KR20220108773A - 샘플 제조를 위한 시스템 및 방법 - Google Patents

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KR20220108773A
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sequencing
sample
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nucleic acid
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KR1020227017593A
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조나단 엠. 로스버그
존 에이치. 리몬
조나단 씨. 슐츠
미셸 밀햄
카이시아 르브
샤오샤오 마
Original Assignee
퀀텀-에스아이 인코포레이티드
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Abstract

용해, 단편화 및 친화성 정제를 사용하여, 예를 들어, 스코다포레시스를 사용하여 샘플로부터 표적 분자를 단리하거나 풍부화하기 위한 방법 및 장치가 본원에서 제공된다. 특정 실시양태에서, 생물학적 샘플로부터 표적 분자를 풍부화하기 위한 장치는 장치가 제거가능한 카트리지를 수용하도록 구성된 카트리지 하우징을 포함하는 자동화 샘플 제조 모듈를 포함하는 것을 특징으로 한다. 일부 실시양태에서, 방법 및 장치는 표적 분자의 검출, 분석 및/또는 서열분석을 추가로 수반한다.

Description

샘플 제조를 위한 시스템 및 방법
관련 출원
본 출원은 2019년 10월 29일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 63/101,213의 출원일의 35 U.S.C. § 119(e) 하의 우선권을 주장하며, 이의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
관심의 분자를 정제하거나, 분리하거나, 농축시키기 위한 한 메커니즘은 드랙 변경의 동기 계수(Synchronous Coefficient Of Drag Alteration) (또는 "SCODA") 기반 정제로 지칭된다. 일부 실시양태에서 스코다포레시스로 공지된 SCODA는 입자를 정제하거나, 분리하거나, 농축시키기 위해 적용될 수 있는 접근법이다.
SCODA 기반 수송은 그렇지 않다면 제로 순 운동을 부여할 시간-가변성 구동력을 시간-가변성 드랙 (또는 이동성) 변경과 동기화함으로써 관심의 분자의 순 운동을 생성하는데 사용된다. 구동력 및 주기적 이동성 변경의 적용이 적절하게 조화되는 경우, 결과는 제로 시간-평균된 힘에도 불구하고 순 운동이다. 구동 및 이동성 변경 장의 시간적 및 공간적 배치 둘 다의 주의 깊은 선택으로, 이 수송의 방법이 입자의 분리, 정제 및/또는 농축에 사용될 수 있도록, 고유한 속도 장, 특히 비-제로 발산을 갖는 속도 장이 생성될 수 있다.
발명의 요약
본 개시내용의 측면은 분석을 위한 샘플을 제조하고/거나 샘플 중의 1개 이상의 표적 분자를 분석하는 (예를 들어, 서열분석에 의해 분석하는) 프로세스에 사용하기 위한 방법, 조성물, 시스템, 및/또는 장치를 제공한다. 일부 실시양태에서, 표적 분자는 핵산 (예를 들어, 제한 없이, cDNA, 게놈 DNA, mRNA, 및 그의 유도체 및 단편을 포함한 DNA 또는 RNA)이다. 일부 실시양태에서, 표적 분자는 단백질 또는 폴리펩티드이다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 생물학적 샘플로부터 표적 분자를 풍부화하기 위한 장치이며, 제거가능한 카트리지를 수용하도록 구성된 카트리지 하우징을 포함하는 자동화 샘플 제조 모듈을 포함하는 장치를 제공한다.
일부 실시양태에서, 제거가능한 카트리지는 단일-사용 카트리지 또는 다중-사용 카트리지이다. 일부 실시양태에서, 제거가능한 카트리지는 생물학적 샘플을 수용하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 제거가능한 카트리지는 생물학적 샘플을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 카트리지는 샘플 제조 프로세스에 사용되는 유체를 함유하고/거나 수송하도록 구성된 1개 이상의 미세유체 채널을 포함한다. 일부 실시양태에서, 카트리지는 1개 이상의 친화성 매트릭스를 포함하고, 여기서 각각의 친화성 매트릭스는 표적 분자에 대한 결합 친화도를 갖는 고정화된 포획 프로브를 포함한다.
일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 혈액, 타액, 가래, 대변, 소변 또는 협측 스왑 샘플이다. 일부 실시양태에서, 표적 분자는 표적 핵산이다. 일부 실시양태에서, 표적 핵산은 RNA 또는 DNA 분자이다. 일부 실시양태에서, 표적 분자는 표적 단백질이다.
일부 실시양태에서, 고정화된 포획 프로브는 올리고뉴클레오티드 포획 프로브이고, 여기서 올리고뉴클레오티드 포획 프로브는 표적 핵산에 적어도 부분적으로 상보적인 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 포획 프로브는 표적 핵산에 적어도 80%, 90% 95%, 또는 100% 상보적인 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 장치 또는 카트리지는 대조군 방법을 사용하여 생성된 평균 판독물-길이보다 더 긴 하류 서열분석 적용을 위한 평균 판독물-길이를 갖는 표적 핵산을 생산한다.
일부 실시양태에서, 고정화된 포획 프로브는 표적 단백질에 결합하는 단백질 포획 프로브이다. 일부 실시양태에서, 단백질 포획 프로브는 압타머 또는 항체이다. 일부 실시양태에서, 단백질 포획 프로브는 10-9 내지 10-8 M, 10-8 내지 10-7 M, 10-7 내지 10-6 M, 10-6 내지 10-5 M, 10-5 내지 10-4 M, 10-4 내지 10-3 M, 또는 10-3 내지 10-2 M의 결합 친화도로 표적 단백질에 결합한다.
일부 실시양태에서, 장치는 서열분석 모듈을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 자동화 샘플 제조 모듈은 서열분석 모듈에 직접적으로 또는 간접적으로 연결된다. 일부 실시양태에서, 장치는 표적 분자를 자동화 샘플 제조 모듈로부터 서열분석 모듈로 전달하도록 구성된다.
일부 실시양태에서, 서열분석 모듈은 핵산 서열분석을 수행한다. 일부 실시양태에서, 핵산 서열분석은 단일-분자 실시간 서열분석, 합성에 의한 서열분석, 라이게이션에 의한 서열분석, 나노포어 서열분석, 및/또는 생거(Sanger) 서열분석을 포함한다.
일부 실시양태에서, 서열분석 모듈은 폴리펩티드 서열분석을 수행한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 서열분석은 에드만 분해 또는 질량 분광법을 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열분석 모듈은 단일-분자 폴리펩티드 서열분석을 수행한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 생물학적 샘플로부터 표적 분자를 정제하는 방법이며, (i) 생물학적 샘플을 용해시키는 단계; (ii) (i)의 용해된 샘플을 단편화하는 단계; 및 (iii) 표적 분자 (예를 들어, 표적 핵산 또는 표적 단백질)에 대한 결합 친화도를 갖는 고정화된 포획 프로브를 포함하는 친화성 매트릭스를 사용하여 샘플을 풍부화하고, 그에 의해 표적 분자를 정제하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 고정화된 포획 프로브는 올리고뉴클레오티드 포획 프로브이고, 여기서 올리고뉴클레오티드 포획 프로브는 표적 핵산에 적어도 부분적으로 상보적인 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 포획 프로브는 표적 핵산에 적어도 80%, 90% 95%, 또는 100% 상보적인 서열을 포함한다. 다른 실시양태에서, 고정화된 포획 프로브는 표적 단백질에 결합하는 단백질 포획 프로브이다. 단백질 포획 프로브는 압타머 또는 항체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 단백질 포획 프로브는 10-9 내지 10-8 M, 10-8 내지 10-7 M, 10-7 내지 10-6 M, 10-6 내지 10-5 M, 10-5 내지 10-4 M, 10-4 내지 10-3 M, 또는 10-3 내지 10-2 M의 결합 친화도로 표적 단백질에 결합한다.
일부 실시양태에서, 표적 분자를 정제하는 방법의 단계 (i)은 전해적 방법, 효소적 방법, 세정제-기반 방법, 및/또는 기계적 균질화를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단계 (i)은 연속적으로 수행되는 다중 용해 방법을 포함한다. 샘플은 용해 후에 및 표적 분자를 정제하는 방법의 단계 (ii) 또는 (iii) 전에 정제될 수 있다. 일부 실시양태에서, 단계 (ii)는 기계적, 화학적 및/또는 효소적 단편화 방법을 포함한다. 샘플은 단편화 후에 및 단계 (iii) 전에 정제될 수 있다. 일부 실시양태에서, 단계 (iii)은 전기영동적 방법 (예를 들어, 친화성 SCODA, FIGE, 또는 PFGE)을 사용한 풍부화를 포함한다.
일부 실시양태에서, 생물학적 샘플로부터 표적 분자를 정제하는 방법은 (iv) 표적 분자를 검출하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 단계 (iv)는 흡광도, 형광, 질량 분광법, 및/또는 서열분석 방법을 사용한 검출을 포함한다.
일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 혈액, 타액, 가래, 대변, 소변 또는 협측 샘플이다. 생물학적 샘플은 인간, 비-인간 영장류, 설치류, 개, 고양이, 또는 말로부터의 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 박테리아 세포 또는 박테리아 세포의 집단을 포함한다.
추가의 측면에서, 본 개시내용은 자동화 샘플 제조 모듈을 포함하는, 생물학적 샘플로부터 표적 분자를 풍부화하기 위한 장치이며, 여기서 자동화 샘플 제조 모듈은 하기 단계를 수행하는 것인 장치를 제공한다: (i) 생물학적 샘플을 수용하는 단계; (ii) 생물학적 샘플을 용해시키는 단계; (iii) (ii)의 샘플을 단편화하는 단계; 및 (iv) 표적 분자 (예를 들어, 표적 핵산 또는 단백질)에 대한 결합 친화도를 갖는 고정화된 포획 프로브를 포함하는 친화성 매트릭스를 사용하여 샘플을 풍부화하는 단계. 일부 실시양태에서, 장치는 서열분석 모듈 (예를 들어, 샘플 제조 모듈에 직접적으로 연결되거나 간접적으로 연결됨)을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 장치는 대조군 방법을 사용하여 생성된 평균 서열분석 판독물-길이보다 더 긴 평균 서열분석 판독물-길이를 갖는 표적 핵산을 생산한다.
상기 기재된 예시적인 측면 및 실시양태 외에도, 추가의 측면 및 실시양태는 도면에 대한 참조에 의해 및 하기 상세한 설명의 연구에 의해 명백하게 될 것이다.
예시적인 실시양태는 도면의 참조된 도면에 예시된다. 본원에 개시된 실시양태 및 도면은 제한적이라기 보다는 실례적인 것으로 간주되어야 한다.
도 1은 -L에서 +L로 연장하는 도메인에 걸쳐 1차원에서 SCODA 드리프트 속도를 나타내는 방정식 [10]의 플롯을 나타낸다.
도 2는 온도의 함수로서 이동성의 상대 변화를 예시하는 두가닥 용융 온도 Tm 부근의 방정식 [23]의 플롯을 나타낸다.
도 3은 고정화된 프로브 분자에 대한 상이한 결합 에너지를 갖는 2개의 상이한 분자에 대한 이동성 대 온도의 플롯을 나타낸다. 높은 결합 에너지 표적의 이동성은 우측의 곡선에 의해 나타내어지는 반면, 낮은 결합 에너지 표적의 이동성은 좌측의 곡선에 의해 나타내어진다.
도 4는 2가지 상이한 결합 에너지를 갖는 분자에 대한 적용된 DC 세척 바이어스의 효과를 나타낸다. 실선 곡선은 파선 곡선에 의해 나타내어진 분자보다 결합된 프로브에 대해 더 낮은 결합 에너지를 갖는 표적 분자의 드리프트 속도를 나타낸다.
도 5는 일부 실시양태에서 2차원 SCODA 기반 농축에 적합한 전기장 패턴의 예를 나타낸다. 전극 A, B, C 및 D에서 적용된 전압은 각각 -V, 0, 0, 및 0이다. 화살표는 음으로 하전된 분석물 분자, 예컨대 DNA의 속도를 나타낸다. 색상 강도는 전기장 강도를 나타낸다.
도 6은 친화성 SCODA의 한 실시양태에서 그의 이동성이 온도에 따라 증가하는 분자의 포커싱을 초래하는 전기장의 단계적 회전을 나타낸다. 입자 경로는 화살표에 의해 나타내어진다.
도 7은 전열적 모델링에 사용된 경계 조건 및 벌크한 겔 특성을 포함한 겔 기하학을 나타낸다.
도 8은 한 실시양태에서 SCODA 사이클의 단일 단계에 대한 전열적 모델의 결과를 나타낸다. 4개의 전극에 적용된 전압은 -120 V, 0 V, 0 V, 0 V였다. 스프레더 플레이트 온도는 55℃ (328 K)로 설정되었다.
도 9는 본 발명의 한 예시적인 실시양태에서 SCODA 속도 벡터 플롯을 나타낸다.
도 10A 및 10B는 한 실시양태에서 DC 세척 바이어스의 적용 하에서의 SCODA 포커싱의 예측을 나타낸다. 도 10A는 완벽한 매치 표적에 대한 SCODA 속도 장을 나타낸다. 원형 스폿은 최종 포커스 위치를 지시한다. 도 10B는 단일 염기 미스매치 표적에 대한 SCODA 속도 장을 나타낸다.
도 11은 한 예시적인 분리를 위한 고정화된 상보적 올리고뉴클레오티드 프로브를 함유하는 겔을 통한 DNA 표적 이동성의 온도 의존성의 측정의 결과를 나타낸다.
도 12는 한 실시양태에 따른 DC 바이어스의 적용 하에서의 친화성 SCODA 포커싱의 시간 계열을 나타낸다. 완벽한 매치 DNA는 6-FAM으로 태그부착되고 (녹색) (기밀한 스폿에 포커싱하는 리딩 밝은 선), 단일 염기 미스매치 DNA는 Cy5로 태그부착된다 (적색) (겔로부터 세척되는 트레일링 밝은 선). 화상은 3분 간격으로 취해졌다. 첫번째 화상은 주사 직후 취해졌다.
도 13A, 13B, 13C 및 13D는 상이한 농도의 프로브로 및 200 mM NaCl의 존재 및 부재 하에서 SCODA 포커싱을 수행하는 것의 결과를 나타낸다. 프로브 농도는 각각 100 μM, 10 μM, 1 μM, 및 100 μM이다. 도 13A, 13B 및 13C에 사용된 완충제는 0.2 M NaCl을 갖는 1X TB였다. 도 13D에 사용된 완충제는 1X TBE였다. 상이한 양의 표적을 이들 실험의 각각에서 주사하였고, 카메라 게인은 포화를 방지하도록 조정되었다.
도 14는 위상 지연 유도된 회전의 예를 제공하는 실험을 나타낸다. 장 회전은 반시계방향이며, 이는 겔에서 표적의 시계방향 회전을 유도한다. 화상은 5분 간격으로 취해졌다.
도 15A는 상이한 형광 마커로 표지된 250 bp 및 1000 bp 단편에 대한 바이어스 하에서의 포커스 위치를 나타내며, 정사각형은 10 V DC 바이어스의 적용에 대한 데이터를 지시하고, 원은 20 V DC 바이어스의 적용에 대한 데이터를 지시한다. 도 15B는 실행의 종료시의 친화성 겔의 화상을 나타내고, 여기서 각각의 형광 마커의 위치를 나타내는 화상은 겹쳐졌다.
도 16A 및 16B는 각각 한 예에 따른 표적 DNA 분자와 비교하여 단일 염기 미스매치를 갖는 100 뉴클레오티드 서열의 정규화된 형광 신호 및 계산된 거부 비를 나타낸다.
도 17A, 17B 및 17C는 DC 바이어스의 적용을 갖는 친화성 SCODA를 사용하여 야생형 및 돌연변이체 앰플리콘의 혼합물로부터의 EZH2 Y641N 돌연변이로부터 얻어진 cDNA의 풍부화를 나타낸다. 화상은 0분 (도 17A), 10분 (도 17B), 및 20분 (도 17C)에서 취해졌다.
도 18은 메틸화된 및 비메틸화된 표적에 대한 이동성 대 온도의 측정에 대한 실험 결과를 나타낸다. 데이터 점은 방정식 [23]에 피팅되었다. 비메틸화된 표적에 대한 데이터는 좌측의 곡선에 피팅되고; 메틸화된 표적에 대한 데이터는 우측의 곡선에 피팅된다.
도 19는 도 18로부터의 데이터에 피팅된 2개의 이동성 대 온도 곡선 사이의 차이를 나타낸다. 이 차이의 최대 값은 69.5℃에서이며, 이는 DC 바이어스의 적용을 갖는 친화성 SCODA 포커싱을 수행하는 동안 최대 분리에 대한 온도이다.
도 20은 적용된 DC 바이어스를 갖는 SCODA 포커싱을 사용함으로써 메틸화된 (6-FAM, 녹색) 및 비메틸화된 (Cy5, 적색) 표적의 분리에 대한 실험 결과를 나타낸다.
도 21A 내지 21D는 친화성 SCODA를 사용한 차등적으로 메틸화된 올리고뉴클레오티드의 분리를 나타낸다. 도 21A 및 21B는 10 pmol 비메틸화된 DNA (도 21A) 및 0.1 pmol 메틸화된 DNA (도 21B)에 대한 겔로부터 비메틸화된 표적을 세척하기 전의 초기 포커스의 결과를 나타낸다. 도 21C 및 21D는 비메틸화된 서열이 각각 비메틸화된 및 메틸화된 표적에 대한 겔로부터 세척된 후에 수행된 제2 포커싱의 결과를 나타낸다.
도 22A 내지 22K는 상이한 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용한 동일한 친화성 매트릭스에서의 2개의 상이한 서열의 차등적 분리의 결과를 나타낸다. 도 22A는 로딩 후의 겔을 나타낸다. 도 22B 및 22C는 각각 2분 및 4분 후의 55℃에서의 포커싱을 나타낸다. 도 22D 및 22E는 각각 2분 및 4분 후의 62℃에서의 포커싱을 나타낸다. 도 22F, 22G 및 22H는 각각 55℃에서 0.5분 및 1분 후 및 온도를 62℃로 상승시킨 후 3분에서의 겔의 중심에서의 추출 웰에 대한 표적 분자의 포커싱을 나타낸다. 도 22I, 22J 및 22K는 각각 6분, 12분 및 18분 후의 55℃에서의 우측으로의 세척 바이어스의 적용을 나타낸다.
도 23은 생물학적 샘플로부터 표적 분자를 제조하는 예시 방법 (예를 들어, 본 개시내용의 자동화 샘플 제조 모듈을 사용하여)을 나타낸다.
도 24는 일부 실시양태에 따른, 채널 (102)의 폭을 따른 카트리지 (100)의 횡단면도의 개략도를 나타낸다.
도 25는 수동으로 추출되고 정제된 DNA로부터 생성된 라이브러리에 비해 본 개시내용의 샘플 제조 장치를 사용하여 자동화 종단간 (DNA 추출-내지-완성된 라이브러리) 샘플 제조로 생성된 DNA 라이브러리로부터의 서열분석 데이터 출력을 나타낸다.
도 26A 내지 26B는 상업적 및 수동 방법을 사용하여 크기 선택된 샘플로부터 유래된 DNA 라이브러리에 비해 본 개시내용의 샘플 제조 장치를 사용하여 자동화 종단간 (DNA 추출-내지-완성된 라이브러리) 샘플 제조로 생성된 DNA 라이브러리로부터의 서열분석 데이터 출력을 나타낸다.
하기 설명 전반에 걸쳐 구체적인 상세사항이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 보다 철저한 이해를 제공하기 위해 제시된다. 그러나, 널리 공지된 요소는 본 개시내용을 불필요하게 불명료하게 하는 것을 회피하기 위해 상세하게 나타내어지거나 기재되지 않았을 수 있다. 따라서, 설명 및 도면은 제한적 의미라기 보다는 실례적 의미로 간주되어야 한다.
본원에 사용된 용어 "차등적으로 변형된"은 상이한 방식으로 화학적으로 변형된 동일한 종류의 2개의 분자를 의미한다. 차등적으로 변형된 분자의 비-제한적 예는 메틸화된 단백질 또는 핵산이 비메틸화된 분자와 비교하여 차등적으로 변형된 것; 과메틸화된 또는 저메틸화된 (예를 들어 암성 또는 전암성 세포에서 일어날 수 있는 바와 같음) 핵산이 건강한 세포에서의 핵산과 비교하여 차등적으로 변형된 것; 아세틸화된 히스톤이 비-아세틸화된 히스톤과 비교하여 차등적으로 변형된 것 등을 포함한다.
일부 실시양태에서, 차등적으로 변형된 분자는 분자 중 하나 상의 화학적 변형의 존재를 제외하고는 서로 동일하다. 일부 실시양태에서, 차등적으로 변형된 분자는 서로 매우 유사하지만, 동일하지는 않다. 예를 들어, 분자가 핵산 또는 단백질인 경우, 생체분자 중 하나는 차등적으로 변형된 분자와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 공유할 수 있다.
SCODA
SCODA는 매질에서 입자의 이동성에 영향을 미치는 시간-가변성 이동성-변경 장 성분과 조합으로 일부 매질에서 입자에 힘을 적용하는 시간-가변성 구동 장 성분을 제공하는 것을 수반할 수 있다. 이동성-변경 장 성분은 입자의 시간-평균된 순 운동을 제공하도록 구동 장 성분과 상관된다. SCODA는 선택된 입자가 포커스 영역을 향해 이동하는 것을 유발하도록 적용될 수 있다.
전기영동적 SCODA로서 본원에 기재된 SCODA 기반 정제의 한 실시양태에서, 시간 가변성 전기장은 주기적 구동력을 제공하기도 하고, 전기장 강도에 의존하는 매질에서 이동성을 갖는 분자, 예를 들어 핵산 분자의 드랙 (또는 등가적으로 이동성)을 변경시키기도 한다. 예를 들어, DNA 분자는 체질 매트릭스, 예컨대 아가로스 또는 폴리아크릴아미드를 통해 이동하면서 적용된 전기장의 규모에 의존하는 이동성을 갖는다. 적절한 주기적 전기장 패턴을 분리 매트릭스 (예를 들어 아가로스 또는 폴리아크릴아미드 겔)에 적용함으로써, 수렴성 속도 장은 그의 이동성이 전기장에 의존하는 겔에서 모든 분자에 대해 생성될 수 있다. 장 의존적 이동성은 반복 DNA 분자 및 체질 매트릭스 사이의 상호작용의 결과이며, 체질 매트릭스를 통해 이동하는 높은 형태적 엔트로피 및 높은 전하 대 질량 비를 갖는 하전된 분자의 일반적 특색이다. 핵산은 높은 형태적 엔트로피 및 높은 전하 대 질량 비 둘 다를 갖는 대부분의 생물학적 샘플에 존재하는 유일한 분자인 경향이 있기 때문에, 전기영동적 SCODA 기반 정제는 핵산에 대해 고도로 선택적인 것으로 나타났다.
샘플에서 특이적 생체분자를 검출하는 능력은 질환의 진단 및 치료의 분야에서 폭넓은 적용을 갖는다. 연구는 다양한 장애와 연관된 다수의 바이오마커를 밝혀내기를 계속하고 있다. 예시적인 바이오마커는 유전자 돌연변이, 특이적 단백질의 존재 또는 부재, 특이적 단백질의 상승된 또는 감소된 발현, 특이적 RNA의 상승된 또는 감소된 수준, 변형된 생체분자의 존재 등을 포함한다. 바이오마커 및 바이오마커를 검출하는 방법은 암, 질환, 감염, 기관 부전 등을 포함한 다양한 장애의 진단, 예측, 및 그의 치료의 모니터링에 잠재적으로 유용하다.
생체내에서 생체분자의 차등적 변형은 발달 및 질환 진행을 포함한 많은 생물학적 프로세스의 중요한 특색이다. 차등적 변형의 한 예는 DNA 메틸화이다. DNA 메틸화는 핵산에의 메틸 기의 첨가를 수반한다. 예를 들어 메틸 기는 시토신에서 피리미딘 고리 상의 5' 위치에서 첨가될 수 있다. CpG 섬에서의 시토신의 메틸화는 유전자 발현의 장기 조절을 위해 진핵생물에서 통상적으로 사용된다. 비정상적 메틸화 패턴은 암을 포함한 많은 인간 질환에 연루되었다. DNA는 또한 아데닌 퓨린 고리의 6 질소에서 메틸화될 수 있다.
예를 들어 메틸화, 아세틸화 또는 다른 화학적 변경에 의한 분자의 화학적 변형은 표적 분자 및 표적 분자에 결합하는 작용제의 결합 친화도를 변경시킬 수 있다. 예를 들어, 시토신 잔기의 메틸화는 비메틸화된 두가닥에 비해 혼성화의 결합 에너지를 증가시킨다. 효과는 작다. 이전의 연구는 비메틸화된 둘 다의 가닥을 갖는 두가닥을 메틸화된 둘 다의 가닥을 갖는 두가닥과 비교할 경우, 16 뉴클레오티드 서열에서 메틸화 부위 당 대략 0.7℃의 두가닥 용융 온도의 증가를 보고한다.
친화성 SCODA
SCODA포레시스는 겔 내로 생체분자를 주사하고, 겔의 중심에서 관심의 핵산 또는 다른 생체분자를 우선적으로 농축시키는 방법이다. SCODA는 예를 들어, DNA, RNA 및 다른 분자에 적용될 수 있다. 농축 후, 정제된 분자는 추가의 분석을 위해 제거될 수 있다. SCODA포레시스-친화성 SCODA의 한 구체적인 실시양태에서, 관심의 생체분자에 특이적인 결합 부위는 겔에서 고정화될 수 있다. 그렇게 함에 있어서, 특이적 결합 부위에 결합하는 생체분자에 대한 전기장에 대한 비-선형 모티브 반응을 생성할 수 있다. 친화성 SCODA의 한 구체적인 적용은 서열-특이적 SCODA이다. 여기서 올리고뉴클레오티드는 겔에서 고정화되어 단지 결합된 올리고뉴클레오티드에 상보적인 DNA 분자의 농축을 허용할 수 있다. 상보적이지 않은 모든 다른 DNA 분자는 약하게 포커싱할 수 있거나 전혀 포커싱하지 않을 수 있으며, 따라서 작은 DC 바이어스의 적용에 의해 겔로부터 세척될 수 있다.
SCODA 기반 수송은 먼저 시간-가변성 포싱 (즉, 구동) 장을 적용하여 입자의 주기적 운동을 유도하고, 이 포싱 장 상에 입자의 드랙 (또는 등가적으로 이동성)을 주기적으로 변경시키는 시간-가변성 동요 장 (즉, 이동성-변경 장)을 겹침으로써 매질을 통해 입자를 이동시키는 일반적 기술이다. 이동성-변경 장의 적용은 입자가 포싱 사이클의 다른 부분에서보다 포싱 사이클의 한 부분 동안 추가로 이동하도록 포싱 장의 적용과 조화된다. 구체적으로, 시간 가변성 드랙 계수 ζ (t) (즉, 가변성 이동성)를 갖는 외부 힘 F(t)에 의해 유도된 입자의 드리프트 속도 υ(t)는
Figure pct00001
에 의해 주어진다.
외부 힘 및 드랙 계수가
Figure pct00002
및
Figure pct00003
이도록 주기적으로 가변하는 경우, 한 완전한 사이클에 걸쳐 평균된 드리프트 속도는
Figure pct00004
에 의해 주어진다.
외부 적용된 힘과 동일한 빈도에서 입자의 드랙 (즉, 이동성)을 가변시킴으로써, 순 드리프트는 제로-시간-평균된 포싱으로 유도될 수 있다. 방정식 [4]의 결과는 시간 및 공간에서 가변하여 1 또는 2차원에서 수렴성 속도 장을 생성하는 구동력 및 드랙 계수의 적절한 선택으로 사용될 수 있다. 시간 가변성 드랙 계수 및 구동력은 표적 분자 및 1개 이상의 비-표적 분자, 예를 들어 1개 이상의 위치에서 차등적으로 변형된 분자, 또는 1개 이상의 염기에서 서열에 있어서 상이한 핵산 사이의 차이는 매우 작은 경우라도, 단지 특정 분자를 특이적으로 농축시키는 (즉, 우선적으로 포커싱하는) 실제 시스템에 이용될 수 있다.
1차원 SCODA 농축
시간에 따라 주기적으로 가변하는 공간적으로 균일한 구동력을 시간에 따라 뿐만 아니라 공간에 따라 가변하는 드랙 계수와 조합함으로써, 1차원에서 수렴성 속도 장을 생성하는 것이 가능하다. 적용된 전기장 E의 영향 하에서 이동하는 이동성 μ를 갖는 하전된 입자의 사례를 고려한다; 그의 속도는
Figure pct00005
에 의해 주어질 것이다.
전기장이
Figure pct00006
및
선형 이동성 구배가 동일한 주기에서 가변하는 도메인 -L.ltoreq.x.ltoreq.L 내에서 제공되도록 시간에 따라 주기적으로 가변하는 경우, 입자의 SCODA-기반 분리가 달성될 수 있다:
Figure pct00007
여기서 k는 이동성 변동의 진폭으로 생각될 수 있다.
적용된 외부 전기장의 영향 하에서 용액에서 이동하는 하전된 분자에 대한 이동성 구배를 확립하기 위한 다수의 방법이 있다. 예를 들어, 시간-가변성 전기장은 상기 기재된 바와 같이 제공될 수 있고, 온도 구배는 확립될 수 있고, pH 구배는 확립될 수 있고, 광 구배는 광의 존재 또는 부재 하에서 형태적 변화를 겪는 분자에 대해 확립될 수 있는 등이다.
방정식 [7]의 이동성 구배가 제공되는 경우, 속도는
Figure pct00008
이 된다.
이 속도의 시간 평균을 한 완전한 사이클에 걸쳐 취하면 하기 드리프트 속도가 산출된다:
Figure pct00009
.
이 속도 장은 x=0에서 평형 점을 갖고, kE0 cos(φ)의 사인에 따라 수렴성 또는 발산성으로 만들어질 수 있다. 양의 값에 대해 속도 장은 발산성이고, 음의 값에 대해 이는 수렴성이다. 도 1은 kE0 cos(φ)<0인 경우에 대해 x의 함수로서 플롯팅된 속도를 나타낸다. 도 1에서 화살표는 드리프트의 방향을 지시한다. -L 및 +L 사이의 모든 입자는 x=0에서 제로 속도 점을 향해 드리프트할 것이다. 도메인 외부에서 시간 평균된 속도는 이동성이 단지 -L 및 +L 사이에 변경되기 때문에 제로이다.
도 1에 예시된 실시양태에서, 속도는 x의 음의 값에 대해 양의 값을 취하고, x의 양의 값에 대해 그 역도 마찬가지이며, 이는 속도가 제로인 경우 x=0을 향해 드리프트하는 도메인 내의 모든 입자를 발생시킨다.
2차원 SCODA
방정식 [10]의 결과를 2차원으로 연장하기 위해, 일부 실시양태에서 회전 전기장은 구동 장으로서 사용되고, 회전 이동성 구배가 확립된다:
Figure pct00010
.
1차원 사례 {(υ)에 걸쳐 우측 화살표}=μ{(E)에 걸쳐 우측 화살표}에서와 같이, 및 방정식 [9]에서와 동일한 적분을 수행하여 2차원에서 시간 평균된 드리프트 속도를 산출할 수 있다:
Figure pct00011
.
이는 드리프트 속도에 대한 하기 표현을 발생시킨다:
Figure pct00012
.
극성 좌표로 다시 쓰고 단순화하면
Figure pct00013
가 산출된다
이 결과는 2차원에서 SCODA의 다수의 측면을 강조한다. 이는 제로 시간 평균된 포싱에도 불구하고, r=0인 매질에서의 점에서를 제외하고 어디에서나 비-제로 드리프트가 있을 것임을 나타낸다. 이는 드리프트의 성질이 2개의 신호의 상대 위상, φ에 의존함을 나타내며, 포커싱의 강도 (반경, {(r)에 걸쳐 만곡}, 항)는 전기 구동 장 진동 및 이동성 진동 사이의 위상 지연의 코사인에 비례한다. 0° 위상각에 대해, 도메인의 중심을 향해 지향된 순 드리프트를 갖는 순수한 포커싱 속도 장이 있다. 180° 위상각에 대해, 속도 장은 겔의 중심으로부터 떨어진 순 드리프트를 갖는 순수한 탈-포커싱이다. 그리고 90° 및 270°의 위상각에 대해, 속도 장은 순수하게 회전적이다. 중간 각도에서, 생성된 속도 장은 회전 및 포커싱 성분 둘 다의 조합일 것이다. 효율적인 포커싱을 달성하기 위해, 일부 실시양태에서 구동력 및 이동성 변동 사이의 위상 차이는 가능한 한 작다.
시간 가변성 이동성 장의 생성
SCODA 기반 농축의 이전의 적용은 체질 매트릭스, 예컨대 아가로스 또는 폴리아크릴아미드에서의 DNA의 이동성이 적용된 전기장의 규모에 의존한다는 사실을 사용하였다. 일부 적용에서, 관심의 분자, 예컨대 200개 미만의 염기의 짧은 핵산, 핵산 이외의 생체분자 (예를 들어 단백질 또는 폴리펩티드) 등은 통상적으로 전기장에 강하게 의존하지 않는 이동성을 가질 수 있다. 일부 적용에서, 샘플에서 핵산의 단지 하위세트를 정제하는 것, 예를 들어 게놈 DNA의 샘플로부터 단일 유전자를 정제하거나 검출하는 것 또는 동일한 기본적 구조를 갖는 차등적으로 변형된 분자 (예를 들어 동일한 서열을 갖는 비메틸화된 DNA)로부터 화학적으로 변형된 분자 (예를 들어 메틸화된 DNA)를 정제하거나 검출하는 것 등이 요망될 수 있다.
전기장 강도에 강하게 의존하는 이동성을 갖지 않는 (즉, 전기장 강도의 변동에 기반하여 k의 낮은 값을 갖는) 분자의 SCODA-기반 정제는 농축되는 분자에 대한 친화도를 갖는 SCODA 매트릭스를 사용함으로써 달성될 수 있다. 친화성 매트릭스는 매질에서 표적 분자에 대한 결합 친화도를 갖는 작용제 (즉, 프로브)를 고정화함으로써 생성될 수 있다. 이러한 매트릭스를 사용하여, 표적 분자가 그것이 친화성 매트릭스를 통해 이동함에 따라 표적 분자의 전체 이동성을 감소시키는 효과를 갖는 친화성 매트릭스에 일시적으로 결합하는 작동 조건이 선택될 수 있다. 이들 일시적 상호작용의 강도는 시간 경과에 따라 가변하며, 이는 관심의 표적 분자의 이동성을 변경시키는 효과를 갖는다. 따라서 SCODA 드리프트가 생성될 수 있다. 이 기술은 친화성 SCODA로 지칭되며, 일반적으로 매트릭스에 대한 친화도를 갖는 임의의 표적 분자에 적용가능하다.
친화성 SCODA는 단일 뉴클레오티드 분해능을 갖는 서열 함량에 기반하여 핵산에 대해 선택적으로 풍부화할 수 있다. 또한, 친화성 SCODA는 동일한 DNA 서열을 갖지만 미묘하게 상이한 화학적 변형, 예컨대 메틸화를 갖는 분자에 대한 k의 상이한 값을 초래할 수 있다. 따라서, 친화성 SCODA는 주어진 프로브에 대한 결합 에너지에 있어서 미묘하게 상이한 분자에 대해 풍부화 (즉, 우선적으로 포커싱)하는데 사용될 수 있으며, 구체적으로 메틸화된, 비메틸화된, 과메틸화된, 또는 저메틸화된 서열에 대해 풍부화하는데 사용될 수 있다.
친화성 SCODA를 수행하는데 사용될 수 있는 예시적인 매질은 관심의 분자가 이동할 수 있고, 친화성 작용제가 고정화되어 친화성 매트릭스를 제공할 수 있는 임의의 매질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리아크릴아미드 겔, 아가로스 겔 등을 포함한 중합체성 겔이 사용된다. 일부 실시양태에서, 미세제작된/미세유체 매트릭스가 사용된다.
이동성 변경 장을 제공하기 위해 가변할 수 있는 예시적인 작동 조건은 온도, pH, 염도, 변성제의 농도, 촉매의 농도, 두가닥을 물리적으로 뜯어내기 위한 전기장의 적용 등을 포함한다.
매트릭스 상에 고정화되어 친화성 매트릭스를 제공할 수 있는 예시적인 친화성 작용제는 관심의 핵산 서열에 상보적인 서열을 갖는 핵산, 차등적으로 변형된 분자에 대한 상이한 결합 친화도를 갖는 단백질, 변형된 또는 비변형된 분자에 대해 특이적인 항체, 변형된 또는 비변형된 분자에 대해 특이적인 핵산 압타머, 변형된 또는 비변형된 분자에 우선적으로 결합하는 다른 분자 또는 화학적 작용제 등을 포함한다.
친화성 작용제는 임의의 적합한 방식으로 매질 내에 고정화될 수 있다. 예를 들어 친화성 작용제가 올리고뉴클레오티드인 경우, 올리고뉴클레오티드는 매질에 공유 결합될 수 있거나, 아크리다이트 변형된 올리고뉴클레오티드는 폴리아크릴아미드 겔 내로 직접적으로 혼입될 수 있거나, 올리고뉴클레오티드는 매질 내에 물리적으로 동반된 비드 또는 다른 구축물에 공유 결합될 수 있는 등이다.
친화성 작용제가 단백질 또는 항체인 경우, 일부 실시양태에서 단백질은 매질 내에 물리적으로 동반되거나 (예를 들어 단백질은 아가로스 또는 폴리아크릴아미드 겔 내로 직접적으로 캐스팅될 수 있음), 매질에 공유 커플링되거나 (예를 들어 단백질을 아가로스 겔에 커플링시키는 시아노겐 브로마이드의 사용을 통해), 매질 내에 동반된 비드에 공유 커플링되거나, 매질에 또는 매질 내에 동반된 비드에 직접적으로 커플링된 제2 친화성 작용제에 결합될 수 있는 (예를 들어 NTA-아가로스에 결합된 헥사히스티딘 태그) 등이다.
친화성 작용제가 단백질인 경우, 친화성 매트릭스가 제조되는 조건 및 샘플이 로딩되는 조건은 단백질을 변성시키지 않도록 제어되어야 한다 (예를 들어 온도는 단백질을 변성시킬 가능성이 있을 수준 미만으로 유지되어야 하고, 매질을 제조하거나 SCODA 포커싱을 수행하는데 사용되는 샘플 중의 또는 완충제 중의 임의의 변성제의 농도는 단백질을 변성시킬 가능성이 있을 수준 미만으로 유지되어야 함).
친화성 작용제가 관심의 분자와 상호작용하는 소분자인 경우, 친화성 작용제는 임의의 적합한 방식으로 매질에 공유 커플링될 수 있다.
친화성 SCODA의 한 예시적인 실시양태는 서열-특이적 SCODA이다. 서열 특이적 SCODA에서, 표적 분자는 특이적 서열을 포함하는 핵산 분자이거나 이를 포함하고, 친화성 매트릭스는 표적 핵산 분자에 상보적인 고정화된 올리고뉴클레오티드 프로브를 함유한다. 일부 실시양태에서, 서열 특이적 SCODA는 샘플로부터 특이적 핵산 서열을 분리하는데, 및 그 특이적 핵산 서열이 샘플 내에서 차등적으로 변형되는지 여부를 분리하고/거나 검출하는데 둘 다에 사용된다. 일부 이러한 실시양태에서, 친화성 SCODA는 핵산 서열 및 차등적으로 변형된 핵산 서열 둘 다가 SCODA 장의 적용에 의해 농축되도록 하는 조건 하에서 수행된다. 비목적하는 서열을 갖는 핵산을 포함한 오염 분자는 SCODA 포커싱 동안 친화성 매트릭스로부터 세척될 수 있다. 이어서 세척 바이어스는 고정화된 올리고뉴클레오티드 프로브에 대한 보다 높은 결합 에너지를 갖는 분자를 우선적으로 포커싱함으로써, SCODA 포커싱 장과 함께 적용되어 하기 기재된 바와 같이 차등적으로 변형된 핵산 분자를 분리할 수 있다.
친화성 매트릭스에서의 표적의 이동성
친화성 매트릭스에서의 표적 및 고정화된 프로브 사이의 상호작용은 1차 반응 동역학에 의해 기재될 수 있다:
Figure pct00014
여기서 [T]는 표적이고, [P]는 고정화된 프로브이고, [T. P]는 프로브-표적 두가닥이고, kf는 정 (혼성화) 반응 속도이고, kr은 역 (해리) 반응 속도이다. 표적의 이동성은 그것이 매트릭스에 결합된 동안 제로이기 때문에, 표적의 유효 이동성은 매트릭스 상에 고정화된 표적의 상대 양만큼 감소될 것이다:
Figure pct00015
여기서 μ0은 비결합된 표적의 이동성이다. 정반응 속도6 및 비결합된 표적의 농도보다 유의하게 더 높은 고정화된 프로브 농도에 대한 합리적인 추정치를 사용하여, 혼성화를 위한 시간 상수는 유의하게 1초 미만일 것으로 가정될 수 있다. 이동성-변경 장의 주기가 1초보다 더 길게 유지되는 경우, 분석의 목적상 결합 동역학은 빠른 것으로 가정될 수 있고, 방정식 [17]은 반응 속도의 관점에서 다시 쓰여질 수 있다:
Figure pct00016
.
[20]을 방정식 [18] 내로 삽입하고, 단순화하면
Figure pct00017
가 산출된다.
이 결과로부터, 이동성은 정반응 또는 역반응 속도 중 어느 하나를 변형시킴으로써 변경될 수 있음을 알 수 있다. 정반응 또는 역반응 속도의 변형은 다수의 상이한 방식으로, 예를 들어 온도, 염도, pH, 변성제의 농도, 촉매의 농도를 조정함으로써, 두가닥을 외부 전기장으로 물리적으로 뜯어냄으로써 등에 의해 달성될 수 있다. 하기 보다 상세하게 기재된 한 예시적인 실시양태에서, 친화성 매트릭스를 통해 이동하는 표적 분자의 이동성을 변형시키기 위한 메커니즘은 매트릭스 온도의 제어이다.
분석을 용이하게 하기 위해, 일부 단순화 가정을 하는 것이 도움이 된다. 먼저 표적 분자에 비해 다수의 고정화된 프로브가 있다고 가정된다. 이것이 사실인 한, 표적 분자의 많은 부분이 프로브에 결합되게 된다 하더라도, 유리 프로브의 농도, [P]는 많이 변화하지 않을 것이고, [P]는 일정한 것으로 가정될 수 있다. 또한, 정반응 속도 kf는 온도에 의존하지 않는 것으로 가정된다. 이는 정반응 속도가 온도에 의존하기 때문에 엄격하게는 사실이 아니다. 고정화된 프로브에서의 또는 표적 분자에서의 2차 구조는 온도 의존적 정반응 속도를 발생시킬 수 있다. 그러나, 두가닥 용융 온도 부근의 온도 범위에서 작동하는 실시양태에서 역반응 속도는 온도에 대한 지수적 의존성을 갖고, 정반응 속도는 용융 온도 주위의 30℃의 범위에 걸쳐 약 30%만큼 가변하는 훨씬 더 약한 온도 의존성을 갖는다. 추가로, 표적 서열은 임의의 유의한 2차 구조가 없는 것으로 가정된다. 이 최종 가정은 항상 정확하지는 않을 것이지만, 이는 이 초기 분석을 단순화한다.
역반응 속도의 온도 의존성을 결정하기 위해, 비결합 동역학에 대한 아레니우스(Arrhenius) 모델이 가정된다. 이 가정은 나노포어 힘 분광학에서의 최근의 연구에 의해 정당화된다.
Figure pct00018
여기서 A는 경험적으로 유도된 상수이고, ΔG는 프로브-표적 결합 에너지이고, kb는 볼츠만(Boltzmann) 상수이고, T는 온도이다. 이를 [21] 내로 삽입하고, 자유 에너지 ΔG를 ΔH-TΔS로서 다시 쓰고, 상수항을 수정하면 이동성이 하기와 같이 다시 쓰여지게 된다:
Figure pct00019
.
방정식 [23]은 S자형 이동성 온도 의존성을 기재한다. 이 곡선의 형상은 도 2에 나타내어진다. 낮은 온도에서 이동성은 거의 제로이다. 이는 열 여기가 친화성 매트릭스로부터 표적 분자를 유도하는데 불충분한 체제이다. 높은 온도에서 표적 분자는 비결합된 이동성에서 이동하며, 여기서 열 에너지는 결합 에너지보다 더 크다. 이들 2개의 극단 사이에 온도의 작은 변화가 이동성의 큰 변화를 발생시키는 온도 범위가 존재한다. 이는 이동성 변경 파라미터로서 온도를 이용하는 친화성 SCODA의 실시양태에 대한 작동 체제이다.
서열에 기반하여 핵산을 분리하는데 사용되는 친화성 SCODA, 즉, 서열-특이적 SCODA의 실시양태에서, 이 온도 범위는 프로브-표적 두가닥의 용융 온도 부근에 있는 경향이 있다. 방정식 [10] 및 [16]은 농축의 속도가, 이동성이 한 SCODA 사이클 동안 얼마나 변화하는지의 척도인 k에 비례함을 진술한다. 이동성 대 온도 곡선의 기울기가 가장 가파른 프로브-표적 두가닥 용융 온도 부근에서 작동하는 것은 온도가 이동성 변경 파라미터로서 사용되는 실시양태에서 SCODA 사이클 동안 주어진 온도 변동에 대한 k를 최대화한다.
일부 실시양태에서, 친화성 SCODA는 표적 분자 및 친화성 작용제의 용융 온도의 약 ±20℃ 내에서, 약 ±10℃ 내에서, 약 ±5℃ 내에서, 또는 약 ±2℃ 내에서 가변하는 SCODA 포커싱 장의 적용 동안 최대 진폭을 갖는 온도 구배 내에서 수행될 수 있다.
방정식 [7]의 시간 의존적 이동성을 방정식 [23]의 온도 의존적 이동성 및 시간 의존적 온도로 대체함으로써 1차원에서 친화성 SCODA를 기재하는 것이 가능하다:
Figure pct00020
여기서, 온도는 Tm, 프로브 표적 용융 온도 주위에서 진동하고, Ta는 x=±L에서의 온도 진동의 최대 진폭이다. 온도의 함수로서 드리프트 속도에 대한 분석적 표현, υd=μE를 얻기 위해, 방정식 [23]의 테일러(Taylor) 확장은 Tm 주위에서 수행된다:
Figure pct00021
이는
Figure pct00022
으로 다시 쓰여질 수 있다.
여기서 테일러 확장에서 제1 항은 상수 알파로 모아졌다. [24] 및 [26]을 이동성에 대한 표현으로 조합하는 것은 [7]과 유사한 표현을 산출한다:
Figure pct00023
.
방정식 [27]은 k를
Figure pct00024
로 대체함으로써 1차원 및 2차원 사례 둘 다에 대한 시간 평균된 드리프트 속도를 결정하는데 사용될 수 있다.
이어서 드리프트 속도는 1차원에서
Figure pct00025
에 의해 주어지고, 2차원에서
Figure pct00026
에 의해 주어진다. 이 결과는 2차원 겔이 고정화된 프로브 (즉, 친화성 매트릭스)로 관능화되는 경우, 회전 온도 구배를 회전 쌍극자 전기장과 조합함으로써, 모든 표적 분자가 겔에서 중심 영역을 향해 포싱되고, 따라서 고정화된 프로브에 결합하는 표적 분자를 농축시킬 것임을 나타낸다.
친화성 SCODA로의 분자적 분리
일부 실시양태에서, 친화성 SCODA는 고정화된 프로브에 대한 상이한 결합 친화도를 갖는 2개의 유사한 분자 (예를 들어 차등적으로 변형되었거나, 단지 하나 또는 소수의 위치에서 서열에 있어서 상이한 동일한 분자)를 분리하는데 사용된다. 각각 고정화된 프로브에 대한 상이한 결합 에너지를 갖는 2개의 분자 종으로 시작하여, 이들 2개의 분자 종은 세척 모티브 힘을 SCODA 포커싱을 생성하는데 사용되는 구동 및 이동성 변경 장 위에 겹쳐, 고정화된 프로브에 대한 더 적은 결합 친화도를 갖는 분자의 순 운동을 제공함으로써 분리될 수 있다 (즉, 고정화된 프로브에 대한 보다 높은 결합 친화도를 갖는 분자가 SCODA 포커싱 장의 적용 동안 우선적으로 포커싱됨). 일부 실시양태에서, 세척 힘은 본원에서 DC 바이어스로 지칭되는 작은 적용된 DC 힘이다.
작은 DC 힘이 세척 또는 바이어스 힘으로서 적용되는 1차원 사례에서, 전기장은
Figure pct00027
이 된다.
여기서 Eb는 적용된 DC 바이어스이다. 최종 드리프트 속도는 바이어스 장의 강도에 비례하는 일정한 속도인 SCODA 포커싱 속도 상에 겹쳐졌다:
Figure pct00028
.
이 드리프트 속도는 바이어스의 방향에 따라 최종 포커스 위치를 좌측 또는 우측으로 이동시키는 경향이 있을 것이다. 이 바이어스가 포커스를 중심으로부터 이동시키는 양은 표적 및 프로브 분자 사이의 상호작용의 강도에 의존한다. 따라서, 표적-프로브 상호작용의 차등적 강도는 2개의 매우 유사한 종의 분자적 분리를 가능하게 하는 메커니즘으로서 역할을 할 수 있다.
고정화된 프로브에 대한 상이한 결합 친화도를 갖는 2개의 분자를 고려한다. 방정식 [23]에서 프로브-표적 결합 에너지, ΔG를 감소시키는 것은 도 3에 나타내어진 바와 같이 이동성 대 온도 곡선을 온도 스케일 상의 좌측으로 이동시키는 역할을 할 것이다. 높은 결합 에너지 표적의 이동성은 우측의 곡선에 의해 나타내어지는 반면, 낮은 결합 에너지 표적의 이동성은 좌측의 곡선에 의해 나타내어진다.
이 예시적인 실시양태에서의 SCODA 시스템이 보다 높은 결합 에너지 분자에 대한 최적 포커싱 온도, 즉, 도 3에서의 Tm에서 작동되는 경우, 보다 낮은 결합 에너지 분자의 이동성은 더 높을 것이고, 더 약한 온도 의존성을 가질 것이다. 방정식 [32]의 관점에서 보다 낮은 결합 에너지를 갖는 분자는 μ(Tm)의 보다 큰 값 및 a의 보다 작은 값을 가질 것이다. 이는 보다 낮은 결합 에너지 분자가 보다 낮은 SCODA 드리프트 속도 및 DC 바이어스 하에서의 보다 높은 속도를 가질 것이고, 이는 도 4에 예시된 바와 같이 높은 결합 에너지 분자와는 상이한 최종 포커스 위치를 발생시킬 것임을 의미한다.
도 4는 한 실시양태에 따른 고정화된 프로브에 대한 2개의 상이한 결합 에너지를 갖는 분자에 대한 적용된 DC 바이어스의 효과를 나타낸다. 실선 곡선은 파선 곡선에 의해 나타내어진 분자보다 결합된 프로브에 대한 더 낮은 결합 에너지를 갖는 표적 분자의 드리프트 속도를 나타낸다. 최종 포커스 위치는 드리프트 속도가 제로와 동등한 점이다. 실선 곡선에 의해 나타내어진 분자는 파선 곡선에 의해 나타내어진 분자에 비해 더 낮은 SCODA 드리프트 속도 및 더 높은 DC 속도 둘 다를 갖는다. SCODA 포커싱이 DC 바이어스와 조합되는 경우, 보다 낮은 결합 에너지 분자는 x=0에서 비바이어스된 포커스로부터 추가로 떨어져 포커싱하여, 2개의 별개의 포커스, 각각의 분자 종에 대한 것을 발생시킬 것이다. 높은 결합 에너지 분자에 대한 최종 포커스 위치는 참조 번호 30에 의해 지시된다. 낮은 결합 에너지 분자에 대한 최종 포커스 위치는 참조 번호 32에 의해 지시된다.
2차원 사례는 1차원 사례와 동일하며, 적용된 세척 바이어스로부터 겹쳐진 속도는 최종 포커스 스폿을 세척 바이어스의 방향에서 중심으로부터 이동시킨다.
일부 실시양태에서, 분리되는 분자 사이의 결합 에너지의 차이가 충분히 크고, 충분히 높은 세척 바이어스가 적용되는 경우, 낮은 결합 에너지 분자는 친화성 매트릭스로부터 세척될 수 있는 반면, 보다 높은 결합 에너지를 갖는 분자는 친화성 매트릭스에 보유되고, SCODA 포커싱 장의 적용을 통해 친화성 매트릭스 내의 포커스 위치에서 포획될 수 있다 (즉, 우선적으로 포커싱됨).
시간 가변성 온도 구배의 생성
이동성 변경 장으로서 온도의 변동을 사용하는 친화성 SCODA의 실시양태는 주기적으로 가변하는 온도 구배를 사용하여 수렴성 속도 장을 생성할 수 있다. 주기적으로 가변하는 온도 구배는 임의의 적합한 방식으로, 예를 들어 매질의 영역을 주기적으로 가열하고 냉각시키는 히터 또는 열전기 냉각장치의 사용, 매질의 영역을 주기적으로 가열하는 방사 가열의 사용, 매질의 영역을 주기적으로 가열하는 광 또는 방사선의 적용, 매질에의 전기장의 적용을 사용하는 줄(Joule) 가열 등에 의해 제공될 수 있다.
주기적으로 가변하는 온도 구배는 목적하는 포커스 스폿으로부터 더 먼 거리에 놓인 입자가 목적하는 포커스 스폿으로부터 떨어진 구동 장의 적용의 시간 동안보다 목적하는 포커스 스폿을 향한 구동 장의 적용의 시간 동안 더 큰 이동성을 경험하도록 (즉, 보다 높은 온도에 있고, 따라서 더 멀리 활주하도록) 하는 임의의 적합한 방식으로 확립될 수 있다. 일부 실시양태에서, 온도 구배는 시간-가변성 구동력의 적용과 함께 수렴성 속도 장을 생성하도록 회전된다.
일부 실시양태에서, 전기장을 사용한 줄 가열은 온도 구배를 제공하기 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, 온도 구배를 제공하기 위해 줄 가열을 제공하는데 사용되는 전기장은 구동 장을 제공하는 전기장과 동일하다. 일부 실시양태에서, 적용된 전기장의 규모는 친화성 매트릭스 내의 목적하는 온도 구배를 생성하도록 선택된다.
일부 실시양태에서, 공간적 온도 구배는 줄 가열을 제공하기 위해 사중극 전기장을 사용하여 생성된다. 일부 이러한 실시양태에서, 4개의 전극을 갖는 2차원 겔이 제공된다. 전압은 겔에서의 전기장이 비-균일하여, 높은 전기장 (및 결과적으로 높은 온도) 및 낮은 전기장의 영역을 함유하도록 4개의 전극에 적용된다. 전기장은 높은 전기장의 영역이 겔의 중심을 향해 음으로 하전된 분자를 밀어내는 경향이 있는 반면, 낮은 전기장의 영역은 이러한 분자를 겔의 중심으로부터 멀리 밀어내는 경향이 있도록 배향된다. 일부 이러한 실시양태에서, 줄 가열을 통해 온도 구배를 제공하는 전기장은 또한 겔에서 분자에 구동력을 적용하는 전기장이다.
이러한 장 패턴의 예는 도 5에 예시된다. 도 5에서 전극 A, B, C 및 D에서 적용된 전압은 각각 -V, 0, 0, 및 0이다. 화살표는 음으로 하전된 분석물 분자의 속도를 나타낸다. 색상 강도는 전기장 강도를 나타낸다. 전극 A 부근의 영역은 높은 전기장 강도를 가지며, 이는 전극 C를 향해 감소한다. 전극 A 부근의 높은 장 영역은 음으로 하전된 분자를 겔의 중심을 향해 밀어내는 경향이 있는 반면, 전극 B, C, 및 D 부근의 보다 낮은 장 영역은 음으로 하전된 분자를 겔의 중심으로부터 멀리 밀어내는 경향이 있다. 전기장이 또한 온도 구배를 제공하는 실시양태에서, 친화성 매트릭스는 줄 가열로 인해 보다 높은 장 강도의 영역에서 더 뜨거워지게 될 것이다. 따라서, 높은 전기장 강도의 영역은 보다 높은 온도 및 따라서 보다 높은 이동성의 영역과 일치할 것이다. 따라서, 전극 A 부근의 높은 전기장 영역에서의 분자는 겔의 중심을 향해 보다 큰 거리를 이동하는 경향이 있을 것인 반면, 전극 B, C, 및 D 부근의 보다 낮은 전기장 영역에서의 분자는 보다 낮은 이동성을 갖고 (보다 낮은 온도에서임), 겔의 중심으로부터 단지 짧은 거리를 떨어져 이동할 것이다.
일부 실시양태에서, 도 5의 전기장 패턴은 도 6에 나타내어진 바와 같이 시간 평균된 전기장이 제로이도록 4개의 전극 주위에서 전압 패턴을 회전시킴으로써 단계적 방식으로 회전된다. 이 회전 장은 음으로 하전되고 온도에 따라 가변하는 이동성을 갖는 임의의 분자에 대한 겔의 중심을 향한 순 이동을 발생시킬 것이다. 일부 실시양태에서, 전기장 패턴은 예를 들어 전압 패턴을 180°, 90°, 180°, 및 90° 순차적으로 이동시킴으로써, 또는 전기장의 방향을 무작위로 스위칭함으로써, 회전 이외의 방식으로 가변한다. 상기 나타내어진 바와 같이, 친화성 매트릭스를 통해 이동하는 분자의 이동성은 전기장 강도가 아니라 온도에 의존한다. 적용된 전기장은 줄 가열을 통해 매트릭스의 온도를 증가시키는 경향이 있을 것이며; 매트릭스에서 임의의 주어진 점에서의 온도 상승의 규모는 전기장의 규모의 제곱에 비례할 것이다.
열 구배가 또한 구동 장을 제공하는 전기장에 의해 생성된 줄 가열에 의해 제공되는 실시양태에서, 열 구배의 진동은 전기장 진동과 동일한 주기를 가질 것이다. 이들 진동은 2차원 겔에서 친화성 SCODA 기반 농축을 유도할 수 있다.
도 6은 그의 이동성이 이러한 실시양태에 따라 온도 또는 전기장에 따라 증가하는 분자의 포커싱을 초래하는 전기장의 단계적 회전을 예시한다. 음으로 하전된 분자에 대한 입자 경로가 나타내어진다. 4 단계 후, 입자는 겔의 중심을 향한 순 변위를 갖는다. 변화하는 온도 또는 전기장에 따라 이동성의 변화를 경험하지 않는 분자는 제로 시간 평균된 전기장에서 제로 순 운동을 경험할 것이다.
포커싱 및 분리의 이론적 예측
일부 실시양태에서, 전기장 및 이어서 친화성 SCODA 겔 내의 줄 가열은 소스 전극에 적용된 전압, 및 겔의 형상 둘 다에 의해 제어된다. 마르지알리(Marziali) 등은 전기영동적 SCODA 농축을 유도하기 위해 겹쳐진 회전 쌍극자 및 사중극 장을 사용하였다. 이들 2개 장의 강도의 비, 즉, 쌍극자 대 사중극 비 (D/Q)는 대략 D/Q=4.5에서 최대를 갖는 SCODA 포커싱의 효율에 대한 영향을 갖지만, 최적은 상대적으로 평평하며, SCODA 힘은 1.75 내지 1013의 값에 대해 상대적으로 일정하게 머문다. D/Q의 한 편리한 선택은 2이다. 이 특정 선택으로, 단지 2개의 독특한 포텐셜은 소스 전극에 적용될 필요가 있으며, 이는 한 전극을 공통 전압 레일에 연결하고, 다른 3개를 접지하고, 이 패턴을 표 1에 나타내어진 바와 같은 4가지 가능한 배치를 통해 단계적 방식으로 회전시킴으로써 달성될 수 있다. 아날로그 증폭기가 사용될 수 있고, 본원에 기재된 실시예에서 사용되었지만, 2의 D/Q 비를 사용하는 것은 별개의 MOSFET 스위치를 사용하는 것을 허용하고, 이는 전력 공급의 요구되는 크기 및 복잡성을 단순화하고 감소시킨다.
표 1 . D/Q=2를 갖는 SCODA 포커싱에 대한 전압 패턴
Figure pct00029
서열 특이적 겔 기하학에 대한 시작점은 전기영동적 SCODA의 초기 입증에 사용된 4-면 겔 기하학이었다. 이 기하학은 2개의 수, 즉, 겔 폭 및 코너 반경에 의해 정의될 수 있다. 본 발명자들은 10 mm의 폭 및 3 mm의 코너 반경을 가진 기하학을 사용함으로써 시작하였다. 이 기하학의 전열적 모델은 겔 내의 전기장 및 온도 프로파일을 추정하고, 그러한 장 및 온도 프로파일이 온도 의존적 이동성을 갖는 표적의 농축을 유도할 수 있는지 여부를 확립하는 콤솔 멀티피직스(COMSOL Multiphysics)® 모델링 소프트웨어 (콤솔, 인크(COMSOL, Inc), 미국 매사추세츠주 벌링턴)에서 실행되었다. 사용된 모델은 열 방정식에 대한 소스 항으로서 옴(Ohm)의 법칙의 해답으로부터 계산된 전력 밀도를 사용하고, 겔에서의 전해질의 온도 의존적 전기 전도도를 결정하기 위해 열 방정식으로부터의 온도 해답을 사용하여 옴의 법칙 및 도메인 내의 열 방정식을 동시에 해결한다.
겔 내의 온도 프로파일의 정확한 추정치를 얻기 위해, 겔의 상부 및 하부로부터 전도된 열이 모델링된다. 경계 조건 및 다른 모델 파라미터는 도 7에 예시된다. 물의 열적 특성 및 0.2 M NaCl의 전기적 특성이 사용되었다. 겔 카세트는 일정한 온도 저장소로서 작용하는 알루미늄 스프레더 플레이트 상에 정치된다. 스프레더 플레이트 내로의 열 유동을 모델링하기 위해, 릴트에 의해 주어진 유리 바닥의 열 전달 계수가 사용되었다. SCODA 사이클의 단일 단계를 위한 이 모델에 의해 해결된 온도 및 전기장 프로파일은 도 8에 나타내어진다. 4개의 전극에 적용된 전압은 -120 V, 0 V, 0 V, 0 V이고, 스프레더 플레이트 온도는 55℃ (328 K)로 설정되었다. 컬러 지도는 겔 온도를 지시하고, 벡터 장은 겔 내의 전기장의 상대 규모 및 방향을 나타낸다. DNA는 음으로 하전되기 때문에, 그의 이동 방향은 전기장의 방향과 반대일 것임을 주목한다.
주어진 분자에 대한 이동성 대 온도의 실험적으로 결정된 값 및 상기 기재된 열 모델을 사용하여, 한 완전한 사이클에 걸쳐 적분된 순간 드리프트 속도의 시간 평균을 취함으로써 그 특정 분자에 대한 겔 중의 모든 곳에서의 SCODA 속도를 결정하는 것이 가능하다:
Figure pct00030
여기서 μ는 온도 의존적 이동성이고, E는 전기장이고, τ는 SCODA 사이클의 주기이다. 온도 및 전기장은 SCODA 사이클에서 4개의 단계에 대해 해결되고, 방정식 [23]에서 이동성 함수와 커플링되었다. 이 방식으로, 겔 중의 모든 곳에서의 SCODA 속도가 계산될 수 있다. 별개의 단계가 사용되고 있기 때문에, 주기가 전기장 및 온도 사이의 위상 지연이 무시될 수 있기에 충분히 길다고 가정되는 경우, 방정식 [33]에서의 적분은 합계가 된다:
Figure pct00031
여기서 속도는 사이클에서의 모든 4개의 단계에 걸쳐 합계된다.
예로서, 도 9는 도 11에 나타내어진 완벽한 매치 표적에 대한 실험적으로 결정된 이동성 대 온도 곡선 (하기 기재된 예) 및 상기 계산된 온도 및 전기장 값을 사용한 SCODA 속도의 벡터 플롯을 나타낸다.
도 9에서 플롯팅된 속도 장은 겔의 기하 중심에서 제로 속도 점을 나타내며, 겔에서의 모든 다른 점에서의 속도는 중심을 향해 가리킨다. 따라서, 표적 분자는 전기장 패턴의 중심에서 겔 내에서 모아질 수 있다.
고정화된 프로브에 대한 결합 친화도의 차이에 기반하여 2개의 유사한 분자를 분리하는데 사용되는 실시양태에서, 세척 힘은 상기 기재된 SCODA 포커싱 장 위에 겹쳐진다. 일부 실시양태에서, 세척 힘은 본원에서 DC 바이어스로 기재된 DC 전기장이다. 고정화된 프로브에 대한 친화도를 갖는 분자에 대해, 상기 기재된 SCODA 포커싱 장에 의해 적용된 SCODA 포커싱 힘은 세척 장에 의해 유발된 분자의 운동을 반대작용하는 경향이 있을 것이며, 즉, SCODA 포커싱 장은 분자에 대한 복원력을 발휘하는 경향이 있을 것이고, 분자는 보다 작은 결합 친화도를 갖는 분자와 비교하여 우선적으로 포커싱될 것이다. 고정화된 프로브에 대한 보다 작은 결합 친화도를 갖는 분자는 친화성 매트릭스를 통해 보다 큰 이동성을 가질 것이고, 복원 SCODA 힘은 보다 약할 것이다. 그 결과, 보다 작은 결합 친화도를 갖는 분자의 포커스 스폿은 이동될 것이다. 일부 경우에, 복원 SCODA 힘은 너무 약하여 보다 작은 결합 친화도를 갖는 이러한 분자는 친화성 매트릭스로부터 함께 세척될 것이다.
친화성 SCODA를 사용하여 다른 유사한 생체분자의 집단으로부터 특이적 생체분자에 대해 풍부화하기 위해, 겹쳐진 DC 바이어스를 갖는 SCODA 포커싱 전기장을 작동시킬 수 있다. DC 바이어스는 고정화된 결합 부위에 대한 보다 낮은 결합 에너지를 갖는 분자가 보다 높은 결합 에너지를 갖는 분자보다 중심을 더 벗어나서 이동하고, 따라서 포커스가 다수의 포커스로 분할되는 것을 유발하도록 하는 방식으로, 포커싱된 분자를 중심을 벗어나서 이동시킬 수 있다. 유사한 결합 에너지를 갖는 분자에 대해, 이 분할은 바이어스 하에서 세척하는 동안 작을 수 있다. DC 바이어스는 포커싱 장 위에 직접적으로 겹쳐질 수 있거나, 또는 DC 장은 포커싱 장과 시간 다중화될 수 있다.
유사한 서열을 갖는 핵산을 분리하는데 사용되는 한 예시적인 실시양태에서, DC 바이어스는 표 1에 나타내어진 전압 패턴 위에 겹쳐져, 표 2에 하기 나타내어진 전압 패턴을 발생시킨다. 일부 실시양태에서, DC 바이어스는 SCODA 포커싱 장과 교대로 적용되며, 즉, SCODA 포커싱 장은 일정 기간 동안 적용되고, 이어서 정지되고, DC 바이어스는 일정 기간 동안 적용되고, 이어서 정지된다.
표 2 . DC 바이어스 하에서 포커싱을 위해 적용된 전압. 10 V DC 바이어스 위에 겹쳐진 120 V SCODA 포커싱 포텐셜에 대한 값이 나타내어진다.
Figure pct00032
적용된 DC 바이어스의 존재 하에서의 완벽한 매치 및 단일 염기 미스매치 표적 둘 다의 생성된 속도 플롯은 각각 도 10A 및 10B에 나타내어진다. 전기장 및 온도는 61℃의 스프레더 플레이트 온도를 사용하여 콤솔을 사용하여 계산되었다. 속도는 방정식 [34] 및 도 11에 나타내어진 실험적으로 얻어진 데이터 핏 (상기 기재된 예)을 사용하여 계산되었다. 완벽한 매치 표적의 제로 속도 위치는 바이어스의 방향 (원 스폿으로 지시됨)에서 중심을 약간 벗어나서 이동되었지만, 미스매치 표적은 겔 내에서 제로 속도 점을 갖지 않는다. 이들 계산은 뉴클레오티드 표적이 단지 한 위치에서 서열에 있어서 상이한 경우에도, 보다 높은 결합 친화도를 갖는 표적을 포획하면서 겔 영역으로부터의 고정화된 프로브로부터 보다 작은 결합 친화도를 갖는 표적을 완전히 세척하여, 특이적 서열의 선택적 정제, 농축 및/또는 검출을 가능하게 하는 것이 가능함을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 유사한 분자 사이의 포커싱 힘의 최대 차이가 있는 SCODA 포커싱을 수행하는데 사용되는 구동 장 및 이동성 변경 장의 최적 조합은 이동성 가변성 장의 함수로서 매질을 통한 샘플 분자의 속도를 측정함으로써 경험적으로 결정된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서 다양한 온도에서의 목적하는 표적 분자 및 비-목적하는 표적 분자의 이동성은 상기 기재된 바와 같이 친화성 매트릭스에서 측정되고, 상대 이동성의 차이가 가장 큰 온도 범위가 친화성 SCODA를 수행하기 위한 온도 범위로서 선택된다. 일부 실시양태에서, 포커싱 힘은 속도가 동요 장에 관하여 변화하는 비율 dv/df (여기서 v는 분자 속도이고, f는 전기장 강도임)에 비례한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 SCODA 포커싱을 최대화하고 포커싱하지 않는 오염물의 신속한 세척을 가능하게 하도록 dv/df를 최대화할 수 있다. 2개의 유사한 분자를 최대로 분리하기 위해, 친화성 SCODA는 dva/df-dvb/df (여기서 va는 분자 a의 속도이고, vb는 분자 b의 속도임)가 최대화되도록 하는 조건 하에서 수행될 수 있다.
일부 실시양태에서, 친화성 매트릭스에 적용된 전기장의 강도는 겔 내의 가장 높은 온도가 분리되는 2개의 분자 사이의 결합 친화도의 차이가 가장 높은 온도에 대략 상응하도록 계산된다.
일부 실시양태에서, 분리되는 2개의 분자 사이의 결합 친화도의 차이가 가장 높은 온도는 표적 분자 및 친화성 작용제의 용융 온도 및 비-표적 분자 및 친화성 작용제의 용융 온도 사이의 차이가 가장 높은 온도에 상응한다. 일부 실시양태에서, 표적 분자 및 친화성 작용제의 용융 온도 및 비-표적 분자 및 친화성 작용제의 용융 온도 사이의 최대 차이는 약 9.3℃ 미만, 일부 실시양태에서 약 7.8℃ 미만, 일부 실시양태에서 약 5.2℃ 미만, 및 일부 실시양태에서 약 0.7℃ 미만이다.
일부 실시양태에서, 친화성 SCODA에 의해 분리될 수 있는 표적 분자 대 비-표적 분자의 비는 1:1 내지 1:10,000의 임의의 비 및 그 사이의 임의의 값, 예를 들어 1:100 또는 1:1,000이다. 일부 실시양태에서, 친화성 SCODA를 수행한 후, 표적 분자의 포커스 스폿에 위치한 표적 분자에 비한 비-표적 분자의 비는 최대 10,000배 감소되었다.
위상 지연 유도된 회전
일부 실시양태에서, 고정화된 친화성 작용제에 대한 상이한 친화도를 갖는 분자를 분리하기 위해, DC 바이어스는 상기 기재된 바와 같이 SCODA 포커싱 장 위에 겹쳐진다. 결합 에너지에서의 분리가 충분히 큰 경우, 미스매칭된 표적은 겔로부터 완전히 세척될 수 있다. 겔로부터 약하게 포커싱하는 오염 단편을 세척하는 능력은 상기 논의된 위상 지연 유도된 회전에 의해 영향을 받을 수 있으며, 여기서 2차원 시스템의 SCODA 속도는
Figure pct00033
에 의해 주어졌다.
여기서 φ는 전기장 진동 및 이동성 가변성 진동 사이의 위상 지연이다. 농도에 기여하는 SCODA 속도의 비율을 감소시키는 것 외에도, 이 결과는 친화성 매트릭스로부터 약하게 포커싱하는 오염물을 세척하는 경우 추가의 영향을 갖는다. 회전 성분은 DC 바이어스에 더해질 것이고, 겔로부터 미스매칭된 표적을 세척하는데 요구되는 시간을 유의하게 증가시킬 수 있는 겔에서의 제로 또는 낮은 속도 점을 발생시킬 수 있다.
전기장 진동 및 이동성 가변성 진동 사이의 위상 지연이 있는 실시양태에서 발생할 수 있는 운동의 회전 성분의 효과를 반대작용하기 위해, SCODA 포커싱 장이 적용되는 방향은 주기적으로 회전될 수 있다. 일부 실시양태에서, SCODA 포커싱 장이 회전되는 방향은 주기마다 1회 변경된다.
광학 피드백
관심의 한 분자 (표적 분자)는 친화성 매트릭스에서 농축되는 반면, 제2의 유사한 분자 (비-표적 분자)는 친화성 매트릭스로부터 세척되는 일부 실시양태에서, 광학 피드백은 언제 세척이 완결되는지를 결정하고/거나 친화성 매트릭스로부터 표적 분자의 주행을 회피하는데 사용될 수 있다.
유사한 분자의 2개의 포커스는 지리적으로 함께 가까울 수 있고, 광학 피드백은 관심의 분자가 겔로부터 세척되지 않는 것을 보장하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 관심의 분자 또는 오염 분자 (또는 둘 다)에 대한 형광 대용물을 사용하여, 바이어스 하에서 포커싱하면서 그들의 각각의 위치를 모니터링하고, 그 지리적 정보를 사용하여 바이어스를 조정하여 관심의 분자가 가능한 한 겔의 연부에 가깝게 밀어내어지지만 제거되지는 않는 반면, 오염 분자는 겔로부터 제거될 수 있음을 보장할 수 있다.
일부 실시양태에서, 분리되는 분자는 예를 들어 상이한 색상의 형광 태그로 차등적으로 표지된다. 형광 검출을 사용한 실시간 모니터링은 언제 비-표적 분자가 친화성 매트릭스로부터 세척되었는지를 결정하거나, 언제 표적 분자 및 비-표적 분자의 포커스가 친화성 매트릭스 내에서 충분히 멀리 떨어지는지를 결정하여 둘 다의 포커스가 친화성 매트릭스로부터 개별적으로 추출되는 것을 허용하는데 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 표적 및/또는 비-표적 분자에 유사하게 포커싱하는 형광 대용물 분자는 광학 피드백을 수행하는데 사용될 수 있다. 표적 분자, 비-표적 분자, 또는 표적 분자 및 비-표적 분자 둘 다에 대한 형광 대용물을 사용함으로써, 세척 바이어스 하에서 친화성 포커싱을 수행하면서 표적 분자 및/또는 비-표적 분자의 각각의 위치가 모니터링될 수 있다. 친화성 매트릭스 내의 대용물 분자의 위치는 세척 바이어스를 조정하여 관심의 분자가 가능한 한 겔의 연부에 가깝게 밀어내어지지만 제거되지는 않는 반면, 오염 분자는 겔로부터 세척될 수 있음을 보장하는데 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 표적 및/또는 비-표적 분자에 유사하게 포커싱하지만 수행될 수 있는 임의의 후속 PCR 반응에서 증폭하지 않을 형광 대용물 분자는 정제되는 샘플에 첨가될 수 있다. 친화성 매트릭스 내의 형광 대용물 분자의 존재는 광학 피드백의 사용이 SCODA 포커싱 조건을 실시간으로 제어하는 것을 가능하게 한다. 형광 검출은 친화성 매트릭스에서 형광 대용물 분자의 위치를 가시화하는데 사용될 수 있다. 형광 대용물이 표적 분자의 포커싱 거동을 모방하는 실시양태에서, 적용된 세척 힘은 형광 대용물이 친화성 매트릭스의 연부에 접근하는 경우 감소되어, 표적 분자를 친화성 매트릭스로부터 세척하는 것을 회피할 수 있다. 형광 대용물이 표적 분자로부터 분리되어야 할 비-표적 분자의 포커싱 거동을 모방하는 실시양태에서, 적용된 세척 힘은 형광 대용물이 친화성 매트릭스로부터 세척된 후, 또는 대안적으로 형광 대용물의 위치가 친화성 매트릭스의 연부에 접근하는 경우 감소되거나 정지될 수 있다.
차등적으로 변형된 분자의 분리
일부 실시양태에서, 프로브에 대한 분자의 결합 친화도를 변경시키는 화학적 변형의 존재 또는 부재를 제외하고는 동일한 분자는 친화성 SCODA를 사용하여 분리된다. 친화성 SCODA의 일부 실시양태는 고정화된 친화성 작용제에 대한 결합 친화도의 단지 작은 차이를 갖는 2개의 분자를 분리하는데 충분히 민감하다. 이러한 분자의 예는 차등적으로 변형된 분자, 예컨대 메틸화된 및 비메틸화된 핵산, 메틸화된 또는 아세틸화된 단백질 등을 포함한다.
예를 들어, 시토신 잔기의 메틸화는 비메틸화된 DNA 서열에 비해 혼성화의 결합 에너지를 증가시킴이 이전에 보여졌다. RNA 서열은 비메틸화된 서열과 비교하여 메틸화되는 경우 혼성화의 결합 에너지의 유사한 증가를 나타낼 것으로 예상될 것이다. 본 발명자들은 친화성 SCODA의 한 실시양태가 단지 단일 메틸화된 시토신 잔기의 존재에 의해 상이한 핵산 서열을 분리하는데 사용될 수 있음을 보였다. 다른 화학적 변형은 핵산 및 그의 상보적 서열의 결합 에너지를 유사한 방식으로 변경시킬 것으로 예상될 것이다. 예컨대 메틸화를 통한 단백질의 변형은 또한 단백질, RNA 또는 DNA 압타머, 항체, 또는 메틸화 부위에서 또는 그 부근에서 단백질에 결합하는 다른 분자와의 관심의 단백질의 결합 친화도를 변경시킬 수 있다. 따라서, 친화성 SCODA의 실시양태는 관심의 차등적으로 변형된 분자를 분리하는데 사용될 수 있다. 본원의 예는 메틸화 풍부화에 관한 것이지만, 친화성 SCODA는 또한 예를 들어 아세틸화를 포함한 다른 화학적 차이를 갖는 분자의 풍부화 및 선택에 적용될 수 있다.
친화성 SCODA, 및 서열-특이적 SCODA는 메틸화된 및 비메틸화된 DNA의 배경으로부터 메틸화된 DNA의 특이적 서열을 풍부화하는데 사용될 수 있다. 친화성 SCODA의 이 적용에서, SCODA 포커싱 힘의 강도는 결합된 올리고뉴클레오티드에 대한 표적 DNA의 결합 에너지와 관련될 수 있다. 보다 높은 결합 에너지를 갖는 표적 분자는 보다 낮은 결합 에너지를 갖는 표적보다 더 강하게 포커싱하도록 만들어질 수 있다. DNA의 메틸화는 표적 DNA의 그의 상보적 서열에 대한 결합 에너지를 약간 증가시키는 것으로 이전에 문서화되었다. 상보적 올리고뉴클레오티드의 결합 에너지의 작은 변화는 메틸화된 DNA에 대해 우선적으로 풍부화하는 친화성 SCODA를 통해 이용될 수 있다. SCODA 작동 조건은 예를 들어 상기 기재된 바와 같이, 메틸화된 DNA는 농축되는 반면, 동일한 서열의 비메틸화된 DNA는 겔로부터 세척되도록 선택될 수 있다.
일부 실시양태는 표적 분자의 열 여기 에너지인 kT 미만의 고정화된 친화성 작용제에 대한 결합 에너지의 차이를 갖는 분자를 분리할 수 있다. 일부 실시양태는 0.19 kcal/mol 미만의 고정화된 친화성 작용제에 대한 결합 에너지의 차이를 갖는 분자를 분리할 수 있다. 일부 실시양태는 2.6 kcal/mol 미만의 고정화된 친화성 작용제에 대한 결합 에너지의 차이를 갖는 분자를 분리할 수 있다. 일부 실시양태는 3.8 kcal/mol 미만의 고정화된 친화성 작용제에 대한 결합 에너지의 차이를 갖는 분자를 분리할 수 있다. 일부 실시양태는 단지 메틸 기의 존재에 의해 상이한 분자를 분리할 수 있다. 일부 실시양태는 단지 1개의 염기에서 서열에 있어서 상이한 핵산 서열을 분리할 수 있다.
친화성 SCODA의 적용
상기 기재된 바와 같은 차등적으로 변형된 분자를 분리하고/거나, 정제하고/거나, 농축시키고/거나, 검출하기 위한 시스템 및 방법은 바이오마커, 특이적 뉴클레오티드 서열 또는 차등적으로 변형된 분자의 검출이 중요한 분야, 예를 들어 후성유전학, 태아 DNA 검출, 병원체 검출, 암 스크리닝 및 모니터링, 기관 부전의 검출, 다양한 질환 상태의 검출 등에 적용될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서 친화성 SCODA는 모체 체액을 이용하는 태아 진단 시험, 체액에서의 병원체 검출, 및 암, 기관 부전, 또는 다른 질환 상태를 검출하기 위한 및 이러한 상태의 진행 또는 치료를 모니터링하기 위한 체액에서의 바이오마커 검출과 같은 분야에서 차등적으로 메틸화된 DNA를 분리하고/거나, 정제하고/거나, 농축시키고/거나, 검출하는데 사용된다.
일부 실시양태에서, 체액의 샘플 또는 조직 샘플은 대상체로부터 얻어진다. 세포는 용해될 수 있고, 게놈 DNA는 전단되고, 샘플은 친화성 SCODA로 처리된다. 일부 실시양태에서, 친화성 SCODA를 사용하여 농축된 분자는 특정 바이오마커 또는 뉴클레오티드 서열의 존재에 대해 검정하기 위해 추가의 분석, 예를 들어 DNA 서열분석, 디지털 PCR, 형광 검출 등으로 처리된다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다.
태아 DNA는 모체 혈장에 존재하고, 모체 혈장으로부터 얻어진 모체 대 태아 DNA의 차등적 메틸화는 유전적 장애에 대해 스크리닝하는데 사용될 수 있는 것으로 공지되어 있다 (예를 들어 문헌 [Poon et al., 2002, Clinical Chemistry 48:1, 35-41] 참조). 그러나, 극복하기 어려운 한 가지 문제는 태아 및 모체 DNA 사이의 식별이다. 상기 기재된 바와 같은 친화성 SCODA는 태아 DNA 대 모체 DNA에서 차등적으로 메틸화된 DNA를 우선적으로 분리하고/거나, 정제하고/거나, 농축시키고/거나, 검출하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 친화성 SCODA는 태아 DNA에서는 메틸화되지만 모체 DNA에서는 그렇지 않은, 또는 모체 DNA에서는 메틸화되지만 태아 DNA에서는 그렇지 않은 DNA를 농축시키거나 검출하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 모체 혈장의 샘플은 대상체로부터 얻어지고, 관심의 서열에 대해 지정된 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여 친화성 SCODA로 처리된다. SCODA 포커싱 장의 적용 후의 2개의 포커스의 검출은 대상체 및 태아 사이에서와 같이 차등적으로 메틸화된 DNA의 존재를 지시할 수 있다. 특정 유전적 장애를 나타내는 대상체로부터의 참조 샘플과의 비교는 태아가 유전적 장애를 가질 위험이 있을 수 있는지를 결정하는데 사용될 수 있다. 통상적인 방법, 예컨대 PCR, DNA 서열분석, 디지털 PCR, 형광 검출 등을 통한 차등적 변형 SCODA를 통해 얻어진 DNA의 샘플의 추가의 분석은 태아가 유전적 장애를 가질 수 있는 위험을 평가하는데 사용될 수 있다.
본 시스템 및 방법의 한 실시양태는 염색체 카피 수 이상을 포함한 태아 DNA에서의 이상을 검출하는데 사용된다. 모체 DNA와 반대로 태아 DNA에서 차등적으로 메틸화되는 것으로 공지된 상이한 염색체의 영역은 모체 혈장 샘플에서의 태아 DNA의 차등적 메틸화에 기반하여 모체 DNA로부터 태아 DNA를 분리하는 친화성 SCODA를 사용하여 농축된다. 분리된 태아 DNA의 추가의 분석은 각각의 염색체로부터의 카피의 수를 카운팅하고 카피 수 이상을 결정하기 위해 수행된다 (예를 들어 qPCR, DNA 서열분석, 형광 검출, 또는 다른 적합한 방법을 사용하여).
대부분의 암은 유전적 변화 및 후성적 변화, 예컨대 DNA 메틸화의 변화 (예를 들어 특정 영역의 저메틸화 및/또는 과메틸화, 예를 들어 문헌 [Ehrich, 2002, Oncogene 21:35, 5400-5413] 참조)의 조합의 결과이다. 친화성 SCODA는 관심의 DNA 서열을 분리하고/거나, 정제하고/거나, 농축시키고/거나, 검출하여 비정상적으로 메틸화된 종양유전자에 대해 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 친화성 SCODA의 실시양태는 건강한 세포에서보다 암성 또는 전-암성 세포에서 상이한 메틸화 패턴을 갖는 DNA를 수반하는 바이오마커의 검출에 사용된다. 이러한 바이오마커의 검출은 초기 암 스크리닝, 및 암 발달 또는 치료 진행의 모니터링 둘 다에 유용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체로부터 얻어진 샘플, 예를 들어 체액, 예컨대 혈장 또는 생검의 샘플은 프로세싱되고, 관심의 서열에 대해 지정된 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용한 차등적 변형 SCODA에 의해 분석될 수 있다. SCODA 장의 적용 동안 2개의 포커스의 존재는 관심의 DNA 서열에서 차등적 메틸화의 존재를 지시할 수 있다. 대상체로부터 얻어진 샘플과 참조 샘플 (예를 들어 건강한 환자로부터의 샘플 및/또는 암성 또는 전-암성 조직으로부터 기원한 것으로 공지된 샘플)의 비교는 대상체의 세포가 암성 또는 전-암성일 위험이 있는지 여부를 지시할 수 있다. 통상적인 방법, 예컨대 PCR, DNA 서열분석, 디지털 PCR, 형광 검출 등을 통한 차등적 변형 SCODA를 통해 얻어진 DNA의 샘플의 추가의 분석은 샘플이 암성 또는 전-암성일 수 있는 세포를 포함할 위험을 평가하거나, 암의 진행을 평가하거나, 치료의 유효성을 평가하는데 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 특이적 뉴클레오티드 서열은 메틸화와 무관하게 (즉, 핵산의 특정 메틸화 상태에 대해 선택하지 않고) 겔에서 포획된다. 비목적하는 뉴클레오티드 서열 및/또는 다른 오염물은 겔로부터 세척될 수 있는 반면, 특이적 뉴클레오티드 서열은 분리 매질 내에 고정화된 올리고뉴클레오티드 프로브에 의해 결합되어 잔류한다. 이어서, 차등적 메틸화 SCODA는 완충제 챔버 또는 또 다른 겔을 향해 비메틸화된 서열을 전기적으로 세척하면서 (여기서 그것은 이어서 회수될 수 있음) 서열의 메틸화된 버전을 포커싱하는데 사용된다. 일부 실시양태에서, 비메틸화된 서열은 우선적으로 추출될 수 있다.
일부 실시양태에서, 질환 상태 또는 감염과 관련된 혈액 중의 생체분자는 친화성 SCODA를 사용하여 선택적으로 농축된다. 일부 실시양태에서, 생체분자는 이들을 질환 상태 또는 감염의 유용한 바이오마커로 만드는 서열 또는 화학적 차이를 갖는 고유한 핵산이다. 이러한 농축 후, 바이오마커는 PCR, 서열분석, 또는 유사한 수단을 사용하여 검출될 수 있다. 일부 실시양태에서, 체액 또는 조직의 샘플은 대상체로부터 얻어지고, 세포는 용해되고, 게놈 DNA는 전단되고, 친화성 SCODA는 관심의 서열에 상보적인 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여 수행된다. 친화성 SCODA는 관심의 핵산 서열의 차등적으로 메틸화된 집단의 존재를 검출하는데 사용된다. 관심의 표적 서열의 차등적으로 메틸화된 집단의 존재는 대상체가 특정 질환 상태 또는 감염을 앓고 있을 가능성을 지시할 수 있다.
일부 실시양태에서, 대상체로부터 친화성 SCODA에 의해 생성된 표적 핵산의 포커싱 패턴은 1개 이상의 참조 샘플 (예를 들어 건강한 대상체로부터 얻어진 등가의 샘플, 및/또는 특정 질환을 앓고 있는 것으로 공지된 대상체로부터 얻어진 등가의 샘플)로부터 친화성 SCODA에 의해 생성된 표적 핵산의 포커싱 패턴과 비교된다. 대상체로부터 얻어진 샘플 및 특정 질환을 앓고 있는 것으로 공지된 대상체로부터 얻어진 참조 샘플에 의해 생성된 포커싱 패턴 사이의 유사성은 대상체가 동일한 질환을 앓고 있을 가능성을 지시한다. 대상체로부터 얻어진 샘플 및 건강한 대상체로부터 얻어진 참조 샘플로부터 생성된 포커싱 패턴 사이의 차이는 대상체가 질환을 앓고 있을 수 있을 가능성을 지시한다. 대상체로부터 얻어진 샘플 및 건강한 대상체로부터 얻어진 참조 샘플로부터 생성된 포커싱 패턴의 차이는 건강한 대상체와 비교하여 대상체에서의 차등적 변형 또는 돌연변이의 존재를 지시할 수 있다.
다수의 표적 분자를 포획하기 위한 다수의 친화성 작용제의 사용
일부 실시양태에서, 친화성 SCODA는 샘플 당 1개 초과의 서열을 분리하고/거나, 정제하고/거나, 농축시키고/거나, 검출하는데 사용된다. 본원에 기재된 예는 1 μM만큼 낮은 프로브 농도에서, 뿐만 아니라 100 μM만큼 높은 프로브 농도로 표적 DNA를 농축시키는 것이 가능함을 입증한다. 일부 실시양태에서, 다중화된 농축은 매질에서 복수의 상이한 친화성 작용제를 고정화하여 친화성 매트릭스를 제공함으로써 수행된다. 일부 실시양태에서, 적어도 2개의 상이한 친화성 작용제는 적어도 2개의 상이한 표적 분자를 분리하고/거나, 정제하고/거나, 농축시키고/거나, 검출하기 위해 매질 내에 고정화된다. 일부 실시양태에서, 친화성 작용제의 각각의 것은 상이한 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 프로브이다. 일부 실시양태에서, 2 내지 100개 정도의 상이한 올리고뉴클레오티드 프로브는 매질 내에 고정화되어 친화성 매트릭스를 제공하고, 2 내지 100개 정도의 상이한 표적 분자는 단일 친화성 겔에서 동시에 분리되고/거나, 정제되고/거나, 농축되고/거나, 검출된다. 표적 분자의 각각의 것은 검출을 용이하게 하기 위해 상이한 태그로 표지될 수 있으며, 예를 들어, 표적 분자의 각각의 것은 형광 태그의 상이한 색상으로 표지될 수 있다.
2개 이상의 친화성 작용제 및 2개 이상의 표적 분자의 각각 사이의 결합 에너지가 상이한 일부 실시양태에서, 2개 이상의 표적 분자는 적절한 온도에서 SCODA 포커싱 장의 적용에 의해 친화성 매트릭스 내에서 차등적으로 분리될 수 있다. 일부 실시양태에서, 그의 상응하는 친화성 작용제에 대한 보다 낮은 용융 온도를 갖는 제1 표적 분자는 그의 상응하는 친화성 작용제에 대한 상대적으로 보다 높은 용융 온도를 갖는 제2 표적 분자로부터 우선적으로 분리될 수 있다. 일부 이러한 실시양태에서, 제1 분자는 그의 상응하는 친화성 작용제에 대한 상대적으로 보다 높은 용융 온도를 갖는 제2 표적 분자가 효율적으로 포커싱하지 않는 충분히 낮은 (즉, 친화성 매트릭스 내의 제2 표적 분자의 이동성이 상대적으로 낮은 온도), 그러나 제1 분자의 효율적인 포커싱을 가능하게 하는 충분히 높은 온도에서 SCODA 포커싱을 수행함으로써 우선적으로 농축된다. 일부 이러한 실시양태에서, 제1 및 제2 분자는 제2 표적 분자가 대체되지 않거나 세척 바이어스에 의해 단지 천천히 대체되는 충분히 낮은, 그러나 제1 표적 분자가 대체되거나 세척 바이어스에 의해 보다 높은 속도에서 대체되는 충분히 높은 온도에서, 세척 바이어스, 예를 들어 DC 바이어스의 적용을 통해 차등적으로 분리된다.
친화성 SCODA를 수행하기 위한 기구
일부 실시양태에서, 친화성 SCODA는 친화성 매트릭스를 함유하기 위한 영역, 완충제 저장소, 목적하는 효과, SCODA 매질 (일부 실시양태에서 겔임)의 정확한 온도 제어를 유발하는데 충분히 큰 전압 및 전류를 전달할 수 있는 전력 공급기, 및 SCODA 매질에서 2개의 상이한 분자의 모니터링을 위한 2 색상 형광 화상화 시스템을 포함하는 전기영동 기구 상에서 수행된다.
샘플 제조 프로세스
일부 측면에서, 본 개시내용은 예를 들어, 검출 및/또는 분석을 위한 샘플을 제조하는 프로세스를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 프로세스는 샘플에서 1개 이상의 표적 분자의 신원 또는 서열 (예를 들어, 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열)을 포함한 샘플의 특성 또는 특징을 확인하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로세스는 1개 이상의 샘플 변환 단계, 예컨대 샘플 용해, 샘플 정제, 샘플 단편화, 단편화된 샘플의 정제, 라이브러리 제조 (예를 들어, 핵산 라이브러리 제조), 라이브러리 제제의 정제, 샘플 풍부화 (예를 들어, 친화성 SCODA를 사용하여), 및/또는 표적 분자의 검출/분석을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 샘플은 정제된 샘플, 세포 용해물, 단일-세포, 세포의 집단, 또는 조직일 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플은 임의의 생물학적 샘플이다. 일부 실시양태에서, 샘플 (예를 들어, 생물학적 샘플)은 혈액, 타액, 가래, 대변, 소변 또는 협측 스왑 샘플이다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 인간, 비-인간 영장류, 설치류, 개, 고양이, 말, 또는 임의의 다른 포유동물로부터의 것이다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 박테리아 세포 배양물 (예를 들어, 이. 콜라이(E. coli) 박테리아 세포 배양물)로부터의 것이다. 박테리아 세포 배양물은 그람 양성 박테리아 세포 및/또는 그람 음성 박테리아 세포를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플은 메타게놈 샘플 또는 환경적 샘플로부터 사용자-개발된 방법을 통해 이전에 추출된 핵산 또는 단백질의 정제된 샘플이다. 혈액 샘플은 대상체 (예를 들어, 인간 대상체)로부터 신선하게 채혈된 혈액 샘플 또는 건조된 혈액 샘플 (예를 들어, 고체 매질 (예를 들어, 구트리에(Guthrie) 카드) 상에 보존됨)일 수 있다. 혈액 샘플은 전혈, 혈청, 혈장, 적혈구, 및/또는 백혈구를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 샘플 (예를 들어, 세포 또는 조직을 포함하는 샘플)은 본 개시내용에 따른 프로세스에서 용해될 (예를 들어, 파괴될, 분해될 및/또는 다르게는 소화될) 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 또는 조직을 포함하는 샘플은 상기 세포 또는 조직으로부터 표적 분자 (예를 들어, 표적 핵산 또는 표적 단백질)를 방출시키는 공지된 물리적 또는 화학적 방법론 중 어느 하나를 사용하여 용해된다. 일부 실시양태에서, 샘플은 전해적 방법, 효소적 방법, 세정제-기반 방법, 및/또는 기계적 균질화를 사용하여 용해될 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플 (예를 들어, 복합체 조직, 그람 양성 또는 그람 음성 박테리아)은 연속적으로 수행되는 다중 용해 방법을 요구할 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플이 세포 또는 조직을 포함하지 않는 경우 (예를 들어, 정제된 핵산을 포함하는 샘플), 용해 단계는 생략될 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플의 용해는 표적 핵산(들)을 단리하기 위해 수행된다. 일부 실시양태에서, 샘플의 용해는 표적 단백질(들)을 단리하기 위해 수행된다. 일부 실시양태에서, 용해 방법은 샘플을 분쇄하는 분쇄기의 사용, 초음파처리, 표면 음파 (SAW), 동결-해동 사이클, 가열, 세정제의 첨가, 단백질 변성제 (예를 들어, 효소, 예컨대 히드롤라제 또는 프로테아제)의 첨가, 및/또는 세포벽 소화 효소 (예를 들어, 리소자임 또는 지몰라제)의 첨가를 추가로 포함한다. 용해를 위한 예시적인 세정제 (예를 들어, 비-이온성 세정제)는 폴리옥시에틸렌 지방 알콜 에테르, 폴리옥시에틸렌 알킬페닐 에테르, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체, 폴리소르베이트 및 알킬페놀 에톡실레이트, 바람직하게는 노닐페놀 에톡실레이트, 알킬글루코시드 및/또는 폴리옥시에틸렌 알킬 페닐 에테르를 포함한다. 일부 실시양태에서, 용해 방법은 샘플을 목적하는 온도 (예를 들어, 적어도 60℃, 적어도 70℃, 적어도 80℃, 적어도 90℃, 또는 적어도 95℃)에서 적어도 1 내지 30분, 1 내지 25분, 5 내지 25분, 5 내지 20분, 10 내지 30분, 5 내지 10분, 10 내지 20분, 또는 적어도 5분 동안 가열하는 것을 수반한다.
일부 실시양태에서, 샘플 (예를 들어, 표적 핵산 또는 표적 단백질을 포함하는 샘플)은 본 개시내용에 따른 프로세스에서 예를 들어, 용해 후에 정제될 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플은 크로마토그래피 (예를 들어, 샘플에 선택적으로 결합하는 친화성 크로마토그래피) 또는 전기영동을 사용하여 정제될 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플은 침전제의 존재 하에서 정제될 수 있다. 일부 실시양태에서, 정제 단계 또는 방법 후, 샘플은 용리 완충제를 사용하여 정제 매트릭스 (예를 들어, 친화성 크로마토그래피 매트릭스)로부터 세척되고/거나 방출될 수 있다. 일부 실시양태에서, 정제 단계 또는 방법은 가역적으로 스위칭가능한 중합체, 예컨대 전기활성 중합체의 사용을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플은 다공성 매트릭스 (예를 들어, 셀룰로스 아세테이트, 아가로스, 아크릴아미드)를 통한 샘플의 전기영동적 통과에 의해 정제될 수 있다.
일부 실시양태에서, 샘플 (예를 들어, 표적 핵산 또는 표적 단백질을 포함하는 샘플)은 본 개시내용에 따른 프로세스에서 단편화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산 샘플은 단편화되어 서열 특이적 확인을 위한 작은 (<1 킬로베이스) 단편 내지 긴 판독물 서열분석 적용을 위한 큰 (최대 10+ 킬로베이스) 단편을 생성할 수 있다. 핵산 또는 단백질의 단편화는 일부 실시양태에서, 기계적 (예를 들어, 유체 전단), 화학적 (예를 들어, 철 (Fe+) 절단) 및/또는 효소적 (예를 들어, 제한 효소, 트랜스포사제를 사용한 태그부착) 방법을 사용하여 달성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 단백질 샘플은 단편화되어 임의의 길이의 펩티드 단편을 생성할 수 있다. 단백질의 단편화는 일부 실시양태에서, 화학적 및/또는 효소적 (예를 들어, 단백질분해 효소, 예컨대 트립신) 방법을 사용하여 달성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 평균 단편 길이는 반응 시간, 온도, 및 샘플 및/또는 효소 (예를 들어, 제한 효소, 트랜스포사제)의 농도에 의해 제어될 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산은 핵산이 형광 분자 (예를 들어, 형광단)로 동시에 단편화되고 표지되도록 태그부착에 의해 단편화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 단편화된 샘플은 작은 및/또는 비목적하는 단편 뿐만 아니라 단편화 단계 동안 사용된 잔류의 탑재물, 화학물질 및/또는 효소 (예를 들어, 트랜스포사제)를 제거하기 위해 정제 (예를 들어, 크로마토그래피 또는 전기영동)의 라운드로 처리될 수 있다. 예를 들어, 단편화된 샘플 (예를 들어, 핵산을 포함하는 샘플)은 효소 (예를 들어, 트랜스포사제)로부터 정제될 수 있고, 여기서 정제는 효소를 변성시키는 것 (예를 들어, 열, 화학적 (예를 들어 SDS), 및 효소적 (예를 들어 프로테이나제 K) 프로세스의 조합에 의해)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 표적 핵산을 포함하는 샘플은 본 개시내용에 따른 프로세스에서 후속 분석 (예를 들어, 게놈 서열분석)을 위한 핵산 라이브러리를 생성하는데 사용될 수 있다. 핵산 라이브러리는 선형 라이브러리 또는 원형 라이브러리일 수 있다. 일부 실시양태에서, 원형 라이브러리의 핵산은 하류 선형화를 허용하는 요소 (예를 들어, 엔도뉴클레아제 제한 부위, 우라실의 혼입)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산 라이브러리는 정제될 수 있다 (예를 들어, 크로마토그래피, 예를 들어, 친화성 크로마토그래피), 또는 전기영동을 사용하여.
일부 실시양태에서, 핵산 (예를 들어, 선형 핵산)의 라이브러리는 효소 (예를 들어, Taq DNA 리가제, 엔도뉴클레아제 IV, Bst DNA 폴리머라제, Fpg, 우라실-DNA 글리코실라제, T4 엔도뉴클레아제 V 및/또는 엔도뉴클레아제 VIII)의 조합이 핵산의 3' 단부를 연장하여, 5' 탑재물에 대한 상보체를 생성하고, 핵산에서 임의의 무염기 부위 또는 닉을 복구하는 프로세스인 단부-복구를 사용하여 제조된다. 일부 실시양태에서, 선형 핵산의 라이브러리는 폴리머라제 복합체의 형성 전에 고유한 서열분석 프라이머를 개별적 핵산 단편 프라이머에 어닐링할 필요를 제거할 수 있는 프로세스인 자기-프라이밍 헤어핀 어댑터를 사용하여 제조된다. 단부-복구 후, 핵산 (예를 들어, 선형 핵산)의 라이브러리는 크기-선택적 매트릭스 (예를 들어, 아가로스 겔)를 통한 핵산의 통과를 사용하여, 신선한 완충제 내로의 후속 용리를 갖는 고상 흡착을 사용하여 정제될 수 있다. 크기-선택적 매트릭스는 표적 핵산의 크기보다 더 작은 핵산 단편을 제거하는데 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 샘플 (예를 들어, 표적 핵산 또는 표적 단백질을 포함하는 샘플)은 본 개시내용에 따른 프로세스에서 표적 분자에 대해 풍부화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플은 전기영동적 방법을 사용하여 표적 분자에 대해 풍부화된다. 일부 실시양태에서, 샘플은 친화성 SCODA를 사용하여 표적 분자에 대해 풍부화된다. 일부 실시양태에서, 샘플은 장 역전 겔 전기영동 (FIGE)을 사용하여 표적 분자에 대해 풍부화된다. 일부 실시양태에서, 샘플은 펄스화된 장 겔 전기영동 (PFGE)을 사용하여 표적 분자에 대해 풍부화된다. 일부 실시양태에서, 풍부화 동안 사용되는 매트릭스 (예를 들어, 다공성 매질, 전기영동적 중합체 겔)는 샘플에 존재하는 표적 분자에 결합하는 고정화된 친화성 작용제 (또한 '고정화된 포획 프로브'로 공지됨)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 풍부화 동안 사용되는 매트릭스는 1, 2, 3, 4, 5개, 또는 그 초과의 고유한 고정화된 포획 프로브를 포함하며, 이의 각각은 고유한 표적 분자에 결합하고/거나, 상이한 결합 친화도를 갖는 동일한 표적 분자에 결합한다.
일부 실시양태에서, 고정화된 포획 프로브는 표적 핵산에 혼성화하는 올리고뉴클레오티드 포획 프로브이다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 포획 프로브는 표적 핵산에 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 95%, 또는 100% 상보적이다. 일부 실시양태에서, 단일 올리고뉴클레오티드 포획 프로브는 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 95%, 또는 99% 서열 동일성을 공유하는 복수의 관련된 표적 핵산 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50개, 또는 그 초과의 관련된 표적 핵산)을 풍부화하는데 사용될 수 있다. 복수의 관련된 표적 핵산의 풍부화는 메타게놈 라이브러리의 생성을 허용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 포획 프로브는 관련된 표적 핵산의 차등적 풍부화를 가능하게 할 수 있다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 포획 프로브는 그의 변형 상태 (예를 들어, 단일 뉴클레오티드 다형성, 메틸화 상태, 아세틸화 상태)에 있어서 상이한 동일한 서열의 핵산에 비해 표적 핵산의 풍부화를 가능하게 할 수 있다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 포획 프로브는 관심의 특이적 유전자 (예를 들어, HLA)에 대한 인간 게놈 DNA를 풍부화하는데 사용된다. 관심의 특이적 유전자는 특이적 질환 상태 또는 장애와 관련된 유전자일 수 있다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 포획 프로브는 메타게놈 샘플의 핵산(들)을 풍부화하는데 사용된다.
일부 실시양태에서, 0.5 내지 2 킬로베이스의 길이를 갖는 핵산 표적 분자를 풍부화하는 목적을 위해, 올리고뉴클레오티드 포획 프로브는 5' 아크리다이트 모이어티를 사용하여 아크릴아미드 매트릭스에 공유 고정화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 보다 큰 핵산 표적 분자 (예를 들어, >2 킬로베이스의 길이를 가짐)를 풍부화하는 목적을 위해, 올리고뉴클레오티드 포획 프로브는 아가로스 매트릭스에 고정화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 포획 프로브는 티올-에폭시드 화학을 사용하여 (예를 들어, 가교된 아가로스 비드에의 공유 부착된 티올-변형된 올리고뉴클레오티드에 의해) 아가로스 매트릭스에 고정화될 수 있다. 아가로스 비드에 연결된 올리고뉴클레오티드 포획 프로브는 표준 아가로스 매트릭스 내에서 조합되고 고형화될 수 있다 (예를 들어, 동일한 아가로스 백분율로).
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법을 사용한 핵산의 풍부화 (예를 들어, SCODA를 사용한 풍부화)는 약 0.5 킬로베이스 (kb), 약 1 kb, 약 1.5 kb, 약 2 kb, 약 3 kb, 약 4 kb, 약 5 kb, 약 6 kb, 약 7 kb, 약 8 kb, 약 9 kb, 약 10 kb, 약 12 kb, 약 15 kb, 약 20 kb, 또는 그 초과의 길이를 포함하는 핵산 표적 분자를 생산한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법을 사용한 핵산의 풍부화 (예를 들어, SCODA를 사용한 풍부화)는 약 0.5 내지 2 kb, 0.5 내지 5 kb, 1 내지 2 kb, 1 내지 3 kb, 1 내지 4 kb, 1 내지 5 kb, 1 내지 10 kb, 2 내지 10 kb, 2 내지 5 kb, 5 내지 10 kb, 5 내지 15 kb, 5 내지 20 kb, 5 내지 25 kb, 10 내지 15 kb, 10 내지 20 kb, 또는 10 내지 25 kb의 길이를 포함하는 핵산 표적 분자를 생산한다.
일부 실시양태에서, 고정화된 포획 프로브는 표적 단백질 또는 펩티드 단편에 결합하는 단백질 포획 프로브 (예를 들어, 압타머 또는 항체)이다. 일부 실시양태에서, 단백질 포획 프로브는 10-9 내지 10-8 M, 10-8 내지 10-7 M, 10-7 내지 10-6 M, 10-6 내지 10-5 M, 10-5 내지 10-4 M, 10-4 내지 10-3 M, 또는 10-3 내지 10-2 M의 결합 친화도로 표적 단백질 또는 펩티드 단편에 결합한다. 일부 실시양태에서, 결합 친화도는 피코몰 내지 나노몰 범위 (예를 들어, 약 10-12 내지 약 10-9 M)이다. 일부 실시양태에서, 결합 친화도는 나노몰 내지 마이크로몰 범위 (예를 들어, 약 10-9 내지 약 10-6 M)이다. 일부 실시양태에서, 결합 친화도는 마이크로몰 내지 밀리몰 범위 (예를 들어, 약 10-6 내지 약 10-3 M)이다. 일부 실시양태에서, 결합 친화도는 피코몰 내지 마이크로몰 범위 (예를 들어, 약 10-12 내지 약 10-6 M)이다. 일부 실시양태에서, 결합 친화도는 나노몰 내지 밀리몰 범위 (예를 들어, 약 10-9 내지 약 10-3 M)이다. 일부 실시양태에서, 단일 단백질 포획 프로브는 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 95%, 또는 99% 서열 동일성을 공유하는 복수의 관련된 표적 단백질을 풍부화하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 단일 단백질 포획 프로브는 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 95%, 또는 99% 서열 상동성을 공유하는 복수의 관련된 표적 단백질 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50개, 또는 그 초과의 관련된 표적 단백질)을 풍부화하는데 사용될 수 있다. 복수의 관련된 표적 단백질의 풍부화는 메타프로테오믹스 라이브러리의 생성을 허용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단백질 포획 프로브는 관련된 표적 단백질의 차등적 풍부화를 가능하게 할 수 있다.
일부 실시양태에서, 다수의 포획 프로브 (예를 들어, 예를 들어 감염성 작용제, 예컨대 아데노바이러스, 스타필로코쿠스, 뉴모니아, 또는 투베르쿨로시스의 결정적 표적 분자에 결합하는 다수의 포획 프로브 유형의 집단)는 풍부화 매트릭스에서 고정화될 수 있다. 다수의 결정적 포획 프로브로의 풍부화 매트릭스에의 샘플의 적용은 질환 또는 상태 (예를 들어, 감염성 작용제의 존재)의 진단을 발생시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 표적 분자 또는 관련된 표적 분자는 본 개시내용에 따른 프로세스에서 비-표적 분자의 제거 후에 풍부화 매트릭스로부터 방출될 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 분자는 풍부화 매트릭스의 온도를 증가시킴으로써 풍부화 매트릭스로부터 방출될 수 있다. 매트릭스의 온도를 조정하는 것은 이동 속도에 추가로 영향을 미치는데, 이는 증가된 온도가 표적 분자 및 포획 프로브 사이의 보다 큰 결합 친화도를 요구하는 보다 높은 포획 프로브 엄격성을 제공하기 때문이다. 일부 실시양태에서, 관련된 표적 분자를 풍부화하는 경우, 매트릭스 온도는 계속-증가하는 상동성의 단계에서 표적 분자를 방출시키고 단리하기 위해 단계적 방식으로 점진적으로 증가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 온도는 각각의 단계에서 또는 일정 기간 (예를 들어, 1 내지 10분, 1 내지 5분, 또는 4 내지 8분)에 걸쳐 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 또는 그 초과 증가된다. 일부 실시양태에서, 온도는 각각의 단계에서 또는 일정 기간 (예를 들어, 1 내지 10분, 1 내지 5분, 또는 4 내지 8분)에 걸쳐 5% 내지 10%, 5 내지 15%, 5% 내지 20%, 5% 내지 25%, 5% 내지 30%, 5% 내지 40%, 5% 내지 50%, 10% 내지 25%, 20% 내지 30%, 30% 내지 40%, 35% 내지 50%, 또는 40% 내지 70% 증가된다. 일부 실시양태에서, 온도는 각각의 단계에서 또는 일정 기간 (예를 들어, 1 내지 10분, 1 내지 5분, 또는 4 내지 8분)에 걸쳐 약 1 ℃, 2 ℃, 3 ℃, 4 ℃, 5 ℃, 6 ℃, 7℃, 8 ℃, 9 ℃, 또는 10 ℃ 증가된다. 일부 실시양태에서, 온도는 각각의 단계에서 또는 일정 기간 (예를 들어, 1 내지 10분, 1 내지 5분, 또는 4 내지 8분)에 걸쳐 1 내지 10 ℃, 1 내지 5 ℃, 2 내지 5 ℃, 2 내지 10 ℃, 3 내지 8 ℃, 4 내지 9 ℃, 또는 5 내지 10 ℃ 증가된다. 이는 초기 참조 표적 분자에 관하여 점점 멀어지는 표적 단백질 또는 표적 핵산의 서열분석을 허용하여, 신규한 단백질 (예를 들어, 효소) 또는 기능 (예를 들어, 효소적 기능 또는 유전자 기능)의 발견을 가능하게 할 수 있다. 일부 실시양태에서, 다수의 포획 프로브 (예를 들어, 다수의 결정적 포획 프로브)를 사용하는 경우, 매트릭스 온도는 단계적 또는 구배 방식으로 증가되어, 상이한 표적 분자의 온도-의존적 방출을 허용하고, 대조군 및 표적 분자의 존재 또는 부재를 나타내는 일련의 바코드화된 방출 밴드의 생성을 발생시킬 수 있다.
샘플 (예를 들어, 표적 핵산 또는 표적 단백질을 포함하는 샘플)의 풍부화는 샘플의 총 부피의 감소를 허용한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 샘플의 총 부피는 풍부화 후 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 또는 적어도 120% 감소된다. 일부 실시양태에서, 샘플의 총 부피는 풍부화 후 1 내지 20 mL 초기 부피로부터 100 내지 1000 μL 최종 부피로, 1 내지 5 mL 초기 부피로부터 100 내지 1000 μL 최종 부피로, 100 내지 1000 μL 초기 부피로부터 25 내지 100 μL 최종 부피로, 100 내지 500 μL 초기 부피로부터 10 내지 100 μL 최종 부피로, 또는 50 내지 200 μL 초기 부피로부터 1 내지 25 μL 최종 부피로 감소된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 풍부화 후 샘플의 최종 부피는 10 내지 100 μL, 10 내지 50 μL, 10 내지 25 μL, 20 내지 100 μL, 20 내지 50 μL, 25 내지 100 μL, 25 내지 250 μL, 25 내지 1000 μL, 100 내지 1000 μL, 100 내지 500 μL, 100 내지 250 μL, 200 내지 1000 μL, 200 내지 500 μL, 200 내지 750 μL, 500 내지 1000 μL, 500 내지 1500 μL, 500 내지 750 μL, 1 내지 5 mL, 1 내지 10 mL, 1 내지 2 mL, 1 내지 3 mL, 또는 1 내지 4 mL이다.
일부 실시양태에서, 표적 분자 또는 표적 분자들은 본 개시내용에 따른 프로세스에서, 풍부화 및 후속 방출 후에 검출되어 상기 표적 분자(들) 및 그의 상류 샘플의 분석을 가능하게 할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 핵산은 유전자 서열분석, 흡광도, 형광, 전기 전도도, 정전용량, 표면 플라스몬 공명, 하이브리드 포획, 항체, 핵산의 직접적 표지화 (예를 들어, 단부-표지화, 표지된 태그부착 탑재물), 개재 염료 (예를 들어, 에티듐 브로마이드, SYBR 염료)로의 비-특이적 표지화, 또는 핵산 검출을 위한 임의의 다른 공지된 방법론을 사용하여 검출될 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 단백질 또는 펩티드 단편은 흡광도, 형광, 질량 분광법, 아미노산 서열분석, 또는 단백질 또는 펩티드 검출을 위한 임의의 다른 공지된 방법론을 사용하여 검출될 수 있다.
샘플 제조 장치 및 모듈
분석을 위한 샘플을 제조하는 프로세스에 사용하기 위한 기구, 카트리지 (예를 들어, 채널 (예를 들어, 미세유체 채널)을 포함함), 및/또는 펌프 (예를 들어, 연동 펌프)를 포함한 장치 또는 모듈이 일반적으로 제공된다. 생물학적 샘플로부터 표적 분자의 포획, 농축, 조작, 및/또는 검출을 가능하게 하는 장치는 본 개시내용에 따라 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 차세대 서열분석 및/또는 다른 하류 분석 기술을 위한 물질을 생산하기 위한 샘플의 자동화 프로세싱을 위한 장치 및 관련된 방법이 제공된다. 장치 및 관련된 방법은 본원의 다른 곳에 기재된 샘플 제조 또는 샘플 분석 프로세스에 따른 핵산 및/또는 단백질 프로세싱을 위한 반응을 포함한 화학적 및/또는 생물학적 반응을 수행하는데 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 샘플 제조 장치 또는 모듈은 서열분석 모듈 또는 장치에 표적 분자 또는 복수의 표적 분자 (예를 들어, 표적 핵산 또는 표적 단백질)를 전달하거나(deliver) 전달하도록(transfer) 위치된다. 일부 실시양태에서, 샘플 제조 장치 또는 모듈은 서열분석 장치 또는 모듈에 직접적으로 (예를 들어, 물리적으로 부착됨) 또는 간접적으로 연결된다.
일부 실시양태에서, 샘플 제조 장치 또는 모듈은 진단 목적을 위한 샘플을 제조하는데 사용된다. 일부 실시양태에서, 진단 목적을 위한 샘플을 제조하는데 사용되는 샘플 제조 장치는 진단 모듈 또는 진단 장치에 표적 분자 또는 복수의 분자 (예를 들어, 표적 핵산 또는 표적 단백질)를 전달하거나 전달하도록 위치된다. 일부 실시양태에서, 샘플 제조 장치 또는 모듈은 진단 장치에 직접적으로 (예를 들어, 물리적으로 부착됨) 또는 간접적으로 연결된다.
일부 실시양태에서, 장치는 1개 이상의 카트리지를 수용하도록 구성된 (예를 들어, 한 번에 1개의 카트리지를 수용하도록 구성된) 카트리지 하우징을 포함한다. 일부 실시양태에서, 카트리지는 유체를 수용하고/거나 샘플 제조 프로세스에 사용되는 1종 이상의 시약을 함유하도록 구성된 1개 이상의 저장소 또는 반응 용기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 카트리지는 샘플 제조 프로세스에 사용되는 유체 (예를 들어, 1종 이상의 시약을 포함하는 유체)를 함유하고/거나 수송하도록 구성된 1개 이상의 채널 (예를 들어, 미세유체 채널)을 포함한다. 시약은 완충제, 효소적 시약, 중합체 매트릭스, 포획 시약, 크기-특이적 선택 시약, 서열-특이적 선택 시약, 및/또는 정제 시약을 포함한다. 샘플 제조 프로세스에 사용하기 위한 추가의 시약은 본원의 다른 곳에 기재되어 있다.
일부 실시양태에서, 카트리지는 1종 이상의 저장된 시약 (예를 들어, 액체 또는 액체 형태로의 재구성에 적합한 동결건조된 형태의)을 포함한다. 카트리지의 저장된 시약은 목적하는 프로세스를 수행하는데 적합한 시약 및/또는 목적하는 샘플 유형을 프로세싱하는데 적합한 시약을 포함한다. 일부 실시양태에서, 카트리지는 단일-사용 카트리지 (예를 들어, 일회용 카트리지) 또는 다중-사용 카트리지 (예를 들어, 재사용가능한 카트리지)이다. 일부 실시양태에서, 카트리지는 사용자-공급된 샘플을 수용하도록 구성된다. 사용자-공급된 샘플은 카트리지가 장치에 의해, 예를 들어, 사용자에 의해 수동으로 또는 자동화 프로세스에서 수용되기 전에 또는 후에 카트리지에 첨가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 카트리지는 샘플 제조 카트리지이다. 일부 실시양태에서, 샘플 제조 카트리지는 샘플 (예를 들어, 생물학적 샘플)로부터 표적 분자 (예를 들어, 표적 핵산 또는 표적 단백질)를 단리하거나 정제할 수 있다.
일부 실시양태에서, 카트리지는 본원에 기재된 바와 같은 풍부화를 위한 친화성 매트릭스를 포함한다. 일부 실시양태에서, 카트리지는 친화성 SCODA, FIGE, 또는 PFGE를 사용한 풍부화를 위한 친화성 매트릭스를 포함한다. 일부 실시양태에서, 카트리지는 표적 핵산 또는 표적 단백질에 대한 결합 친화도를 갖는 고정화된 친화성 작용제를 포함하는 친화성 매트릭스를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 샘플 제조 장치는 대조군 방법 (예를 들어, 세이지 블루피핀(Sage BluePippin) 방법, 수동 방법 (예를 들어, 수동 비드-기반 크기 선택 방법))을 사용하여 생성된 평균 판독물-길이보다 더 긴 하류 서열분석 적용을 위한 평균 판독물-길이를 갖는 표적 핵산을 생산한다 (예를 들어, 풍부화하거나 정제함). 일부 실시양태에서, 샘플 제조 장치는 적어도 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 또는 3000개의 뉴클레오티드의 길이를 포함하는 서열분석을 위한 평균 판독물-길이를 갖는 표적 핵산을 생산한다. 일부 실시양태에서, 샘플 제조 장치는 700 내지 3000, 1000 내지 3000, 1000 내지 2500, 1000 내지 2400, 1000 내지 2300, 1000 내지 2200, 1000 내지 2100, 1000 내지 2000, 1000 내지 1900, 1000 내지 1800, 1000 내지 1700, 1000 내지 1600, 1000 내지 1500, 1000 내지 1400, 1000 내지 1300, 1000 내지 1200, 1500 내지 3000, 1500 내지 2500, 1500 내지 2000, 또는 2000 내지 3000개의 뉴클레오티드의 길이를 포함하는 서열분석을 위한 평균 판독물-길이를 갖는 표적 핵산을 생산한다.
본 개시내용에 따른 장치는 일반적으로 본원에 기재된 바와 같은 카트리지를 작동시키는데 사용될 수 있는 기계적 및 전자적 및/또는 광학 성분을 함유한다. 일부 실시양태에서, 장치 성분은 카트리지에 대한 또는 카트리지의 특이적 영역에 대한 특이적 온도를 달성하고 유지하도록 작동한다. 일부 실시양태에서, 장치 성분은 특이적 전압을 특이적 시간 지속기간 동안 카트리지의 전극에 적용하도록 작동한다. 일부 실시양태에서, 장치 성분은 액체를 카트리지의 저장소 및/또는 반응 용기로, 그로부터, 또는 그 사이에 이동시키도록 작동한다. 일부 실시양태에서, 장치 성분은 액체를 카트리지의 채널(들)을 통해 예를 들어, 카트리지의 저장소 및/또는 반응 용기로, 그로부터, 또는 그 사이에 이동시키도록 작동한다. 일부 실시양태에서, 장치 성분은 카트리지의 엘라스토머성, 시약-특이적 저장소 또는 반응 용기와 상호작용하는 연동 펌핑 메커니즘 (예를 들어, 기구)을 통해 액체를 이동시킨다. 일부 실시양태에서, 장치 성분은 채널을 통해 유체를 펌핑하는 카트리지의 채널과 연관된 엘라스토머성 성분 (예를 들어, 엘라스토머를 포함하는 표면 층)과 상호작용하도록 구성된 연동 펌핑 메커니즘 (예를 들어, 기구)을 통해 액체를 이동시킨다. 장치 성분은 예를 들어, 샘플 정보가 입력될 수 있고, 특이적 프로세스가 선택될 수 있고, 실행 결과가 보고될 수 있는 사용자 인터페이스를 구동하기 위한 컴퓨터 리소스를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 카트리지는 작은-부피 유체 (예를 들어, 1 내지 10 μL, 2 내지 10 μL, 4 내지 10 μL, 5 내지 10 μL, 1 내지 8 μL, 또는 1 내지 6 μL 유체)를 취급할 수 있다. 일부 실시양태에서, 서열분석 카트리지는 샘플 제조 장치 또는 모듈과 물리적으로 포매되거나 회합된다 (예를 들어, 제조된 샘플이 서열분석을 위한 반응 혼합물에 전달되는 것을 허용하기 위해). 일부 실시양태에서, 샘플 제조 장치 또는 모듈과 물리적으로 포매되거나 회합된 서열분석 카트리지는 페이스 밀봉 가스켓 또는 원뿔 프레스 핏 (예를 들어, 루어(Luer) 피팅)의 형태로 유체 계면을 갖는 미세유체 채널을 포함한다. 일부 실시양태에서, 유체 계면은 이어서 서열분석 카트리지를 샘플 제조 장치 또는 모듈로부터 물리적으로 분리하기 위해 제조된 샘플의 전달 후에 파괴될 수 있다.
하기 비-제한적 예는 본원에 기재된 장치, 방법, 및 조성물의 측면을 예시하는 것으로 의미된다. 본 개시내용에 따른 샘플 제조 장치 또는 모듈의 사용은 하기 기재된 단계 중 하나 이상으로 진행될 수 있다. 사용자는 장치의 뚜껑을 열고, 목적하는 프로세스를 지지하는 카트리지를 삽입할 수 있다. 사용자는 이어서 특이적 용해 용액과 조합될 수 있는 샘플을 카트리지 상의 샘플 포트에 첨가할 수 있다. 사용자는 이어서 장치 뚜껑을 닫고, 임의의 샘플 특이적 정보를 장치 상의 터치 스크린 인터페이스를 통해 입력하고, 임의의 프로세스 특이적 파라미터 (예를 들어, 목적하는 크기 선택의 범위, 표적 분자 포획을 위한 상동성의 목적하는 정도 등)를 선택하고, 샘플 제조 프로세스 실행을 개시할 수 있다. 실행 후, 사용자는 관련된 실행 데이터 (예를 들어, 실행의 성공적인 완결의 확인, 실행 특이적 계량치 등), 뿐만 아니라 프로세스 특이적 정보 (예를 들어, 생성된 샘플의 양, 특이적 표적 서열의 존재 또는 부재 등)를 수신할 수 있다. 실행에 의해 생성된 데이터는 로컬 또는 클라우드 기반일 수 있는 후속 생물정보학 분석으로 처리될 수 있다. 프로세스에 따라, 완성된 샘플은 후속 사용 (예를 들어, 게놈 서열분석, qPCR 정량화, 클로닝 등)을 위해 카트리지로부터 추출될 수 있다. 이어서 장치는 개방될 수 있고, 이어서 카트리지는 제거될 수 있다.
일부 실시양태에서, 샘플 제조 모듈은 펌프를 포함한다. 일부 실시양태에서, 펌프는 연동 펌프이다. 일부 이러한 펌프는 본원에 기재된 유체 취급을 위한 발명적 성분 중 1종 이상을 포함한다. 예를 들어, 펌프는 기구 및/또는 카트리지를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 펌프의 기구는 롤러, 크랭크, 및 로커를 포함한다. 일부 이러한 실시양태에서, 크랭크 및 로커는 롤러에 연결된 크랭크-및-로커 메커니즘으로서 구성된다. 기구의 롤러와의 크랭크-및-로커 메커니즘의 커플링은 일부 경우에 본원에 기재된 특정 이점이 달성되는 것을 허용할 수 있다 (예를 들어, 카트리지로부터 기구의 손쉬운 이탈, 잘-계량된 스트로크 부피). 특정 실시양태에서, 펌프의 카트리지는 채널 (예를 들어, 미세유체 채널)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 카트리지의 채널의 적어도 부분은 본원에 기재된 임의의 다수의 이점에 기여할 수 있는 특정 횡단면 형상 및/또는 표면 층을 갖는다.
일부 경우에 특정 유익을 제공할 수 있는 일부 카트리지의 한 비-제한적 측면은 카트리지에서의 특정 횡단면 형상을 갖는 채널의 포함이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 카트리지는 v-형상 채널을 포함한다. 이러한 v-형상 채널을 형성하는 한 잠재적으로 편리한, 그러나 비-제한적 방식은 카트리지 내로 v-형상 홈을 성형하거나 기계가공함으로써이다. v-형상 채널 (또한 본원에서 v-홈 또는 실질적으로 삼각형-형상 횡단면을 갖는 채널로 지칭됨)을 포함하는 것의 인식된 이점은 특정 실시양태에서 기구의 롤러가 카트리지와 결속되어 채널로부터 유체 유동을 유발하는 것이다. 예를 들어, 일부 경우에, v-형상 채널은 롤러에 대해 치수적으로 비민감하다. 다시 말해서, 일부 경우에, v-형상 채널과 적합하게 결속하기 위해 기구의 롤러 (예를 들어, 쐐기 형상 롤러)가 부착해야 하는 단일 치수는 없다. 대조적으로, 채널의 특정 통상적인 횡단면 형상, 예컨대 반-원형은 채널과 적합하게 결속하기 위해 (예를 들어, 연동 펌핑 프로세스에서 차등적인 압력을 유발하는 유체 밀봉부를 생성하기 위해) 롤러가 특정 치수 (예를 들어, 반경)를 갖는 것을 요구할 수 있다. 일부 실시양태에서, 롤러에 대해 치수적으로 비민감한 채널의 포함은 하드웨어 성분의 보다 간단하고 덜 비싼 제작 및 증가된 구성성/유연성을 발생시킬 수 있다.
특정 측면에서, 카트리지는 표면 층 (예를 들어, 평평한 표면 층)을 포함한다. 한 예시적인 측면은 v-홈 위에 엘라스토머 (예를 들어, 실리콘)를 포함하는 (예를 들어, 이로 본질적으로 이루어진) 막 (또한 본원에서 표면 층으로 지칭됨)을 층상화하여, 사실상, 가요성 튜브의 절반을 생성하는 것을 수반하는 잠재적으로 유리한 실시양태에 관한 것이다. 도 24는 특정 이러한 실시양태에 따른 예시적인 카트리지 (100)를 도시하며, 하기에 보다 상세하게 기재된다. 이어서, 일부 실시양태에서, 엘라스토머를 포함하는 표면 층을 채널로 변형시켜 핀치를 형성함으로써, 및 이어서 핀치를 변환함으로써, 음성 압력은 석션을 생성하는 핀치의 트레일링 연부 상에 생성될 수 있고, 양성 압력은 핀치의 리딩 연부 상에 생성되어, 핀치의 리딩 연부의 방향에서 유체를 펌핑할 수 있다. 특정 실시양태에서, 이는 카트리지 (표면 층을 갖는 채널을 포함함)를 롤러를 포함하는 기구와 접속함으로써 펌핑하며, 기구는 롤러를 표면 층의 부분과 결속시켜 표면 층의 부분을 연관된 채널의 벽 및/또는 베이스와 핀칭하고/거나, 롤링 운동에서 롤러를 연관된 채널의 벽 및/또는 베이스를 따라 변환하여 표면 층의 핀치를 벽 및/또는 베이스에 대해 변환하고/거나, 롤러를 표면 층의 제2 부분과 이탈시키는 것을 포함하는 롤러의 운동을 수행하도록 구성된다. 특정 실시양태에서, 크랭크-및-로커 메커니즘은 롤러의 이 운동을 수행하는 기구 내로 혼입된다.
통상적인 연동 펌프는 일반적으로 배관이 펌프가 기능할 때 기구의 나머지와 항상 결속되도록, 회전 캐리지 상의 롤러를 포함하는 기구 내로 삽입된 배관을 수반한다. 대조적으로, 특정 실시양태에서, 본원에서 카트리지에서의 채널은 롤러가 수평 표면과 결속하도록, 선형이거나 적어도 1개의 선형 부분을 포함한다. 특정 실시양태에서, 롤러는 롤러가 표면 층의 부분을 연속적으로 핀칭하면서 수평 표면을 추적할 수 있도록 스프링-로딩된 작은 롤러 아암에 연결된다. 기구 (예를 들어, 기구의 롤러 아암)를 스프링 로딩하는 것은 일부 경우에 기구 (예를 들어, 롤러)에 의해 표면 층 및 카트리지의 채널에 적용되는 힘을 조절하는 것을 도울 수 있다.
특정 실시양태에서, 롤러에 연결된 크랭크-및-로커 메커니즘에서 크랭크의 각각의 회전은 별개의 펌핑 부피를 제공한다. 특정 실시양태에서, 기구를 이탈된 위치에 파킹하는 것은 간단하며, 여기서 롤러는 임의의 카트리지로부터 이탈된다. 특정 실시양태에서, 전방 및 후방 펌핑 운동은 유사한 양의 힘 (토크) (예를 들어, 10% 내)이 전방 및 후방 펌핑 운동에 요구되도록, 본원에 기재된 기구에 의해 제공된 바와 같이 상당히 대칭적이다.
특정 실시양태에서, 기구의 특정 크기에 대해, 상대적으로 높은 크랭크 반경 (예를 들어, 2 mm 이상, 임의로 연관된 연결을 포함함)을 갖는 것이 유리할 수 있다. 결과적으로, 특정 실시양태에서, 연관된 카트리지와 결속하는 상대적으로 높은 스트로크 길이 (예를 들어, 10 mm 이상)를 갖는 것이 또한 유리할 수 있다. 상대적으로 높은 크랭크 반경 및 스트로크 길이를 갖는 것은 특정 실시양태에서, 카트리지에 대해 기구의 성분을 이동시키는 경우, 기구 및 카트리지 사이의 기계적 간섭이 없는 것을 보장한다.
특정 실시양태에서, v-형상 홈을 갖는 것은 유리하게는 쐐기-형상 연부를 갖는 다양한 크기의 롤러로의 이용을 허용한다. 대조적으로, 예를 들어, v-홈이라기 보다는 직사각형 채널을 갖는 것은 직사각형 채널과 연관된 롤러의 폭이 직사각형 채널의 폭에 관하여 보다 제어되고 정확할 것을 필요로 하게 하고, 직사각형 채널에 적용되는 힘이 보다 정확할 필요가 있게 한다. 유사하게, 반원형 횡단면을 갖는 채널(들)은 또한 연관된 롤러의 폭에 대한 보다 제어되고 정확한 치수를 요구할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 기구는 기구의 적어도 부분을 복수의 차원 (예를 들어, 2차원, 3차원)으로 이동시키도록 구성된 다중-축 시스템 (예를 들어, 로봇)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 다중-축 시스템은 기구의 적어도 부분을 연관된 카트리지(들) 중에서 임의의 펌핑 레인 위치로 이동시키도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 본원의 캐리지는 다중-축 시스템에 기능적으로 연결될 수 있다. 특정 실시양태에서, 롤러는 다중-축 시스템에 간접적으로 기능적으로 연결될 수 있다. 특정 실시양태에서, 롤러에 연결된 크랭크-및-로커 메커니즘을 포함하는 기구 부분은 다중-축 시스템에 기능적으로 연결될 수 있다. 특정 실시양태에서, 각각의 펌핑 레인은 위치에 의해 어드레스되고, 다중-축 시스템을 사용하여 본원에 기재된 기구에 의해 접근될 수 있다.
핵산 서열분석 프로세스
본 개시내용의 일부 측면은 핵산 (예를 들어, 데옥시리보핵산 또는 리보핵산)을 서열분석하는 것을 추가로 수반한다. 일부 측면에서, 본원에 기재된 조성물, 장치, 시스템, 및 기술은 핵산 내로 혼입된 일련의 뉴클레오티드를 확인하는데 사용될 수 있다 (예를 들어, 일련의 표지된 뉴클레오티드의 혼입의 시간-과정을 검출함으로써). 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물, 장치, 시스템, 및 기술은 중합 효소 (예를 들어, RNA 폴리머라제)에 의해 합성된 주형-의존적 핵산 서열분석 반응 생성물 내로 혼입된 일련의 뉴클레오티드를 확인하는데 사용될 수 있다.
따라서, 또한 표적 핵산의 서열을 결정하는 방법이 본원에서 제공된다. 일부 실시양태에서, 표적 핵산은 표적 핵산의 서열을 결정하기 전에 풍부화된다 (예를 들어, 전기영동적 방법, 예를 들어, 친화성 SCODA를 사용하여 풍부화됨). 일부 실시양태에서, 샘플 (예를 들어, 정제된 샘플, 세포 용해물, 단일-세포, 세포의 집단, 또는 조직)에 존재하는 복수의 표적 핵산 (예를 들어, 적어도 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 50개, 또는 그 초과)의 서열을 결정하는 방법이 본원에서 제공된다. 일부 실시양태에서, 샘플은 샘플에 존재하는 표적 핵산 또는 복수의 표적 핵산의 서열을 결정하기 전에 본원에 기재된 바와 같이 제조된다 (예를 들어, 용해되고/거나, 정제되고/거나, 단편화되고/거나, 표적 핵산에 대해 풍부화됨). 일부 실시양태에서, 표적 핵산은 풍부화된 표적 핵산이다 (예를 들어, 전기영동적 방법, 예를 들어, 친화성 SCODA를 사용하여 풍부화됨).
일부 실시양태에서, 서열분석의 방법은 (i) 표적 부피에서의 복합체를 하나 이상의 표지된 뉴클레오티드에 노출시키는 단계이며, 여기서 복합체는 샘플에 존재하는 표적 핵산 또는 복수의 핵산, 적어도 하나의 프라이머, 및 중합 효소를 포함하는 것인 단계; (ii) 하나 이상의 여기 에너지, 또는 하나 이상의 여기 에너지의 일련의 펄스를 표적 부피의 부근을 향해 지향시키는 단계; (iii) 적어도 하나의 프라이머 중 하나를 포함하는 핵산 내로의 순차적 혼입 동안 하나 이상의 표지된 뉴클레오티드로부터 복수의 방출된 광자를 검출하는 단계; 및 (iv) 방출된 광자의 하나 이상의 특징을 결정함으로써 혼입된 뉴클레오티드의 서열을 확인하는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 복수의 핵산 단편을 서열분석함으로써 샘플에 존재하는 표적 핵산 또는 복수의 표적 핵산을 서열분석하는 방법이며, 여기서 표적 핵산(들)은 단편을 포함하는 것인 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 방법은 복수의 단편 서열을 조합하여 모 핵산 (예를 들어, 모 표적 핵산)에 대한 서열 또는 부분적 서열을 제공하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조합의 단계는 컴퓨터 하드웨어 및 소프트웨어에 의해 수행된다. 본원에 기재된 방법은 관련된 핵산의 세트 (예를 들어, 샘플에 존재하는 2개 이상의 핵산), 예컨대 전체 염색체 또는 게놈이 서열분석되는 것을 허용할 수 있다.
일부 실시양태에서, 프라이머는 서열분석 프라이머이다. 일부 실시양태에서, 서열분석 프라이머는 고체 지지체에 고정화될 수 있거나 그렇지 않을 수 있는 핵산 (예를 들어, 표적 핵산)에 어닐링될 수 있다. 고체 지지체는 예를 들어, 핵산 서열분석에 사용되는 칩 또는 카트리지 상의 샘플 웰 (예를 들어, 나노구멍, 반응 챔버)을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 서열분석 프라이머는 고체 지지체에 고정화될 수 있고, 핵산 (예를 들어, 표적 핵산)의 혼성화는 핵산 분자를 고체 지지체에 추가로 고정화한다. 일부 실시양태에서, 폴리머라제 (예를 들어, RNA 폴리머라제)는 고체 지지체 상에 고정화되고, 가용성 서열분석 프라이머 및 핵산은 폴리머라제에 접촉된다. 일부 실시양태에서 폴리머라제, 핵산 (예를 들어, 표적 핵산) 및 프라이머를 포함하는 복합체는 용액에서 형성되고, 복합체는 고체 지지체에 고정화된다 (예를 들어, 폴리머라제, 프라이머, 및/또는 표적 핵산의 고정화를 통해). 일부 실시양태에서, 성분 중 어느 것도 고체 지지체에 고정화되지 않는다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 폴리머라제, 표적 핵산, 및 서열분석 프라이머를 포함하는 복합체는 계내에서 형성되고, 복합체는 고체 지지체에 고정화되지 않는다.
일부 실시양태에서, 합성에 의한 서열분석 방법은 표적 핵산 분자 (예를 들어, 표적 핵산의 카피)의 집단의 존재 및/또는 표적 핵산의 집단을 달성하기 위한 표적 핵산의 증폭 (예를 들어, 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR))의 단계를 포함할 수 있다. 그러나, 일부 실시양태에서, 합성에 의한 서열분석은 평가되고 있는 임의의 하나의 반응에서 단일 핵산 분자의 서열을 결정하는데 사용될 수 있으며, 핵산 증폭은 표적 핵산을 제조하는데 요구되지 않을 수 있다. 일부 실시양태에서, 복수의 단일 분자 서열분석 반응은 본 개시내용의 측면에 따라 병렬로 (예를 들어, 단일 칩 또는 카트리지 상에서) 수행된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 복수의 단일 분자 서열분석 반응은 단일 칩 또는 카트리지 상의 별개의 샘플 웰 (예를 들어, 나노구멍, 반응 챔버)에서 각각 수행된다.
일부 실시양태에서, 표적 핵산 분자의 서열분석은 표적 핵산의 적어도 2개의 (예를 들어, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100개, 또는 그 초과의) 뉴클레오티드를 확인하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 2개의 뉴클레오티드는 인접한 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 적어도 2개의 아미노산은 비-인접한 뉴클레오티드이다.
일부 실시양태에서, 표적 핵산의 서열분석은 표적 핵산에서 모든 뉴클레오티드의 100% 미만 (예를 들어, 99% 미만, 95% 미만, 90% 미만, 85% 미만, 80% 미만, 75% 미만, 70% 미만, 65% 미만, 60% 미만, 55% 미만, 50% 미만, 45% 미만, 40% 미만, 35% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 1% 미만 또는 그 미만)의 확인을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 표적 핵산의 서열분석은 표적 핵산에서 뉴클레오티드의 한 유형의 100% 미만의 확인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적 핵산의 서열분석은 표적 핵산에서 뉴클레오티드의 각각의 유형의 100% 미만의 확인을 포함한다.
단백질 서열분석 프로세스
본 개시내용의 측면은 또한 단백질 서열분석 및 확인의 방법, 폴리펩티드 서열분석 및 확인의 방법, 아미노산 확인의 방법, 및 이러한 방법을 수행하기 위한 조성물, 시스템, 및 장치를 수반한다. 이러한 단백질 서열분석 및 확인은 일부 실시양태에서, 본원에 보다 상세하게 기재된 샘플 제조 및/또는 게놈 서열분석을 수행하는 동일한 기기로 수행된다. 일부 측면에서, 표적 단백질의 서열을 결정하는 방법이 기재된다. 일부 실시양태에서, 표적 단백질은 표적 단백질의 서열을 결정하기 전에 풍부화된다 (예를 들어, 전기영동적 방법, 예를 들어, 친화성 SCODA를 사용하여 풍부화됨). 일부 측면에서, 샘플 (예를 들어, 정제된 샘플, 세포 용해물, 단일-세포, 세포의 집단, 또는 조직)에 존재하는 복수의 단백질 (예를 들어, 적어도 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 50개, 또는 그 초과)의 서열을 결정하는 방법이 기재된다. 일부 실시양태에서, 샘플은 샘플에 존재하는 표적 단백질 또는 복수의 단백질의 서열을 결정하기 전에 본원에 기재된 바와 같이 제조된다 (예를 들어, 용해되고/거나, 정제되고/거나, 단편화되고/거나, 표적 단백질에 대해 풍부화됨). 일부 실시양태에서, 표적 단백질은 풍부화된 표적 단백질이다 (예를 들어, 전기영동적 방법, 예를 들어, 친화성 SCODA를 사용하여 풍부화됨).
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 혼합물로부터 단백질의 아미노산의 1개 이상의 유형을 확인함으로써 복수의 단백질을 포함하는 샘플에서 개별적 단백질을 서열분석하고/거나 확인하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 단백질의 1개 이상의 아미노산 (예를 들어, 말단 아미노산 또는 내부 아미노산)은 표지되고 (예를 들어, 직접적으로 또는 간접적으로, 예를 들어 결합제를 사용하여), 단백질에서의 표지된 아미노산의 상대 위치가 결정된다. 일부 실시양태에서, 단백질에서의 아미노산의 상대 위치는 일련의 아미노산 표지화 및 절단 단계를 사용하여 결정된다. 일부 실시양태에서, 단백질에서의 표지된 아미노산의 상대 위치는 표지된 단백질을 공극 (예를 들어, 단백질 채널)을 통해 전위시키고, 단백질 분자에서의 표지된 아미노산의 상대 위치를 결정하기 위해 공극을 통한 전위 동안 표지된 아미노산(들)으로부터 신호 (예를 들어, 푀르스터(Foerster) 공명 에너지 전달 (FRET) 신호)를 검출함으로써 단백질로부터 아미노산을 제거하지 않고 결정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 말단 아미노산 (예를 들어, N-말단 또는 C-말단 아미노산)의 신원은 말단 아미노산이 제거되고, 말단 단부에서의 다음 아미노산의 신원이 평가되기 전에 결정되며; 이 프로세스는 단백질에서의 복수의 연속적 아미노산이 평가될 때까지 반복될 수 있다. 일부 실시양태에서, 아미노산의 신원을 평가하는 것은 존재하는 아미노산의 유형을 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 아미노산의 유형을 결정하는 것은 실제 아미노산 신원을 결정하는 것 (예를 들어, 예를 들어 개별적 말단 아미노산에 대해 특이적인 결합제를 사용하여 천연-발생 20종의 아미노산 중, 어느 아미노산인지를 결정하는 것)을 포함한다. 그러나, 일부 실시양태에서, 말단 아미노산 유형의 신원을 결정하는 것은 단백질의 말단에 존재할 수 있는 잠재적 아미노산의 하위세트를 결정하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이는 아미노산이 1개 이상의 특이적 아미노산이 아님 (즉, 및 따라서 임의의 다른 아미노산일 수 있음)을 결정함으로써 달성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이는 아미노산의 특정된 하위세트 중 어느 것이 (예를 들어, 크기, 전하, 소수성, 결합 특성에 기반하여) 단백질의 말단에 있을 수 있는지 (예를 들어, 2개 이상의 말단 아미노산의 특정된 하위세트에 결합하는 결합제를 사용하여) 결정함으로써 달성될 수 있다.
일부 실시양태에서, 단백질 또는 폴리펩티드는 복수의 보다 작은 단백질 또는 폴리펩티드로 소화될 수 있고, 서열 정보는 이들 보다 작은 단백질 또는 폴리펩티드 중 1종 이상으로부터 얻어질 수 있다 (예를 들어, 단백질의 말단 아미노산을 순차적으로 평가하고, 그 아미노산을 제거하여 다음 아미노산을 말단에 노출시키는 것을 수반하는 방법을 사용하여).
일부 실시양태에서, 단백질은 그의 아미노 (N) 말단으로부터 서열분석된다. 일부 실시양태에서, 단백질은 그의 카르복시 (C) 말단으로부터 서열분석된다. 일부 실시양태에서, 단백질의 제1 말단 (예를 들어, N 또는 C 말단)은 고정화되고, 다른 말단 (예를 들어, C 또는 N 말단)은 본원에 기재된 바와 같이 서열분석된다.
본원에 사용된 단백질을 서열분석하는 것은 단백질에 대한 서열 정보를 결정하는 것을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 이는 단백질의 부분 (또는 전부)에 대한 각각의 순차적 아미노산의 신원을 결정하는 것을 수반할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이는 단편 (예를 들어, 표적 단백질의 단편 또는 복수의 단백질을 포함하는 샘플의 단편)의 신원을 결정하는 것을 수반할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이는 단백질 내의 아미노산의 하위세트의 신원을 평가하는 것 (예를 들어, 및 단백질에서의 각각의 아미노산의 신원을 결정하지 않으면서 1개 이상의 아미노산 유형의 상대 위치를 결정하는 것)을 수반할 수 있다. 일부 실시양태에서 아미노산 함량 정보는 단백질에서의 아미노산의 상이한 유형의 상대 위치를 직접적으로 결정하지 않으면서 단백질로부터 얻어질 수 있다. 아미노산 함량 단독은 존재하는 단백질의 신원을 추론하는데 사용될 수 있다 (예를 들어, 아미노산 함량을 단백질 정보의 데이터베이스와 비교하고, 어느 단백질(들)이 동일한 아미노산 함량을 갖는지를 결정함으로써).
일부 실시양태에서, (예를 들어, 효소적 및/또는 화학적 절단을 통해) 표적 단백질 또는 복수의 단백질을 포함하는 샘플로부터 얻어진 복수의 단백질 단편에 대한 서열 정보는 샘플에 존재하는 표적 단백질 또는 복수의 단백질의 서열을 재구축하거나 추론하기 위해 분석되 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 아미노산의 1개 이상의 유형은 아미노산의 1개 이상의 유형에 선택적으로 결합하는 1종 이상의 표지된 친화성 시약의 발광을 검출함으로써 확인된다. 일부 실시양태에서, 아미노산의 1개 이상의 유형은 표지된 단백질의 발광을 검출함으로써 확인된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 단백질의 말단에 존재하는 일련의 아미노산을 시간 경과에 따라 확인함으로써 (예를 들어, 말단에서의 아미노산의 반복적 검출 및 절단에 의해) 단백질을 서열분석하기 위한 조성물, 장치, 및 방법을 제공한다. 추가의 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 단백질의 표지된 아미노 함량을 확인하고, 참조 서열 데이터베이스와 비교함으로써 단백질을 서열분석하기 위한 조성물, 장치, 및 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 단백질의 복수의 단편을 서열분석함으로써 단백질을 서열분석하기 위한 조성물, 장치, 및 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 단백질을 서열분석하는 것은 복수의 단백질 단편에 대한 서열 정보를 조합하여 단백질에 대한 서열을 확인하고/거나 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열 정보를 조합하는 것은 컴퓨터 하드웨어 및 소프트웨어에 의해 수행될 수 있다. 본원에 기재된 방법은 관련된 단백질의 세트, 예컨대 유기체의 전체 프로테옴이 서열분석되는 것을 허용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 복수의 단일 분자 서열분석 반응은 본 개시내용의 측면에 따라 병렬로 (예를 들어, 단일 칩 또는 카트리지 상에서) 수행된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 복수의 단일 분자 서열분석 반응은 단일 칩 또는 카트리지 상의 별개의 샘플 웰에서 각각 수행된다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 방법은 복수의 단백질을 포함하는 샘플에서 개별적 단백질의 서열분석 및 확인에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 복수의 단백질을 포함하는 샘플에서 개별적 단백질을 고유하게 확인하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 개별적 단백질은 단백질의 부분적 아미노산 서열을 결정함으로써 혼합된 샘플에서 검출된다. 일부 실시양태에서, 단백질의 부분적 아미노산 서열은 대략 5 내지 50, 10 내지 50, 25 내지 50, 25 내지 100, 또는 50 내지 100개의 아미노산의 인접한 스트레치 내이다.
임의의 특정 이론에 구애되기를 원하지는 않지만, 대부분의 인간 단백질은 프로테오믹 데이터베이스를 참고로 불완전한 서열 정보를 사용하여 확인될 수 있는 것으로 예상된다. 예를 들어, 인간 프로테옴의 간단한 모델링은 단백질의 대략 98%가 6 내지 40개의 아미노산의 스트레치 내에서 아미노산의 단지 4개의 유형을 검출함으로써 고유하게 확인될 수 있음을 보였다 (예를 들어, 문헌 [Swaminathan, et al. PLoS Comput Biol. 2015, 11(2):e1004080]; 및 [Yao, et al. Phys. Biol. 2015, 12(5):055003] 참조). 따라서, 복수의 단백질을 포함하는 샘플은 대략 6 내지 40개의 아미노산의 짧은 단백질 단편으로 단편화될 (예를 들어, 화학적으로 분해될, 효소적으로 분해될) 수 있고, 이 단백질-기반 라이브러리의 서열분석은 원래 샘플에 존재하는 단백질의 각각의 신원 및 풍부도를 밝힐 것이다. 선택적 아미노산 표지화 및 부분적 서열 정보를 결정함으로써 폴리펩티드를 확인하기 위한 조성물 및 방법은 발명의 명칭이 "단일 분자 펩티드 서열분석"인 2015년 9월 15일에 출원된 미국 특허 출원 번호 15/510,962에 상세하게 기재되어 있으며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
본 개시내용에 따른 서열분석은 일부 측면에서, 기재의 (예를 들어, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 서열분석 장치 또는 모듈에서 고체 지지체, 예를 들어 칩 또는 카트리지의) 표면 상에 단백질 (예를 들어, 표적 단백질)을 고정화하는 것을 수반할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단백질은 기재 상의 샘플 웰의 표면 상에 (예를 들어, 샘플 웰의 바닥 표면 상에) 고정화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 단백질의 N-말단 아미노산은 고정화된다 (예를 들어, 표면에 부착됨). 일부 실시양태에서, 단백질의 C-말단 아미노산은 고정화된다 (예를 들어, 표면에 부착됨). 일부 실시양태에서, 1개 이상의 비-말단 아미노산은 고정화된다 (예를 들어, 표면에 부착됨). 고정화된 아미노산(들)은 예를 들어 본 개시내용에 기재된 바와 같이 임의의 적합한 공유 또는 비-공유 연결을 사용하여 부착될 수 있다. 일부 실시양태에서, 복수의 단백질은 예를 들어 기재 상의 샘플 웰의 어레이에서 복수의 샘플 웰 (예를 들어, 각각의 샘플 웰의 표면, 예를 들어 바닥 표면에 부착된 1종의 단백질을 가짐)에 부착된다.
일부 실시양태에서, 말단 아미노산 (예를 들어, N-말단 또는 C-말단 아미노산)의 신원이 결정되고, 이어서 말단 아미노산이 제거되고, 말단 단부에서의 다음 아미노산의 신원이 결정된다. 이 프로세스는 단백질에서 복수의 연속적 아미노산이 결정될 때까지 반복될 수 있다. 일부 실시양태에서, 아미노산의 신원을 결정하는 것은 존재하는 아미노산의 유형을 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 아미노산의 유형을 결정하는 것은 예를 들어 천연-발생 20종의 아미노산 중 어느 것이 말단 아미노산인지 (예를 들어, 개별적 말단 아미노산에 대해 특이적인 결합제를 사용하여) 결정함으로써 실제 아미노산 신원을 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 아미노산의 유형은 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 셀레노시스테인, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 말단 아미노산 유형의 신원을 결정하는 것은 단백질의 말단에 존재할 수 있는 잠재적 아미노산의 하위세트를 결정하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이는 아미노산이 1종 이상의 특이적 아미노산이 아님 (및 따라서 임의의 다른 아미노산일 수 있음)을 결정함으로써 달성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이는 아미노산의 특정된 하위세트 중 어느 것이 (예를 들어, 크기, 전하, 소수성, 번역후 변형, 결합 특성에 기반하여) 단백질의 말단에 있을 수 있는지 (예를 들어, 2종 이상의 말단 아미노산의 특정된 하위세트에 결합하는 결합제를 사용하여) 결정함으로써 달성될 수 있다.
일부 실시양태에서, 말단 아미노산 유형의 신원을 평가하는 것은 아미노산이 번역후 변형을 포함하는 것을 결정하는 것을 포함한다. 번역후 변형의 비-제한적 예는 아세틸화, ADP-리보실화, 카스파제 절단, 시트룰린화, 포르밀화, N-연결된 글리코실화, O-연결된 글리코실화, 히드록실화, 메틸화, 미리스토일화, 네딜화, 질화, 산화, 팔미토일화, 인산화, 프레닐화, S-니트로실화, 황산화, 수모일화, 및 유비퀴틴화를 포함한다.
일부 실시양태에서, 단백질 또는 단백질은 복수의 보다 작은 단백질로 소화될 수 있고, 서열 정보는 이들 보다 작은 단백질 중 1종 이상으로부터 얻어질 수 있다 (예를 들어, 단백질의 말단 아미노산을 순차적으로 평가하고, 그 아미노산을 제거하여 다음 아미노산을 말단에 노출시키는 것을 포함하는 방법을 사용하여).
일부 실시양태에서, 단백질 분자의 서열분석은 단백질 분자에서 적어도 2개의 (예를 들어, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100개, 또는 그 초과의) 아미노산을 확인하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 2개의 아미노산은 인접한 아미노산이다. 일부 실시양태에서, 적어도 2개의 아미노산은 비-인접한 아미노산이다.
일부 실시양태에서, 단백질 분자의 서열분석은 단백질 분자에서 모든 아미노산의 100% 미만 (예를 들어, 99% 미만, 95% 미만, 90% 미만, 85% 미만, 80% 미만, 75% 미만, 70% 미만, 65% 미만, 60% 미만, 55% 미만, 50% 미만, 45% 미만, 40% 미만, 35% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 1% 미만 또는 그 미만)의 확인을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 단백질 분자의 서열분석은 단백질 분자에서 아미노산의 1개의 유형의 100% 미만의 확인 (예를 들어, 단백질 분자에서 1개의 유형의 모든 아미노산의 부분의 확인)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단백질 분자의 서열분석은 단백질 분자에서 아미노산의 각각의 유형의 100% 미만의 확인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 단백질 분자의 서열분석은 단백질에서 아미노산의 적어도 1, 적어도 5, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 55, 적어도 60, 적어도 65, 적어도 70, 적어도 75, 적어도 80, 적어도 85, 적어도 90, 적어도 95, 적어도 100개 또는 그 초과의 유형의 확인을 포함한다.
서열분석 장치 또는 모듈
본 개시내용에 따른 핵산 또는 단백질의 서열분석은 일부 측면에서, 단일 분자 분석을 수행하는 시스템을 사용하여 수행될 수 있다. 시스템은 서열분석 장치 또는 모듈 및 서열분석 장치 또는 모듈과 접속하도록 구성된 기기를 포함할 수 있다. 서열분석 장치 또는 모듈은 픽셀의 어레이를 포함할 수 있고, 여기서 개별적 픽셀은 샘플 웰 및 적어도 1개의 광검출기를 포함한다. 서열분석 장치 또는 모듈의 샘플 웰은 서열분석 장치 또는 모듈의 표면 상에 또는 이를 통해 형성되고, 서열분석 장치 또는 모듈의 표면 상에 정치된 샘플을 수용하도록 구성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플 웰은 장치 내로 삽입될 수 있는 카트리지 (예를 들어, 일회용 또는 단일-사용 카트리지)의 성분이다. 집합적으로, 샘플 웰은 샘플 웰의 어레이로 간주될 수 있다. 복수의 샘플 웰은 샘플 웰의 적어도 부분이 단일 표적 분자 또는 복수의 분자 (예를 들어, 표적 핵산 또는 표적 단백질)를 포함하는 샘플을 수용하도록 적합한 크기 및 형상을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플 웰 내의 분자의 수는 일부 샘플 웰은 1개의 분자 (예를 들어, 표적 핵산 또는 표적 단백질)를 함유하는 반면, 다른 것들은 0, 2개, 또는 복수의 분자를 함유하도록 서열분석 장치 또는 모듈의 샘플 웰 중에서 분포될 수 있다.
일부 실시양태에서, 서열분석 장치 또는 모듈은 샘플 제조 장치 또는 모듈로부터 표적 분자 또는 복수의 분자 (예를 들어, 표적 핵산 또는 표적 단백질)를 포함하는 샘플을 수용하도록 위치된다. 일부 실시양태에서, 서열분석 장치 또는 모듈은 샘플 제조 장치 또는 모듈에 직접적으로 (예를 들어, 물리적으로 부착됨) 또는 간접적으로 연결된다.
여기 광은 서열분석 장치 또는 모듈의 외부의 1개 이상의 광원으로부터 서열분석 장치 또는 모듈에 제공된다. 서열분석 장치 또는 모듈의 광학 성분은 광원으로부터 여기 광을 수용하고, 서열분석 장치 또는 모듈의 샘플 웰의 어레이를 향해 광을 지향시키고, 샘플 웰 내의 조명 영역을 조명할 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플 웰은 표적 분자 또는 복수의 분자를 포함하는 샘플이 샘플 웰의 표면에 근접하여 보유되는 것을 허용하는 배치를 가질 수 있으며, 이는 샘플 웰로의 여기 광의 전달 및 표적 분자 또는 복수의 분자를 포함하는 샘플로부터의 방출 광의 검출을 용이하게 할 수 있다. 조명 영역 내에 위치된 표적 분자 또는 복수의 분자를 포함하는 샘플은 여기 광에 의해 조명되는 것에 반응하여 방출 광을 방출할 수 있다. 예를 들어, 핵산 또는 단백질 (또는 그의 복수)은 여기 광의 조명을 통해 여기된 상태를 달성하는 것에 반응하여 광을 방출하는 형광 마커로 표지될 수 있다. 이어서 표적 분자 또는 복수의 분자를 포함하는 샘플에 의해 방출된 방출 광은 분석되는 표적 분자 또는 복수의 분자를 포함하는 샘플을 갖는 샘플 웰에 상응하는 픽셀 내의 1개 이상의 광검출기에 의해 검출될 수 있다. 일부 실시양태에 따르면 수에 있어서 대략 10,000개의 픽셀 내지 1,000,000개의 픽셀의 범위일 수 있는 샘플 웰의 어레이에 걸쳐 수행되는 경우, 다수의 샘플 웰은 병렬로 분석될 수 있다.
서열분석 장치 또는 모듈은 여기 광을 수용하고, 여기 광을 샘플 웰 어레이 중에 지향시키기 위한 광학 시스템을 포함할 수 있다. 광학 시스템은 여기 광을 서열분석 장치 또는 모듈에 커플링시키고, 여기 광을 다른 광학 성분에 지향시키도록 구성된 1개 이상의 격자 커플러를 포함할 수 있다. 광학 시스템은 격자 커플러로부터의 여기 광을 샘플 웰 어레이를 향해 지향시키는 광학 성분을 포함할 수 있다. 이러한 광학 성분은 광학 스플리터, 광학 컴바이너, 및 도파관을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 광학 스플리터는 격자 커플러로부터의 여기 광을 커플링시키고, 여기 광을 도파관의 적어도 하나에 전달할 수 있다. 일부 실시양태에 따르면, 광학 스플리터는 각각의 도파관이 실질적으로 유사한 양의 여기 광을 수용하도록 여기 광의 전달이 모든 도파관에 걸쳐 실질적으로 균일한 것을 허용하는 배치를 가질 수 있다. 이러한 실시양태는 서열분석 장치 또는 모듈의 샘플 웰에 의해 수용되는 여기 광의 균일성을 개선시킴으로써 서열분석 장치 또는 모듈의 성능을 개선시킬 수 있다. 예를 들어, 서열분석 장치 또는 모듈에 포함되는, 여기 광을 샘플 웰에 커플링시키고/거나 방출 광을 광검출기에 지향시키기 위한 적합한 성분의 예는 발명의 명칭이 "분자를 탐색, 검출 및 분석하기 위한 통합 장치"인 2015년 8월 7일에 출원된 미국 특허 출원 번호 14/821,688, 및 발명의 명칭이 "분자를 탐색, 검출 및 분석하기 위한 외부 광원을 갖는 통합 장치"인 2014년 11월 17일에 출원된 미국 특허 출원 번호 14/543,865에 기재되어 있으며, 이의 둘 다는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 서열분석 장치 또는 모듈에서 실행될 수 있는 적합한 격자 커플러 및 도파관의 예는 발명의 명칭이 "광학 커플러 및 도파관 시스템"인 2017년 12월 15일에 출원된 미국 특허 출원 번호 15/844,403에 기재되어 있으며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
추가의 광자 구조는 샘플 웰 및 광검출기 사이에 위치되고, 여기 광이 광검출기에 도달하는 것을 감소시키거나 방지하도록 구성될 수 있으며, 이는 그렇지 않다면 방출 광을 검출하는데 있어서 신호 잡음에 기여할 수 있다. 일부 실시양태에서, 서열분석 장치 또는 모듈에 대한 회로로서 작용할 수 있는 금속 층은 또한 공간 필터로서 작용할 수 있다. 적합한 광자 구조의 예는 스펙트럼 필터, 편광 필터, 및 공간 필터를 포함할 수 있고, 발명의 명칭이 "광학 거부 광자 구조"인 2018년 7월 23일에 출원된 미국 특허 출원 번호 16/042,968에 기재되어 있으며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
서열분석 장치 또는 모듈로부터 위치한 성분은 여기원을 서열분석 장치 또는 모듈에 위치시키고 정렬하는데 사용될 수 있다. 이러한 성분은 렌즈, 거울, 프리즘, 윈도우, 조리개, 감쇠기, 및/또는 광학 섬유를 포함한 광학 성분을 포함할 수 있다. 1개 이상의 정렬 성분의 제어를 허용하는 추가의 기계적 성분은 기기에 포함될 수 있다. 이러한 기계적 성분은 작동기, 스텝퍼 모터, 및/또는 손잡이를 포함할 수 있다. 적합한 여기원 및 정렬 메커니즘의 예는 발명의 명칭이 "펄스화된 레이저 및 시스템"인 2016년 5월 20일에 출원된 미국 특허 출원 번호 15/161,088에 기재되어 있으며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 빔-스티어링 모듈의 또 다른 예는 발명의 명칭이 "콤팩트 빔 쉐이핑 및 스티어링 어셈블리"인 2017년 12월 14일에 출원된 미국 특허 출원 번호 15/842,720에 기재되어 있으며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 적합한 여기원의 추가의 예는 발명의 명칭이 "분자를 탐색, 검출 및 분석하기 위한 통합 장치"인 2015년 8월 7일에 출원된 미국 특허 출원 번호 14/821,688에 기재되어 있으며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
서열분석 장치 또는 모듈의 개별적 픽셀과 함께 위치된 광검출기(들)는 픽셀의 상응하는 샘플 웰로부터 방출 광을 검출하도록 구성되고 위치될 수 있다. 적합한 광검출기의 예는 발명의 명칭이 "광자를 수용하는 시간적 비닝을 위한 통합 장치"인 2015년 8월 7일에 출원된 미국 특허 출원 번호 14/821,656에 기재되어 있으며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 일부 실시양태에서, 샘플 웰 및 그의 각각의 광검출기(들)는 공통 축을 따라 정렬될 수 있다. 이 방식으로, 광검출기(들)는 픽셀 내에서 샘플 웰과 중첩될 수 있다.
검출된 방출 광의 특징은 방출 광과 연관된 마커를 확인하기 위한 지시를 제공할 수 있다. 이러한 특징은 광검출기에 의해 검출된 광자의 도착 시간, 광검출기에 의해 시간 경과에 따라 축적된 광자의 양, 및/또는 2개 이상의 광검출기에 걸친 광자의 분포를 포함한 임의의 적합한 유형의 특징을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 광검출기는 샘플의 방출 광과 연관된 하나 이상의 타이밍 특징 (예를 들어, 발광 수명)의 검출을 허용하는 배치를 가질 수 있다. 광검출기는 여기 광의 펄스가 서열분석 장치 또는 모듈을 통해 전파된 후에 광자 도착 시간의 분포를 검출할 수 있고, 도착 시간의 분포는 샘플의 방출 광의 타이밍 특징 (예를 들어, 발광 수명에 대한 프록시)의 지시를 제공할 수 있다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 광검출기는 마커에 의해 방출된 방출 광의 확률 (예를 들어, 발광 강도)의 지시를 제공한다. 일부 실시양태에서, 복수의 광검출기는 방출 광의 공간적 분포를 포획하도록 사이징되고 배열될 수 있다. 이어서 1개 이상의 광검출기로부터의 출력 신호는 복수의 마커 중에서로부터 마커를 구별하는데 사용될 수 있고, 여기서 복수의 마커는 샘플 내에서 샘플을 확인하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플은 다수의 여기 에너지에 의해 여기될 수 있고, 다수의 여기 에너지에 반응하여 샘플에 의해 방출된 방출 광 및/또는 방출 광의 타이밍 특징은 복수의 마커로부터 마커를 구별할 수 있다.
작동에 있어서, 샘플 웰 내의 샘플의 병렬 분석은 여기 광을 사용하여 웰 내의 샘플의 일부 또는 전부를 여기시키고, 샘플 방출로부터의 신호를 광검출기로 검출함으로써 수행된다. 샘플로부터의 방출 광은 상응하는 광검출기에 의해 검출되고, 적어도 하나의 전기적 신호로 전환될 수 있다. 전기적 신호는 서열분석 장치 또는 모듈과 접속된 기기에 연결될 수 있는 서열분석 장치 또는 모듈의 회로에서의 전도선을 따라 전송될 수 있다. 전기적 신호는 이어서 프로세싱되고/거나 분석될 수 있다. 전기적 신호의 프로세싱 및/또는 분석은 기기 상에 또는 그 외부에 위치한 적합한 컴퓨팅 장치 상에서 일어날 수 있다.
기기는 기기 및/또는 서열분석 장치 또는 모듈의 작동을 제어하기 위한 사용자 인터페이스를 포함할 수 있다. 사용자 인터페이스는 사용자가 기기 내로 정보, 예컨대 기기의 기능을 제어하는데 사용되는 명령 및/또는 설정을 입력하는 것을 허용하도록 구성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 사용자 인터페이스는 버튼, 스위치, 다이알, 및/또는 음성 명령을 위한 마이크를 포함할 수 있다. 사용자 인터페이스는 사용자가 기기 및/또는 서열분석 장치 또는 모듈의 성능에 대한 피드백, 예컨대 서열분석 장치 또는 모듈 상의 광검출기로부터의 판독 신호에 의해 얻어진 적절한 정렬 및/또는 정보를 수신하는 것을 허용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 사용자 인터페이스는 음향 피드백을 제공하는 스피커를 사용하여 피드백을 제공할 수 있다. 일부 실시양태에서, 사용자 인터페이스는 사용자에게 시각적 피드백을 제공하기 위한 인디케이터 라이트 및/또는 디스플레이 스크린을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 기기 또는 장치는 컴퓨팅 장치와 연결하도록 구성된 컴퓨터 인터페이스를 포함할 수 있다. 컴퓨터 인터페이스는 USB 인터페이스, 파이어와이어(FireWire) 인터페이스, 또는 임의의 다른 적합한 컴퓨터 인터페이스일 수 있다. 컴퓨팅 장치는 임의의 일반용 컴퓨터, 예컨대 랩탑 또는 데스크탑 컴퓨터일 수 있다. 일부 실시양태에서, 컴퓨팅 장치는 적합한 컴퓨터 인터페이스를 통해 무선 네트워크 상에서 접근가능한 서버 (예를 들어, 클라우드-기반 서버)일 수 있다. 컴퓨터 인터페이스는 기기 및 컴퓨팅 장치 사이의 정보의 통신을 용이하게 할 수 있다. 기기를 제어하고/거나 설정하기 위한 입력 정보는 컴퓨팅 장치에 제공되고, 컴퓨터 인터페이스를 통해 기기에 전송될 수 있다. 기기에 의해 생성된 출력 정보는 컴퓨터 인터페이스를 통해 컴퓨팅 장치에 의해 수신될 수 있다. 출력 정보는 기기의 성능, 서열분석 장치 또는 모듈의 성능, 및/또는 광검출기의 판독 신호로부터 생성된 데이터에 관한 피드백을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 기기는 서열분석 장치 또는 모듈의 1개 이상의 광검출기로부터 수신된 데이터를 분석하고/거나 제어 신호를 여기원(들)에 전송하도록 구성된 프로세싱 장치를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로세싱 장치는 일반용 프로세서, 및/또는 특수-적응된 프로세서 (예를 들어, 중앙 처리 장치 (CPU), 예컨대 1개 이상의 마이크로프로세서 또는 마이크로컨트롤러 코어, 필드-프로그램가능 게이트 어레이 (FPGA), 어플리케이션-특이적 집적 회로 (ASIC), 커스텀 집적 회로, 디지털 신호 프로세서 (DSP), 또는 이들의 조합)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 광검출기로부터의 데이터의 프로세싱은 기기의 프로세싱 장치 및 외부 컴퓨팅 장치 둘 다에 의해 수행될 수 있다. 다른 실시양태에서, 외부 컴퓨팅 장치는 생략될 수 있고, 1개 이상의 광검출기로부터의 데이터의 프로세싱은 단지 서열분석 장치 또는 모듈의 프로세싱 장치에 의해 수행될 수 있다.
일부 실시양태에 따르면, 발광 방출 특징에 기반하여 표적 분자 또는 복수의 분자를 포함하는 샘플을 분석하도록 구성된 기기는 상이한 발광 분자 사이의 발광 수명 및/또는 강도의 차이, 및/또는 상이한 환경에서의 동일한 발광 분자의 수명 및/또는 강도 사이의 차이를 검출할 수 있다. 본 발명자들은 발광 방출 수명의 차이가 상이한 발광 분자의 존재 또는 부재 사이를 식별하고/거나 발광 분자가 처리되는 상이한 환경 또는 조건 사이를 식별하는데 사용될 수 있음을 인식하고 인정하였다. 일부 경우에, 수명 (예를 들어, 방출 파장이라기 보다는)에 기반하여 발광 분자를 식별하는 것은 시스템의 측면을 단순화할 수 있다. 예로서, 파장-식별 광학장치 (예컨대 파장 필터, 각각의 파장에 대한 전용 검출기, 상이한 파장에서 전용 펄스화된 광원, 및/또는 회절 광학장치)는 수명에 기반하여 발광 분자를 식별하는 경우 수에 있어서 감소되거나 제거될 수 있다. 일부 경우에, 단일 특징적 파장에서 작동하는 단일 펄스화된 광원은 광학 스펙트럼의 동일한 파장 영역 내에서 방출하지만 측정가능하게 상이한 수명을 갖는 상이한 발광 분자를 여기시키는데 사용될 수 있다. 동일한 파장 영역에서 방출하는 상이한 발광 분자를 여기시키고 식별하기 위한, 상이한 파장에서 작동하는 다수의 광원이라기 보다는 단일 펄스화된 광원을 사용하는 분석 시스템은 작동 및 유지가 덜 복잡할 수 있고, 보다 컴팩트할 수 있으며, 보다 낮은 비용으로 제조될 수 있다.
발광 수명 분석에 기반한 분석 시스템은 특정 유익을 가질 수 있지만, 분석 시스템에 의해 얻어지는 정보의 양 및/또는 검출 정확도는 추가의 검출 기술을 허용함으로써 증가될 수 있다. 예를 들어, 시스템의 일부 실시양태는 추가적으로 발광 파장 및/또는 발광 강도에 기반하여 샘플의 하나 이상의 특성을 식별하도록 구성될 수 있다. 일부 실행에서, 발광 강도는 추가적으로 또는 대안적으로 상이한 발광 표지 사이에 구별하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 발광 표지는 그들의 붕괴 속도가 유사할 수 있다고 하더라도, 유의하게 상이한 강도에서 방출하거나 그들의 여기의 확률의 유의한 차이 (예를 들어, 적어도 약 35%의 차이)를 가질 수 있다. 측정된 여기 광에 대한 비닝된 신호를 참고함으로써, 상이한 발광 표지를 강도 수준에 기반하여 구별하는 것이 가능할 수 있다.
일부 실시양태에 따르면, 상이한 발광 수명은 발광 표지의 여기 후 발광 방출 사건을 시간-비닝하도록 구성된 광검출기로 구별될 수 있다. 시간 비닝은 광검출기에 대한 단일 전하-축적 사이클 동안 일어날 수 있다. 전하-축적 사이클은 광-생성된 운반체가 시간-비닝 광검출기의 빈에서 축적되는 판독 사건 사이의 간격이다. 시간-비닝 광검출기의 예는 발명의 명칭이 "수용된 광자의 시간적 비닝을 위한 통합 장치"인 2015년 8월 7일에 출원된 미국 특허 출원 번호 14/821,656에 기재되어 있으며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 일부 실시양태에서, 시간-비닝 광검출기는 광자 흡수/운반체 생성 영역에서 전하 운반체를 생성하고, 전하 운반체를 전하 운반체 저장 영역에서의 전하 운반체 저장 빈에 직접적으로 전달할 수 있다. 이러한 실시양태에서, 시간-비닝 광검출기는 운반체 활주/포획 영역을 포함하지 않을 수 있다. 이러한 시간-비닝 광검출기는 "직접적 비닝 픽셀"로 지칭될 수 있다. 직접적 비닝 픽셀을 포함한 시간-비닝 광검출기의 예는 발명의 명칭이 "직접적 비닝 픽셀을 갖는 통합 광검출기"인 2017년 12월 22일에 출원된 미국 특허 출원 번호 15/852,571에 기재되어 있으며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시양태에서, 동일한 유형의 상이한 수의 형광단은 각각의 개별적 분자가 발광 강도에 기반하여 확인될 수 있도록, 표적 분자 (예를 들어, 표적 핵산 또는 표적 단백질) 또는 샘플에 존재하는 복수의 분자 (예를 들어, 복수의 핵산 또는 복수의 단백질)의 상이한 성분에 연결될 수 있다. 예를 들어, 2개의 형광단은 제1 표지된 분자에 연결될 수 있고, 4개 이상의 형광단은 제2 표지된 분자에 연결될 수 있다. 상이한 수의 형광단 때문에, 상이한 분자와 연관된 상이한 여기 및 형광단 방출 확률이 있을 수 있다. 예를 들어, 빈의 겉보기 강도가 제1 표지된 분자에 대해 유의하게 더 높도록, 신호 축적 간격 동안 제2 표지된 분자에 대한 보다 많은 방출 사건이 있을 수 있다.
본 발명자들은 형광단 붕괴 속도 및/또는 형광단 강도에 기반하여 핵산 또는 단백질을 구별하는 것이 광학 여기 및 검출 시스템의 단순화를 가능하게 할 수 있음을 인식하고 인정하였다. 예를 들어, 광학 여기는 단일-파장 공급원 (예를 들어, 다수의 공급원 또는 다수의 상이한 특징적 파장에서 작동하는 공급원이라기 보다는 하나의 특징적 파장을 생성하는 공급원)으로 수행될 수 있다. 추가적으로, 파장 식별 광학장치 및 필터는 검출 시스템에 필요하지 않을 수 있다. 또한, 단일 광검출기는 각각의 샘플 웰이 상이한 형광단으로부터 방출을 검출하는데 사용될 수 있다. 어구 "특징적 파장" 또는 "파장"은 방사선의 제한된 밴드폭을 갖는 중심 또는 우세한 파장을 지칭하는데 사용된다. 예를 들어, 방사선의 제한된 밴드폭은 펄스화된 광원에 의한 20 nm 밴드폭 출력 내의 중심 또는 피크 파장을 포함할 수 있다. 일부 경우에, "특징적 파장" 또는 "파장"은 공급원에 의한 방사선 출력의 총 밴드폭 내의 피크 파장을 지칭하는데 사용될 수 있다.
조합된 샘플 제조 및 서열분석 장치
일부 실시양태에서, 본원의 장치는 샘플 제조 모듈 및 서열분석 모듈을 포함한다. 일부 실시양태에서, 샘플 제조 모듈 및 서열분석 모듈을 포함하는 장치는 2개의 카트리지가 단일, 분리불가능한 소모품을 포함하도록, 샘플 제조 카트리지 내로 포매된 서열분석 칩 또는 카트리지를 수반한다. 일부 실시양태에서, 서열분석 칩 또는 카트리지는 소모품 지지 전자장치 (예를 들어, 와이어본드, 전기적 접촉을 갖는 PCB 기재)를 요구한다. 소모품 지지 전자장치는 서열분석 칩 또는 카트리지와 직접적으로 물리적 접촉될 수 있다. 일부 실시양태에서, 서열분석 칩 또는 카트리지는 연동 펌프, 온도 제어 및/또는 전기영동 접촉을 위한 인터페이스를 요구한다. 이들 인터페이스는 많은 전기적 접촉 및 레이저 정렬을 위한 정확한 기하학적 등록을 허용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 칩 또는 카트리지의 상이한 섹션은 상이한 온도, 물리적 힘, 가변하는 전압 및 전류의 전기적 인터페이스, 진동, 및/또는 경쟁 정렬 요건을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플 제조 또는 서열분석 모듈과 연관된 이질적인 기기 하위-시스템은 자원을 공유하기 위해 가깝게 근접해야 한다. 일부 실시양태에서, 샘플 제조 모듈 및 서열분석 모듈을 포함하는 장치는 핸즈-프리이다 (즉, 손을 사용하지 않고 사용될 수 있음).
일부 실시양태에서, 샘플 제조 모듈 및 서열분석 모듈을 포함하는 장치는 대조군 방법 (예를 들어, 세이지 블루피핀 방법, 수동 방법 (예를 들어, 수동 비드-기반 크기 선택 방법))을 사용하여 생성된 평균 판독물-길이보다 더 긴 하류 서열분석 적용을 위한 평균 판독물-길이를 갖는 표적 핵산을 생산한다 (예를 들어, 풍부화하거나 정제함). 일부 실시양태에서, 샘플 제조 장치는 적어도 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 또는 3000개의 뉴클레오티드의 길이를 포함하는 서열분석을 위한 평균 판독물-길이를 갖는 표적 핵산을 생산한다. 일부 실시양태에서, 샘플 제조 장치는 700 내지 3000, 1000 내지 3000, 1000 내지 2500, 1000 내지 2400, 1000 내지 2300, 1000 내지 2200, 1000 내지 2100, 1000 내지 2000, 1000 내지 1900, 1000 내지 1800, 1000 내지 1700, 1000 내지 1600, 1000 내지 1500, 1000 내지 1400, 1000 내지 1300, 1000 내지 1200, 1500 내지 3000, 1500 내지 2500, 1500 내지 2000, 또는 2000 내지 3000개의 뉴클레오티드의 길이를 포함하는 서열분석을 위한 평균 판독물-길이를 갖는 표적 핵산을 생산한다.
일부 실시양태에서, 샘플 제조 모듈 및 서열분석 모듈을 포함하는 장치는 대조군 또는 전통적인 방법 (예를 들어, 세이지 블루피핀 방법, 이어서 서열분석)보다 샘플 제조의 개시 및 샘플 내에 함유된 표적 분자의 검출 사이의 단축된 시간을 허용한다. 일부 실시양태에서, 샘플 제조 모듈 및 서열분석 모듈을 포함하는 장치는 대조군 또는 전통적인 방법 (예를 들어, 세이지 블루피핀 방법, 이어서 서열분석)보다 더 적은 시간 (예를 들어, 2배, 3배, 4배, 5배, 또는 10배 더 적은 시간)에 서열분석을 사용하여 표적 분자를 검출할 수 있다.
일부 실시양태에서, 샘플 제조 모듈 및 서열분석 모듈을 포함하는 장치는 대조군 또는 전통적인 방법 (예를 들어, 세이지 블루피핀 방법, 이어서 서열분석)보다 샘플의 더 낮은 입력으로 표적 분자를 검출할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 장치는 0.1 μg, 0.2 μg, 0.3 μg, 0.4 μg, 0.5 μg, 0.6 μg, 0.7 μg, 0.8 μg, 0.9 μg, 또는 1 μg만큼 적은 샘플 (예를 들어, 생물학적 샘플)을 요구한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 장치는 10 μL, 20 μL, 30 μL, 40 μL, 50 μL, 60 μL, 70 μL, 80 μL, 90 μL, 100 μL, 110 μL, 130 μL, 150 μL, 175 μL, 200 μL, 225 μL, 또는 250 μL만큼 적은 샘플 (예를 들어, 생물학적 샘플, 예컨대 혈액)을 요구한다.
장치 또는 모듈
일부 실시양태에서, 장치 또는 모듈 (예를 들어, 샘플 제조 장치; 서열분석 장치; 조합된 샘플 제조 및 서열분석 장치)는 일부 경우에 작은 부피(들)의 유체를 잘 정의된 유체 유동 분해능으로, 및 잘 정의된 유속으로 정확하게 수송하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 장치 또는 모듈은 0.1 μL/s 이상, 0.5 μL/s 이상, 1 μL/s 이상, 2 μL/s 이상, 5 μL/s 이상, 또는 그 초과의 유속으로 유체를 수송하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 본원의 장치 또는 모듈은 100 μL/s 이하, 75 μL/s 이하, 50 μL/s 이하, 30 μL/s 이하, 20 μL/s 이하, 15 μL/s 이하, 또는 그 미만의 유속으로 유체를 수송하도록 구성된다. 이들 범위의 조합은 가능하다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본원의 장치 또는 모듈은 0.1 μL/s 이상 및 100 μL/s 이하, 또는 5 μL/s 이상 및 15 μL/s 이하의 유속으로 유체를 수송하도록 구성된다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 본원의 시스템, 장치, 및 모듈은 수십 마이크로리터 또는 수백 마이크로리터의 정도의 유체 유동 분해능을 갖는다. 유체 유동 분해능의 추가의 설명은 본원의 다른 곳에 기재되어 있다. 특정 실시양태에서, 시스템, 장치, 및 모듈은 카트리지의 적어도 부분을 통해 작은 부피의 유체를 수송하도록 구성된다.
일부 측면은 (예를 들어, 크랭크-및-로커 메커니즘과 조합으로) 롤러를 포함하는 펌프 및 기구의 배치에 관한 것이다. 다른 측면은 횡단면 형상 (예를 들어, 실질적으로 삼각형 형상), 밸브, 딥 섹션, 및/또는 표면 층 (예를 들어, 평평한 엘라스토머 막)을 갖는 채널 (예를 들어, 마이크로채널)을 포함하는 카트리지에 관한 것이다. 특정 측면은 펌프의 다른 성분 (예를 들어, 펌핑 레인)으로부터의 연동 펌프의 특정 성분 (예를 들어, 롤러)의 분리에 관한 것이다. 일부 경우에, 기구의 특정 요소 (예를 들어, 롤러의 연부)는 임의의 다양한 이점이 달성되도록 하는 방식으로 (예를 들어, 결속 및 이탈을 통해) 카트리지의 요소 (예를 들어, 표면 층 및 채널의 특정 형상)와 상호작용하도록 구성된다. 일부 비-제한적 실시양태에서, 본원에 기재된 기구, 카트리지, 및 펌프의 특정 발명적 특색 및 배치는 유체 펌핑 프로세스의 개선된 자동화에 기여한다 (예를 들어, 롤러에 의해 인덱싱될 수 있는 다수의 상이한 유체 채널을 함유하는 변환가능한 롤러 및 별개의 카트리지의 사용으로 인해). 일부 경우에, 본원에 기재된 특색은 상대적으로 작은 수의 하드웨어 성분을 사용하여 상대적으로 높은 수의 배치를 갖는 상대적으로 높은 수의 상이한 유체 (예를 들어, 다수의 샘플과 다중화하기 위한)를 취급하는 능력에 기여한다 (예를 들어, 그의 각각이 롤러에 접근가능할 수 있는 다수의 상이한 채널을 갖는 별개의 카트리지의 사용으로 인해). 한 예로서, 일부 경우에, 본원에 기재된 특색은 1개 초과의 기구가 카트리지와 쌍형성되어 1개 초과의 레인을 동시에 펌핑하거나 다른 기능성에 대해 1개의 레인에서 2개의 펌프를 사용하는 것을 허용한다. 일부 경우에, 특색은 요구되는 유체 부피의 감소 및/또는 롤러/채널 상호작용에서 덜 엄격한 내성에 기여한다 (예를 들어, 채널 및/또는 롤러의 연부의 발명적 횡단면 형상으로 인해, 및/또는 채널의 발명적 밸브 및/또는 딥 섹션의 사용으로 인해). 일부 경우에, 본원에 기재된 특색은 하드웨어 성분의 요구되는 세척의 감소를 발생시킨다 (예를 들어, 연동 펌프의 기구 및 카트리지의 분리로 인해). 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 기구, 카트리지, 및 펌프의 측면은 샘플을 제조하는데 유용하다. 예를 들어, 일부 이러한 측면은 검출 모듈의 상류의 샘플 제조 모듈 내로 혼입될 수 있다 (예를 들어, 생물학적으로-유래된 샘플의 분석/서열분석/확인을 위해).
또 다른 측면에서, 연동 펌프가 제공된다. 일부 실시양태에서, 연동 펌프는 롤러 및 카트리지를 포함하고, 여기서 카트리지는 채널을 포함하는 표면을 갖는 베이스 층을 포함하고, 채널의 적어도 일부의 적어도 부분은 (1) 채널의 베이스에 단일 정점을 갖고 베이스 층의 표면에 2개의 다른 정점을 갖는 실질적으로 삼각형-형상 횡단면을 갖고, (2) 채널의 표면 개구를 실질적으로 밀봉하도록 구성된 엘라스토머를 포함하는 표면 층을 갖는다. 연동 펌프의 실시양태는 본원의 다른 곳에 추가로 기재되어 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 시스템 (예를 들어, 펌프, 장치)은 펌프 사이클을 겪는다. 일부 실시양태에서, 펌프 사이클은 시스템의 크랭크의 1회 회전에 상응한다. 일부 실시양태에서, 각각의 펌프 사이클은 1 μL 이상, 2 μL 이상, 4 μL 이상, 10 μL 이하, 8 μL 이하, 및/또는 6 μL 이하의 유체를 수송할 수 있다. 상기-언급된 범위의 조합은 또한 가능하다 (예를 들어, 1 μL 내지 10 μL). 유체의 부피의 다른 범위는 또한 가능하다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 시스템은 특정 스트로크 길이를 갖는다. 특정 실시양태에서, 각각의 펌프 사이클이 1 μL 내지 10 μL 정도의 유체를 수송할 수 있는 경우, 및/또는 채널 치수가 바람직하게는 1 mm 정도의 폭 및 1 mm 정도의 깊이일 수 있는 경우 (예를 들어, 채널 부피를 감소시키고 합리적인 내성을 유지하도록 기계가공되거나 성형될 수 있는 것에 따라), 스트로크 길이는 10 mm 이상, 12 mm 이상, 14 mm 이상, 20 mm 이하, 18 mm 이하, 및/또는 16 mm 이하일 수 있다. 상기-언급된 범위의 조합은 또한 가능하다 (예를 들어, 10 mm 내지 20 mm). 다른 범위는 또한 가능하다. 본원에 사용된 "스트로크 길이"는 기재와 결속되면서 롤러가 활주하는 거리를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 기재는 카트리지를 포함한다.
또 다른 측면에서, 카트리지가 제공된다. 일부 실시양태에서, 카트리지는 채널을 포함하는 표면을 갖는 베이스 층을 갖고, 채널의 적어도 일부의 적어도 부분은 (1) 채널의 베이스에 단일 정점을 갖고 베이스 층의 표면에 2개의 다른 정점을 갖는 실질적으로 삼각형-형상 횡단면을 갖고, (2) 채널의 표면 개구를 실질적으로 밀봉하도록 구성된 엘라스토머를 포함하는 표면 층을 갖는다. 카트리지의 실시양태는 본원의 다른 곳에 추가로 기재되어 있다.
일부 실시양태에서, 카트리지는 베이스 층을 포함한다. 일부 실시양태에서, 베이스 층은 1개 이상의 채널을 포함하는 표면을 갖는다. 예를 들어, 도 24는 일부 실시양태에 따른, 채널 (102)의 폭을 따른 카트리지 (100)의 횡단면도의 개략도이다. 도시된 카트리지 (100)는 채널 (102)을 포함하는 표면 (111)을 갖는 베이스 층 (104)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 채널의 적어도 일부는 마이크로채널이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 채널 (102)의 적어도 일부는 마이크로채널이다. 특정 실시양태에서, 모든 채널은 마이크로채널이다. 예를 들어, 도 24를 다시 언급하면, 특정 실시양태에서, 모든 채널 (102)은 마이크로채널이다.
본원에 사용된 용어 "채널"은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있을 것이며, 유체를 함유하고/거나 수송하도록 구성된 구조를 지칭할 수 있다. 채널은 일반적으로 벽; 베이스 (예를 들어, 벽에 연결되고/거나 벽으로부터 형성된 베이스); 및 채널의 1개 이상의 부분에서 개방되고/거나, 커버되고/거나, 밀봉될 수 있는 표면 개구를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "마이크로채널"은 1000 마이크로미터 이하의 크기의 적어도 1개의 치수를 포함하는 채널을 지칭한다. 예를 들어, 마이크로채널은 1000 마이크로미터 이하 (예를 들어, 100 마이크로미터 이하, 10 마이크로미터 이하, 5 마이크로미터 이하)의 크기의 적어도 1개의 치수 (예를 들어, 폭, 높이)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 마이크로채널은 1 마이크로미터 이상 (예를 들어, 2 마이크로미터 이상, 10 마이크로미터 이상)의 적어도 1개의 치수를 포함한다. 상기-언급된 범위의 조합은 또한 가능하다 (예를 들어, 1 마이크로미터 이상 및 1000 마이크로미터 이하, 10 마이크로미터 이상 및 100 마이크로미터 이하). 다른 범위는 또한 가능하다. 일부 실시양태에서, 마이크로채널은 1000 마이크로미터 이하의 수력학적 직경을 갖는다. 본원에 사용된 용어 "수력학적 직경" (DH)은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있을 것이며, DH = 4A/P로서 결정될 수 있고, 여기서 A는 채널을 통한 유체의 유동의 횡단면적이고, P는 횡단면의 윤변 (유체에 의해 접촉된 채널의 횡단면의 둘레)이다.
일부 실시양태에서, 적어도 일부 채널(들)의 적어도 부분은 실질적으로 삼각형-형상 횡단면을 갖는다. 일부 실시양태에서, 적어도 일부 채널(들)의 적어도 부분은 채널의 베이스에 단일 정점을 갖고 베이스 층의 표면에 2개의 다른 정점을 갖는 실질적으로 삼각형-형상 횡단면을 갖는다. 도 24를 다시 언급하면, 일부 실시양태에서, 채널 (102)의 적어도 일부의 적어도 부분은 채널의 베이스에 단일 정점을 갖고 베이스 층의 표면에 2개의 다른 정점을 갖는 실질적으로 삼각형-형상 횡단면을 갖는다.
본원에 사용된 용어 "삼각형"은 삼각형이 실제 형상에 근사하거나 동등하도록 내접되거나 외접될 수 있는 형상을 지칭하는데 사용되며, 순수하게 삼각형에 국한되지는 않는다. 예를 들어, 삼각형 횡단면은 1개 이상의 부분에서 비-제로 곡률을 포함할 수 있다.
삼각형 횡단면은 쐐기 형상을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "쐐기 형상"은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 공지되어 있을 것이며, 두꺼운 단부를 갖고 얇은 단부로 가늘어지는 형상을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 쐐기 형상은 두꺼운 단부로부터 얇은 단부로 대칭의 축을 갖는다. 예를 들어, 쐐기 형상은 두꺼운 단부 (예를 들어, 채널의 표면 개구)를 갖고, 얇은 단부 (예를 들어, 채널의 베이스)로 가늘어질 수 있으며, 두꺼운 단부로부터 얇은 단부로 대칭의 축을 가질 수 있다.
추가적으로, 특정 실시양태에서, 실질적으로 삼각형 횡단면 (즉, "v-홈(들)")은 다양한 종횡비를 가질 수 있다. 본원에 사용된 용어 v-홈에 대한 "종횡비"는 높이-대-폭 비를 지칭한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, v-홈(들)은 2 이하, 1 이하, 또는 0.5 이하, 및/또는 0.1 이상, 0.2 이상, 또는 0.3 이상의 종횡비를 가질 수 있다. 상기-언급된 범위의 조합은 또한 가능하다 (예를 들어, 0.1 내지 2, 0.2 내지 1). 다른 범위는 또한 가능하다.
일부 실시양태에서, 적어도 일부 채널(들)의 적어도 부분은 실질적으로 삼각형 부분 및 실질적으로 삼각형 부분 내로 제2 부분 개구를 포함하고, 채널의 표면에 비해 실질적으로 삼각형 부분 밑으로 연장하는 횡단면을 갖는다. 일부 실시양태에서, 제2 부분은 실질적으로 삼각형 부분의 평균 직경보다 유의하게 더 작은 직경 (예를 들어, 평균 직경)을 갖는다. 도 24를 다시 언급하면, 일부 실시양태에서, 채널 (102)의 적어도 일부의 적어도 부분은 실질적으로 삼각형 부분 (101) 및 실질적으로 삼각형 부분 (101) 내로 개방된 제2 부분 (103)을 포함하고, 채널의 표면 (105)에 비해 실질적으로 삼각형 부분 (101) 밑으로 연장하는 횡단면을 갖고, 여기서 제2 부분 (103)은 실질적으로 삼각형 부분 (101)의 평균 직경 (109)보다 유의하게 더 작은 직경 (107)을 갖는다. 일부 이러한 경우에, 채널의 실질적으로 삼각형 부분의 평균 직경의 그것보다 유의하게 더 작은 직경을 갖는 채널의 제2 부분은 기구의 롤러에 접근가능한 실질적으로 삼각형 부분 및 표면 층의 변형된 부분, 그러나 롤러에 접근불가능한 제2 부분 및 표면 층의 변형된 부분을 발생시킬 수 있다. 예를 들어, 도 24를 다시 언급하면, 특정 실시양태에 따르면, 채널 (102)의 실질적으로 삼각형 부분 (101)은 롤러 (도시되지 않음) 및 표면 층 (106)의 변형된 부분에 접근가능한 반면, 제2 부분 (103)은 롤러 및 표면 층 (106)의 변형된 부분에 접근불가능하다. 일부 이러한 경우에, 표면 층 (106)을 갖는 밀봉부는 제2 부분 (103)을 갖는 채널 (102)의 부분에서 달성될 수 없는데, 이는 표면 층 (106)이 그것이 실질적으로 삼각형 부분 (101)을 채우지만, 제2 부분 (103)은 그렇지 않도록 롤러에 의해 변형되는 경우에도, 유체가 제2 부분 (103)에서 여전히 자유롭게 이동할 수 있기 때문이다. 일부 실시양태에서, 채널의 길이를 따른 부분은 실질적으로 삼각형 부분 및 제2 부분 ("딥 섹션") 둘 다를 가질 수 있는 반면, 채널의 길이를 따른 상이한 부분은 단지 실질적으로 삼각형 부분만을 갖는다. 일부 이러한 실시양태에서, 기구 (예를 들어, 롤러)가 실질적으로 삼각형 부분 및 제2 부분 (딥 섹션) 둘 다를 갖는 부분과 결속하는 경우, 펌프 작용은 시작되지 않는데, 이는 표면 층을 갖는 밀봉부가 달성되지 않기 때문이다. 그러나, 기구가 채널의 길이 방향을 따라 결속함에 따라, 기구가 단지 실질적으로 삼각형 섹션만을 갖는 채널의 부분에서 표면 층을 변형시키는 경우, 펌프 작용은 시작하는데, 이는 그 부분에서 제2 부분 (딥 섹션)의 결여가 밀봉부 (및 결과적으로 차등적 압력)가 생성되는 것을 허용하기 때문이다. 따라서, 일부 경우에, 카트리지의 채널의 길이를 따른 딥 섹션의 존재 및 부재는 채널의 부분의 제어가 기구와의 결속시 펌프 작용을 겪을 수 있음을 허용할 수 있다.
카트리지의 채널의 적어도 일부의 제2 부분으로서 이러한 "딥 섹션"의 포함은 임의의 다양한 잠재적 유익에 기여할 수 있다. 예를 들어, 이러한 딥 섹션 (예를 들어, 제2 부분 (103))은 일부 경우에, 연동 펌핑 프로세스에서 펌프 부피의 감소에 기여한다. 일부 이러한 경우에, 펌프 부피는 보다 높은 부피 분해능에 대해 2배 이상 감소될 수 있다. 일부 경우에, 이러한 딥 섹션은 또한 어디에서 롤러가 채널 상에 착륙하는지에 의해 결정되지 않는 펌프 부피에 대한 잘 정의된 시작점을 제공할 수 있다. 예를 들어, 실질적으로 삼각형 부분 및 제2 부분 (딥 섹션) 둘 다를 갖는 채널의 부분 및 단지 실질적으로 삼각형 부분만을 갖는 채널의 부분 사이의 계면은 일부 경우에, 펌프 부피에 대한 잘 정의된 시작점으로서 사용될 수 있는데, 이는 단지 후자의 채널 부분의 부피를 점유하는 유체만이 펌핑될 수 있기 때문이다. 일부 경우에, 어디에서 롤러가 채널 상에 착륙하는지는 임의의 다양한 인자, 예컨대 카트리지 등록에 따라 연관된 일부 오류를 가질 수 있다. 딥 섹션의 포함은 일부 경우에, 이러한 오류와 연관된 펌프 부피의 변동을 감소시키거나 제거할 수 있다.
본원에 사용된 채널의 실질적으로 삼각형 부분의 평균 직경은 실질적으로 삼각형 부분의 정점으로부터 채널의 표면까지의 z-축에 걸친 평균으로서 측정될 수 있다.
실시예
본 발명의 실시양태는 하기 실시예를 참고로 추가로 기재되며, 이는 성질상 실례적인 것으로 의도되고, 제한적인 것으로 의도되지 않는다. 하기 실시예는 DNA 올리고뉴클레오티드 및 메틸화된 DNA 올리고뉴클레오티드의 분리를 참고로 기재되지만, 본 발명의 실시양태는 또한 다른 차등적으로 변형된 분자를 포함한, 매질 내에 고정화된 작용제에 대한 친화도를 갖는 다른 분자의 정제 및 분리에서의 적용을 갖는다. 이러한 분자의 예는 폴리펩티드 또는 단백질, 차등적으로 변형된 폴리펩티드 또는 단백질, 차등적으로 메틸화된 DNA 또는 RNA를 포함한 차등적으로 변형된 핵산 등을 포함한다. 본 발명의 실시양태에서 프로브로서 고정화될 수 있는 작용제의 예는 DNA, RNA, 항체, 폴리펩티드, 단백질, 핵산 압타머, 및 관심의 분자에 대한 친화도를 갖는 다른 작용제를 포함한다.
실시예 1.0 - 단일 염기 미스매치를 갖는 친화성 SCODA
방정식 [23]에서 표현된 예측된 온도 의존적 이동성을 확인하기 위해, 온도의 변화에 대한 표적 DNA 속도의 반응을 측정하는 실험을 수행하였다. 초기 실험을 표적 DNA로서 100 뉴클레오티드 올리고뉴클레오티드로 수행하였다. 올리고뉴클레오티드는 단일 가닥이고, 따라서 친화성 겔과 상호작용하도록 변성될 필요가 없다. 올리고뉴클레오티드는 또한 이들이 무시가능한 장 의존적 이동성을 갖도록 충분히 짧다. 보다 긴 핵산 분자, 예를 들어 약 1000개 초과의 뉴클레오티드의 길이는 서열에 기반하여 분리되기 곤란할 수 있는데, 이는 보다 긴 분자가 온도 구배를 제공하는 전기장에 의해 제공된 줄 가열을 사용하는 실시양태에서 전기영동적 SCODA 효과로부터 비-서열 특이적 방식으로 포커싱하는 경향성을 갖기 때문이다.
이들 측정을 수행하기 위해, 0.2 M NaCl 및 10 μM 아크리다이트 프로브 (서열식별번호(SEQ ID NO.): 1) 올리고를 갖는 1X TB (89 mM 트리스, 89 mM 붕산) 중 폴리아크릴아미드 겔 (4% T, 2% C)을 단지 2개의 접근 포트를 함유하는 1차원 겔 카세트에서 캐스팅하였다. 중합을 겔의 ml 당 2 μl의 10% w/v APS 및 0.2 μl TEMED의 첨가를 통해 개시하였다.
이동성 측정을 프로브에 대한 완벽한 매치 (PM) (서열식별번호: 2) 및 단일 염기 미스매치 (sbMM) (서열식별번호: 3)를 갖는 서열을 함유하는 단일 염기에 의해 상이한 2개의 상이한 100 뉴클레오티드 올리고뉴클레오티드 상에서 수행하였다. 이들 표적 올리고뉴클레오티드를 6-FAM 또는 Cy5 (IDT DNA) 중 어느 하나로 단부 표지하였다. 이들 실험에 사용된 프로브 및 표적 서열은 표 3에 나타내어진다. 고정화된 프로브에 상보적인 PM 및 sbMM 표적 올리고뉴클레오티드의 영역은 이들 올리고뉴클레오티드의 다른 부분보다 더 어두운 활자체로 나타내어진다. 단일 염기 미스매치의 위치는 sbMM 표적 서열에서 밑줄친다.
표 3 . 서열 특이적 SCODA에 사용된 프로브 및 표적 올리고뉴클레오티드 서열.
Figure pct00034
프로브 서열을 하기 논의되는 보다 긴 표적으로의 후속 실험을 위해 pUC19에 상보적이도록 선택하였다. 100 뉴클레오티드 표적은 100 뉴클레오티드 길이를 구성하기 위해 프로브에 상보적인 (완벽한 매치: PM) 또는 플랭킹 서열을 갖는 프로브에 대한 단일 염기 미스매치 (sbMM)를 갖는 서열을 함유한다. 플랭킹 서열을 2차 구조 및 자기-혼성화의 효과를 최소화하도록 디자인하였다. 프로브 결합 부위에 플랭킹된 영역에 대한 초기 서열을 무작위로 선택하였다. 이어서 폴딩 및 자기-혼성화 에너지를 M폴드를 사용하여 계산하고, 서열을 한 번에 1개의 염기를 변경시켜 이들 효과를 최소화하여 우세한 상호작용이 표적 가닥 및 프로브 사이에 있을 것을 보장하였다.
표 4는 M폴드를 사용하여 계산된 표 3에 나타내어진 서열에 대한 결합 에너지 및 용융 온도를 나타낸다. 결합 에너지, ΔG는 ΔH-TΔS로서 주어지고, 여기서 ΔH는 엔탈피이고, ΔS는 엔트로피이며, 단위는 각각 kcal/mol 및 kcal/mol K이다. 하기 파라미터 값을 표 2에서의 값의 계산에 사용하였다: 온도=50℃, [Na+] = 0.2 M, [Mg++] = 0 M, 가닥 농도 = 10 μM. 비 프로브-표적 혼성화에 대한 가장 큰 T.는 23.9℃이고, 가장 큰 2차 구조 T.는 38.1℃이다. 이들 값 둘 다는 이들이 표적-프로브 상호작용을 방해할 것으로 예상되지 않는 sbMM 표적-프로브 Tm 충분히 미만이다.
표 4 . 표 3 서열에 대한 결합 에너지 및 용융 온도.
Figure pct00035
온도의 함수로서 속도 반응을 측정하기 위해, 형광 표지된 표적을 먼저 고온 (70℃)에서 겔 내로 주사하고, 일정한 전기장 하에서 겔의 화상화 영역 내로 유도하였다. 주사된 밴드가 가시적이 되었으면, 스프레더 플레이트의 온도를 55℃로 강하시켰다. 온도를 0.5℃/분의 속도로 40℃에서 70℃로 감소시키면서 25 V/cm의 전기장을 겔 카세트에 적용하였다. 겔의 화상을 20초마다 취하였다. 랩뷰(LabView)® (내셔널 인스트루먼츠(National Instruments), 미국 텍사스주 오스틴)에 기록된 화상 프로세싱 소프트웨어를 사용하여 각각의 화상에서 밴드의 중심의 위치를 결정하고, 이어서 이 위치 데이터를 사용하여 속도를 계산하였다.
도 11은 온도의 함수로서 표적 DNA 이동성의 플롯을 나타낸다. 표 3에 나타내어진 프로브 및 표적 서열에 대한 ΔG의 값을 사용하여, 속도 대 온도 곡선을 방정식 [23]에 피팅하여 2개의 자유 파라미터를 결정하였다: 혼성화 반응의 동역학에 의존하는 이동성 μ 0, 및 β a 상수.
도 11에 나타내어진 데이터의 핏은 상기 제시된 이동의 이론과 양호한 일치를 나타낸다. 미스매치 이동성에 대한 데이터는 좌측의 곡선으로서 나타내어지고, 완벽한 매치 이동성에 대한 데이터는 우측의 곡선으로서 나타내어진다. PM 핏 및 MM 핏에 대한 R2 값은 각각 0.99551 및 0.99539였다. 완벽한 매치 및 단일 염기 미스매치 표적 사이의 분리는 완벽한 매치 표적의 포커싱 속도가 미스매칭된 표적의 그것보다 유의하게 더 큰 작동 온도가 있어, 도 4에 예시된 바와 같은 DC 바이어스 장의 적용을 통해 2개의 종의 분리를 가능하게 함을 지지한다.
실시예 2.0 - 친화성 SCODA를 사용한 분자의 선택적 분리
10 μM 아크리다이트 변형된 프로브 올리고 (인테그레이티드 디엔에이 테크놀로지스(Integrated DNA Technologies), www.idtdna.com)를 함유하는 4% 폴리아크릴아미드 겔을 겔 카세트에서 캐스팅하여 친화성 매트릭스를 제공하였다.
등몰량의 완벽한 매치 및 단일 염기 미스매치 표적을 둘 다의 표적 분자가 겔 완충제 계면에서 초기에 포획되고 고정화되도록 겔을 가로질러 적용된 100 V/cm의 전기장으로 30℃에서 친화성 겔 내로 주사하였다. 이어서 온도를 70℃로 증가시키고, 20 V/cm의 일정한 전기장을 겔에 적용하여 표적을 겔의 화상화 영역 내로 이동시켰다. 이어서 온도를 62℃로 강하시키고, 표 2에 나타내어진 바와 같이 8 V/cm DC 바이어스 위에 겹쳐진 108 V/cm SCODA 포커싱 장을 5초의 주기로 4개의 소스 전극에 적용하였다. SCODA 포커싱 장의 회전 방향을 주기마다 변경시켰다.
표 5 . 포커싱 더하기 적용된 바이어스 포텐셜
Figure pct00036
도 12는 2분마다 취해진 농도의 화상을 나타낸다. 완벽한 매치 표적은 6-FAM으로 태그부착되며 녹색으로 나타내어지고 (기밀한 스폿에 포커싱하는 리딩 밝은 스폿), 미스매치 표적은 Cy5로 태그부착되며 적색으로 나타내어진다 (겔로부터 세척되는 트레일링 밝은 선). 카메라 게인을 최초 화상을 취한 후 녹색 채널 상에서 감소시켰다. DNA를 겔의 우측 내로 주사하고, 포커싱 더하기 바이어스 장을 적용하였다. 완벽한 매치 표적 (녹색)은 도 10A에 나타내어진 것과 유사한 드리프트 속도를 경험하고, 중심 포커스 위치를 향해 이동한다. 보다 약하게 포커싱하는 미스매치 표적 (적색)은 도 10B에 나타내어진 것과 유사한 속도 장을 경험하고, 바이어스 장에 의해 겔의 연부로부터 밀려난다. 적용된 세척 장의 적용의 방향은 백색 화살표에 의해 지시된다.
이 실험은 도 10A 및 10B의 예측을 확인하며, 이는 단지 단일 염기에 의해 상이한 2개의 DNA 표적에 대한 2가지 상이한 속도 프로파일을 생성하여 겔에 대한 보다 높은 결합 에너지를 갖는 표적의 우선적 포커싱을 가능하게 하는 것이 가능함을 입증한다. 도 12에서의 화상은 SCODA 포커싱 장 및 DC 바이어스 둘 다의 적용 하에서 친화성 매트릭스를 통해 이동하는 표적 DNA의 2개의 상이한 서열에 대해 생성된 2개의 특유의 속도 프로파일이 있음을 확인시켜 준다. 분산성 속도 장은 단일 염기 미스매치 표적에 대해 생성되고, 비 분산성 속도 장은 완벽한 매치 표적에 대해 생성된다. 이 실시예는 샘플에 매우 과량의 미스매치 표적이 있는 경우에도, 단일 염기 특이성을 갖는 표적에 대해 효율적으로 풍부화하고, 임의로 친화성 매트릭스로부터 비-목적하는 표적을 세척하는 것이 가능함을 입증한다.
실시예 3.0 - 작동 조건의 최적화
SCODA 프로세스의 상이한 파라미터는 합리적인 수율로 양호한 샘플 풍부화를 달성하도록 최척화될 수 있다. 겔에 고정화된 (및 음으로 하전된) DNA를 갖는 실시양태에서, 상대적으로 높은 염도 실행 완충제는 효율적이고 안정한 포커싱 둘 다를 제공할 뿐만 아니라, 인접한 샘플 챔버로부터 SCODA 겔 내로 표적 DNA를 동전기적으로 주사하는데 요구되는 시간을 최소화하는 것으로 밝혀졌다.
실시예 3.1 - 완충제 염도의 최적화
친화성 겔에서 분자의 온도 의존적 이동성을 측정하는 초기 시도 뿐만 아니라 서열 특이적 SCODA의 최초 입증을 전기영동적 SCODA에 사용되는 완충제에서 수행하였다. 이들은 전형적으로 표준 전기영동 완충제, 예컨대 겔 전도도를 감소시키기 위해 종종 4 내지 6배 희석되어, 줄 가열에 의해 부과된 열 제한 내의 높은 전기장의 적용을 가능하게 하여, 보다 짧은 농축 시간을 발생시키는 트리스-보레이트 EDTA (TBE)이다. 1X TBE 완충제 (89 mM 트리스, 89 mM 붕산, 2 mM 디나트륨 EDTA)에서 서열 특이적 SCODA 기반 농축을 달성하는 것이 가능하지만, 조건은 1X TBE 완충제에서 평형에서 해리된 이온의 상대적으로 낮은 농도로 인해 서열 특이적 SCODA의 성능에 대해 추가로 최적화될 수 있다. 해리된 이온의 낮은 농도는 느린 혼성화 동역학을 발생시키고, 겔에서 고정화 전하 (올리고뉴클레오티드 프로브)와 연관된 이온 고갈을 악화시키고, 겔 내로 표적 DNA를 동전기적으로 주사하는데 요구되는 시간을 증가시킨다. 붕산에 대해 9.24의 pKa 및 트리스에 대해 8.3의 pKa를 갖는 89 mM 트리스 염기 및 89 mM 붕산을 사용한 계산은 1X TBE 완충제에서 해리된 트리스 및 해리된 붕산의 각각 1.49 mM의 농도를 나타낸다.
실시예 3.2 - DNA 혼성화에 대한 염 농도의 효과
핵산을 분리하는데 사용되는 실시양태에서, 양성 카운터 이온의 존재는 핵산의 음으로 하전된 상보적 가닥의 정전기적 반발을 차폐하여, 증가된 혼성화의 속도를 발생시킨다. 예를 들어, Na+ 이온의 농도를 증가시키는 것은 DNA 혼성화의 속도에 비-선형 방식으로 영향을 미치는 것으로 공지되어 있다 (본원에 참조로 포함되는 문헌 [Tsuruoka et al. Optimization of the rate of DNA hybridization and rapid detection of methicillin resistant Staphylococcus aureus DNA using fluorescence polarization. Journal of Biotechnology 1996; 48(3):201-208.] 참조). 혼성화 속도는 [NaCl]이 10 mM에서 1 M의 [NaCl]로 증가되는 경우 약 10배 증가하며, 대부분의 게인은 약 200 mM에 도달하는 시간에 의해 달성된다. 양성 카운터 이온의 낮은 농도, 약 10 mM 미만에서, 혼성화의 속도는 염 농도의 세제곱에 대략 비례하는 염 농도에 보다 강하게 의존적이다6. 이론적 계산은 1X TBE의 총 양성 카운터 이온 농도가 대략 5.5 mM (1.5 mM의 해리된 트리스, 및 디나트륨 EDTA로부터의 4 mM의 Na+)임을 시사한다. 이 이온 농도에서, 포커싱을 달성하는 것이 가능하였지만, 느린 혼성화 속도는 약한 포커싱 및 큰 최종 포커스 스폿 크기를 발생시켰다.
느린 혼성화의 속도는 전기장의 변화 및 이동성의 변화 사이의 위상 지연의 증가를 통해 약한 포커싱을 초래할 수 있다. 방정식 [16]은 SCODA 속도를 cos(φ)에 비례하는 것으로서 기재하며, 여기서 φ는 이동성 진동 및 전기장 진동 사이의 위상 지연을 나타낸다. ssSCODA의 경우 위상 지연은 느린 열 반응 뿐만 아니라 느린 혼성화 동역학 둘 다로부터 초래될 수 있다.
이 위상 지연은 보다 느린 포커싱 시간 및 보다 큰 스폿 크기를 발생시키는데, 이는 최종 스폿 크기가 내부 SCODA-유도된 드리프트, 및 외부 확산-유도된 드리프트 사이의 균형이기 때문이다. 보다 빠른 포커싱 시간은 이것이 복합체 혼합물로부터 표적을 풍부화하는 전체 시간을 감소시키는 경향이 있기 때문에 항상 요망된다. 보다 작은 스폿 크기는 그것이 상이한 분자 종 사이를 식별하는 능력을 개선시키기 때문에 또한 요망된다. 상기 논의된 바와 같이, DC 바이어스의 적용 하에서 SCODA 포커싱을 수행하는 경우, 최종 포커스 스폿은 표적의 이동성 및 포커싱의 속도 둘 다에 의존하는 양만큼 중심을 벗어나 이동할 것이며, 이들 둘 다는 표적 및 겔 결합된 프로브 사이의 상호작용의 강도에 의존한다. 따라서, 바이어스 하에서 포커싱하는 경우 2개의 유사한 분자 사이를 식별하는데 요구되는 분리의 양은 최종 포커스 스폿 직경에 의존한다. 보다 작은 스폿 직경은 겔 결합된 프로브에 대한 유사한 친화도를 갖는 2개의 표적 사이를 식별하는 능력을 개선시킬 것이다.
1X TBE 완충제로 달성되는 낮은 혼성화의 속도에서, 신뢰성 있는 포커싱은 단지 100 μM 부근의 프로브 농도로 달성가능하였다. 프로브 농도를 100 μM에서 유지하면서, NaCl의 첨가를 통해 염 농도를 대략 5 mM에서 200 mM로 증가시키는 것은 도 13A 내지 D에 나타내어진 바와 같이 최종 포커스 스폿 크기를 감소시키는 효과를 가졌다. 도 13A 내지 D에서의 모든 화상은 유사한 양의 포커싱 시간 (대략 5분) 후에 취해졌지만, 증가된 염도는 증가된 줄 가열을 발생시켰으며, 이는 200 mM NaCl로 포커싱하는 경우 비등을 방지하기 위해 장 강도의 4배 감소를 요구하였다. 프로브 농도는 도 13A, 13B, 13C 및 13D에서 각각 100 μM, 10 μM, 1 μM, 및 100 μM이다. 도 13A, 13B 및 13C에 사용된 완충제는 0.2 M NaCl을 갖는 1X TB였다. 도 13D에 사용된 완충제는 1X TBE였다. 포커싱은 1X TBE 중 10 μM 및 1 μM 프로브에서 신뢰성 있지 않았으며, 이들 결과는 나타내어지지 않는다. 이 실시예에서 등가의 조건 하에서, 겔에의 200 mM NaCl의 첨가는 또한 100배 더 낮은 프로브 농도에서 상보적 표적의 포커싱을 허용하였다.
방정식 [30]은 포커싱 속도가 전기장 강도에 비례함을 진술하므로, 필적하는 포커싱 시간이 전기장 강도의 4배 감소로 달성된다는 사실은 장 정규화된 포커싱 속도가 높은 염도 조건 하에서 상당히 더 빠름을 시사한다.
포커싱을 위한 총 시간은 200 mM NaCl의 첨가에 의해 감소되지 않았지만, 보다 낮은 전기장 강도에서의 포커싱은 일부 실시양태에서 요망될 수 있는데, 이는 보다 낮은 장 강도가 일부 실시양태에서 친화성 매트릭스에서 일어날 수 있는 비-특이적 전기영동적 SCODA의 정도를 제한할 수 있기 때문이다. 예를 들어, 모든 표적 핵산 분자는 열 구배가 전기영동적 SCODA로 인해 전기장에 의해 확립되는 실시양태에서 서열 특이적 SCODA에 사용된 친화성 겔에서의 그들의 서열과 무관하에 포커싱할 것이다. 전기영동적 SCODA 포커싱의 속도는 전기장에 따라 증가하며, 따라서 장 강도를 감소시키는 것은 비-특이적 SCODA 포커싱 속도를 감소시키는 효과를 가져서, DC 바이어스를 적용함으로써 겔로부터 비-표적 DNA 분자를 보다 용이하게 세척하는 것을 허용할 것이다.
실시예 3.3 - 이온 고갈 및 결합된 전하
이온이 경계에서 고갈되는 (또는 축적되는) 속도는 고정성 증가인 전하의 분율에 따라 증가한다. 1X TBE에서 효율적인 농축을 달성하는데 요구되는 100 μM 프로브 농도는 20 뉴클레오티드 프로브가 사용되는 경우 겔 내의 2 mM의 결합된 음전하를 발생시키며, 이는 겔 내의 용해된 음이온의 총량 (대략 5.5 mM)에 필적한다. 결합된 전하의 이 높은 비율은 일정한 전기장이 주사 동안 및 DC 바이어스 하에서의 SCODA 포커싱 동안 그 자체로서 겔에 걸쳐 놓이는 경우 이온이 고갈되게 되는 겔 내의 영역의 형성을 발생시킬 수 있다.
따라서, 높은 염도 실행 완충제는 보다 낮은 프로브 농도에서의 포커싱을 가능하게 할 뿐만 아니라, 추가의 유리 전하를 첨가함으로써 결합된 전하의 분율을 감소시킴으로써 ssSCODA 겔에서의 고정화 전하와 연관된 많은 이온 고갈 문제를 최소화하는 것을 도울 수 있다.
실시예 3.4 - 이중 가닥 DNA의 변성
표적 DNA는 그것이 단일 가닥이 아닌 한, 겔 고정화된 프로브와 상호작용하지 않을 것이다. 이중 가닥 DNA로부터 단일 가닥 DNA를 생성하는 가장 간단한 방법은 주사 전에 샘플을 비등시키는 것이다. 이 방법으로의 한 가지 잠재적 문제는 샘플이 주사 전에 재-어닐링하여 프로세스의 수율을 감소시킬 수 있다는 것인데, 이는 재-어닐링된 이중 가닥 표적이 프로브와 상호작용하지 않을 것이고, 바이어스 장에 의해 겔로부터 세척될 수 있기 때문이다. 이론적 계산은 샘플의 복원의 속도가 변성된 단일 가닥 DNA의 농도에 비례할 것임을 나타낸다. 표적 농도 및 샘플 염도가 둘 다 낮게 유지되는 한, 샘플의 복원은 최소화될 수 있다.
복원 및 전체 효율에 대한 표적 농도의 효과를 측정하기 위해, 겔 결합된 프로브에 상보적인 형광 표지된 이중 가닥 PCR 앰플리콘을 약 2 mM NaCl을 함유하는 250 μl 부피로 희석하고, 5분 동안 비등시키고, 이어서 빙조에서 5분 동안 냉각시킴으로써 변성시켰다. 이어서 샘플을 겔 카세트의 샘플 챔버에 정치하고, 포커싱 겔 내로 주사하고, 겔의 중심으로 농축시켰다. 농축이 완결된 후, 최종 포커스 스폿의 형광을 측정하고, 비어 있는 겔 카세트의 중심 내로 수동으로 피펫팅된 동일한 양의 표적의 형광과 비교하였다. 이 실험은 100 ng (2X 1011개의 카피) 및 10 ng (2X 1010개의 카피)의 이중 가닥 PCR 앰플리콘으로 수행되었다. 100 ng 샘플은 40%의 수율을 발생시켰고, 10 ng 샘플은 80%의 수율을 발생시켰다. 이 실시예는 보다 낮은 샘플 DNA 농도가 보다 높은 수율을 발생시킬 것임을 확인시켜 준다.
실시예 3.5 - 위상 지연 유도된 회전
상기 논의된 바와 같이, 전기장 진동 및 이동성 가변성 진동 사이의 위상 지연이 있는 실시양태에서, 회전 성분은 친화성 매트릭스를 통해 이동하는 분자의 속도에 더해질 것이다. 이 문제의 예는 도 14에 나타내어진다. 도 14에 나타내어진 표적은 SCODA 장 하에서 약하게 포커싱하고, 작은 바이어스가 겔로부터 이들을 세척하도록 적용되는 경우, 세척 장 및 SCODA 장에 의해 유도된 회전 속도는 겔의 하부 좌측 코너 부근에서 제로로 합계된다. 이는 긴 세척 시간, 및 극단적인 경우 오염물 단편의 약한 트래핑을 발생시킨다. SCODA 포커싱을 생성하는데 사용된 전기장의 회전의 방향은 화살표 34에 의해 지시된다. 적용된 세척 힘의 방향은 화살표 36에 의해 지시된다.
이 문제를 극복하기 위해, 장 회전의 방향은 주기적으로 변경될 수 있다. 본원에 기재된 다른 실시예에서, 장 회전의 방향은 주기마다 변경되었다. 이는 훨씬 더 깨끗한 세척 및 최소 죽은 구역을 갖는 포커싱을 발생시킨다. 이 스킴은 상기 기재되고, 미스매칭된 표적이 회전 없이 겔로부터 깨끗하게 세척된 실시예인 도 12에 나타내어진 포커스 및 세척 입증 동안 적용되었다. 이들 조건 하에서, 위상 지연으로 인한 감소된 SCODA 포커싱 속도가 있지만, SCODA 속도의 추가의 회전 성분은 없다.
실시예 3.6 - 2차 구조의 효과
표적 DNA에서의 2차 구조는 고정화된 프로브에 대한 표적의 혼성화의 속도를 감소시킬 것이다. 이는 방정식 [16]에 기재된 위상 지연을 증가시킴으로써 포커싱 속도를 감소시키는 효과를 가질 것이다. 2차 구조가 혼성화 속도를 감소시키는 양은 2차 구조의 상세사항에 의존한다. 예를 들어 단순한 헤어핀으로, 줄기 및 루프의 길이 둘 다는 혼성화 속도에 영향을 미친다9. 서열 특이적 SCODA의 대부분의 실제적 적용에 대해, 오염 배경 DNA로부터 단일 염기에 의해 상이한 표적 분자에 대해 풍부화할 것을 요망하는 경우, 표적 및 배경 둘 다는 유사한 2차 구조를 가질 것이다. 이 경우, 표적 및 배경 사이를 식별하는 능력은 영향을 받지 않을 것이고, 단지 전체 프로세스 시간만이 영향을 받을 것이다. 고정화된 프로브 농도 및 전기장 회전 주기를 증가시킴으로써, 감소된 혼성화 속도에 대해 보상할 수 있다.
2차 구조가 표적 분자를 배경 분자로부터 식별하는 능력에 대한 영향을 가질 수 있는 경우가 잠재적으로 있다. 표적 및 배경 사이의 단일 염기 차이는 배경 DNA가 표적에 비해 감소된 2차 구조 및 증가된 혼성화 속도를 갖도록 하는 방식으로 2차 구조에 영향을 미치는 것이 가능하며, 단일 가닥 형태 다형성 (SSCP) 돌연변이 분석에 대한 기초이다. 이 효과는 표적 DNA에 대해 성공적으로 풍부화하는 능력을 감소시키거나 증진시키는 둘 다에 대한 잠재성을 가지며, 2차 구조의 효과를 최소화하기 위해 표적 및 프로브 서열을 디자인하는 경우 주의가 기울여져야 한다. 표적 분자가 선택되었으면, 프로브 위치는 돌연변이 부위 주위에서 이동될 수 있다. 프로브 분자의 길이는 조정될 수 있다. 일부 경우에, 올리고뉴클레오티드는 프로브가 어닐링하여 2차 구조를 추가로 억제하는 영역에 플랭킹된 서열에 혼성화될 수 있다.
실시예 4.0 - 서열 특이적 SCODA 성능의 정량화
DC 바이어스 하에서 포커싱하는 동안 최종 포커스 위치의 길이 의존성이 측정되었고, 200 nt 내지 1000 nt의 길이의 범위의 단편에 대해 길이에 독립적인 것으로 나타났으며; ssSCODA가 모든 표적이 유사한 길이의 것임을 보장할 필요 없이 서열 단독에 의해 핵산 표적을 구별할 수 있음을 암시하는 중요한 결과이다. 측정은 단지 단일 염기에 의해 표적으로부터 상이한 오염 서열을 거부하면서 표적 서열에 대해 풍부화하는 능력, 및 오염 배경 DNA 분자에 관하여 단지 단일 메틸화된 시토신 잔기에 의해 상이한 표적 DNA에 대해 풍부화하는 능력을 확인시켜 주었다.
실시예 4.1 - 포커싱의 길이 독립성
단편 길이와 무관하게 서열 단독에 기반하여 핵산을 정제하는 능력은 모든 표적 단편이 풍부화 전에 유사한 길이의 것임을 보장할 필요를 제거한다. 상기 제시된 서열 특이적 SCODA의 이론은 서열 특이적 SCODA 풍부화가 표적 길이에 독립적일 것으로 예측한다. 그러나, 상기 모델링되지 않은 효과는 길이 의존성을 초래할 수 있으며, 따라서 서열 특이적 SCODA의 길이 독립성을 확인하기 위한 실험을 수행하였다.
상기 개발된 열적으로 유도된 서열 특이적 SCODA의 이론에 따르면, 바이어스 하에서의 최종 포커스 위치는 표적 가닥의 길이에 의존하지 않아야 한다. 최종 포커스 위치의 길이 의존성은 표적의 비방해된 이동성 μ 0의 길이 의존성을 통해 이 표현 내로 들어간다. 그러나, μ(Tm) 및 a 둘 다는 μ 0에 비례하기 때문에, 길이 의존성은 이 표현으로부터 취소될 것이다. 따라서, 열적으로 유도된 ssSCODA로 농축된 표적의 최종 포커스 위치는 바이어스가 존재하는 경우에도 표적의 길이에 의존하지 않아야 한다.
또한 고려되어야 하는, 상기 모델링되지 않은 최종 포커스 위치에서의 길이 의존성의 2가지 잠재적 근원이 있다: 온도 구배가 전기장에 의해 확립되는 실시양태에서의 전기영동적 SCODA, 및 프로브 표적 두가닥의 힘 기반 해리. 충분한 길이 (>200개의 뉴클레오티드)의 DNA 표적은 서열 특이적 SCODA에 사용되는 폴리아크릴아미드 겔에서 장 의존적 이동성을 갖고, 따라서 포커싱 장이 겔에 적용되는 경우 서열 독립적 포커싱 힘을 경험할 것이다. 따라서, 표적 분자에 의해 경험된 총 포커싱 힘은 전기영동적 SCODA 및 서열 특이적 SCODA로부터의 기여의 합계일 것이다. 전기영동적 SCODA 하에서, 포커싱 속도는 보다 긴 분자에 대해 증가하는 경향이 있는 반면, DC 속도는 바이어스 하에서 최종 포커스 위치가 길이에 의존하도록 감소하는 경향이 있다. 최종 포커스 위치에서의 길이 의존성의 제2 잠재적 근원은 힘 기반 해리이다. 상기 제시된 친화성 SCODA의 이론은 프로브-표적 해리가 열 여기에 의해 배타적으로 유도되었음을 가정하였다. 그러나, 적용된 힘으로 이중 가닥 DNA를 해리시키는 것이 가능하다. 구체적으로, 표적 가닥의 하전된 백본 상에 잡아당겨진 외부 전기장은 프로브-표적 두가닥을 해리시키는데 사용될 수 있다. 적용된 전기장은 방정식 [22]에서 자유 에너지 항 ΔG를 전기장을 통해 이동하는 하전된 분자에 의해 획득된 에너지와 동등한 양만큼 감소시키는 경향이 있을 것이다. 이 힘은 표적 DNA의 길이에 비례할 것인데, 이는 보다 긴 표적 분자에 대해 잡아당기는 전기장에 대해 존재하는 보다 많은 전하가 있을 것이고, 따라서 주어진 전기장 강도에 대해 해리의 속도는 표적의 길이에 따라 증가할 것이기 때문이다.
이러한 2가지 효과가 최종 포커스 위치의 길이 의존성에 유의하게 기여하는지 여부를 측정하기 위해, 각각 겔 고정화된 프로브에 상보적인 서열을 함유하는 표적 DNA의 2개의 상이한 길이를 바이어스 하에서 포커싱하고, 최종 포커스 위치를 측정하고 비교하였다. 표적 DNA를 표 3에서의 프로브 서열에 상보적인 서열을 함유하는 pUC19의 영역의 PCR 증폭에 의해 생성하였다. 2가지 반응을 공통적인 정방향 프라이머로 수행하고, 역방향 프라이머를 250 bp 앰플리콘 및 1000 bp 앰플리콘을 생성하도록 선택하였다. 정방향 프라이머를 250 bp 및 1000 bp 단편에 대해 각각 6-FAM 및 Cy5로 형광 표지하였다. 표적을 친화성 겔 내로 주사하고, 중심으로 포커싱한 후 바이어스 장을 적용하였다. 10 V/cm의 바이어스 장을 120 V/cm 포커싱 장 위에 10분 동안 겹치고, 이 시점에서 바이어스를 추가의 7분 동안 20 V/cm로 증가시켰다. 겔의 화상을 6-FAM 채널 및 Cy5 채널 사이에 1초 지연으로 20초마다 취하였다. 장 회전 주기는 5초였다. 화상을 후 프로세싱하여 각각의 단편의 포커스 위치를 결정하였다. 도 15A 및 15B는 250 bp (녹색) 및 1000 bp (적색) 단편에 대한 포커스 위치 대 시간을 나타낸다. 도 15B는 실험의 종료시 2개의 단편의 최종 포커스의 화상이다.
2개의 화상이 SCODA 사이클에서 동일한 위상에서 취해지지 않았다는 사실에 기인할 수 있는 최종 위치의 작은 차이가 있다. 이 실시예는 최종 포커스 위치가 길이에 의존하지 않음을 나타낸다. 따라서, 이들 작동 조건 하에서 전기영동적 SCODA 포커싱은 친화성 SCODA 포커싱보다 훨씬 더 약하고, 그 친화성 SCODA는 힘-기반 해리라기 보다는 대부분 열 해리에 의해 유도된다. 이 결과는 친화성 SCODA가 모든 표적이 유사한 길이의 것임을 보장할 필요 없이 서열 단독에 의해 핵산 표적을 구별할 수 있음을 확인시켜 준다.
실시예 4.2 - 단일 염기 미스매치 거부 비
단일 염기에 의해 상이한 서열의 거부에 관하여 ssSCODA의 특이성을 입증하기 위해, 겔 결합된 프로브에 대한 완벽한 매치 (PM) 또는 단일 염기 미스매치 (sbMM) 중 어느 하나를 함유하는 상이한 비의 합성 100 nt 표적 DNA를 친화성 겔 내로 주사하였다. DC 세척 장의 존재 하에서의 SCODA 포커싱을 수행하여 과량의 sbMM DNA를 제거하였다. PM 표적 서열을 6-FAM으로 및 sbMM을 Cy5로 표지하고; sbMM 표적을 겔로부터 세척한 후, 포커스 위치에서의 형광의 양을 각각의 염료에 대해 정량화하고, 보정 실행과 비교하였다. 보정 실행을 위해, 등몰량의 6-FAM 표지된 PM 및 Cy5 표지된 PM 표적 DNA를 겔의 중심으로 포커싱하고, 포커스 위치에서의 형광 신호를 각각의 채널 상에서 정량화하였다. 따라서, 이 보정 동안 측정된 신호 Cy5 채널 대 6-FAM 채널 상의 신호의 비는 2가지 염료 분자가 등몰 농도로 존재하는 경우의 신호 비이다. 과량의 sbMM을 겔로부터 세척한 후의 형광 비를 보정 실행과 비교함으로써, 세척에 의해 겔로부터 거부된 sbMM DNA의 양을 결정하는 것이 가능하였다.
표 3에 나타내어진 표적 서열을 함유하는 샘플을 샘플 챔버에 첨가하고, 50 V/cm의 전기장을 45℃에서 샘플 챔버에 걸쳐 적용하여 샘플을 10 μM의 고정화된 프로브를 함유하는 겔 내로 주사하였다. 샘플이 겔 내로 주사되었으면, 샘플 챔버 중의 액체를 깨끗한 완충제로 대체하고, SCODA 포커싱을 겹쳐진 DC 세척 장으로 수행하였다. 60 V/cm의 포커싱 장을 7 V/cm의 DC 세척 장과 조합하고, 후자를 주사 장의 반대 방향에서 적용하였다. 세척 장에 대한 이 방향은 가장 짧은 양의 시간에서 미스매칭된 표적 DNA의 완전한 거부를 초래하였음이 밝혀졌다. 하기 표 6은 각각의 실험에 대한 겔 내로 주사된 DNA의 양을 나타낸다.
표 6 단일 염기 차이에 관한 친화성 SCODA의 거부 비를 측정하기 위한 표적 실행의 목록.
Figure pct00037
미스매칭된 표적이 겔로부터 세척된 후, 포커싱 장을 끄고, 겔의 온도를 25℃로 감소시킨 후, 정량화를 위해 겔의 화상을 취하였다. 정량화에 사용된 모든 화상이 동일한 온도에서 취해짐을 보장하는 것이 중요하였는데, 이는 Cy5 형광이 매우 온도 의존적이며, 형광이 보다 높은 온도에서 감소하기 때문이다. Cy5 및 6-FAM 채널 상의 형광의 비를 1:1 보정 실행과 비교하여 각각의 실행에 대한 거부 비를 결정하였다. 도 16A 및 16B는 이들 실험의 결과를 나타낸다. sbMM:PM의 4가지 상이한 비를 겔 내로 주사하고, 바이어스 하에서 포커싱하여 과량의 sbMM을 제거하였다. PM DNA를 6-FAM으로 태그부착하고, sbMM DNA를 Cy5로 태그부착하였다. 도 16A는 과량의 sbMM DNA가 겔로부터 세척된 후 최종 포커스 스폿으로부터의 형광 신호를 나타낸다. 형광 신호는 PM-FAM:PMCy5 DNA의 1:1 비가 주사되고, 겔의 중심으로 포커싱된 초기 보정 실행에 대해 측정된 형광에 대해 정규화된다. 도 16B는 sbMM:PM의 초기 비를 세척 후의 최종 비로 나눔으로써 계산된 거부 비를 나타낸다.
약 10,000배의 거부 비가 달성됨이 밝혀졌다. 그러나, 높은 sbMM:PM 비에서 포커싱 및 세척 동안 취해진 화상은 2개의 독특한 속도 프로파일을 갖는 sbMM 분자가 있었음을 시사함이 주목되어야 한다. 대부분의 미스매치 표적은 겔로부터 깨끗하게 세척된 반면, 소량은 포커스에서 포획되었다. Cy5 채널 상에 가시적인 이들 최종 포커스 스폿은 그들에게 PM 서열을 제공한 단일 염기 치환 오류로 부정확하게 합성된 Cy5 표지된 표적으로 이루어졌을 가능성이 있다. 여기서 측정된 10,000:1 거부 비는 단일 염기 치환에 관한 올리고뉴클레오티드 합성 오류율의 추정치에 상응하며, 이는 IDT에 의해 합성된 미스매치 분자가 10,000개의 완벽한 매치 분자에서 대략 1부를 함유할 가능성이 있음을 의미한다. 이는 비분해된 미스매치라기 보다는 Cy5 채널 상에서 검출된 잔류 형광이 사실 미스매치 샘플로부터 풍부화된 Cy5 표지된 완벽한 매치일 수 있음을 암시한다. 결과적으로 ssSCODA의 거부 비는 실제로 10,000:1 초과일 수 있다.
실시예 4.3 - 임상적으로 관련된 돌연변이에 대한 돌연변이 풍부화
상기 실시예에 사용된 합성 올리고뉴클레오티드는 완벽한 매치-프로브 두가닥 및 미스매치-프로브 두가닥 사이의 결합 에너지의 차이를 최대화하도록 의도적으로 디자인되었다. 생물학적으로 관련된 서열에 대해 풍부화하는 친화성 SCODA의 능력은 또한 입증되었다. 이 실시예에서, cDNA를 EZH2 유전자의 야생형 버전 또는 이전에 B-세포 비-호지킨 림프종에 연루된 것으로 나타난 Y641N 돌연변이체 중 어느 하나를 함유한 세포주로부터 단리하였다. 돌연변이 부위를 함유한 EZH2 cDNA의 460 bp 영역을 농축 및 세척 동안 가시화될 수 있는 형광 태그부착된 표적 분자를 생성하기 위해 형광 프라이머를 사용하여 PCR 증폭시켰다. 60℃에서 돌연변이체-프로브 두가닥 및 야생형-프로브 두가닥 사이의 결합 에너지의 차이는 이전의 실시예에서 사용된 합성 올리고뉴클레오티드에 대한 3.8 kcal/mol에 비해 2.6 kcal/mol이었다. 이는 야생형에 비해 돌연변이체에 대한 5.2℃의 용융 온도 차이에 상응한다. 표 7은 프로브 서열에 대한 야생형 및 돌연변이체에 대한 혼성화의 자유 에너지 및 용융 온도를 나타낸다.
표 7 겔 결합된 프로브에 대한 EZH2 표적의 결합 에너지 및 용융 온도
Figure pct00038
2개의 대립유전자의 1:1 혼합물을 함께 혼합하고, 친화성 SCODA로 분리하였다. 30 ng의 각각의 표적 앰플리콘을 300 μl의 0.01X 서열 특이적 SCODA 실행 완충제에 첨가하였다. 표적 용액을 비등 수조에 5분 동안 침지시키고, 이어서 5분 동안 빙조에 정치시킨 후, 이중 가닥 표적을 변성시키기 위해 겔 카세트 상으로 로딩하였다. 샘플을 55℃에서 7분 동안 4 mA의 주사 전류로 주사하였다. 주사되면, 10 V/cm DC 바이어스를 갖는 150 V/cm의 포커싱 장을 55℃에서 20분 동안 적용하였다.
이 실험의 결과는 도 17A, 17B 및 17C에 나타내어진다. 이들 서열의 거동은 상기 실시예에서 나타내어진 보다 높은 Tm 차이 서열과 정성적으로 유사하다. 야생형 (미스매치) 표적은 겔로부터 완전히 세척된 반면 (도면의 우측의 화상), 돌연변이체 (완벽한 매치)는 겔의 중심을 향해 유도된다 (도면의 좌측의 화상). 이 경우, 포커싱의 효율은 재-어닐링된 표적의 일부가 재-어닐링하여 겔 결합된 프로브와 상호작용하지 않은 이중 가닥 DNA를 형성함에 따라 감소되었다.
사용된 광학 시스템으로의 검출의 하한은 단독으로 표지된 460 bp DNA의 대략 10 ng이었다.
실시예 5.0 - 메틸화 풍부화
유사한 결합 에너지를 갖는 분자에 대해 선택적으로 풍부화하는 친화성 SCODA 기반 정제의 능력은 동일한 서열을 갖는 메틸화된 및 비메틸화된 표적의 혼합된 집단에서 메틸화된 DNA에 대해 풍부화함으로써 입증되었다.
표 3에 제시된 서열 (서열식별번호: 2)을 갖는 형광 태그부착된 PM 올리고뉴클레오티드를 포획 프로브 영역 내의 단일 메틸화된 시토신 잔기 (표 3의 PM 서열에서 잔기 50)로 IDT에 의해 합성하였다. 메틸화된 및 비메틸화된 PM 가닥 둘 다의 DC 이동성 측정을 수행하여 상기 기재된 바와 같은 속도 대 온도 곡선을 생성하였으며; 이 곡선은 도 18에 나타내어진다.
방정식 [23]에의 이들 곡선의 피팅은 결합 에너지의 차이가 69℃에서 대략 0.19 kcal/mol임을 시사하며, 이는 열 에너지 FN1의 약 1/3이다. 곡선은 2개의 표적의 분리가 2개의 단편이 도 19에 나타내어진 바와 같이 이동성의 가장 큰 차이를 갖는 대략 69℃의 작동 온도에서 가장 효과적일 것임을 추가로 시사한다. 이 실시예에서, 이 차이의 최대 값은 69.5℃에서이며, 이는 DC 바이어스의 적용 하에서 SCODA 포커싱을 수행하는 동안 최대 분리에 대한 온도이며, 69℃에서 kbT=0.65 kcal/mol이다.
이 온도는 상기 실시예에서 사용된 것보다 약간 더 높으며, 이는 보다 양호한 식별을 발생시킬 것이지만, 포커스 시간은 더 긴데, 이는 보다 높은 온도가 겔을 비등시키지 않고 작동시킬 수 있는 최대 전기장 강도를 제한하기 때문이다.
초기 포커싱 시험은 겹쳐진 DC 바이어스를 갖는 친화성 SCODA 포커싱을 수행함으로써 2개의 표적을 분리하는 것이 가능함을 나타내었다. 도 20은 69℃에서 75 V/cm의 포커싱 장 강도 및 14 V/cm의 바이어스에서 5초의 주기로 포커싱된, 등몰 비의 메틸화된 및 비메틸화된 표적이 겔 내로 주사된 실험의 결과를 나타낸다. 메틸화된 표적을 6-FAM으로 표지하고 (녹색, 우측의 스폿), 비메틸화된 표적을 Cy5로 표지하였다 (적색, 좌측의 스폿). 실험을 스위칭된 염료로 반복하였고, 동일한 결과를 가졌다.
비메틸화된 표적을 겔로부터 완전히 세척함으로써 풍부화를 달성하는 것은 상기 실시예에 대해 동일한 겔 기하학을 사용하여 곤란한 것으로 입증되었는데, 이는 겔 완충제 계면이 완충제 웰에 의해 불명료해져 비메틸화된 표적을 겔로부터 세척하려고 시도하는 동안 가시적 피드백의 사용이 DC 바이어스 장을 제어하는 것을 방지하였기 때문이다. 이 문제를 극복하기 위해, 겔을 2단계로 캐스팅하였다: 먼저 프로브 올리고뉴클레오티드 없는 겔을 겔의 아암 중 하나에서 캐스팅하고, 제1 겔이 중합되었으면, 겔 영역의 나머지를 프로브 올리고뉴클레오티드를 함유하는 겔로 충전하였다. 겔을 둘 사이의 계면이 형광 화상화 시스템으로 가시적이도록 캐스팅하였다. 이 시스템은 비메틸화된 표적이 고정화된 프로브 없는 겔로 들어가고, 겔로부터 빠르게 세척되는 반면, 메틸화된 표적은 포커싱 겔에 보유될 수 있도록 바이어스 전압에서 실시간 조정을 허용하였다. 도 21A 내지 21D는 이 실험의 결과를 나타낸다. 도 21A 및 21B는 10 pmol 비메틸화된 DNA (도 21A) 및 0.1 pmol 메틸화된 DNA (도 21B)에 대해 비메틸화된 표적을 겔로부터 세척하기 전의 초기 포커스의 결과를 나타낸다. 도 21C 및 21D는 비메틸화된 서열이 각각 비메틸화된 및 메틸화된 표적에 대해 겔로부터 세척된 후에 수행된 제2 포커싱의 결과를 나타낸다. 모든 화상은 동일한 게인 및 셔터 설정으로 취해졌다.
이 실험에서, 100배 과량의 비메틸화된 표적이 겔 내로 주사되었고, 적용된 임의의 세척 장 없이 중심으로 포커싱되었다. 이어서 표적을 바이어스 장으로 포커싱하여 비메틸화된 표적을 제거하고, 마지막으로 형광 정량화를 위해 겔의 중심으로 다시 포커싱하였다. 이들 화상의 형광 정량화는 풍부화 인자가 102배였으며, 세척 동안 메틸화된 표적의 소실이 20%임을 지시한다. 이 실험을 스와핑된 염료 분자 (메틸화된 Cy5 및 비메틸화된 6-FAM)로 반복하였으며, 유사한 결과를 가졌다.
실시예 6.0 - 다중화된 친화성 SCODA
상기 기재된 2개의 상이한 올리고뉴클레오티드 프로브, 즉, EZH2에 대한 친화도를 갖는 하나 및 pUC에 대한 친화도를 갖는 하나를 각각 10 μM의 농도에서 겔에서 캐스팅하여 2개의 상이한 고정화된 프로브를 함유하는 친화성 매트릭스를 제공하였다. EZH2 프로브에 대한 친화도 및 62.3℃의 이론적 용융 온도를 갖는 100 뉴클레오티드 표적 서열을 Cy5로 표지하였다. pUC 프로브에 대한 친화도 및 70.1℃의 이론적 용융 온도를 갖는 100 뉴클레오티드 표적 서열을 FAM으로 표지하였다. 2개의 표적 분자 사이의 용융 온도의 이론적 차이는 7.8℃이다.
표적 분자를 친화성 겔 상에 로딩하고 (도 22A), 포커싱을 55℃에서 유지된 겔 보트 밑의 온도로 수행하였다 (도 22B, 2분 후의 포커싱, 및 22C, 4분 후). EZH2 표적은 이들 조건 하에서 포커싱한 반면 (4개의 적색 스폿), pUC 표적은 이들 조건 하에서 단지 약하게 포커싱하였다 (겔 상에 가시적인 3개의 분산성 녹색 스폿). 중심 추출 웰은 이 실험의 초기 부분 동안 완충제를 함유하지 않았으며, 이는 단일 중심 포커스 스폿이라기 보다는 4개의 포커스 스폿의 생성을 발생시켰다. 이어서 겔 밑의 온도를 7℃의 온도 증가인 62℃로 증가시켰으며 (도 22D, 온도 증가 후 2분에서의 포커싱, 및 22E, 4분 후), 이는 pUC 표적에 대한 4개의 투명한 포커스 스폿의 형성을 발생시켰다. EZH2 표적은 이 보다 높은 온도에서 4개의 기밀한 스폿에서 포커싱되어 잔류하였다.
겔 밑의 온도를 55℃로 감소시키고, 완충제를 중심 추출 웰에 첨가하였다. 이 온도에서의 SCODA 포커싱 장의 적용은 중심 추출 웰 내로 선택적으로 농축된 EZH2 표적을 발생시킨 반면 (도 22F, 0.5분, 및 22G, 1분의 중심에서 가시적인 분산성 적색 스폿), pUC 표적은 중심 추출 웰의 외부의 4개의 스폿에서 크게 포커싱되어 잔류하였다. 겔 밑의 온도를 7℃의 온도 증가인 62℃로 증가시켰다. 2분 내에, pUC 표적은 중심 추출 웰 내로 포커싱되었다 (도 22H, 겔의 중심에서 가시적인 분산성 적색 및 녹색 형광).
제2 실험을 제1 실험과 유사한 조건 하에서 수행하였다. 상기 기재된 바와 같이 55℃에서 EZH2 표적 및 62℃에서 pUC 표적을 포커싱한 후, DC 세척 바이어스를 겔 밑의 온도를 55℃에서 유지하면서 겔에 적용하였다. 이들 조건 하에서, EZH2 표적은 pUC 표적보다 더 큰 바이어스 속도를 경험하였다. EZH2 표적에 대한 포커스 스폿은 바이어스 장의 적용 후 보다 빠르게 이동하였다 (도 22I, 바이어스 장의 적용 후 6분, 22J, 12분 후, 및 22K, 18분 후에서 겔의 우측으로 이동하는 적색 스폿). EZH2 표적에 대한 포커스 스폿은 또한 겔 내에서 우측으로 더 먼 거리로 이동되었다. 대조적으로, pUC 표적에 대한 포커스 스폿은 보다 천천히 이동하였으며 (6분 후 도 22I에서 여전히 크게 가시적인 초기 녹색 포커스 스폿, 도 22J, 12분 및 22K, 18분을 통해 우측으로 이동함), 세척 바이어스에 의해 EZH2 표적에 대한 포커스 스폿만큼 멀리 우측으로 이동되지 않았다.
친화성 SCODA 수율 대 순도
친화성 SCODA는 오염물에 대한 분산성 장을 생성하면서, 표적 분자에 대한 비-분산성 속도 장을 생성하기 위해 표적 및 프로브 사이의 반복된 상호작용에 의존하기 때문에 (세척 바이어스가 적용되는 한), 높은 특이성은 수율을 희생시키지 않고 달성될 수 있다. 최종 포커스 스폿이 확산에 대해 균형된 방사상 속도 장에 대한 스폿 크기를 계산함으로써 정당화되는 가우스적이라고 가정하는 경우, 스폿은 모든 길을 겔의 연부로 연장할 것이다. 여기서 확산은 표적을 복원 포커싱 힘이 없는 겔 밖으로 유도할 것이고, 적용된 DC 바이어스는 표적을 겔로부터 쓸어버릴 것이고, 여기서 이들은 소실될 것이다. 이 방식으로, ssSCODA에 대한 소실은 세척 장을 적용하는 시간의 양에 따라 규모화될 수 있지만; 도 13A 내지 13D를 생성하는데 사용된 화상은 그 실시예에서 포커스 스폿이 300 μm의 전체 폭 절반 최대 (FWHM)를 갖고, 바이어스 하에서 이는 겔 중심으로부터 대략 1.0 mm에 있음을 지시한다. 포커스 스폿에서 10 fmol의 표적이 있다고 가정되는 경우, 바이어스가 적용되는 겔의 연부에서의 농도는 1e-352 M이며; 겔의 연부에 존재하는 본질적으로 제로 표적 분자가 있고, 여기서 이들은 DC 바이어스 하에서 소실될 수 있다. 이는 소실이 적용된 바이어스로 인해 축적되는 속도 (즉, 세척 단계)가 본질적으로 제로임을 암시한다. 목적하는 표적이 다른 방식으로, 예를 들어 주사 전에 샘플 웰에 흡착시키거나, 주사 동안 겔의 연부를 흘러넘치게 하거나, 포커싱 전에 또는 동안 (이중 가닥 표적 분자의 경우), 또는 추출 동안 재-어닐링함으로써 시스템으로부터 소실될 수 있지만, 모든 이들 소실은 정제된 표적의 순도로부터 분리된다.
실시예 7.0 - 샘플 제조 장치의 사용
본 개시내용의 자동화 샘플 제조 장치를 사용하여 인간 혈액으로부터 추출된 DNA의 샘플을 제조하였다.
샘플 제조 장치는 유체공학 모듈 (연동 펌핑 시스템을 포함함), 온도 제어 모듈 (온도 및 기계적 정확성을 제공하기 위해), 사용자가 임의의 프로세스-특이적 파라미터 (예를 들어, 핵산의 목적하는 크기의 범위, 표적 분자 포획을 위한 상동성의 목적하는 정도 등)를 선택하는 것을 허용하는 장치 상의 터치 스크린 인터페이스, 및 사용자가 본 개시내용의 샘플 제조 카트리지를 삽입하기 위해 개방할 수 있는 뚜껑을 포함하였다. 장치는 1000-볼트 전극 공급으로 전력공급되었다. 샘플 제조 카트리지는 13개의 별개의 미세유체 채널 (또는 펌핑 레인)을 포함하였으며, 그것이 종단간 샘플 제조를 수행할 수 있도록 제작되었다. 미세유체 채널은 자동화 연속으로 가능한 시약 및 카트리지를 제조하도록 디자인되었다: (1) 용해+용해 완충제를 사용한 조합된 샘플 용해의 피펫 도입 및 표적 DNA의 후속 추출; (2) DNA 정제; (3) 트랜스포사제 Tn5를 사용한 DNA 태그부착, 이어서 DNA 복구; (4) 핵산 포획 프로브 및 SCODA를 사용한 특정 크기 범위의 DNA 단편의 선택; 및 (5) DNA 세정.
100 μL의 전체 인간 혈액을 용해 완충제와 혼합하고, 프로테이나제 K를 55℃에서 10분 동안 인큐베이션하고, 이어서 이소프로판올과 혼합하고; 용해물 혼합물을 이어서 샘플 제조 카트리지 중의 샘플 포트에 첨가하고, 로딩된 카트리지를 샘플 제조 장치 내로 삽입하고, DNA를 추출하였다. 상기 기재된 바와 같은 자동화 장치는 1.2 μg 추출된 DNA를 생성하였으며; 1 μg의 그 추출된 DNA를 상기 기재된 연속적 단계를 사용하여 추가로 프로세싱하여 6.5 nM의 농도에서 530 ng의 DNA 라이브러리를 생성하였다. 이어서 샘플 제조 장치에 의해 생산된 이 정제된 DNA 라이브러리를 유리 서열분석 칩을 사용하여 서열분석으로 처리하였다.
대조 실험으로서, 100 μL의 전체 인간 혈액 (상기와 동일한 샘플로부터)을 수동으로 프로세싱하여 전통적인 DNA 추출 및 정제 기술을 사용한 서열분석을 위한 DNA 라이브러리를 생성하였다.
본 발명자들은 자동화 샘플 제조 장치를 사용하여 제조된 DNA 라이브러리를 사용하여 획득된 서열분석 데이터가 전통적인 DNA 추출 및 정제 기술을 사용하여 수동으로 제조된 DNA를 사용하여 획득된 서열분석 데이터에 비해 품질에 있어서 (예를 들어, 평균 판독물 길이에 의해 평가된 바와 같이) 유사하였음을 밝혀내었다. 표 8에 나타내어진 바와 같이, 자동화 장치는 수동 프로세스보다 더 많은 총 판독물 (수동 프로세스를 사용하여 27개의 총 판독물에 비해 자동화 프로세스를 사용하여 72개의 총 판독물) 및 더 큰 판독물 길이 (수동 프로세스를 사용하여 1132.1 ± 324.5 염기 쌍 판독물 길이에 비해 자동화 프로세스를 사용하여 1989.0 ± 760.1 염기 쌍 판독물 길이)를 생성하였으며, 생성된 판독물의 정확도 및 GC 함량의 관점에서 프로세스 사이에 관찰된 유의한 차이는 없었다.
표 8. 전체 인간 혈액으로부터 생성된 DNA 라이브러리로부터의 서열분석 결과
Figure pct00039
실시예 8.0 - 서열분석을 위한 DNA를 풍부화하기 위한 샘플 제조 장치의 사용
본 개시내용의 자동화 샘플 제조 장치를 사용하여, 배양된 이. 콜라이 세포로부터 추출된 DNA의 샘플을 제조하였다.
샘플 제조 장치는 유체공학 모듈 (연동 펌핑 시스템을 포함함), 온도 제어 모듈 (온도 및 기계적 정확성을 제공하기 위해), 사용자가 임의의 프로세스-특이적 파라미터 (예를 들어, 핵산의 목적하는 크기의 범위, 표적 분자 포획을 위한 상동성의 목적하는 정도 등)를 선택하는 것을 허용하는 장치 상의 터치 스크린 인터페이스, 및 사용자가 본 개시내용의 샘플 제조 카트리지를 삽입하기 위해 개방할 수 있는 뚜껑을 포함하였다. 장치는 1000-볼트 전극 공급으로 전력공급되었다. 샘플 제조 카트리지는 13개의 별개의 미세유체 채널 (또는 펌핑 레인)을 포함하였으며, 그것이 종단간 샘플 제조를 수행할 수 있도록 제작되었다. 미세유체 채널은 자동화 연속으로 가능한 시약 및 카트리지를 제조하도록 디자인되었다: (1) 조합된 샘플 + 용해 완충제의 피펫 도입 및 표적 DNA의 후속 추출; (2) DNA 정제; (3) 트랜스포사제 Tn5를 사용한 DNA 태그부착, 이어서 DNA 복구; (4) SCODA를 사용한 특정 크기 범위의 DNA 단편의 선택; 및 (5) DNA 세정.
용해 완충제 및 프로테이나제 K와 혼합된 밤샘 배양물로부터의 7억개의 이. 콜라이 세포의 샘플을 55℃에서 10분 동안 인큐베이션하고, 이어서 이소프로판올과 혼합하고; 용해물 혼합물을 샘플 제조 카트리지 중의 샘플 포트에 첨가하고, 로딩된 카트리지를 샘플 제조 장치 내로 삽입하고, DNA를 추출하였다. 자동화 프로세싱을 계속하여 DNA를 서열분석을 위해 준비된 DNA 라이브러리 내로, DNA 복구 단계 직전에 사용자가 DNA 복구 효소 및 DNA 복구 완충제 믹스를 카트리지에 첨가하도록 짧은 휴식을 갖고 제공하였다. 자동화 장치는 DNA 복구 효소 및 DNA 복구 완충제 믹스를 카트리지 중의 반응 위치에 수송하였다. 상기 기재된 바와 같은 자동화 장치는 0.96 μg 추출된 DNA를 생성하였으며; 후속 자동화 단계는 2.89 nM의 농도에서 279 ng의 DNA 라이브러리를 생성하였다.
대조 실험으로서, 7억개의 이. 콜라이 세포의 샘플 (상기와 동일한 샘플로부터)을 수동으로 프로세싱하여 전통적인 DNA 추출 및 정제 기술을 사용하여 DNA를 생성하였다. 이 수동으로 제조된 DNA를 자동화 장치 상에서 동일한 자동화 라이브러리 제조 프로세스로 처리하여 2.65 nM의 농도에서 199 ng의 DNA 라이브러리를 생성하였다.
샘플 제조 장치에 의해 생산된 정제된 DNA 라이브러리를 얼라인(Aline) 비드를 사용하여 농축시키고, 이어서 퍼시픽 바이오사이언시스(Pacific Biosciences)® RSII DNA 서열분석기 상에서 서열분석으로 처리하였다.
본 발명자들은 정제된 DNA를 사용하여 획득되고 자동화 샘플 제조 장치를 사용하여 라이브러리 형식으로 제조된 서열분석 데이터가 전통적인 DNA 추출 및 정제 기술, 이어서 자동화 DNA 라이브러리 제조로 수동으로 제조된 DNA를 사용하여 획득된 서열분석 데이터에 비해 길이에 있어서 약간 더 짧지만, 품질에 있어서 (Rsq 점수에 의해 평가된 바와 같이) 유사한 서열분석 판독물을 생성하였음을 밝혀내었다 (도 25).
표 9에 나타내어진 바와 같이, 완전히 자동화 라이브러리는 수동 DNA 추출로 생성된 것들과 동일한 판독물 품질 (Rsq 0.82)을 갖는 판독물을 생성하였으며, 대략 등가의 판독물 길이 (851 염기 평균 판독물 길이 대 수동에 대해 922)를 가졌다.
표 9. 동일한 자동화 장치 상에서 실행된 자동화 샘플 제조 장치를 통해 추출되고 정제된 이. 콜라이 세포로부터 생성된 DNA 라이브러리 대 수동으로 추출되고 정제된 DNA로부터의 서열분석 결과.
Figure pct00040
실시예 9.0 - 서열분석을 위한 DNA를 풍부화하기 위한 샘플 제조 장치의 사용
본 개시내용의 자동화 샘플 제조 장치를 사용하여 이. 콜라이 배양된 세포로부터 수동으로 제조된 DNA 라이브러리에 대해 SCODA를 사용하여 특정 크기 범위의 DNA 단편을 선택하였다.
4 마이크로그램의 수동으로 정제된 이. 콜라이 DNA를 Tn5a 태그부착으로 처리하고, 이어서 각각 1 μg으로 이루어진 4개의 별개의 샘플로 분할하였다. 특정 크기의 DNA 단편의 선택을 4가지 상이한 방법, (1) 3 kb 내지 10kb의 크기의 단편을 수집하는 프로그램을 갖는 세이지 블루피핀, (2) 4 kb 내지 10 kb보다 크기가 더 큰 단편을 수집하는 프로그램을 갖는 세이지 블루피핀, (3) 0.45x 비드 첨가를 갖는 수동 얼라인 비드 크기 선택, 또는 (4) 자동화 샘플 제조 장치에서와 같은 SCODA 기술 (실시예 8.0에 기재됨)에 의해 별개로 수행하였다.
크기 선택 후, 각각의 샘플을 DNA 라이브러리 내로 별개로 제조하고, 퍼시픽 바이오사이언시스® RSII DNA 서열분석기 상에서 서열분석하였다.
본 발명자들은 자동화 샘플 제조 장치를 사용한 DNA 라이브러리 크기 선택을 사용하여 획득된 서열분석 데이터가 표준 수동 비드-기반 프로세스 또는 자동화 세이지 블루피핀 크기 선택 방법에 의해 크기에 대해 선택된 DNA 라이브러리를 복제하는데 우수하거나 등가였음을 밝혀내었다 (도 26).
표 10 (하기)에 나타내어진 바와 같이, 자동화 장치는 수동 크기 선택 프로세스보다 더 긴 및 블루피핀 방법과 등가의 판독물 길이를 생성하였으며, 생성된 판독물의 정확도 및 GC 함량의 관점에서 프로세스 사이에 관찰된 유의한 차이는 없었다.
표 10. 상업적 및 수동 방법에 의해 선택된 샘플 크기로부터 유래된 것들에 비해 자동화 크기 선택에서 생성된 DNA 라이브러리로부터의 서열분석 계량치
Figure pct00041
추가의 실시양태
본 발명의 실시양태는 매질, 예컨대 겔 및 다른 매트릭스를 통한 입자, 예컨대 핵산, 단백질 및 다른 분자의 유도된 운동에 관한 것이다. 일부 실시양태는 관심의 입자를 선택적으로 정제하고/거나, 분리하고/거나, 농축시키고/거나, 검출하기 위한 방법 및 기구를 제공한다. 일부 실시양태는 관심의 차등적으로 변형된 입자를 선택적으로 정제하고/거나, 분리하고/거나, 농축시키고/거나, 검출하기 위한 방법 및 기구를 제공한다. 일부 실시양태는 차등적으로 메틸화된 DNA를 선택적으로 정제하고/거나, 분리하고/거나, 농축시키고/거나, 검출하기 위한 방법 및 기구를 제공한다. 일부 실시양태는 후성유전학, 종양학, 또는 의학의 다양한 분야와 같은 분야에 사용된다. 일부 실시양태는 태아 유전적 장애, 암 또는 암, 기관 부전, 질환 상태, 감염 등의 위험을 지시하는 바이오마커를 검출하는데 사용된다.
하기 실시양태 및 그의 측면은 예시적이고 실례적인 것으로 의미되고, 범위에 있어서 제한적이지 않은 시스템, 도구 및 방법과 함께 기재되고 예시된다. 다양한 실시양태에서, 상기 기재된 문제 중 하나 이상은 감소되거나 제거된 반면, 다른 실시양태는 다른 개선에 관한 것이다.
한 실시양태는 생물학적 샘플로부터 관심의 분자를 농축시키는 방법을 제공한다. 생물학적 샘플은 대상체로부터 얻어지고, 친화성 매트릭스 상에 로딩된다. 친화성 매트릭스는 관심의 분자에 대한 제1 결합 친화도 및 생물학적 샘플 중의 다른 분자의 적어도 일부에 대한 제2 결합 친화도를 갖는 고정화된 친화성 작용제를 갖는다. 제1 결합 친화도는 제2 결합 친화도보다 더 높다. 친화성 SCODA는 관심의 분자를 포커스 스폿 내로 선택적으로 농축시키기 위해 수행되고, 여기서 포커스 스폿에서의 관심의 분자의 농축은 생물학적 샘플 중의 다른 분자의 농축에 비해 증가된다. 분자는 핵산일 수 있다. 관심의 분자는 생물학적 샘플 중의 다른 분자의 적어도 일부와 동일한 서열을 가질 수 있다. 관심의 분자는 생물학적 샘플 중의 다른 분자의 적어도 일부와 비교하여 차등적으로 변형될 수 있다. 관심의 분자는 생물학적 샘플 중의 다른 분자의 적어도 일부와 비교하여 차등적으로 메틸화될 수 있다. 생물학적 샘플은 모체 혈장일 수 있고, 관심의 분자는 모체 DNA와 비교하여 차등적으로 메틸화된 태아 DNA일 수 있다. 생물학적 샘플은 조직 샘플일 수 있고, 관심의 분자는 건강한 대상체에서의 유전자와 비교하여 차등적으로 메틸화된 암에 연루된 유전자일 수 있다.
한 실시양태는 샘플에서 제2 분자로부터 제1 분자를 분리하는 방법을 제공한다. 제1 및 제2 분자에 결합하는 고정화된 프로브를 갖는 친화성 매트릭스가 제공된다. 제1 분자 및 프로브 사이의 결합 에너지는 제2 분자 및 프로브 사이의 결합 에너지보다 더 크다. 프로브에 대한 제1 및 제2 분자의 친화도를 변경시키는 이동성 변경 장인 공간적 구배는 친화성 매트릭스 내에서 제공된다. 친화성 매트릭스 내의 분자의 운동을 실행하는 구동 장이 적용된다. 공간적 구배 및 구동 장 둘 다의 배향은 포커스 스폿을 향한 제1 분자의 순 운동을 실행하도록 시간 경과에 따라 가변한다. 세척 장은 친화성 매트릭스를 통한 제1 및 제2 분자 둘 다의 순 운동을 실행하도록 적용되고 위치된다. 제1 및 제2 분자는 핵산일 수 있다. 제1 및 제2 분자는 차등적으로 변형될 수 있다. 제1 및 제2 분자는 차등적으로 메틸화될 수 있다. 제1 분자는 태아 DNA일 수 있고, 제2 분자는 태아 DNA와 동일한 서열을 갖지만 태아 DNA와 비교하여 차등적으로 메틸화된 모체 DNA일 수 있다. 제1 분자 및 제2 분자는 암에 연루된 유전자일 수 있고, 제1 분자는 제2 분자와 비교하여 차등적으로 메틸화될 수 있다.
한 실시양태는 제1 및 제2 차등적으로 메틸화된 핵산 분자를 분리하기 위한 시간-가변성 이동성 변경 장과 조합으로 시간-가변성 구동 장의 용도를 제공하고, 여기서 제1 및 제2 핵산 분자는 동일한 DNA 서열을 갖는다. 시간-가변성 구동 장 및 시간-가변성 이동성 변경 장은 상기 DNA 서열에 적어도 부분적으로 상보적인 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함하는 매트릭스에 적용된다. 제1 핵산 분자는 올리고뉴클레오티드 프로브에 대한 제1 결합 에너지를 갖고, 제2 핵산 분자는 올리고뉴클레오티드 프로브에 대한 제2 결합 에너지를 갖고, 제1 결합 에너지는 제2 결합 에너지보다 더 높다. 제1 핵산 분자는 태아 DNA일 수 있고, 제2 핵산 분자는 모체 DNA일 수 있고, 제1 및 제2 핵산 분자는 모체 혈액의 샘플로부터 얻어질 수 있다. 제1 및 제2 핵산 분자는 태아 장애에 연루된 유전자일 수 있다. 제1 및 제2 분자는 암에 연루된 유전자의 차등적으로 메틸화된 형태일 수 있다. 제1 및 제2 분자는 대상체의 조직 샘플로부터 얻어질 수 있다. 한 실시양태는 대상체에서 바이오마커의 존재를 검출하기 위한 드랙 변경의 동기 계수 (SCODA)의 용도를 제공한다.
본 발명의 추가의 측면
상기 기재된 예시적인 실시양태 및 실시예의 측면은 다양한 조합 및 하위조합으로 조합되어 본 발명의 추가의 실시양태를 생성할 수 있다. 상기 기재된 예시적인 실시양태 및 실시예의 측면이 상호 배타적이지 않은 정도까지, 모든 이러한 조합 및 하위조합은 본 발명의 범위 내인 것으로 의도된다. 본 발명의 실시양태는 다수의 측면을 포함함이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 따라서, 청구항의 범위는 설명 및 실시예에 제시된 바람직한 실시양태에 의해 제한되지 않아야 하며, 전체로서 설명과 일치하는 가장 넓은 해석이 주어져야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> Quantum-Si Incorporated <120> SYSTEMS AND METHODS FOR SAMPLE PREPARATION <130> R0708.70068WO00 <140> Not Yet Assigned <141> Concurrently Herewith <150> US 63/101,213 <151> 2019-10-29 <160> 3 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 1 actggccgtc gttttact 18 <210> 2 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 2 cgattaagtt gagtaacgcc actattttca cagtcataac catgtaaaac gacggccagt 60 gaattagcga tgcatacctt gggatcctct agaatgtacc 100 <210> 3 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 3 cgattaagtt gagtaacgcc actattttca cagtcataac catgtaaaac tacggccagt 60 gaattagcga tgcatacctt gggatcctct agaatgtacc 100

Claims (63)

  1. 생물학적 샘플로부터 표적 분자를 풍부화하기 위한 장치이며, 제거가능한 카트리지를 수용하도록 구성된 카트리지 하우징을 포함하는 자동화 샘플 제조 모듈을 포함하는 장치.
  2. 제1항에 있어서, 제거가능한 카트리지가 단일-사용 카트리지 또는 다중-사용 카트리지인 장치.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 제거가능한 카트리지가 생물학적 샘플을 수용하도록 구성된 것인 장치.
  4. 제3항에 있어서, 제거가능한 카트리지가 생물학적 샘플을 추가로 포함하는 것인 장치.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 카트리지가 샘플 제조 프로세스에 사용되는 유체를 함유하고/거나 수송하도록 구성된 1개 이상의 미세유체 채널을 포함하는 것인 장치.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 카트리지가 1개 이상의 친화성 매트릭스를 포함하고, 각각의 친화성 매트릭스가 표적 분자에 대한 결합 친화도를 갖는 고정화된 포획 프로브를 포함하는 것인 장치.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 샘플이 혈액, 타액, 가래, 대변, 소변 또는 협측 스왑 샘플인 장치.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 분자가 표적 핵산인 장치.
  9. 제8항에 있어서, 표적 핵산이 RNA 또는 DNA 분자인 장치.
  10. 제3항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 고정화된 포획 프로브가 올리고뉴클레오티드 포획 프로브이고, 올리고뉴클레오티드 포획 프로브가 표적 핵산에 적어도 부분적으로 상보적인 서열을 포함하는 것인 장치.
  11. 제10항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 포획 프로브가 표적 핵산에 적어도 80%, 90% 95%, 또는 100% 상보적인 서열을 포함하는 것인 장치.
  12. 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 장치가 대조군 방법을 사용하여 생성된 평균 판독물-길이보다 더 긴 하류 서열분석 적용을 위한 평균 판독물-길이를 갖는 표적 핵산을 생산하는 것인 장치.
  13. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 분자가 표적 단백질인 장치.
  14. 제1항 내지 제7항 및 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 고정화된 포획 프로브가 표적 단백질에 결합하는 단백질 포획 프로브인 장치.
  15. 제13항에 있어서, 단백질 포획 프로브가 압타머 또는 항체인 장치.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 단백질 포획 프로브가 10-9 내지 10-8 M, 10-8 내지 10-7 M, 10-7 내지 10-6 M, 10-6 내지 10-5 M, 10-5 내지 10-4 M, 10-4 내지 10-3 M, 또는 10-3 내지 10-2 M의 결합 친화도로 표적 단백질에 결합하는 것인 장치.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 장치가 서열분석 모듈을 추가로 포함하는 것인 장치.
  18. 제17항에 있어서, 자동화 샘플 제조 모듈이 서열분석 모듈에 직접적으로 또는 간접적으로 연결된 것인 장치.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 장치가 표적 분자를 자동화 샘플 제조 모듈로부터 서열분석 모듈로 전달하도록 구성된 것인 장치.
  20. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 서열분석 모듈이 핵산 서열분석을 수행하는 것인 장치.
  21. 제20항에 있어서, 핵산 서열분석이 단일-분자 실시간 서열분석, 합성에 의한 서열분석, 라이게이션에 의한 서열분석, 나노포어 서열분석, 및/또는 생거(Sanger) 서열분석을 포함하는 것인 장치.
  22. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 서열분석 모듈이 폴리펩티드 서열분석을 수행하는 것인 장치.
  23. 제22항에 있어서, 폴리펩티드 서열분석이 에드만 분해 또는 질량 분광법을 포함하는 것인 장치.
  24. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 서열분석 모듈이 단일-분자 폴리펩티드 서열분석을 수행하는 것인 장치.
  25. 생물학적 샘플로부터 표적 분자를 정제하는 방법이며,
    (i) 생물학적 샘플을 용해시키는 단계;
    (ii) (i)의 용해된 샘플을 단편화하는 단계; 및
    (iii) 표적 분자에 대한 결합 친화도를 갖는 고정화된 포획 프로브를 포함하는 친화성 매트릭스를 사용하여 샘플을 풍부화하고,
    그에 의해 표적 분자를 정제하는 단계
    를 포함하는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 표적 분자가 분자이고 표적 핵산인 방법.
  27. 제26항에 있어서, 표적 핵산이 RNA 또는 DNA 분자인 방법.
  28. 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 고정화된 포획 프로브가 올리고뉴클레오티드 포획 프로브이고, 올리고뉴클레오티드 포획 프로브가 표적 핵산에 적어도 부분적으로 상보적인 서열을 포함하는 것인 방법.
  29. 제28항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 포획 프로브가 표적 핵산에 적어도 80%, 90% 95%, 또는 100% 상보적인 서열을 포함하는 것인 방법.
  30. 제28항에 있어서, 표적 분자가 표적 단백질인 방법.
  31. 제25항 또는 제30항에 있어서, 고정화된 포획 프로브가 표적 단백질에 결합하는 단백질 포획 프로브인 방법.
  32. 제31항에 있어서, 단백질 포획 프로브가 압타머 또는 항체인 방법.
  33. 제31항 또는 제32항에 있어서, 단백질 포획 프로브가 10-9 내지 10-8 M, 10-8 내지 10-7 M, 10-7 내지 10-6 M, 10-6 내지 10-5 M, 10-5 내지 10-4 M, 10-4 내지 10-3 M, 또는 10-3 내지 10-2 M의 결합 친화도로 표적 단백질에 결합하는 것인 방법.
  34. 제25항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (i)이 전해적 방법, 효소적 방법, 세정제-기반 방법, 및/또는 기계적 균질화를 포함하는 것인 방법.
  35. 제25항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (i)이 연속적으로 수행되는 다중 용해 방법을 포함하는 것인 방법.
  36. 제25항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플이 용해 후에 및 단계 (ii) 또는 (iii) 전에 정제되는 것인 방법.
  37. 제25항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (ii)가 기계적, 화학적 및/또는 효소적 단편화 방법을 포함하는 것인 방법.
  38. 제25항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플이 단편화 후에 및 단계 (iii) 전에 정제되는 것인 방법.
  39. 제25항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (iii)이 전기영동적 방법을 사용한 풍부화를 포함하는 것인 방법.
  40. 제39항에 있어서, 전기영동적 방법이 친화성 SCODA, FIGE, 또는 PFGE인 방법.
  41. 제25항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서,
    (iv) 표적 분자를 검출하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  42. 제41항에 있어서, 단계 (iv)가 흡광도, 형광, 질량 분광법, 및/또는 서열분석 방법을 사용한 검출을 포함하는 것인 방법.
  43. 제25항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 샘플이 혈액, 타액, 가래, 대변, 소변 또는 협측 샘플인 방법.
  44. 제25항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 샘플이 인간, 비-인간 영장류, 설치류, 개, 고양이, 또는 말로부터의 것인 방법.
  45. 제25항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 샘플이 박테리아 세포 또는 박테리아 세포의 집단을 포함하는 것인 방법.
  46. 자동화 샘플 제조 모듈을 포함하는, 생물학적 샘플로부터 표적 분자를 풍부화하기 위한 장치이며, 여기서 자동화 샘플 제조 모듈은 하기 단계를 수행하는 것인 장치:
    (i) 생물학적 샘플을 수용하는 단계
    (ii) 생물학적 샘플을 용해시키는 단계;
    (iii) (ii)의 샘플을 단편화하는 단계; 및
    (iv) 표적 분자에 대한 결합 친화도를 갖는 고정화된 포획 프로브를 포함하는 친화성 매트릭스를 사용하여 샘플을 풍부화하는 단계.
  47. 제46항에 있어서, 표적 분자가 분자이고 표적 핵산인 장치.
  48. 제46항에 있어서, 표적 핵산이 RNA 또는 DNA 분자인 장치.
  49. 제46항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 고정화된 포획 프로브가 올리고뉴클레오티드 포획 프로브이고, 올리고뉴클레오티드 포획 프로브가 표적 핵산에 적어도 부분적으로 상보적인 서열을 포함하는 것인 장치.
  50. 제49항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 포획 프로브가 표적 핵산에 적어도 80%, 90% 95%, 또는 100% 상보적인 서열을 포함하는 것인 장치.
  51. 제46항에 있어서, 표적 분자가 표적 단백질인 장치.
  52. 제46항 또는 제51항에 있어서, 고정화된 포획 프로브가 표적 단백질에 결합하는 단백질 포획 프로브인 장치.
  53. 제52항에 있어서, 단백질 포획 프로브가 압타머 또는 항체인 장치.
  54. 제52항 또는 제53항에 있어서, 단백질 포획 프로브가 10-9 내지 10-8 M, 10-8 내지 10-7 M, 10-7 내지 10-6 M, 10-6 내지 10-5 M, 10-5 내지 10-4 M, 10-4 내지 10-3 M, 또는 10-3 내지 10-2 M의 결합 친화도로 표적 단백질에 결합하는 것인 장치.
  55. 제46항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 장치가 서열분석 모듈을 추가로 포함하는 것인 장치.
  56. 제55항에 있어서, 자동화 샘플 제조 모듈이 서열분석 모듈에 직접적으로 연결되거나 간접적으로 연결된 것인 장치.
  57. 제55항 또는 제56항에 있어서, 장치가 표적 분자를 자동화 샘플 제조 모듈로부터 서열분석 모듈로 전달하도록 구성된 것인 장치.
  58. 제55항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 서열분석 모듈이 핵산 서열분석을 수행하는 것인 장치.
  59. 제58항에 있어서, 핵산 서열분석이 단일-분자 실시간 서열분석, 합성에 의한 서열분석, 라이게이션에 의한 서열분석, 나노포어 서열분석, 및/또는 생거 서열분석을 포함하는 것인 장치.
  60. 제55항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 서열분석 모듈이 폴리펩티드 서열분석을 수행하는 것인 장치.
  61. 제60항에 있어서, 폴리펩티드 서열분석이 에드만 분해 또는 질량 분광법을 포함하는 것인 장치.
  62. 제55항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 서열분석 모듈이 단일-분자 폴리펩티드 서열분석을 수행하는 것인 장치.
  63. 제55항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 장치가 대조군 방법을 사용하여 생성된 평균 서열분석 판독물-길이보다 더 긴 평균 서열분석 판독물-길이를 갖는 표적 핵산을 생산하는 것인 장치.
KR1020227017593A 2019-10-29 2020-10-28 샘플 제조를 위한 시스템 및 방법 KR20220108773A (ko)

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