CN108026591B - 诊断方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本文提供了用于鉴定遗传相关信息的方法和组合物。本文提供的方法的至少部分可在没有热循环的情况下进行。方法和组合物可以包括诸如核酸聚合酶和引物等试剂。

Description

诊断方法和组合物
背景技术
为了有效地诊断或治疗在受试者的基因中具有突变或罹患病原体感染的受试者，通常需要获得关于该突变或病原体的详细遗传信息。
例如，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)是一类可导致人类感染并且耐受β-内酰胺抗生素的金黄色葡萄球菌(S.aureus)。由于其对某些抗生素的抗性，MRSA感染可能难以治疗。
金黄色葡萄球菌通常通过获得mecA基因而变为耐甲氧西林的。mecA基因通常位于葡萄球菌盒式染色体mec(SCCmec)中，后者是一种多基因、可转移的基因组元件。存在不同类型的SCCmec，已知的SCCmec类型的大小约为21,000-67,000个核苷酸长度。通常，在每种类型的SCCmec中，mecA基因被作为SCCmec的其他组分的其他基因或元件包围。在MRSA细菌中，含有mecA基因的SCCmec被整合至金黄色葡萄球菌染色体中。
为了鉴定和控制MRSA细菌，需要用于MRSA检测的有效试剂及方法。此外，需要用于评估宿主遗传物质中的其他整合基因以及用于评估两种或更多种遗传元件是否在共同分子中的改进试剂和方法。
作为另一实例，在丙型肝炎基因型1a中，在蛋白酶基因中存在多态性位点Q80K，即非结构蛋白3(“NS3”；也称为“p-70”)，其与蛋白酶抑制剂波普瑞韦(boceprevir)的治疗失败相关，否则波普瑞韦可有效阻断病毒中的肽成熟。评估1a亚型患者的NS3基因中的Q80多态性可能是制定治疗方案的重要部分。
因此，需要改进的用于评估Q80多态性的试剂和方法。此外，需要改进的用于评估其他SNP、点突变和其他核苷酸变异的试剂和方法。
援引并入
本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请均通过引用而并入本文，其程度犹如特别地且单独地指出每个单独的出版物、专利或专利申请通过引用而并入。然而，在本公开的内容与本文通过引用并入的文献的内容之间冲突的情况下，以本公开的内容为准。
发明内容
本文提供了与遗传相关信息的鉴定有关的方法和组合物。在实施方式中，提供了用于评估宿主遗传物质中的整合基因的改进试剂和方法。例如，提供了用于MRSA检测的改进试剂和方法。在实施方式中，提供了用于评估至少第一遗传元件和第二遗传元件是否均在共同核酸分子上的改进试剂和方法。在这样的实施方式中，所述第一遗传元件和所述第二遗传元件可在共同核酸分子上彼此被大量的核苷酸隔开。在其他实施方式中，提供了用于评估SNP和点突变的改进试剂和方法。例如，提供了用于评估丙型肝炎NS3基因中的Q80多态性的改进试剂和方法。
在实施方式中，本文提供了一种用于检测共同双链核酸分子上的第一遗传元件和第二遗传元件的方法，该方法包括：在第一扩增反应混合物中进行第一扩增反应，其中该第一扩增反应混合物包含：i)共同双链核酸分子，其中该共同双链核酸分子包含第一链和第二链，以及第一遗传元件和第二遗传元件，其中所述第一遗传元件包含第一遗传元件第一互补序列和第一遗传元件第二互补序列，其中所述第二遗传元件包含第二遗传元件第一互补序列和第二遗传元件第二互补序列，其中所述第一遗传元件第一互补序列和所述第二遗传元件第一互补序列是所述第一链的一部分，并且其中所述第一遗传元件第二互补序列和所述第二遗传元件第二互补序列是所述第二链的一部分；ii)第一扩增反应第一引物，其中该第一扩增反应第一引物具有与所述第一遗传元件第一互补序列互补的核苷酸序列；和iii)第一扩增反应第二引物，其中该第一扩增反应第二引物具有与所述第二遗传元件第二互补序列互补的核苷酸序列，并且其中在所述第一扩增反应混合物中生成第一扩增反应产物，其中该第一扩增反应产物包含所述第一遗传元件的至少一部分和所述第二遗传元件的至少一部分，并且其中该第一扩增反应产物具有双链、线性构型；在连接反应混合物中进行连接反应，其中该连接反应混合物包含i)所述第一扩增反应产物；和ii)连接酶，并且其中在所述连接反应混合物中，由所述第一扩增反应产物形成环状连接产物，其中该环状连接产物是双链的并且包含环状连接产物第一链和环状连接产物第二链，并且其中该环状连接产物第一链包含所述第一扩增反应产物第一链的核苷酸，并且该环状连接产物第二链包含所述第一扩增反应产物第二链的核苷酸；以及在第二扩增反应混合物中进行第二扩增反应，其中该第二扩增反应混合物包含：i)所述环状连接产物；ii)第二扩增反应第一引物，其中该第二扩增反应第一引物具有与所述第一遗传元件第二互补序列互补的核苷酸序列；和iii)第二扩增反应第二引物，其中该第二扩增反应第二引物具有与所述第二遗传元件第一互补序列互补的核苷酸序列，并且其中在所述第二扩增反应混合物中生成第二扩增反应产物，其中该第二扩增反应产物包含所述第一遗传元件的至少一部分和所述第二遗传元件的至少一部分；以及检测所述第二扩增反应产物。任选地，所述方法可进一步包括，在进行所述连接反应之前，将所述第一扩增反应产物与激酶一起温育。
在实施方式中，在本文提供的涉及包含第一遗传元件和第二遗传元件的双链核酸分子的组合物或方法中，所述第一遗传元件和所述第二遗传元件可在所述双链核酸上彼此被至少100、200、500、1000、2000、3000、4000、5000、10,000、15,000、20,000、25,000或30,000个且不多于200、500、1000、2000、3000、4000、5000、10,000、15,000、20,000、25,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000或100,000个核苷酸隔开。
在实施方式中，在本文提供的涉及第一扩增反应的方法或组合物中，所述第一扩增反应可以是PCR扩增反应或非热循环扩增反应。
在实施方式中，在本文提供的涉及第二扩增反应的方法或组合物中，所述第二扩增反应可以是PCR扩增反应或非热循环扩增反应。
在实施方式中，在本文提供的涉及第一引物和第二引物的方法或组合物中，所述第一引物和所述第二引物各自为至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、15、20或25个且不多于5、6、7、8、9、10、11、12、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90或100个核苷酸的长度。
在实施方式中，在本文提供的涉及第一引物和第二引物的方法或组合物中，所述第一扩增反应混合物中的所述第一引物和所述第二引物中的至少一个或两者在所述引物的5’端被磷酸化。
在实施方式中，在本文提供的涉及激酶的方法或组合物中，所述激酶为T4多核苷酸激酶。
在实施方式中，在本文提供的涉及激酶的方法或组合物中，所述连接酶为T4DNA连接酶。
在实施方式中，在本文提供的方法或组合物中涉及第二扩增反应第一引物和第二扩增反应第二引物。
在实施方式中，在本文提供的涉及第二扩增反应第一引物和第二扩增反应第二引物的方法或组合物中，所述第二扩增反应第一引物包含第一区域和第二区域，其中所述第二扩增反应第一引物的第二区域与所述第二遗传元件第一互补序列互补，并且所述第二扩增反应第二引物包含第一区域和第二区域，其中所述第二扩增反应第二引物的第二区域与所述第一遗传元件第二互补序列互补，并且其中所述第二扩增反应第二引物的第一区域与所述第二扩增反应第一引物的第一区域互补。任选地，所述第二扩增反应第二底物的第一区域还与所述环状连接产物的第一链的至少一部分互补。
在实施方式中，在本文提供的涉及第二扩增反应产物的方法或组合物中，所述第二扩增产物在其生成时实时地进行检测。
在实施方式中，在本文提供的涉及第一遗传元件的方法或组合物中，所述第一遗传元件为抗生素抗性基因，如mecA基因。
在实施方式中，在本文提供的涉及第二遗传元件的方法或组合物中，所述第二遗传元件为病原体基因，如来自金黄色葡萄球菌。
在实施方式中，本文提供的方法可进一步包括从受试者获取生物样品，其中来自受试者的生物样品含有共同双链核酸分子或多核苷酸模板。在实施方式中，可从受试者的手指/脚趾获取生物样品。在实施方式中，所述生物样品可具有不超过500、400、300、200、100或50微升的体积。
在实施方式中，在本文提供的涉及来自受试者、含有共同双链核酸分子的生物样品的方法或组合物中，所述样品含有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌生物体中的共同双链核酸分子。
在实施方式中，在本文提供的涉及第一扩增反应、连接反应和第二扩增反应的方法或组合物中，所述第一扩增反应、所述连接反应和所述第二扩增反应均在同一容器中发生。
在实施方式中，在本文提供的涉及第一扩增反应、连接反应和第二扩增反应的方法或组合物中，所述第一扩增反应、所述连接反应和所述第二扩增反应在不同容器中发生。
在实施方式中，在本文提供的涉及连接反应的方法或组合物中，所述连接反应可产生环状连接产物或端对端连接产物中的一种或两者。
在实施方式中，本文提供了一种用于评估在多核苷酸模板中核苷酸序列的感兴趣位置处的核苷酸身份的方法，该方法包括：A)在聚合酶链反应(PCR)扩增反应混合物中生成多核苷酸模板的多个拷贝，其中所述PCR扩增反应混合物包含PCR扩增反应第一引物和PCR扩增反应第二引物，其中在所述PCR扩增反应混合物中，所述PCR扩增反应第一引物与所述多核苷酸模板退火，并且所述PCR第二引物与同所述多核苷酸模板互补的多核苷酸退火，并且其中在所述PCR扩增反应混合物中，形成PCR扩增反应产物的多个拷贝，其中所述PCR扩增反应产物为包含第一链和第二链的双链核酸分子，并且其中所述PCR扩增反应产物的第一链为所述多核苷酸模板的拷贝；B)在至少非热循环第一反应混合物和非热循环第二反应混合物中的每一个中提供步骤A)中生成的PCR扩增反应产物的拷贝，其中：所述多核苷酸模板包含第一部分、第二部分和第三部分，其中所述第三部分位于该多核苷酸模板中所述第一部分与所述第二部分之间，并且其中所述感兴趣位置是在第三位置；所述非热循环第一反应混合物包含所述多核苷酸模板的拷贝、非热循环第一引物和非热循环第二引物，其中：所述非热循环第一引物包含第一区域和第二区域，其中所述第一区域包含该引物的5’端，所述第二区域包含该引物的3’端，并且所述第二区域与所述多核苷酸模板的第一部分互补；所述非热循环第二引物包含第一区域和第二区域，其中所述第一区域包含该引物的5’端，所述第二区域包含该引物的3’端，并且所述第二区域与同所述多核苷酸模板的第二部分互补的序列互补；所述非热循环第一引物的第一区域与所述非热循环第二引物的第一区域互补；并且所述非热循环第二引物的第一区域与所述多核苷酸模板的第三部分互补；所述第二反应混合物包含所述多核苷酸模板的拷贝、非热循环第三引物和非热循环第四引物，其中：所述非热循环第三引物包含第一区域和第二区域，其中所述第一区域包含该引物的5’端，所述第二区域包含该引物的3’端，并且所述第二区域与所述多核苷酸模板的第一部分互补；所述非热循环第四引物包含第一区域和第二区域，其中所述第一区域包含该引物的5’端，所述第二区域包含该引物的3’端，并且所述第二区域与同所述多核苷酸模板的第二部分互补的序列互补；所述非热循环第三引物的第一区域与所述非热循环第四引物的第一区域互补；并且所述非热循环第四引物的第一区域与所述多核苷酸模板的第三部分互补；并且所述非热循环第二引物的第一区域的核苷酸序列与所述非热循环第四引物的第一区域的核苷酸序列有一个核苷酸不同，其中当为了序列的最大互补而用所述多核苷酸模板的第三部分的核苷酸序列定位所述非热循环第二引物或非热循环第四引物的第一区域的核苷酸序列时，在所述非热循环第二引物与非热循环第四引物中不同的核苷酸的位置对应于所述多核苷酸模板中感兴趣的核苷酸的位置；C)在没有热循环的条件下温育所述非热循环第一反应混合物和非热循环第二反应混合物；以及D)比较所述非热循环第一反应混合物中多核苷酸模板的扩增速率或量与所述非热循环第二反应混合物中多核苷酸模板的扩增速率或量，其中所述多核苷酸模板的扩增速率或量指示所述非热循环第二引物或非热循环第四引物的第一区域与所述多核苷酸模板的第三部分的核苷酸序列之间的互补程度。任选地，所述PCR扩增反应第一引物为至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、40、50或60个且不多于10、11、12、13、14、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90或100个核苷酸的长度，并且其中当所述PCR扩增反应第一引物与所述多核苷酸模板退火时，所述PCR扩增反应第一引物的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸根据沃森-克里克(Watson-Crick)碱基配对原则与所述多核苷酸模板上相应的核苷酸错配。任选地，所述PCR扩增反应第二引物为至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、40、50或60个且不多于10、11、12、13、14、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90或100个核苷酸的长度，并且其中当所述PCR扩增反应第二引物与同所述多核苷酸模板互补的多核苷酸退火时，所述PCR扩增反应第二引物的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸根据沃森-克里克碱基配对原则与同所述多核苷酸模板互补的多核苷酸上相应的核苷酸错配。
在实施方式中，在本文提供的涉及多核苷酸模板中核苷酸序列的感兴趣位置的方法或组合物中，所述多核苷酸模板中核苷酸序列的感兴趣位置为SNP。
在实施方式中，本文提供的多核苷酸模板可来自丙型肝炎病毒，任选地，具体来自丙型肝炎NS3基因。在实施方式中，在本文提供的涉及多核苷酸模板中核苷酸序列的感兴趣位置的方法或组合物中，所述多核苷酸模板中核苷酸序列的感兴趣位置是在编码丙型肝炎NS3基因第80位氨基酸的密码子。
在实施方式中，本文提供了一种用于扩增多核苷酸模板的方法，该方法包括：A)在聚合酶链反应(PCR)扩增反应混合物中生成多核苷酸模板的多个拷贝，其中所述PCR扩增反应混合物包含第一PCR扩增反应引物和第二PCR扩增反应引物，其中在所述PCR扩增反应混合物中，所述第一PCR扩增反应引物与所述多核苷酸模板退火，并且所述第二PCR扩增反应引物与同所述多核苷酸模板互补的多核苷酸退火，并且其中在所述PCR扩增反应混合物中，形成PCR扩增反应产物的多个拷贝，其中所述PCR扩增反应产物为包含第一链和第二链的双链核酸分子，并且其中所述PCR扩增反应产物的第一链为多核苷酸模板的拷贝；B)在包含非热循环反应第一引物和非热循环反应第二引物的非热循环反应混合物中温育所述多核苷酸模板的拷贝，其中：所述多核苷酸模板包含第一部分、第二部分和第三部分，其中所述第三部分位于该多核苷酸模板中所述第一部分与所述第二部分之间；所述第一引物包含第一区域和第二区域，其中所述第一引物的第二区域与所述多核苷酸模板的第一部分互补；并且所述第二引物包含第一区域和第二区域，其中所述第二引物的第二区域与所述PCR扩增反应产物第二链中同所述多核苷酸模板的第二部分互补的序列互补，所述第二引物的第一区域与所述第一引物的第一区域互补，并且所述第二引物的第一区域与所述多核苷酸模板的第三部分互补。
在实施方式中，在本文提供的涉及包含第一部分和第二部分的多核苷酸模板的方法或组合物中，所述多核苷酸模板的第一部分和第二部分各自为6至30个核苷酸的长度。
在实施方式中，在本文提供的涉及包含第三部分的多核苷酸模板的方法或组合物中，所述多核苷酸模板的第三部分为4至14个核苷酸的长度。
在实施方式中，在本文提供的涉及在非热循环反应混合物中扩增多核苷酸模板的方法或组合物中，所述非热循环反应混合物中多核苷酸模板的拷贝数在所述方法开始60分钟内增加至少10倍。
在实施方式中，在本文提供的涉及在非热循环反应混合物中扩增多核苷酸模板的方法或组合物中，在所述非热循环反应混合物的温育期间生成包含至少三个拷贝的所述多核苷酸模板的多联体链。
在实施方式中，本文提供了一种容器，其中包含本文所述反应混合物的任何一种或多种组分。
在实施方式中，本文提供了一种试剂盒，其中包含本文所述反应混合物的任何一种或多种组分。任选地，在本文提供的涉及试剂盒的实施方式中，该试剂盒的组分可以在至少两个单独的、流体隔离的器皿之间分配。
附图说明
在附图中：
图1A是示出了本文所提供方法的示例性组分的特征的示意图。
图1B是示出了本文所提供方法的示例性组分的特征的示意图。
图1C是示出了本文所提供方法的示例性组分的特征的示意图。
图1D是示出了本文所提供方法的示例性组分的特征的示意图。
图1E是示出了本文所提供方法的示例性组分的特征的示意图。
图2是本文所提供方法的步骤的一般示意图。
图3是示出了根据本文所提供方法进行的反应的结果的图。
需要注意的是，附图和其中的元件不必要按形状或比例绘制。例如，为便于呈现或使呈现清楚，附图中元件的形状或比例可进行简化或修改。应进一步理解，附图和其中的元件仅用于示例性说明目的，不应理解为以任何方式进行限制。
具体实施方式
本文提供了与遗传相关信息的鉴定有关的方法和组合物。在实施方式中，提供了用于评估宿主遗传物质中的整合基因的改进试剂和方法。例如，提供了用于MRSA检测的改进试剂和方法。在实施方式中，提供了用于评估至少第一遗传元件和第二遗传元件是否均在共同核酸分子上的改进试剂和方法。在这样的实施方式中，第一遗传元件和第二遗传元件可在共同核酸分子上彼此被大量的核苷酸隔开。在其他实施方式中，提供了用于评估SNP和点突变的改进试剂和方法。例如，提供了用于评估丙型肝炎NS3基因中的Q80多态性的改进试剂和方法。本文描述的各个特征可应用于下文阐述的任何特定实施方式，或者可应用于针对或涉及遗传相关信息鉴定的其他任何类型的系统。本文描述的系统和方法可作为独立的系统或方法，或作为集成系统或方法的一部分而应用。应当理解，所公开的系统和方法的不同方面可以单独地、共同地或彼此组合地来理解。
在实施方式中，本文提供了用于MRSA检测的系统、组合物和方法。现有MRSA检测方法通常分开测试样品的mecA基因和来自金黄色葡萄球菌染色体的遗传物质。如果在样品中同时发现了mecA基因和金黄色葡萄球菌遗传物质，则作出存在MRSA的推定结论。然而，这个结论可能不准确，因为mecA基因可能存在于金黄色葡萄球菌外(作为可在生物体之间转移的SCCmec的一部分)。因此，同时含有mecA基因和金黄色葡萄球菌的样品可能实际上不含MRSA细菌；相反，其可能含有非MRSA金黄色葡萄球菌，以及含有mecA基因的不同细菌或游离遗传元件。因此，这种情况可能导致对样品中MRSA的假阳性鉴定。
本文提供的方法和组合物的实施方式解决了上述问题，并且提供了鉴定金黄色葡萄球菌染色体中的mecA基因(因此是真正的MRSA)的方法和组合物。
鉴定金黄色葡萄球菌染色体中的mecA基因的一种途径可以是进行例如聚合酶链反应(PCR)，其中PCR反应将含有可能含有MRSA细菌或MRSA遗传物质的样品，并且其中用于PCR反应的一条引物将与mecA基因的一部分退火，并且用于PCR反应的另一条引物将与金黄色葡萄球菌染色体的一部分退火。如果这样的PCR反应产生了反应产物，则其将表明mecA基因和来自金黄色葡萄球菌染色体的遗传物质在同一DNA链上(因此表明该样品含有真正的MRSA细菌)。然而，通常这种方法是无效的，因为在大多数MRSA细菌中，mecA基因距离金黄色葡萄球菌染色体的遗传物质达数千个核苷酸。这是由于在MRSA中，mecA基因被整合至金黄色葡萄球菌染色体中作为SCCmec的一部分，并且mecA基因通常位于SCCmec的内部部分中，两侧被SCCmec插入物的数千个其他核酸包围。由于传统的PCR(例如使用Taq聚合酶)和许多其他核酸扩增技术在扩增相对较长的核苷酸序列(例如超过3000、4000或5000个核苷酸的长度)时不是很有效，因此在大多数MRSA菌株中mecA基因与金黄色葡萄球菌染色体之间相对较大的核苷酸距离通常导致如上所述的传统PCR反应(例如，其中一条引物与mecA基因的一部分退火而另一条引物与金黄色葡萄球菌染色体的一部分退火)表现不佳。
例如，在Antimicrob.Agents Chemother.2009年12月,vol.53no.12，第4961-4967页，Methods Mol Biol.2014；1085:131-48，和Methods Mol Biol.2007；391:87-102中描述了SCCmec类型，其中每一个均通过引用而整体并入本文以用于所有目的。通常，当存在于金黄色葡萄球菌染色体中时，mecA基因与金黄色葡萄球菌遗传物质相隔数千甚至数万个核苷酸。
在实施方式中，本文提供了用于鉴定已整合到金黄色葡萄球菌染色体中的mecA基因的改进方法和组合物。
在实施方式中，本文提供的方法包括至少两个步骤：1)生成核酸链的步骤，其中mecA基因的至少一部分与金黄色葡萄球菌染色体的至少一部分在该链内彼此物理地紧邻；以及2)采用至少第一引物、第二引物和步骤1)的核酸链进行核酸扩增方法的步骤，其中第一引物与mecA基因的一部分退火并且第二引物与金黄色葡萄球菌染色体的一部分退火，并且其中生成包含mecA基因和金黄色葡萄球菌染色体二者的部分的扩增产物。
本文提供的系统和方法的实施方式可描述如下。可以提供包含含有mecA基因的SCCmec盒的金黄色葡萄球菌染色体或其部分(本文中任选地称为“MRSA染色体”)。MRSA染色体可与第一引物和第二引物一起温育，其中第一引物与mecA基因的一部分(或任选地，SCCmec盒的其他元件)互补，而第二引物与金黄色葡萄球菌染色体的一部分互补。此外，一个或两个引物在5’端被磷酸化。MRSA染色体在第一扩增反应中与具有高持续性的DNA聚合酶一起温育。示例性的具有高持续性的DNA聚合酶是phi29聚合酶。第一扩增反应可以是例如聚合酶链反应(PCR反应)或等温扩增反应。通过使用具有高持续性的DNA聚合酶，可生成至少少量的扩增产物。来自该反应的扩增产物将含有金黄色葡萄球菌和mecA遗传物质，但通常从该扩增反应仅生成少量的扩增物质。由于生成的量少，这种扩增物质通常难以检测。因此，然后将所扩增的物质与DNA连接酶一起温育，由于用于扩增反应的引物5’端上的磷酸基团，该DNA连接酶可将这些扩增产物连接在一起(以链内或链间连接方式)。来自第一扩增反应的扩增物质与连接酶一起温育可产生两种一般类型的连接产物中的一种或两种：a)通过来自第一扩增反应的两种或更多种扩增产物的端对端连接而形成的多联体；或b)通过来自第一扩增反应的扩增产物的一端与同一扩增产物的另一端连接而形成的环化产物。通过这两种类型的连接产物，使得mecA基因与金黄色葡萄球菌遗传物质(例如，与基因attR或orfX)物理地紧邻。因此，在实施方式中，这两种类型的连接产物均为在扩增相对小的扩增子(例如2000个核苷酸或更短)时最有效的核酸扩增方法的合适模板。因此，本文提供的方法的下一步涉及使用一种或两种连接产物进行第二核酸扩增步骤。该第二核酸扩增步骤至少可使用与mecA基因的一部分(或任选地，SCCmec盒的另一部分)退火的第一引物，以及与金黄色葡萄球菌遗传物质退火的第二引物。多种核酸扩增方法可用于第二核酸扩增步骤，如PCR或如2014年9月17日提交的PCT/US14/56151中描述的扩增方法，其通过引用全文并入本文以用于所有目的。在实施方式中，第二核酸扩增步骤的第一引物和第二引物不同于第一核酸扩增步骤的第一引物和第二引物。在实施方式中，第二核酸扩增步骤的第一引物和第二引物与第一核酸扩增步骤的第一引物和第二引物相比具有相反的取向。在实施方式中，第二核酸扩增步骤的第一引物和第二引物与第一核酸扩增步骤的第一引物和第二引物相同。
可参照图1A-1E来描述本文提供的系统和方法的实施方式。在实施方式中，在图1A-1E中描述的以及与图1A-1E相关的组合物和方法在本文中可针对“遗传元件分析”进行描述。可以提供双链核酸分子10。双链核酸分子10包含第一链22和第二链24。
双链核酸10可以是任何合适的形状和构象。例如，尽管图1将双链核酸10描述为线性双链核酸，但双链核酸10可备选地例如是环状双链核酸的部分或全部。环状双链核酸在双链核酸的任一条链上将不会有游离的5’或3’端(由于其环状形状)。另外，双链核酸10可以是整个核酸分子，或者可以仅为较大的双链核酸的一部分。
可从广泛的来源提供双链核酸10。例如，双链核酸10可以在从受试者获得的样品中或者可以由从受试者获得的样品来制备，双链核酸10可直接从培养的微生物获得，或者可化学合成。
在双链核酸10内，可存在一个或多个不同的遗传元件32、34、36、38。例如，在双链核酸10内，可存在至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、100个或更多个不同的遗传元件。如本文所使用的，“遗传元件”是指核酸分子的任何可鉴定的感兴趣区域，诸如基因序列、启动子序列、增强子序列、内含子、外显子等。遗传元件通常含有两个互补序列，其中该遗传元件的一个序列位于第一链22上，该遗传元件的另一个序列位于第二链24上，并且其中第一链22上的元件的序列和第二链24上的元件的序列根据沃森-克里克碱基配对原则(A与T；C与G)互补。通常，第一链上的互补序列和第二链上的互补序列含有相同数目的核苷酸。另外，如本文所使用的，对于任何给定的遗传元件，5’至3’方向的第一链上的元件序列可称为“第一互补序列”，而5’至3’方向的第二链上的该元件序列可称为“第二互补序列”。因此，例如，在双链核酸分子含有例如第一遗传元件、第二遗传元件和第三遗传元件的情况下，可以描述该双链核酸分子的第一链含有“第一遗传元件第一互补序列”、“第二遗传元件第一互补序列”和“第三遗传元件第一互补序列”，其中“第一遗传元件第一互补序列”是第一遗传元件的第一互补序列，“第二遗传元件第一互补序列”是第二遗传元件的第一互补序列，“第三遗传元件第一互补序列”是第三遗传元件的第一互补序列。类似地，可以描述该双链核酸分子的第二链含有“第一遗传元件第二互补序列”、“第二遗传元件第二互补序列”和“第三遗传元件第二互补序列”，其中“第一遗传元件第二互补序列”是第一遗传元件的第二互补序列，“第二遗传元件第二互补序列”是第二遗传元件的第二互补序列，“第三遗传元件第二互补序列”是第三遗传元件的第二互补序列。将序列中任何给定的遗传元件指定为序列中的“第一遗传元件”、“第二遗传元件”或“第三遗传元件”等通常是任意的，并且这些术语可适当地用来指代感兴趣核酸分子上的不同的感兴趣遗传元件(只要该术语一致地用于给定核酸分子上的相同遗传元件即可)。
例如，在图1中，遗传元件32含有第一链32a上的互补序列和第二链32b上的互补序列(在本文中也分别称为“遗传元件32第一互补序列”和“遗传元件32第二互补序列”；该命名体系也可与其他遗传元件一起使用)；第一链32a上的序列和第二链32b上的序列根据沃森-克里克碱基配对原则互补。类似地，遗传元件34含有第一链34a上的互补序列和第二链34b上的互补序列；第一链34a上的序列和第二链34b上的序列根据沃森-克里克碱基配对原则互补。类似地，遗传元件36含有第一链36a上的互补序列和第二链36b上的互补序列；第一链36a上的序列和第二链36b上的序列根据沃森-克里克碱基配对原则互补。类似地，遗传元件38含有第一链38a上的互补序列和第二链38b上的互补序列；第一链38a上的序列和第二链38b上的序列根据沃森-克里克碱基配对原则互补。
为了强调，图1A中的遗传元件32、34、36和38由不同的几何形状(即元件32为矩形，34为三角形，等等)表示。然而，重要的是需要指出，几何形状不提供关于遗传元件的特征的细节(形状仅仅是为了帮助概述图1A-E中呈现的各种概念)。另外，虽然图1A将互补序列32a、34a、36a、38a、32b、34b、36b和38b描绘成与互补序列32a、34a、36a、38a、32b、34b、36b和38b所在的第一链22和第二链24不同的形状，但这些形状仅用于强调，而这些互补序列实际上具有与该链的其余部分相同的结构。
遗传元件可以是任何长度的核苷酸。例如，在实施方式中，遗传元件可以是至少3、4、5、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、200、500、1000、2000或5000个核苷酸的长度。在实施方式中，遗传元件可以含有不多于5、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、200、500、1000、2000、5000或10,000个核苷酸。在实施方式中，遗传元件可以含有至少3、4、5、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、200、500、1000、2000或5000个，并且不多于9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、200、500、1000、2000、5000或10,000个核苷酸。通常，遗传元件的互补序列可视为具有5’端和3’端，其中该互补序列的核苷酸包括该序列的5’端和3’端并位于该序列的5’端和3’端之间。例如，遗传元件的互补序列可具有5’至3’方向的示例性序列：5’TGGA 3’。在该序列中，“T”是该序列5’端的核苷酸，“A”是该序列3’端的核苷酸。
在含有至少第一遗传元件和第二遗传元件的双链核酸分子中，第一遗传元件和第二遗传元件彼此可被任何数目的核苷酸隔开。例如，在含有至少第一遗传元件和第二遗传元件的双链核酸分子中，第一遗传元件和第二遗传元件可以彼此被至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、200、500、1000、2000、5000、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000或100,000个核苷酸，不多于5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、200、500、1000、2000、5000、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000或100,000个核苷酸，或者至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、200、500、1000、2000或5000个，并且不多于5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、200、500、1000、2000、5000、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000或100,000个核苷酸隔开(即，在第一遗传元件与第二遗传元件之间存在前述数目的核苷酸)。在另一实例中，双链核酸分子可以含有至少第一遗传元件和第二遗传元件，并且在该双链核酸分子的第一链上，在第一遗传元件第一互补序列处于第二遗传元件第一互补序列上游的情况下，第一遗传元件第一互补序列的3’端与第二遗传元件第一互补序列的5’端之间可以存在至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、200、500、1000、2000、5000、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000或100,000个核苷酸。在实施方式中，双链核酸分子可以含有至少第一遗传元件和第二遗传元件，并且在该双链核酸分子的第一链上，在第一遗传元件第一互补序列处于第二遗传元件第一互补序列上游的情况下，第一遗传元件第一互补序列的3’端与第二遗传元件第一互补序列的5’端之间可以存在不多于5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、200、500、1000、2000、5000、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000或100,000个核苷酸。在实施方式中，双链核酸分子可以含有至少第一遗传元件和第二遗传元件，并且在该双链核酸分子的第一链上，在第一遗传元件第一互补序列处于第二遗传元件第一互补序列上游的情况下，第一遗传元件第一互补序列的3’端与第二遗传元件第一互补序列的5’端之间可以存在至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、200、500、1000、2000或5000个，并且不多于5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、200、500、1000、2000、5000、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000或100,000个核苷酸。上述陈述对于第一遗传元件第一互补序列处于第二遗传元件第一互补序列下游的情况也同样适用。
类似地，在另一实例中，双链核酸分子可以含有至少第一遗传元件和第二遗传元件，并且在该双链核酸分子的第二链上，在第二遗传元件第二互补序列处于第一遗传元件第二互补序列上游的情况下，第二遗传元件第二互补序列的3’端与第一遗传元件第二互补序列的5’端之间可以存在至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、200、500、1000、2000、5000、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000或100,000个核苷酸。在实施方式中，双链核酸分子可以含有至少第一遗传元件和第二遗传元件，并且在该双链核酸分子的第二链上，在第二遗传元件第二互补序列处于第一遗传元件第二互补序列上游的情况下，第二遗传元件第二互补序列的3’端与第一遗传元件第二互补序列的5’端之间可以存在不多于5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、200、500、1000、2000、5000、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000或100,000个核苷酸。在实施方式中，双链核酸分子可以含有至少第一遗传元件和第二遗传元件，并且在该双链核酸分子的第二链上，在第二遗传元件第二互补序列处于第一遗传元件第二互补序列上游的情况下，第二遗传元件第二互补序列的3’端与第一遗传元件第二互补序列的5’端之间可以存在至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、200、500、1000、2000或5000个，并且不多于5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、200、500、1000、2000、5000、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000或100,000个核苷酸。
在实施方式中，可以进行第一扩增反应以便扩增双链核酸分子10的至少一部分。通常，可能需要确定感兴趣的第一遗传元件和感兴趣的第二遗传元件是否存在于样品中，以及具体地，它们是否为同一双链核酸分子10的一部分。确定感兴趣的第一遗传元件和感兴趣的第二遗传元件是否为同一双链核酸分子的一部分可能是重要的，以便更好地理解例如可能在样品中的病原体的遗传特征。例如，确定特定细菌的特定抗生素抗性菌株是否存在于来自受试者的样品中可能是有意义的，并且这可以通过鉴定例如是否存在既含有抗生素抗性基因(即第一遗传元件)又含有来自特定细菌物种的基因(即第二遗传元件)的双链核酸分子来确定。例如当细菌获得抗生素抗性基因并且该抗生素抗性基因随后整合到该细菌的染色体中时，可以形成这样的双链核酸分子。抗生素抗性基因通常通过编码促进对抗生素或抗生素类别的抗性的蛋白质来提供对特定抗生素或抗生素类别的抗性(例如，该蛋白质促进例如以化学方式使抗生素失活或将抗生素从细菌中排出)。
因此，在进行第一扩增反应以扩增双链核酸分子10的至少一部分时，可能需要生成含有感兴趣的第一遗传元件的至少一部分和感兴趣的第二遗传元件的至少一部分的扩增产物。从扩增反应中成功生成这种扩增产物(即，该扩增产物含有感兴趣的第一遗传元件的至少一部分和感兴趣的第二遗传元件的至少一部分)表明在扩增反应混合物中存在模板双链核酸分子10，其在同一双链核酸分子上含有感兴趣的第一遗传元件和感兴趣的第二遗传元件。来自本文提供的第一核酸扩增的扩增产物在本文中可称为“第一扩增反应产物”。
为了进行可潜在地生成含有第一遗传元件的至少一部分和第二遗传元件的至少一部分的第一核酸扩增产物的第一扩增反应(假定第一扩增反应混合物中存在在同一双链核酸分子上既含有感兴趣的第一遗传元件又含有感兴趣的第二遗传元件的模板双链核酸分子10)，可在第一扩增反应混合物中提供第一引物46和第二引物48(“第一扩增反应第一引物”46和“第一扩增反应第二引物”48)。
第一扩增反应第一引物46可以具有与感兴趣的第一遗传元件36的至少一部分互补，并且在实施方式中具体地与第一遗传元件36的第一互补序列36a的至少一部分互补的核苷酸序列。由于第一扩增反应第一引物46的核苷酸序列与第一遗传元件36的第一互补序列36a的至少一部分的核苷酸序列之间的互补，第一扩增反应第一引物46可与第一遗传元件36的第一互补序列36a的至少一部分退火。在图1A中代表第一扩增反应第一引物46的块状箭头中(以及对于本文附图中的所有其他箭头)，箭头的指向端代表引物的3’端，箭头的矩形端代表引物的5’端。因此，引物将通过聚合酶在箭头指向的方向上延伸。在图1A中，与第一扩增反应第一引物46互补并且可与第一扩增反应第一引物46退火的第一互补序列36a的一部分用黑色方块42示出。尽管与第一扩增反应第一引物46互补的第一互补序列36a的部分42仅仅是图1A中第一互补序列36a的一部分，但应当理解，与第一扩增反应第一引物46互补的第一互补序列36a的部分42可以备选地为整个第一互补序列36a，相对于第一互补序列36a具有不同的大小，或者位于第一互补序列36a内的不同位置。
第一扩增反应第二引物48可以具有与感兴趣的第二遗传元件32的至少一部分互补，并且在实施方式中具体地与第二遗传元件32的第二互补序列32b的至少一部分互补的核苷酸序列。由于第一扩增反应第二引物48的核苷酸序列与第二遗传元件32的第二互补序列32b的至少一部分的核苷酸序列之间的互补，第一扩增反应第二引物48可与第二遗传元件32的第二互补序列32b的至少一部分退火。在图1A中，与第一扩增反应第二引物48互补并且可与第一扩增反应第二引物48退火的第二互补序列32b的部分用黑色方块44示出。尽管与第一扩增反应第二引物48互补的第二互补序列32b的部分44仅仅是图1A中第二互补序列32b的一部分，但应当理解，与第一扩增反应第二引物48互补的第二互补序列32b的部分44可以备选地为整个第二互补序列32b，相对于第二互补序列32b具有不同的大小，或者位于第二互补序列32b内的不同位置。
在实施方式中，第一扩增反应第一引物46和第一扩增反应第二引物48中的一个或两个可在引物的5’端被磷酸化。在实施方式中，可向第一扩增反应混合物中提供已磷酸化形式的引物。如果引物尚未磷酸化，则可用激酶(例如T4多核苷酸激酶)处理以便使该引物磷酸化。
第一扩增反应可以利用涉及至少两种模板特异性引物(例如，第一引物与第一遗传元件的序列退火，而第二引物与第二遗传元件的序列退火)的任何合适的核酸复制技术。在实施方式中，第一核酸复制技术为聚合酶链反应(PCR)。PCR在例如美国专利4,683,202中描述，其通过引用并入于此以用于所有目的。在其他实施方式中，第一核酸复制技术可以是等温扩增反应。这种等温扩增可以使用例如phi29DNA聚合酶(或另一种具有高持续性并具有链置换活性的DNA聚合酶)，并且可以如下进行：在等温条件下(通常在40至65℃的温度下)，首先使共同双链核酸分子热变性(为了允许第一引物和第二引物与其互补序列退火)，然后使引物得以延伸并生成其拷贝。第一扩增反应可生成第一扩增反应产物，其含有第一遗传元件的至少一部分和第二遗传元件的至少一部分。
第一扩增反应混合物包含核酸聚合酶(例如DNA聚合酶)。在第一扩增反应中使用的核酸聚合酶可以是具有相对较高的持续性(即，能够容易地扩增至少例如3000个核苷酸长度的模板)的DNA聚合酶。具有高持续性的DNA聚合酶包括，例如
Figure GDA0001387860250000201
Taq DNA聚合酶(New England BioLabs,Inc.；该酶是Taq和DeepVentRTMDNA聚合酶的掺和物)、
Figure GDA0001387860250000202
高保真DNA聚合酶(New England BioLabs,Inc.)、
Figure GDA0001387860250000203
高保真DNA聚合酶(New England BioLabs,Inc.)、HOTSTAR HIGHFIDELITY DNA聚合酶(Qiagen)和phi29 DNA聚合酶。另外，在第一扩增反应中使用的核酸聚合酶可以是具有链置换活性的DNA聚合酶。
在一些实施方式中，本文提供的用于扩增反应的方法和步骤包括足以支持基于聚合酶的核酸合成的条件或在此条件下进行。针对基于聚合酶的核酸合成的示例性条件是本领域已知的并提供于例如，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,M.R.Green andJ.Sambrook,Cold Spring Harbor Laboratory Press(2012)中，该文献通过引用全文并入本文。用于基于聚合酶的核酸合成反应的非限制性组分可包括以下的一种或多种：聚合酶(例如，以每50微升反应体积0.01至10个单位的酶，或者其中的任何范围，包括例如，每50微升反应体积0.01-1、0.1-10、0.1-5、0.5-10、0.5-5、0.5-2、1-10或1-5个单位的酶的浓度，其中1单位的酶在75℃下将使15nmol的dNTP在30分钟内掺入聚合产物中)；模板(以每个反应至少例如1、10、100、1,000、10,000或100,000个拷贝的浓度)；引物(以例如0.01至10微摩尔，或者其中的任何范围，包括例如0.01-1、0.1-10、0.1-5、0.5-5或0.5-2微摩尔的浓度)；dNTP(例如dATP、dTTP、dGTP和dCTP，以例如每个dATP、dTTP、dGTP和dCTP50至500微摩尔，或者其中的任何范围，包括例如每个dATP、dTTP、dGTP和dCTP 50-350、100-500、100-300、200-500或300-400微摩尔的浓度)；盐(例如KCl或乙酸钾，以例如1至200毫摩尔，或者其中的任何范围，包括例如1-100、1-50、1-20、1-10、10-20、10-50或10-200毫摩尔的浓度)；缓冲液(例如Tris-HCl或Tris-乙酸盐(Tris-acetate)，pH 7.8-8.5，以例如1至100毫摩尔，或者其中的任何范围，包括例如1-50、1-20、1-10、1-5、10-100、20-100或50-100毫摩尔的浓度)；以及镁离子(以例如0.1至10毫摩尔，或者其中的任何范围，包括例如，0.1-5、0.1-1、0.5-10、0.5-5或0.5-2.5毫摩尔的浓度)。用于基于聚合酶的核酸合成反应的另外的非限制性组分可提高反应速度、提高反应的保真度或提高反应中的酶或DNA的稳定性，并且可以包括以下的一种或多种：明胶(以例如0.0001％至0.1％w/v的浓度)、BSA(以例如0.01至1微克每微升的浓度)、蔗糖(以例如0.01摩尔至0.8摩尔的浓度)、海藻糖(以例如0.01摩尔至0.8摩尔的浓度)、DMSO(以例如0.01％至10％v/v的浓度)、甜菜碱(以例如0.1至10摩尔的浓度)、甲酰胺(以例如0.1％至10％v/v的浓度)、甘油(以例如0.1％至20％v/v的浓度)、聚乙二醇(以例如0.1％至20％v/v的浓度)、非离子型去污剂[例如NP-40(以例如0.01％至1％v/v的浓度)]、吐温-20(以例如0.01％至1％v/v的浓度)或Triton X-100(以例如0.01％至1％v/v的浓度)]、铵离子[例如硫酸铵(以例如1至100毫摩尔的浓度)]和EDTA(以例如0.001至0.1毫摩尔的浓度)。其他试剂也可存在于本文提供的基于聚合酶的核酸合成反应中。例如，可以使用足以合成RNA反应产物或含有非标准核苷酸的反应产物的试剂。足以支持基于聚合酶的核酸合成的条件可包括多个温度和pH值。例如，基于聚合酶的核酸合成反应的pH可为例如pH 6.0至pH 10.0，诸如pH 6.5、7、7.5、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.5、9或9.5。基于聚合酶的核酸合成反应的温度可以是恒定的或变化的。恒定的温度可以在例如10℃至95℃之间，诸如20、25、30、35、37、40、42、45、50、55、60、65、70、75、80或85℃。变化的温度可以是例如10℃至95℃之间的两个或更多个不同的温度，诸如选自20、25、30、35、37、40、42、45、50、55、60、65、70、75、80或85℃的两个或更多个温度。在一些实施方式中，变化的温度可以周期地变化(例如，在PCR反应中，在诸如94-98℃，然后是50-65℃，然后72-80℃，然后回到94-98℃之间循环，并持续循环约10-50轮循环)。可在本文描述的扩增反应混合物中提供任何上述试剂；类似地，也可将被描述为存在于本文所述的“扩增反应”中的任何试剂描述为存在于相应的“扩增反应混合物”中。
图1B示出了示例性的第一扩增反应产物50。第一扩增反应产物50含有第一扩增反应产物第一链52和第一扩增反应产物第二链54。第一扩增反应产物第一链52和第一扩增反应产物第二链54在核苷酸长度上比共同双链核酸分子10的第一链22和第二链24短，因为只有在与第一扩增反应第一引物46和第一扩增反应第二引物48退火的核苷酸之间或包含这些核苷酸的核苷酸得到扩增。如图1B所示，第一扩增产物50含有遗传元件32、34和36。另外，应当指出，尽管图1B将某些特征标记为遗传元件32和36(并因此提示这些特征与图1A中的元件32和36相同)，但图1B(以及随后的图)中的元件32和36可与图1A中的略微不同。具体地，这些元件可能不含存在于图1A中的这些元件中的所有核苷酸。在以下情况下这可能发生，例如，如果与第一扩增反应第一引物46互补的第一互补序列36a的部分42位于第一互补序列36a的中间(而不是在末端)，使得在第一扩增反应中只有第一遗传元件的一部分得到扩增(或相应地对于第一扩增反应第二引物和第二遗传元件)。尽管如此，在图1B以及图1中的随后附图中标记为特征32和36的特征将分别具有与图1A中特征32和36的核苷酸序列密切相关的核苷酸序列——图1B和随后附图中的核苷酸序列可能只是在长度上比图1A中的短。如图1B所示，第一扩增反应产物50可以具有双链、线性构型。
在实施方式中，在含有感兴趣的第一遗传元件的至少一部分和感兴趣的第二遗传元件的至少一部分的第一扩增反应产物中，第一遗传元件的3’端与第二遗传元件的5’起点之间存在至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、200、500、1000、2000、5000、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000或100,000个核苷酸，不多于5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、200、500、1000、2000、5000、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000或100,000个核苷酸，或者至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、200、500、1000、2000或5000个，并且不多于5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、200、500、1000、2000、5000、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000或100,000个核苷酸(或者反之亦然)。
在实施方式中，第一扩增反应产物可在第一扩增反应产物第一链52或第一扩增反应产物第二链54中的一个或两个的5’端被磷酸化。可通过在第一扩增反应中使用磷酸化的第一和第二引物来生成磷酸化的第一扩增反应产物，或者第一扩增反应产物一旦生成即可被磷酸化。在任一种情况下，可通过本领域已知的方法(例如使用T4多核苷酸激酶)使相应的分子磷酸化。
可在连接反应混合物中提供第一扩增反应产物，并在其中发生连接反应。连接反应混合物含有DNA连接酶(例如T4DNA连接酶)。在连接反应中，多核苷酸(例如DNA或RNA)链的末端5’磷酸与多核苷酸链的3’OH基团形成共价的磷酸二酯键。在连接反应中，多核苷酸链的5’磷酸可与同一条链的3’OH基团连接(即链内连接)，或者5’磷酸可与不同链的3’OH基团连接(即链间连接)。如图1C所示，在本文提供的实施方式中，连接反应混合物中的磷酸化的第一扩增反应产物可产生环状连接产物60。在环状连接产物60中，存在分别由第一扩增反应产物第一链52和第一扩增反应产物第二链54形成的环状连接产物第一链62和环状连接产物第二链64(即，通过将第一扩增反应产物第一链52的5’端与同一条链的3’端连接，以形成环状连接产物第一链62，并通过将第一扩增反应产物第二链54的5’端与同一条链的3’端连接，以形成环状连接产物第二链64)。如图1C所示，在环状连接产物60中，在第一链62上，遗传元件32的互补序列32a与遗传元件36的互补序列36a相邻。另外，在环状连接产物第二链64上，遗传元件32的互补序列32b与遗传元件36的互补序列36b相邻。因此，环状连接产物60的形成使得与共同双链核酸分子10中遗传元件32和36相对于彼此的距离相比，在环状连接产物60中遗传元件32更接近于遗传元件36。
在实施方式中，连接反应混合物中的磷酸化的第一扩增反应产物可产生端对端的连接产物(除了环状连接产物60之外或替代环状连接产物60)。在端对端的连接产物中，磷酸化的第一扩增反应产物的第一拷贝与磷酸化的第一扩增反应产物的第二拷贝端对端地连接(例如，在实施方式中，第一扩增反应产物的第一拷贝的第一链的3’端与第一扩增反应产物的第二拷贝的第一链的5’端连接，并且第一扩增反应产物的第二拷贝的第二链的3’端与第一扩增反应产物的第一拷贝的第二链的5’端连接，使得形成含有端对端连接产物第一链和端对端连接产物第二链的端对端连接产物，并且端对端连接产物第一链含有第一扩增反应产物的第一链的至少两个拷贝，并且端对端连接产物第二链含有第一扩增反应产物的第二链的至少两个拷贝)。在端对端连接产物中，可使与共同双链核酸分子10中遗传元件32和36相对于彼此的距离相比，遗传元件32的拷贝更接近于遗传元件36的拷贝。
可向第二扩增反应混合物中提供环状连接产物或端对端连接产物中的一种或两种。图1D示出了第二扩增反应中的环状连接产物60。在第二扩增反应混合物中，提供第二扩增反应第一引物76和第二扩增反应第二引物78。第二扩增反应第一引物76的至少一个区域与遗传元件32(在该实例中为感兴趣的第二遗传元件)第一互补序列32a的一部分72互补并退火，并且第二扩增反应第二引物78的至少一个区域与遗传元件36(在该实例中为感兴趣的第一遗传元件)第二互补序列36b的一部分74互补并退火。如代表第二扩增反应第一引物76和第二扩增反应第二引物78的箭头的方向性所指示的，可以以与第一扩增反应中引物的延伸产物的合成方向相反的方向合成第二扩增反应中引物的延伸产物。第二扩增反应中第二扩增反应第一引物76和第二扩增反应第二引物78的方向性允许第一遗传元件和第二遗传元件的快速扩增，而无需扩增中间的核苷酸序列(或其中的附加遗传元件)，从而允许第一遗传元件的强效扩增和检测。
第二扩增反应可以利用涉及至少两种模板特异性引物(例如，第一引物与第一遗传元件的序列退火，而第二引物与第二遗传元件的序列退火)的任何合适的核酸复制技术。可用于第二扩增反应的合适的示例性核酸复制技术包括，例如，PCR或如PCT/US14/56151中描述的扩增方法，其通过引用并入本文以用于所有目的。PCT/US14/56151描述了用于核酸复制的方法和组合物。在实施方式中，PCT/US14/56151的方法可在没有热循环的情况下进行。在实施方式中，PCT/US14/56151的方法可涉及第一引物和第二引物。在实施方式中，PCT/US14/56151的方法的第一引物含有第一区域和第二区域，其中第一区域包含引物的5’端，第二区域包含引物的3’端，并且第二区域与双链核酸模板(即双链核酸分子)的第一链的至少一部分互补。在实施方式中，PCT/US14/56151的方法的第二引物含有第一区域和第二区域，其中第一区域包含引物的5’端并且与第一引物的第一区域互补，第二区域包含引物的3’端，并且其中第二区域与该双链核酸模板的第二链的至少一部分互补。在实施方式中，PCT/US14/56151的方法的第一引物的第二区域可以以与本文提供的方法中的第一引物相同的方式与本文方法中提供的元件的第一互补序列退火，并且PCT/US14/56151的方法的第二引物的第二区域可以以与本文提供的方法中的第二引物相同的方式与本文方法中提供的元件的第二互补序列退火。PCT/US14/56151的方法和组合物的其他细节在本文其他地方描述。
第二扩增反应可生成第二扩增反应产物80，其含有第一遗传元件的至少一部分和第二遗传元件的至少一部分。在实施方式中，第二扩增反应产物80可具有双链、线性构型。如图1E所示，第二扩增反应产物80含有第二扩增反应产物第一链82和第二扩增反应产物第二链84。第二扩增反应产物第一链82含有第一遗传元件36的第一互补序列36a和第二遗传元件32的第一互补序列32a。第二扩增反应产物第二链84含有第一遗传元件36的第二互补序列36b和第二遗传元件32的第二互补序列32b。在实施方式中，如果例如按PCT/US14/56151中描述的方法进行第二扩增反应，则第二扩增反应产物80可形成含有第一遗传元件36和第二遗传元件32的两个或更多个拷贝的多联体。
可通过本领域已知的用于核酸检测的方法并如本文其他地方所述来检测第二扩增反应产物80。
在一个实例中，本文提供的用于检测共同双链核酸分子上的两个遗传元件的方法可如下进行。在该实例中，引物和遗传元件的序列比本文所提供方法的典型值更短(即具有更少的核苷酸)。然而，该实例中的序列足以提供关于本文所提供方法的实施方式的示例性步骤的信息。在该实例中，第一遗传元件和第二遗传元件是感兴趣的。第一遗传元件的第一互补序列为：5’AAT 3’，而第一遗传元件的第二互补序列为：5’ATT 3’。第二遗传元件的第一互补序列为：5’TTG 3’，而第二遗传元件的第二互补序列为5’CAA 3’。第一遗传元件和第二遗传元件存在于共同双链核酸分子上。如本文所使用的，两个或更多个元件位于“共同”分子上的描述表明这些元件是同一连续分子(即同一条单链或双链DNA分子)的部分。共同双链核酸分子的第一链的核苷酸序列为：5’TTGXAAT 3’，其中X是任何数目和序列的核苷酸。例如，X可含有至少100、500、1000、2000、3000、4000、5000或10,000个核苷酸。双链核酸分子的第二链的核苷酸序列为：5’ATTX’CAA 3’，其中X’是与X的序列互补的某种数目和序列的核苷酸。在第一扩增反应混合物中，提供第一扩增反应第一引物和第一扩增反应第二引物。第一扩增反应第一引物的核苷酸序列为：5’ATT 3’。第一扩增反应第二引物的核苷酸序列为：5’TTG 3’。在第一扩增反应混合物中，生成第一扩增反应产物。第一扩增反应产物含有第一扩增反应产物第一链和第一扩增反应产物第二链。第一扩增反应产物第一链的核苷酸序列为：5’TTGXAAT 3’，其中X是任何数目和序列的核苷酸。第一扩增反应产物第二链的核苷酸序列为：5’ATTX’CAA 3’，其中X’是与X的序列互补的某种数目和序列的核苷酸。(尽管在该实例中，第一扩增反应产物的大小与共同双链核酸分子相同，但是通常，在本文提供的方法中，第一扩增反应产物在长度上比共同双链核酸分子短。)在连接反应混合物中，由第一扩增反应产物形成环状连接产物，其中环状连接产物第一链具有核苷酸序列：5’TTGXAAT 3’，并且其中5’T和3’T共价连接，是环状多核苷酸的一部分。环状连接产物第二链具有核苷酸序列：5’ATTX’CAA 3’，并且其中5’A和3’A共价连接，是环状多核苷酸的一部分。在第二扩增反应混合物中，提供第二扩增反应第一引物和第二扩增反应第二引物。第二扩增反应第一引物的核苷酸序列为：5’CAA 3’。第二扩增反应第二引物的核苷酸序列为：5’AAT 3’。在第二扩增反应混合物中，生成第二扩增反应产物。第二扩增反应产物含有第二扩增反应产物第一链和第二扩增反应产物第二链。第二扩增反应产物第一链的核苷酸序列为：5’AATTTG 3’。第二扩增反应产物第二链的核苷酸序列为：5’CAAATT 3’。
在实施方式中，本文提供的方法的所有步骤都可被允许在同一容器中同时发生(例如，用于本文提供的方法的所有试剂都可在同一容器中同时提供)。另外，本文提供了含有用于本文所提供方法的试剂的试剂盒。
除了用于检测真正的MRSA细菌外，本文提供的方法还可用于检测其他物种或分子中的其他遗传元件，其中，例如，存在可在共同核酸链上或共同分子的一部分上的两个或更多个遗传元件，但其元件彼此相隔较大的核苷酸距离。如本文提供的一般途径(即，进行第一扩增反应，随后进行连接反应，之后进行第二扩增反应)可用于呈现出类似结构问题的许多种遗传元件。
此外，在实施方式中，如果已经存在多个拷贝的含有感兴趣遗传元件的分子，而且这类分子可被连接在一起以形成其中感兴趣的元件可通过例如PCR或如PCT/US14/56151中描述的扩增方法而容易地扩增的结构，则可省略本文提供的第一扩增反应。
在实施方式中，本文提供了用于评价靶序列中的SNP、突变或感兴趣的其他核苷酸的组合物和方法。在一些情况下，靶序列可具有围绕感兴趣核苷酸位置的多种不同的多态性。例如，感兴趣的核苷酸可位于具有150个核苷酸的靶序列的第60个核苷酸位置(最5’端的核苷酸在第一位，紧接着最5’端的核苷酸的核苷酸在第二位，以此类推)，并且靶序列中的其他核苷酸还可以经常是可变的(例如，第49位、第51位、第57位核苷酸位置也可经常具有变异核苷酸/为SNP位点)。
在实施方式中，可通过利用如2014年9月17日提交的PCT/US14/56151中所提供的SNP检测方法来评价感兴趣的核苷酸，该申请在此通过引用全文并入以用于所有目的。在这样的方法中，利用引物对来扩增含有感兴趣核苷酸的靶核酸，其中每个引物均含有尾区/第一区域和模板结合区/第二区域。在实施方式中，引物对的第二引物的尾区/第一区域与包含感兴趣核苷酸的靶核酸的一部分互补。在如PCT/US14/56151公开的方法中，例如，可通过比较使用在引物的第一区域/尾区中具有略微不同的核苷酸序列的一种或多种引物对(一般在引物对之间仅有单个核苷酸差异)扩增含有感兴趣核苷酸的靶核酸的速率或量，来确定感兴趣的核苷酸的身份。
然而，在某些情况下，如果靶核酸中感兴趣核苷酸附近的一个或多个位置存在大量的序列变异，则可能难以进行如PCT/US14/56151中提供的SNP检测方法。例如，这样的位置可以在与第一引物和/或第二引物的模板结合区相对应的区域中。如果如PCT/US14/56151中描述的用于SNP检测的引物不能容易地与靶核酸序列相结合，则其中公开的方法可能对SNP检测是无效的。
因此，本文提供了有利于鉴定感兴趣的SNP或其他核苷酸的组合物和方法。在实施方式中，用于这种类型的方法的步骤和试剂在本文中可针对“核苷酸分析”进行描述。在第一步中，通过第一扩增反应(如PCR；本文中也称为“PCR扩增反应”)扩增含有感兴趣核苷酸的靶核酸的区域，以生成PCR扩增反应产物。PCR扩增反应可在PCR扩增反应混合物中发生。在该PCR扩增反应中，相对较长的引物对(例如每条引物含有至少15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、80、90或100个核苷酸)可用来扩增靶核酸。长引物可容许模板结合区中的相对大量的序列多样性(即，因为引物较长，其可能仍然与靶序列退火，即使多个核苷酸是错配的)。重要的是，在PCR扩增反应中，两个引物都不会与感兴趣核苷酸/SNP的确切位置退火(即，引物应该只与感兴趣SNP附近的区域退火)。这是因为对于本文提供的方法，不希望改变感兴趣核苷酸/SNP的身份(因为希望鉴定感兴趣的核苷酸/SNP)。一旦在PCR扩增反应中生成PCR扩增产物，PCR扩增产物将具有通常已知的核苷酸序列(由于知道在PCR扩增反应中使用以生成PCR反应扩增产物的引物的核苷酸序列)。然而，在PCR扩增反应产物中，感兴趣的核苷酸/SNP的身份仍然是未知的，因为在PCR扩增反应中使用的引物均不与感兴趣的核苷酸/SNP的位置退火。然后可将PCR扩增反应产物与PCT/US14/56151中提供的用于SNP检测的引物一起温育。基于PCR扩增反应产物是通过使用已知序列的引物而生成的事实，可将这些引物设计为具有与已知存在于PCR扩增反应产物中的序列互补的区域。然后可如PCT/US14/56151所述确定感兴趣的SNP/核苷酸的身份。
图2提供了本文提供的方法的一般示意图。可提供含有靶核酸102的核酸链100。靶核酸102可含有多个多态性/变异核苷酸104。靶核酸102还含有感兴趣的核苷酸/SNP 106。在PCR反应混合物中将靶核酸与PCR扩增反应第一引物112和PCR扩增反应第二引物114一起温育，以便生成PCR扩增反应产物120。PCR扩增反应产物120将具有通常已知的核苷酸序列，因为该产物是用PCR扩增反应第一引物112和PCR扩增反应第二引物114(其具有已知的核苷酸序列)扩增的。PCR扩增反应产物120是含有PCR扩增反应产物第一链和PCR扩增反应产物第二链的双链核酸分子。在实施方式中，PCR扩增反应产物第一链可以是感兴趣的多核苷酸模板的拷贝。在生成PCR扩增反应产物120的过程中，多个多态性/变异核苷酸104被第一引物112和第二引物114的核苷酸替代。然而，PCR扩增反应产物120仍然具有未知的感兴趣的核苷酸/SNP 106。然后可在如PCT/US14/56151中所述用于SNP检测的方法中使用PCR扩增反应产物120。
在实施方式中，可以以与本文提供的用于遗传元件分析第一扩增反应的第一扩增反应相同的方式进行用作核苷酸分析方法一部分的PCR扩增反应(例如两种扩增反应均可为PCR反应)。类似地，在实施方式中，遗传元件分析第一扩增反应混合物的组分可与本文提供的PCR扩增反应混合物的组分相同(考虑到例如引物和模板核苷酸序列中的差异以及温度或试剂优化)。另外，如果期望将特定方法步骤或试剂鉴定为与本文描述的遗传元件分析或核苷酸分析过程相关联，则本文提供的步骤和试剂通常可用前缀“遗传元件分析”或“核苷酸分析”加以描述。或者，如果上下文明确指定特定方法，或者，如果一个陈述广泛适用于各种类型的引物或方法步骤(即，不仅仅适用于具体的方法或试剂)，则本文提供的方法步骤或试剂可能不能用前缀“遗传元件分析”或“核苷酸分析”加以描述(例如第一引物或第一链)。
在实施方式中，本文提供的方法可用于评估丙型肝炎蛋白酶基因NS3中多态性位点Q80K中的SNP。可在本文提供的用于评估Q80K位点的方法中使用的示例性引物对为：第一引物(5’至3’方向)：GGAACGAGGACCATCGCATCACCCAAGGGTCCTGTTATCCAGATGTATACCAATGTAGAC(SEQ ID NO:1)；第二引物(5’至3’方向)：CGCAGGTGCAGGGTGTCAATGAGCGGGCACCTTGAGGAGCGGGCCAGCCCACGAGGTCT(SEQ ID NO:2)。本文提供的方法可用于评估许多不同靶核酸中的SNP，其中该靶核酸具有高水平的序列变异性。
在实施方式中，本文提供的方法的所有步骤都可被允许在同一容器中同时发生(例如，用于本文提供的方法的所有试剂都可在同一容器中同时提供)。
在实施方式中，本文提供的方法可如下进行。可在第一扩增反应中扩增多核苷酸模板，其中该第一扩增反应为PCR反应。在第一扩增反应中，可生成PCR扩增反应产物。该PCR扩增反应产物可为包含第一链和第二链的双链核酸分子，并且其中该PCR扩增反应产物的第一链为多核苷酸模板的拷贝。接下来，该PCR反应产物(其包含多核苷酸模板的拷贝)可用作如PCT/US14/56151中提供的非热循环扩增反应的模板，以便生成如PCT/US14/56151中所述的非热循环反应产物。此类非热循环反应产物可包括多联体。在涉及PCR扩增反应及随后的非热循环扩增反应的该方法的实施方式中，仅检测到非热循环反应产物(而非PCR反应产物)。在实施方式中，在非热循环反应产物形成时对其进行实时检测。在实施方式中，PCT/US14/56151的方法可涉及第一引物和第二引物。在实施方式中，PCT/US14/56151的方法的第一引物含有第一区域和第二区域，其中第一区域包含引物的5’端，第二区域包含引物的3’端，并且第二区与双链核酸模板(即，双链核酸分子，如PCR扩增反应产物)的第一链的至少一部分互补。在实施方式中，PCT/US14/56151的方法的第二引物含有第一区域和第二区域，其中第一区域包含引物的5’端并且与第一引物的第一区域互补，第二区域包含引物的3’端，并且其中第二区域与双链核酸模板的第二链的至少一部分互补。在实施方式中，PCT/US14/56151的方法的第一引物的第二区域可以与本文方法中PCR扩增反应产物的第一链退火，其退火方式与本文提供的PCR扩增反应中第一PCR扩增反应引物与多核苷酸模板链退火的方式相同，并且PCT/US14/56151的方法的第二引物的第二区可以与本文方法中提供的PCR扩增反应产物的第二链退火，其退火方式与本文提供的PCR扩增反应方法中第二PCR扩增反应引物与同多核苷酸模板互补的多核苷酸退火的方式相同。
如本文所用的“引物”可以指这样的多核苷酸，其i)能够与原始核酸链杂交，并且ii)充当合成新的核酸链的起始点，其中新的核酸链是引物的延伸产物并与原始链互补。引物可在其3’末端具有游离的–OH基团，其可充当延伸产物合成的起点。
引物可含有标准核苷酸[例如，标准DNA脱氧核糖核苷酸(脱氧腺苷单磷酸、脱氧鸟苷单磷酸、胸苷单磷酸、脱氧胞苷单磷酸)或标准RNA核糖核苷酸(腺苷单磷酸、鸟苷单磷酸、尿苷单磷酸、胞苷单磷酸)]、替代性核苷酸(例如，肌苷)、修饰的核苷酸、核苷酸类似物或其组合。例如，寡核苷酸引物可包括肽核酸、吗啉代寡核苷酸(例如，磷二酰胺吗啉代寡核苷酸)、锁定核酸[参见，例如，Kaur,H,等人,Biochemistry 45(23),7347-55(2006)]、乙二醇核酸或苏糖核酸。引物可具有骨架，包括，例如，磷酸二酯键、硫代磷酸酯键(用硫替代非桥接O)或肽键(作为肽核酸的一部分)。替代性核苷酸、修饰的核苷酸以及核苷酸类似物可在本文中通称为“非标准核苷酸”。
引物中非标准核苷酸的存在可影响该引物的各种特性。在一些实施方式中，在引物中包含非标准核苷酸可增加或降低引物对其互补序列的热力学稳定性。例如，具有增加的热力学稳定性的引物可含有锁定核酸。具有降低的热力学稳定性的引物可含有，例如，肌苷(由Auer等人,Nucl.Acids Res.24；5021-5025(1996)描述)或带负电荷的化学基团，诸如羧酸。
本文提供的第一引物或第二引物可以是任何长度。第一引物和第二引物可含有相同数目的核苷酸或不同数目的核苷酸。在一些实施方式中，第一或第二引物可以为至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、500、750、1000或1500个核苷酸的长度。在一些实施方式中，第一或第二引物可以为不多于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、500、750、1000或1500个核苷酸的长度。在一些实施方式中，第一或第二引物可具有选自最小值为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、500、750或1000个核苷酸的长度并且最大值为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、500、750、1000或1500个核苷酸的长度的范围的长度。
可测定扩增的核酸的存在，例如，通过检测反应产物(扩增的核酸或反应副产物)或通过检测与反应进程相关的探针。
在一些实施方式中，可通过用染料将产物染色来鉴定反应产物。在一些实施方式中，染料在与核酸结合时比未与核酸结合时可具有更大的荧光。在实施方式中，染料可嵌入双链核酸或者它可与核酸的外部区域结合。可与本文提供的方法和组合物一起使用的核酸染料包括，例如，花青染料、
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染料、
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Gold、
Figure GDA0001387860250000333
Green I、
Figure GDA0001387860250000334
Green II、溴化乙锭、二氢乙锭、BlueViewTM、
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染料、
Figure GDA0001387860250000336
染料、
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染料、
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染料、
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染料、
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染料、
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染料、
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染料、
Figure GDA00013878602500003314
染料、碘化丙锭、碘化己锭(hexidium iodide)、亚甲蓝、DAPI、吖啶橙、奎纳克林(quinacrine)、吖啶二聚体(acridine dimer)、9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶、双苯酰亚胺染料、Hoechst染料、7-氨基放线菌素D、放线菌素D、羟芪巴脒、派洛宁Y(pyronin Y)、DiamondTM染料、GelRedTM、GelGreenTM和LDS 751。
在一些实施方式中，可通过分析扩增反应的浊度来鉴定反应产物。例如，在实施方式中，增加的浊度可与反应产物和反应副产物(例如，与镁复合的焦磷酸)的形成相关。
在一些实施方式中，可通过用凝胶电泳分离根据本文方法进行的反应并随后用核酸染料将凝胶染色来鉴定反应产物。该染料可以是本文公开的或本领域以其他方式已知的任何核酸染料。
在一些实施方式中，本领域已知的用于检测核酸或用于生成核酸的任何方法或组合物可与本文提供的方法和组合物一起使用。
在一些实施方式中，根据本文提供的方法进行的反应可在含有光源和光学传感器的设备中进行监测。在一些情况下，可将反应定位于来自光源的光路上，并且可测量由样品吸收(例如，在混浊反应的情况下)、由样品散射(例如，在混浊反应的情况下)或由样品发射(例如，在含有荧光分子的反应的情况下)的光。在一些实施方式中，本文提供的方法可在如2013年2月18日提交的美国专利申请系列号13/769,779中公开的装置或其中的模块中进行或监测，该专利申请通过引用全文并入本文。
通过使用本文提供的方法，感兴趣的核酸模板的特异性扩增产物可在扩增反应开始后例如30秒、1分钟、3分钟、5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、30分钟、45分钟、60分钟、90分钟、120分钟、180分钟或240分钟内进行鉴定。在其他实例中，当生成模板的少至10、50、100、500、1000、5000、10,000、50,000、100,000、500,000或1,000,000个拷贝时，通过使用本文提供的方法可鉴定对于感兴趣的核酸模板为阳性的扩增反应。在其他实例中，通过使用本文提供的方法，可鉴定样品中感兴趣的核酸模板的存在，该样品在该方法开始时含有感兴趣的模板的少至1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、40、50、100、200、500、1000、5000或10,000个拷贝。
在实施方式中，本文提供的方法可用于测定样品中的感兴趣的靶核酸。在某些实施方式中，可通过涉及测定反应中核酸扩增的转变时间的方法来确定样品中感兴趣的靶核酸的存在或量。转变时间/拐点是扩增反应被确定为对核酸模板为阳性的时间或点。转变时间/拐点可以通过一个或多个指标来鉴定，例如，反应开始后在反应中已经生成所选量的核酸的时间，当反应的扩增速率由基线期变为指数期时的时间，或者当反应的扩增速率由指数期变为平台期(plateau phase)时的时间，等等。在实施方式中，转变时间/拐点可以基于反应的荧光或吸光度的变化或基于反应的荧光或吸光度达到所选值来鉴定。在某些实施方式中，样品中感兴趣的靶核酸的存在或量可通过包括比较反应的核酸扩增的转变时间来确定，该反应相对于以下反应中的一者或两者具有未知量的感兴趣的靶核酸：i)已知缺乏感兴趣的靶核酸的反应(即，阴性对照)；或ii)已知含有感兴趣的靶核酸的反应(即，阳性对照)。在实施方式中，可测量含有感兴趣的靶核酸的反应和不含有靶核酸的反应两者的所选的转变时间。在实施方式中，样品中感兴趣的靶核酸的存在可基于这样的方法来确定，该方法包括评价包含可含有或可不含有感兴趣的靶核酸的样品的反应的拐点与具有感兴趣状态(例如，已知其含有或不含有感兴趣的靶核酸)的已知靶核酸的一个或多个反应的转变时间之间的时间差异。例如，如果根据本文提供的方法的反应的转变时间比已知不含有感兴趣的靶核酸的相应反应早至少3、5、10、15、20、30、40、50、60、90、120或180分钟，则样品可被鉴定为含有感兴趣的靶核酸。在另一实例中，如果根据本文提供的方法的反应的转变时间比已知不含有感兴趣的靶核酸的相应反应晚不多于3、5、10、15、20、30、40、50、60、90、120或180分钟，则样品可被鉴定为含有感兴趣的靶核酸。
本文提供的方法可进行任意时间长度。通常，该方法将进行足以监测例如核酸复制速率、聚合酶活性的出现或扩增产物的积累的时间长度。在一些实施方式中，本文提供的方法可进行总计少于10秒、30秒、1分钟、5分钟、10分钟、20分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、6小时、8小时、12小时、16小时或24小时，到该时间时测量核酸复制速率、聚合酶活性的出现或扩增产物的积累。
本文提供的方法可以以各种方式终止。在一个实施方式中，方法步骤可在浓度降低时或该方法的一个或多个步骤中包含的一种或多种试剂(例如，dNTP)完全消耗时结束。在另一个实施方式中，方法步骤可在该方法的一个或多个步骤中包含的一种或多种酶(例如，聚合酶)失活时结束。酶可通过各种方式失活。例如，由于影响酶结构的随机事件，导致酶可随时间逐渐失去酶活性，或者酶可暴露于加速酶活性失活的条件(例如，高热、极端pH等)。
在本文提供的方法中，核酸多联体的生成还增加了该多联体中的核酸模板/特定核酸的拷贝数。因此，本文中对用于生成多联体的方法和组合物的提及还适用于核酸的扩增。
如本文所用的，“多核苷酸”是指含有两个或更多个核苷酸的聚合链。“多核苷酸”包括引物、寡核苷酸、核酸链等。多核苷酸可含有标准或非标准核苷酸。通常，多核苷酸在链的一个末端(“5’末端”)含有5’磷酸并在链的另一末端(“3’末端”)含有3’羟基基团。多核苷酸的最5’核苷酸在本文中可被称为多核苷酸的“5’末端核苷酸”。多核苷酸的最3’核苷酸在本文中可被称为多核苷酸的“3’末端核苷酸”。
在含有5’末端核苷酸和3’末端核苷酸的多核苷酸的语境中，如本文所用的术语“下游”是指比多核苷酸中的参考位置更接近3’末端核苷酸的该多核苷酸中的位置。例如，在具有序列5’ATAAGC 3’的引物中，“G”在“T”和全部“A”的下游。
在含有5’末端核苷酸和3’末端核苷酸的多核苷酸的语境中，如本文所用的术语“上游”是指比多核苷酸中的参考位置更接近5’末端核苷酸的该多核苷酸中的位置。例如，在具有序列5’ATAAGC 3’的引物中，“T”在“G”、“C”以及最接近“G”的两个“A”的上游。
如本文所用的，“核酸”包括DNA和RNA两者，包括含有非标准核苷酸的DNA和RNA。“核酸”含有至少一个多核苷酸(“核酸链”)。核酸可以是单链或双链的。
如本文所用的，“多联体”是指在其内含有特定核酸的两个或更多个拷贝的核酸分子，其中这些拷贝串联连接。在该多联体内，特定核酸的拷贝可彼此直接连接，或者它们可间接地连接(例如，在特定核酸的拷贝之间可具有核苷酸)。在一个实例中，该特定核酸可以是双链核酸模板的核酸，以使得多联体可含有该双链核酸模板的两个或更多个拷贝。在另一个实例中，该特定核酸可以是多核苷酸模板的核酸，以使得多联体可含有该多核苷酸模板的两个或更多个拷贝。
如本文所用的，“靶”核酸或分子是指感兴趣的核酸。靶核酸/分子可以是任何类型的，包括单链或双链DNA或RNA(例如，mRNA)。
如本文所用的，“互补”序列是指这样的两个核苷酸序列，这两个核苷酸序列在彼此反平行对齐时，含有按照标准碱基配对原则(例如，A-T、G-C或A-U)可彼此配对的多个单独的核苷酸碱基，使得含有该序列的分子可彼此特异性地退火。对于被认为“互补的”序列，不必要两个序列中的每一个核苷酸碱基均能够彼此配对。例如，如果当两个序列为了互补而进行最佳对齐时，该两个序列中至少30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的核苷酸碱基可彼此配对，则这两个序列可被认为是互补的。此外，当两个序列的总长度彼此明显不同时，两个序列仍可被认为是“互补的”。例如，如果在15个核苷酸的引物与含有数百个核苷酸的更长的多核苷酸的特定区域反向平行对齐的情况下该引物的多个单独的核苷酸碱基可与更长的多核苷酸中的核苷酸碱基配对，则该15个核苷酸的引物可被认为与该含有数百个核苷酸的更长的多核苷酸是“互补的”。此外，“互补”序列可含有一种或多种核苷酸类似物或核碱基类似物。如本文所用的，“完美地互补”或“完美互补”等是指彼此100％互补的两个序列(即，当序列配对达到最高程度互补时，在序列的核苷酸之间不存在错配)。此外，本文中提及具有与第二多核苷酸“互补的核苷酸序列”的第一多核苷酸等与声称第一多核苷酸与第二多核苷酸“互补”具有相同的含义。
如本文所用的，当应用于蛋白质、核酸或其他生物分子时，术语“分离的”是指已从其天然存在的环境的组分中纯化或分离的分子(例如，从其天然产生的细胞中纯化的蛋白质)。“分离的”分子可与其他分子相接触(例如，作为反应混合物的一部分)。如本文所用的，“分离的”分子还包括具有天然存在的氨基酸或核苷酸序列的重组产生的蛋白质或核酸。“分离的”核酸包括在细胞中包含的编码多肽的核酸分子，该细胞通常在例如该核酸分子在与天然细胞不同的染色体位置时表达该多肽。在一些实施方式中，“分离的”多肽被纯化为至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或100％的同质性，如通过多肽的SDS-PAGE以及随后的考马斯蓝、银或其他蛋白质染色方法所证实的。
除非上下文中另外明确指出，否则如本文所用的，被描述为含有模板或其他核酸的“序列”的核酸分子也可被认为含有该模板或其他核酸本身(例如，被描述为含有模板的序列的分子也可以被描述为含有该模板)。
如本文所用的，当第一多核苷酸被描述为与第二多核苷酸“退火”等时，第一多核苷酸的全部或其任何部分可与第二多核苷酸退火，反之亦然。
如本文所用的，提及“生成模板的拷贝”等包括i)生成模板的精确拷贝(例如生成DNA模板的DNA拷贝)和ii)生成RNA模板的DNA版本。例如，模板可以是单链RNA分子(如来自单链RNA病毒)。该模板可通过逆转录PCR来复制，这导致RNA模板的许多DNA版本的拷贝。
如本文所用的，提及在某一条件下或采用其他对象等“处理”给定对象是指直接或间接地将给定对象暴露于所提及的条件或其他对象。因此，尽管“处理”步骤可包括不同的相关操作(例如，将酶加入到容器中，振荡容器等)，但并非每一个“处理”步骤都需要不同的相关操作。例如，涉及一种或多种试剂的反应可设置在容器中，并且一旦反应已经开始，则多个事件或步骤可以在该容器中发生，而无需进一步人为或机械干预该容器中的内容物。在容器中进行的这些多个事件或步骤中的一个或多个可以被描述为“处理”该容器中的对象，即使在反应开始后不单独地干预该容器中的内容物。
在一些实施方式中，核酸模板可以是单链或双链的。核酸模板的单链在本文可被称为“多核苷酸模板”。如本文提及的“多核苷酸模板”并不排除与其互补序列结合。换言之，“多核苷酸模板”可以是例如整个单链核酸模板，或者它可以是双链核酸模板的一条链。核酸模板可以包含在一级核酸分子中。在一些实施方式中，核酸模板可构成整个一级核酸分子。在其他实施方式中，核酸模板可包含在含有不是核酸模板的一部分的一个或多个核苷酸的一级核酸中(例如，核酸模板可具有比含有核酸模板的一级核酸更短的长度)。
采用本文提供的方法，可以在样品或反应混合物中在低至例如小于1000、500、100、50、10、5、2或1个拷贝/微升的浓度下明确鉴定病原体或基因。在实施方式中，本文提供的方法可从一种类型的病原体或基因特异性地扩增核酸，并且不从相关的病原体或基因扩增核酸。例如，本文提供的用于扩增甲型流感基质蛋白基因的试验可从甲型流感的多个不同菌株中扩增该基因，但不从乙型流感中扩增遗传物质。
在实施方式中，本文提供的方法可在一种或多种潜在干扰性物质的存在下成功进行。潜在干扰性物质的实例包括BSA、葡萄糖、胆红素、亚硝酸盐、β-hCG、丙酮、低pH条件、高pH条件、醋氨酚、阿司匹林、黄体酮、炔雌醇、尿防腐剂、精液、人体润滑剂、避孕凝胶剂、杀精剂、女性粉剂、痔疮乳膏、咪康唑、人类基因组DNA、洗剂、通用转运培养基(病毒的)、艾米斯(amies)转运培养基(细菌的)、血液、粘蛋白、阿昔洛韦、冷疱治疗、尿、粪便、血红蛋白、甘油三酯、EDTA、肝素、胆固醇、γ-球蛋白、氨苄青霉素、烟碱、可替宁、喷鼻剂、滴鼻剂或它们的任意组合。在实施方式中，本文提供的方法可在潜在干扰性物质的存在下进行，该物质的浓度可达至少与2014年5月20日提交的美国临时专利申请号62/001,050中提供的一样大，该申请通过引用并入于此以用于所有目的。在实施方式中，本文提供的方法可在潜在干扰性物质的存在下进行，该物质的浓度可达比美国临时专利申请号62/001,050中提供的大至少10％、25％、50％或100％。
本文公开的测定和方法可在用于处理样品的装置或系统上进行。本文公开的测定和方法可容易地并入用于处理样品的装置或用于处理样品的系统中并在其中使用，该装置或系统可以是自动化的测定装置，或者可以是自动化的测定系统。此类装置以及此类系统可用于实施本文公开的方法。例如，装置可用于接收样品。装置可用于制备或用于处理样品。装置可用于对样品进行测定。装置可用于从样品获得数据。装置可用于传送从样品中获得的数据。装置可用于在处理或测定样品之后处置样品。
装置可以是系统的一部分，该系统的组件可以是样品处理装置。装置可以是样品处理装置。如本文所公开的，样品处理装置可配置为促进样品的采集、制备用于临床检验的样品，或进行使用一种或多种试剂的方法。样品处理装置可配置为从样品获得数据。样品处理装置可配置为传送从样品中获得的数据。样品处理装置可配置为分析来自样品的数据。样品处理装置可配置为与另一装置或实验室或隶属于实验室的个体通信，以分析从样品中获得的数据。
样品处理装置可配置为放置在受试者体内或受试者上。样品处理装置可配置为直接或间接地接纳来自受试者的样品。样品可以是，例如，血液样品(例如，由手指针刺或由静脉穿刺获得的样品，或动脉血样品)、尿液样品、活检样品、组织切片、粪便样品或其他生物样品；水样品、土壤样品、食物样品、空气样品；或其他样品。血液样品可以包括，例如，全血、血浆或血清。样品处理装置可通过该装置的外壳接收来自受试者的样品。样品采集可发生在样品采集地点或其他地方。可在样品采集地点向该装置提供样品。
在一些实施方式中，样品处理装置可配置为接收或容纳筒匣。在一些实施方式中，样品处理装置可包含筒匣。该筒匣可从样品处理装置中移除。在一些实施方式中，可向样品处理装置的筒匣提供样品。或者，可向样品处理装置的另一部分提供样品。该筒匣和/或装置可包含可配置为容纳样品的样品采集单元。
筒匣可包含样品，并可包含用于在处理或测试样品中使用的试剂、用于在处理或测试样品中使用的一次性用品或其他材料。筒匣可包含本文公开的用于进行本文公开的方法的试剂。将筒匣放置在样品处理装置上或将筒匣插入样品处理装置之后，筒匣的一个或多个组件可与样品处理装置的其他组件流体连通。例如，如果在筒匣处收集样品，则样品可转移至样品处理装置的其他部分。类似地，如果在筒匣上提供了一种或多种试剂，则该试剂可转移至样品处理装置的其他部分，或者样品处理装置的其他组件可得到该试剂。在一些实施方式中，筒匣的试剂或组件可保持在筒匣上。在一些实施方式中，不包括需要装管或需要维护(例如，人工或自动维护)的流体元件。
样品或试剂可转移至装置，诸如样品处理装置。样品或试剂可在装置内转移。样品或试剂的这种转移可在不提供从筒匣到装置的连续流体路径的情况下完成。样品或试剂的这种转移可在不提供装置内的连续流体路径的情况下完成。在实施方式中，样品或试剂的这种转移可以通过样品处理系统(例如移液器)来完成；例如，样品、试剂或其等分试样可被吸入顶端开放的转移组件如移液器端头中，该转移组件可以可操作地连接到样品处理系统，该样品处理系统将该端头以及包含在该端头内的样品、试剂或其等分试样一起转移至样品处理装置之上或之内的位置。该样品、试剂或其等分试样可存放在样品处理装置之上或之内的位置。样品和试剂或多种试剂可利用样品处理系统以相似的方式进行混合。筒匣的一个或多个组件可以以自动化方式转移至样品处理装置的其他部分，反之亦然。
装置，诸如样品处理装置，可具有流体处理系统。流体处理系统可进行或可帮助进行运输、稀释、提取、等分、混合以及对于流体如样品的其他操作。在一些实施方式中，流体处理系统可包含在装置外壳内。流体处理系统可允许流体的采集、递送、处理和/或运输，干燥试剂的溶解，液体和/或干燥试剂与液体的混合，以及非流体组分、样品或材料的采集、递送、处理和/或运输。该流体可以是样品、试剂、稀释液、洗液、染料或可被该装置使用的其他任何流体，并且可以包括但不限于均质流体、不同的液体、乳液、悬浮液和其他流体。流体处理系统(包括但不限于移液器)还可用于在该装置周围运输容器(其中含有或不含有流体)。流体处理系统可分配或抽吸流体。样品可包含漂浮在流体内的一个或多个微粒或固体物质。
在实施方式中，流体处理系统可包含移液器、移液器端头、注射器、毛细管或其他组件。流体处理系统可具有含内表面和外表面以及开放端的部分。流体处理系统可包含移液器(其可包括移液器主体和移液器的管嘴)并且可包含移液器端头。移液器端头可以是或可以不是能从移液器管嘴上移除的。在实施方式中，流体处理系统可使用与移液器端头配对的移液器；移液器端头可以是一次性的。端头在与移液器配对时，可形成流体密封。移液器端头可使用一次、两次或更多次。在实施方式中，流体处理系统可采用具有或不具有移液器端头的移液器或相似装置来抽吸、分配、混合、运输或以其他方式处理流体。需要时，可从流体处理系统中分配流体。在从例如移液器端头的孔口中分配之前流体可包含在移液器端头内。在实施方式，或在使用的情况下，可分配全部流体；在其他实施方式，或在使用的情况下，可分配端头内流体的一部分。移液器可选择性地抽吸流体。移液器可抽吸所选量的流体。移液器可以能够驱动搅拌机构以混合端头或容器内的流体。移液器可合并端头或容器，从而产生连续的流动回路以用于包括非液体形式的材料或试剂的混合。移液器端头还可通过多个流体的同时或按顺序(如在两段式底物反应中)计量递送来促进混合。
流体处理系统可包括一个或多个流体隔离的或液压独立的单元。例如，流体处理系统可包含一个、两个或更多个移液器端头。移液器端头可被配置为接纳并限制流体。端头可以是彼此流体隔离的或彼此液压独立的。包含在每个端头内的流体可以与其他端头内的一种流体以及与装置内的其他流体为流体隔离或液压独立的。流体隔离或液压独立的单元可以是相对于装置的其他部分和/或彼此可移动的。流体隔离或液压独立的单元可以是单独可移动的。流体处理系统可以包含一个或多个基部或支持体。基部或支持体可支持一个或多个移液器或移液器单元。基部或支持体可将流体处理系统的一个或多个移液器彼此连接。
样品处理装置可配置为对从受试者获得的样品进行处理步骤或操作。样品处理可包括样品制备，包括，例如，样品稀释、将样品分为等分试样、提取、与试剂接触、过滤、分离、离心或其他的预备或处理操作或步骤。样品处理装置可配置为对样品进行一个或多个样品制备操作或步骤。任选地，可制备样品以用于化学反应和/或物理处理步骤。样品制备操作或步骤可包括以下的一个或多个：离心、分离、过滤、稀释、富集、纯化、沉淀、温育、移液、运输、色谱分析、细胞裂解、细胞计数、粉碎、研磨、活化、超声处理、微柱处理、用磁珠处理、用纳米颗粒处理或其他样品制备操作或步骤。例如，样品制备可包括将血液分离为血清和/或微粒部分或者将任何其他样品分离为各个组分的一个或多个步骤。样品制备可包括稀释和/或浓缩样品如血液样品或其他生物样品的一个或多个步骤。样品制备可包括向样品中加入抗凝剂或其他成分。样品制备还可包括样品的纯化。在实施方式中，所有的样品处理、制备或测定操作或步骤均由单一装置执行。在实施方式中，所有的样品处理、制备或测定操作或步骤均在单一装置的外壳内执行。在实施方式中，大多数的样品处理、制备或测定操作或步骤由单一装置执行，并且可在单一装置的外壳内执行。在实施方式中，许多的样品处理、制备或测定操作或步骤由单一装置执行，并且可在单一装置的外壳内执行。在实施方式中，样品处理、制备或测定操作或步骤可由多于一个装置执行。
样品处理装置可配置为对样品运行一个或多个测定，并从该样品获得数据。样品处理装置可进行本文提供的方法以及附加的测定。测定可包括一种或多种物理或化学处理，并可包括运行一个或多个化学或物理反应。样品处理装置可配置为对体液的小样品进行一个、两个或更多个测定。可在具有一定体积的样品上进行一个或多个化学反应，如本文其他地方所述。例如，可在具有小于飞升(femtoliter)体积的丸剂中进行一个或多个化学反应。在实例中，样品采集单元被配置为接收相当于单滴或更少的血液或间质液体积的体液样品。在实施方式中，样品的体积可以是小体积，其中小体积可以是小于约1000μL，或小于约500μL，或小于约250μL，或小于约150μL，或小于约100μL，或小于约75μL，或小于约50μL，或小于约40μL，或小于约20μL，或小于约10μL、小于约5μL、小于约1μL、小于约0.5μL、小于约0.1μL的体积，或其他的小体积。在实施方式中，对单一样品进行所有的样品测定操作或步骤。在实施方式中，所有的样品测定操作或步骤均由单一装置执行。在实施方式中，所有的样品测定操作或步骤均在单一装置的外壳内执行。在实施方式中，大多数的样品测定操作或步骤由单一装置执行，并且可在单一装置的外壳内执行。在实施方式中，许多的样品测定操作或步骤由单一装置执行，并且可在单一装置的外壳内执行。在实施方式中，样品处理、制备或测定操作或步骤可由多于一个装置执行。
样品处理装置可配置为对样品进行多个测定。在一些实施方式中，样品处理装置可以配置为进行本文提供的方法以及一个、两个或更多个附加测定。在实施方式中，样品处理装置可配置为对单一样品进行多个测定。在实施方式中，样品处理装置可配置为对单一样品进行多个测定，其中该样品是小样品。例如，小样品可以具有为小于约1000μL，或小于约500μL，或小于约250μL，或小于约150μL，或小于约100μL，或小于约75μL，或小于约50μL，或小于约40μL，或小于约20μL，或小于约10μL、小于约5μL、小于约1μL、小于约0.5μL、小于约0.1μL的小体积或其他小体积的样品体积。样品处理装置可以能够对单一样品进行多重测定。多个测定可同时运行；可按顺序运行；或者一些测定可同时运行而其他测定按顺序运行。一个或多个对照测定和/或校准物(例如，包括具有用于测定/测试的校准物的对照的配置)也可并入该装置中；对照测定和对校准物的测定可与对样品进行的测定同时进行，或可在对样品进行的测定之前或之后进行，或以其任何组合方式进行。在实施方式中，所有的样品测定操作或步骤均由单一装置执行。在实施方式中，全部多个样品测定操作或步骤均在单一装置的外壳内执行。在实施方式中，多个测定中的大多数的样品测定操作或步骤由单一装置执行，并且可在单一装置的外壳内执行。在实施方式中，多个测定中的许多样品测定操作或步骤由单一装置执行，并且可在单一装置的外壳内执行。在实施方式中，样品处理、制备或测定操作或步骤可由多于一个装置来执行。
在实施方式中，全部多个测定可在短时间段内进行。在实施方式中，这样的短时间段包括少于约三小时，或少于约两小时，或少于约一小时，或少于约40分钟，或少于约30分钟，或少于约25分钟，或少于约20分钟，或少于约15分钟，或少于约10分钟，或少于约5分钟，或少于约4分钟，或少于约3分钟，或少于约2分钟，或少于约1分钟，或其他短时间段。
样品处理装置可配置为检测与样品相关的一种或多种信号。样品处理装置可配置为鉴定样品的一种或多种特性。例如，样品处理装置可配置为检测样品中一种分析物(例如，靶核酸)或多种分析物或疾病状况的存在或浓度(例如，在体液、分泌物、组织或其他样品中或通过体液、分泌物、组织或其他样品)。或者，样品处理装置可配置为检测一种或多种可被分析以检测样品中一种或多种分析物(其可以指示疾病状况)或疾病状况的存在或浓度的信号。该信号可在该装置上或另一位置进行分析。运行临床检验可以包括或可以不包括对所收集的数据的任何分析或比较。
可在有或没有样品的情况下进行化学反应或其他处理步骤。可由装置准备或运行的步骤、测试或测定的实例可包括但不限于免疫测定、核酸测定(例如本文提供的方法)、基于受体的测定、细胞计数测定、比色测定、酶测定、电泳测定、电化学测定、光谱测定、色谱测定、显微测定、地形测定(topographic assay)、量热测定、浊度测定、凝集测定、放射性同位素测定、粘度测定、凝聚测定、凝固时间测定、蛋白质合成测定、组织学测定、培养测定、摩尔渗透压浓度测定和/或其他类型的测定，离心、分离、过滤、稀释、富集、纯化、沉淀、粉碎、温育、移液、运输、细胞裂解或其他样品制备操作或步骤，或其组合。可由装置准备或运行的步骤、测试或测定可包括成像，包括显微镜检查、细胞计数以及制备或使用图像的其他技术。可由装置准备或运行的步骤、测试或测定可进一步包括对样品的组织学、形态学、运动学、动力学和/或状态的评估，该评估可包括对细胞的此类评估。
装置可以能够在短时间长度内进行所有的机载步骤(例如，由单一装置执行的步骤或操作)。装置可以能够在短时间长度内对单一样品进行所有的机载步骤。例如，从受试者样品采集到传输数据和/或分析可能花费约3小时或更少、2小时或更少、1小时或更少、50分钟或更少、45分钟或更少、40分钟或更少、30分钟或更少、20分钟或更少、15分钟或更少、10分钟或更少、5分钟或更少、4分钟或更少、3分钟或更少、2分钟或更少或1分钟或更少的时间。从将样品接纳在装置内到传输数据和/或针对此样品的装置分析的时间长度可能依赖于对样品进行的步骤、测试或测定的类型或数目。从将样品接纳在装置内到传输数据和/或针对此样品的装置分析的时间长度可能花费约3小时或更少、2小时或更少、1小时或更少、50分钟或更少、45分钟或更少、40分钟或更少、30分钟或更少、20分钟或更少、15分钟或更少、10分钟或更少、5分钟或更少、4分钟或更少、3分钟或更少、2分钟或更少或1分钟或更少的时间。
装置可配置为准备样品以供处置或配置为在样品的处理或测定后处置样品，诸如生物样品。
在实施方式中，样品处理装置可配置为传送从样品获得的数据。在实施方式中，样品处理装置可配置为通过网络进行通信。样品处理装置可包括可与网络接合的通信模块。样品处理装置可经由有线连接或无线地连接至网络。该网络可以是局域网(LAN)或广域网(WAN)如因特网。在一些实施方式中，该网络可以是个人局域网。该网络可包括云。样品处理装置可连接至网络而无需中间装置，或者可能需要中间装置将样品处理装置连接至网络。样品处理装置可以通过网络与另一装置通信，该另一装置可以是任何类型的联网装置，包括但不限于个人计算机、服务器计算机或膝上型计算机；个人数字助理(PDA)，诸如WindowsCE装置；电话，诸如蜂窝电话、智能电话(例如，iPhone、Android、Blackberry等)或位置感知的便携式电话(例如GPS)；漫游装置，诸如联网的漫游装置；无线装置，诸如无线电子邮件装置或能够与计算机网络无线通信的其他装置；或可以通过网络而可能通信并处理电子交易的其他任何类型的网络装置。这样的通信可包括向云计算基础设施或可被其他装置访问的其他任何类型的数据存储基础设施提供数据。
样品处理装置可以向例如卫生保健专业人员、卫生保健专业场所如实验室或其附属机构提供关于样品的数据。实验室、卫生保健专业人员或受试者中的一个或多个可具有能够接收或访问由该样品处理装置提供的数据的网络装置。样品处理装置可配置为向数据库提供关于样品的数据。样品处理装置可配置为向电子病历系统、向实验室信息系统、向实验室自动化系统或其他系统或软件提供关于样品的数据。样品处理装置可以以报告的形式提供数据。
实验室、装置或其他实体或软件可对关于样品的数据进行实时分析。软件系统可进行化学分析和/或病理分析，或者这些可分布在实验室、临床以及专业或专家人员的组合中。分析可包括样品的定性和/或定量评估。数据分析可包括随后对样品的定性和/或定量评估。任选地，报告可基于原始数据、预处理的数据或经分析的数据而生成。可制作这样的报告以便维持从样品获得的数据的机密性、关于从中获得样品的受试者的身份和其他信息、数据的分析以及其他机密信息。该报告和/或数据可传输至卫生保健专业人员。可向数据库、电子病历系统、向实验室信息系统、向实验室自动化系统或其他系统或软件提供由样品处理装置获得的数据或关于此类数据的分析或报告。
可使用或可与本文公开的方法、组合物或其他试剂一起使用的试剂、测定、方法、试剂盒、装置和系统的实例的描述和公开内容可见于，例如，美国专利8,088,593；美国专利8,380,541；2013年2月18日提交的美国专利申请序列号13/769,798；2013年2月18日提交的美国专利申请序列号13/769,779；2011年9月26日提交的美国专利申请序列号13/244,947；2012年9月25日提交的国际申请号PCT/US2012/57155；2011年9月26日提交的美国申请序列号13/244,946；2011年9月26日提交的美国专利申请13/244,949；以及2011年9月26日提交的美国申请序列号61/673,245；2014年3月15日提交的国际申请号PCT/US14/30034；和2014年3月15日提交的美国专利申请号14/214,850，这些专利和专利申请的公开内容均通过引用全文并入于此。
本申请要求2014年9月17日提交的美国临时专利申请号62/051,912；2014年9月17日提交的美国临时专利申请号62/051,945；2014年10月24日提交的美国临时专利申请号62/068,603；2014年10月24日提交的美国临时专利申请号62/068,605；2015年4月22日提交的美国临时专利申请号62/151,358；2014年3月15日提交的美国非临时专利申请号14/214,850；2014年3月15日提交的国际专利申请号PCT/US14/30034；和2014年9月17日提交的国际专利申请号PCT/US14/56151的权益和优先权，其各自的公开内容也通过引用而整体并入本文以用于所有目的。
2013年11月22日提交的美国临时专利申请号61/908,027；2014年5月20日提交的美国临时专利申请号62/001,050；和2013年3月15日提交的美国临时专利申请号61/800,606的公开内容也通过引用而整体并入本文以用于所有目的。
如PCT/US14/56151中所提供的方法和组合物
在实施方式中，本文提供的方法和组合物可包括如2014年9月17日提交的PCT/US14/56151中所提供的方法或组合物，其通过引用而整体并入本文以用于所有目的。PCT/US14/56151中提供的方法可在没有热循环的情况下进行。下文提供了如PCT/US14/56151中所提供的示例性方法和组合物。以下描述也适用于如本文所提供的适用于上下文的方法和组合物。
在一些实施方式中，本文提供了一种用于生成包含双链核酸模板的两个或更多个拷贝的多联体的方法，该方法包括：(A)在使得合成与双链核酸模板的第一链退火的第一引物的第一拷贝的延伸产物的条件下，用第一引物的第一拷贝和聚合酶处理包含双链核酸模板的一级双链核酸，其中第一引物包含5’末端核苷酸、3’末端核苷酸以及两个区域：(i)尾区，其包含：(a)引物的5’末端核苷酸，(b)最内核苷酸，其中该最内核苷酸在5’末端核苷酸的下游，(c)5’末端核苷酸与最内核苷酸之间的中间部分，该中间部分包含一个或多个核苷酸，以及(ii)模板结合区，其包括：(a)引物的3’末端核苷酸，(b)最内核苷酸，其中该最内核苷酸在3’末端核苷酸的上游，(c)3’末端核苷酸与最内核苷酸之间的中间部分，该中间部分包含一个或多个核苷酸，并且第一引物的第一拷贝的模板结合区与双链核酸模板的第一链退火，(B)在使得合成与步骤(A)的第一引物的第一拷贝的延伸产物退火的第二引物的延伸产物的条件下，用第二引物和聚合酶处理步骤(A)的第一引物的第一拷贝的延伸产物，其中第二引物包含5’末端核苷酸、3’末端核苷酸以及两个区域：(i)尾区，其包含：(a)引物的5’末端核苷酸，(b)最内核苷酸，其中该最内核苷酸在5’末端核苷酸的下游，(c)5’末端核苷酸与最内核苷酸之间的中间部分，该中间部分包含一个或多个核苷酸，以及(ii)模板结合区，其包含：(a)引物的3’末端核苷酸，(b)最内核苷酸，其中该最内核苷酸在3’末端核苷酸的上游，(c)3’末端核苷酸与最内核苷酸之间的中间部分，该中间部分包含一个或多个核苷酸，第二引物的尾区包含与第一引物的尾区的核苷酸序列互补的核苷酸序列，如果将所述序列对齐使得第二引物的5’末端核苷酸与第一引物的尾区的最内核苷酸对齐并且第一引物的5’末端核苷酸与第二引物的尾区的最内核苷酸对齐，第二引物的模板结合区与步骤(A)的第一引物的第一拷贝的延伸产物退火，并且第二引物的延伸产物含有5’末端核苷酸、3’末端核苷酸以及包含3’末端核苷酸的3’末端区，其中该3’末端区含有与在5’至3’方向读取的第二引物的尾区的核苷酸序列相同的核苷酸序列，且3’末端区的最后的核苷酸是第二引物的延伸产物的3’末端核苷酸，(C)在使得合成与步骤(B)的第二引物的延伸产物退火的第一引物的第二拷贝的延伸产物的条件下，用第一引物的第二拷贝和聚合酶处理步骤(B)的第二引物的延伸产物，以产生包含步骤(B)的第二引物的延伸产物和第一引物的第二拷贝的延伸产物的二级核酸的第一拷贝，其中第一引物的第二拷贝的延伸产物含有5’末端核苷酸、3’末端核苷酸以及包含3’末端核苷酸的3’末端区，其中该3’末端区含有与在5’至3’方向读取的第一引物的尾区的核苷酸序列相同的核苷酸序列，并且该3’末端区的最后的核苷酸是第二引物的延伸产物的3’末端核苷酸，(D)将至少步骤(C)重复另外一次或多次以生成步骤(C)的二级核酸的至少第二拷贝，(E)在使得二级核酸的第一拷贝的第一引物的第二拷贝的延伸产物的3’末端区与二级核酸的第二拷贝的第二引物的延伸产物的3’末端区退火的条件下，处理步骤(C)的二级核酸的第一拷贝以及步骤(D)的二级核酸的第二拷贝，以产生包含二级核酸的第一拷贝的第一引物的第二拷贝的延伸产物以及二级核酸的第二拷贝的第二引物的延伸产物的交换结构，(F)在使得合成二级核酸的第一拷贝的第一引物的第二拷贝的延伸产物的延伸产物以及合成二级核酸的第二拷贝的第二引物的延伸产物的延伸产物的条件下，用聚合酶处理步骤(E)的交换结构，以产生包含步骤(A)的双链核酸模板的两个拷贝的多联体，其中该多联体包含二级核酸的第一拷贝的第一引物的第二拷贝的延伸产物的延伸产物以及二级核酸的第二拷贝的第二引物的延伸产物的延伸产物。
在一些实施方式中，本文提供了一种用于生成包含多核苷酸模板或其类似序列的两个或更多个拷贝的多联体的方法，该方法包括：(A)在使得合成与多核苷酸模板退火的第一引物的第一拷贝的延伸产物的条件下，用第一引物的第一拷贝和聚合酶处理包含多核苷酸模板的一级核酸，其中第一引物包含5’末端核苷酸、3’末端核苷酸以及两个区域：(i)尾区，其包含：(a)引物的5’末端核苷酸，(b)最内核苷酸，其中该最内核苷酸在5’末端核苷酸的下游，(c)5’末端核苷酸与最内核苷酸之间的中间部分，该中间部分包含一个或多个核苷酸，以及(ii)模板结合区，其包括：(a)引物的3’末端核苷酸，(b)最内核苷酸，其中该最内核苷酸在3’末端核苷酸的上游，(c)3’末端核苷酸与最内核苷酸之间的中间部分，该中间部分包含一个或多个核苷酸，并且第一引物的第一拷贝的模板结合区与多核苷酸模板退火，(B)在使得合成与步骤(A)的第一引物的第一拷贝的延伸产物退火的第二引物的延伸产物的条件下，用第二引物和聚合酶处理步骤(A)的第一引物的第一拷贝的延伸产物，其中第二引物包含5’末端核苷酸、3’末端核苷酸以及两个区域：(i)尾区，其包含：(a)引物的5’末端核苷酸，(b)最内核苷酸，其中该最内核苷酸在5’末端核苷酸的下游，(c)5’末端核苷酸与最内核苷酸之间的中间部分，该中间部分包含一个或多个核苷酸，(ii)模板结合区，其包含：(a)引物的3’末端核苷酸，(b)最内核苷酸，其中该最内核苷酸在3’末端核苷酸的上游，(c)3’末端核苷酸与最内核苷酸之间的中间部分，该中间部分包含一个或多个核苷酸，第二引物的尾区包含与第一引物的尾区的核苷酸序列互补的核苷酸序列，如果将所述序列对齐使得第二引物的5’末端核苷酸与第一引物的尾区的最内核苷酸对齐以及第一引物的5’末端核苷酸与第二引物的尾区的最内核苷酸对齐，第二引物的模板结合区与步骤(A)的第一引物的第一拷贝的延伸产物退火，并且第二引物的延伸产物含有5’末端核苷酸、3’末端核苷酸以及包含3’末端核苷酸的3’末端区，其中该3’末端区含有与在5’至3’方向读取的第二引物的尾区的核苷酸序列相同的核苷酸序列，且3’末端区的最后的核苷酸是第二引物的延伸产物的3’末端核苷酸，(C)在使得合成与步骤(B)的第二引物的延伸产物退火的第一引物的第二拷贝的延伸产物的条件下，用第一引物的第二拷贝和聚合酶处理步骤(B)的第二引物的延伸产物，以产生包含步骤(B)的第二引物的延伸产物和第一引物的第二拷贝的延伸产物的二级核酸的第一拷贝，其中第一引物的第二拷贝的延伸产物含有5’末端核苷酸、3’末端核苷酸以及包含3’末端核苷酸的3’末端区，其中该3’末端区含有与在5’至3’方向读取的第一引物的尾区的核苷酸序列相同的核苷酸序列，并且该3’末端区的最后的核苷酸是第二引物的延伸产物的3’末端核苷酸，(D)将至少步骤(C)重复另外一次或多次以生成包含步骤(B)的第二引物的延伸产物和步骤(C)的第一引物的第二拷贝的延伸产物的二级核酸的至少第二拷贝，(E)在使得二级核酸的第一拷贝的第一引物的第二拷贝的延伸产物的3’末端区与二级核酸的第二拷贝的第二引物的延伸产物的3’末端区退火的条件下，处理步骤(C)的二级核酸的第一拷贝以及步骤(D)的二级核酸的第二拷贝，以产生包含二级核酸的第一拷贝的第一引物的第二拷贝的延伸产物以及二级核酸的第二拷贝的第二引物的延伸产物的交换结构，(F)在使得合成二级核酸的第一拷贝的第一引物的第二拷贝的延伸产物的延伸产物以及合成二级核酸的第二拷贝的第二引物的延伸产物的延伸产物的条件下，用聚合酶处理步骤(E)的交换结构，以产生包含步骤(A)的多核苷酸模板的两个拷贝的多联体，其中该多联体包含二级核酸的第一拷贝的第一引物的第二拷贝的延伸产物的延伸产物以及二级核酸的第二拷贝的第二引物的延伸产物的延伸产物。在一些实施方式中，步骤(A)的核酸聚合酶是DNA聚合酶。在一些实施方式中，步骤(A)的核酸聚合酶是逆转录酶。
在一些实施方式中，本文提供了一种用于生成包含双链核酸模板的两个或更多个拷贝的多联体的方法，该方法包括：(A)制备反应混合物，其包含：(i)包含双链核酸模板的一级核酸，(ii)分离的核酸聚合酶，(iii)第一引物，其包含5’末端核苷酸、3’末端核苷酸以及两个区域：(a)尾区，其包含：(1)引物的5’末端核苷酸，(2)最内核苷酸，其中该最内核苷酸在5’末端核苷酸的下游，(3)5’末端核苷酸与最内核苷酸之间的中间部分，该中间部分包含一个或多个核苷酸，以及(b)模板结合区，其包括：(1)引物的3’末端核苷酸，(2)最内核苷酸，其中该最内核苷酸在3’末端核苷酸的上游，(3)3’末端核苷酸与最内核苷酸之间的中间部分，该中间部分包含一个或多个核苷酸，其中模板结合区与核酸模板的第一链互补，(iv)第二引物，其包含5’末端核苷酸、3’末端核苷酸以及两个区域：(a)尾区，其包含：(1)引物的5’末端核苷酸，(2)最内核苷酸，其中该最内核苷酸在5’末端核苷酸的下游，(3)5’末端核苷酸与最内核苷酸之间的中间部分，该中间部分包含一个或多个核苷酸，以及(b)模板结合区，其包含：(1)引物的3’末端核苷酸，(2)最内核苷酸，其中该最内核苷酸在3’末端核苷酸的上游，(3)3’末端核苷酸与最内核苷酸之间的中间部分，该中间部分包含一个或多个核苷酸，并且其中模板结合区与核酸模板的第二链互补，并且其中如果将所述序列对齐使得第二引物的5’末端核苷酸与第一引物的尾区的最内核苷酸对齐并且第一引物的5’末端核苷酸与第二引物的尾区的最内核苷酸对齐，第二引物的尾区含有与第一引物的尾区的核苷酸序列互补的核苷酸序列，以及(B)在没有热循环的情况下将反应混合物温育至少3分钟。
在一些实施方式中，本文提供了一种用于生成包含多核苷酸模板的两个或更多个拷贝的多联体的方法，该方法包括：(A)制备反应混合物，其包含：(i)包含多核苷酸模板的核酸，(ii)分离的核酸聚合酶，(iii)第一引物，其包含5’末端核苷酸、3’末端核苷酸以及两个区域：(a)尾区，其包含：(1)引物的5’末端核苷酸，(2)最内核苷酸，其中该最内核苷酸在5’末端核苷酸的下游，(3)5’末端核苷酸与最内核苷酸之间的中间部分，该中间部分包含一个或多个核苷酸，以及(b)模板结合区，其包括：(1)引物的3’末端核苷酸，(2)最内核苷酸，其中该最内核苷酸在3’末端核苷酸的上游，(3)3’末端核苷酸与最内核苷酸之间的中间部分，该中间部分包含一个或多个核苷酸，并且其中模板结合区与多核苷酸模板互补，(iv)第二引物，其包含5’末端核苷酸、3’末端核苷酸以及两个区域：(a)尾区，其包含：(1)引物的5’末端核苷酸，(2)最内核苷酸，其中该最内核苷酸在5’末端核苷酸的下游，(3)5’末端核苷酸与最内核苷酸之间的中间部分，该中间部分包含一个或多个核苷酸，以及(b)模板结合区，其包含：(1)引物的3’末端核苷酸，(2)最内核苷酸，其中该最内核苷酸在3’末端核苷酸的上游，(3)3’末端核苷酸与最内核苷酸之间的中间部分，该中间部分包含一个或多个核苷酸，并且其中模板结合区与同多核苷酸模板互补的核苷酸序列互补，并且其中如果将所述引物的序列对齐使得第二引物的5’末端核苷酸与第一引物的尾区的最内核苷酸对齐并且第一引物的5’末端核苷酸与第二引物的尾区的最内核苷酸对齐，第二引物的尾区含有与第一引物的尾区的核苷酸序列互补的核苷酸序列，以及(B)在不高于80℃的温度下将反应混合物温育至少3分钟。
在一些实施方式中，本文提供了一种用于生成包含双链核酸模板的两个或更多个拷贝的多联体的方法，该方法包括：将包含双链核酸模板的双链核酸分子的第一拷贝和第二拷贝与聚合酶一起温育，以产生包含与交换结构的第二链的延伸产物退火的交换结构的第一链的延伸产物的多联体，其中该多联体包含双链核酸模板的两个拷贝，其中双链核酸分子包含各自含有多个核苷酸的第一链和第二链，第一链包含5’末端核苷酸和3’末端核苷酸，并含有5’至3’方向的通用格式的区域：A1-B-A2，第二链包含5’末端核苷酸和3’末端核苷酸，并含有5’至3’方向的通用格式的区域：C1-D-C2，区域B包含双链核酸模板的第一链的核苷酸序列，区域D包含双链核酸模板的第二链的核苷酸序列，在双链核酸分子中，区域A1与C2退火，B与D退火，且A2与C1退火，生成了包含双链核酸分子的第一拷贝的第一链以及双链核酸分子的第二拷贝的第二链的交换结构，其中第一链的A2区域与第二链的C2区域退火，合成了交换结构的第一链的延伸产物，并合成了交换结构的第二链的延伸产物。
在实施方式中，本文提供了一种拷贝多核苷酸模板的方法，该方法包括：在包含第一引物的多个拷贝和第二引物的多个拷贝的反应混合物中温育多核苷酸模板，其中：第一引物包含第一区域和第二区域，其中第一引物的第二区域包含与多核苷酸模板的第一部分互补的核苷酸序列；第二引物包含第一区域和第二区域，其中第二引物的第二区域包含与配偶体核苷酸序列互补的核苷酸序列，其中该配偶体核苷酸序列与多核苷酸模板的第二部分互补；并且在多核苷酸模板与第一引物的多个拷贝和第二引物的多个拷贝一起温育时，形成至少一条多联体链，其中该多联体链包含5’端和3’端，并且包含具有5’至3’方向的通用结构C’-T-C’-T-X-C’的核苷酸序列，其中：C’表示第二引物的第一区域的核苷酸序列，T表示多核苷酸模板的核苷酸序列或其类似序列，且X表示任何数目和序列的核苷酸。
在一些实施方式中，在本文提供的涉及形成包含具有5’至3’方向的通用结构C’-T-C’-T-X-C’的核苷酸序列的多联体链的方法中，该多联体链是第一多联体链，并且还形成了第二多联体链，其中该第二多联体链包含5’端和3’端，并且包含具有5’至3’方向的通用结构C-X’-T’-C-T’-C的核苷酸序列，其中：C表示第一引物的第一区域的核苷酸序列，T’表示与多核苷酸模板互补的核苷酸序列，且X’表示与X的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
在实施方式中，本文提供了测定生物样品中的靶多核苷酸模板的方法，该方法包括：A)在包含第一引物的多个拷贝和第二引物的多个拷贝的反应混合物中温育生物样品或其部分，其中：第一引物包含第一区域和第二区域，其中第一引物的第二区域包含与多核苷酸模板的第一部分互补的核苷酸序列；第二引物包含第一区域和第二区域，其中第二引物的第二区域包含与配偶体核苷酸序列互补的核苷酸序列，其中该配偶体核苷酸序列与多核苷酸模板的第二部分互补；并且在多核苷酸模板与第一引物的多个拷贝和第二引物的多个拷贝一起温育时，形成至少一条多联体链，其中该多联体链包含5’端和3’端，并且包含具有5’至3’方向的通用结构C’-T-C’-T-X-C’的核苷酸序列，其中：C’表示第二引物的第一区域的核苷酸序列，T表示多核苷酸模板的核苷酸序列或其类似序列，且X表示任何数目和序列的核苷酸；以及B)在A)温育步骤开始后在一个或多个点测量A)的反应混合物中扩增的核酸的量。在实施方式中，测量反应混合物中扩增的核酸的量可包括确定反应混合物中的荧光的水平。在实施方式中，该方法可进一步包括确定反应混合物中的核酸扩增的转变时间。
在实施方式中，在本文提供的涉及多联体链(其包含具有5’至3’方向的通用结构C’-T-C’-T-X-C’的核苷酸序列)的方法、反应混合物、容器或试剂盒中，X可含有具有5’至3’方向的通用结构[(C’-T)N]的序列，其中C’表示第二引物的第一区域的核苷酸序列，T表示多核苷酸模板的核苷酸序列或其类似序列，且N为0至2000之间的任何整数。在实施方式中，N可以是0至10、0至100、0至1000、0至5000、0至10,000、1至10、1至100、1至1000、1至2000、1至5000或1至10,000之间的任何整数。
在实施方式中，在本文提供的涉及多联体链(其包含具有5’至3’方向的通用结构C’-T-C’-T-X-C’的核苷酸序列)的方法、反应混合物、容器或试剂盒中，X可含有不多于0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、100、500、1000、10,000、50,000、100,000或500,000个核苷酸。在实施方式中，在本文提供的涉及多联体链(其包含具有5’至3’方向的通用结构C’-T-C’-T-X-C’的核苷酸序列)的方法、容器或试剂盒中，X可含有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、100、500、1000、10,000、50,000、100,000或500,000个核苷酸。在实施方式中，在本文提供的涉及多联体链(其包含具有5’至3’方向的通用结构C’-T-C’-T-X-C’的核苷酸序列)的方法、容器或试剂盒中，X可含有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、100、500、1000、10,000、50,000、100,000个核苷酸，并且不多于2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、100、500、1000、10,000、50,000、100,000或500,000个核苷酸。
在实施方式中，在本文提供的涉及多联体链(其包含具有5’至3’方向的通用结构C’-T-C’-T-X-C’的核苷酸序列)的方法、反应混合物、容器或试剂盒中，在至少一个C’与T之间，存在并非C’或T序列的一部分的一个或多个额外的核苷酸。所述一个或多个额外的核苷酸可以是，例如，1至10、1至20、1至100或1至1000个核苷酸。
在实施方式中，在本文提供的涉及多联体链(其包含具有5’至3’方向的通用结构C’-T-C’-T-X-C’的核苷酸序列)的方法、反应混合物、容器或试剂盒中，至少一个C’或T序列可缺失一个或多个核苷酸。在2个或更多个核苷酸缺失的情况下，缺失的核苷酸可以是邻近的，或者可以在分开的位置。所述一个或多个缺失的核苷酸可以是，例如，1至10、1至20、1至100或1至1000个核苷酸。
在实施方式中，在本文提供的涉及多联体链(其包含具有5’至3’方向的通用结构C’-T-C’-T-X-C’的核苷酸序列)的方法、反应混合物、容器或试剂盒中，至少一个C’或T序列可具有一个或多个点突变。在存在两个或更多个点突变的情况下，点突变可以是邻近的，或者可以在分开的位置。所述一个或多个点突变可以是，例如，1至10、1至20、1至100或1至1000个点突变。
在实施方式中，在本文提供的涉及多联体链(其包含具有5’至3’方向的通用结构C’-T-C’-T-X-C’的核苷酸序列)的方法、反应混合物、容器或试剂盒中，核苷酸序列具有以下特点中的两个或全部三个：i)在至少一个C’与T之间，存在并非C’或T序列的一部分的一个或多个额外的核苷酸；ii)至少一个C’或T序列缺失一个或多个核苷酸；以及iii)至少一个C’或T序列含有一个或多个点突变。
在实施方式中，在本文提供的涉及多联体链(其包含具有5’至3’方向的通用结构C’-T-C’-T-X-C’的核苷酸序列)的方法、反应混合物、容器或试剂盒中，在多核苷酸模板是RNA分子的实施方式中，T可表示与多核苷酸模板的RNA序列类似的DNA序列的核苷酸序列。
在实施方式中，在本文提供的涉及多联体链(其包含具有5’至3’方向的通用结构C’-T-C’-T-X-C’的核苷酸序列)的方法、反应混合物、容器或试剂盒中，该多联体链进一步包含位于最5’的C’序列的5’的一个或多个核苷酸。所述一个或多个核苷酸可以是，例如，1至10、1至20、1至100或1至1000个核苷酸。
在实施方式中，在本文提供的涉及多联体链(其包含具有5’至3’方向的通用结构C’-T-C’-T-X-C’的核苷酸序列)的方法、反应混合物、容器或试剂盒中，该多联体链进一步包含位于最3’的C’序列的3’的一个或多个核苷酸。所述一个或多个核苷酸可以是，例如，1至10、1至20、1至100或1至1000个核苷酸。
在实施方式中，本文提供了一种生成包含双链核酸模板的至少两个拷贝的多联体的方法，该方法包括：在反应混合物中温育至少第一模板分子和第二模板分子，其中：第一模板分子包含第一核酸链和第二核酸链，其中：第一模板分子的第一核酸链包含具有5’至3’方向的通用结构H’-S-Y1-H’的核苷酸序列，其中：H’表示第一同源序列的核苷酸序列，S表示双链核酸模板的第一链的核苷酸序列，且Y1表示任何数目和序列的核苷酸；并且第一模板分子的第二核酸链包含具有5’至3’方向的通用结构H-Y1’-S’-H的核苷酸序列，其中：H表示第二同源序列的核苷酸序列，其中第一同源序列与第二同源序列彼此互补，Y1’表示与Y1的核苷酸序列互补的核苷酸序列，且S’表示双链核酸模板的第二链的核苷酸序列，其中双链核酸模板的第一链和第二链彼此互补；并且第二模板分子包含第一核酸链和第二核酸链，其中：第二模板分子的第一核酸链包含具有5’至3’方向的通用结构H’-S-Y2-H’的核苷酸序列，其中：H’表示第一同源序列的核苷酸序列，S表示双链核酸模板的第一链的核苷酸序列，且Y2表示任何数目和序列的核苷酸；且第一模板分子的第二核酸链包含具有5’至3’方向的通用结构H-Y2’-S’-H的核苷酸序列，其中：H表示第二同源序列的核苷酸序列，Y2’表示与Y2的核苷酸序列互补的核苷酸序列，且S’表示双链核酸模板的第二链的核酸序列；并且在反应混合物中的第一模板分子与第二模板分子一起温育时，形成包含双链核酸模板的至少两个拷贝的至少一个多联体，其中多联体包含第一多联体链和第二多联体链，其中第一多联体链包含5’端和3’端，并包含具有5’至3’方向的通用结构H’-S-Y2-H’-S-Y1-H’的核苷酸序列，其中H’、Y1、S和Y2中的每一个均表示如上所述的核苷酸序列；并且其中第二多联体链包含5’端和3’端，并包含具有5’至3’方向的通用结构H-Y1’-S’-H-Y2’-S’-H的序列，其中，H’、Y1、S和Y2中的每一个均表示如上所述的核苷酸序列。
在实施方式中，在本文提供的包含第一多联体链(其包含具有5’至3’方向的通用结构H’-S-Y2-H’-S-Y1-H’的核苷酸序列)的方法、反应混合物、容器或试剂盒中，Y1和Y2中的至少一个或两者可表示0个核苷酸。
在实施方式中，在本文提供的涉及第一多联体链(其包含具有5’至3’方向的通用结构H’-S-Y2-H’-S-Y1-H’的核苷酸序列)的方法、反应混合物、容器或试剂盒中，Y1可含有具有5’至3’方向的通用结构[(H’-S)N1]的序列，其中H’和S表示如上所述的核苷酸序列，且N1是0至2000之间的任何整数。
在实施方式中，在本文提供的涉及第一多联体链(其包含具有5’至3’方向的通用结构H’-S-Y2-H’-S-Y1-H’的核苷酸序列)的方法、反应混合物、容器或试剂盒中，Y2可含有具有5’至3’方向的通用结构[(H’-S)N2]的序列，其中H’和S表示如上所述的核苷酸序列，且N2是0至2000之间的任何整数。
在实施方式中，在本文提供的涉及第一模板分子和第二模板分子的方法、反应混合物、容器或试剂盒中，第一模板分子和第二模板分子两者均为双链DNA分子。
在实施方式中，在本文提供的涉及第一模板分子的第一核酸链的方法、反应混合物、容器或试剂盒中，其中第一核酸链包含具有5’至3’方向的通用结构H’-S-Y1-H’的核苷酸序列，其中H’表示第一同源序列的核苷酸序列，第一同源序列可含有不多于4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90或100个核苷酸。在实施方式中，第一同源序列可含有至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90或100个核苷酸。在实施方式中，第一同源序列可含有至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90或100个且不多于5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100或200个核苷酸。
在实施方式中，本文提供的反应混合物、容器或试剂盒包含核酸聚合酶。在实施方式中，核酸聚合酶是具有链置换活性的DNA聚合酶。在实施方式中，核酸聚合酶是RNA聚合酶。在实施方式中，核酸聚合酶是逆转录酶。在实施方式中，反应混合物、容器或试剂盒包含多于一种核酸聚合酶，诸如具有链置换活性的DNA聚合酶和逆转录酶两种酶。在实施方式中，本文提供的反应混合物、容器或试剂盒包含核苷酸和缓冲液。
在实施方式中，在本文提供的涉及多核苷酸模板的方法、反应混合物、容器或试剂盒中，多核苷酸模板是单链分子。在实施方式中，在本文提供的涉及多核苷酸模板的方法、反应混合物、容器或试剂盒中，多核苷酸模板包含双链核酸模板的一条链。在实施方式中，在本文提供的涉及多核苷酸模板的方法、反应混合物、容器或试剂盒中，多核苷酸模板是DNA或RNA分子。
在实施方式中，在本文提供的涉及核酸模板的方法、反应混合物、容器或试剂盒中，核酸模板是RNA或DNA分子。在实施方式中，核酸模板可以是单链或双链分子。
在实施方式中，在本文提供的涉及温育反应混合物的方法中，在温育反应混合物的过程中，反应混合物的温度不超过90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、37、35、30、25或20℃。在实施方式中，在本文提供的方法中，该方法的所有步骤均在不高于90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、37、35、30、25或20℃的温度下进行。在实施方式中，本文提供的反应混合物、容器或试剂盒保持不高于90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、37、35、30、25、或20℃的温度。在实施方式中，本文提供的方法在没有热循环的情况下进行。
在实施方式中，在本文提供的涉及包含第一部分的多核苷酸模板的方法、反应混合物、容器或试剂盒中，第一部分含有不多于5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100或200个核苷酸。在实施方式中，在本文提供的涉及包含第一部分的多核苷酸模板的方法、反应混合物、容器或试剂盒中，第一部分含有至少5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100或200个核苷酸。在实施方式中，在本文提供的涉及包含第一部分的多核苷酸模板的方法、反应混合物、容器或试剂盒中，第一部分含有至少5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90或100个且不多于10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100或200个核苷酸。
在实施方式中，在本文提供的涉及包含第一区域的引物的方法、反应混合物、容器或试剂盒中，第一区域含有至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、或100个核苷酸。在实施方式中，在本文提供的涉及包含第一区域的引物的方法、反应混合物、容器或试剂盒中，第一区域含有不多于4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90或100个核苷酸。在实施方式中，在本文提供的涉及包含第一区域的引物的方法、反应混合物、容器或试剂盒中，第一区域含有至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80或90个且不多于5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90或100个核苷酸。在实施方式中，在本文提供的涉及包含第一区域的第一引物和含有第一区域的第二引物的方法、反应混合物、容器或试剂盒中，第一引物和第二引物两者均可具有以上所述的任何特征。在实施方式中，在本文提供的涉及包含第一区域的第一引物和含有第一区域的第二引物的方法、反应混合物、容器或试剂盒中，第一引物的第一区域和第二引物的第一区域可含有相同数目的核苷酸。在实施方式中，在本文提供的涉及包含第一区域的第一引物和含有第一区域的第二引物的方法、反应混合物、容器或试剂盒中，第一引物的第一区域和第二引物的第一区域可含有不同数目的核苷酸。
在实施方式中，在本文提供的涉及包含第二区域的引物的方法、反应混合物、容器或试剂盒中，第二区域含有至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、或100个核苷酸。在实施方式中，在本文提供的涉及包含第二区域的引物的方法、反应混合物、容器或试剂盒中，第二区域含有不多于4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90或100个核苷酸。在实施方式中，在本文提供的涉及包含第二区域的引物的方法、反应混合物、容器或试剂盒中，第二区域含有至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80或90个且不多于5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90或100个核苷酸。在实施方式中，在本文提供的涉及包含第二区域的第一引物和含有第二区域的第二引物的方法、反应混合物、容器或试剂盒中，第一引物和第二引物两者均可具有以上所述的任何特征。在实施方式中，在本文提供的涉及包含第二区域的第一引物和含有第二区域的第二引物的方法、反应混合物、容器或试剂盒中，第一引物的第二区域和第二引物的第二区域可含有相同数目的核苷酸。在实施方式中，在本文提供的涉及包含第二区域的第一引物和含有第二区域的第二引物的方法、反应混合物、容器或试剂盒中，第一引物的第二区域和第二引物的第二区域可含有不同数目的核苷酸。
在实施方式中，在本文提供的涉及包含第二区域的第二引物和包含第二部分的多核苷酸模板的方法、反应混合物、容器或试剂盒中，第二引物的第二区域的核苷酸序列与多核苷酸模板的第二部分的核苷酸序列相同。
在实施方式中，在本文提供的涉及包含尾区的引物的方法、反应混合物、容器或试剂盒中，尾区含有至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90或100个核苷酸。在实施方式中，在本文提供的涉及包含尾区的引物的方法、反应混合物、容器或试剂盒中，尾区含有不多于4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90或100个核苷酸。在实施方式中，在本文提供的涉及包含尾区的引物的方法、反应混合物、容器或试剂盒中，尾区含有至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80或90个且不多于5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90或100个核苷酸。在实施方式中，在本文提供的涉及包含尾区的第一引物和含有尾区的第二引物的方法、反应混合物、容器或试剂盒中，第一引物和第二引物两者均可具有以上所述的任何特征。在实施方式中，在本文提供的涉及包含尾区的第一引物和含有尾区的第二引物的方法、反应混合物、容器或试剂盒中，第一引物的尾区和第二引物的尾区可含有相同数目的核苷酸。在实施方式中，在本文提供的涉及包含尾区的第一引物和含有尾区的第二引物的方法、反应混合物、容器或试剂盒中，第一引物的尾区和第二引物的尾区可含有不同数目的核苷酸。
在实施方式中，在本文提供的涉及包含模板结合区的引物的方法、反应混合物、容器或试剂盒中，该模板结合区含有至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90或100个核苷酸。在实施方式中，在本文提供的涉及包含模板结合区的引物的方法、反应混合物、容器或试剂盒中，模板结合区含有不多于4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90或100个核苷酸。在实施方式中，在本文提供的涉及包含模板结合区的引物的方法、反应混合物、容器或试剂盒中，模板结合区含有至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80或90个且不多于5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90或100个核苷酸。在实施方式中，在本文提供的涉及包含模板结合区的第一引物和含有模板结合区的第二引物的方法、反应混合物、容器或试剂盒中，第一引物和第二引物两者均可具有以上所述的任何特征。在实施方式中，在本文提供的涉及包含模板结合区的第一引物和含有模板结合区的第二引物的方法、反应混合物、容器或试剂盒中，第一引物的模板结合区和第二引物的模板结合区可含有相同数目的核苷酸。在实施方式中，在本文提供的涉及包含模板结合区的第一引物和含有模板结合区的第二引物的方法、反应混合物、容器或试剂盒中，第一引物的模板结合区和第二引物的模板结合区可含有不同数目的核苷酸。
在实施方式中，在本文提供的涉及多核苷酸模板的方法、反应混合物、容器或试剂盒中，多核苷酸模板可含有至少8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、200、500、1000、2000或5000个核苷酸。在实施方式中，在本文提供的涉及多核苷酸模板的方法、反应混合物、容器或试剂盒中，多核苷酸模板可含有不多于8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、200、500、1000、2000、5000或10,000个核苷酸。在实施方式中，在本文提供的涉及多核苷酸模板的方法、反应混合物、容器或试剂盒中，多核苷酸模板可含有至少8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、200、500、1000、2000或5000个且不多于9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、200、500、1000、2000、5000或10,000个核苷酸。
在实施方式中，在本文提供的涉及双链核酸模板的方法、反应混合物、容器或试剂盒中，双链核酸模板的每一条链可含有至少8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、200、500、1000、2000或5000个核苷酸。在实施方式中，在本文提供的涉及双链核酸模板的方法、反应混合物、容器或试剂盒中，双链核酸模板的每一条链可含有不多于8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、200、500、1000、2000、5000或10,000个核苷酸。在实施方式中，在本文提供的涉及双链核酸模板的方法、反应混合物、容器或试剂盒中，双链核酸模板的每一条链可含有至少8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、200、500、1000、2000或5000个且不多于9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、200、500、1000、2000、5000或10,000个核苷酸。
在实施方式中，本文提供的反应混合物、容器或试剂盒不含有重组酶。
在实施方式中，本文提供的方法、反应混合物、容器或试剂盒可含有或涉及引物的多个拷贝。所述多个拷贝可以是，例如，引物的至少5、10、15、20、50、100、500、1000、10,000、100,000或1,000,000个拷贝。
在实施方式中，本文提供的反应混合物或容器可包含来自受试者的生物样品的至少一部分。该生物样品可以是，例如，唾液、血液、尿液、脸颊拭子或鼻拭子。该受试者可以是人。
在一些实施方式中，本文提供的方法的所有步骤均在不高于70、65、60、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15或10℃的温度下进行。在一些实施方式中，本文提供的方法的一些步骤在不高于70、65、60、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15或10℃的温度下进行。
在一些实施方式中，本文提供的方法的两个或更多个步骤在相同的反应混合物中同时进行。在一些实施方式中，本文提供的方法的所有步骤均在相同的反应混合物中同时进行。
在一些实施方式中，在本文提供的方法中，在该方法开始后的5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、120或180分钟内核酸模板扩增了至少10、100、1000、10,000、100,000或1,000,000倍。在一些实施方式中，在本文提供的方法中，在该方法开始后的5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、120或180分钟内反应混合物中核酸模板的拷贝数增加了至少10、100、1000、10,000、100,000或1,000,000倍。
在实施方式中，本文提供的核酸模板可以是单链或双链核酸模板。
在实施方式中，本文提供了一种容器，该容器包含在其中流体连通的：第一引物，其中该第一引物包含第一区域和第二区域，并且其中第一引物的第二区域包含与多核苷酸模板的第一部分互补的核苷酸序列；第二引物，其中该第二引物包含第一区域和第二区域，并且其中第二引物的第二区域包含与配偶体核苷酸序列互补的核苷酸序列，其中该配偶体核苷酸序列与多核苷酸模板的第二部分互补；以及至少一条多联体链，其中该多联体链包含5’端和3’端，并且包含具有5’至3’方向的通用结构C’-T-C’-T-X-C’的核苷酸序列，其中：C’表示第二引物的第一区域的核苷酸序列，T表示多核苷酸模板的核苷酸序列或其类似序列，且X表示任何数目和序列的核苷酸。
在一些实施方式中，本文提供了一种容器，该容器包含在其中流体流通的：(A)分离的核酸聚合酶，(B)包含至少第一链的核酸模板，(C)第一引物，其包含5’末端核苷酸、3’末端核苷酸以及两个区域：(i)尾区，其包含：(a)引物的5’末端核苷酸，(b)最内核苷酸，其中该最内核苷酸在5’末端核苷酸的下游，(c)5’末端核苷酸与最内核苷酸之间的中间部分，该中间部分包含一个或多个核苷酸，以及(ii)模板结合区，其包括：(a)引物的3’末端核苷酸，(b)最内核苷酸，其中该最内核苷酸在3’末端核苷酸的上游，(c)3’末端核苷酸与最内核苷酸之间的中间部分，该中间部分包含一个或多个核苷酸，其中模板结合区与核酸模板的第一链互补，以及(D)第二引物，其包含5’末端核苷酸、3’末端核苷酸以及两个区域：(i)尾区，其包含：(a)引物的5’末端核苷酸，(b)最内核苷酸，其中该最内核苷酸在5’末端核苷酸的下游，(c)5’末端核苷酸与最内核苷酸之间的中间部分，该中间部分包含一个或多个核苷酸，以及(ii)模板结合区，其包含：(a)引物的3’末端核苷酸，(b)最内核苷酸，其中该最内核苷酸在3’末端核苷酸的上游，(c)3’末端核苷酸与最内核苷酸之间的中间部分，该中间部分包含一个或多个核苷酸，并且其中模板结合区与同核酸模板的第一链互补的核苷酸序列互补，并且其中如果将引物的序列对齐使得第二引物的5’末端核苷酸与第一引物的尾区的最内核苷酸对齐并且第一引物的5’末端核苷酸与第二引物的尾区的最内核苷酸对齐，第二引物的尾区含有与第一引物的尾区的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
在实施方式中，本文提供了一种试剂盒，其包含两个或更多个流体隔离的器皿，该器皿共同包含：第一引物，其中第一引物包含第一区域和第二区域，并且其中第一引物的第二区域包含与多核苷酸模板的第一部分互补的核苷酸序列；第二引物，其中第二引物包含第一区域和第二区域，并且其中第二引物的第二区域包含与配偶体核苷酸序列互补的核苷酸序列，其中该配偶体核苷酸序列与核苷酸模板的第二部分互补；以及分离的具有链置换活性的DNA聚合酶；其中：第一引物的第一区域和第二引物的第一区域互补。
在一些实施方式中，本文提供了一种用于检测包含至少第一链的感兴趣的靶核酸的试剂盒，该试剂盒包含两个或更多个流体隔离的器皿，该器皿共同包含：(A)分离的核酸聚合酶，(B)第一引物，其包含5’末端核苷酸、3’末端核苷酸以及两个区域：(i)尾区，其包含：(a)引物的5’末端核苷酸，(b)最内核苷酸，其中该最内核苷酸在5’末端核苷酸的下游，(c)5’末端核苷酸与最内核苷酸之间的中间部分，该中间部分包含一个或多个核苷酸，以及(ii)模板结合区，其包括：(a)引物的3’末端核苷酸，(b)最内核苷酸，其中该最内核苷酸在3’末端核苷酸的上游，(c)3’末端核苷酸与最内核苷酸之间的中间部分，该中间部分包含一个或多个核苷酸，其中模板结合区与靶核酸的第一链互补，以及(C)第二引物，其包含5’末端核苷酸、3’末端核苷酸以及两个区域：(i)尾区，其包含：(a)引物的5’末端核苷酸，(b)最内核苷酸，其中该最内核苷酸在5’末端核苷酸的下游，(c)5’末端核苷酸与最内核苷酸之间的中间部分，该中间部分包含一个或多个核苷酸，以及(ii)模板结合区，其包含：(a)引物的3’末端核苷酸，(b)最内核苷酸，其中该最内核苷酸在3’末端核苷酸的上游，(c)3’末端核苷酸与最内核苷酸之间的中间部分，该中间部分包含一个或多个核苷酸，并且其中模板结合区与同靶核酸的第一链互补的核苷酸序列互补，并且其中如果将引物的序列对齐使得第二引物的5’末端核苷酸与第一引物的尾区的最内核苷酸对齐并且第一引物的5’末端核苷酸与第二引物的尾区的最内核苷酸对齐，第二引物的尾区含有与第一引物的尾区的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
在一些实施方式中，本文提供的试剂盒包含具有感兴趣的靶核酸的核苷酸序列的核酸。
在一些实施方式中，本文提供的反应混合物、容器或试剂盒包含核酸染料。
在一些实施方式中，在本文提供的包含分离的核酸聚合酶的容器或试剂盒中，分离的核酸聚合酶是DNA聚合酶。在一些实施方式中，在本文提供的包含分离的核酸聚合酶的容器或试剂盒中，分离的核酸聚合酶是逆转录酶。在一些实施方式中，在本文提供的包含分离的核酸聚合酶的容器或试剂盒中，该容器或试剂盒包含DNA聚合酶和逆转录酶两者。
在一些实施方式中，在本文提供的包含核酸聚合酶的方法、容器或试剂盒中，该核酸聚合酶具有链置换活性。
在一些实施方式中，本文提供的方法包括用核酸染料处理一个或多个反应组分或该方法的步骤。
在一些实施方式中，在本文提供的包含核酸模板的方法、容器或试剂盒中，模板是DNA分子。在一些实施方式中，在本文提供的包含核酸模板的方法、容器或试剂盒中，模板是RNA分子。
在一些实施方式中，在本文提供的包含第一引物的方法、容器或试剂盒中，第一引物的尾区包含至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸。在一些实施方式中，在本文提供的包含第一引物的方法、容器或试剂盒中，第一引物的尾区包含不多于4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50或60个核苷酸。
在一些实施方式中，在本文提供的包含第二引物的方法、容器或试剂盒中，第二引物的尾区包含至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸。在一些实施方式中，在本文提供的包含第二引物的方法、容器或试剂盒中，第二引物的尾区包含不多于4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50或60个核苷酸。
在一些实施方式中，在本文提供的包含第一引物的方法、容器或试剂盒中，第一引物的模板结合区包含至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸。在一些实施方式中，在本文提供的包含第一引物的方法、容器或试剂盒中，第一引物的模板结合区包含不多于4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50或60个核苷酸。
在一些实施方式中，在本文提供的包含第二引物的方法、容器或试剂盒中，第二引物的模板结合区包含至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸。在一些实施方式中，在本文提供的包含第二引物的方法、容器或试剂盒中，第二引物的模板结合区包含不多于4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50或60个核苷酸。
在一些实施方式中，在本文提供的其中RNA分子是模板分子或一级核酸的方法和组合物中，模板的扩增可以指对应于RNA分子的DNA链的拷贝的生成。
在一些实施方式中，本文提供的方法包括测量来自包括本方法的测定的荧光信号。
在一些实施方式中，核酸连接酶可包含在本文提供的方法或组合物中。在一些实施方式中，相比于如果核酸连接酶不包含在反应中，当连接酶包含在反应混合物中用于本文提供的方法时，采用本文提供的方法可更快速地扩增核酸模板。在实施方式中，本文提供的反应混合物、容器或试剂盒可含有具有连接酶活性的酶。
在实施方式中，本文提供了一种测定样品中的病原体的方法，该方法包括进行如本文提供的方法以从病原体中扩增核酸。在实施方式中，在本文提供的组合物或方法中使用的靶核酸可以是来自病原体的核酸。在实施方式中，在本文提供的方法中使用的第一和第二引物可各自含有与病原体的核酸中的序列互补的区域，或者与同病原体核酸中的序列互补的序列互补的区域。在实施方式中，病原体的核酸可以是DNA或RNA。病原体可包括但不限于病毒、细菌、真菌和原生生物。样品可来自受试者，并可具有本文其他地方所述的任何样品特征。
在实施方式中，本文提供的用于核酸扩增的方法可用于人体或动物体外部的诊断方法。例如，样品可从人或动物中获得，并且可用本文提供的用于核酸扩增的方法测定样品中感兴趣的靶核酸。
在实施方式中，本文提供的方法可包括：a)在反应混合物中提供一种或多种用于进行如本文所述的方法的试剂(例如，第一引物、第二引物、核酸模板、核酸聚合酶、核苷酸、缓冲液、水等中的一种或多种)，以及b)在基本等温的温度下温育反应混合物，其中在温育期间反应混合物的温度偏离中心温度不多于或少于20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1摄氏度。在实施方式中，中心温度可以是，例如，30、35、40、45、50、55、60、65、70、75或80摄氏度。
在实施方式中，本文提供的方法可以在基本等温的温度下进行。在实施方式中，基本等温的温度可以是30、35、40、45、50、55、60、65、70、75或80摄氏度加或减20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1摄氏度中的任何温度。
在实施方式中，本文提供的方法可在一个或多个温度下进行，该温度均不超过90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30或25摄氏度。
在实施方式中，本文提供的方法可在没有热循环的情况下进行/反应混合物可在没有热循环(即没有升高和降低温育温度以分离链或使引物杂交的循环，如在例如基于PCR的方法中使用的)的条件下温育。
在本文提供的涉及包含第一区域的第一引物和含有第一区域的第二引物的组合物和方法中，其中第一引物的第一区域与第二引物的第一区域互补，在实施方式中，第一引物的第一区域和第二引物的第一区域含有核苷酸序列，使得双链结构不会形成限制酶识别序列，该双链结构根据沃森-克里克碱基配对原则通过第一引物的第一区域与第二引物的第一区域退火而形成。
在本文提供的涉及核酸聚合酶的组合物和方法中，在实施方式中，该核酸聚合酶具有3’至5’外切核酸酶活性。
在实施方式中，本文提供了一种用于扩增靶核酸链的方法，该方法包括：在基本上等温的条件下温育包含靶核酸链、第一引物和第二引物的反应混合物，其中：所述靶核酸链包含第一部分和第二部分；所述第一引物包含第一区域和第二区域，其中所述第一区域包含该引物的5’端，所述第二区域包含该引物的3’端，并且所述第二区域与该核酸链的第一部分互补；所述第二引物包含第一区域和第二区域，其中所述第一区域包含该引物的5’端，所述第二区域包含该引物的3’端，并且所述第二区域与同该核酸链的第二部分互补的序列互补；所述第一引物的第一区域与所述第二引物的第一区域互补；并扩增靶核酸链。任选地，该靶核酸链可进一步包含第三部分，其中所述第三部分位于该靶核酸链中第一部分与第二部分之间，并且其中所述第二引物的第一区域与所述靶核酸链的第三部分互补。
在实施方式中，在本文提供的任何方法中，多核苷酸模板、靶核酸链等可含有内部基序，其中本文提供的用于扩增靶核酸链的引物的尾区与该内部基序互补。
在实施方式中，本文提供的方法可进一步包括向本文提供的反应混合物中添加肽-核酸(PNA)探针和与DNA-PNA杂合体结合的染料，其中该PNA探针与用于在反应混合物中扩增的靶核酸或其互补序列互补。
在实施方式中，本文提供的反应混合物可包含具有链置换活性的DNA聚合酶。
当核酸在本文被描述为被“扩增”等时，该核酸还可被描述为被“拷贝”等。
在实施方式中，在本文描述为具有第一区域和第二区域的引物中，所述第一区域可含有该引物的5’端，并且所述第二区域可含有该引物的3’端。
在实施方式中，在本文描述为具有尾区和模板结合区的引物中，所述第一区域可含有该引物的5’端，并且所述第二区域可含有该引物的3’端。
在实施方式中，本文提供了用于拷贝多核苷酸模板的方法，该方法包括：在没有热循环的条件下温育包含多核苷酸模板、第一引物和第二引物的反应混合物，其中：所述多核苷酸模板包含第一部分和第二部分；所述第一引物包含第一区域和第二区域，其中所述第一区域包含该引物的5’端，所述第二区域包含该引物的3’端，并且所述第二区域与该多核苷酸模板的第一部分互补；所述第二引物包含第一区域和第二区域，其中所述第一区域包含该引物的5’端，所述第二区域包含该引物的3’端，并且所述第二区域与同该多核苷酸模板的第二部分互补的序列互补；所述第一引物的第一区域与所述第二引物的第一区域互补；并生成该多核苷酸模板的多个拷贝。任选地，该多核苷酸模板可进一步包含第三部分，其中所述第三部分位于该多核苷酸模板中第一部分与第二部分之间，并且其中所述第二引物的第一区域与所述多核苷酸模板的第三部分互补。
在实施方式中，本文提供了一种用于扩增多核苷酸模板的方法，该方法包括在包含第一引物和第二引物的反应混合物中温育所述多核苷酸模板，其中：所述多核苷酸模板包含第一部分、第二部分和第三部分，其中所述第三部分位于该多核苷酸模板中第一部分与第二部分之间；所述第一引物包含第一区域和第二区域，其中所述第一引物的第二区域与所述多核苷酸模板的第一部分互补；并且所述第二引物包含第一区域和第二区域，其中所述第二引物的第二区域与同所述多核苷酸模板的第二部分互补的序列互补，所述第二引物的第一区域与所述第一引物的第一区域互补，并且所述第二引物的第一区域与所述多核苷酸模板的第三部分互补。
在实施方式中，本文提供了一种用于评估在多核苷酸模板中核苷酸序列的感兴趣位置处的核苷酸身份的方法，该方法包括：A)在至少第一反应混合物和第二反应混合物的每一个中提供所述多核苷酸模板的拷贝，其中：该多核苷酸模板包含第一部分、第二部分和第三部分，其中所述第三部分位于该多核苷酸模板中所述第一部分与所述第二部分之间，并且其中所述感兴趣的位置在第三部分中；所述第一反应混合物包含所述多核苷酸模板的拷贝、第一引物和第二引物，其中：所述第一引物包含第一区域和第二区域，其中所述第一区域包含该引物的5’端，所述第二区域包含该引物的3’端，并且所述第二区域与所述多核苷酸模板的第一部分互补；所述第二引物包含第一区域和第二区域，其中所述第一区域包含该引物的5’端，所述第二区域包含该引物的3’端，并且所述第二区域与同所述多核苷酸模板的第二部分互补的序列互补；所述第一引物的第一区域与所述第二引物的第一区域互补；并且所述第二引物的第一区域与所述多核苷酸模板的第三部分互补；所述第二反应混合物包含所述多核苷酸模板的拷贝、第三引物和第四引物，其中：所述第三引物包含第一区域和第二区域，其中所述第一区域包含该引物的5’端，所述第二区域包含该引物的3’端，并且所述第二区域与所述多核苷酸模板的第一部分互补；所述第四引物包含第一区域和第二区域，其中所述第一区域包含该引物的5’端，所述第二区域包含该引物的3’端，并且所述第二区域与同所述多核苷酸模板的第二部分互补的序列互补；所述第三引物的第一区域与所述第四引物的第一区域互补；并且所述第四引物的第一区域与所述多核苷酸模板的第三部分互补；并且所述第二引物的第一区域的核苷酸序列与所述第四引物的第一区域的核苷酸序列有一个核苷酸不同，其中如果为了序列的最大互补而用所述多核苷酸模板的第三部分的核苷酸序列定位所述第二引物或第四引物的第一区域的核苷酸序列，则在所述第二引物与第四引物中不同的核苷酸的位置对应于所述多核苷酸模板中感兴趣的核苷酸的位置；B)在没有热循环的条件下温育所述第一反应混合物和第二反应混合物；以及C)比较所述第一反应混合物中多核苷酸模板的扩增速率或量与所述第二反应混合物中多核苷酸模板的扩增速率或量，其中所述多核苷酸模板的扩增速率或量指示所述第二或第四引物的第一区域与所述多核苷酸模板的第三部分的核苷酸序列之间的互补程度。
任选地，在本文提供的涉及多核苷酸模板的实施方式中，该多核苷酸模板是DNA链。
任选地，在本文提供的涉及多核苷酸模板的实施方式中，该多核苷酸模板是RNA链。
任选地，在本文提供的涉及多核苷酸模板的实施方式中，该多核苷酸模板是双链体核酸分子的一条链。在实施方式中，该双链体核酸分子是双链体DNA分子或双链体RNA分子。
任选地，在本文提供的涉及反应混合物、容器或试剂盒的实施方式中，该反应混合物、容器或试剂盒包含具有链置换活性的DNA聚合酶。
任选地，在本文提供的涉及反应混合物、容器或试剂盒的实施方式中，该反应混合物、容器或试剂盒包含逆转录酶。
任选地，在本文提供的涉及反应混合物、容器或试剂盒的实施方式中，该反应混合物、容器或试剂盒包含核酸染料、核苷酸或缓冲液。
任选地，在本文提供的涉及含有第一部分、第二部分和第三部分的多核苷酸模板的实施方式中，该多核苷酸模板可具有3’至5’方向的元件的通用结构1P-1S-3P-2S-2P，其中“1P”是所述第一部分，“1S”是第一间隔区(space)，“3P”是所述第三部分，“2S”是第二间隔区，并且“2P”是所述第二部分。所述“第一间隔区”和“第二间隔区”是所述多核苷酸模板的部分，它们含有不是所述第一部分、第二部分或第三部分的一部分的核苷酸。在实施方式中，所述第一部分可具有，例如，6至30个核苷酸或如本文其他地方所述的任何其他数目的核苷酸。在实施方式中，所述第一间隔区可具有，例如，2至30个核苷酸或如本文其他地方所述的任何其他数目的核苷酸。在实施方式中，所述第三部分可具有，例如，4至14个核苷酸或如本文其他地方所述的任何其他数目的核苷酸。在实施方式中，所述第一间隔区可具有，例如，2至30个核苷酸或如本文其他地方所述的任何其他数目的核苷酸。在实施方式中，所述第一部分可具有，例如，6至30个核苷酸或如本文其他地方所述的任何其他数目的核苷酸。
在实施方式中，在本文提供的涉及在反应混合物中温育多核苷酸模板的方法中，可以在该反应混合物的温育过程中生成包含所述多核苷酸模板的至少2、3、4、5或10个拷贝的多联体链。
在实施方式中，本文提供了一种用于扩增双链核酸分子的方法，该方法包括在包含第一引物和第二引物的反应混合物中温育所述双链核酸分子，其中：所述双链核酸分子包含第一链和第二链，其中所述第一链包含第一部分和第三部分，并且所述第二链包含第二部分；所述第一引物包含第一区域和第二区域，其中所述第一引物的第二区域与所述第一链的第一部分互补；并且所述第二引物包含第一区域和第二区域，其中所述第二引物的第二区域与所述第二链的第二部分互补，所述第二引物的第一区域与所述第一链的第三部分互补，并且所述第二引物的第一区域与所述第一引物的第一区域互补。
在实施方式中，本文提供了一种反应混合物，其包含：多核苷酸模板、第一引物和第二引物，其中：所述多核苷酸模板包含第一部分、第二部分和第三部分，其中所述第三部分位于该多核苷酸模板中第一部分与第二部分之间；所述第一引物包含第一区域和第二区域，其中所述第一区域包含该引物的5’端，所述第二区域包含该引物的3’端，并且所述第二区域与所述多核苷酸模板的第一部分互补；所述第二引物包含第一区域和第二区域，其中所述第一区域包含该引物的5’端，所述第二区域包含该引物的3’端，并且所述第二区域与同所述多核苷酸模板的第二部分互补的序列互补；所述第一引物的第一区域与所述第二引物的第一区域互补；并且所述第二引物的第一区域与所述多核苷酸模板的第三部分互补。
在实施方式中，本文提供了一种用于扩增多核苷酸模板的试剂盒，该试剂盒包含：第一引物和第二引物，其中：所述第一引物包含第一区域和第二区域，其中所述第一区域包含该引物的5’端，所述第二区域包含该引物的3’端，并且所述第二区域与所述多核苷酸模板的第一部分互补；所述第二引物包含第一区域和第二区域，其中所述第一区域包含该引物的5’端，所述第二区域包含该引物的3’端，并且所述第二区域与同所述多核苷酸模板的第二部分互补的序列互补；所述第一引物的第一区域与所述第二引物的第一区域互补；并且所述第二引物的第一区域与所述多核苷酸模板的第三部分互补，其中所述第三部分位于该多核苷酸模板中第一部分与第二部分之间。
任选地，在本文提供的涉及试剂盒的实施方式中，该试剂盒的组分可以在至少两个单独的流体隔离的器皿之间分配。
在实施方式中，本文提供了一种包含两个或更多个流体隔离的器皿的试剂盒，所述器皿共同包含：第一引物、第二引物、第三引物和第四引物，其中：所述第一引物包含第一区域和第二区域，其中所述第一区域包含该引物的5’端，所述第二区域包含该引物的3’端，并且所述第二区域与多核苷酸模板的第一部分互补；所述第二引物包含第一区域和第二区域，其中所述第一区域包含该引物的5’端，所述第二区域包含该引物的3’端，并且所述第二区域与同所述多核苷酸模板的第二部分互补的序列互补；所述第三引物包含第一区域和第二区域，其中所述第一区域包含该引物的5’端，所述第二区域包含该引物的3’端，并且所述第二区域与所述多核苷酸模板的第一部分互补；所述第四引物包含第一区域和第二区域，其中所述第一区域包含该引物的5’端，所述第二区域包含该引物的3’端，并且所述第二区域与同所述多核苷酸模板的第二部分互补的序列互补；所述第一引物的第一区域与所述第二引物的第一区域互补；所述第三引物的第一区域与所述第四引物的第一区域互补；并且所述第一引物的第一区域的核苷酸序列与所述第三引物的第一区域的核苷酸序列有一个核苷酸不同。任选地，所述第二引物的第一区域和所述第四引物的第一区域均与所述多核苷酸模板的第三部分互补，其中所述第三部分位于该多核苷酸模板中第一部分与第二部分之间。任选地，所述第一引物、第二引物、第三引物和第四引物中的每一个的第二区域为6至30个核苷酸的长度。任选地，所述第一引物、第二引物、第三引物和第四引物中的每一个的第二区域为6至30个核苷酸的长度。
在本文提供的涉及试剂盒的实施方式中，该试剂盒可包含对照核酸链，该对照核酸链包含有待用该试剂盒的试剂检测的多核苷酸模板的核苷酸序列。
在本文提供的方法和组合物中，任选地，可包括PNA探针和染料DiSc2(5)。该PNA探针可以与用于在相关反应中扩增的靶序列及其拷贝特异性地退火，从而形成DNA-PNA双链体。本文提供的方法可包括检测在染料DiSc2(5)与DNA-PNA双链体结合时该染料的颜色变化。在实施方式中，可以在反应开始之后或反应结束之后，向本文提供的反应混合物中添加PNA探针和染料。在实施方式中，可以在反应开始之后至少5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90或100分钟，向本文提供的反应混合物中添加PNA探针和染料。在实施方式中，可以在反应开始之后不超过5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90或100分钟，向本文提供的反应混合物中添加PNA探针和染料。
除非上下文另外明确指出，否则本文中对生成多核苷酸模板或核酸模板的拷贝或扩增多核苷酸模板或核酸模板的提及包括生成含有多核苷酸模板/核酸模板的序列的拷贝，以及生成含有多核苷酸模板/核酸模板的类似序列的拷贝。例如，如果多核苷酸模板是RNA，则生成模板的拷贝可包括生成这样的拷贝，该拷贝是含有多核苷酸模板的RNA序列的DNA形式的DNA分子(即，在DNA序列中，含有“T”而非“U”)。
在一些实施方式中，本文提供的方法或组合物可用于检测靶核酸中感兴趣的特定核苷酸的存在或不存在(例如，在突变或SNP的情况下)。例如，可选择与靶核酸中包括感兴趣的核苷酸或与之相邻的区域选择性结合的第一或第二引物。该引物可设计为使得其选择性地：i)当该区域含有感兴趣的核苷酸时与该区域结合，或ii)当该区域含有感兴趣的核苷酸时不与该区域结合。可用所选引物来进行如本文所述的方法，并且扩增反应的结果可提供关于靶核酸中感兴趣的核苷酸存在或不存在的信息。例如，如果第一引物的模板结合区被设计为具有与包含感兴趣的特定核苷酸(例如突变)的靶核酸中的序列互补的核苷酸序列，则用所选引物从样品中成功扩增靶核酸可表明该样品含有具有感兴趣的特定核苷酸的靶核酸。在一些实施方式中，用于分析靶核酸中感兴趣的核苷酸的引物可在该引物的3’末端含有关键核苷酸(即对应于靶核酸中感兴趣的核苷酸的同一位置的核苷酸)。在这样的情况下，引物的3’末端核苷酸的退火可能依赖于靶核酸中感兴趣的核苷酸的存在。如果引物的3’末端核苷酸不与靶核酸中的核苷酸退火(例如由于核苷酸之间的错配)，则该错配可显著影响核酸聚合酶由引物合成延伸产物。因此，在一些实施方式中，具有对应于感兴趣的核苷酸的3’末端核苷酸的引物可用于确定靶核酸中特定核苷酸的存在或不存在。在这样的实施方式中，在一些情况下可选择在引物的3’末端的关键核苷酸与靶核酸中感兴趣的核苷酸互补，并且在一些其他情况下可选择在引物的3’末端的关键核苷酸与靶核酸中感兴趣的核苷酸不互补。感兴趣的核苷酸可代表例如靶核酸的野生型形式、突变体形式或多态性。
在其他实施方式中，可通过选择引物，使得感兴趣的核苷酸存在于不与第一或第二引物的模板结合区互补的区域中的靶核酸中，来检测靶核酸中感兴趣的特定核苷酸(例如突变或SNP)。例如，感兴趣的核苷酸可以大约在靶核酸序列的中间。在实施方式中，感兴趣的核苷酸可以在本文其他地方所述的“内部基序”中。在实施方式中，当感兴趣的核苷酸在内部基序中时，可以将引物对制备成在引物的尾区中含有与内部基序或其互补体互补，并且可用于确定在靶序列中的内部基序中存在或不存在感兴趣的核苷酸的核苷酸序列。如本文其他地方所解释的，引物的尾区中的核苷酸序列与该引物的延伸产物中的内部基序暂时退火可提高本文提供的反应的速率。在一些情况下，引物的尾区中的核苷酸序列对该引物的延伸产物中的内部基序的亲和力越大，反应可越快发生。而且，通常，在引物的尾区中的核苷酸序列中可与该引物的延伸产物中的内部基序中的核苷酸结合的核苷酸数目越大，该延伸产物的尾区中的核苷酸序列对于延伸产物中的内部基序的亲和力越大。因此，在实施方式中，采用本文提供的组合物和方法，可以通过使用引物来确定在靶序列中存在或不存在感兴趣的核苷酸，所述引物在引物的尾区中具有能与靶序列中的内部基序或其互补体结合的核苷酸序列，并且在尾区内具有或不具有与内部基序或其互补体中感兴趣的特定核苷酸特异性结合的核苷酸。通常，当引物的尾区中的核苷酸序列含有与该引物的延伸产物中的核苷酸(对应于靶标中感兴趣的核苷酸)互补的核苷酸时，将比当引物的尾区中的相关核苷酸不与该引物的延伸产物中的核苷酸(对应于靶标中感兴趣的核苷酸)互补时更快地发生反应。例如，野生型形式的靶核酸链的内部基序可具有核苷酸序列：5’TATTGCAT 3’。然而，在群体中的许多个体中，该序列中的“G”可频繁突变为“A”。为了确定特定靶核酸是否在序列中含有“G”或其他核苷酸，可以制备在其尾区中含有具有序列5’ATGCAATA 3’的核苷酸序列的引物。如果使用该引物(和合适的第二引物)根据本文提供的方法扩增靶核酸，则当“G”存在于内部基序中时，相对于当在该内部基序中“G”的位置处存在不同的核苷酸时，扩增反应可具有特定的反应速率。这是因为如果“G”存在于内部基序中，则引物的尾区中的核苷酸序列将与内部基序完全互补，但是如果在G的正常位置处存在非“G”的核苷酸，则将不会完全互补。通常，在这一实例中，如果“G”存在于内部基序中，与不存在“G”相比，引物的尾区将与内部基序更频繁地退火，并且这可以转而导致存在“G”时比不存在“G”时更快的反应速率。采用本文提供的系统和方法，可以制备引物，以确定存在或不存在感兴趣的核苷酸(例如，可以制备引物，使得当存在突变形式的核苷酸时比存在野生型形式的核苷酸时更快地发生反应，或反之亦然)。而且，在实施方式中，可以制备引物，以便确定在靶标中的内部基序中在感兴趣的位置处的未知核苷酸的身份。例如，可以制备四个不同的引物对，每一个根据情况含有对应于靶核酸中感兴趣的核苷酸的A、T、G或C。在实施方式中，产生最快反应结果的引物对可能指示哪个核苷酸存在于靶核酸中的内部基序中感兴趣的位置处。例如，靶核酸可具有通常具有5’至3’方向的序列GTAACGAG的内部基序。然而，靶核酸的不同变体可在内部基序的第5位置(即“C”的位置)处具有不同的核苷酸。继续该实例，如果提供含有靶核酸的样品，其中不知道在内部基序的第5位置处是何种核苷酸，则可将该样品分成至少4个部分，并且这四个部分可用于第一反应混合物、第二反应混合物、第三反应混合物和第四反应混合物。向第一反应混合物中提供第一引物对，其中引物分别具有包含5’至3’方向的序列CTCGTTAC和GTAACGAG的尾区。如果“C”存在于内部基序的第5位置处，则这些尾区将与该内部基序或其互补体完全互补。因此，如果靶标在这一反应混合物中扩增最快，则表明“C”存在于该靶标中的内部基序中感兴趣的核苷酸的位置处。向第二反应混合物中提供第二引物对，其中引物分别具有包含5’至3’方向的序列CTCATTAC和GTAATGAG的尾区。如果“T”存在于内部基序的第5位置处，则这些尾区将与该内部基序或其互补体完全互补。因此，如果靶标在这一反应混合物中扩增最快，则表明“T”存在于该靶标中的内部基序中感兴趣的核苷酸的位置处。向第三反应混合物中提供第三引物对，其中引物分别具有包含5’至3’方向的序列CTCCTTAC和GTAAGGAG的尾区。如果“G”存在于内部基序的第5位置处，则这些尾区将与该内部基序或其互补体完全互补。因此，如果靶标在这一反应混合物中扩增最快，则表明“G”存在于该靶标中的内部基序中感兴趣的核苷酸的位置处。向第四反应混合物中提供第四引物对，其中引物分别具有包含5’至3’方向的序列CTCTTTAC和GTAAAGAG的尾区。如果“A”存在于内部基序的第5位置处，则这些尾区将与该内部基序或其互补体完全互补。因此，如果靶标在这一反应混合物中扩增最快，则表明“A”存在于该靶标中的内部基序中感兴趣的核苷酸的位置处。在实施方式中，如果例如不希望筛选所有可能的核苷酸变体(例如，如果在感兴趣的位置通常发现仅2个不同的核苷酸)，则以上概述的方法或组合物可以任选地仅用2或3种反应混合物来准备，这些反应混合物具有对应于在感兴趣的位置处仅有2或3个核苷酸选项的引物对。
在实施方式中，根据本文提供的方法，含有靶核酸的样品可被分成至少第一和第二部分，其中第一部分在具有第一引物对的第一反应混合物中温育，并且第二部分在具有第二引物对的第二反应混合物中温育。在实施方式中，第一引物对和第二引物对彼此仅在引物各自的尾区/第一区域中有一个核苷酸不同(例如，第一对的第一引物的第一区域的序列与第二对的第一引物的第一区域的序列仅有一个核苷酸不同)。在引物的尾区中不同的单一核苷酸可对应于靶核酸中感兴趣的核苷酸的位置。通过比较在第一反应混合物中与在第二反应混合物中靶核酸的扩增速率或量，可以确定在靶核酸中的感兴趣的核苷酸的身份。在实施方式中，以上概述的方法可采用样品的第一、第二、第三和第四部分以及第一引物对、第二引物对、第三引物对和第四引物对进行，其中如上所述，第一引物对、第二引物对、第三引物对和第四引物对彼此仅在引物各自的尾区/第一区域中有一个核苷酸不同。
在实施方式中，可提供至少第一靶核酸和第二靶核酸，其中第一靶核酸和第二靶核酸如本文其他地方所述在内部基序中感兴趣的位置处有一个核苷酸不同。在实施方式中，根据本文提供的方法，第一靶核酸可在含有本文所述的引物对的第一反应混合物中温育，并且第二靶核酸可在含有相同引物对的第二反应混合物中温育。通过比较在第一反应混合物中的第一靶核酸与在第二反应混合物中的第二靶核酸的扩增速率或量，或与绝对值比较，根据本文其他地方所述的原理，可以确定在第一靶核酸和第二靶核酸的一个或两者中感兴趣的位置处的核苷酸的身份。
此外，在实施方式中，本文所述用于检测感兴趣的单一核苷酸的组合物和方法也可以用来检测多个核苷酸突变或多态性。
实施例
以下实施例仅为了说明目的而提供，而非意在以任何方式限制本公开内容。
实施例1-用于MRSA检测的引物
制备用于在第一扩增反应中从共同双链核酸分子扩增第一遗传元件(mecA)和第二遗传元件(来自金黄色葡萄球菌的orfX)的引物。示例性遗传元件分析第一扩增反应第一引物在5’至3’方向具有以下序列：GAACCAACGCATGACCCAAG(SEQ ID NO:3)；TTGAACCAACGCATGACCC(SEQ ID NO:4)；CAGACGAAAAAGCACCAGAA(SEQ ID NO:5)；GCACCAGAAAATATGAGCGAC(SEQ ID NO:6)。示例性遗传元件分析第一扩增反应第二引物在5’至3’方向具有以下序列：ATCCGGTACTGCAGAACTCA(SEQ ID NO:7)；GCAAATCCGGTACTGCAGAA(SEQ ID NO:8)；ATTGGCAAATCCGGTACTGC(SEQ ID NO:9)；GGCAGACAAATTGGGTGGTT(SEQ IDNO:10)。示例性遗传元件分析第二扩增反应第一引物在5’至3’方向具有以下序列：GCCAATGACGAATACAAAGTC(SEQ ID NO:11)。示例性遗传元件分析第二扩增反应第二引物在5’至3’方向具有以下序列：TAATAGCCATCATCATGTTTGG(SEQ ID NO:12)。
实施例2-野生型和突变的丙型肝炎NS3基因的扩增
制备九种不同的反应混合物。每种反应混合物含有相同的试剂和引物浓度，但反应混合物在引物和模板方面不同。在九种反应混合物中，为三种不同模板中的每一种准备三种：模板1：野生型NS3[5’至3’方向的核苷酸序列：GGAACGAGGACCATCGCATCACCCAAGGGTCCTGTTATCCAGATGTATACCAATGTAGACCAAGACCTCGTGGGCTGGCCCGCTCCTCAAGGTGCCCGCTCATTGACACCCTGCACCTGCG(SEQ ID NO:13)]；模板2：Q80K突变NS3[5’至3’方向的核苷酸序列：GGAACGAGGACCATCGCATCACCCAAGGGTCCTGTTATCCAGATGTATACCAATGTAGACAAAGACCTCGTGGGCTGGCCCGCTCCTCAAGGTGCCCGCTCATTGACACCCTGCACCTGCG(SEQ ID NO:14)]；模板3：无模板对照。对于每种不同的模板，制备3种不同的反应混合物，其中每种不同的反应混合物具有不同的引物对：引物对1：第一引物[5’至3’方向的核苷酸序列：TTTGTCTAAAGGGTCCTGTTATCC(SEQ IDNO:15)]，第二引物[5’至3’方向的核苷酸序列：TAGACAAACAGCCCACGAGG(SEQ ID NO:16)]，引物对2：第一引物[5’至3’方向的核苷酸序列：TTTGTCTAGTTATCCAGATGTAT(SEQ ID NO:17)]，第二引物[5’至3’方向的核苷酸序列：TAGACAAACCAGCCCACGAGGTC(SEQ ID NO:18)]，引物对3：第一引物[5’至3’方向的核苷酸序列：TCTTGGTCCAAGGGTCCTGTTATC(SEQ ID NO:19)]，第二引物[5’至3’方向的核苷酸序列：GACCAAGAAGGGTGTCAATGAGC(SEQ ID NO:20)]。反应混合物各自含有以下试剂：乙酸钾(50mM)；乙酸镁(10mM)；DTT(1mM)；吐温-
Figure GDA0001387860250000821
(0.08％)；Tris-HCl，pH7.9(20mM)；甜菜碱(800mM)；dNTP混合物(每种dNTP各1.4mM)；Syto
Figure GDA0001387860250000822
(2uM)；Bst DNA聚合酶(0.8U/ul)；AMV逆转录酶(0.016U/ul)；各自的第一引物和第二引物(各0.8uM)；和各自的模板。在质粒中提供模板序列。图3提供了不同扩增反应的结果。Y轴显示不同反应的转变时间(以分钟为单位)。无模板反应显示由于背景信号导致的最终转变时间。在X轴上，基于引物对将反应分组在一起。从左到右，第一组反应是使用引物对1，然后是引物对2，然后是引物对3。在针对每对引物对的每组3个柱条中，这些柱条针对以下模板，从左到右：野生型NS3；Q80K突变NS3；无模板对照。如图3所示，野生型和Q80K突变模板具有不同的转变时间，取决于用来扩增序列的引物对。
虽然本文已经示出和描述了本发明的优选实施方式，但对于本领域技术人员显而易见的是，这些实施方式只是以示例的方式提供的。本领域技术人员现将在不偏离本发明的情况下想到许多更改、改变和替代。应当理解，在实践本发明的过程中可以采用本文所描述的本发明实施方式的各种替代方式。例如，一个实施方式的特征可与另一个实施方式的特征相组合，无论这种组合在本文中是否已经描述。还应当理解，虽然出于方便的目的，本文中已经使用有限数目的术语和短语描述了本文提供的发明，但本发明也可以使用本文未提供的同样准确描述本发明的其他术语和短语进行描述。
应当理解，除非上下文另有明确规定，否则在本文的说明书和随后的整个权利要求书中使用的“一个”、“一种”和“该”的含义包括复数的提及物。例如，提到“一个测定”可以指单个测定或多个测定。另外，除非上下文另有明确规定，否则在本文的说明书和随后的整个权利要求书中使用的“在……中”的含义包括“在……中”和“在……上”。所附权利要求不应解释为包括装置加功能式限定，除非在给定的权利要求中使用短语“用于……的装置”明确地叙述了这样的限定。如在此处的说明书和随后的整个权利要求书中所用的，描述为含有第二个对象的“至少一部分”的第一对象可含有所有量的/完整的第二对象。
如在此处的说明书和随后的整个权利要求书中所用的，术语“包含”、“包括”和“含有”以及相关的时态是包含在内且开放式的，并且不排除额外的、未叙述的要素或方法步骤。而且，在一些情况下，拓宽性词语和短语如“一个或多个(一种或多种)”、“至少”、“但不限于”或其他类似短语的存在不应被理解为有以下含义：在可能不存在这类拓宽性短语的情况下，预期或要求较窄的范围。最后，除非上下文另有明确规定，否则在此处的说明书和随后的整个权利要求书中使用的“或”的含义包括连接性和转折性的含义。因此，除非上下文另有明确规定，否则术语“或”包括“和/或”。
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Claims (23)

1.第一扩增反应混合物、连接混合物和第二扩增反应混合物的组合,在用于制备检测共同双链核酸分子上的第一遗传元件和第二遗传元件的试剂盒中的用途，
其特征在于：
该第一扩增反应混合物包含：i)共同双链核酸分子，其中该共同双链核酸分子包含第一链和第二链，以及第一遗传元件和第二遗传元件，其中所述第一遗传元件包含第一遗传元件第一互补序列和第一遗传元件第二互补序列，其中所述第二遗传元件包含第二遗传元件第一互补序列和第二遗传元件第二互补序列，其中所述第一遗传元件第一互补序列和所述第二遗传元件第一互补序列是所述第一链的一部分，并且其中所述第一遗传元件第二互补序列和所述第二遗传元件第二互补序列是所述第二链的一部分；ii)第一扩增反应第一引物，其中该第一扩增反应第一引物具有与所述第一遗传元件第一互补序列互补的核苷酸序列；和iii)第一扩增反应第二引物，其中该第一扩增反应第二引物具有与所述第二遗传元件第二互补序列互补的核苷酸序列；
该连接反应混合物包含i)第一扩增反应产物，所述第一扩增反应产物包含所述第一遗传元件的至少一部分和所述第二遗传元件的至少一部分，并且其中该第一扩增反应产物具有双链、线性构型；和ii)连接酶；以及
该第二扩增反应混合物包含：i)由所述第一扩增反应产物形成的环状连接产物，所述环状连接产物是双链的并且包含环状连接产物第一链和环状连接产物第二链，并且其中该环状连接产物第一链包含所述第一扩增反应产物第一链的核苷酸，并且该环状连接产物第二链包含所述第一扩增反应产物第二链的核苷酸；ii)第二扩增反应第一引物，其中该第二扩增反应第一引物具有与所述第一遗传元件第二互补序列互补的核苷酸序列；和iii)第二扩增反应第二引物，其中该第二扩增反应第二引物具有与所述第二遗传元件第一互补序列互补的核苷酸序列,其中所述第一遗传元件和所述第二遗传元件在所述双链核酸分子上彼此被至少2000个且不多于50000个核苷酸隔开；和
其中，该检测包括步骤：
在所述第一扩增反应混合物中进行第一扩增反应，并且其中在所述第一扩增反应混合物中生成第一扩增反应产物；
在所述连接反应混合物中进行连接反应，其中在所述连接反应混合物中，由所述第一扩增反应产物形成环状连接产物；
在所述第二扩增反应混合物中进行第二扩增反应，其中在所述第二扩增反应混合物中生成第二扩增反应产物，其中该第二扩增反应产物包含所述第一遗传元件的至少一部分和所述第二遗传元件的至少一部分；和检测所述第二扩增反应产物。
2.如权利要求1所述的用途，其中所述第一遗传元件和所述第二遗传元件在所述双链核酸分子上彼此被至少4000个且不多于50000个核苷酸隔开。
3.如权利要求1或2所述的用途，其中所述第一扩增反应为PCR扩增反应。
4.如权利要求1述的用途，其中所述第一扩增反应第一引物和所述第一扩增反应第二引物各自为至少6个核苷酸且不多于50个核苷酸的长度。
5.如权利要求1所述的用途，其中所述第一扩增反应混合物中的所述第一扩增反应第一引物和所述第一扩增反应第二引物中的至少一个在所述引物的5’端被磷酸化。
6.如权利要求1所述的用途，其中所述第一扩增反应混合物中的所述第一扩增反应第一引物和所述第一扩增反应第二引物均在所述引物的5’端被磷酸化。
7.如权利要求1所述的用途，其进一步包括，在进行所述连接反应之前，将所述第一扩增反应产物与激酶一起温育。
8.如权利要求7所述的用途，其中所述激酶为T4多核苷酸激酶。
9.如权利要求1所述的用途，其中所述连接酶为T4 DNA连接酶。
10.如权利要求1所述的用途，其中所述第二扩增反应第一引物和所述第二扩增反应第二引物各自为至少6个核苷酸且不多于60个核苷酸的长度。
11.如权利要求1所述的用途，其中所述第二扩增反应为PCR扩增反应。
12.如权利要求1所述的用途，其中所述第二扩增反应在没有热循环的情况下进行。
13.如权利要求12所述的用途，其中所述第二扩增反应第一引物包含第一区域和第二区域，其中所述第二扩增反应第一引物的第二区域与所述第二遗传元件第一互补序列互补，并且所述第二扩增反应第二引物包含第一区域和第二区域，其中所述第二扩增反应第二引物的第二区域与所述第一遗传元件第二互补序列互补，并且其中所述第二扩增反应第二引物的第一区域与所述第二扩增反应第一引物的第一区域互补。
14.如权利要求13所述的用途，其中所述第二扩增反应第二引物的第一区域还与所述环状连接产物的第一链的至少一部分互补。
15.如权利要求1所述的用途，其中所述第二扩增产物在其生成时实时地进行检测。
16.如权利要求1所述的用途，其中所述第一遗传元件为抗生素抗性基因。
17.如权利要求1所述的用途，其中所述第二遗传元件为病原体基因。
18.如权利要求1所述的用途，其中所述第一遗传元件为mecA基因。
19.如权利要求1所述的用途，其中所述第二遗传元件为来自金黄色葡萄球菌的基因。
20.如权利要求1所述的用途，其进一步包括从受试者获取生物样品，其中来自所述受试者的生物样品含有所述共同双链核酸分子。
21.如权利要求20所述的用途，其中所述来自受试者、含有所述共同双链核酸分子的生物样品含有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌生物体中的共同双链核酸分子。
22.如权利要求1所述的用途，其中所述第一扩增反应、所述连接反应和所述第二扩增反应均在同一容器中发生。
23.如权利要求1所述的用途，其中所述第一扩增反应、所述连接反应和所述第二扩增反应在不同容器中发生。
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