のデバイス。
- 前記オリゴヌクレオチド捕捉プローブは、前記標的核酸に対して少なくとも80%、90%、95%、または100%相補的である配列を含む、請求項49に記載のデバイス。
- 前記標的分子が標的タンパク質である、請求項46に記載のデバイス。
- 前記固定化捕捉プローブは、前記標的タンパク質に結合するタンパク質捕捉プローブである、請求項46または請求項51に記載のデバイス。
- 前記タンパク質捕捉プローブは、アプタマーまたは抗体である、請求項52に記載のデバイス。
- 前記タンパク質捕捉プローブは、10-9~10-8M、10-8~10-7M、10-7~10-6M、10-6~10-5M、10-5~10-4M、10-4~10-3M、または10-3~10-2Mの結合親和性で前記標的タンパク質に結合する、請求項52または請求項53に記載のデバイス。
- 前記デバイスが配列決定モジュールをさらに含む、請求項46~54のいずれか一項に記載のデバイス。
- 前記自動化サンプル調製モジュールは、前記配列決定モジュールに直接連結されているか、または間接的に連結されている、請求項55に記載のデバイス。
- 前記デバイスは、前記自動化サンプル調製モジュールから前記配列決定モジュールに前記標的分子を送達するように構成されている、請求項55または請求項56に記載のデバイス。
- 前記配列決定モジュールが核酸の配列決定を行う、請求項55~57のいずれか一項に記載のデバイス。
- 前記核酸の配列決定は、単一分子リアルタイム配列決定、合成による配列決定、ライゲーションによる配列決定、ナノポア配列決定、および/またはサンガー配列決定を含む、請求項58に記載のデバイス。
- 前記配列決定モジュールがポリペプチドの配列決定を行う、請求項55~57のいずれか一項に記載のデバイス。
- 前記ポリペプチドの配列決定はエドマン分解または質量分析を含む、請求項60に記載のデバイス。
- 前記配列決定モジュールが単一分子ポリペプチドの配列決定を行う、請求項55~57のいずれか一項に記載のデバイス。
- 前記デバイスは、制御方法を使用して作製される平均配列決定リード長よりも長い平均配列決定リード長を有する標的核酸を作製する、請求項55~59のいずれか一項に記載のデバイス。
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