CN110462042B - 抗病毒剂 - Google Patents

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Abstract

提供一种具有二氨基磷酸吗啉代寡聚体的抗病毒剂，所述寡聚体具有针对寨卡病毒(ZIKV)毒株的基因组的一部分的反义序列。所述抗病毒剂具有许多用途，比如在药用组合物，治疗ZIKV介导的疾病的方法，预防ZIKV介导的疾病的方法，减少或防止ZIKV在宿主细胞中的复制的方法，控制ZIKV在捐献的组织、经处理的组织样品中的扩散的方法中，以及在用于治疗或预防ZIKV介导的疾病的药物的制备中。

Description

抗病毒剂
相关申请的交叉参考
本申请引用了美国专利申请号62/434802 (2016年12月15日递交)和62/560144(2017年9月18日递交)的优先权，两者均在审理中。上述两个申请均通过参考以其全部结合至本文中。
背景
A. 公开领域
本公开总体上涉及药物，并且具体地讲涉及抗病毒剂。提供这种抗病毒剂以及与其一起使用的方法和试剂盒。
B. 背景
寨卡病毒(ZIKV)为黄病毒科、黄病毒属的成员，该属还包括登革热、西尼罗、日本脑炎和黄热病病毒。ZIKV为蚊子传播的虫媒病毒，主要通过伊蚊属(Aedes)科的载体传播，特别是埃及伊蚊(Aedes aegypti)和白纹伊蚊(Aedes albopictus)。ZIKV已迅速蔓延到美洲和加勒比海地区的超过50个国家，感染了超过200万人。ZIKV感染导致70%-80%的感染个体出现无症状疾病；然而，ZIKV感染与婴儿的格林-巴利综合征和小头畸形的发病率增加密切相关。ZIKV感染的临床表现包括皮疹、头痛、肌痛、关节疼痛和结膜炎，但在很大程度上为自限性的。然而，在免疫抑制的情况下的ZIKV疾病知之甚少。在Nogueira等人的一个小案例研究中，他们发现ZIKV的同种异体移植传播可在免疫抑制的SOTp (实体器官移植患者)中发生，导致肾移植和肝移植患者两者的临床疾病。在这项研究中，入院时在移植之后感染ZIKV的4名患者出现细菌感染、发热、肌痛和无力以及急性肝脏或肾脏损害的迹象。他们没有皮疹、结膜炎或神经症状，但4人中有3人为贫血，并且全部为血小板减少。
目前没有针对ZIKV感染的特异性治疗或疫苗。这代表了对ZIKV有效治疗的迫切未满足的医疗需求。即使要开发疫苗，ZIKV疾病的零星爆发也可能需要广泛的疫苗接种，这可能不是成本有效的。对于治疗急性疾病的治疗性干预或接受来自ZIKV感染的捐献者的同种异体移植的免疫抑制的SOTp的及时预防的需求是必要的。
概述
以上阐述的问题及其他问题通过有效防止ZIKV复制的抗病毒剂的发明来解决(尽管应当理解，并非所有这种问题都将通过每个这种实施方案来解决)。
在第一方面，提供一种包含二氨基磷酸吗啉代寡聚体的抗病毒剂，所述寡聚体包含针对ZIKV毒株的基因组的一部分的反义序列。
在第二方面，提供一种用于治疗或预防由ZIKV介导的疾病的药用组合物，组合物包含：以上抗病毒剂和药学上可接受的载体。
在第三方面，提供一种在需要它的受试者中治疗或预防由ZIKV介导的疾病的方法，方法包括给予受试者治疗有效量的以上药用组合物。
在第四方面，提供一种减少或防止ZIKV在宿主细胞中的复制的方法，方法包括使宿主细胞与以上抗病毒剂接触。
在第五方面，提供一种控制ZIKV在捐献的组织中扩散的方法，方法包括使捐献的组织暴露于有效量的以上抗病毒剂。
在第六方面，提供一种经处理的捐献的组织样品，其包含捐献的组织样品和以上抗病毒剂。
在第七方面，提供以上抗病毒剂在制备用于治疗或预防由ZIKV介导的疾病的药物中的用途。
以上呈现简化的概述，以提供对所要求保护的主题的一些方面的基本理解。该概述不是一个广泛的综述。其不旨在识别重要或关键的要素或者描述所要求保护的主题的范围。其唯一目的是以简化形式呈现一些概念，作为稍后呈现的更详细描述的序言。
附图简述
图1A和1B：在用DWK-M1处理之后用ZIKV感染的人肾小球足细胞的RT-PCR分析。(1A) 用ZIKV感染72小时的肾小球足细胞的定量实时qRT-PCR分析。显示模拟感染的足细胞、用野生型ZIKV感染的足细胞和用DWK-M1吗啉代预处理24小时+ ZIKV 72小时的足细胞。(1B) 用ZIKV感染72小时的肾小球足细胞的qRT-PCR分析。显示模拟感染的足细胞、暴露于对照吗啉代(Co DWK)的足细胞、暴露于Co DWK + ZIKV感染的足细胞、仅暴露于DWK-M1的足细胞、用野生型ZIKV感染的足细胞、以及暴露于DWK-M1 + ZIKV感染的足细胞。将所有数值标准化为GAPDH。
图2：使用针对ZIKV的E蛋白的4G-2抗体对ZIKV感染的足细胞进行免疫荧光染色，(A) 模拟感染的足细胞用4G-2抗体染色，(B) 足细胞用野生型ZIKV感染72小时并用4G-2抗体染色，(C) 足细胞用DWK-M1预处理24小时，然后用ZIKV感染72小时，并用4G-2抗体染色。在安装有电荷耦合器件(CCD)照相机的Nikon TE2000S显微镜上以放大200x拍摄相位和荧光图像。对于荧光图像，使用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)将核染成蓝色。
图3：显示来自ZIKV感染的足细胞的蛋白质溶解产物的蛋白质印迹分析。结果包括模拟感染的足细胞、暴露于对照吗啉代(Co DWK)的足细胞、暴露于Co DWK和ZIKV感染的足细胞、暴露于单独的DWK-M1的足细胞、用野生型ZIKV感染的足细胞和暴露于DWK-M1 + ZIKV感染的足细胞。E蛋白(E2抗原)的ZIKV表达如上图所示。中图显示足细胞标记物突触足蛋白和下图显示作为上样对照的GAPDH。
图4A：感染之后72小时暴露于DWK-M1之后，用ZIKV感染的足细胞的RANTES的实时PCR分析。结果显示，在用Co DWK和DWK-M1吗啉代预处理24小时之后足细胞中的RANTES的ZIKV诱导。还显示模拟感染和吗啉代对照(没有ZIKV)。将所有数值标准化为GAPDH。
图4B：在感染之后72小时暴露于DWK-M1之后，用ZIKV感染的足细胞的MP1-α的实时PCR分析。结果显示，在用Co DWK和DWK-M1吗啉代预处理24小时之后MIP-1α的ZIKV诱导。还显示模拟感染和吗啉代对照(没有ZIKV)。将所有数值标准化为GAPDH。
图4C：在感染之后72小时暴露于DWK-M1之后，用ZIKV感染的足细胞的TNFα的实时PCR分析。结果显示，在用Co DWK和DWK-M1吗啉代预处理24小时之后足细胞中的TNF-α的ZIKV诱导。还显示模拟感染和吗啉代对照(没有ZIKV)。将所有数值标准化为GAPDH。
图4D：在感染之后72小时暴露于DWK-M1之后，用ZIKV感染的足细胞的IFN-b的实时PCR分析。结果显示，在用Co DWK和DWK-M1吗啉代预处理24小时之后足细胞中的INF-b的ZIKV诱导。还显示模拟感染和吗啉代对照(没有ZIKV)。将所有数值标准化为GAPDH。
图5：体内吗啉代的结构示意图。体内吗啉代由与用作传递部分的八胍树状聚体共价连接的25聚体长吗啉代寡核苷酸组成。显示ZIKV PRVABC59体内吗啉代DWK-1 (之前称为DWK-M1)的核苷酸序列。
图6：DWK-1和Co DWK-1对感染的人足细胞中的细胞内ZIKV RNA积累的剂量依赖性影响。用指定剂量的DWK-1或Co DWK-1将足细胞预处理24小时，冲洗并在不存在吗啉代的情况下以MOI为0.1用ZIKV感染。在72小时p.i，从模拟感染和ZIKV感染的细胞中分离总RNA。通过qRT-PCR测定ZIKV RNA的表达，并将其标准化为GAPDH mRNA表达。ZIKV感染一式三份进行。数值代表平均值±SD。
图7：皮下注射DWK-1之后96小时CD-1小鼠的死亡率。
图8A-8D：DWK-1减少感染的足细胞中的ZIKV RNA基因组拷贝数。(8A) 使用ZIKV特异性引物通过qRT-PCR扩增合成的ZIKV RNA (VR-3252SD，106至10个拷贝)的10倍稀释液。显示扩增曲线。NTC，无模板对照。(8B) 通过将阈值循环(CT)值相对于合成RNA的拷贝数作图来建立回归线。测定系数R2为0.997和斜率为-3.923。(8C) 从模拟、ZIKV感染的细胞、用单独的10 μM DWK-1或Co DWK-1预处理24小时的细胞、或用吗啉代预处理并用ZIKV感染48小时的细胞分离的总细胞RNA，通过qRT-PCR分析ZIKV和GAPDH RNA的表达。将细胞内ZIKVRNA的相对表达标准化为GAPDH mRNA。数值代表3个独立样品的平均值±SD。* P<0.001。(8D) 如(8C)所述制备的总细胞内RNA中的ZIKV基因组拷贝数的定量显示，在用DWK-1预处理的感染的细胞中ZIKV拷贝数减少94.1%。数值代表3个独立样品的平均值±SD。*P<0.001。ND，未检测到。
图9A-9D：使用对ZIKV的E蛋白特异性的4G-2抗体对ZIKV感染的足细胞进行免疫荧光染色。(9A) 模拟感染的足细胞用4G-2抗体染色，(9B) 足细胞用野生型ZIKV感染72小时并用4G-2抗体染色，(9C) 足细胞用DWK-1预处理24小时，冲洗并用ZIKV感染72小时，用4G-2抗体染色。(9D) 4G-2抗体的同种型对照。在安装有电荷耦合器件(CCD)照相机的NikonTE2000S显微镜上以放大200x拍摄荧光图像。使用DAPI (4',6-二脒基-2-苯基吲哚)将核染成蓝色。
图10：DWK-1抑制ZIKV感染的足细胞中的E蛋白的表达。来自未感染和ZIKV感染的足细胞的蛋白质溶解产物的蛋白质印迹分析。从模拟感染的足细胞和用10 μM DWK-1或CoDWK-1预处理24小时的足细胞制备对照蛋白质溶解产物，冲洗并在不添加吗啉代的情况下再培养72小时。未处理的足细胞或者用DWK-1或Co DWK-1预处理24小时的细胞随后用ZIKV感染，并在ZIKV感染之后72小时制备蛋白质溶解产物。E蛋白(E2抗原)的ZIKV表达如上图所示。中图显示足细胞生物标记物突触足蛋白和下图显示作为上样对照的GAPDH。
图11A-11F：DWK-1抑制ZIKV诱导的促炎细胞因子基因表达。将足细胞用10 μMDWK-1或Co DWK-1预处理24小时，并以MOI为0.1用ZIKV感染。模拟感染的细胞和仅用DWK-1或Co DWK-1处理的细胞作为对照包括在内。在72小时p.i分离总RNA，并通过qRT-PCR定量指定的细胞因子基因表达，且将其标准化为GAPDH mRNA。结果显示DWK-1和Co DWK-1对ZIKV感染的足细胞中选定的细胞因子基因表达的影响：(11A) IFN-β，*P<0.001，(11B) RANTES，*P<0.001，(11C) MIP-1α，*P<0.005，(11D) TNF-α，**P<0.01，(11E) IL-1α，*P<0.01，和(11F)IL-6，ns (统计学上不显著)。数值代表3个独立样品的平均值±SD。模拟感染的细胞中的细胞因子基因mRNA的表达设定为1.0。
图12：黄病毒属(ZIKV)高度结构化5’UTR和3’UTR的示意图。DWK-2 (方框)靶向高度保守的sHP-3’SL区域。ORF，编码病毒多聚蛋白的开放阅读框。
图13：由DWK-2吗啉代靶向的ZIKV毒株的3’UTR的sHP-3’SL区域中的序列以黑底白字显示。显示3种不同ZIKV毒株的序列比对。
图14A-14D：DWK-2抑制ZIKV诱导的促炎细胞因子基因表达。将足细胞用10 μMDWK-2或Co DWK-1 (对照)预处理24小时并用ZIKV感染。模拟感染的细胞和仅用DWK-2或CoDWK-2处理的细胞作为对照包括在内。在72小时p.i分离总RNA，并通过qRT-PCR定量细胞内ZIKV RNA，且将其标准化为GAPDH mRNA水平。结果显示DWK-2对ZIKV诱导的(14A) IL-6、(14B) IL-1α、(14C) INF-β、(14D) RANTES基因表达的抑制作用。数值代表3个独立样品的平均值±SD。模拟感染的细胞中的细胞因子基因mRNA的表达设定为1.0。
图15A-15B：(15A) DWK-2抑制感染的足细胞中的细胞内ZIKV RNA的积累。将足细胞用10 μM DWK-2或Co DWK-2 (对照)预处理24小时并用ZIKV感染。模拟感染的和DWK-2和Co DWK-2预处理的细胞作为对照包括在内。在72小时p.i分离总RNA，并通过qRT-PCR测定细胞内ZIKV RNA表达，且将其标准化为GAPDH mRNA水平。ZIKV感染一式三份进行。数值代表3个独立样品的平均值±SD。ND，未检测到。(15B) DWK-2减少感染的足细胞中的ZIKV RNA基因组拷贝数。从模拟、ZIKV感染的细胞、或用单独的10 μM DWK-2预处理24小时的细胞、或从DWK-2预处理并用ZIKV感染48小时的细胞分离的总细胞RNA，通过qRT-PCR分析ZIKV和GAPDHRNA的表达。标准化为GAPDH RNA的细胞内ZIKV RNA的相对表达降低94.2%。总细胞内RNA中的ZIKV基因组拷贝数的定量显示用DWK-2预处理的感染的细胞中的ZIKV拷贝数减少。数值代表3个独立样品的平均值±SD。ND，未检测到。
详述
A. 定义
除非另外定义，否则本文使用的所有术语(包括技术和科学术语)具有与本公开领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。应当进一步理解的是，比如在常用词典中定义的那些术语应解释为具有与其在说明书的上下文中的含义一致的含义，并且不应以理想化或过于正式的意义来解释，除非本文明确地如此定义。为了简洁或清楚起见，可能不会详细描述众所周知的功能或结构。
本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，而不旨在限制性的。本文使用的单数形式“a”、“an”和“the”也旨在包括复数形式，除非上下文另外明确说明。
本文使用术语“第一”、“第二”等来描述各种特征或要素，但是这些特征或要素不应受这些术语的限制。这些术语仅用于将一个特征或要素与另一个特征或要素区分开。因此，以下讨论的第一特征或要素可称为第二特征或要素，并且类似地，以下讨论的第二特征或要素可称为第一特征或要素而不背离本公开的教导。
术语“基本上由......组成”意指除了所列举的要素之外，要求保护的要素还可含有不会对本公开所述的为其预期目的要求保护的要素的可操作性产生不利影响的其他要素(步骤、结构、成分、组分等)。该术语排除对本公开所述的为其预期目的要求保护的可操作性产生不利影响的这种其他要素，即使这种其他要素可能增强对于一些其他目的要求保护的可操作性。
术语“约”和“大约”通常意指考虑到测量的性质或精度测量的量的可接受的误差或变化的程度。典型的示例性的误差或变化的程度在给定数值或数值范围的20% (%)范围内，优选地在10%范围内，和更优选地在5%范围内。对于生物系统，术语“约”是指可接受的误差的标准偏差，优选地不超过给定数值的2倍。除非另外说明，否则本文给出的数量为大约的，意味着当未明确说明时可推断出术语“约”或“大约”。
本文使用的术语“预防(prevention)”、“预防(prevent)”、“预防(preventing)”、“抑制(suppression)”、“抑制(suppress)”和“抑制(suppressing)”是指在疾病状态或状况的临床表现发病之前开始，以降低其可能性或严重性的作用过程(比如给予药用组合物)。这种可能性或严重性的降低不一定是绝对有用的。
本文使用的术语“治疗(treatment)”、“治疗(treat)”和“治疗(treating)”是指在疾病状态或状况的临床表现发病之后开始，以消除或减少疾病状态或状况的这种临床表现的作用过程(比如给予药用组合物)。这种治疗不一定是绝对有用的。
本文使用的术语“需要治疗”是指护理人员对患者需要或将得益于治疗做出的判断。该判断基于护理人员的专业知识领域中的多种因素做出，而且这包括由于可通过本公开的方法或装置治疗的病症导致患者生病或将患病的知识。
本文使用的术语“需要预防”是指护理人员对患者需要或将得益于预防做出的判断。该判断基于护理人员的专业知识领域中的多种因素做出，而且这包括由于可通过本公开的方法或装置预防的病症导致患者生病或将患病的知识。
本文使用的术语“个体”、“受试者”或“患者”是指任何动物，包括哺乳动物，比如小鼠、大鼠、其他啮齿动物、兔、狗、猫、猪、牛、羊、马、灵长类动物和人类。该术语可指定雄性或雌性或两者，或者排除雄性或雌性。
本文使用的术语“治疗有效量”(或简称“有效量”)是指单独或作为药用组合物的一部分的试剂的量，其能够对疾病状态或状况的任何症状、方面或特征具有任何可检测的积极作用。这种作用不一定是绝对有益的。
本文使用的术语“药学上可接受的盐”包括用相对非毒性的酸或碱制备的抗病毒剂的盐，这取决于本文所述化合物上存在的特定取代基。当本发明的化合物含有相对酸性的官能团时，碱加成盐可通过使这种化合物的中性形式与足够量的期望的碱(纯净的或在合适的惰性溶剂中)接触而获得。药学上可接受的碱加成盐的实例包括钠、钾、钙、铵、有机氨基或镁盐或者类似的盐。当本发明的化合物含有相对碱性的官能团时，酸加成盐可通过使这种化合物的中性形式与足够量的期望的酸(纯净的或在合适的惰性溶剂中)接触而获得。药学上可接受的酸加成盐的实例包括衍生自无机酸像盐酸、氢溴酸、硝酸、碳酸、一氢碳酸、磷酸、一氢磷酸、二氢磷酸、硫酸、一氢硫酸、氢碘酸或亚磷酸等的那些盐，以及衍生自相对非毒性的有机酸像乙酸、丙酸、异丁酸、草酸、马来酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、富马酸、扁桃酸、邻苯二甲酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、枸橼酸、酒石酸、甲磺酸等的盐。还包括氨基酸的盐比如精氨酸盐等，以及有机酸像葡萄糖醛酸或半乳糖醛酸等的盐(参见例如Berge, S. M., et al., “Pharmaceutical Salts”, Journal of PharmaceuticalScience, 1977, 66, 1-19)。本发明的某些特定化合物含有碱性和酸性官能团两者，使得化合物可转化成碱或酸加成盐。
当核酸的一条链中的核苷酸序列由于其核苷酸氢原子的取向而与相对核酸链上的另一个序列形成氢键时，本文使用的核酸为彼此“互补”(当然，核酸链也可为自身互补的)。互补碱基一般地在DNA中为A与T和C与G，和在RNA中为C与G和U与A。互补性可为完全的或者基本的/足够的。两个核酸之间的完全互补性意指两个核酸可形成双链体，其中双链体中的每个碱基通过Watson-Crick配对与互补碱基键合。“基本的”或“足够的”互补性意指一条链中的序列与相对链中的序列不完全互补，但是在两条链上的碱基之间发生足够的键合以在给定组的杂交条件(例如盐浓度和温度)下形成稳定的杂交复合物。这种条件可通过使用序列和标准模型来预测杂交链的Tm或通过使用已建立的方法经验确定Tm来预测。Tm是指在两条核酸链之间形成的杂交复合物群变性50%的温度。在低于Tm的温度下，有利于形成杂交复合物，而在高于Tm的温度下，有利于杂交复合物中的链的解链或分离。如Berger和Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology,152, Academic Press, San Diego CA)所教导的，这种严格性基于核酸键合复合物的解链温度(Tm)。退火的双链体的Tm取决于双链体的碱基组成、碱基错配的频率和反应介质的离子强度。本领域的普通技术人员可使用普遍接受的算法，基于这两个因素来计算双链体的Tm。最大严格性一般地发生在低于Tm约5℃，高严格性发生在低于Tm约5-10℃，中等严格性发生在低于Tm约10-20℃，和低严格性发生在低于Tm约20-25℃。如本领域的技术人员所理解的那样，最大严格性杂交可用于鉴定或检测相同的核苷酸序列，而中等(或低)严格性杂交可用于鉴定或检测类似或相关的序列。术语比如最严格的、高度严格的和不太严格的分别指最大严格性、高严格性和低严格性的条件。
在以下讨论中，参考某些外部文件以使得读者能够制备和使用本文所述的主题。本文包含的任何内容均不应理解为对现有技术的“承认”。申请人明确保留在适当情况下证明根据适用的法定条款本文参考的这种文件不构成现有技术的权利。
B. 抗病毒剂
公开了一种抑制病毒复制的二氨基磷酸吗啉代寡聚体(PMO)。为了清楚起见，在本说明书中并未描述实际实施的所有特征。当然应当意识到，在开发任何这种实际实施方案中，必须做出许多实施特异性的决定以实现工作者的特定目标，比如遵守与系统相关的和与业务相关的约束，这些约束将因实施而异。此外，应当意识到，这种开发努力可能是复杂且耗时的，但是对于得益于本公开的本领域的普通技术人员来说仍然是常规任务。
PMO为除了亚甲基吗啉环和二氨基磷酸酯键的骨架之外具有常规核苷酸碱基的核酸。PMO以高特异性与RNA结合。这使PMO能够通过与mRNA上的互补序列结合来阻断mRNA的翻译，这阻止mRNA与核糖体的结合。PMO的翻译阻断为高度特异性的，并且不会导致非靶mRNA的阻断。PMO也比RNA稳定得多，并且对大多数核酸外切酶具有抗性。未修饰的PMO具有以下通式结构，每个“B”独立地选自腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤或胸腺嘧啶：
式1
抗病毒剂的PMO包含与病毒基因组中的序列(“靶序列”)互补的核苷酸序列。这种互补序列本文称为“反义序列”，尽管如下所述，在一些实施方案中，序列可能偏离靶标的精确反义序列。基因组非限制性地可为单链有义RNA病毒(比如黄病毒属)的基因组。在抗病毒剂的一个具体实施方案中，基因组为ZIKV毒株的基因组。病毒基因组中的序列应为必须与细胞核糖体结合以发生复制的序列。这可为结构基因中(即开放阅读框中)的序列，或者其可为促进链与核糖体结合的非翻译序列。
出于说明的目的，将使用ZIKV基因组作为实例。ZIKV基因组包含未翻译的5’区域(其具有用于规范细胞翻译的甲基化帽)、长度为3419个残基的单个多聚蛋白以及形成茎-环结构的非多腺苷酸化3’区域。规范的ZIKV基因组为长10794个碱基对(bp)的单链RNA。规范的ZIKV基因组已被指定GENBANK登录号为AY632535，并且通过参考以其全部结合至本文中(SEQ ID NO: 1)。ZIKV基因组的侧翼为5’非翻译区(UTR)和3’UTR。非编码3’UTR为高度结构化的(图12)，其中一些区域在黄病毒属之间高度保守。不希望受任何假设模型的束缚，5’和3’UTR之间的相互作用认为对于病毒RNA复制至关重要。不希望受任何假设模型的束缚，认为3’UTR内的RNA元件对于黄病毒属复制和发病机制是必要的。在3’UTR中的几种RNA元件中，3’短发夹结构(sHP)和3’茎环(3’SL)在黄病毒属和特别是ZIKV毒株中高度保守。
在抗病毒剂的一些实施方案中，靶序列为来自ZIKV基因组的5’区域的序列，例如包含C (衣壳)蛋白和5’非翻译区(UTR)的区域。在抗病毒剂的一个具体实施方案中，靶序列包含来自5’UTR的5’-TTG GAA ACG AGA GTT TCT GGT CAT G-3’ (SEQ ID NO: 2)。在相同的具体实施方案中，PMO包含序列5’-CAT GAC CAG AAA CTC TCG TTT CCA A-3’ (SEQ IDNO: 3)。在抗病毒剂的进一步实施方案中，靶序列为来自ZIKV基因组的3’区域的序列，例如3’UTR。再次转到图12，ZIKV基因组的3’UTR含有3个茎-环结构(SL I、SL II和SL III)、3’短发夹结构(sHP)和末端的3’末端茎-环结构。抗病毒剂的各种实施方案靶向这些3’结构中的一个或多个。sHP在ZIKV毒株中特别高度保守(图13)。抗病毒剂的具体实施方案靶向sHP中的序列。在抗病毒剂的一个具体实施方案中，靶序列包含来自sHP的5’-GCT GGG AAA GACCAG AGA CTC CAT G-3’ (SEQ ID NO: 4)。在相同的具体实施方案中，PMO包含序列5’-CATGGA GTC TCT GGT CTT TCC CAG C-3’ (SEQ ID NO: 5)。
在生理(细胞内)条件下，反义序列将以高严格性与靶序列结合。本领域的普通技术人员理解这种条件，但是会因细胞类型而异。例如，细胞内pH和钠浓度根据细胞类型在窄范围内变化。人类受试者的生理条件通常为37℃ (98.6°F)。一般地，这意味着反义序列与靶序列的精确互补序列具有至少80%同一性。在抗病毒剂的各种实施方案中，反义序列与靶序列的精确互补序列具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。在一个具体实施方案中，反义序列为靶序列的精确互补序列。
反义序列通常为长约25个碱基。这可在约10-30个碱基的范围内有所变化。反义序列的具体实施方案可为10-30个碱基的任何长度。更具体的实施方案为15-25个碱基。反义序列的一个特定实施方案恰好为长25个碱基。PMO可在靶识别序列的5’末端或3’末端(或两者)包含另外的核苷酸。在一个具体实施方案中，反义序列为PMO的整个核苷酸序列，并且在反义序列的5’末端或3’末端没有另外的核苷酸。
PMO可具有其他各种期望的特性。这些可非限制性地包括：自身互补性很小的碱基序列；足够高的GC含量(鸟嘌呤-胞嘧啶含量) (例如40-60%)，使得其具有高的靶标亲和力；和没有4个或更多个连续G的一段以保持水溶性。
PMO可具有修饰的3’或5’末端以添加各种另外的功能性。这种修饰可包括与以下任何一种的3’缀合：荧光团、猝灭剂、羧基荧光素、丽丝胺、dabcyl、生物素、胺、具有生物素的胺、二硫化胺、吡啶基二硫代、叠氮化物和炔烃。这种修饰可包括与以下任何一种的5’缀合：伯胺、dabcyl、叠氮化物和炔烃。在抗病毒剂的一个具体实施方案中，PMO被修饰用于细胞内传递。
用于细胞传递的修饰可包括内吞作用刺激肽，比如美国专利第7084248号中所教导的弱碱性两亲性肽，可以商品名ENDO PORTER从Gene Tools, LLC (Philomath, OR,USA)市售得到。在另一个实例中，PMO与八胍树状聚体缀合。八胍树状聚体的具体实施方案具有以下结构：
式2
C. 药用组合物
提供用于治疗或预防由ZIKV介导的疾病的药用组合物，组合物包含以上提供的任何抗病毒剂。所公开的组合物可包含一种或多种这种抗病毒剂与药学上可接受的载体的组合。这种载体和配制方法的实例可在Remington: The Science and Practice ofPharmacy (20th Ed., Lippincott, Williams & Wilkins, Daniel Limmer, editor)中发现，并且本领域的技术人员通常可很好地理解。为了形成适合于给予的药学上可接受的组合物，这种组合物含有治疗有效量的抗病毒剂。
本公开的药用组合物可用于本公开的治疗和预防方法。将这种组合物以足以传递治疗有效量的抗病毒剂的量给予受试者，以便有效地用于本文公开的治疗和预防方法。治疗有效量可根据多种因素而变化，比如受试者的状况、体重、性别和年龄。例如，组合物的一些实施方案包含高达半数致死剂量(LD50)的抗病毒剂。LD50可使用标准毒理学方法或通过参考过去的研究来确定。或者，可配制药用组合物以在感染部位获得所期望浓度的抗病毒剂。
PMO的毒性通常很低。已测试了抗病毒剂的实施方案在小鼠体内的毒性(参见以下实施例4)。在高达30 mg/kg时未观察到死亡率。在药用组合物的一些实施方案中，PMO以高达约30 mg/kg给予受试者。在药用组合物的进一步实施方案中，PMO以高达约5、10、15或20mg/kg给予受试者。为了说明对抗病毒剂的敏感性的可能的种间变化，在药用组合物的进一步实施方案中，PMO以高达约0.5、1、1.5、2或3 mg/kg给予受试者。为了进一步说明个体间可能的变化和种间变化，在药用组合物的进一步实施方案中，PMO以高达约0.05、0.1、0.15、0.2或0.3 mg/kg给予受试者。PMO可比如以药用组合物给予受试者，以高达选自0.05、0.1、0.15、0.2、0.3、0.5、1、1.5、2、3、5、10、15、20、30 mg/kg、约任何上述值及任何上述值之间的范围的量的剂量/体重浓度提供PMO。
其他因素包括给予的方式和部位。可配制药用组合物以便以本领域已知的任何方法提供给受试者。示例性的剂型包括眼部、皮下、静脉内、局部、表皮、经口、骨内、肌内、鼻内和肺部。本公开的组合物可配制成仅给予受试者一次或给予受试者一次以上。此外，当组合物给予受试者一次以上时，它们可配制成用于各种方案，比如每天一次、每周一次、每月一次或每年一次。组合物还可配制成给予受试者每天一次以上。可通过测试来鉴定治疗有效量的抗病毒剂和合适的给药方案，以获得最佳活性同时使任何潜在的副作用最小化。另外，可期望用于共同给予或依序给予其他药物的制剂。
本公开的组合物可配制成全身给予(比如通过静脉内给予)或局部给予(比如通过皮下注射或通过应用凝胶剂、纤维、糊剂或霜剂)。
本公开的组合物可进一步包含改善抗病毒剂的溶解性、半衰期、吸收等的试剂。此外，本公开的组合物可进一步包含减弱抗病毒剂的不期望的副作用和/或降低毒性的试剂。这种试剂的实例描述于多种文本中，比如Remington: The Science and Practice ofPharmacy (20th Ed., Lippincott, Williams & Wilkins, Daniel Limmer, editor)。
本公开的组合物可配制成广泛种类的剂型用于给予。例如，组合物可以片剂、胶囊剂、小药囊、糖锭剂、锭剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、酏剂、酊剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂、软膏剂、霜剂、糊剂、乳剂或者用于静脉内给予或注射的溶液剂的形式存在。其他剂型包括经贴剂机制或软膏剂经皮给予。进一步的剂型包括适合于经喷雾器或计量吸入器传递的制剂。可修改任何上述试剂以提供定时释放和/或持续释放制剂。
在本公开中，药用组合物可进一步包含药学上可接受的载体。这种载体可包括媒介物、佐剂、表面活性剂、悬浮剂、乳化剂、惰性填充剂、稀释剂、赋形剂、润湿剂、粘合剂、润滑剂、缓冲剂、崩解剂、辅剂、着色剂和矫味剂(本文统称为载体)。一般地，药学上可接受的载体对抗病毒剂为化学惰性的，并且在使用条件下没有有害的副作用或毒性。药学上可接受的载体可包括聚合物和聚合物基质。药学上可接受的载体的性质可根据所用的具体剂型和组合物的其他特性而不同。
例如，在用于以固体形式口服给予的组合物，比如片剂、胶囊剂、小药囊、糖锭剂、锭剂、丸剂、粉剂或颗粒剂中，抗病毒剂可与口服的非毒性的药学上可接受的惰性载体比如惰性填充剂、合适的粘合剂、润滑剂、崩解剂和辅剂组合。合适的粘合剂非限制性地包括淀粉、明胶、天然糖类比如葡萄糖或β-乳糖、玉米甜味剂、天然和合成树胶比如阿拉伯胶、黄蓍胶或海藻酸钠、羧甲基纤维素、聚乙二醇、蜡等。用于这些剂型的润滑剂非限制性地包括油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠等。崩解剂非限制性地包括淀粉、甲基纤维素、琼脂、膨润土、黄原胶等。片剂形式可包含以下中的一种或多种：乳糖、蔗糖、甘露醇、玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸、微晶纤维素、阿拉伯胶、明胶、瓜尔胶、胶体二氧化硅、交联羧甲基纤维素钠、滑石粉、硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸锌、硬脂酸以及本文所述的其他载体。糖锭剂形式可包含矫味剂中的活性成分(通常为蔗糖)和阿拉伯胶或黄蓍胶，以及包含在惰性基质中的活性成分(比如明胶和甘油)或蔗糖和阿拉伯胶的糖果锭剂，除活性成分之外含有本领域已知的这种载体的乳剂和凝胶剂。
组合物也可以口服液体形式比如酊剂、溶液剂、混悬剂、酏剂和糖浆剂存在，并且本公开的抗病毒剂可溶解于稀释剂比如水、盐水或醇中。此外，口服液体形式可包含适当矫味的悬浮或分散剂，比如合成和天然树胶，例如黄蓍胶、阿拉伯胶、甲基纤维素等。此外，当期望或必要时，也可将合适的着色剂或其他辅剂掺入到混合物中。可使用的其他分散剂包括甘油等。
适合于非肠道给予的制剂包括水性和非水性等渗无菌注射溶液剂，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与患者的血液等渗的溶质；以及水性和非水性无菌混悬剂，其可包含悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。组合物可包含生理学上可接受的稀释剂，比如无菌液体或液体的混合物，包括水、盐水、右旋糖水溶液和相关的糖溶液、醇(比如乙醇、异丙醇或十六烷醇)、二醇类(比如丙二醇或聚乙二醇，比如聚乙二醇400)、甘油缩酮(比如2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-甲醇)、醚类、油、脂肪酸、脂肪酸酯或甘油酯或者乙酰化脂肪酸甘油酯，添加或不添加药学上可接受的表面活性剂(比如皂、油或洗涤剂)、悬浮剂(比如果胶、卡波姆、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素或羧甲基纤维素)或乳化剂和其它药用佐剂。
可用于非肠道制剂的油类包括石油、动物油、植物油或合成油类。油类的具体实例包括花生、大豆、芝麻、棉籽、玉米、橄榄、凡士林和矿物油。用于非肠道制剂的合适的脂肪酸包括聚乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯(比如脱水山梨糖醇单油酸酯)和环氧乙烷与疏水性基质的高分子量加合物(其通过环氧丙烷与丙二醇、油酸、硬脂酸和异硬脂酸的缩合形成)。油酸乙酯和肉豆蔻酸异丙酯为合适的脂肪酸酯的实例。用于非肠道制剂的合适的皂包括脂肪酸碱金属、铵和三乙醇胺盐，并且合适的洗涤剂包括：(a) 阳离子洗涤剂，比如二甲基二烷基铵卤化物和烷基吡啶鎓卤化物；(b) 阴离子洗涤剂，比如烷基、芳基和烯烃磺酸盐，烷基、烯烃、醚和单甘油酯硫酸盐和磺基琥珀酸酯盐；(c) 非离子洗涤剂，比如脂肪胺氧化物、脂肪酸链烷醇酰胺和聚氧乙烯聚丙烯共聚物；(d) 两性洗涤剂，比如烷基β-氨基丙酸酯和2-烷基咪唑啉季铵盐；和(e) 其混合物。
合适的防腐剂和缓冲剂可用于这种制剂中。为了最小化或消除注射部位的刺激，这种组合物可含有一种或多种亲水亲油平衡值(HLB)为约12-约17的非离子表面活性剂。
含有抗病毒剂的局部剂型(比如软膏剂、霜剂、糊剂和乳剂)，可与本领域熟知的多种载体材料，比如醇类、芦荟凝胶、尿囊素、甘油、维生素A和E油、矿物油、PPG2丙酸肉豆蔻酯等混合，以形成醇溶液、局部清洁剂、清洁霜、皮肤凝胶、皮肤洗剂和霜剂或凝胶制剂形式的洗发剂。也可使用包含皮肤去角质剂或皮肤研磨剂的制剂。这种局部制剂可应用于贴剂、绷带或敷料用于经皮传递，或者可应用于绷带或敷料以直接传递至伤口或皮肤损伤部位。
本公开的抗病毒剂还可配制成以脂质体传递系统的形式给予，比如小单层囊泡、大单层囊泡和止吐药。脂质体可由多种磷脂形成，比如胆固醇、硬脂胺或磷脂酰胆碱。这种脂质体还可含有单克隆抗体，以将脂质体直接传递至特定细胞类型或细胞类型组。
本公开的抗病毒剂还可与作为可靶向药物载体的可溶性聚合物偶联。这种聚合物可包括聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、聚羟丙基甲基丙烯酰胺苯酚、聚羟乙基天冬酰胺苯酚或用棕榈酰残基取代的聚氧化乙烯聚赖氨酸。此外，本发明的抗病毒剂可与一类可用于实现药物的控制释放的可生物降解聚合物偶联，例如聚乳酸、聚ε-己内酯、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚缩醛、聚二氢吡喃、聚氰基丙烯酸酯和水凝胶的交联或两亲性嵌段共聚物。
D. 使用方法
仅作为非限制性实例，提供使用以上公开的抗病毒剂和药用组合物的方法。
提供一种在需要它的受试者中治疗或预防由ZIKV介导的疾病的方法，方法包括给予受试者治疗有效量的任何以上公开的药用组合物。疾病可为由ZIKV感染引起、复杂化或加重的任何疾病，包括寨卡热、格林-巴利综合征、先天性缺陷、小头畸形、眼部疾病和寨卡相关的器官病理学。ZIKV感染不一定是在受试者他或她自己中，例如，方法可用于通过给予母亲来预防胎儿的小头畸形。
治疗和/或预防的方法包括给予受试者足以治疗或预防ZIKV介导的疾病的量(治疗有效量)的抗病毒剂。方法通常进一步包括鉴定需要这种治疗或预防的受试者。太少的抗病毒剂不能提供治疗效果。另一方面，过量的抗病毒剂可能导致不期望的副作用。
治疗有效量可根据多种因素而变化，比如受试者的状况、体重、性别和年龄。例如，方法的一些实施方案包括给予高达半数致死剂量(LD50)的抗病毒剂。LD50可使用标准毒理学方法或通过参考过去的研究来确定。或者，方法可包括将所期望浓度的抗病毒剂传递至受试者中作为ZIKV的宿主的组织、器官或细胞类型。
如果在给予抗病毒剂之后，受试者仍具有ZIKV介导的疾病，或者具有相同的风险，则方法的任选步骤为继续给予抗病毒剂或药用组合物。
在一个实施方案中，方法包括将抗病毒剂递送至作为ZIKV宿主的受试者的组织、器官或细胞类型。这种组织和器官包括眼、视网膜组织、视网膜内皮细胞、视网膜微血管内皮细胞、视网膜色素上皮细胞、视网膜周细胞、肾脏、肾小球组织、肾小球足细胞、肾脏肾小球内皮细胞、系膜细胞、细胞滋养层、合体滋养层、人脑微血管内皮细胞、人神经干细胞、星形胶质细胞、成神经细胞瘤细胞、神经祖细胞、胎盘内皮细胞、胎盘成纤维细胞、霍夫鲍尔细胞、羊膜上皮细胞、绒毛膜绒毛细胞、角质形成细胞、真皮成纤维细胞、树突状细胞、脐静脉内皮细胞、主动脉内皮细胞、冠状动脉内皮细胞、隐静脉内皮细胞、神经胶质细胞、初级精母细胞、塞尔托利氏细胞、视网膜双极细胞、视网膜神经节细胞、视神经细胞和Vero细胞。期望将抗病毒剂传递至这种靶标，因为它们是感染和复制的位点。有针对性的传递还可防止对其他组织或器官的不需要的作用。在一个备选实施方案中，方法包括将抗病毒剂局部给予受试者的眼睛。
提供一种减少或防止ZIKV在宿主细胞中的复制的方法，方法包括使宿主细胞与有效浓度的任何上述抗病毒剂接触。在方法的一个具体实施方案中，有效浓度为至少约10、12、15或20 μM。在方法的进一步具体实施方案中，有效浓度为约10、12、15或20 μM或其任何子范围。宿主细胞可位于体内或离体，并且可为已知允许ZIKV的任何细胞类型，包括以上列出的那些的任何细胞类型。
提供一种控制捐献的组织中的ZIKV扩散的方法，方法包括使捐献的组织暴露于有效量的以上公开的抗病毒剂的任何实施方案。捐献的组织可以捐献的器官形式存在。通过用含有有效浓度的抗病毒剂的溶液灌注器官或组织，可使器官或组织暴露于抗病毒剂。在方法的一个具体实施方案中，有效浓度为至少约10、12、15或20 μM。在方法的进一步具体实施方案中，有效浓度为约10、12、15或20 μM或其任何子范围。抗病毒剂可为器官保存组合物的一部分，比如University of Wisconsin冷藏溶液(可从Bridge to Life Ltd.,Columbia, South Carolina获得)或本领域已知的任何其他器官保存溶液。所公开的工作的另一方面为经处理的捐献的器官或组织，其包含器官保存组合物，组合物包含有效量的任何以上列出的抗病毒剂。
E. 工作实施例1
研究了基于PMO的技术的使用，该技术针对ZIKV的核苷酸翻译起始复合体位点用于抗病毒开发。
人肾小球足细胞得自Dr. Moin A. Saleem [14]并如[15]所述进行培养。使所有细胞胰蛋白酶化并以2.5x105个细胞/孔的密度接种于未涂覆的4.2 cm2/孔玻璃腔室载玻片上，或以3.5x105/孔的浓度接种于6孔培养皿中。
使冻干的修饰的PMO溶解于无菌水中至最终浓度为0.5 mM。PMO为具有序列5’-CATGAC CAG AAA CTC TCG TTT CCA A-3’ (SEQ ID NO: 4)的25聚体。PMO通过添加以下结构的八胍树状聚体来修饰：
式2
这种修饰的PMO称为DWK-M1。
将30 μL等分试样添加至在6孔培养皿的每孔中的补充有2% FCS和胰岛素-转铁蛋白-硒(ITS)的新鲜1.5 mL RPMI培养基中培养的足细胞中。修饰的PMO培养基的最终浓度为10 μM。温育24小时之后，用补充有10% FCS和ITS的RPMI冲洗足细胞，并模拟感染或用ZIKV感染且培养指定的时间。
使用ZIKV毒株PRVABC59，其最初于2015年12月从来自波多黎各的人血清样本中分离出来，核苷酸(GenBank):KU501215 ZIKV毒株PRVABC59 [1-3]。将病毒在Vero细胞(非洲绿猴(Cercopithecus aethiops)，肾细胞系)中培养，并使用0.22 μm滤器过滤感染性上清液，且将血清含量调节至15%。使用来自Millipore (Temecula, CA, USA)的4G-2黄病毒(Flavivirus)组抗原单克隆抗体(“4G-2抗体”)，通过荧光聚焦测定(FFA)对Vero细胞进行储备病毒滴定，并将其调节至约1 X 104个颗粒/5 μL感染性培养上清液。
使用Qiagen RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA)，从ZIKV感染的足细胞以及相应的模拟感染的细胞或用对照或经修饰的PMO预处理并用ZIKV感染的足细胞中提取总RNA。使用随机六聚体引发0.5 μg每种样品中的信使RNA，并用高容量cDNA逆转录试剂盒(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)逆转录。使用iQ Sybr GreenSupermix (Bio-Rad)在iCycler96上进行实时定量PCR。一式三份分析样品并标准化为GAPDH RNA。反应混合物含有250 nM的每种引物和200-400 ng的模板cDNA，终体积为20 μL。对ZIKV特异性的引物如下：正向5’ AGG ATC ATA GGT GAT GAA GAA AAG T 3’ (SEQ IDNO: 6)和反向5’ CCT GAC AAC ACT AAG ATT GGT GC 3’ (SEQ ID NO: 7) [4]。用于qRT-PCR的GAPDH引物如下：正向：5’-GAA GGT GAA GGT CGG AGT-3’ (SEQ ID NO: 8)和反向：5’-GAA GAT GGT GAT GGG ATT TC-3’ (SEQ ID NO: 9)。
进行免疫荧光染色。简而言之，腔室载玻片培养物含有模拟感染的人足细胞、用ZIKV感染的足细胞和在用修饰的PMO预处理24小时之后感染ZIKV的足细胞。用PBS (pH7.4)洗涤细胞两次，空气干燥并在-20℃下于无水甲醇中固定20分钟。将细胞空气干燥10分钟，在Tris缓冲盐水(pH 7.6)中水合10分钟，并与4G-2抗体以1:100稀释在PBS (pH 7.4)中温育1小时[5]。
对于蛋白质印迹分析，使用RIPA裂解缓冲液(50 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl,2 mM乙二胺四乙酸(EDTA) pH 8.0, 1% NP40, 0.5%脱氧胆酸钠，0.1%十二烷基硫酸钠(SDS)和蛋白酶抑制剂(Complete Ultra, Roche))制备细胞提取物。使溶解产物在冰上温育30分钟，并然后通过离心澄清。通过微量BCA蛋白质测定试剂盒(ThermoFisherScientific)测量总蛋白质。来自配对、模拟和ZIKV和PMO对照(用和不用ZIKV感染)的30 μg蛋白质溶解产物通过10% SDS-PAGE凝胶分离，转移至硝酸纤维素膜(Bio-Rad)上，用在0.1%TBST (0.1% Tween 20, 20 mM Tris, 150 mM NaCl)中的5%牛奶封闭并在4℃下与4G-2抗体以1:250稀释度一起温育过夜。突触足蛋白抗体(Santa Cruz Biotechnology)以1:250稀释度使用和GAPDH抗体(Santa Cruz Biotechnology)以1:3000稀释度使用。将膜以0.1%TBST洗涤5次，并与相应的与HRP缀合的二抗(ThermoFisher Scientific)以1:50000稀释度一起温育1小时。在暴露于X射线胶片后，用WesternBright ECL (Advansta)检测免疫反应条带。
该实施例中呈现的实验一式三份进行。为了比较两组之间的平均值，使用非配对t检验。统计学显著性定义为P<0.05。数据表示为平均值±SD。qRT-PCR实验重复3次并标准化为甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)。
有利地，发现修饰的PMO抑制受感染的人肾小球足细胞中的ZIKV转录。不受任何特定理论的束缚，认为ZIKV经受体介导的内吞作用进入允许细胞。内体的酸化导致病毒核衣壳的分解和有义基因组RNA的释放。修饰的PMO有效地与ZIKV基因组RNA结合以阻断ZIKV多聚蛋白前体的翻译。发现修饰的PMO抑制对ZIKV感染高度允许的受感染的人肾小球足细胞中的ZIKV转录。如qRT-PCR所示，与模拟和ZIKV感染的对照相比较，在ZIKV感染之前用10 μM经修饰的PMO预处理24小时的足细胞可在72小时之后将ZIKV RNA表达减少到1/1438 (减少99.9%)(图1A)。
重复测试以包括模拟感染的足细胞、暴露于对照PMO的足细胞、暴露于对照PMO +ZIKV感染的足细胞、暴露于单独的经修饰的PMO的足细胞、用野生型ZIKV感染的足细胞以及暴露于经修饰的PMO + ZIKV感染的足细胞(图1B)。结果显示，模拟感染的足细胞、暴露于单独的对照PMO或经修饰的PMO的足细胞在扩增之后未显示出可检测的(ND)水平的ZIKV RNA表达(图1B)。与模拟感染的对照相比较，暴露于对照PMO并用ZIKV感染的足细胞显示出ZIKVRNA的水平增加。暴露于野生型ZIKV的足细胞显示出ZIKV RNA表达的水平增加，但暴露于经修饰的PMO并用野生型ZIKV感染的足细胞与用野生型ZIKV感染的足细胞相比较显示出ZIKVRNA表达减少94% (图1B)。
发现修饰的PMO抑制足细胞中的ZIKV复制和蛋白质合成至不可检测的水平。为了确定受感染的人肾小球足细胞中的修饰的PMO抑制ZIKV转录是否会导致ZIKV蛋白表达的降低，通过免疫荧光染色和免疫印迹分析检测了修饰的PMO处理感染的足细胞之后的ZIKV总蛋白表达(图2和3)。4G-2抗体不使模拟感染的足细胞染色，而用野生型ZIKV感染72小时的足细胞显示出用4G-2抗体的特征性核周染色(图2)。用修饰的PMO预处理并用野生型ZIKV感染72小时的足细胞在感染之后没有显示出ZIKV蛋白的特异性表达，如通过用4G-2抗体的阴性染色和通过与模拟感染的细胞相比较所示(图2)。另外，用修饰的PMO处理72小时之后的ZIKV总E蛋白表达经受免疫印迹分析(图3)。在免疫印迹分析中，观察到用野生型ZIKV感染的足细胞和暴露于PMO对照(Co DWK) + ZIKV的足细胞两者中的ZIKV E蛋白表达。与暴露于PMO对照(Co DWK) + ZIKV的足细胞相比较，在用野生型ZIKV感染的足细胞中观察到更高水平的ZIKV E蛋白(图3)。然而，用修饰的PMO预处理并用野生型ZIKV感染的足细胞未显示出可检测水平的ZIKV E蛋白(图3)。此外，足细胞标记物突触足蛋白的表达不受ZIKV感染或足细胞暴露于对照PMO或修饰的PMO的影响(图3)。
发现修饰的PMO抑制足细胞中ZIKV诱导的炎症。通过qRT-PCR检测模拟感染的足细胞、暴露于对照PMO的足细胞、暴露于对照PMO + ZIKV的足细胞、暴露于单独的修饰的PMO的足细胞、用野生型ZIKV感染的足细胞及暴露于修饰的PMO + ZIKV的足细胞的RANTES、MIP-1α、TNF-α和INF-b的ZIKV诱导(图4A-4D)。结果显示，与未暴露于ZIKV的对照细胞相比较，ZIKV感染的足细胞中的RANTES (图4A)、MIP-1α (图4B)、TNFα (图4C)和INF-b (图4D)的水平增加(图4A-4D)。在暴露于对照PMO + ZIKV的足细胞和用野生型ZIKV感染的足细胞两者中，在ZIKV感染之后72小时观察到RANTES表达的上调(图4A)。然而，与暴露于野生型ZIKV的足细胞中检测到的水平相比较，在ZIKV感染之前用修饰的PMO预处理的足细胞中观察到RANTES转录的抑制(图4A)。然而，在模拟足细胞或暴露于单独的修饰的PMO的足细胞中未检测到RANTES表达的诱导(图4A)。与仅用野生型ZIKV感染的足细胞相比较，在暴露于对照PMO+ ZIKV的足细胞中观察到较低水平的RANTES转录(图4A)。在暴露于对照PMO + ZIKV的足细胞和用野生型ZIKV感染的足细胞两者中，在ZIKV感染之后72小时检测到MIP-1α、TNF-α和IFN-b mRNA表达的上调(图4B、4C和4D)。与暴露于野生型ZIKV的足细胞相比较，在ZIKV感染之前暴露于修饰的PMO的足细胞中的MIP-1α、TNF-α和IFN-b转录受到抑制(图4B、4C和4D)。然而，在模拟足细胞或暴露于单独的修饰的PMO的足细胞中未检测到MIP-1α、TNF-α和IFN-b表达的显著诱导(图4B、4C和4D)。与仅用野生型ZIKV感染的足细胞相比较，在暴露于对照PMO + ZIKV的足细胞中观察到较低水平的MIP-1α、TNF-α和IFN-b转录(图4B、4C和4D)。
在该实施例中，令人惊讶地发现ZIKV特异性的PMO (“修饰的吗啉代”或“DWK-M1”)在体外抑制ZIKV的活性转录到1/1438，或抑制99.9%。修饰的PMO显示将ZIKV总E蛋白表达降低至不可检测的水平。另外，修饰的PMO显示对足细胞特异性生物标记物突触足蛋白的稳态表达水平没有影响。此外，显示经修饰的PMO抑制ZIKV诱导的RANTES、MIP-1α、TNF-α和INF-b达到在模拟感染的对照细胞中观察到的水平。
参考文献：
1. Lanciotti RS, Lambert AJ, Holodniyet M, et al. 2016. Phylogeny ofZika Virus in Western Hemisphere, 2015. Emerg Infect Dis 2016; 5: 933-35.
2. Thomas DL, Sharp TM, Torres J, et al. Local Transmission of ZikaVirus - Puerto Rico, November 23, 2015-January 28, 2016. MMWR Morb MortalWkly Rep 2016; 6:154-58.
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4. Xu MY, Liu SQ, Deng CL, et al. Detection of Zika virus by SYBRgreen one-step real-time RT-PCR. J Virol Methods 2016; 236:93-7.
5. Wilkerson I, Laban J, Mitchell JM, et al. Retinal pericytes andcytomegalovirus infectivity: implications for HCMV-induced retinopathy andcongenital ocular disease. J Neuroinflammation 2015; 12: 2.
F. 工作实施例2
在工作实施例2中，研究了靶向ZIKV RNA的5’非翻译区(5’-UTR)的吗啉代寡核苷酸用于防止ZIKV复制的用途。体内吗啉代寡核苷酸DWK-1以10 μM浓度使用，并通过qRT-PCR、ZIKV基因组拷贝数的减少、蛋白质印迹分析、免疫荧光和促炎细胞因子基因表达(在用DWK-1预处理的ZIKV感染的足细胞中)，来分析用DWK-1处理的人肾小球足细胞中的ZIKV复制的抑制。显示当与对照相比较，用DWK-1预处理随后暴露于ZIKV 72小时的足细胞中的ZIKV转录减少约95%。免疫荧光测定和免疫印迹分析显示在用DWK-1预处理的感染的足细胞中表达的ZIKV E蛋白的水平高度降低。还观察到对用DWK-1预处理的ZIKV感染的足细胞中的促炎基因表达、IFN-β (干扰素β) RANTES (调节活化正常T细胞表达与分泌)、MIP-1α(巨噬细胞炎性蛋白-1α)、TNF-α (肿瘤坏死因子-α)和IL1-α (白细胞介素1-α)的强烈抑制。因此，工作实施例2发现靶向ZIKV 5’-UTR的吗啉代DWK-1有效抑制ZIKV复制并抑制ZIKV诱导的促炎基因表达。以下进一步详细描述工作实施例2，其中章节和子章节用于组织目的。
材料和方法
吗啉代寡聚体
靶向ZIKV的吗啉代寡聚体DWK-1被设计成与ZIKV 5’非翻译区(5’-UTR)内的25聚体核苷酸序列(括号中的粗体) (其包括寨卡病毒株PRVABC59 (GenBank mRNA转录物KU501215.1, PRVABC59/Puerto-Rico/2015)的第一ATG翻译起始密码子(粗体，下划线))互补：5’-GTA TCA ACA GGT TTT ATT TTG GAT [TTG GAA ACG AGA GTT TCT GGT CAT G]AAAAAC CCA AAA AAG AAA TCC G-3’ (SEQ ID NO: 10)。由DWK-1靶向的ZIKV PRVABC59 RNA序列的5’-UTR在ZIKV毒株中为高度保守的。与ZIKV 5’-UTR的25聚体互补的DWK-1的序列如下：5’-CAT GAC CAG AAA CTC TCG TTT CCA A-3’ (SEQ ID NO: 3)。本实施例中使用的对照寡聚体为靶向引起β-地中海贫血的人β-珠蛋白内含子突变的标准对照寡聚体。该寡聚体，称为Co DWK-1，除了人β-地中海贫血造血细胞以外，在任何已知的测试系统中几乎不引起表型变化，并且是定制体内吗啉代寡聚体的适当阴性对照(Moulton, 2017)。Co DWK-1的序列如下：5’-CCT CTT ACC TCA GTT ACA ATT TAT A-3’ (SEQ ID NO: 11)。使用的吗啉代寡核苷酸(体内吗啉代)与传递部分缀合，传递部分由在每个分支尖端处携带胍基部分的8分支树状聚体组成(参见图5)，用于将吗啉代有效传递至细胞的细胞溶质和核区室。体内吗啉代DWK-1和Co DWK-1由Gene Tools, LLC合成。使用25聚体(其为市售可得到的最长吗啉代)的根本原因是它们被推荐用于大多数应用。这是因为效力随着长度的增加而显著增加，并且因为长寡聚体最好地确保接近靶RNA中的单链区域，这是寡聚体配对成核所需要的。该长度与活性研究由Gene Tools用吗啉代寡聚体进行，并且发现25聚体为哺乳动物细胞中的基因的序列特异性敲减的最佳长度。
细胞
从Moin A. Saleem (Saleem et al., 2002)获得永生化人肾小球足细胞AB8/13并如所述进行培养(Khatua et al., 2010)。使细胞胰蛋白酶化并以3.5x105个细胞/孔的浓度接种于6孔培养皿中。在补充有10% FCS和胰岛素-转铁蛋白-硒(ITS; ThermoFisherScientific)的RPMI培养基中培养细胞。
吗啉代预处理
使冻干的吗啉代寡聚体DWK-1和Co-DWK-1溶解于无菌水中至最终浓度为0.5 mM。将30 μL等分试样加入到在6孔培养皿的每孔中补充有10% FCS和ITS的新鲜1.5 mL RPMI培养基中培养的足细胞中。培养基中的DWK-1和Co DWK-1的最终浓度为10 μM。温育24小时之后，用培养基冲洗足细胞，并模拟感染或用ZIKV感染，且在不存在吗啉代的情况下培养指定的时间。
ZIKV制备和滴定
本研究中使用的寨卡病毒株PRVABC59最初于2015年12月从来自波多黎各的人血清样本中分离出来，核苷酸(GenBank):KU501215 ZIKV毒株PRVABC59，完整基因组(Lanciotti et al., 2015; Thomas et al., 2016; Dirlikov et al., 2016;Lancontti et al., 2008)。将病毒在Vero细胞中培养，并使用0.22 μm滤器过滤感染性上清液，且将血清含量调节至15%。如先前所述(Alcendor, 2017)测定储备病毒滴度。所有实验均按照所建议的2级生物安全防护进行。ZIKV的使用得到了梅哈里医学院机构审查委员会(Meharry Medical College Institutional Review Board)和机构生物安全委员会(Institutional Biosafety Committee)的批准。
ZIKV RNA分析
使用Quick RNA MiniPrep试剂盒(Zymo Research)从细胞中分离总细胞RNA，并使用iScript cDNA合成试剂盒(Bio-Rad)将500 ng RNA逆转录成cDNA。使用SYBR Green PCR主混合物(Bio-Rad)、ZIKA特异性引物(正向引物5’-CCG CTG CCC AAC ACA AG-3’ (SEQ IDNO: 12)和反向引物5’-CCA CTA ACG TTC TTT TGC AGA CAT-3’ (SEQ ID NO: 13))和GAPDH特异性引物(正向5’-GAA GGT GAA GGT CGG AGT-3’ (SEQ ID NO: 8)和反向5’-GAAGAT GGT GAT GGG ATT TC-3’ (SEQ ID NO: 9))在CFX96 PCR机(Bio-Rad)上进行实时PCR。使用以下扩增条件：95℃ 3分钟进行初始变性，和40个循环的95℃10秒和60℃ 45秒。一式三份分析样品，并将ZIKV RNA表达标准化为GAPDH mRNA水平。数据表示为平均值±SD。通过使用具有已知ZIKV基因组拷贝(作为1.2 x 106个拷贝/μL提供)的合成ZIKV RNA (ATCCVR-3252SD)的10倍系列稀释液产生标准曲线。通过将每个样品的阈值循环(CT)值与ZIKVRNA标准曲线相比较，一式三份地进行ZIKV基因组拷贝数的绝对定量。
促炎细胞因子基因表达的qRT-PCR分析
如上所述分离、处理和分析总细胞RNA。用于分析细胞因子基因表达的引物如下：IFN-β: 正向5’-CTT GGA TTC CTA CAA AGA AGC AGC-3’ (SEQ ID NO: 14), 反向5’-TCCTCC TTC TGG AAC TGCT GCA-3’ (SEQ ID NO: 15); RANTES: 正向5’-CCT GCT GCT TTGCCT ACA TTG C-3’ (SEQ ID NO: 16), 反向5’-ACA CAC TTG GCG GTT CTT TCG G-3’(SEQ ID NO: 17); MIP-1α: 正向5’-ACT TTG AGA CGA GCA GCC AGT G-3’ (SEQ ID NO:18), 反向5’-TTT CTG GAC CCA CTC CTC ACT G-3’ (SEQ ID NO: 19); TNF-α: 正向5’-CTC TTC TGC CTG CTG CAC TTT G-3’ (SEQ ID NO: 20), 反向5’-ATG GGC TAC AGG CTTGTC ACT C-3’ (SEQ ID NO: 21); IL-1α: 正向5’-TGT ATG TGA CTG CCC AAG ATG AAG-3’ (SEQ ID NO: 22), 反向5’-AGA GGA GGT TGG TCT CAC TAC C-3’ (SEQ ID NO: 23);IL-6: 正向5’-AGA CAG CCA CTC ACC TCT TCA G-3’ (SEQ ID NO: 24), 反向5’-TTC TGCCAG TGC CTC TTT GCT G-3’ (SEQ ID NO: 25)。
一式三份分析样品，并将细胞因子基因表达标准化为GAPDH mRNA水平。
免疫荧光
如前所述进行免疫荧光染色(Alcendor, 2017)。简而言之，腔室载玻片培养物含有模拟感染的人足细胞、用ZIKV感染的足细胞和在用DWK-1预处理24小时之后感染ZIKV的足细胞。用PBS (pH 7.4)洗涤细胞两次，空气干燥并在-20℃下于无水甲醇中固定20分钟。将细胞空气干燥10分钟，在Tris缓冲盐水(pH 7.6)中水合10分钟，并与来自Millipore(Temecula, CA, USA)的4G-2黄病毒(Flavivirus)组抗原单克隆抗体以1:100稀释度在PBS(pH 7.4)中一起温育1小时(Wilkerson et al., 2015)。
蛋白质印迹分析
使用RIPA裂解缓冲液[50 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 2 mM乙二胺四乙酸(EDTA) pH 8.0, 1% NP40, 0.5%脱氧胆酸钠，0.1%十二烷基硫酸钠(SDS)和蛋白酶抑制剂(Complete Ultra, Roche)]制备细胞提取物。使溶解产物在冰上温育30分钟，并然后通过离心澄清。通过微量BCA蛋白质测定试剂盒(ThermoFisher Scientific)测量总蛋白质。蛋白质溶解产物(30 μg)通过10% SDS-PAGE分离，转移至硝酸纤维素膜(Bio-Rad)上，用在0.1% TBST (0.1% Tween 20, 20 mM Tris, 150 mM NaCl)中的5%牛奶封闭并在4℃下与4G-2黄病毒(Flavivirus)组抗原单克隆抗体(Millipore, Temecula, CA, USA)以1:250稀释度一起温育过夜。突触足蛋白抗体(Santa Cruz Biotechnology)以1:250稀释度使用和GAPDH抗体(Santa Cruz Biotechnology)以1:3000稀释度使用。将膜以0.1% TBST洗涤5次，并与相应的与HRP缀合的二抗(ThermoFisher Scientific)以1:50000的稀释度一起温育1小时。在暴露于X射线胶片后，用WesternBright ECL (Advansta)检测免疫反应条带。
统计分析
该研究中呈现的实验在类似条件下独立地进行3次。数据表示为具有标准偏差的平均值。非配对t检验用于比较组间的平均值。P<0.05时，差异认为是统计学上显著的。
结果
DWK-1以剂量依赖性方式抑制细胞内ZIKV RNA的积累
为了确定抑制人足细胞中的ZIKV复制的体内吗啉代DWK-1 (图5)的有效浓度，将细胞用1-10 μM范围内的不同浓度的DWK-1和Co DWK-1预处理24小时，冲洗并在不存在吗啉代的情况下模拟感染或以感染复数(MOI)为0.1用ZIKV (PRVABC59)感染。感染之后72小时，收集细胞并通过qRT-PCR测定细胞内ZIKV RNA积累(图6)。结果显示，DWK-1以剂量依赖性浓度降低细胞内ZIKV RNA积累，其中ZIKV RNA积累在1.0-1.5 μM下抑制约50%，和在10 μM下抑制> 95%。相比之下，Co-DWK-1在10 μM下仅显示出小的抑制(9 ± 5%)。由于10 μM浓度的DWK-1对细胞具有低毒性，因此将其用于所有工作实施例2的实验中。
DWK-1降低足细胞中的细胞内ZIKV RNA的表达
为了进一步验证DWK-1的抗病毒活性，在感染的足细胞或用DWK-1或Co DWK-1预处理并随后用ZIKV感染的足细胞中测量ZIKV RNA拷贝数。首先，通过使用10倍稀释的合成ZIKV RNA (ATCC VR-3252SD)产生标准曲线(图8A)。标准曲线涵盖了从ZIKV RNA的106到10个拷贝的线性范围，斜率= -3.923和R2 = 0.997，表明SYBR Green qRT-PCR测定的灵敏度良好(图8B)。如图8C所示从处理的足细胞中分离总细胞RNA，并通过qRT-PCR分析ZIKV和GAPDH转录物的表达。结果表明，与用Co DWK-1预处理的感染的足细胞相比较，用DWK-1预处理并用ZIKV感染48小时的足细胞中的ZIKV RNA表达减少95%。这些结果与从使用合成ZIKVRNA产生的标准曲线(图8B)定量的ZIKV RNA拷贝数减少约94% (图8D)相关。
DWK-1强烈降低感染的足细胞中的ZIKV E蛋白的表达
为了确定受感染的人肾小球足细胞中的DWK-1抑制ZIKV转录是否会导致ZIKV蛋白表达的降低，检测了用DWK-1预处理的足细胞中的ZIKV E蛋白的表达。免疫荧光染色显示E蛋白特异性4G-2抗体不使模拟感染的足细胞染色，而用ZIKV感染72小时的足细胞显示出用4G-2抗体的特征性核周染色(图9A-9D)。相比之下，与模拟和同种型对照相比较，用DWK-1预处理并用ZIKV感染72小时的足细胞仅显示出ZIKV E蛋白的最小表达(如果有的话) (图9A-9D)。类似地，通过免疫印迹分析，用DWK-1预处理之后感染的足细胞(ZIKV + DWK-1)中的ZIKV E蛋白的表达强烈降低(>98%) (图10)。在未感染的(模拟、Co DWK-1、DWK-1)足细胞中未观察到E蛋白表达。足细胞生物标记物突触足蛋白的表达被证明不受ZIKV感染或足细胞暴露于DWK-1或Co DWK-1的显著影响(图10)。
DWK-1抑制足细胞中的ZIKV诱导的促炎基因表达
ZIKV病毒感染导致促炎细胞因子的诱导。检查DWK-1预处理是否影响ZIKV感染的足细胞中的促炎细胞因子基因的表达(图11A-11D)。令人惊讶的是，当与模拟感染的细胞相比较，ZIKV诱导IFN-β基因表达的强烈4023倍增加，和在用Co DWK-1预处理的足细胞中的3330倍增加(图11A)。重要的是，与用Co DWK-1预处理的细胞相比较，在ZIKV感染之前用DWK-1预处理导致IFN-β转录表达抑制到小于1/16 (图11A)。类似地，观察到在用ZIKV感染之后72小时(58.8倍增加)和用Co DWK-1预处理并用ZIKV感染的细胞中(47.2倍增加)的RANTES转录表达的强烈上调(图11B)。与用Co DWK-1预处理的感染的足细胞中检测到的水平相比较，在ZIKV感染之前用DWK-1预处理足细胞导致RANTES基因表达降低到<1/9 (图11B)。在模拟足细胞或暴露于单独的DWK-1或Co DWK-1的足细胞中未观察到RANTES转录表达的显著变化(图11B)。尽管当与IFNβ或RANTES相比较，MIK-1α、TNF-α和IL-1α的表达在足细胞中没有受到ZIKV的如此有效诱导(~2-4倍上调)，但在ZIKV感染之前用DWK-1预处理使这些基因的表达降低至模拟感染的足细胞中检测到的水平(图11C-11E)。当与预先暴露于Co DWK-1的感染的足细胞相比较，在ZIKV感染之前暴露于DWK-1的足细胞中未检测到IL-6转录表达的显著变化(图11F)。
讨论
在该工作实施例中，靶向ZIKV的吗啉代DWK-1的有效性证明是在体外抑制ZIKV的活性转录约95%和使ZIKV E蛋白表达降低至不可检测的水平。另外，显示出DWK-1对足细胞特异性生物标记物突触足蛋白的稳态表达水平没有影响。还显示出，与用Co DWK-1预处理的感染的细胞相比较，DWK-1有效地降低ZIKV感染的细胞中的IFN-β、RANTES、MIP-1α和TNF-α的表达。
有利地，本文所述的抗病毒剂具有作为用于免疫抑制的SOTp (其接受来自ZIKV感染的捐献者的同种异体移植)的预防或治疗以及用于保护受ZIKV污染的血液供应(尤其是在其中ZIKV血液筛查不可获得的ZIKV流行地区)的抗感染剂的高度有用的可能性。
这些抑制ZIKV的活性复制的抗病毒剂对于这些患者有益，并且可潜在抑制普通人群中ZIKV感染的零星爆发。这种在室温下稳定的抗病毒剂在没有冷藏的干旱条件下高度有用。这一优势还可使得能够开发随身干预，以预防前往ZIKV流行地区的军事人员和人道主义工作者的ZIKV感染。
结论
体内吗啉代由具有独特共价连接的传递部分的吗啉代寡聚体组成，传递部分由八胍树状聚体组成。活性组分，即胍基的富含精氨酸的传递肽有助于将修饰的吗啉代传递至细胞溶质中。在该工作实施例中，显示基于吗啉代的抗病毒剂靶向ZIKV 5’-UTR，具有低毒性，在室温下稳定，并且能够穿透靶细胞。
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G. 工作实施例3
设计MPO以靶向ZIKV毒株的3’UTR的sHP-3’SL区域中的序列。这是高度保守的区域(图12和13)。MPO，称为DWK-2，靶向序列5’-GCT GGG AAA GAC CAG AGA CTC CAT G-3’ (SEQID NO: 4) (图13)，并具有一级序列5’-CAT GGA GTC TCT GGT CTT TCC CAG C-3’ (SEQID NO: 5)。
测量了DWK-2对ZIKV诱导的促炎细胞因子基因表达的抑制作用。将足细胞用10 μMDWK-2或Co DWK-1 (对照)预处理24小时并用ZIKV感染。模拟感染的细胞和仅用DWK-2或CoDWK-2处理的细胞作为对照包括在内。在72小时p.i分离总RNA，并通过qRT-PCR定量细胞内ZIKV RNA，且将其标准化为GAPDH mRNA水平。图14A-14D中的结果显示DWK-2对ZIKV诱导的IL-6 (图14A)、IL-1α (图14B)、INF-β (图14C)和RANTES (图14D)基因表达的抑制作用。数值代表3个独立样品的平均值±SD。模拟感染的细胞中的细胞因子基因mRNA的表达设定为1.0。
测量了感染的足细胞中的细胞内ZIKV RNA的积累的抑制作用。将足细胞用10 μMDWK-2或Co DWK-2 (对照)预处理24小时并用ZIKV感染。模拟感染的和DWK-2和Co DWK-2预处理的细胞作为对照包括在内。在72小时p.i分离总RNA，并通过qRT-PCR测定细胞内ZIKVRNA表达，且将其标准化为GAPDH mRNA水平。ZIKV感染一式三份进行。结果如图15A所示。数值代表3个独立样品的平均值±SD。ND，未检测到。
测试了DWK-2对感染的足细胞中的ZIKV RNA基因组拷贝数的影响。从模拟、ZIKV感染的细胞、或用单独的10 μM DWK-2预处理24小时的细胞，或从DWK-2预处理并用ZIKV感染48小时的细胞分离的总细胞RNA，通过qRT-PCR分析ZIKV和GAPDH RNA的表达。结果如图15B所示。标准化为GAPDH RNA的细胞内ZIKV RNA的相对表达降低了94.2%。总细胞内RNA中的ZIKV基因组拷贝数的定量显示，用DWK-2预处理的感染的细胞中的ZIKV拷贝数减少。数值代表3个独立样品的平均值±SD。ND，未检测到。
H. 工作实施例4
测定了DWK-1在小鼠中的毒性。CD-1小鼠中显示的DWK-1毒性数据由PacificBiolab, Hercules CA进行(图7)。显示包括动物分组、给药方案和s.c.注射之后96小时的死亡率在内的数据的概述。在紧接给药之后的暂时性血管扩张和活动减退之后，所有动物在30 mg/kg的最高剂量下存活。所有组在3小时内从暂时性血管舒张和活动减退中恢复，仅有邋遢的外表和轻微的血管舒张。这些数据表明DWK-1在CD-1小鼠中为非毒性的，并且支持以小鼠模型测试DWK-1用于ZIKV感染。
I. 工作实施例5
在ZIKV暴露之前在小鼠模型中的DWK-1给药和毒性。DWK-1的多次给药将在CD-1小鼠进行96小时的时间段。该实验还将在怀孕的雌性小鼠中进行，旨在检查DWK-1对母亲和幼仔的不良影响。腹膜内(i.p.)给予50 μl体积的多次给药(每天1剂，持续4天)。每天检查动物的不良影响，并在出生之后检查幼仔的毒性和病理学证据。鼠模型的ZIKV感染。动物：利用先前毒性研究中针对DWK-1的预定给药方案，在先前描述的ZIKV感染的鼠模型中对DWK-1进行功效评估(Miner JJ, Sene A, Richner JM, Smith AM, Santeford A, Ban N,Weger-Lucarelli J, Manzella F, Rückert C, Govero J, Noguchi KK, Ebel GD,Diamond MS, Apte RS. Zika Virus Infection in Mice Causes Panuveitis withShedding of Virus in Tears. Cell Rep. 2016; 20;16(12):3208-3218)。以ZIKV鼠模型进行的动物研究将作为圣路易斯华盛顿大学的服务费用进行。所有方案均将由华盛顿大学医学院(Washington University School of Medicine)的机构动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee)批准。野生型C57BL/6小鼠(JacksonLaboratories)将用2 mg抗Ifnar1阻断小鼠MAb (MAR1-5A3)或同种型对照小鼠MAb (GIR-208) (Leinco Technologies)处理。病毒：ZIKV毒株H/PF/2013 (French Polynesia)和ZIKV PRVABC59将用于本研究。ZIKV感染：4-8周龄的抗Ifnar1小鼠通过皮下(足垫)途径用在50 μl PBS中的103 FFU接种ZIKV，对照动物仅给予PBS。对ZIKV感染的小鼠的评估：每天检查小鼠的疾病和病理学证据。通过qRT-PCR检查收获的器官的ZIKV感染。动物治疗后的评估：检查用ZIKV感染的治疗和对照小鼠的保护免受眼部疾病、全身性感染和母系传播的证据。另外，通过qRT-PCR评价动物的毒性、脱靶效应、组织和体液中的病毒载量。组织的组织学检查将通过免疫组织化学(IHC)进行。
眼部组织中的ZIKV感染性的分析。包括对照和用和不用DWK-1处理的ZIKV感染的小鼠的左眼和右眼两者的完整眼眶在内的眼部组织将作为储存于液氮中的新鲜冷冻组织(FFT)以及福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织单独处理。将FFPE组织置于Chemate载玻片上并H＆E染色以检查大体病理学。使用4G2抗体，通过IHC对感染和对照样本进行ZIKV感染的染色。通过qRT-PCR分析FFT的ZIKV RNA。通过qRT-PCR检查来自感染和对照动物的泪液和泪腺的病毒负荷。
用DWK-1处理的怀孕小鼠的ZIKV感染性分析以在幼仔中预防ZIKV引起的眼部疾病。ZIKV在人类中的垂直传播和婴儿眼部疾病的发展有据可查，但其潜在的机制却知之甚少。目前还没有预防ZIKV宫内传播的治疗方法。检查DWK-1预防ZIKV宫内传播到幼仔和预防ZIKV相关的CNS疾病的能力。在相同妊娠时间点的怀孕小鼠用ZIKV感染，随后重复皮下给予20 mg/kg DWK-1。该剂量每天重复，持续5天。使得动物分娩，并检查母亲和幼仔的毒性和ZIKV诱导的CNS病理学证据。临床和转化目标。来自提议研究的发现将用作在猕猴模型中评估DWK-1以及未来对人类I期试验的影响的基础。
J. 示例性的实施方案
实施方案1：一种限制寨卡病毒(ZIKV)在细胞中的复制的抗病毒剂，所述抗病毒剂包含二氨基磷酸吗啉代寡聚体(PMO)，所述寡聚体包含针对ZIKV毒株的基因组的一部分的反义序列。
实施方案2：一种用于治疗或预防由寨卡病毒(ZIKV)介导的疾病的药用组合物，所述组合物包含：实施方案1的抗病毒剂和药学上可接受的载体。
实施方案3：实施方案2的药用组合物，其中所述药学上可接受的载体选自：媒介物、佐剂、表面活性剂、悬浮剂、乳化剂、惰性填充剂、稀释剂、赋形剂、润湿剂、粘合剂、润滑剂、缓冲剂、崩解剂、辅剂、着色剂和矫味剂。
实施方案4：实施方案2-3中任何一项的药用组合物，其中所述抗病毒剂以治疗有效量存在。
实施方案5：实施方案3-4中任何一项的药用组合物，其中所述治疗有效量足以在受试者的病毒感染部位提供浓度为至少约10 μM的所述抗病毒剂。
实施方案6：实施方案3-5中任何一项的药用组合物，其中所述治疗有效量为非毒性的量。
实施方案7：实施方案3-6中任何一项的药用组合物，其中所述治疗有效量足以为受试者提供浓度低于LD50的所述抗病毒剂。
实施方案8：实施方案3-7中任何一项的药用组合物，其中所述治疗有效量足以提供达到选自0.05、0.1、0.15、0.2、0.3、0.5、1、1.5、2、3、5、10、15、20、30 mg/kg、约任何上述值及任何上述值之间的范围的量的剂量/体重浓度的所述抗病毒剂。
实施方案9：实施方案2-8中任何一项的药用组合物，其中配制所述药用组合物以将所述抗病毒剂传递至受试者的循环系统、胎盘、胎儿、眼、肾、脑、皮肤或上述的任何组合。
实施方案10：一种在需要它的受试者中治疗或预防由寨卡病毒(ZIKV)介导的疾病的方法，所述方法包括给予所述受试者治疗有效量的实施方案2-9中任何一项的药用组合物。
实施方案11：实施方案2-10中任何一项的组合物或方法，其中由ZIKV介导的疾病选自：寨卡热、格林-巴利综合征、先天性缺陷、小头畸形、眼部疾病和寨卡相关的器官病理学。
实施方案12：一种减少或防止寨卡病毒(ZIKV)在宿主细胞中的复制的方法，所述方法包括使宿主细胞与有效量的实施方案1的抗病毒剂接触。
实施方案13：实施方案12的方法，其中所述宿主细胞选自：视网膜内皮细胞、视网膜微血管内皮细胞、视网膜色素上皮细胞、视网膜周细胞、肾脏细胞、肾小球足细胞、肾脏肾小球内皮细胞、系膜细胞、细胞滋养层、合体滋养层、人脑微血管内皮细胞、人神经干细胞、星形胶质细胞、成神经细胞瘤细胞、神经祖细胞、胎盘内皮细胞、胎盘成纤维细胞、霍夫鲍尔细胞、羊膜上皮细胞、绒毛膜绒毛细胞、角质形成细胞、真皮成纤维细胞、树突状细胞、脐静脉内皮细胞、主动脉内皮细胞、冠状动脉内皮细胞、隐静脉内皮细胞、神经胶质细胞、初级精母细胞、塞尔托利氏细胞、视网膜双极细胞、视网膜神经节细胞、视神经细胞、Vero细胞及其组合。
实施方案14：一种控制ZIKV在捐献的组织或器官的样本中的扩散的方法，所述方法包括使所述样本暴露于有效量的实施方案1的抗病毒剂。
实施方案15：实施方案14的方法，其中所述捐献的器官选自：心脏、肠、肾、肝、肺和胰腺；或者所述捐献的组织选自：骨、软骨、角膜、硬脑膜、筋膜、心脏瓣膜、韧带、心包、皮肤、肌腱和静脉。
实施方案16：实施方案14-15中任何一项的方法，所述方法包括用所述抗病毒剂灌注所述样本。
实施方案17：实施方案14-16中任何一项的方法，其中所述有效量为至少约10 μM。
实施方案18：实施方案14-17中任何一项的方法，其中所述有效量为非毒性的量。
实施方案19：一种捐献的组织或器官的经处理的样本，其为实施方案14-18中任何一项的方法的产物。
实施方案20：实施方案1-19中的任何一项，其中ZIKV毒株的基因组的一部分为包含非翻译区和衣壳蛋白的5’部分。
实施方案21：实施方案1-20中的任何一项，其中所述反义序列与5’-CAT GAC CAGAAA CTC TCG TTT CCA A-3’ (SEQ ID NO: 3)具有至少80%的同一性。
实施方案22：实施方案1-21中的任何一项，其中所述反义序列与5’-CAT GAC CAGAAA CTC TCG TTT CCA A-3’ (SEQ ID NO: 3)具有至少选自85%、90%、95%、99%和100%的同一性水平。
实施方案23：实施方案1-22中的任何一项，其中所述反义序列在生理条件下与含有序列5’-TTG GAA ACG AGA GTT TCT GGT CAT G-3’ (SEQ ID NO: 2)的RNA杂交。
实施方案24：实施方案1-23中的任何一项，其中所述反义序列在高度严格性条件下与含有序列5’-TTG GAA ACG AGA GTT TCT GGT CAT G-3’ (SEQ ID NO: 2)的RNA杂交。
实施方案25：实施方案1-19中的任何一项，其中所述ZIKV毒株的基因组的一部分为包含非翻译区的3’部分。
实施方案26：实施方案1-19中的任何一项，其中所述ZIKV毒株的基因组的一部分为3’部分中的结构，其包含选自茎-环结构和短发夹结构的非翻译区。
实施方案27：实施方案1-19中的任何一项，其中所述ZIKV毒株的基因组的一部分为3’部分中的结构，其包含选自SL I、SL II、SL III、sHP和末端3’末端茎-环结构的非翻译区。
实施方案28：实施方案1-19和25-27中的任何一项，其中所述反义序列与5’-CATGGA GTC TCT GGT CTT TCC CAG C-3’ (SEQ ID NO: 5)具有至少80%的同一性。
实施方案29：实施方案1-19和25-28中的任何一项，其中所述反义序列与5’-CATGGA GTC TCT GGT CTT TCC CAG C-3’ (SEQ ID NO: 5)具有至少选自85%、90%、95%、99%和100%的同一性水平。
实施方案30：实施方案1-19和25-29中的任何一项，其中所述反义序列在生理条件下与含有序列5’-GCT GGG AAA GAC CAG AGA CTC CAT G-3’ (SEQ ID NO: 4)的RNA杂交。
实施方案31：实施方案1-19和25-30中的任何一项，其中所述反义序列在高度严格性条件下与含有序列5’-GCT GGG AAA GAC CAG AGA CTC CAT G-3’ (SEQ ID NO: 4)的RNA杂交。
实施方案32：实施方案1-31中的任何一项，其中所述抗病毒剂包含用于细胞内传递的部分。
实施方案33：实施方案1-32中的任何一项，其中所述抗病毒剂包含八胍树状聚体传递部分。
实施方案34：实施方案1-33中的任何一项，其中所述抗病毒剂包含以下结构的八胍树状聚体：
。
实施方案35：实施方案1和20-34中任何一项的抗病毒剂用于制备用于治疗或预防由寨卡病毒(ZIKV)介导的疾病的药物的用途。
实施方案36：实施方案35的用途，其中由ZIKV介导的疾病选自：寨卡热、格林-巴利综合征、先天性缺陷、小头畸形、眼部疾病和寨卡相关的器官病理学。
实施方案37：实施方案1和20-34中任何一项的抗病毒剂用于制备用于控制ZIKV在捐献的组织或器官的样本中的扩散的组合物的用途。
K. 结论
应当理解，本发明公开的实施方案的任何给定要素可体现为单一结构、单一步骤、单一物质等。类似地，所公开的实施方案的给定要素可体现为多个结构、步骤、物质等。
上述描述说明和描述了本公开的方法、机器、制备、物质组合物和其他教导。另外，本公开仅显示和描述了所公开的方法、机器、制备、物质组合物和其他教导的某些实施方案，但是，如上所述，应当理解，本公开的教导能够用于各种其他组合、修改和环境，并且能够在本文所表达的教导的范围内进行变化或修改，与相关领域普通技术人员的技能和/或知识相称。上文所述的实施方案进一步旨在解释已知的实践本公开的方法、机器、制备、物质组合物和其他教导的某些最佳模式，并且使得本领域的其他技术人员能够在这种或其他实施方案中利用本公开的教导，并且具有特定应用或用途所需的各种修改。因此，本公开的方法、机器、制备、物质组合物和其他教导不旨在限制本文公开的精确实施方案和实施例。提供本文的任何章节标题仅用于与37 C.F.R. § 1.77的建议一致或者另外提供组织排列。这些标题不应限制或表征本文所述的发明。

Claims (34)

1.一种限制寨卡病毒(ZIKV)在细胞中的复制的抗病毒剂，所述抗病毒剂包含二氨基磷酸吗啉代寡聚体(PMO)，所述寡聚体包含以下序列：
5’-CAT GAC CAGAAACTC TCG TTT CCAA-3’(SEQ ID NO:3)；或
5’-CAT GGAGTC TCT GGT CTT TCC CAG C-3’(SEQ ID NO:5)。
2.一种用于治疗或预防由寨卡病毒(ZIKV)介导的疾病的药用组合物，所述组合物包含：权利要求1的抗病毒剂和药学上可接受的载体。
3.权利要求2的药用组合物，其中所述药学上可接受的载体选自：媒介物、佐剂、表面活性剂、悬浮剂、乳化剂、惰性填充剂、稀释剂、赋形剂、润湿剂、粘合剂、润滑剂、缓冲剂、崩解剂、辅剂、着色剂和矫味剂。
4.权利要求2的药用组合物，其中所述抗病毒剂以治疗有效量存在。
5.权利要求4的药用组合物，其中所述治疗有效量足以在受试者的病毒感染部位提供浓度为至少10μM的所述抗病毒剂。
6.权利要求4的药用组合物，其中所述治疗有效量为非毒性的量。
7.权利要求4的药用组合物，其中所述治疗有效量足以为受试者提供浓度低于LD50的所述抗病毒剂。
8.权利要求4的药用组合物，其中所述治疗有效量足以提供达到选自0.05、0.1、0.15、0.2、0.3、0.5、1、1.5、2、3、5、10、15、20、30mg/kg、任何上述值及任何上述值之间的范围的量的剂量/体重浓度的所述抗病毒剂。
9.权利要求2的药用组合物，其中配制所述药用组合物以将所述抗病毒剂传递至受试者的循环系统、胎盘、胎儿、眼、肾、脑、皮肤、或上述的任何组合。
10.权利要求2的药用组合物，其中所述由ZIKV介导的疾病选自：寨卡热、格林-巴利综合征、先天性缺陷、小头畸形、眼部疾病和寨卡相关的器官病理学。
11.权利要求2的药用组合物在制备用于在需要它的受试者中治疗或预防由寨卡病毒(ZIKV)介导的疾病的药物中的用途。
12.权利要求11的用途，其中所述由ZIKV介导的疾病选自：寨卡热、格林-巴利综合征、先天性缺陷、小头畸形、眼部疾病和寨卡相关的器官病理学。
13.权利要求1的抗病毒剂在制备用于减少或防止寨卡病毒(ZIKV)在宿主细胞中的复制的药物中的用途。
14.权利要求13的用途，其中所述宿主细胞选自：视网膜内皮细胞、视网膜微血管内皮细胞、视网膜色素上皮细胞、视网膜周细胞、肾脏细胞、肾小球足细胞、肾脏肾小球内皮细胞、系膜细胞、细胞滋养层、合体滋养层、人脑微血管内皮细胞、人神经干细胞、星形胶质细胞、成神经细胞瘤细胞、神经祖细胞、胎盘内皮细胞、胎盘成纤维细胞、霍夫鲍尔细胞、羊膜上皮细胞、绒毛膜绒毛细胞、角质形成细胞、真皮成纤维细胞、树突状细胞、脐静脉内皮细胞、主动脉内皮细胞、冠状动脉内皮细胞、隐静脉内皮细胞、神经胶质细胞、初级精母细胞、塞尔托利氏细胞、视网膜双极细胞、视网膜神经节细胞、视神经细胞、Vero细胞及其组合。
15.一种控制ZIKV在捐献的组织或器官的样本中的扩散的方法，所述方法包括使所述样本暴露于有效量的权利要求1的抗病毒剂。
16.权利要求15的方法，其中所述捐献的器官选自：心脏、肠、肾、肝、肺和胰腺；或者
所述捐献的组织选自：骨、软骨、角膜、硬脑膜、筋膜、心脏瓣膜、韧带、心包、皮肤、肌腱和静脉。
17.权利要求15的方法，所述方法包括用所述抗病毒剂灌注所述样本。
18.权利要求15-17中任何一项的方法，其中所述有效量为至少10μM。
19.权利要求15的方法，其中所述有效量为非毒性的量。
20.一种捐献的组织或器官的经处理的样本，其为权利要求17的方法的产物并且包含权利要求1的抗病毒剂。
21.权利要求1-10中的任何一项，其中所述抗病毒剂靶向ZIKV病毒5’区中的序列。
22.权利要求1-20中的任何一项，其中所述序列在生理条件下与含有序列5’-TTG GAAACGAGAGTT TCT GGT CAT G-3’(SEQ ID NO:2)的RNA杂交。
23.权利要求1-20中的任何一项，其中所述序列在高度严格性条件下与含有序列5’-TTG GAAACGAGAGTT TCT GGT CAT G-3’(SEQ ID NO:2)的RNA杂交。
24.权利要求1-20中的任何一项，其中所述抗病毒剂靶向ZIKV病毒3’区中的序列。
25.权利要求1-20中的任何一项，其中所述抗病毒剂靶向ZIKV病毒3’区中的结构，其中所述结构包括茎-环结构或短发夹结构。
26.权利要求1-20中的任何一项，其中所述抗病毒剂靶向ZIKV病毒3’区中的结构，其中所述结构包括SLI、SLII、SLIII、sHP或末端3’末端茎-环结构。
27.权利要求1-20中的任何一项，其中所述序列在生理条件下与含有序列5’-GCT GGGAAAGAC CAGAGACTC CAT G-3’(SEQ ID NO:4)的RNA杂交。
28.权利要求1-20中的任何一项，其中所述序列在高度严格性条件下与含有序列5’-GCT GGGAAAGAC CAGAGACTC CAT G-3’(SEQ ID NO:4)的RNA杂交。
29.权利要求1-20中的任何一项，其中所述抗病毒剂包含用于细胞内传递的部分。
30.权利要求1-20中的任何一项，其中所述抗病毒剂包含八胍树状聚体传递部分。
31.权利要求1-20中的任何一项，其中所述抗病毒剂包含以下结构的八胍树状聚体：
32.权利要求1的抗病毒剂用于制备用于治疗或预防由寨卡病毒(ZIKV)介导的疾病的药物的用途。
33.权利要求32的用途，其中所述由ZIKV介导的疾病选自：寨卡热、格林-巴利综合征、先天性缺陷、小头畸形、眼部疾病和寨卡相关的器官病理学。
34.权利要求1的抗病毒剂用于制备用于控制ZIKV在捐献的组织或器官的样本中的扩散的组合物的用途。
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