CN103079597A - 包含反义寡核苷酸的药物组合物及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于反义治疗遗传病、传染病以及多种其他医学疾病的组合物以及相关方法。具体地，本发明的实施方式是针对包含与带正电荷的聚合物结合的反义寡核苷酸化合物（“ON-PCP”）和带负电荷的聚合物的组合的药物组合物。与包含与带正电荷的聚合物结合的寡核苷酸化合物的组合物相比较，根据本发明的药物组合物已表现出提高的反义疗效和降低的细胞毒性。

Description

包含反义寡核苷酸的药物组合物及其使用方法
背景技术
对于遗传病、传染病以及其他紊乱，反义治疗是有前景的治疗形式，其中互补核酸（DNA、RNA或者化学类似物）的链用来结合到DNA或者RNA链（如信使RNA（mRNA））的目标序列上，从而激活目标基因。通过诱导突变基因中的外显子跳跃，反义治疗还用于恢复基因功能。
在反义治疗上，寡聚物（包括天然寡核苷酸和化学修饰寡聚物）显示了特别的潜力。当前，正在研究寡聚物用于治疗癌症（包括肺癌、结肠癌、胰腺癌、恶性胶质瘤和恶性黑色素瘤）、糖尿病、ALS、迪谢内肌营养不良以及多种疾病（如具有炎症成分的哮喘和关节炎）。寡聚物在病毒和细菌感染的治疗中也显示出前景。
使反义寡核苷酸化合物与带正电荷的聚合物结合已经显示增加了对于可以将这些分子导入细胞中的有效性。然而，与带正电荷的聚合物的结合与毒性增加联系在一起。在反义寡核苷酸的有效治疗窗接近LD50剂量（50%的实验动物死亡的剂量）的情况下，这是特别成问题的。因此，限制了反义寡核苷酸的使用。
如此，仍然存在对于反义寡核苷酸给药的改善配制品的需要。
发明内容
本发明提供了用于反义治疗遗传病、传染病以及多种其他医学疾病的组合物以及相关方法。具体地，本发明的实施方式是针对包含与带正电荷的聚合物结合的反义寡核苷酸化合物（“ON-PCP”）和带负电荷的或者两性的聚合物的组合的药物组合物。与包含与带正电荷的聚合物结合的寡核苷酸化合物的组合物相比较，根据本发明的药物组合物表现出了提高的反义疗效和减少的细胞毒性。在一个具体实施方式中，本发明是针对包含与带正电荷的聚合物结合的反义磷酸二酰胺吗啉代寡聚物（PMO）（“PMO-PCP”）和带负电荷或者两性的聚合物的组合的药物组合物。可以使用的其他反义寡核苷酸包括肽核酸聚合物（PNA）。
本发明的发明人惊奇地发现，通过使ON-PCP化合物与带负电荷的聚合物或者两性的聚合物结合，可以显著地降低通常与寡核苷酸并且特别地是与带正电荷的聚合物结合的PMO寡聚物的治疗相关联的细胞毒性。还意外地发现通过使用带负电荷的聚合物和与带正电荷的聚合物结合的寡聚物化合物结合，可以提高将反义寡核苷酸化合物（如PMO寡聚物）递送到目标RNA/DNA链上的效率。通常，普遍认为PMO-PCP或者PNA-PCP的有效性看起来与结合的聚合物的正电荷有联系，并且增强的递送是由于带正电荷的聚合物结合到细胞膜上。这样，常规的想法预测带负电荷的聚合物与ON-PCP的结合将导致中和了带正电荷的聚合物的增强效果。令人惊奇地，与预测相反，发明人发现通过使ON-PCP与带负电荷的聚合物结合，可以降低细胞毒性同时仍然提供增强的反义寡聚物化合物递送到细胞上。在一些实施方式中，发现带负电荷的聚合物与ON-PCP的组合实际上可以增强反义作用。
根据本发明的药物配制品可以用来治疗多种多样的医学疾病包括细菌和病毒感染、癌症、糖尿病和遗传病（如肌肉营养不良症）。在一个实施方式中，根据本发明的药物配制品可以用来治疗病毒感染如乙型肝炎、丙型肝炎、流感病毒、埃博拉病毒和马尔堡热。
附图说明
本专利或申请文件包括彩色制作的至少一个图。当提出要求并且支付必须的费用时，专利局可以提供具有彩图的本专利或专利申请公开的复本。
现在参考附图（所述附图并非必须按比例绘制），大体上描述本发明，其中：
图1是正常小鼠的肌肉组织（C57）、对照营养不良的mdx肌肉（用对目标肌营养不良premRNA非特异性的混杂PPMO序列处理，从左起第二列）和用PPMO处理的mdx肌肉（从左起第三列）和用PPMO和DNA寡核苷酸配制品处理的mdx肌肉（右列）的免疫组织化学染色。PPMO相对于DNA的比例是4:1。在肌肉组织中红色的肌肉纤维膜染色表示肌营养不良蛋白表达，在未处理的mdx小鼠中缺少这种现象。标记为30mg/kgPPMO+DNA的右列显示在不同组织中肌营养不良蛋白诱导的水平与仅用PPMO处理的小鼠组织相同，或者明显地高于（在心脏中）仅用PPMO处理的相同组织（从左起第三列）。红色的膜染色表示肌营养不良蛋白。
图2是在120mg/kg PPMO+DNA处理之后，在mdx小鼠组织中肌营养不良蛋白表达的免疫组织化学检测的图像。深红色的膜染色表明在所有肌肉中肌营养不良蛋白接近正常水平。在单次静脉注射PPMO/DNA配制品之后2周，检测组织。
图3是比较带负电荷的聚合物结合到已经与带正电荷的多肽结合的寡聚物上的琼脂糖凝胶图像。图像表明PPMO、VivoPMO和富含精氨酸的肽（Arg肽)的核酸结合特性。VivoPMO最强地结合到二氧甲基硫代磷酸酯RNA寡聚物（2OMePS）上。PMOE23和PPMOE23是靶向小鼠肌营养不良蛋白外显子23的寡聚物序列。较低强度的条带是溴化乙锭染色的2OMePS寡聚物。
具体实施方式
现在参考附图在下文中将更全面地描述本发明，其中，显示了一些但不是全部的本发明的实施方式。实际上，这些发明能够以许多不同形式体现，并且不应该理解为限制在此提出的实施方式；而是，提供了这些实施方式使得本公开可以满足适用的法律要求。贯穿全文类似的数字指示类似的元件。
本发明提供了用于反义治疗遗传病、传染病以及多种其他医学疾病的组合物以及相关方法。具体地，本发明的实施方式是针对包含与带正电荷的聚合物结合的反义寡核苷酸化合物（“ON-PCP”）和带负电荷的聚合物或者两性聚合物的组合的药物组合物。与包含与带正电荷的聚合物结合的寡核苷酸化合物的组合物相比较，根据本发明的药物组合物已表现出提高的反义疗效和减少的细胞毒性。
本发明的发明人惊奇地发现，通过使ON-PCP化合物与带负电荷的聚合物结合，可以显著地降低通常与带正电荷的聚合物结合的寡核苷酸化合物的治疗相关联的细胞毒性。还意外地发现通过使用带负电荷的聚合物和与带正电荷的聚合物结合的寡核苷酸化合物结合，可以提高将寡核苷酸递送到目标RNA/DNA链上的效率。通常，普遍认为ON-PCP的有效性看起来与结合的聚合物的正电荷有联系，并且增强的递送是由于带正电荷的聚合物结合到细胞膜上。这样，常规的想法预测带负电荷的聚合物与ON-PCP结合会导致中和了带正电荷的聚合物的增强作用。令人惊奇地，与预测相反，发明人发现通过使ON-PCP与带负电荷的聚合物结合，可以降低细胞毒性，同时仍然提供增强的反义寡核苷酸化合物递送到细胞中，（尤其在体内和全身性的情况下）。在一些实施方式中，发现带负电荷的聚合物与ON-PCP的组合实际上可以增强反义作用。
根据本发明的药物配制品可以用来治疗多种多样的医学疾病，包括细菌和病毒感染、癌症、糖尿病和遗传病，如肌肉营养不良症。在一个实施方式中，根据本发明的药物配制品可以用来治疗病毒感染如乙型肝炎、丙型肝炎、流感病毒、埃博拉病毒和马尔堡热。根据本发明能够靶向的细菌的实例在美国专利号7,625,873中得以描述。
本发明可以使用各种各样的反义寡核苷酸化合物，用于反义治疗。术语“反义寡核苷酸”和“反义寡聚物”可以互换地使用，并且是指允许通过Watson-Crick碱基配对使反义寡聚物与目标核酸（例如，RNA/DNA）序列杂交从而在目标序列内形成核酸：寡聚物异源双链的核苷酸碱基序列以及亚基-亚基主链。通常，这样的寡聚物长度为8至大约50个核苷酸亚基，并且更通常地长度为大约12至25个核苷酸亚基。寡聚物可以具有与目标序列完全的序列互补性或者接近的互补性。
在一个实施方式中，在本发明中使用的反义寡核苷酸化合物的优选类别包括吗啉代寡聚物和肽核酸（PNA）。吗啉代寡聚物是具有支持能够氢键结合到典型的聚核苷酸上的碱基的主链的聚合物分子，其中所述聚合物缺少戊糖主链部分，并且更具体地，缺少通过核苷酸和核苷典型的磷酸二酯键连接的核糖主链，而是相反地，包含通过环氮连接的环氮。可以用于实践本发明的吗啉代寡聚物的实例更详细地描述在美国专利号5,698,685、5,217,866、5,142,047、5,034,506、5,166,315、5,185,444、5,521,063、5,506,337、6,124,271、6,784,291、7,049,431、7,582,615和7,625,873中。
在本发明的实践中，肽核酸聚合物（PNA）也可以用作反义寡聚物。PNA具有与脱氧核糖主链结构同形的主链，并且由其中附连核酸碱基的N-(2-氨乙基)甘氨酸单元组成。PNA已经研究作为反义寡聚物是，因为其有可能靶向与人类疾病相关的基因。PNA连同带正电荷的聚合物一起易于合成使得PNA和它的结合物被广泛地作为实验性治疗癌症、遗传病和其他疾病的药物进行测试。
寡核苷酸化合物，并且具体地是吗啉代寡聚物和PNA，可以与各种各样的不同带正电荷的聚合物结合。带正电荷的聚合物的实例包括肽，例如富含精氨酸的肽（可以用于实践本发明的带正电荷的肽的实例包括R9F2C；(RXR)4XB（其中X可以是任何氨基酸）；R5F2R4C；(RFF)3；Tat蛋白，如TAT序列CYGRKKRRQRRR；以及(RFF)3R）、阳离子聚合物，如树枝状八胍聚合物（dendrimeric octaguanindine polymer）以及本领域已知的用于与反义寡核苷酸化合物结合的其他带正电荷的分子。在一个实施方式中，带正电荷的聚合物包括分子量为大约1,000到20,000道尔顿，并且优选地为大约5,000到10,000道尔顿的聚合物。带正电荷的聚合物的另一个实例是在其支链或者非支链上具有多个带正电荷的胺基团的聚乙烯亚胺（PEI）。此外，PEI广泛用作基因和寡聚物递送运载体。
可以用于实践本发明的带负电荷的聚合物包括带负电荷的DNA、RNA寡核苷酸、肽和多糖。用于本发明的带负电荷的寡核苷酸通常具有大约2到1000个碱基，并且更通常地从大约10到100个碱基，稍微优选的是从大约15到50个碱基，并且更优选的是从大约20到30个碱基。在一个实施方式中，带负电荷的聚合物包括具有以下分子量的肽或多糖：即从大约1,000到20,000道尔顿，并且优选从大约5000到10000道尔顿。较大的带负电荷的蛋白（如白蛋白）也可以用来与ON-PCP化合物一起增强递送并降低毒性。
在优选实施方式中，带负电荷的聚合物包括具有与反义寡核苷酸相同或者相似序列的带负电荷的寡核苷酸。优选的寡核苷酸包括DNA、RNA或者它们的修饰的类似物，如2'-O-甲基硫代磷酸酯寡核苷酸和2'-O-甲氧基-乙基硫代磷酸酯寡核苷酸。特别地，带负电荷的聚合物优选地包括具有与给予的反义寡核苷酸相同或相似序列的RNA、DNA、2'-O-甲基硫代磷酸酯寡核苷酸、2'-O-甲氧基-乙基硫代磷酸酯寡核苷酸以及它们的组合，使得带负电荷的聚合物可以靶向由反义寡核苷酸靶向的相同的目标基因、目标外显子或者基因的遗传目标区域。可以用于实践本发明的带负电荷的聚合物的实例包括15链节DNA寡核苷酸，所述15链节DNA寡核苷酸可以与PMO-PCP寡聚物一起用于配制品中，靶向小鼠或人的肌营养不良序列进行外显子跳跃，以治疗迪谢内肌营养不良。
在优选实施方式中，本发明的配制品可以使用两性聚合物，如普流尼克（pluronic）共聚物。这些聚合物的性质可以中和PMO-PCP或者PNA-PCP的电荷，并且增强递送以及减少毒性。
带负电荷的寡核苷酸/聚合物或者两性聚合物相对于反义寡核苷酸的量的比例可以范围为大约1:100到100:1。在优选实施方式中，带负电荷的寡核苷酸/聚合物或者两性聚合物相对于反义寡核苷酸的量的比例为大约0.2:1到1:5。
根据本发明的包含反义寡核苷酸的药物配制品能够在任何常规的生理学上可接受的运载体中给药。标准的药学上可接受的载体的实例包括盐水、磷酸盐缓冲盐水（PBS）、水、乙醇水溶液、乳液如油/水乳液，甘油三酯乳液、润湿剂、片剂和胶囊。应该知道的是合适的生理学可接受的载体的选择根据选择的给药模式而变化。
根据本发明的药物组合物可以通过用治疗有效量的药物配制品来治疗需要它的受试者（如人类）进行给药。在一个实施方式中，以可以通过静脉注射给予受试者的溶液形式提供药物溶液。例如，通过将包含与带正电荷的聚合物结合的反义寡核苷酸的第一种溶液和包含带负电荷的聚合物的第二种溶液混合，可以制备包含药物组合物的溶液。虽然不希望受到理论的限制，但是应当理解的是在本发明的配制品中，通过带负电荷的聚合物和带正电荷的聚合物之间的静电吸引或者氢键，带负电荷的聚合物和ON-PCP形成离子复合物。
本发明的药物组合物可以通过任何合适的方式提供到目标细胞中，包括直接给药（例如，在体外通过加入到培养基中，或者在动物体内局部地通过注射或者在治疗部位局部给药）或者全身给药（例如，肠道外给药或者口服给药）。在一个实施方式中，这些化合物和组合物包括生理学可接受的溶液的一部分，使得除了将希望的药剂递送到细胞中之外，溶液不会另外地不利地影响细胞或组织或受试者的电解质和/或体积和/或代谢。
本发明中使用的药物组合物和化合物可以通过鼻内、口服、吸入、肠道、局部、子宫内、阴道、舌下、直肠、肌肉内、胸膜内、心室内、腹膜内、眼睛、静脉、或者皮下方式给药。在优选实施方式中，通过静脉注射提供药物溶液。
根据本发明的药物组合物能够以液体或固体形式提供。根据本发明的组合物可以进一步包括溶剂、稀释剂、赋形剂、防腐剂、乳化剂、用于调节气味、味道、pH的化合物等。通常，除了活性化合物之外，本发明的药物组合物可以包含有助于将活性化合物加工成药学上可以使用的制剂的合适的赋形剂和辅助剂。合适的赋形剂包括填充物，如糖，例如乳糖、蔗糖、甘露醇或者山梨糖醇、纤维素制剂、磷酸钙以及粘合剂，如淀粉、明胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮。如果需要的话，可以加入崩解剂，如上述的淀粉以及羧甲基淀粉、交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、褐藻酸或者它们的盐。辅助剂包括流动调节剂和润滑剂，例如硅石、滑石、硬脂酸或它们的盐，和/或聚乙二醇。
这些配制品可以与或者不与另外的载体或者稀释剂一起，通过口服、全身注射、经皮肤、粘膜或者其他典型途径给药。根据本发明的药物配制品能够以囊片剂、片剂、颗粒、微粒或者粉末形式口服给药。
本发明还提供了通过将治疗有效量和/或预防量的上述药物配制品给予需要它的患者来治疗和/或改善一种或者多种医学疾病的方法。根据本发明，本发明的“治疗有效量”的化合物、组合或者药物组合物是足以实现希望的药物学作用的量。通常，提供有效量的组合物所需要的剂量可以依赖于接受者的年龄、健康情况、身体状况、性别、体重和疾病程度而变化，并且可以由本领域普通技术人员来调节。另外，可以通过治疗频率和希望的效果的特性和范围来决定剂量。
如上所讨论的，带负电荷的聚合物和/或两性聚合物和与带正电荷的聚合物结合的反义寡核苷酸的组合可以允许给予更高剂量的反义寡核苷酸。在药物配制品中的反义寡聚物的通常剂量范围可以为大约0.05到500mg/kg体重，并且具体地从约1到50mg/kg体重。在一个实施方式中，剂量为大约5到30mg/kg体重，每周一次或两次。
当然，给药的剂量可以依赖于多种使用和已知因素而变化，如活性成分的药效特征；接受者的年龄、健康情况、以及体重；症状的特性和程度、同期治疗的类型、治疗频率以及希望的效果。接受者可以是任何类型的哺乳动物，但是优选人类。在一个实施方式中，本发明的药物组合物的剂型（组合物）可以包含大约1微克到1,000微克活性成分/单位，并且具体地大约2到80微克活性成分/单位。
对于静脉给药而言，药物配制品的单位剂量通常包含0.05到200微克/千克体重，优选地可以包含1到100微克，具体地10、15、20、30、40、50、60、70或80微克/千克体重（μg/kg体重）的反义寡聚物。药物组合物可以一天一次或多次，或者一周一次或多次，例如每天2、3或4次，或者每周2、3或4次给药，并且对于70kg成人的每日总剂量通常在10到700微克范围内。优选的静脉注射剂量范围为10ng到200μg，优选地为2到200μg，更优选地为10到100μg金属/千克体重。可替换地，单位计量可以包含从2到20微克的反义寡核苷酸并且如果需要的话，可以多次给药以提供前述的日剂量。在这些药物组合物中，一般以基于组合物总重量按重量计大约0.5到95%的量给予反义寡核苷酸。
在一个具体实施方式中，在治疗肌肉失调（如迪谢内肌营养不良（DMD））中，本发明的药物组合物是特别有利的。例如，在用于治疗目标肌肉损伤或者肌肉相关失调中，当每周通过静脉注射给药时，作为一般性的指导，活性成分（即反义寡核苷酸）的日口服剂量的范围通常可以为大约5到30mg/kg体重。在一个优选实施方式中，当通过静脉注射每14天给药一次时，能够以大约20到100mg/千克体重的剂量给予反义寡核苷酸。应该知道的是基于单个病人的反应可以提高或降低该剂量。应当理解的是所使用的反义寡核苷酸的实际量可以根据使用的特异性反义寡核苷酸、配制的特定组合物、给药方式，以及给药的具体位点而变化。
对于口服给药而言，当组合物是片剂或者胶囊的形式时，活性成分可以与口服的、无毒性的、药学上可接受的惰性载体结合，包括但不限于，乳糖、淀粉、蔗糖、葡萄糖、甲基纤维素、硬脂酸镁、磷酸二钙、硫酸钙、甘露醇、山梨糖醇等。另外，当希望或需要时，合适的粘合剂、润滑剂、崩解剂、以及着色剂也可以并入混合物中。合适的粘合剂可以包括淀粉、明胶、天然的糖类如葡萄糖或者β-乳糖、玉米甜味剂、天然树胶和合成树胶，如阿拉伯树胶、黄蓍胶、或者海藻酸钠、羧甲基纤维素、聚乙二醇、蜡等。在这些剂型中使用的润滑剂可以包括油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠等。崩解剂包括，但不限于，淀粉、甲基纤维素、琼脂、膨润土、黄原胶等。
在一些实施方式中，本发明的硝酸酯配制品还可以与可溶解的聚合物结合（如可靶向的药物载体）。这样的聚合物可以包括，例如聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、聚羟丙基甲基丙烯酰胺-酚、聚羟乙基天冬酰胺酚或者由棕榈酰基残基取代的聚乙烯氧化物-聚赖氨酸。在一个实施方式中，根据本发明的硝酸酯配制品可以结合到用于实现药物控制释放的一类生物可降解的聚合物上，例如，聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸和聚乙醇酸的共聚物、聚ε-己内酮、聚羟基丁酸、聚正酯、聚缩醛、聚二氢吡喃、聚氰基丙烯酸酯、以及交联的或者两性的水凝胶的嵌段共聚物。
在此描述的组合物可以作为持续释放的配制品的一部分进行给药（即例如在给药后可以缓慢释放调制剂的胶囊或者树脂或者海绵的配制品）。这样的配制品通常可以使用已熟知的技术制备，并且通过，例如口服、直肠或者皮下植入，或者通过在要求的目标位点植入进行给药。持续释放的配制品可以包含分散在载体基质中和/或包含在由速度控制膜包围的储蓄囊中的调制剂。在这种配制品中使用的载体是生物相容的，并且也可以是生物可降解的；优选地配制品提供相对稳定的调制剂释放水平。
应当指出的是人类通常比在此举例说明的小鼠或其他试验动物治疗时间更长。因此，治疗长度通常与疾病或者病理生理学过程的长度或者强度或者之前的持续时间成比例，并且可以进一步依赖于所要求或者推荐的动物种类、药物有效性以及作用程度。这些剂量可以是在一天至数天或者更长时间内的单剂量或者多剂量。
在一个实施方式中，本发明的药物组合物和化合物局部地给药，特别是当治疗目标包括局部给药容易接近的区域或者器官，包括眼睛、皮肤或者下肠道疾病。局部给药还可以容易地用于将本发明的组合、化合物和组合物给予皮肤下面的组织中（如肌肉）。针对这些区域或者器官的每一种，可以制备合适的局部配制品。
下肠道的局部给药能够以肠道栓剂配制品或者以合适的灌肠剂配制品形式实现。还可以使用局部经皮贴剂。对于局部给药而言，能够在包含悬浮或溶解在一种或多种载体中的活性成分的合适的药膏中配制药物组合物。用于本发明化合物的局部给药的载体包括，但不限制于，矿物油、液体矿脂、白矿脂、丙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯化合物、乳化蜡和水。可替代地，可以在包含悬浮或溶解在一种或多种药学上可接受的载体中的活性成分的适当洗剂或者乳膏中配制药物组合物。合适的载体包括，但不限制于，矿物油、山梨醇酐单硬脂酸酯、聚山梨醇酯60、十六烷基酯蜡、鲸蜡硬脂醇（cetearyl alcohol）、2-辛基十二烷醇、苄醇和水。
对于眼睛应用而言，药物组合物可以配制成处于等渗的、pH调节的无菌盐水中的微粒悬浮液，或者优选地，配制成处于等渗的、pH调节的无菌盐水中的溶液（具有或不具有防腐剂（如苯扎氯铵））。可替代地，对于眼睛应用而言，可以在药膏（如凡士林油）中配制药物组合物。
适合用于局部给药到眼睛的配制品还包括滴眼剂，其中活性成分溶解或悬浮在合适的载体中（特别是活性成分的水溶剂）。活性成分优选地以0.5到20%的浓度（有利地0.5到10%，并且特别地大约为1.5%w/w）存在于这样的配制品中。
人们可以使用局部给药将本发明的药物配制品通过活性药剂的经皮途径递送到病人的全身循环系统中。皮肤位点包括用于经皮给药的解剖学区域，例如前臂、腹部、胸部、背部、臀部、大腿以及耳后区域。通过将包含化合物的局部配制品或者给予化合物的经皮药物递送装置放置在皮肤上，将化合物给予到皮肤中。在任何一个实施方式中，递送装置被设计、做成一定形状，做成一定尺寸，并且被适配以便容易地放置并且舒适地保留在皮肤上，或者以规定的量和方案将配制品直接施用到皮肤上。
适合局部给药的配制品包括适合渗透通过皮肤的液体或者半液体的制剂（例如，擦剂、洗剂、软膏、乳膏、凝胶或者糊剂）以及适合给予眼睛、耳朵或者鼻子的滴剂。本发明化合物的活性成分的合适的局部剂量为0.1mg至150mg，每天给药一到四次，优选地每天给药一或两次。对于局部给药而言，反义寡核苷酸可以包含从0.001%到10%w/w，例如按重量计1%到2%的配制品，虽然它可以包含多达10%w/w，但是不能超过5%w/w，或者0.1%到1%的配制品。
当在软膏中配制时，反义寡核苷酸可以与石蜡族的或者易溶于水的软膏基质一起使用。可替代地，反义寡核苷酸与乳化的乳膏基底一起可以在乳膏中配制。如果希望的话，乳膏基底的水相可以包括，例如至少30%w/w的多元醇，如丙二醇、丁-1,3-二醇、甘露醇、山梨糖醇、甘油、聚乙二醇以及它们的混合物。局部配制品可以令人希望地包括增强活性成分通过皮肤或其他影响区域的吸收或渗透的化合物。这样的皮肤渗透增强剂的实例包括美索巴莫、较长链的醇类、二甲亚砜和相关类似物。
多种经皮药物递送装置可以与本发明的药物配制品一起使用。例如，可以制备包括背板材料和丙烯酸酯粘着剂的简单的粘性贴剂。可以将药物和任何渗透增强剂配制成粘性的浇注溶液。粘性的浇注溶液能够直接浇注到背板材料上或者可以施用到皮肤上以形成附着涂层。
使用储库（储蓄泡，reservoir）和多孔膜类型的贴剂或者固体基质种类的贴剂可以实现经皮给药。在任何一种情况下，活性药剂连续地从储库或者微胶囊通过膜递送到活性药剂可渗透的粘着剂中，所述粘着剂与接受者的皮肤或者粘膜接触。如果活性药剂通过皮肤吸收，则活性药剂的控制的和预定的流量给予接受者。在微胶囊的情况下，装入胶囊内的药剂还可以作为膜起作用。
在其他实施方式中，可以使用液体储库系统药物递送装置来递送本发明的化合物。这些系统通常包括背板材料、膜、基于丙烯酸酯的粘着剂和释放衬垫（release liner）。将膜密封到背板上从而形成储库。然后将药物或化合物以及任何运载体、增强剂、稳定剂、胶凝剂等并入储库中。
包括背板、药物/渗透增强剂基质、膜和粘着剂的基质贴剂也可用于经皮地递送本发明的化合物。基质材料通常可以包括聚氨酯泡沫。药物、任何增强剂、运载体、稳定剂等与泡沫前体结合。泡沫可以固化从而产生有粘性的弹性体基质，它可以直接固定到背板材料上。
还包括在本发明中的是用于局部施药到皮肤上的制剂，包含通常地浓度范围为0.001%至10%的本发明的化合物，连同无毒性的药学上可接受的局部载体一起。可以通过使根据本发明的活性成分与通常用于局部干燥、液体和乳膏配制品中的常规药物稀释剂以及载体结合，来制备这些局部制剂。例如，用水性的或者油性的基底加入合适的增稠剂和/或胶凝剂，可以配制软膏和乳膏。这样的基底可以包括水和/或油，如液体石蜡或者植物油，如花生油或者蓖麻油。根据基底的性质可以使用的增稠剂包括软石蜡、硬脂酸铝、鲸蜡硬脂醇、丙二醇、聚乙二醇、羊毛脂、氢化的羊毛脂、蜂蜡等。
洗剂可以用水性或者油性基底配制，并且通常还包括下列的一项或多项：稳定剂、乳化剂、分散剂、悬浮剂、增稠剂、着色剂（coloring agent）、调味剂、显色剂（colouring agent）、芳香剂等。在任何合适的粉末基底（例如滑石、乳糖、淀粉等）的协助下，可以形成粉末。可以用水性基底或者非水性基底来配制滴剂，所述水性基底或者非水性基底还包含一种或多种分散剂、悬浮剂、增溶剂、调味剂、着色剂等。
本发明的乳液的油相能够以已知方式由已知成分构成。虽然所述相可以仅包含乳化剂，它可以包含至少一种乳化剂与脂或油或者与脂和油两者的混合物。优选地，亲水性乳化剂与作为稳定剂的亲脂性乳化剂一起被包括。还优选地包括油和脂两者。一起地，具有或不具有稳定剂的乳化剂构成所谓的乳化软膏基底，它形成乳膏配制品的油分散相。适用于本发明的配制品中的乳化剂和乳液稳定剂包括TweenTM60、SpanTM80、鲸蜡硬脂醇、肉豆蔻醇、甘油单硬脂酸酯、月桂基硫酸钠、甘油二硬脂酸酯（单独地或者与蜡一起）或者本领域已熟知的其他物质。
选择适合配制品的油或者脂是基于实现希望的化妆品特性，因为在有可能用于药物乳液配制品中的大多数油中活性化合物的溶解度非常低。因此，乳膏应该优选地为具有适当稠度的不滑腻、不染色并且可洗去的产品以避免从管子或其他容器中泄露。可以使用直链或支链，单或双碱性烷基酯，如二异己二酸酯、硬脂酸异十六烷基酯、椰子脂肪酸的丙二醇二酯、肉豆蔻酸异丙酯、油酸癸酯、棕榈酸异丙酯、硬脂酸丁酯、棕榈酸2-乙基己基酯或者支链酯的混合物。依赖于需要的特性，这些可以单独使用或者结合地使用。可替代地，可以使用高熔点的脂，如白色软石蜡和/或液体石蜡或者其他矿物油。
根据本发明的局部药物组合物还可以包括一种或多种防腐剂或者抑菌剂，例如羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、氯甲酚、苯扎氯铵等。局部药物组合物还可以包含其他活性成分，如抗微生物剂，特别是抗生素、麻醉剂、镇痛剂、和止痒剂以及抗真菌剂。还可以包括给予组合物气味的芳香剂或挥发剂，而通过蒸发，它们“固定”或者干燥局部配制品/施用。
本发明的药物组合物还可以通过粘膜给药。经粘膜（即，舌下、颊和阴道）给药提供了活性物质进入全身性循环系统中的有效途径并且减少了被肝脏和肠壁菌群立即代谢。经粘膜药物剂型（例如，药片、栓剂、软膏、阴道栓剂、膜和粉末）通常保持与粘膜接触，并且能够迅速分解和/或溶解以允许立即全身吸收。
在相关的方面中，本发明包括通过抑制或改变目标蛋白的表达来治疗或预防疾病的方法。这些疾病包括病毒、细菌或真菌感染、癌性肿瘤，以及特征为细胞增殖的其他疾病，如再狭窄、过度增殖的皮肤失调或者炎症。靶向的基因（在DNA、RNA、或蛋白质水平）包括转录因子，它们包括许多癌基因、受体蛋白、基质蛋白、结构蛋白和病毒蛋白。这些蛋白的抑制通常导致细胞周期、病毒复制或者其他关键功能的破坏。
在一个实施方式中，通过给予受试者反义寡核苷酸，特别是吗啉代寡聚物来执行该方法，选择所述吗啉代寡聚物靶向旨在恢复特异性基因表达或转换基因的亚型的特异性的基因区域。通常，所述方法包括给予受试者，处于适当的药物载体中，能够有效地干扰完整性、转录或剪接，从而抑制或恢复蛋白的正常表达或者转换不同亚型的表达的反义药剂的量。在优选实施方式中，所述方法导致蛋白的显性阴性变异体的表达。在所述方法的一个方面，受试者是人类受试者。为了用于抗病毒治疗，可以使用多种全身性给药途径，包括口服和肠道外途径，例如静脉、皮下、腹膜内、肌肉内，以及吸入、经皮和局部给药。
通常，给予一个或多个剂量的反义寡核苷酸化合物，一般以规律的间隔，优选为一天一次至一个月一次。用于口服给药的优选剂量为大约1mg寡聚物/千克体重至大约600mg寡聚物/千克体重，并且更优选大约30mg寡聚物/千克体重至大约300mg寡聚物/千克体重。对于IV给药，优选的剂量为大约0.1mg/千克体重至大约50mg寡聚物/千克体重。剂量会根据这类因素而变化：如病人的年龄、健康情况、性别、体型和体重，给药途径以及寡核苷酸试剂关于特定疾病状态的疗效。对于感染药剂的治疗而言，优选的剂量通常是需要获得血液中浓度为大约0.1至大约10μM的量，并且更优选大约400至1000nM的反义寡聚物。能够以多种方式达到该浓度；发现通过连续的IV注入，在大约1至大约10mg/kg/小时之间的剂量是可接受的。根据需要，可以给予更多或更少量的寡核苷酸。
使用本发明的反义寡核苷酸的体内有效治疗方案可以根据给药频率和途径以及在治疗下受试者的身体情况而变化。可以根据本领域已知的方法，通过常规实验来测定给定途径的最佳剂量。这种体内治疗通常由适合于特定类型的治疗疾病的测试来监测，并且可以做出剂量或治疗方案的相应调整，以实现最佳的治疗结果。
实施例：
探究了本发明的药物配制品的毒性。结果汇总在下面表1中。在这个实例中，将各种剂量水平的PMO-PCP的毒性与PMO-PCP和带负电荷的聚合物联合给予的毒性进行了比较。在试验号1至4的每一个中，八只小鼠用包含PMO-PCP的药物组合物注射一次。在试验3和4中，药物组合物还包括除了PMO-PCP之外的带负电荷的聚合物。PMO-PCP是反义寡聚物，E23+7-18，其靶向小鼠肌营养不良蛋白的外显子23和内含子23的接合处，并且与(RXRRBR)2XB序列（R=精氨酸，X=6-氨基己酸，并且B=□丙氨酸）的肽结合。带负电荷的聚合物是15链节DNA。在试验号2中，PMO-PCP的剂量为120mg/kg，并导致除一个小鼠之外全部死亡。在试验号4中，使用与试验号2相同的PMO-PCP剂量。然而，在试验号4中，使PMO-PCP组合物与带负电荷的15链节DNA寡核苷酸混合。如表1可见，与实验号2相比较，当反义寡聚物与带负电荷的DNA寡核苷酸一起配制时，相同剂量的PMO-PCP导致8只小鼠中仅一只死亡。PMO-PCP与DNA之间比例是4:1。
表1：
Figure BDA00002723820200171
在这个实例中，将本发明的药物组合物在治疗营养不良小鼠中的作用与使用与带正电荷的肽结合的磷酸二酰胺吗啉代寡聚物（PMO）（PPMO）处理的小鼠进行比较。将本发明的组合物中的PPMO与包含20链节的DNA寡核苷酸的带负电荷的DNA寡聚物混合。PPMO相对于DNA的比例为4:1。用单次静脉注射来处理小鼠，其中PPMO剂量为30mg/kg体重。14天后，获得组织样本用于评估和染色。图1是用PPMO/DNA寡聚物配制品处理的mdx小鼠的肌肉组织中肌营养不良蛋白（红色的膜染色）的组织免疫化学证明。正常对照组织来自C57BI10小鼠；mdx对照组织来自用杂乱PPMO序列处理的小鼠。标注为30mg/kg PPMO+DNA的图1的右列显示在不同组织中肌营养不良蛋白诱导的水平与仅用PPMO处理的小鼠的组织相同，或者明显高于（在心脏中）仅用PPMO处理的相同组织（从左起第三列）。通过用对肌营养不良蛋白特异性抗体的红色的膜染色来表示肌营养不良蛋白。
前面讨论的结果的实例表明使用带负电荷的聚合物或者两性聚合物用于显著降低毒性的作用，并未影响反义寡聚物的疗效。实际上，这些结果表明甚至通过全身给药增强反义寡聚物的疗效的潜力。
在图2显示的实例中，研究了本发明的药物组合物在营养不良肌肉组织上的作用。具体地，评估了在120mg/kg PPMO+DNA（4:1）处理之后，在mdx小鼠组织中的肌营养不良蛋白表达的免疫组织化学检测。在图2中，深红色的膜染色表明在所有肌肉中接近正常水平的肌营养不良蛋白。在单次静脉注射PPMO/DNA配制品之后2周测试组织。结果表明如果使用本发明的配制品，当需要这样的剂量以达到治疗时，有可能使用较高剂量的PMO-PCP。
图3是表明PPMO、VivoPMO和富含精氨酸的肽（Arg肽）的核酸结合特性的琼脂糖凝胶图像。VivoPMO最强地结合到二氧甲基硫代磷酸酯RNA寡聚物上（2OMePS）。PMOE23和PPMOE23是靶向小鼠肌营养不良蛋白外显子23的寡聚物序列。较低强度的条带是溴化乙锭染色的2OMePS寡聚物。
本发明所属领域内的技术人员在前面说明中提供的教导以及相关附图的启发下可以想到在此提出的本发明的许多变更和其他实施方式。因此，应该理解的是本发明不限制于公开的具体实施方式，并且这些变更和其他实施方式是旨在包括在所附权利要求的保护范围内。虽然在此使用了特定术语，它们仅以一般性和说明性的含义使用，并非用于限制的目的。

Claims (21)

1.一种药物组合物，包含以下的混合物：
与带正电荷的聚合物结合的反义寡核苷酸；以及
带负电荷的聚合物或者两性聚合物，其中所述组合物表现出提高的反义疗效和/或降低的细胞毒性。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述反义寡核苷酸包含吗啉代寡聚物或者具有大约15至40个碱基对单元（单体）的PNA寡聚物。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述吗啉代寡聚物包括磷酸二酰胺连接的吗啉代寡聚物。
4.根据权利要求1、2和3中任一项所述的组合物，其中所述带正电荷的聚合物选自由肽、阳离子聚合物和树枝状八胍聚合物组成的组中。
5.根据上述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述带负电荷的聚合物包括具有大约2至50个碱基对的RNA或者DNA链。
6.根据权利要求1所述的组合物，其中所述带负电荷的聚合物选自由多糖和2'-O-甲基硫代磷酸酯寡核苷酸组成的组中。
7.根据上述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述带负电荷的聚合物以离子键结合到与反义寡核苷酸结合的带正电荷的聚合物上。
8.根据上述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述带负电荷的聚合物相对于与带正电荷的聚合物结合的所述反义寡聚物的比例为大约1:100至100:1。
9.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物包括包含以下的药物组合物：
与带正电荷的聚合物结合的磷酸二酰胺连接的吗啉代寡聚物；
带负电荷的聚合物；以及
载体，其中所述组合物表现出提高的反义疗效和/或降低的毒性。
10.根据权利要求9所述的药物组合物，其中所述反义寡聚物和所述带负电荷的聚合物与DNA或者RNA的相同目标区域都是互补的、几乎互补的或者不互补的。
11.根据权利要求9或10所述的药物组合物，其中所述带负电荷的聚合物包括2'-O-甲基硫代磷酸酯寡核苷酸或者2'-O-甲氧乙基硫代磷酸酯寡核苷酸。
12.上述权利要求中任一项所述的组合物的用途，包括给予需要它的宿主治疗有效量的所述组合物，所述组合物包含与带正电荷的聚合物结合的反义寡核苷酸和带负电荷的聚合物或者两性聚合物。
13.根据权利要求12所述的用途，其中所述宿主患有选自由以下组成的组中的医学疾病：细菌或病毒感染、癌症、以及肌肉相关疾病。
14.根据权利要求12所述的用途，其中所述医学疾病是肌肉营养不良。
15.一种用于治疗需要它的受试者的医学疾病的方法，包括给予病人治疗有效量的包含与带正电荷的聚合物结合的反义寡核苷酸；以及带负电荷的聚合物或者两性聚合物的药物组合物。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述反义寡核苷酸包括磷酸二酰胺连接的吗啉代寡聚物或者PNA寡聚物。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述带正电荷的聚合物是肽、阳离子聚合物、或者它们的组合。
18.根据权利要求15所述的方法，其中在给予所述药物组合物的步骤之前，使包含所述带负电荷的聚合物和/或两性聚合物的溶液与包含与带正电荷的聚合物结合的反义寡核苷酸的溶液混合。
19.根据权利要求15所述的方法，其中所述医学疾病选自由以下组成的组中：细菌或病毒感染、癌症、以及肌肉相关疾病。
20.根据权利要求15所述的方法，其中所述医学疾病是肌肉营养不良。
21..根据权利要求15所述的方法，其中所述药物组合物以约0.5mg到300mg/kg体重的剂量给药。
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