JP2021006056A - ハイブリッド多元ステップ核酸増幅 - Google Patents

Abstract

【課題】核酸の増幅のためのシステム及び方法を提供すること。【解決手段】標的核酸配列を増幅するための改善された方法が、１）第一に、第一の核酸増幅方法により、サンプル中の標的核酸配列のコピー数を増幅すること、及び次いで２）第二の核酸増幅方法を、前記増幅されたサンプル又はその等分に適用し、更に標的配列のコピー数を増幅することにより提供される。実施形態では、第一の核酸増幅方法は熱サイクリング方法であり、及び第二の核酸増幅方法は等温方法である。【選択図】なし

Description

（発明の背景）
核酸の増幅のための複数の技法が知られているが、現在の技法は、標的核酸増幅の、速度、感度、及び／又は特異性に関する等の様々な制限を蒙っている。従って、改善された核酸増幅技法が必要とされる。

（参照による組み込み）
本明細書において言及される、全ての刊行物、特許及び特許出願は、個々の刊行物、特許及び特許出願のそれぞれが、参照により組み込まれるために、あたかも明確に、及び個々に参照により示されるのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。

（発明の要旨）
出願人はサンプル中の１つ以上の標的核酸配列を増幅するための改善された方法を開示する。標的核酸は、ＤＮＡ配列、又はＲＮＡ配列であってよい。本明細書において開示される、改善された核酸増幅方法は、２つの異なる核酸増幅方法を連続して利用することを含む。実施形態では、第一の核酸増幅方法がサンプルに適用され、サンプル中の１つ以上の標的核酸配列のコピー数を増幅し；続いて第二の核酸増幅方法の、サンプル又はその等分への適用により、更にサンプル中の１つ以上の標的核酸配列のコピー数を増幅する。実施形態では、任意の２つの核酸増幅方法が連続して遂行されることができ、第一の核酸増幅方法がサンプルに適用され、及び次いで第二の核酸増幅方法が、前記第一の核酸増幅方法による増幅の後に、前記サンプル又はその等分に適用される。実施形態では、改善された核酸増幅方法は、第一に熱サイクリング増幅方法を利用すること、及び次いでサンプル中の１つの標的核酸配列、又は複数の標的核酸配列を増幅するために、非熱サイクリング（例えば、等温）増幅方法を利用することを利用することを含む。実施形態では、第一の核酸増幅方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅方法を含む。適切なＰＣＲ法としては、２ステップＰＣＲ法、及び３ステップＰＣＲ法が挙げられる。標的核酸がＲＮＡである実施形態では、逆転写酵素ＰＣＲ（ｒｔＰＣＲ）を用い得る。実施形態では、第二の核酸増幅方法は、そのそれぞれが参照によりその全体が全ての目的で本出願に組み込まれる、２０１４年３月１５日に出願された、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１４／３００２８号；２０１４年３月１５日に出願された、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１４／３００３４号；２０１４年９月１７日に出願された、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１４／５６１５１号；２０１４年３月１５日に出願された、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１４／３００３６号；又は２０１５年９月１７日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１５／５０８１１号に記載されているような等温核酸増幅方法を含む。

従って、サンプル中の標的核酸配列を増幅するための方法は：第一の核酸増幅方法により、サンプル中の１つ以上の標的核酸配列のコピー数を増幅すること；及び次いで更に前記サンプル又はその等分中の１つ以上の標的核酸配列を第二の核酸増幅方法により、増幅することを含む。実施形態では、サンプル中の標的核酸配列を増幅するための方法は：熱サイクリング核酸増幅方法によりサンプル中の１つ以上の標的核酸配列のコピー数を増幅すること；及び次いで更にサンプル又はその等分中の１つ以上の標的核酸配列のコピー数を、非熱サイクリング（例えば、等温）核酸増幅方法により増幅することを含む。実施形態では、サンプル中の標的核酸配列を増幅するための方法は：サンプル中の１つ以上の標的核酸配列のコピー数をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）核酸増幅方法により増幅し；及び次いで、２０１４年３月１５日に出願された、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１４／３００２８号；２０１４年３月１５日に出願された、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１４／３００３４号；２０１４年９月１７日に出願された、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１４／５６１５１号；２０１４年３月１５日に出願された、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１４／３００３６号；又は２０１５年９月１７日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１５／５０８１１号に記載されるような等温核酸増幅方法から選ばれる等温核酸増幅方法により、更に前記サンプル又はその等分中の１つ以上の標的核酸配列を増幅することを含む。

更なる実施形態では、サンプル中の標的核酸配列を増幅するための方法は：サンプルを、標的核酸配列にハイブリダイズするプライマー、又は一組のプライマーと接触させること；前記サンプル中の標的核酸配列のコピー数を第一の核酸増幅方法により増幅させること；及び次いで更に前記サンプル又はその等分中の標的核酸配列のコピー数を、第二の核酸増幅方法により増幅することを含む。更なる実施形態は：サンプルを、標的核酸配列にハイブリダイズする複数のプライマー、又は複数の一組のプライマーと接触させること；前記サンプル中の標的核酸配列のコピー数を第一の核酸増幅方法により増幅させること；及び次いで更に前記サンプル又はその等分中の標的核酸配列のコピー数を、第二の核酸増幅方法により増幅することを含む。

更なる実施形態では、改善された核酸増幅方法は：第一にサンプル中の標的核酸配列又は複数の標的核酸配列を増幅するために、非熱サイクリング（例えば、等温）増幅方法を用いること、及び次いで第二に、更にサンプル中の標的核酸配列又は複数の標的核酸配列を増幅するために、熱サイクリング増幅方法を増幅されたサンプル又はその等分に適用することを含む。

従って、出願人は本明細書において、核酸増幅を遂行するための、方法、機器、システム、備品（例えば、容器）、及びキットを開示する。実施形態では、そのような核酸増幅を遂行するための方法、機器、システム、備品（例えば、容器）、及びキットは、臨床サンプル等のサンプルからの核酸の増幅のための方法、機器、システム、備品（例えば、容器）、及びキットを含む。実施形態では、サンプルの一部分（例えば、等分）は、増幅のための核酸を提供するために用い得る。実施形態では、そのようなサンプルは、血液、尿、唾液、又は他の臨床サンプル、又は血液、尿、唾液、又は他の臨床サンプルの一部分（例えば、等分）であり得る。

従って、実施形態では、出願人は、以下を含むサンプル中の標的核酸配列を増幅するための方法を開示する：
第一に、第一の核酸増幅方法によりサンプル中の１つ以上の標的核酸配列のコピー数を増幅すること；及び
次に、第二の核酸増幅方法により、更に前記サンプル又はその等分中の１つ以上の標的核酸配列のコピー数を増幅すること。そのような方法の実施形態においては、前記第一の核酸増幅方法は、熱サイクリング核酸増幅方法を含む。そのような方法の実施形態においては、前記第二の核酸増幅方法は、等温核酸増幅方法を含む。そのような方法の実施形態においては、前記第一の核酸増幅方法は、熱サイクリング核酸増幅方法を含み、及び前記第二の核酸増幅方法は、等温核酸増幅方法を含む。そのような方法の実施形態においては、前記第一の核酸増幅方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）核酸増幅方法を含む。そのような方法の実施形態においては、前記ＰＣＲ増幅方法により増幅された核酸は、ＤＮＡを含む。そのような方法の実施形態においては、前記ＰＣＲ増幅方法により増幅された核酸は、ＲＮＡを含む。実施形態では、前記核酸はウラシルを含むことができ、及び実施形態においてはジデオキシウラシルを含み得る（例えば、増幅の間に、チミンの位置にジデオキシウラシルを含み得る）。そのような方法の実施形態においては、前記第二の核酸増幅方法は、等温核酸増幅方法を含み得る。

本明細書において開示される方法の実施形態においては、増幅方法において用いられるプライマーは、単一の標的核酸配列、及びその相補体に向けられる。本明細書において開示される方法の実施形態においては、増幅方法において用いられるプライマーは、複数の標的核酸配列、及びその相補体に向けられる。

従って、実施形態では、出願人は、共通の核酸分子上の第一の遺伝学的要素及び第二の遺伝学的要素を検出するための方法を開示し、前記方法は以下を含む：
第一のプライマー及び第二のプライマーを用いる第一の核酸増幅反応を遂行することであって、前記第一のプライマー及び前記第二のプライマーの両方は、前記プライマーの５’末端がリン酸化されており、前記第一のプライマーは、前記第一の遺伝学的要素に相補的であり、前記第二のプライマー前記第二の遺伝学的要素に相補的であり、及び第一の反応生成物が形成されると、前記第一の反応生成物は、前記第一の遺伝学的要素の少なくとも一部分を含み、及び前記第二の遺伝学的要素の少なくとも一部分を含み、前記第一の遺伝学的要素の少なくとも一部分及び前記第二の遺伝学的要素の少なくとも一部分は、前記第一の反応生成物中で、互いにＸ個のヌクレオチド分だけ離れており；
少なくとも第一の反応生成物を含む第一のライゲーション生成物を形成するために、前記第一の反応生成物をリガーゼ酵素とインキュベートすることであって、前記第一のライゲーション生成物内においては、前記第一の遺伝学的要素の少なくとも一部分のコピー及び前記第二の遺伝学的要素の少なくとも一部分のコピーは、互いにＸ個未満のヌクレオチド分だけ離れており；
第三のプライマー及び第四のプライマーを用いる第二の核酸増幅反応を遂行することであって、前記第三のプライマーは、前記第一の遺伝学的要素に相補的であり、及び前記第四のプライマーは前記第二の遺伝学的要素に相補的であり、第二の反応生成物が形成され；及び
前記第二の反応生成物を検出すること。

従って、実施形態では、出願人はポリヌクレオチドテンプレートを増幅するための方法であって、以下を含む方法を開示する：
Ａ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅反応混合物中に、ポリヌクレオチドテンプレートの複数のコピーを生成することであって、前記ＰＣＲ増幅反応混合物は、第一のＰＣＲ増幅反応プライマー及び第二のＰＣＲ増幅反応プライマーを含み、前記ＰＣＲ増幅反応混合物中では、前記第一のＰＣＲ増幅反応プライマーが前記ポリヌクレオチドテンプレートにアニールし、及び前記第二のＰＣＲ増幅反応プライマーが、前記ポリヌクレオチドテンプレートに相補的なポリヌクレオチドにアニールし、及び前記ＰＣＲ増幅反応混合物中では、ＰＣＲ増幅反応生成物の複数のコピーが生成されており、前記ＰＣＲ増幅反応生成物は、第一の鎖及び第二の鎖を含む二本鎖の核酸分子であり、及び前記ＰＣＲ増幅反応生成物の第一の鎖は、前記ポリヌクレオチドテンプレートのコピーであり；
Ｂ）非熱サイクリング反応の第一のプライマー及び非熱サイクリング反応の第二のプライマーを含む非熱サイクリング反応混合物中で、前記ポリヌクレオチドテンプレートのコピーをインキュベートすることであって：
前記ポリヌクレオチドテンプレートは、第一の部分、第二の部分、及び第三の部分を含み、前記第三の部分は、前記第一の部分及び前記第二の部分の間の前記ポリヌクレオチドテンプレート内に位置し；
前記第一のプライマーは第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一のプライマーの第二の領域は、前記ポリヌクレオチドテンプレートの第一の部分に相補的であり；及び
前記第二のプライマーは第一の領域及び第二の領域を含み、前記第二のプライマーの第二の領域は、前記ポリヌクレオチドテンプレートの第二の部分に相補的である前記ＰＣＲ増幅反応生成物の第二の鎖の中の配列に相補的であり、前記第二のプライマーの第一の領域は、前記第一のプライマーの第一の領域に相補的であり、及び前記第二のプライマーの第一の領域は、前記ポリヌクレオチドテンプレートの第三の部分に相補的である。

本明細書において開示される方法の実施形態においては、前記ポリヌクレオチドテンプレートの第一の部分及び第二の部分は、長さにおいてそれぞれ６〜３０ヌクレオチドである。そのような方法の実施形態においては、前記ポリヌクレオチドテンプレートの第三の部分は、長さにおいて４〜１４ヌクレオチドである。本明細書において開示される方法の実施形態においては、前記非熱サイクリング反応混合物中のポリヌクレオチドテンプレートのコピー数は、本方法の開始から６０分以内に少なくとも１０倍に増大される。本明細書において開示される方法の実施形態においては、前記ポリヌクレオチドテンプレートの少なくとも３つのコピーを含むコンカテマー鎖が、非熱サイクリング反応混合物のインキュベーションの間に生成される。

出願人は、更に、その中に、本明細書において提供される反応混合物の１つ以上の任意の組成物を含む容器、及び複数の容器を、本明細書において開示する。出願人は、更に、その中に、本明細書において提供される反応混合物の１つ以上の任意の組成物を含むキット、及び複数のキットを開示する。

本明細書において開示される検定及び方法は、サンプルを処理するための機器、又はシステム上で遂行され得る。本明細書において開示される検定及び方法は、自動化された検定機器、及び自動化された検定システム中に、容易に組み込まれることができる。例えば、本明細書において開示されるシステムは、検出されるべき検体（例えば、ウイルス、バクテリア又は他の標的を示す１つ以上の核酸マーカー）、又は前記機器又はシステムにより検出されるべき他の検体に基づいたプロトコルを送受信するための通信組み立て品を含むことができる。実施形態では、検定プロトコルは、機器により遂行されるべき複数の検定の最適なスケジューリングに基づいて変更され得るか、又は以前に被験者から得られたサンプルの結果に基づいて変更され得るか、又は以前に被験者から得られた異なるサンプルの結果に基づいて変更され得る。実施形態では、通信組み立て品は、前記機器からコンピュータに情報を通信するためのチャネルを含むことができ、前記チャネルは、コンピュータネットワーク、電話ネットワーク、メタル通信リンク（ｍｅｔａｌ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ ｌｉｎｋ）、光通信リンク、及び無線通信リンクから選ばれる。実施形態では、本明細書において開示されるシステムは、信号を中央の場所、又はエンドユーザに送信することができ、及びそのような信号を送信するための通信組み立て品を含むことができる。本明細書において開示されるシステムは、プロトコルを、必要に応じてか、又は定期的に更新するために構成され得る。

本明細書において開示される方法に従い、血液サンプル中の核酸マーカー（例えば、ウイルス、バクテリア、又は他の標的を示すことができる）を測定するために構成された機器及びシステムは、約１０００μＬ以下、又は約５００μＬ以下、約２５０μＬ以下、又は約１５０μＬ以下、又は約１００μＬ以下、又は約５０μＬ以下のサンプルの容積を含むか、又は実施形態では、サンプルの容積は約２５μＬを含むか、又は約１０μＬ以下を含むか、又は前記血液のサンプルが、約１０μＬ以下を含む、サンプルの一部分（例えば、血液、尿、唾液、涙液のサンプル、又は他のサンプル）の分析から決定するために構成され得る。そのような機器は、約１時間以下か、又は実施形態では４０分以下か又は３０分以下で、標的レベルを測定するために、又はサンプル中の標的の有無を決定するために構成され得る。

本明細書において開示される機器は、標的核酸の測定のための検定を遂行するために、及び血液サンプル中の別の検体の測定のための、検定を遂行するためにも構成され得る。本明細書において開示される機器は、標的核酸分子の測定のための検定を遂行するために、及び血液サンプル中の血液細胞の形態学的な特性の測定を含む検定も遂行するために、構成され得る。本明細書において開示される機器は、標的核酸分子の測定のための、検定を遂行するために、及び例えば、ビタミン、ホルモン、薬物又は薬物の代謝物、又は他の検体等の、別の血液中の検体の測定を含む、検定も遂行するために構成され得る。そのような機器は、前記機器により遂行され得る検定、又は検定の遂行の順序が、別の機器との通信により、変更され得るように構成され得る。

出願人は本明細書において開示される機器を含むシステムも開示する。実施形態では、前記システムは、標的核酸の測定のための検定を遂行するために、及び血液サンプル中の別の検体の測定のための検定を遂行するためにも構成された機器を含む。実施形態では、前記システムは、標的核酸分子の測定のための検定を遂行するために、及び血液サンプル中の、血液細胞の形態学的な特性の測定を、含む検定も遂行するために、構成され機器を含む。実施形態においては、そのようなシステム、前記機器により遂行される検定、又は検定の遂行の順番は、別の機器との通信により変更され得る。

本明細書において開示される方法、システム、機器、キット、及び組成物は、少量だけの血液、尿、涙液、汗、組織、又は他のサンプルの等の、サンプルの少量のみを必要とする迅速な検定を提供する。本明細書において開示される機器及びシステムは、約２５０μＬ未満、又は約２００μＬ未満、又は約１５０μＬ未満、又は約１００μＬ未満の容積を有するサンプル又はサンプルの一部分等の、少量のサンプルだけを必要とする、そのような迅速な検定を遂行するために構成される。従って、前記方法、組成物、機器、及びシステムは、少量の生物学的サンプルのみを必要とする迅速な試験を提供し、及び従って他の方法、組成物、検定、機器、及びシステムを超える利点を提供する。

出願人は、本明細書において開示される方法のために有用である、プライマー、ヌクレオチド、染料、緩衝液、及び他の試薬を含む試薬の１つ以上を含む組成物を本明細書において開示する。出願人は本明細書において開示される方法のために有用な、自動化された検定機器、及び自動化された検定システム（サンプル分析機器及びシステム、及び自動化されたサンプル分析機器及びシステムとも称され得る）を含む検定機器、及び検定システムにおいて用いるための容器を、本明細書において開示する。出願人は、本明細書において開示される方法のために有用な、自動化された検定機器及び自動化された検定システムを含む、検定機器、及び検定システムにおいて用いるための備品、道具、及び消耗品を、本明細書において開示する。出願人は、本明細書において開示される方法のために有用な、プライマー、ヌクレオチド、染料、及び他の試薬を含む、試薬の１つ以上を含む容器を、本明細書において開示する。出願人は、本明細書において開示される方法のために有用な、プライマー、ヌクレオチド、染料、緩衝液、及び他の試薬を含む、試薬の１つ以上を含む組成物を含むキットを、本明細書において開示し；このキットは、本明細書において開示される方法のために有用な、自動化された検定機器及び自動化された検定システムを含む、検定機器、及び検定システムにおいて用いるための容器を含み；及びこのキットは、本明細書において開示される方法のために有用な自動化された検定機器及び自動化された検定システムを含む、検定機器、及び検定システムにおいて用いるための、組成物及び容器を含む。

本明細書において開示される方法、システム、機器、キット、及び組成物は、他の方法よりも、より大きな感度を含む利点を提供する。本明細書において開示される方法、システム、機器、キット、及び組成物は、単一の核酸増幅機器、又はシステム（例えば、サンプル分析機器及びシステム、並びに自動化されたサンプル分析機器及びシステムとも称され得る、自動化された検定機器、及び自動化された検定システムであり得るか、又はそれらを含み得る）の中において、２つ以上の増幅反応を多重化する、改善された能力を含む利点を提供する。本明細書において開示される方法、システム、機器、キット、及び組成物は、第一の核酸増幅ステップにおいて、単一の容器中で、及び次に起きる、個別の標的核酸に向けられた、複数の第二の核酸増幅ステップにおいて、複数の個別の容器中で、２つ、３つ、又はより多くの標的核酸を増幅するための改善された能力を含む利点を提供する。本明細書において開示される方法、システム、機器、キット、及び組成物は、標的核酸中での、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を、増幅するか、検出するか、同定するか、又はそれらの組み合わせを行うための改善された能力を含む利点を提供する。本明細書において開示される方法、システム、機器、キット、及び組成物は、第一の核酸増幅ステップにおいて、染料を用いることなくＰＣＲを遂行して、及び次に起こる、第二の核酸増幅ステップに従って、標的核酸を検出するための、染料の使用を含む第二の核酸増幅を遂行するための、改善された能力を含む利点を提供し；例えば、このような方法、システム、機器、キット、及び組成物は、ＳＮＰの検出のために有用であり得る。

本明細書において開示される、方法、システム、機器、キット、及び組成物は、他の場合に要求され得るよりも少ない前処理により、サンプルを利用するための能力を含む利点を提供する。本明細書において開示される、方法、システム、機器、キット、及び組成物は、他の場合に要求され得るよりも、多い量にサンプルを希釈するための能力を含む利点を提供する。本明細書において開示される、方法、システム、機器、キット、及び組成物は、被験者以外の人間（例えば、オペレータ）による汚染に対する影響の受けやすさを、他の場合に生じる程度に比べ、低下させることを含む利点を提供する。本明細書において開示される、方法、システム、機器、キット、及び組成物は、他の方法が鼻咽頭の拭い取りを必要とする場合でも、鼻の拭い取りの分析に、これらの技法を適用する能力を含む利点を提供する。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
サンプル中の標的核酸配列を増幅するための方法であって、以下を含む方法：
第一の核酸増幅方法により、第一のサンプル中の１つ以上の標的核酸配列のコピー数を増幅すること；及び
次に、第二の核酸増幅方法により、更に前記サンプル又はその等分中の１つ以上の標的核酸配列のコピー数を増幅すること。
（項目２）
前記第一の核酸増幅方法が、熱サイクリング核酸増幅方法を含む、項目１の方法。
（項目３）
前記第二の核酸増幅方法が、等温核酸増幅方法を含む、項目１の方法。
（項目４）
前記第一の核酸増幅方法が、熱サイクリング核酸増幅方法を含み、及び前記第二の核酸増幅方法が、等温核酸増幅方法を含む、項目１の方法。
（項目５）
前記第一の核酸増幅方法が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）核酸増幅方法を含む、項目１〜４のいずれかの方法。
（項目６）
前記第二の核酸増幅方法が等温核酸増幅を含む、項目１〜５のいずれかの方法。
（項目７）
前記ＰＣＲ増幅方法により増幅された核酸がＤＮＡを含む、項目５の方法。
（項目８）
前記ＰＣＲ増幅方法により増幅された核酸がＲＮＡを含む、項目５の方法。
（項目９）
増幅方法において用いられるプライマーが、単一の標的核酸配列、及びその相補体に向けられた、項目１〜８のいずれかの方法。
（項目１０）
増幅方法において用いられるプライマーが、複数の標的核酸配列、及びその相補体に向けられた、項目１〜８のいずれかの方法。
（項目１１）
共通の核酸分子上の第一の遺伝学的要素、及び第二の遺伝学的要素を検出するための方法であって、以下を含む方法：
第一のプライマー、及び第二のプライマーを用いる第一の核酸増幅反応を遂行することであって、前記第一のプライマー、及び前記第二のプライマーの両方は、前記プライマーの５’末端がリン酸化されており、前記第一のプライマーは、前記第一の遺伝学的要素に相補的であり、前記第二のプライマーは、前記第二の遺伝学的要素に相補的であり、及び第一の反応生成物が形成されると、前記第一の反応生成物は、前記第一の遺伝学的要素の少なくとも一部分を含み、及び前記第二の遺伝学的要素の少なくとも一部分を含み、前記第一の遺伝学的要素の少なくとも一部分、及び前記第二の遺伝学的要素の少なくとも一部分は、前記第一の反応生成物中で、互いにＸ個のヌクレオチド分だけ離れており；
少なくとも第一の反応生成物を含む第一のライゲーション生成物を形成するために、前記第一の反応生成物をリガーゼ酵素とインキュベートすることであって、前記第一のライゲーション生成物内においては、前記第一の遺伝学的要素の少なくとも一部分のコピー、及び前記第二の遺伝学的要素の少なくとも一部分のコピーは、互いにＸ個未満のヌクレオチド分だけ離れており；
第三のプライマー及び第四のプライマーを用いる第二の核酸増幅反応を遂行することであって、前記第三のプライマーは、前記第一の遺伝学的要素に相補的であり、及び前記第四のプライマーは前記第二の遺伝学的要素に相補的であり、第二の反応生成物が形成され；及び
前記第二の反応生成物を検出すること。
（項目１２）
ポリヌクレオチドテンプレートを増幅するための方法であって、以下を含む方法：
Ａ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅反応混合物中に、ポリヌクレオチドテンプレートの複数のコピーを生成することであって、前記ＰＣＲ増幅反応混合物は、第一のＰＣＲ増幅反応プライマー、及び第二のＰＣＲ増幅反応プライマーを含み、前記ＰＣＲ増幅反応混合物中では、前記第一のＰＣＲ増幅反応プライマーが前記ポリヌクレオチドテンプレートにアニールし、及び前記第二のＰＣＲ増幅反応プライマーが、前記ポリヌクレオチドテンプレートに相補的なポリヌクレオチドにアニールし、及び前記ＰＣＲ増幅反応混合物中では、ＰＣＲ増幅反応生成物の複数のコピーが生成されており、前記ＰＣＲ増幅反応生成物は、第一の鎖及び第二の鎖を含む二本鎖の核酸分子であり、及び前記ＰＣＲ増幅反応生成物の第一の鎖は、前記ポリヌクレオチドテンプレートのコピーであり；
Ｂ）非熱サイクリング反応の第一のプライマー及び非熱サイクリング反応の第二のプライマーを含む非熱サイクリング反応混合物中で、前記ポリヌクレオチドテンプレートのコピーをインキュベートすることであって：
前記ポリヌクレオチドテンプレートは、第一の部分、第二の部分、及び第三の部分を含み、前記第三の部分は、前記第一の部分及び前記第二の部分の間の前記ポリヌクレオチドテンプレート内に位置し；
前記第一のプライマーは第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一のプライマーの第二の領域は、前記ポリヌクレオチドテンプレートの第一の部分に相補的であり；及び
前記第二のプライマーは第一の領域及び第二の領域を含み、前記第二のプライマーの第二の領域は、前記ポリヌクレオチドテンプレートの第二の部分に相補的である前記ＰＣＲ増幅反応生成物の第二の鎖の中の配列に相補的であり、前記第二のプライマーの第一の領域は、前記第一のプライマーの第一の領域に相補的であり、及び前記第二のプライマーの第一の領域は、前記ポリヌクレオチドテンプレートの第三の部分に相補的である。
（項目１３）
前記ポリヌクレオチドテンプレートの第一の部分及び第二の部分のそれぞれが、長さにおいて６〜３０ヌクレオチドである、項目１２の方法。
（項目１４）
前記ポリヌクレオチドテンプレートの第三の部分が、長さにおいて４〜１４ヌクレオチドである、項目１２又は１３の方法。
（項目１５）
非熱サイクリング反応混合物中の、前記ポリヌクレオチドテンプレートのコピー数が、本方法の開始から６０分以内に少なくとも１０倍に増大される、項目１２〜１４のいずれかの方法。
（項目１６）
前記ポリヌクレオチドテンプレートの、少なくとも３コピーを含むコンカテマー鎖が、非熱サイクリング反応混合物のインキュベーション中に生成される、項目１２〜１５のいずれかの方法。
（項目１７）
項目１〜１６のいずれかにおいて提供される、反応混合物の１つ以上の構成要素を、その中に含む容器。
（項目１８）
項目１〜１７のいずれかにおいて提供される、反応混合物の１つ以上の構成要素を、その中に含むキット。

本発明の他の目標及び利点は、以下の記載及び添付される図面との関連において考慮された場合に、更に認識され、及び理解されるであろう。以下の記載は、本発明の特定の実施形態を記載する特定の詳細を含むが、これらは本発明の範囲に対する制限と解釈されるべきではなく、可能な実施形態の例示と解釈されるべきである。本発明のそれぞれの態様に対しては、多くの変更及び修正が、本発明の精神を逸脱することなく行われ得る。

図面において、

図１は、本明細書において提供される方法による例示的な結果を示す。

図２は、本明細書において提供される方法による例示的な結果を示す。

図３は、本明細書において提供される方法による例示的な結果を示す。

図４は、本明細書において提供される方法による例示的な結果を示す。

図５は、本明細書において提供される方法による例示的な結果を示す。

図６は、本明細書において提供される方法において、用い得る例示的なプライマー配列を図示する。

図７は、本明細書において提供される方法の一般的な概略図である。

図８は、本明細書において提供される方法において用い得る、例示的なプライマー配列である。

図９は、本明細書において提供される方法からの結果を示す。

図１０は、本明細書において提供される方法において用い得るプライマー配列を示す。

本明細書中の図面及びその中の要素は、必ずしもその形状及び尺度を描いたものではないことに注意されたい。例えば、前記図面中の要素の形状又は尺度は、説明の容易さ又は明瞭さのために、単純化又は修正され得る。本明細書中の図面及びその中の要素は、例示的な説明的な目的のみのためのものであり、いかなる方法においても、制限するものであると解釈されるべきではないことも、更に理解されたい。

（発明の詳細な説明）
本出願は、参照により以下の特許出願の全体を全ての目的で本出願に組み込む：２０１４年９月１７日に出願された米国特許仮出願第６２／０５１，９１２号；２０１４年９月１７日に出願された米国特許仮出願第６２／０５１，９４５号；２０１４年１０月２４日に出願された米国特許仮出願第６２／０６８，６０３号；２０１４年１０月２４日に出願された米国特許仮出願第６２／０６８，６０５号；２０１５年４月２２日に術願された米国特許仮出願第６２／１５１，３５８号；２０１３年１１月２２日に出願された米国特許仮出願第６１／９０８，０２７号；２０１４年５月２０日に出願された米国特許仮出願第６２／００１，０５０号；及び２０１３年３月１５日に出願された米国特許仮出願第６１／８００，６０６号；２０１４年３月１５日に出願された米国実用新案出願（Ｕ．Ｓ．Ｎｏｎ−Ｐｒｏｖｉｓｉｏｎａｌ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）第１４／２１４，８５０号；２０１４年３月１５日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１４／３００３４号；２０１４年９月１７日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１４／５６１５１号；及び２０１５年９月１７日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１５／５０８１１号。

本明細書において提供されるものは、核酸の増幅のためのシステム及び方法である。本明細書において記載される様々な特徴は、以下に説明される特定の実施形態のいずれにも適用されることができるか、又は任意の他のタイプのシステム又は核酸増幅を含むものに適用され得る。本明細書において記載されたシステム及び方法は、スタンドアロンのシステム又は方法として、又は統合されたシステム又は方法の一部として応用され得る。開示されたシステム及び方法の、異なる態様は、個別に、集合的に、又は互いの組み合わせにおいて、評価され得ることが理解されるであろう。

実施形態では、本明細書において提供される方法は、以下のように遂行され得る。第一の増幅反応において、ポリヌクレオチドテンプレートが増幅されることができ、前記第一の増幅反応は、熱サイクリング核酸増幅反応（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））である。前記第一の増幅反応においては、核酸増幅反応生成物が生成され得る（例えば、ＰＣＲ増幅反応生成物が生成され得る）。前記第一の増幅反応により生成された増幅反応生成物は、次いで第二の増幅反応において増幅されることができ、ここで前記第二の増幅反応は非熱サイクリング核酸増幅反応（例えば、等温核酸増幅反応）である。

実施形態では、本明細書において提供される方法は、以下のように遂行され得る。第一の増幅反応において、ポリヌクレオチドテンプレートが増幅されることができ、前記第一の増幅反応は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）反応である。前記第一の増幅反応においては、ＰＣＲ増幅反応生成物が生成され得る。前記ＰＣＲ増幅反応生成物は、第一の鎖及び第二の鎖を含む、二本鎖の核酸分子であることができ、及び前記ＰＣＲ増幅反応生成物の第一の鎖は、前記ポリヌクレオチドテンプレートのコピーである。次に、前記ＰＣＲ反応生成物（前記ポリヌクレオチドテンプレートのコピーを含む）が、ＰＣＴ／ＵＳ１４／５６１５１において提供されるような非熱サイクリング増幅反応において、ＰＣＴ／ＵＳ１４／５６１５１に記載されるような、非熱サイクリング反応生成物を生成するための、テンプレートとして用いられ得る。そのような非熱サイクリング反応生成物は、コンカテマーを含み得る。ＰＣＲ増幅反応に続いた非熱サイクリング増幅反応を含む、この方法の実施形態においては、非熱サイクリング反応の生成物のみが検出される（前記ＰＣＲ反応生成物ではなく）。実施形態では、前記非熱サイクリング反応生成物は、それらが形成されるのと同時に検出される。実施形態では、ＰＣＴ／ＵＳ１４／５６１５１の方法は、第一のプライマー及び第二のプライマーを含み得る。実施形態では、前記ＰＣＴ／ＵＳ１４／５６１５１の方法の第一のプライマーは、第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一の領域は、前記プライマーの５’末端を含み、前記第二の領域は前記プライマーの３’末端を含み、及び前記第二の領域は、二本鎖の核酸テンプレート（即ち、ＰＣＲ増幅反応生成物等の二本鎖の核酸分子）の第一の鎖の少なくとも一部分に相補的である。実施形態では、前記ＰＣＴ／ＵＳ１４／５６１５１の方法の第二のプライマーは、第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一の領域は、前記プライマーの５’末端を含み、及び前記第一のプライマーの第一の領域に相補的であり、前記第二の領域は、前記プライマーの３’末端を含み、及び前記第二の領域は、二本鎖の核酸テンプレートの第二の鎖の少なくとも一部分に相補的である。実施形態では、前記ＰＣＴ／ＵＳ１４／５６１５１の方法の第一のプライマーの第二の領域は、本明細書において提供されるＰＣＲ増幅反応において、第一のＰＣＲ増幅反応のプライマーがポリヌクレオチドテンプレート鎖にアニールするのと同じ様式で、本明細書における方法におけるＰＣＲ増幅反応生成物の第一の鎖にアニールすることができ、及び前記ＰＣＴ／ＵＳ１４／５６１５１の方法の第二のプライマーの第二の領域は、第二のＰＣＲ増幅反応のプライマーが、本明細書において提供される方法におけるＰＣＲ増幅反応中のポリヌクレオチドテンプレートに相補的であるポリヌクレオチドにアニールするのと同じ様式で、本明細書において提供されるＰＣＲ増幅反応生成物の第二の鎖に、アニールし得る。

更なる実施形態では、本明細書において提供される方法は、以下のように遂行され得る。第一の増幅反応において、ポリヌクレオチドテンプレートが増幅されることができ、前記第一の増幅反応は、非熱サイクリング核酸増幅反応（例えば、等温核酸増幅反応）である。前記第一の増幅反応において、核酸増幅反応生成物が生成され得る。前記第一の増幅反応により生成された増幅反応生成物は、次いで第二の増幅反応において増幅されることができ、前記第二の増幅反応は、熱サイクリング核酸増幅反応（例えば、ＰＣＲ反応）である。
（定義）

本明細書において用いられる、“ポリヌクレオチド”は、２つ以上のヌクレオチドを含む、ポリマー性の鎖を指す。“ポリヌクレオチド”としてはプライマー、オリゴヌクレオチド、核酸鎖等が挙げられる。ポリヌクレオチドは、標準的又は非標準的ヌクレオチドを含み得る。典型的には、ポリヌクレオチドは一つの末端（“５’末端”）に５’リン酸を含み、及び鎖の他の末端（“３’末端）に３’水酸基を含む。ポリヌクレオチドのほとんどの５’ヌクレオチドは、本明細書においては、“ポリヌクレオチドの５’末端ヌクレオチド”と称される。ポリヌクレオチドのほとんどの３’ヌクレオチドは、本明細書では、“ポリヌクレオチドの３’末端ヌクレオチド”と称される。

５’末端ヌクレオチド及び３’末端ヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチドの文脈において、本明細書において用いられる用語“下流”は、前記ポリヌクレオチド内の参照点よりも前記３’末端ヌクレオチドにより近い、前記ポリヌクレオチド中の位置を指す。例えば、：５’ＡＴＡＡＧＣ３’の配列を持つプライマーにおいて、前記“Ｇ”は前記“Ｔ”及び全ての“Ａ”から下流にある。

５’末端ヌクレオチド及び３’末端ヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチドの文脈において、本明細書において用いられる用語“上流”は、前記ポリヌクレオチド内の参照点よりも前記５’末端ヌクレオチドにより近い、前記ポリヌクレオチド中の位置を指す。例えば、：５’ＡＴＡＡＧＣ３’の配列を持つプライマーにおいて、前記“Ｔ”は前記“Ｇ”前記“Ｃ”、及び前記“Ｇ”に最も近い、２つの“Ａ”から上流にある。

本明細書において用いられる、“核酸”は、非標準的ヌクレオチドを含むＤＮＡ及びＲＮＡを含むＤＮＡ及びＲＮＡの両方を含む。“核酸”は、少なくとも１つのポリヌクレオチド（“核酸鎖”）を含む。“核酸”単鎖、又は二重鎖であり得る。

明細書において用いられる、“コンカテマー”は、その中に、特定の核酸の２つ以上のコピーを含み、それらのコピーが、直列に連結している核酸分子を指す。前記コンカテマーの中で、前記特定の核酸のコピーは、互いに直接連結することができるか、又はそれらは間接的に連結できる（例えば、前記特定の核酸のコピーの間にヌクレオチドがあり得る）。一実施例では、前記特定の核酸は、二本鎖の核酸テンプレートであることができるので、コンカテマーは、前記二本鎖の核酸テンプレートの２つ以上のコピーを含み得る。別の実施例では前記特定の核酸は、ポリヌクレオチドテンプレートであり得るので、コンカテマーは、前記ポリヌクレオチドテンプレートの２つ以上のコピーを含み得る。

明細書において用いられる、“標的の”核酸又は分子は、目的の核酸を指す。標的の核酸／分子は、単鎖の又は二重鎖のＤＮＡ又はＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）を含む任意のタイプであり得る。

本明細書において用いられる、“相補的”配列は、２つのヌクレオチド配列が、互いに逆平行に整列された場合に、標準的塩基対法則（例えば、Ａ−Ｔ、Ｇ−Ｃ、又はＡ−Ｕ）に従って、ペアーを形成する複数の個々のヌクレオチド塩基を含むために、配列を含む分子が互いに特異的にアニールできる、２つのヌクレオチド配列を指す。配列が“相補的”であると見なされるためには、２つの配列の全てのヌクレオチド塩基が、互いにペアーを形成する能力を有する必要はない。例えば、もし２つの配列が相補性のために最適に整列されたときに、２つの配列の中の、少なくとも３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％のヌクレオチド塩基が、互いにペアーを形成できる場合に、配列が相補的であると見なされる。加えて、２つの配列の長さが、互いに顕著に異なる場合でも、“相補的”と見なされ得る。例えば、１５ヌクレオチドのプライマーは、数百のヌクレオチドを含むより長いポリヌクレオチドに対して、前記プライマーが、より長いポリヌクレオチド特定の領域に対して逆平行に整列されたときに、もし前記プライマーの複数の個別のヌクレオチド塩基が、より長いポリヌクレオチドのヌクレオチド塩基とペアを形成できれば、“相補的”と見なされ得る。加えて、“相補的”配列は、１つ以上のヌクレオチド・アナログ又は核酸塩基アナログを含み得る。本明細書において用いられる、“完全に相補的な”又は“完全な相補性”等は、互いに１００％相補的な２つの配列（即ち、配列が最大の相補性でペアーを形成した時に、配列のヌクレオチドの間に、不一致が全くない場合）を指す。

本明細書において用いられる、タンパク質、核酸、又は他の生体分子に適用される用語“単離された”は、その自然に生じている環境における構成要素から、精製されたか、又は分離された分子を指す（例えば、自然に生成された細胞から精製されたタンパク質）。“単離された”分子は、分子の分子との接触にあってもよい（例えば、反応混合物の一部として）。本明細書において用いられる、“単離された”分子は、更に自然に生じるアミノ酸又はヌクレオチド配列を有する、組み換え的に生成されたタンパク質又は核酸をも含む。“単離された”核酸は、ポリペプチドを通常発現する細胞内に含まれる前記ポリペプチドを、エンコードする核酸分子を含み、例えば、前記核酸分子は、自然の細胞とは異なる遺伝子の染色体上の位置にある。いくつかの実施形態では“単離された”ポリペプチドは、前記ポリペプチドのＳＤＳ−ＰＡＧＥに続いてクマシー・ブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｌｕｅ）、銀、又は他のタンパク質染色方法により証明されるところでは、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は１００％の同質性まで精製される。

本明細書において用いられる、テンプレート又は他の核酸の“配列”を含むものとして記載される核酸分子は、文脈が他のものを明確に指示しない限り、前記テンプレート又は他の核酸それ自身を含むとも見なされ得る（例えば、テンプレートの配列を含むとして記載される分子は、前記テンプレートを含むものとしても記載され得る）。

本明細書において用いられる、第一のポリヌクレオチドが、第二のポリヌクレオチドに“アニールされた（ａｎｎｅａｌｅｄ）”、“アニールしている（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）”等の場合は、前記第一のポリヌクレオチドの全体、又は任意のその一部分が、第二のポリヌクレオチドにアニールすることができ、及びその逆も成り立つ。

本明細書において用いられる、所定の対象を、状態又は他の対象等で“処理すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）”への言及は、所定の対象を、直接又は間接に、列挙された状態又は他の対象に曝露することを指す。従って、“処理すること”のステップが明白に区別できる関連する活動（例えば、酵素を容器に加える、容器を振盪する等）を含み得る一方で、全ての“処理すること”のステップが、明白に区別できる関連する活動を必要とはしない。例えば、１つ以上の試薬を含む反応は、容器中で設定されることができ、及び一旦この反応が開始されると、更なる人間又は機械による前記容器の内容への介入なしで、複数の事象又はステップが容器中で生じ得る。前記容器中での、これらの複数の事象又はステップの１つ以上は、反応の開始後には、前記容器の内容への個別の介入がないにも関わらず前記容器中の対象を「処理すること」と記載されることができる。

実施形態では、本明細書において提供されるものは、標的核酸の増幅のための方法であって、この方法は、少なくとも２つの異なる核酸増幅プロセスを含む。実施形態では、第一に、標的核酸が熱サイクリングを含む第一の核酸増幅方法により増幅され、及び次いで、熱サイクリング反応において増幅された標的核酸の一部又はすべてが、次いで第二の核酸増幅反応のために用いられることができ、前記第二の核酸増幅反応は等温増幅反応である。例えば、第一に、標的核酸はポリメラーゼ連鎖反応（“ＰＣＲ”）増幅反応（例えば、ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼに記載される）により増幅され得る。ＰＣＲ増幅方法は熱サイクリング増幅方法である。

次いで、ＰＣＲ法による増幅に続いて、前記ＰＣＲ反応からの増幅された標的核酸の一部又はすべてが、例えば、そのそれぞれの全体が、参照により全ての目的で本明細書に組み込まれる、２０１４年３月１５日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１４／３００２８号、２０１４年３月１５日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１４／３００３４号、２０１４年９月１７日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１４／５６１５１号、又は２０１４年３月１５日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１４／３００３６号のいずれかに記載されているような、等温核酸増幅反応のために用いられ得る。以下、簡潔さのために、ＰＣＴ／ＵＳ１４／３００２８、ＰＣＴ／ＵＳ１４／３００３４、ＰＣＴ／ＵＳ１４／５６１５１、及びＰＣＴ／ＵＳ１４／３００３６に記載される等温核酸増幅方法は、集合的に“ＮＡＡ”法と称される。

本発明の方法は、核酸増幅検定の検出の限界（ＬＯＤ）を改善する（即ち、低下させる）。つまり、熱サイクリング方法による前増幅がサンプルに適用され、及び次いで等温核酸増幅方法が適用された場合に、そのような前増幅なしで等温方法がサンプルに適用された場合に比べて、サンプル中のより少ない数の標的核酸配列の存在が検出され得る。サンプル中の、１マイクロリットルの標的核酸当たり、わずか１コピーが、ＰＣＲに続くＮＡＡ法を用いて検出される。
ＮＡＡ法

本明細書において“ＮＡＡ法”と称される等温核酸増幅方法の完全な記載が、ＰＣＴ／ＵＳ１４／３００２８、ＰＣＴ／ＵＳ１４／３００３４、ＰＣＴ／ＵＳ１４／５６１５１、及びＰＣＴ／ＵＳ１４／３００３６中に見いだされることが理解されるであろう；しかしながら、これらの方法は、以下にも簡潔に要約される。

核酸増幅のＮＡＡ法は二本鎖のＤＮＡに適用され得る。しかしながら、標的核酸分子は、必ずしも二本鎖のＤＮＡ標的に限定されず；例えば、本明細書に記載される、ＮＡＡ法において用いられる二本鎖のＤＮＡは、ウイルスのＲＮＡ、又はｍＲＮＡ、又は他の単一鎖のＲＮＡ標的ソースから、逆転写酵素により調製され得る。更なる実施例では、本明細書に記載される、ＮＡＡ法において用いられる二本鎖のＤＮＡは、一本鎖のＤＮＡ標的からＤＮＡポリメラーゼにより調製され得る。そのような方法は、以下で議論するＮＡＡ法の適用に先立つ、最初のステップとして適用され得る。

二本鎖のＤＮＡ標的の増幅は、例えば、増幅されるべき一次の二本鎖のＤＮＡ（以下では“一次核酸”と称される）から開始される。この一次の核酸は、テンプレート領域と称される標的領域を含み；このテンプレート領域は、テンプレート配列を有する。そのような二本鎖のテンプレート領域は、第一のＤＮＡ鎖及び相補的なＤＮＡ鎖を含み、及び５’末端ヌクレオチドを１つの鎖に含み、及び３’末端ヌクレオチドを、互いに相補的である、他の鎖の中に含む。

第一のプライマー及び第二のプライマーは、それぞれがテンプレート結合領域及びテール領域を持って提供され；これらのプライマーのテンプレート結合領域は標的のテンプレート領域に相補的である。これらのプライマーのテール領域は以下の３つの構成要素を含み得る：ａ）プライマーの５’末端ヌクレオチド、ｂ）最も内部のヌクレオチドであって、この最も内部のヌクレオチドは前記５’末端ヌクレオチドから下流にあり、及びｃ）前記５’末端ヌクレオチド、及び前記最も内部のヌクレオチドの間の中間部分であって、１つ以上のヌクレオチドを含む中間部分。加えて、２つのプライマーのテール領域の少なくとも一部分は、適切に整列されたときに、互いに相補的であり得る。

前記第二のプライマーのテール領域は、前記第一のプライマーのテール領域のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み得るが、典型的には、前記第一のプライマー及び第二のプライマーのアニーリングにより、形成される生成物は、本明細書において提供される方法又は組成物にとって、望ましくないか、又は有用ではないことに注意されたい。従って、いくつかの実施形態においては、第一のプライマー−第二のプライマーのアニール化生成物の形成を、最少化するためのステップが取られることができる。そのようなステップは、例えば、本明細書において提供される方法を開始する前に、第一のプライマー及び第二のプライマーが、延長された時間の間にアニールしてしまうような条件下での、前培養を行わないことを含み得る。

前記一次核酸は、前記第一のプライマーの第一のコピーのテンプレート結合領域が、前記核酸テンプレートの第一の鎖にアニールできる条件下で、ポリメラーゼ及び前記第一のプライマーの第一のコピーと共に処理されることができる。これらの条件下では、前記第一のプライマーの第一のコピーの延長生成物が形成される。鎖置換活性を有し得る前記ポリメラーゼは、前記第一のプライマーの第一のコピーの延長生成物の形成を触媒し得る。前記第一のプライマーの第一のコピーは、合成された延長生成物に共有結合的に連結されることができるので、前記第一のプライマーの第一のコピー（前記核酸テンプレートの第一の鎖に相補的である）は、“前記第一のプライマーの第一のコピーの延長生成物”として、本明細書に記載される分子の一部になる。前記第一のプライマーの第一のコピーのテール領域ではなく、前記テンプレート結合領域は、前記核酸テンプレートの第一の鎖にアニールする。ポリメラーゼに基づく核酸合成の適切な条件の例は、当技術分野では周知であり、及び例えば、参照により、その全体が本明細書に組み込まれる、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（分子のクローニング：実験室マニュアル）、Ｍ．Ｒ．Ｇｒｅｅｎ及びＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ著、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２０１２年）において提供される。

前記第一のプライマーの第一のコピーの延長生成物は、ポリメラーゼ（鎖置換活性を持ち得る）及び前記第二のプライマーと、前記第二のプライマーのテンプレート結合領域が、前記第一のプライマーの第一のコピーの延長生成物とアニールできる条件下で処理され得る。このような方法で、前記第二のプライマーの延長生成物が形成され得る。前記ポリメラーゼは、前記第二のプライマーの延長生成物の間に、前記第一のプライマーの第一のコピーの延長生成物から、前記核酸テンプレートの第一の鎖を置換し得る。前記第二のプライマーは、合成された延長生成物に共有結合的に連結できるので、前記第二のプライマーは、本明細書に“前記第二のプライマーの延長生成物”として記載される分子の一部になる。前記第二のプライマーの延長生成物は、前記第一のプライマーの第一のコピーの延長生成物に相補的である。前記第二のプライマーのテール領域ではなく、前記テンプレート結合領域は、前記第二のプライマーが前記第一のプライマーの第一のコピーの延長生成物にアニールした時に、前記第一のプライマーの第一のコピーの延長生成物にアニールできる。

前記第二のプライマーの延長生成物は、前記第一のプライマーの第二のコピーの延長生成物を形成するために、ポリメラーゼ（鎖置換活性を持ち得る）及び前記第一のプライマーの第二のコピーと処理され得る。前記第一のプライマーの第二のコピーの延長生成物の生成中に、前記第一のプライマーの第二のコピーは、合成された延長生成物に共有結合的に連結できるので、前記第一のプライマーの第二のコピーは、本明細書において“前記第一のプライマーの第二のコピーの延長生成物”と記載される分子の一部になる。前記第一のプライマーの第二のコピーの延長生成物は、前記第二のプライマーの延長生成物に相補的である。

前記第一のプライマーの第二のコピーの延長生成物の生成は、本明細書において“二次核酸”と称され得る、前記第一のプライマーの第二のコピーの延長生成物、及び前記第二のプライマーの延長生成物を含む分子の生成をもたらすことができる。二次核酸は、前記第二のプライマーの延長生成物の３’末端領域（及びその相補体）を含むことができ、及び前記第一のプライマーの第二のコピーの延長生成物の３’末端領域（及びその相補体）を含むことができる。二次核酸分子は、テール配列に隣接する前記テンプレート領域の配列を含む。実施形態では、二本鎖の核酸が、精製され、その中では相補的なテンプレート及びテール領域の配列が、一列に並んでいる。実際面では、前記二次核酸の複数のコピー（例えば、２つ以上の）が、二次核酸の一般的構造を有する核酸が、それにより生成され得る、本明細書において議論されるＮＡＡ法の実施を含む、任意のプロセスにより生成される。

従って、二次核酸のコピーのペアーが提供され得る。更に数多くのコピーが、例えば、前述のステップ及び方法の反復により、次いで生成されることができる。例えば、二次核酸を一次核酸から生成するために、上述された全プロセスが、二次核酸のコピーの２つのペアーを生成させるために、２回繰り返されることができ；更なる反復が、更にコピー数を増幅するために、例えば、指数関数的に（例えば、２の階乗により）、コピー数を増大させるために遂行されることができる。

加えて、前記二次核酸分子は、前記テール配列に隣接するテンプレート領域の配列を含むために、部分的に、その中でテール領域配列がハイブリダイズし、及び一直線に並ぶ、二本鎖の核酸が生成され得る。これらのテール領域配列は１本鎖のテンプレート領域に接続しているために、ハイブリダイズされたテール領域配列に、一緒に保持される２つの核酸鎖を有する、クロスオーバー構造が生成される。これらのクロスオーバー構造は、両方の構成要素の鎖の延長生成物を形成するために、ポリメラーゼにより延長され得る。これらの延長生成物は“コンカテマー鎖“と称され得る。２つのコンカテマー鎖は、一緒にアニールされることができ、及び集合的にコンカテマーと称されることができ；そのようなコンカテマーは、前記核酸テンプレートの２つ以上のコピーを含み得る。

いくつかの実施形態においては、更に、より長いコンカテマーでさえ形成され得る。例えば、コンカテマーは互いにアニールし得るか；又は２つのコンカテマー分子は、上記で議論されたコンカテマー鎖と称される、より短い分子により形成されるものと同様のクロスオーバー構造を形成することができ、続いて、前記核酸テンプレートの４つのコピーを含むより長いコンカテマー分子が形成され得る。別の実施例では、二次核酸及びコンカテマーは、クロスオーバー構造を形成することができ、前記核酸テンプレートの３コピーを含む、より大きなコンカテマー分子が形成され得る。いくつかの実施形態においては、複数の異なる長さの複数の異なるコンカテマーが同時に形成され得る。

従って、そのような方法により生成されるコンカテマーは、ヌクレオチドの任意の長さであり得る。いくつかの実施形態においては、本明細書において生成されるコンカテマー分子は、長さにおいて、少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、１５，０００、２０，０００、又は２５，０００ヌクレオチドであることができる。そのような方法により生成されるコンカテマーは、核酸テンプレートの任意の数のコピーを含み得る。いくつかの実施形態においては、本明細書において生成されるコンカテマー分子は、核酸テンプレートの、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００コピーを含み得る。更なる実施例が提供され、及びこれら及び他の実施例の、より詳細が、２０１３年３月１５日に出願された、米国特許出願第６１／８００，６０６号の中に提供されている。
反応の検出

本明細書において提供される方法の進行は、複数の異なる方法でモニターされ得る。一実施形態では、反応は、核酸増幅生成物（例えば、生成物のレベル又はその生成の速度について）について検定され得る。別の実施形態では、反応は、核酸テンプレートに沿ったポリメラーゼの活性により検定され得る（例えば、テンプレート鎖に沿ったポリメラーゼの動き）。従って、いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法の事象は、方法からの生成物の累積に起因して（前記方法のステップの間、又はその完了の後の）、又は方法のステップの間に生じる検出可能な事象に起因して観察され得る。

増幅された核酸の存在は、例えば、反応生成物の検出により（増幅された核酸又は反応副生成物）、又は前記反応の進展に伴うプローブの検出により検定され得る。

いくつかの実施形態では、反応生成物は、生成物を染料により染色することにより同定され得る。いくつかの実施形態では、染料は核酸と結合した時に、核酸と結合していない時よりも、より大きな蛍光を有し得る。実施形態では、染料は二本鎖の核酸にインターカレートし得るか、又は染料は核酸の外部領域に結合し得る。本明細書において提供される方法及び組成物により用いられ得る核酸染料としては、例えば、シアニン染料、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ(R)、ＯｌｉＧｒｅｅｎ(R)、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ(R)、ＳＹＢＲ(R)染料、ＳＹＢＲ(R)Ｇｏｌｄ、ＳＹＢＲ(R)Ｇｒｅｅｎ Ｉ、ＳＹＢＲ(R)Ｇｒｅｅｎ ＩＩ、臭化エチジウム、ジヒドロエチジウム、ＢｌｕｅＶｉｅｗ（商標）、ＴＯＴＯ(R)染料、ＴＯ−ＰＲＯ(R)染料、ＰＯＰＯ(R)染料、ＹＯＹＯ(R)染料、ＢＯＢＯ(R)染料、ＪＯＪＯ(R)染料、ＬＯＬＯ(R)染料、ＳＹＴＯＸ(R)染料、ＳＹＴＯ(R)染料、ヨウ化プロピジウム、ヨウ化ヘキシジウム、メチレンブルー、ＤＡＰＩ、アクリジン・オレンジ、キナクリン、アクリジン二量体、９−アミノ−６−クロロ−２−メトキシアクリジン、ビスベンズイミド染料、ヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）染料、７−アミノアクチノマイシンＤ、アクチノマイシンＤ、ヒドロキシスチルバミジン、ピロニンＹ、Ｄｉａｍｏｎｄ（商標）染料、ＧｅｌＲｅｄ（商標）、ＧｅｌＧｒｅｅｎ（商標）及びＬＤＳ７５１が挙げられる。

例えば、サンプル中の、インフルエンザウイルス等のウイルス、黄色ブドウ球菌等のバクテリア、又は他の生物学的標的等の標的マーカーの存在を検出する方法が、本明細書において開示され、複数の可能な標的の存在が、単一のサンプルから短い時間の期間で試験される。実施形態では、前記複数の可能な標的は、少なくとも５個の可能な標的、又は少なくとも１０個の可能な標的、又は少なくとも１５個の可能な標的、又は少なくとも２０個の可能な標的、又は少なくとも２５個の可能な標的、又は少なくとも３０個の可能な標的、又は少なくとも３５個の可能な標的、又は少なくとも４０個の可能な標的、又は少なくとも４５個の可能な標的、又は少なくとも５０個の可能な標的、又は少なくとも５５個の可能な標的、又は少なくとも６０個の可能な標的、又は少なくとも６４可能な標的、又は少なくとも６５個の可能な標的、又はそれより多い可能な標的を含む。実施形態では、短い時間の期間は５時間以下、又は４時間以下、又は３時間以下、又は２つの時間以下、又は１時間以下、又は５０分以下、又は４０分以下、又は３０分以下、又は２０分以下、又は１０分以下、又は５分以下の時間の期間である。

いくつかの実施形態では、反応生成物は、増幅反応の濁度の分析により同定され得る。例えば、実施形態では、増加した濁度は反応生成物及び反応副生成物の生成に相関付けられる（例えば、マグネシウムと複合化したピロリン酸）。

いくつかの実施形態では、反応生成物は、本明細書の方法に従って遂行される反応をゲル電気泳動により分離し、続いてそのゲルを核酸のための染料により染色ことにより同定され得る。前記染料は、本明細書で開示されるか、又はさもなければ当技術分野で周知の、任意の核酸染料であり得る。

いくつかの実施形態では、核酸又は核酸の生成に伴うプロセスの検出のための、当技術分野で周知の、任意の方法又は組成物が、本明細書において提供される方法、及び組成物により用いられることができる。

いくつかの実施形態では、蛍光レポーター（蛍光色素分子）、及び消光剤の１つ又は両方を含む、核酸テンプレート鎖の一部（又は同様の又は同一の配列を有する鎖）に相補的なヌクレオチド配列を含む核酸プローブが、本明細書において提供される反応に含まれる。

一実施例では、核酸プローブは、蛍光レポーターを５’又は３’末端に、及び消光剤をその反対の末端に含み得る。

別の実施例では、核酸プローブは、蛍光レポーターを５’又は３’末端に、含むことができ、及びそれは消光剤を含む核酸プライマーにアニールされ得る。前記消光剤を含む核酸プライマーは、前記プライマーの中の位置に消光剤を含み得るので、前記核酸プローブは前記プライマーにアニールしたときに、前記蛍光レポーターは消光される。

蛍光レポーター及び消光剤のペアーを含むプローブにおいて、前記蛍光レポーター及び消光剤は選択され得るので、前記消光剤は、効果的に前記蛍光レポーターを消光できる。いくつかの実施形態では、蛍光レポーターは、その発光極大が、消光剤の吸収極大と同様であるような特定の消光剤と組み合わされる。前記蛍光レポーターとして用いられ得る蛍光色素分子としては、例えば、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ(R) Ｇｏｌｄ、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ(R) Ｏｒａｎｇｅ、Ｑｕａｓａｒ ５７０、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ(R) Ｒｅｄ ５９０、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ(R) ６１０、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ(R) Ｒｅｄ ６１０、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ(R) Ｒｅｄ ６３５、Ｑｕａｓａｒ(R) ６７０ （バイオサーチ・テクノロジーズ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））、ＶＩＣ、ＮＥＤ（ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５（ＧＥヘルスケア・ライフ・サイエンシズ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ））、Ｏｙｓｔｅｒ ５５６、Ｏｙｓｔｅｒ ６４５（インテグレ―ティッド・ＤＮＡテクノロジーズ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））、ＬＣ ｒｅｄ ６１０、ＬＣ ｒｅｄ ６１０、ＬＣ ｒｅｄ ６４０、ＬＣ ｒｅｄ ６７０、ＬＣ ｒｅｄ ７０５（ロッシュ・アプライズ・サイエンス（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ））、Ｔｅｘａｓ ｒｅｄ、ＦＡＭ、ＴＥＴ、ＨＥＸ、ＪＯＥ、ＴＭＲ、及びＲＯＸが挙げられる。用いられ得る消光剤としては、例えば、ＤＤＱ−Ｉ、ＤＤＱ−ＩＩ（ユーロジェンテック（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ））、Ｅｃｌｉｐｓｅ（エポック・バイオサイエンシズ（Ｅｐｏｃｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ ＦＱ、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ ＲＱ（インテグレ―ティッド・ＤＮＡテクノロジーズ）、ＢＨＱ−１、ＢＨＱ−２、ＢＨＱ−３ （バイオサーチ・テクノロジーズ）、ＱＳＹ−７、ＱＳＹ−２１（モレキュラー・プローブ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、及びＤａｂｃｙｌが挙げられる。

いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、光源及び光学的センサーを含む装置の中で観察され得る。ある場合には、前記反応は、光源からの光の経路の中に位置づけられることができ、及び前記サンプルにより吸収される光（例えば、濁度反応の場合）、前記サンプルにより散乱される光（例えば、濁度反応の場合）、又は前記サンプルより放射される光（例えば、蛍光分子を含む反応の場合）が測定され得る。

実施形態では、前記サンプルは、複数の疾患病原菌の存在の試験に先立って希釈され得る。実施形態では、サンプルのそのような希釈は、疾患病原菌の高いレベルを持つ可能性を示す被験者に対しては、その条件を持たない被験者、又は異なる条件を持つ被験者に比べて、高い希釈率で行われる。
サンプル中の標的の検出のためのシステム及び機器

本明細書で開示される検定及び方法は、サンプルを処理するための機器、又はシステムの上で遂行され得る。実施形態では、出願人は本明細書において、本明細書において開示される方法を遂行するために適切なシステム及び機器を開示する。本明細書で開示される検定及び方法は、直ちに、自動化された検定機器であり得るか、又は自動化された検定システムであり得る、サンプルを処理するための機器、又はサンプルを処理するためのシステムに組み込まれて用いられ得る。そのような機器、及びそのようなシステムは、本明細書で開示される方法の実施に対して有用であり得る。例えば、機器は、サンプルを受け取るために有用であり得る。機器は、サンプルを調製し、又は処理するために有用であり得る。機器は、サンプルに対する検定を遂行するために有用である。機器は、サンプルからのデータを取得するために有用であり得る。機器は、サンプルから得られたデータを送信するために有用であり得る。機器は、サンプルの処理又は検定の後のサンプルの廃棄に対して有用であり得る。

機器は、システムの一部分であることができ、その構成要素が自動化された検定機器であり得る。機器はサンプル自動化された検定機器であり得る。自動化された検定機器は、サンプルの収集、臨床検査のためにサンプルを調製するために、又は本明細書で開示される１つ以上の試薬による化学反応又は他の化学的又は物理的な処理を達成を促進するために構成され得る。自動化された検定機器は、サンプルからデータを取得するために構成され得る。自動化された検定機器は、サンプルから取得されたデータを送信するために構成され得る。自動化された検定機器はサンプルからのデータを分析するために構成され得る。自動化された検定機器は、サンプルから取得されたデータを分析するために、別の機器、臨床検査施設、又は臨床検査施設に関係する個人と通信するために構成され得る。

自動化された検定機器は、被験者の体内又は体表上に配置されるために構成され得る。自動化された検定機器は、サンプルを被験者から、サンプルを直接的には、又は間接的にかのいずれかにより、受け取るために構成され得る。サンプルは、例えば、血液サンプル（例えば、指先穿刺、又は静脈穿刺、又は動脈血液サンプルから得られたサンプル）、尿サンプル、生検サンプル、組織切片、糞便サンプル、又は他の生物学的サンプル；水サンプル、土壌サンプル、食品サンプル、空気サンプル；又は他のサンプルであってよい。血液サンプルは、例えば、全血、血漿、又は血清を含み得る。自動化された検定機器は、前記機器の筐体を通じて、被験者からサンプルを受け取り得る。前記サンプル収集は、サンプル収集サイト、又は他の場所において生じ得る。前記サンプルは、サンプル収集サイトにおいて、前記機器に提供され得る。

いくつかの実施形態では、自動化された検定機器は、カートリッジを受け入れるか、又は保持するために構成され得る。いくつかの実施形態では、自動化された検定機器は、カートリッジを含む。前記カートリッジは、前記サンプル処理機器から取り外すことができる。いくつかの実施形態では、サンプルは、前記自動化された検定機器のカートリッジに提供され得る。代替的に、サンプルは、自動化された検定機器の別の部分に提供され得る。前記カートリッジ及び／又は機器は、サンプルを受け入れるために構成され得るサンプル収集ユニットを含み得る。

カートリッジはサンプルを含むことができ、及びサンプルの処理又は試験において使用するための試薬、サンプルの処理又は試験において使用するための消耗品、又は他の物質を含み得る。カートリッジの自動化された検定機器への配置、又はその中へのカートリッジの挿入に続いて、前記カートリッジの１つ以上の成分が、前記自動化された検定機器の他の成分と流体連通にもたらされ得る。例えば、もしサンプルがカートリッジにおいて収集される場合、前記サンプルは、前記自動化された検定機器の他の部分に輸送され得る。同様に、もし１つ以上の試薬がカートリッジ上に提供されると、前記試薬は、前記自動化された検定機器の他の部分に移動され得るか、又は前記自動化された検定機器の他の成分が、前記試薬にもたらされ得る。いくつかの実施形態では、カートリッジの試薬又は成分は、カートリッジのオンボードに留まることができる。いくつかの実施形態では、チュービング又は保守管理（例えば、手動又は自動化された保守管理）を要する流体工学は含まれない。

サンプル又は試薬は、自動化された検定機器等の機器に輸送され得る。サンプル又は試薬は、機器内で移動され得る。サンプル又は試薬の、そのような移動は、カートリッジから機器までの連続的な流体の経路を提供することなしで達成され得る。サンプル又は試薬の、そのような移動は、機器内で、連続的な流体の経路を提供することなしで達成され得る。実施形態では、サンプル又は試薬の、そのような移動は、サンプル取扱いシステム（例えば、ピペット）により達成されることができ；例えば、サンプル、試薬、又はそれらの等分は、開放先端を持つ、ピペットチップ等の輸送構成要成分に吸引されることができ、このピペットチップ等の輸送構成要成分は、サンプル取扱いシステムに操作可能に接続されており、このサンプル取扱いシステムは、サンプル、試薬、又はそれらの等分をその中に収容するチップを、前記サンプル処理機器上の場所又はその中の場所に移動させる。前記サンプル、試薬、又はそれらの等分は、前記自動化された検定機器上の又は内部の場所に預け入れられることができる。サンプル及び試薬、又は複数の試薬は、サンプル取扱いシステムを用いて、同様の様式で混合され得る。前記カートリッジの１つ以上の成分は、自動化された様式で、前記自動化された検定機器他の部分に移動され得るか、又はその逆も成り立ち得る。

自動化された検定機器等の機器は、流体取扱いシステムを有し得る。流体取扱いシステムは、サンプル等の液体の輸送、希釈、抽出、等分化、混合、及び他の活動を遂行し得るか、又はその遂行を支援し得る。いくつかの実施形態では、流体取扱いシステムは機器の筐体内に収納され得る。流体取扱いシステムは、流体の収集、送達、処理及び／又は輸送、乾燥試薬の溶解、液体の混合及び／又は液体と乾燥試薬の混合と同時に、非流体成分、サンプル、又は物質の収集、送達、処理及び／又は輸送を可能にする。前記流体は、サンプル、試薬、希釈剤、洗浄剤、染料、又は前記機器により用いられ得る任意の他の流体であることができ、及び限定はされないが、均一な流体、異なる液体、エマルション、懸濁液、及び他の流体を含み得る。限定はされないが、ピペットを含む流体取扱いシステムは、前記機器の周囲で、容器を輸送するためにも用いられることができる（その中に流体を含んでも、又は含まなくてもよい）。前記流体取扱いシステムは、液体を分注するか又は吸引し得る。前記サンプルは、流体中を浮遊する１つ以上の微粒子又は固体物体を含み得る。

実施形態では、流体取扱いシステムは、ピペット、ピペットチップ、注射器、毛細管、又は他の構成要素を含み得る。前記流体取扱いシステムは、内部表面、外部表面及び開放末端を持つ部分を有し得る。前記流体取扱いシステムは、ピペットを含むことができ、これはピペット本体、及びピペットノズルを含み、並びにピペットチップを含み得る。ピペットチップは、ピペットノズルから取り外しできても、又はできなくてもよい。実施形態では、流体取扱いシステムは、ピペットチップに嵌合したピペットを用いることができ；ピペットチップは使い捨てであり得る。チップは、ピペットと嵌合した時に、液密の密封を形成し得る。ピペットチップは、１回、２回、又は又はそれ以上の回数用いられ得る。実施形態では、流体取扱いシステムは、ピペット又は同様の機器を、ピペットチップと共に、又はなしで、吸引、分注、混合、輸送、又はさもなければ、流体を取り扱うために用い得る。前記流体は、所望の場合に、流体取扱いシステムから分注され得る。前記流体は、分注される前に、例えば、ピペットチップにおける開口部から、ピペットチップに収納されることができる。実施形態では、又は使用中の例では、前記流体の全てが分注されることができ；他の実施形態では、又は使用中の例では、チップ内の前記流体の一部分が分注され得る。ピペットは選択的に流体を吸入し得る。前記ピペットは、選択された量の流体を吸引し得る。前記ピペットは、前記チップ、又は容器内の前記流体を、撹拌する機構を作動する能力を有し得る。前記ピペットは、非液体形状である物質又は試薬を含む、混合のための継続的な流れのループを生成するチップ又は容器を組み込み得る。ピペットチップは、測定された複数の流体の同時の、又は２部の基質反応等に置けるように順次の送達等により、混合を促進することもできる。

前記流体取扱いシステムは、１つ以上の流体的に単離された、又は水圧駆動的に独立したユニットを含み得る。例えば、前記流体取扱いシステムは１つ、２つ、又はそれを超えるピペットチップを含み得る。前記ピペットチップは、流体を受け入れて拘束するために構成され得る。前記チップは、互いに流体的に分離され得るか、又は互いに水圧駆動的に独立し得る。それぞれのチップ内に含まれる流体は、流体的に分離されているか、又は互いに、他のチップの中の流体及び前記機器内の他の流体と、水圧駆動的に独立している。前記流体的に分離されているか、又は水圧駆動的に独立したユニットは、前記機器他の部分及び／又は互いに対して相対的に移動し得る。前記流体的に分離されているか、又は水圧駆動的に独立したユニットは、個別に移動可能である。流体取扱いシステムは、１つ以上の基部又は支持部を含み得る。基部又は支持部は、１つ以上のピペット又はピペットユニットを支持し得る。基部又は支持部は、前記流体取扱いシステムの１つ以上のピペットを互いに接続させ得る。

自動化された検定機器は、被験者から得られたサンプルに対する処理ステップ又は活動をを遂行するために構成され得る。サンプルの処理は、例えば、サンプル希釈、サンプルの等分への分割、抽出、試薬との接触、ろ過、分離、遠心分離、又は他の予備的な又は処理作業又はステップを含む、サンプル調製を含み得る。自動化された検定機器は、前記サンプルに対する、１つ以上のサンプル調製の活動、又はステップを遂行するために構成され得る。随意的に、サンプルは、化学反応及び／又は物理的処理ステップのために調製され得る。サンプル調製活動又はステップは、以下の１つ以上を含み得る：遠心分離、分離、ろ過、希釈、富化、精製、沈殿、インキュベーション、ピペッティング、輸送、クロマトグラフィー、細胞溶解、血球計算、粉砕、破砕、活性化、超音波処理、マイクロカラム処理、磁気ビーズによる処理、ナノ粒子による処理、又は他のサンプル調製作業又はステップ。例えば、サンプル調製は、血液を血清及び／又は微粒子分画に分離するための、又はその他の任意のサンプルを様々な成分に分離するための、１つ以上のステップを含み得る。例えば、サンプル調製は、血液を血清に分離し、及び／又は微粒子の分画に分離するか、又は任意の他のサンプルを様々な構成要素に分離するために１つ以上のステップを含み得る。サンプル調製は、血液サンプル、又は他の生物学的サンプル等のサンプルを希釈及び／又は濃縮する１つ以上のステップを含み得る。サンプル調製は、抗凝血剤又は他の成分を、サンプルに加えることを含み得る。サンプル調製は、サンプルの精製も含み得る。実施形態では、全てのサンプル処理、調製、又は検定行為又はステップは、単一の機器により遂行され得る。実施形態では、全てのサンプル処理、調製、又は検定行為又はステップは、単一の機器の筐体内で遂行され得る。実施形態では、ほとんどのサンプル処理、調製、又は検定行為又はステップは単一の機器により遂行され、及び単一の機器の筐体内で遂行され得る。実施形態では、多くのサンプル処理、調製、又は検定行為又はステップは、単一の機器により遂行され、及び単一の機器の筐体内で遂行され得る。実施形態では、サンプル処理、調製、又は検定行為又はステップは、２つ以上の機器により遂行され得る。

自動化された検定機器は、サンプルについて１つ以上の検定、及び前記サンプルからのデータを取得するために構成され得る。検定は、１つ以上の物理的な又は化学的な処理を含むことができ、及び１つ以上の化学的又は物理的な反応を実行することを含み得る。自動化された検定機器は、少量の体液サンプルに対して１つ、２つ以上の検定を遂行するために構成され得る。本明細書の他の部分に記載されるように、１つ以上の化学的反応は、容積を有するサンプルに対して生じることができる。例えば、１つ以上の化学的反応は、フェムトリットル未満の容積を有するピルの中で生じ得る。一例では、前記サンプル収集ユニットは、血液又は間質液の単一の１滴以下に相当する体液サンプルを受け取るために構成され得る。実施形態では、サンプルの容積は大変少なく、その容積は、１０００μＬ未満、約５００μＬ未満、約２５０μＬ未満、約１５０μＬ未満、約１００μＬ未満、約７５μＬ未満、約５０μＬ未満、約４０μＬ未満、約２０μＬ未満、約１０μＬ未満であるか、又はその他の小さな容積を下回るものである。実施形態では、全てのサンプル検定行為又はステップは、単一のサンプルについて遂行される。実施形態では、全てのサンプル検定行為又はステップは、単一の機器により遂行される。実施形態では、全てのサンプル検定行為又はステップは、単一の機器の筐体内で遂行される。実施形態では、ほとんどのサンプル検定行為又はステップは、単一の機器により遂行され、及び単一の機器の筐体において遂行され得る。実施形態では、多くのサンプル検定行為又はステップは、単一の機器により遂行されることができ、及び単一の機器の筐体内で遂行され得る。実施形態では、サンプル処理、調製、又は検定行為又はステップは、２つ以上の機器により遂行され得る。

自動化された検定機器は、サンプルに対して複数の検定を遂行するために構成され得る。実施形態では、自動化された検定機器は、単一のサンプルについて複数の検定を遂行するために構成され得る。実施形態では、自動化された検定機器は、単一のサンプルに対して複数の検定を遂行するために構成されることができ、前記サンプルは少量のサンプルである。例えば、少量のサンプルは、約１０００μＬ未満の、約５００μＬ未満の、約２５０μＬ未満の、約１５０μＬ未満の、約１００μＬ未満の、約７５μＬ未満の、約５０μＬ未満の、約４０μＬ未満の、約２０μＬ未満の、約１０μＬ未満の、又は他の少量の容積であるサンプル容積を有し得る。自動化された検定機器は、単一のサンプルについて、多重化された検定を遂行する能力を有し得る。複数ＰＣＴ／ＵＳ１４／５６１５１の検定は、同時に実行されることができ；順次に遂行されることができ；又はいくつかの検定が同時に実行され得る一方で、他の物は順次に遂行され得る。１つ以上の対照検定及び／又は校正器（例えば、検定／試験のための校正器の制御の構成を含む）も前記機器に組み込まれることができ；対照検定及び校正器に対する検定は、サンプルに対して遂行される検定と同時に検定されることができるか、又はサンプルに対する検定の前、若しくは後に、遂行され得るか、又はそれらの任意の組み合わせであってよい。実施形態では、全てのサンプル検定行為又はステップは、単一の機器により遂行される。実施形態では、複数の検定行為又はステップの全ては、単一の機器の筐体内で遂行される。実施形態では、ほとんどのサンプル検定行為又は複数の検定ステップは、単一の機器により遂行され、及び単一の機器の筐体内で遂行され得る。実施形態では、多くのサンプル検定行為又は複数の検定のステップは、単一の機器により遂行され、及び単一の機器の筐体内で遂行され得る。実施形態では、サンプル処理、調製、又は検定行為又はステップは、２つ以上の機器により遂行され得る。

実施形態では、複数の検定の全てが短い時間間隔内で遂行され得る。実施形態では、そのような短い時間間隔は、約３時間未満の、約２時間未満の、約１時間未満の、約４０分未満の、約３０分未満の、約２５分未満の、約２０分未満の、約１５分未満の、約１０分未満の、約５分未満の、約４分未満の、約３分未満の、約２分未満の、約１分未満の、又は他の短い時間間隔を含み得る。

自動化された検定機器は、等温核酸検定を含む核酸検定、（例えば、サンプル中の、ＤＮＡ及びＲＮＡ標的を含む核酸標的の検出及び測定のための検定）を遂行し得る。実施形態では、自動化された検定機器は、２０１４年２月１８日に出願された米国特許出願第１４／１８３，５０３号；２０１４年３月１５日に出願された米国特許出願第１４／２１４，８５０号；２０１４年３月１５日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０３００３４号；及び２０１４年９月１７日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０５６１５１号中に開示される核酸検定を遂行し得る。自動化された検定機器は、酵素免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）、並びにサンプル中のタンパク質（抗体を含む）、ペプチド、及び低分子の量を検出及び測定するための他の検定を含む抗体検定を遂行し得る。自動化された検定機器は、電解質検定（例えば、サンプル中のナトリウム及びカリウム等の検出及び測定するための検定）を含む一般化学検定を遂行し得る。

自動化された検定機器は、前記サンプルに関する１つ以上の信号を検出するために構成され得る。自動化された検定機器は、前記サンプルの性質の１つ以上を特定するために構成され得る。例えば、前記自動化された検定機器は、１つ又は複数の検体の存在又は濃度又は前記サンプル（例えば、体液、分泌物、組織、又は他のサンプル中の又はそれらを介して）の疾患状態を検出するために構成され得る。代替的に、前記自動化された検定機器は、１つ以上の検体存在又は濃度を検出するために分析され得る信号（疾患状態を示し得る）か、又は前記サンプル中の疾患状態を、検出するために構成され得る。この信号は、前記機器のオンボードで分析され得るか、又は別の場所で分析され得る。臨床検査を実行することは、分析又は収集されたデータの比較を含んでも、又は含まなくてもよい。

化学的反応又は他の処理ステップは、前記サンプルと共に、又は前記サンプルなしで遂行され得る。前記機器により調製され得るか、又は実行され得るステップ、検査、又は検定の例としては、限定はされないが免疫検定、核酸検定、受容体に基づく検定、血球計算検定、比色検定、酵素的検定、電気泳動的検定、電気化学的検定、分光的検定、クロマトグラフィー的検定、顕微鏡的検定、局所的検定、熱量測定的検定、比濁的検定、凝集検定、放射性同位体検定、粘度測定検定、凝固検定、凝固時間検定、タンパク合成検定、組織学的検定、培養物検定、浸透圧検定、及び／又は他のタイプの検定、遠心分離、分離、ろ過、希釈、富化、精製、沈殿、粉砕、インキュベーション、ピペッティング、輸送、細胞溶解、又は他のサンプル調製行為又はステップ、又はそれらの組み合わせが挙げられる。前記機器により調製され得るか、又は実行され得るステップ、検査、又は検定は、顕微鏡法、血球計算、及び画像を調製するか、又は利用する他の技法を含む、画像化を含むことができる。前記機器により調製され得るか、又は実行され得るステップ、検査、又は検定の例は、更に組織学、形態学、運動学、力学、及び／又は細胞に対するそのような評価を含むサンプルの状態の評価を更に含み得る。

機器は、全てのオンボードのステップ（例えば、単一の機器により遂行され得るステップ又は行為）を、短い時間の量において遂行する能力を有し得る。機器は単一のサンプルに対する全てのオンボードのステップを、短い時間の量において遂行する能力を有し得る。例えば、被験者からのサンプル収集からデータを送信するまで及び／又は分析までは、約３時間以下、２時間以下、１時間以下、５０分以下、４５分以下、４０分以下、３０分以下、２０分以下、１５分以下、１０分以下、５分以下、４分以下、３分以下、２分以下、又は１分以下を必要とし得る。サンプルを前記機器内に受け入れてから、前記機器からそのようなサンプルに関するデータを送信するまで、及び／又は分析までの時間の量は、タイプ又は前記サンプルに対して遂行されるステップ、検査、又は検定の数に依存し得る。サンプルを前記機器内に受け入れてから、前記機器からそのようなサンプルに関するデータを送信するまで、及び／又は分析までは、約３時間以下、２時間以下、１時間以下、５０分以下、４５分以下、４０分以下、３０分以下、２０分以下、１５分以下、１０分以下、５分以下、４分以下、３分以下、２分以下、又は１分以下を必要とし得る。

機器は、生物学的サンプルなどのサンプルを、処理又は検定した後に、サンプルを廃棄のために準備するか、若しくは廃棄するために構成され得る。

実施形態では、自動化された検定機器は、サンプルから得られたデータを送信するために構成され得る。実施形態では、自動化された検定機器は、ネットワークを通じて通信するために構成され得る。自動化された検定機器は、ネットワークと連結できるための通信モジュールを含み得る。自動化された検定機器は、有線接続又は無線的にネットワークに接続され得る。前記ネットワークは、ローカル・エリア・ネットワーク（ＬＡＮ）又はインターネットなどの広域ネットワーク（ＷＡＮ）などのネットワークであり得る。いくつかの実施形態では、前記ネットワークはパーソナル・エリア・ネットワークであってよい。前記ネットワークはクラウドを含み得る。前記自動化された検定機器 は、前記ネットワークに、仲介機器なしで接続され得るか、又は仲介機器が自動化された検定機器をネットワークに接続するために必要であり得る。自動化された検定機器は、ネットワークを通じて別の機器と通信することができ、この別の機器は、限定はされないが、パーソナルコンピュータ、サーバーコンピュータ、又はラップトップコンピュータ；Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）ＣＥ機器等のパーソナル・デジタル・アシスタンス（ＰＤＡ）、セルフォン等の電話、スマートフォン（例えば、ｉＰｈｏｎｅ（登録商標）、Ａｎｄｒｏｉｄ、Ｂｌａｃｋｂｅｒｒｙ等）、又は位置把握携帯電話（ＧＰＳ等の）；ネットワークに接続されたローミング機器等のローミング機器；無線電子メール機器等の無線機器又はコンピュータ・ネットワークと無線的に通信する能力を有する他の機器；又はネットワークを通じて通信することができ、及び電子的なやり取りを行い得る任意のタイプのネットワーク機器を含む、任意のタイプのネットワーク化された機器であり得る。そのような通信は、クラウドコンピューティングインフラストラクチャー、又は他の機器によりアクセスされ得る、任意の他のタイプのデータ保存インフラストラクチャーにデータを提供することを含み得る。

サンプル処理機器は、サンプルに関するデータを、例えば、ヘルスケア専門家、臨床検査施設等のヘルスケア専門家の場所、又はその関係者に提供し得る。臨床検査施設、ヘルスケア専門家、又は被験者の１つ以上は、又は前記自動化された検定機器から提供されるデータを受信するか、又はアクセスし得るネットワーク機器を有し得る。自動化された検定機器は、サンプルに関するデータをデータベースに提供するために構成され得る。自動化された検定機器は、サンプルに関するデータを、電子医学記録システム、臨床検査施設情報システム、臨床検査施設自動化システム、又は他のシステム又若しくはソフトウエアに提供するために構成され得る。サンプル処理機器は、データを報告書の形態で提供し得る。

臨床検査施設、機器、又は他の実体又はソフトウエアは、サンプルに関するデータの分析をリアルタイムで遂行し得る。ソフトウエアシステムは、化学的分析及び／又は病理学的分析を遂行し得るか、又はこれらは、臨床検査施設、臨床施設、及び専門又はエキスパートの職員の組み合わせの間で分配され得る。分析はサンプルの定性的及び／又は定量的評価を含み得る。データ分析は、後続するサンプルの定性的及び／又は定量的評価を含み得る。随意的に、生データ、前処理されたデータ、又は分析されたデータに基づいて報告書が作成され得る。そのような報告書は、前記サンプルから得られたデータ、そのサンプルが取得された被験者の身元及び他の情報、データの分析、及び他の機密情報の機密性を維持するように作成されることができる。前記報告書及び／又は前記データは、ヘルスケア専門家に送信され得る。サンプル処理機器により得られたデータ、そのようなデータの分析、又は報告書は、データベース、電子的医学記録システム、臨床検査施設情報システム、臨床検査施設自動化システム、又は他のシステム又はソフトウエアに提供されることができる。

本明細書において開示される統合化されたシステムの実施例は、疾患に罹患していることが疑われる被験者の試験及び診断を提供するための統合化されたシステムを含み、前記システムは、サンプルを取得するための機器（例えば、ランセット、シリンジ、針及びチューブ、若しくは他の血液収集機器を含むサンプル収集機器；又は鼻孔の拭い取り、口の拭い取り（例えば、頬の裏の拭い取り）、喉の拭い取り、膣の拭い取り、又は他の拭い取り、及び拭い取りの被験者への接触に続く、拭い取りを浸漬するための流体を含み得る）；疾患の検定のための試薬を含むカートリッジ；複数の疾患を検出するための、複数の検定を実行するための機器；前記疾患の１つ以上の検出を表示／通信するための表示のための機器／手段を含む。そのような統合されたシステムは、前記サンプルは小容積のサンプルである場合に使用するために；検出が短い時間の期間内で遂行される場合に使用されるために；又は前記サンプルが小容積のサンプルであり、及び検出が短い時間の期間内で遂行される両方の場合のために、検出を遂行するか、又は使用されるために、構成され得る。

本明細書において開示される、統合化されたシステムの別の実施例は、呼吸器疾患に罹患していることが疑われる被験者の、検査及び診断を提供するための統合されたシステムを含み、前記システムは、サンプルを取得するための手段（例えば、鼻孔の拭い取り、口拭い取り（例えば、頬の裏の拭い取り）、喉の拭い取り、膣の拭い取り、又は他の拭い取り、及び拭い取りの被験者への接触に続く、拭い取りを浸漬するための流体を含み得る）；呼吸器の疾患の検定のための試薬を含むカートリッジ；複数の呼吸器の疾患を検出するための、複数の検定を実行するための機器；前記呼吸器の疾患の１つ以上の検出を表示／通信するための表示のための機器／手段を含む。そのような統合されたシステムは、前記サンプルは小容積のサンプルである場合に使用するために；検出が短い時間の期間内で遂行される場合に使用されるために；又は前記サンプルが小容積のサンプルであり、及び検出が短い時間の期間内で遂行される両方の場合のために、検出を遂行するか、又は使用されるために、構成され得る。

本明細書において開示される、統合化されたシステムの更なる実施例は、呼吸器疾患に罹患していることが疑われる被験者の、検査及び診断を提供するための統合されたシステムを含み、前記システムは、サンプルを取得するための手段（例えば、鼻孔の拭い取り、口の拭い取り（例えば、頬の裏の拭い取り）、喉の拭い取り、膣の拭い取り、又は他の拭い取り、及び拭い取りの被験者への接触に続く、拭い取りを浸漬するための流体を含み得る）；呼吸器の疾患の検定のための試薬を含むカートリッジ；複数の呼吸器の疾患を検出するための、複数の検定を実行するための機器；前記呼吸器の疾患の１つ以上の検出を表示／通信するための表示のための機器／手段；及び前記サンプル中に検出された呼吸器疾患の治療の処方を提供する手段を含む。そのような統合されたシステムは、前記サンプルは小容積のサンプルである場合に使用するために；検出が短い時間の期間内で遂行される場合に使用されるために；又は前記サンプルが小容積のサンプルであり、及び検出が短い時間の期間内で遂行される両方の場合のために、検出を遂行するか、又は使用されるために、構成され得る。

本明細書において開示される、統合化されたシステムの未だに更なる実施例は、呼吸器疾患に罹患していることが疑われる被験者の、検査及び診断を提供するための統合されたシステムを含み、前記システムは、サンプルを取得するための手段（例えば、鼻孔の拭い取り、口の拭い取り（例えば、頬の裏の拭い取り）、喉の拭い取り、膣の拭い取り、又は他の拭い取り、及び拭い取りの被験者への接触に続く、拭い取りを浸漬するための流体を含み得る）；呼吸器の疾患の検定のための試薬を含むカートリッジ；複数の呼吸器の疾患を検出するための、複数の検定を実行するための機器；前記呼吸器の疾患の１つ以上の検出を表示／通信するための表示のための機器／手段；及び前記サンプル中に検出された呼吸器疾患の治療の処方を提供する手段を含む。そのような統合されたシステムは、前記サンプルは小容積のサンプルである場合に使用するために；検出が短い時間の期間内で遂行される場合に使用されるために；又は前記サンプルが小容積のサンプルであり、及び検出が短い時間の期間内で遂行される両方の場合のために、検出を遂行するか、又は使用されるために、構成され得る。

本明細書において開示される方法、機器、及びシステムで用いることができる試薬、検定、方法、キット、機器、及びシステムの記載及び開示は、例えば、米国特許第８，０８８，５９３号；米国特許第８，３８０，５４１号；米国特許第８，４３５，７３８号；米国特許第８，４７５，７３９号；米国特許第８，８４０，８３８号；２０１４年２月１８日に出願された米国特許出願第１４／１８３，５０３号；２０１３年７月１日に出願された米国特許出願第１３／９３３，０３５号；２０１３年２月１８日に出願された米国特許出願第１３／７６９，８２０号；２０１４年２月１８日に出願された米国特許出願第１４／１８３，５０３号；２０１４年３月１５日に出願された米国特許出願第１４／２１４，８５０号；２０１４年３月１５日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０３００３４号；２０１４年９月１７日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０５６１５１号；２０１３年２月１８日に出願された米国特許出願第１３／７６９，７９８号；２０１３年２月１８日に出願された米国特許出願第１３／７６９，７７９号；２０１１年９月２６日に出願された米国特許出願第１３／２４４，９４７号；２０１２年９月２５日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１２／５７１５５号；２０１１年９月２６日に出願された米国特許出願第１３／２４４，９４６号；米国特許出願第１３／２４４，９４９号；及び２０１３年７月１８日に出願された米国特許出願第１３／９４５，２０２号の中に見出されることができ、上記の全ての特許及び特許出願の開示は、それらの全体が、参照により本明細書に組み込まれる。

以下の実施例は、説明の目的のためだけに提供され、及びいかなる方法によっても本開示を制限することを意図していない。
実施例１

熱サイクリングによる前増殖方法は、ＰＣＲ、逆転写酵素ＰＣＲ（ｒｔＰＣＲ）、及び他のＰＣＲ方法を含む任意の適切な熱サイクリング方法を含む。２ステップＰＣＲ法は、第一の温度（例えば、約３８〜４５°Ｃ、又は約４２°Ｃ）においてインキュベートするステップ；第二の上昇した温度（例えば、約９０〜１０５°Ｃ、又は約９８°Ｃ）においてインキュベートするステップ；ａ）第二の上昇した温度（例えば、約９０〜１０５°Ｃ、又は約９８°Ｃ）、及びｂ）より低いアニーリング温度（Ｔｍ、例えば、約５０°Ｃ〜約８０°Ｃ）の２つの温度の間で熱サイクリングするステップ；及び次いで、より低い温度（例えば、約６５°Ｃ〜約７５°Ｃの温度）でインキュベートするステップによる方法を含む。３ステップＰＣＲ方法は、第一の温度（例えば、約３８〜４５°Ｃ、又は約４２°Ｃ）においてインキュベートするステップ；第二の上昇した温度（例えば、約９０〜１０５°Ｃ、又は約９８°Ｃ）においてインキュベートするステップ；ａ）第二の上昇した温度（例えば、約９０〜１０５°Ｃ、又は約９８°Ｃ）及びｂ）より低いアニーリング温度（Ｔｍ、例えば、約５０°Ｃ〜約８０°Ｃ）、及び次いで、第三のより低い温度（例えば、約６５°Ｃ〜約７５°Ｃの温度）の３つの温度の間での熱サイクリングするステップ；及び次いで、より低い温度（例えば、約６５°Ｃ〜約７５°Ｃの温度）でインキュベートするステップによる方法を含む。最後の、第三のより低い温度でのインキュベーションに続き、増幅されたサンプルは、直ちに用いられるか、又は必要となるまで保存される（例えば、４°Ｃで）ことができる。

本明細書において提供される方法は以下のように遂行された：

ＰＣＲ熱サイクリングがサンプルに行われ、このサンプルは以下のように熱サイクリングに付された：
１）４２°Ｃで３０分インキュベートし、次いで
２）９８°Ｃで２分インキュベートし、続いて
３）以下のように３５回の反復された熱サイクルを行った：
ｉ）９８°Ｃで１０秒間、続いて
ｉｉ）Ｔｍ°Ｃで１５秒間、続いて
ｉｉｉ）７２°Ｃで１５秒間；及び、次いで３５サイクルの後に、
４）７２°Ｃで２分インキュベートした。

代替的な実施形態では、上記のステップ３）での反復サイクルの数は、変更することができ；例えば、反復サイクルの数は、例えば、３０、又は２５、又は２０、又はより少ないサイクルに減らすことができる。他の代替的な実施形態では、上記のステップ３）での反復サイクルの数は、例えば、４０、又は４５、又は５０、又はより多くのサイクルに増大することができる。代替的な実施形態では、上記のステップｉｉｉ）は、１５秒未満に短縮するか、又は完全に除去することができる。ステップｉｉｉ）が除去された場合、前記ＰＣＲ方法は“２ステップ”ＰＣＲ法になる。

上記のステップ１〜４に続いて、前記増幅されたサンプルは、等温増幅（例えば、ＮＡＡ法による）のために直ちに用いられるか、又は必要となるまで４°Ｃで保存されることができる。ステップ１）〜４）は完結するまで約１時間を必要とする。前記“Ｔｍ”は、特定のプライマーセットについてのアニーリング温度を示し；プライマーセットは、他のプライマーセットとは異なるＴｍを有し得るか、又は別のプライマーセットと同じＴｍを有し得る。多くの場合、Ｔｍは典型的には約５０°Ｃ〜約７５°Ｃである。例えば、図面において示される実験において、ＴｍはＲＬＸ３５３９／４０プライマーで６２°Ｃ、及びＲＬＸ３５４７／４８プライマーで７２°Ｃであった。

エボラウイルス内に存在する核酸配列に向かうプライマーが開発され、及び合成された。２つのプライマーセットが、本明細書において開示される実験において用いられた。実験が、標的エボラウイルス核酸標的配列の検出の限界（ＬＯＤ）を決定するために行われた。これらの実験が、前増殖プライマーセットのＲＬＸ３５３９／４０及びＲＬＸ３５４７／４８の両方により遂行された。プライマーセットのＲＬＸ３５３９／４０については、６１°Ｃのアニーリング温度が用いられた。６２°Ｃのアニーリング温度がこのプライマーセットにも用いられ得る。７１°Ｃのアニーリング温度が、プライマーセットＲＬＸ３５４７／４８に対して用いられた。

実施形態では、ＰＣＲ及びＮＡＡ法に使われるプライマーは、ネスティッド（ｎｅｓｔｅｄ）プライマーであってよく、一組のプライマーの核酸標的は前記他のプライマーのセットにより増幅される核酸配列に対して内側になる（内部に取り囲まれる）。例えば、ＮＡＡ増幅に用いられるプライマーは、ＰＣＲ増幅の間に増幅された核酸配列を標的とすることができ、即ち、このＮＡＡ標的核酸は、前記ＰＣＲプライマーがハイブリダイズする標的核酸の内側になる。

プライマーセットＲＬＸ３５３９／４０は以下の核酸配列を有していた：

プライマーセットＲＬＸ３５４７／４８は以下の核酸配列を有していた：

図に示されている“前増幅”実験では、ｒｔＰＣＲが、サンプル中のＲＮＡ標的核酸を増幅するために用いられ；標的核酸が、１０^３、１０^２、１０、５、及び１コピー／マイクロリットル（μＬ）の再終濃度でＰＣＲ試薬に包含され、及びＰＣＲ増幅が遂行され；増幅の後、結果として生じた試薬２．５μＬが、ＮＡＡ試薬と混合され、及び等温ＮＡＡ増幅が遂行された。対照の、前増幅なしの実験では、標的核酸が１０^３、１０^２、１０、５、及び１コピー／マイクロリットル（μＬ）の再終濃度で、ＮＡＡ試薬に包含され、及び等温ＮＡＡ増幅が遂行された。図に示されるように、ＰＣＲ前増殖をＮＡＡ等温増幅と組み合わせるこれらの方法は、１コピー／μＬ（図には“１コピー／ｕＬ”と示される）ＬＯＤを達成することができ；そのようなＬＯＤは、そこに５コピー／ＲＴ−ＰＣＲ反応が存在したことを意味する。両方のプライマーセットについては、以下を参照されたい。

標的の検出は、ＮＡＡ検定において測定される屈曲時間により示される（“ＮＴＣ”（テンプレートなしの対照）は屈曲を示すが、標的配列に対する特有の信号が測定されてから、遥かに遅い時間においてであることに注意されたい）。図１及び２に示される実験では、プライマーセットＲＬＸ３５３９／４０がＲＴ−ＰＣＲによる前増殖に用いられた。図１に示されるように、標的核酸配列は、ＲＴ−ＰＣＲによる前増殖を受けたサンプル中の全てのコピー数に対して２０分以内で検出された（左の５つのコラムであり、１０^３、１０^２、１０、５、及び１コピー／マイクロリットル（μＬ）に対する屈曲時間を示す）。対照的に、対照実験（ＲＴ−ＰＣＲ前増幅なしのＮＡＡ検定、右側に示される）に対する屈曲時間は、約３５分を超えた（１つを除いては６０分を超え；最短の屈曲時間は最大のコピー数（１０^３コピー／μＬ）に対してであった）。従って、サンプル中の標的核酸配列は、本明細書において開示される等温ＮＡＡにより、サンプルが最初にＰＣＲにより“前増幅された”（“前増幅”と書かれた結果）場合に、ＮＡＡ等温方法単独の場合より、より直ちに検出された。

図２は、図１に要約される実験からの、いくつかの生のアウトプットを示す。図２中に示されるトレースは、前増幅に続くＮＡＡ検定の遂行からのものであり、垂直方向には相対蛍光単位が示され、及び時間（“サイクル”として示され、１サイクルは約６０〜９０秒、即ち、大体約１分である）が水平方向に示される。

図３、４、及び５において示される実験においては、プライマーセットＲＴ−ＰＣＲ前増殖にＲＬＸ３５４７／４８が用いられた。図３に示されるように、標的核酸配列は、ＲＴ−ＰＣＲによる前増殖を受けたサンプル中の全てのコピー数に対して３０分以内で検出された（左の５つのコラムであり、１０^３、１０^２、１０、５、及び１コピー／マイクロリットル（μＬ）に対する屈曲時間を示す）。対照的に、対照実験（ＲＴ−ＰＣＲ前増幅なしのＮＡＡ検定、右側に示される）に対する屈曲時間は、約３５分を超え、１０^３コピー／μＬを除いては６０分を超えた。従って、これらの実験でも同様に、サンプル中の標的核酸配列は、本明細書において開示される等温ＮＡＡにより、サンプルが最初にＰＣＲにより“前増幅された”（“前増幅”と書かれた結果）場合に、ＮＡＡ等温方法単独の場合より、より直ちに検出された。

図４は、前増殖を伴ったＮＡＡ検定からの、いくつかの生のアウトプットを示し（図３に要約される実験からの）、垂直方向には相対蛍光単位が示され、及び時間（“サイクル”として示され、１サイクルは約６０〜９０秒、即ち、大体約１分である）が水平方向に示される。対照的に、図５は、前増殖を伴ったＮＡＡ検定からの、いくつかの生のアウトプットを示し（図３に要約される実験からの）、垂直方向には相対蛍光単位が示され、及び時間（“サイクル”として示され、１サイクルは約６０〜９０秒、即ち、大体約１分である）が水平方向に示される。図４及び図５中のトレースの比較は、ＮＡＡ等温方法に先立ちＲＴ−ＰＣＲが行われた場合の検出の時間（屈曲時間）をＮＡＡ等温方法単独（ＲＴ−ＰＣＲ前増幅の欠如）の場合に比較したときの、検出のための短縮された時間（より短い屈曲時間）を説明する。
実施例２

１つの非限定的な実施例では、ＨＩＶ核酸、抗体、及び抗原を検出する能力のある単一の試験を用いる、急性の及び確立されたＨＩＶ感染の迅速な同定は、陽性のＨＩＶ結果を持つ患者が、彼らが必要とするケア及びサービスをより迅速に得ることを支援することにより、公衆衛生に対して劇的な効果を有することができる。一実施形態では、ＨＩＶ核酸、抗体、及び抗原を検出する能力があり、処理されたか又は未処理の標本に対して簡単に用いることができ、定性的及び／又は定量的適用の能力があり、５時間以下、４時間以下、３時間以下、２時間以下、又は６０分以下で遂行されることができ、及び商品流通に適切である、ＨＩＶの単一の試験（診断及び予後の使用の両方のための）が提供される。

一実施形態では、被験者から得たサンプルから、本発明のＨＩＶ試験は、以下のすべてを、単一の機器中で、又は１つの機器の筐体により、試験する：ＨＩＶ−１ＲＮＡ、ＨＩＶ−２ＲＮＡ、ｐ２４抗原、ＨＩＶ−１抗体、及びＨＩＶ−２抗体。従って、本発明のこのＨＩＶ試験は、ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２感染を鑑別する能力も有する。一実施形態では、単純化された第六世代のＨＩＶ試験は、１つの少量のサンプルから以下のすべての試験を遂行することを含む：ＨＩＶ−１ＲＮＡ、ＨＩＶ−２ＲＮＡ、ｐ２４抗原、ＨＩＶ−１ＩｇＧ、ＨＩＶ−２ＩｇＧ、ＨＩＶ−１ＩｇＭ、及びＨＩＶ−２ＩｇＭ。

１つの非限定的な実施例では、前記サンプルは、約１００〜約２００マイクロリットルの血液（静脈又は毛細血管）であり得る。別の非限定的な実施例では、前記少量のサンプルは、約１０〜約１００マイクロリットルの血液（静脈又は毛細血管）であり得る。いくつかの実施形態においては、前記血液は前処理されるので、前記試験されるサンプルは血漿である。いくつかの実施形態においては、前記血液は前処理されるので、前記試験されるサンプルは血清である。いくつかの実施形態においては、前記血液は前処理されるので、前記試験されるサンプルは希釈された血液である。いくつかの実施形態においては、前記試験されるサンプルは希釈されていない血液である。いくつかの実施形態においては、前記前処理は、前記サンプル処理機器からは別個の機器上で生じる。随意的に、前記前処理及びサンプル処理の両方は１つの機器内か、又は１つの機器の筐体内で生じる。一実施形態では、前記ＨＩＶ−１ＲＮＡ、ＨＩＶ−２ＲＮＡ、ｐ２４抗原、ＨＩＶ−１抗体、及びＨＩＶ−２抗体が、被験者から単一のサンプルから試験される。

１つの非限定的な実施例では、核酸検査及び血清学的検査を組み合わせることにより、試験のこの実施形態は、急性感染と同時に確立された感染を検出するための情報を提供する。随意的に、このＨＩＶ試験は、完全に自動化され、及び患者のサンプルと同時に処理される、オンボードの品質管理（ＱＣ）を有する。オンボードのＱＣの一実施形態では、このオンボードの品質管理は、陽性及び陰性対照と同時に、ヒト臨床標本に陽性の対照として作用し、及び臨床標本の抽出からもたらされた核酸の適切な単離を示す、ヒトＲＮａｓｅＰ遺伝子を含む。１つの非限定的な実施例では、前記ＱＣ試薬及び消耗品が、ＨＩＶ試験のための試薬及び消耗品を有する同じカートリッジ中に収容される。

１つの非限定的な実施例では、このＨＩＶ試験は毛細血管の全血サンプルにより試験を行うために設計される。随意的に、更なる実施形態では、この試験は、毛細血管、又は静脈の全血サンプル、血清、又は血漿を試験するために構成され得ることを理解されたい。一実施形態では、この試験は、ユーザーの介入なしに、サンプルから自動的に処理される。一実施形態では、この試験は、前記サンプルを機器内に充填した後は、ユーザーの介入なしに、サンプルから自動的に処理される。サンプル収集の容易さ、サンプル分析実施の容易さ、核酸、抗原、及び血清学的検査の高い感度／高い特異性を考えると、この試験のこの実施形態は、ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２感染の迅速な診断及び鑑別に用い得る。

非限定的な実施例として、サンプル処理のステップは以下を含み得る
a. ビーズに基づく方法による前記サンプルからのＲＮＡ抽出が遂行される；
b. 逆転写（ＲＴ）が遂行される；
c. ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅サイクルを通じて前増殖が遂行される；
d. 等温増幅及び検出が遂行される；
e. ｐ２４、ＨＩＶ−１抗体、及びＨＩＶ−２抗体を検出するための免疫検定が上記の核酸検査と並行して遂行される；
f. オンボードの対照が装置上の前記サンプル処理と並行して処理される。

前記免疫検定は、直接又は間接免疫検定であることができ、及びＥＬＩＳＡ（酵素免疫吸着検定）であってよい。例えば、ｐ２４は、ｐ２４に特異的なモノクローナル抗体を用いる、抗体サンドイッチ免疫検定を用いて検出され得る。本発明のＨＩＶ試験は、ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２のＩｇＧ、ＩｇＭ、又はその両方の抗体を検出する能力も有し得る。特定の実施形態では、本発明の試験は、ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２のＩｇＧ及びＩｇＭ抗体の両方を検出する能力を有し得る。非限定的な実施例では、ＩｇＧ及びＩｇＭ抗体の両方が、ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２に対する抗原サンドイッチ免疫検定を用いて検出される。一実施形態では、前記免疫検定は、例えば、ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２のそれぞれに特異的な抗原を用いることによりＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２抗体を鑑別する能力を有する。別の実施形態では、前記ＨＩＶ試験は、例えば、異なる検出試薬を用い、検定を別々に遂行するか、及び／又は異なる検出方法を遂行することにより抗原反応性及び抗体反応性を鑑別する能力を有する。捕捉試薬（例えば、抗原、抗体等）は、限定はされないが、ビーズ、ウエルの表面、及び検定チップの内側を含む固体の支持体上に固定化され得る。

更に、本明細書における実施形態の多くが等温技法を用いる核酸増幅を記載しているが、ＰＣＲ、ｑＰＣＲ、ネスティッドＰＣＲ、又は他の核酸検出技法等の他の核酸増幅技法が除外されないことを理解されたい。別の実施形態では、前記試験は、ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２のそれぞれに特異的なプライマーを用いることにより、ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２ＲＮＡを鑑別する能力を有する。

１つの非限定的な実施例では、検査からの生データは、解釈のためにデータ分析器に送信される。一実施形態では、このデータ分析器は、上記のステップを用いて前記サンプルを処理する機器とは、同じ場所にはない。随意的に、他の実施形態は、前記データ分析器を、前記サンプル処理器と同じ場所に持つことができる。随意的に、他の実施形態は、前記データ分析器及び前記サンプル処理器を同一の機器内で組み合わせ得る。いくつかの実施形態においては、生データは、電圧、電流、数値的、電子的、光学的、デジタル、又は他の最終的ではない形態であり、それらが、別の当事者又は機器に傍受されたとしても、その別の当事者又は機器が、変換情報か又はそのような生データ若しくは他の読出しを健康測定値に変換するアルゴリズムを持っていない場合には、無意味であることを理解されたい。

一実施形態では、試験カートリッジは、使用前は冷蔵保存される（４〜８°Ｃ）。随意的に、前記試験カートリッジ使用前は冷蔵保存される（２〜１０°Ｃ）。一実施形態では、前記試験は、少なくとも前記核酸検査及び血清学的検査のために用いられる、全ての試薬及び消耗品を提供する単一のカートリッジを用いる。随意的に、前記組み合わされた試験は、前記核酸検査、抗体検査、及び抗原検査のために用いられる全ての試薬及び消耗品を提供する単一のカートリッジを用いる。随意的に、前記組み合わされた試験は、カートリッジ内に含まれる血液及び組織サンプルに対する核酸検査、抗体検査、及び抗原検査のために、用いられる全ての試薬及び消耗品を提供する、単一のカートリッジを用いる。随意的に、前記組み合わされた試験は、カートリッジ内に含まれる鼻の拭い取り上の血液及び組織サンプルに対する核酸検査、抗体検査、及び抗原検査のために、用いられる全ての試薬及び消耗品を提供する、単一のカートリッジを用いる。随意的に、前記組み合わされた試験は、カートリッジ内に含まれる喉の拭い取り上の血液及び組織サンプルに対する核酸検査、抗体検査、及び抗原検査のために、用いられる全ての試薬、及び消耗品を提供する単一のカートリッジを用いる。随意的に、前記組み合わされた試験は、毛細血管血液に対する前記核酸検査、抗体検査、及び抗原検査のために用いられる全ての試薬、及び消耗品を提供する単一のカートリッジを用いる。随意的に、前記組み合わされた試験は、希釈された毛細血管血液に対する核酸検査、抗体検査、及び抗原検査のために用いられる、全ての試薬及び消耗品を提供する、単一のカートリッジを用いる。随意的に、前記組み合わされた試験は、希釈された静脈血液に対する核酸検査、抗体検査、及び抗原検査のために用いられる、全ての試薬及び消耗品を提供する、単一のカートリッジを用いる。随意的に、前記組み合わされた試験は、静脈血液に対する核酸検査、抗体検査、及び抗原検査のために用いられる、全ての試薬及び消耗品を提供する、単一のカートリッジを用いる。

本明細書の一実施形態に記載されるＨＩＶ試験は、応急手当センターにおいて、現場の、訓練を受けた、資格のある医療スタッフにより、指先穿刺試験を行い、及びサンプルを収集するために配備され得る。随意的に、これらの試験を、小売り薬局、小売り店の場所、又は被験者が他の目的（買い物等）のために訪れる場所からアクセスできる他の場所で、通常の診療所が閉まっている間の時間、又は通常の診療所が開いている時ですらも、利用可能にすることができる。

一実施形態では、完全に自動化された生産施設が、極度に大量の試験キットの生産を支援できる（数千万のサンプルを処理するために十分な）。

１つの非限定的な実施例では、前記ＨＩＶ試験の感度は、Ａｂｂｏｔｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＨＩＶ−１試験等の他のＦＤＡに承認された核酸試験よりは感度が高くないとしても、それらに匹敵するであろう。一実施形態では、検出の限界（ＬＯＤ）は、サンプル中に５、８、１０、１５、２０、５０、１００、５００、又は１０００未満のＨＩＶコピーであり得る。

本明細書の一実施形態では、前記核酸試験は、低いコピー数に対する高い感度を有し、急性感染の間の迅速な診断で用いることができる。非限定的な実施例として、この実施形態での前記核酸試験は、ＨＩＶ−１グループＭ（Ａ−Ｈ）及びグループＯ、及びＨＩＶ−２サブタイプＡ及びＢのそれぞれに対して特異的である。

本明細書の前記試験の一実施形態では、ターンアラウンドタイムは、ランタイム、つまり６０分未満である。核酸検査の従来のターンアラウンドタイムは、個別の又はプールされた核酸検査に対して６．５時間（抽出に３．５時間及び増幅及び検出に３時間）である。

ＣＬＩＡステータス、及び試験の複雑性に関しては、サンプル収集の容易さ、オンボードのＱＣ、自動化されたサンプル処理、及び自動化された分析及び結果の解釈を考えると、前記ＨＩＶは、試験の複雑性に関して、ＣＬＩＡ放棄、又は他の規制機関からの同様の放棄のために構成され得るが、場合によってはＣＬＩＡ認証、又は他の規制機関に認証された、臨床検査室を通じて実施することを選択できる。

本明細書の実施形態は、急性の及び確立されたＨＩＶ感染を迅速に特定するための能力を、ＨＩＶを検出し、及び定量するための単純化された核酸試験により、劇的に改善することができ、及び従って患者がケア及びサービスを、より迅速に受けることを可能にする。

いくつかの実施形態においては、前記ＨＩＶ試験は、定量的核酸増幅プロセスを用いる。随意的に、いくつかの実施形態は定性的核酸増幅プロセスを用い得る。

実施例３ ＭＲＳＡ検出

メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）は、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の一種であり、ヒトでの感染を引き起こすことができ、及びβ−ラクタム抗生物質に耐性である。特定の抗生物質に対する耐性の結果として、ＭＲＳＡ感染は治療が困難である。

黄色ブドウ球菌は、典型的には、ｍｅｃＡ遺伝子を獲得することによりメチシリン耐性となる。このｍｅｃＡ遺伝子は、典型的にはブドウ球菌カセット染色体（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃａｌ ｃａｓｓｅｔｔｅ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｍｅｃ：ＳＣＣｍｅｃ）中に位置し、多重遺伝子であり、転移可能なゲノム要素である。異なるタイプのＳＣＣｍｅｃが存在し、周知のＳＣＣｍｅｃのタイプは、長さにおいて約２１，０００〜６７，０００ヌクレオチドの範囲にわたる。一般的に、ＳＣＣｍｅｃのそれぞれのタイプでは、このｍｅｃＡ遺伝子は、ＳＣＣｍｅｃの他の構成要素である他の遺伝子又は要素に取り囲まれている。ＭＲＳＡ菌においては、ｍｅｃＡ遺伝子を含むＳＣＣｍｅｃは、黄色ブドウ球菌染色体に統合化されている。

ＭＲＳＡ菌を同定し及び制御するために、ＭＲＳＡ検出のために効果的な試薬及び方法が必要とされる。

本明細書において提供されるものは、ＭＲＳＡ検出のためのシステム及び方法である。本明細書に記載される様々な特徴が、以下に説明される特定の実施形態のすべて、又はＭＲＳＡ検出のための、若しくはＭＲＳＡ検出を含む他のタイプのシステムのすべてに適用され得る。本明細書に記載されるシステム及び方法は、スタンドアロンのシステム、若しくは方法、又は統合化されたシステム又は方法の一部として適用され得る。開示されたシステム及び方法の異なる態様が、個別に、集合的に、又は互いの組み合わせとして評価され得ることが理解されよう。

ＭＲＳＡ検出のための以前の方法は、典型的にはｍｅｃＡ遺伝子及び黄色ブドウ球菌染色体からの遺伝物質について、サンプルを別々に試験する。ｍｅｃＡ遺伝子、及び黄色ブドウ球菌染色体からの遺伝物質の両方が、前記サンプル中に見出される場合、ＭＲＳＡが存在するという仮定の結論がなされる。しかしながら、ｍｅｃＡ遺伝子はブドウ球菌の外部に存在できる（生物間で移転可能であるＳＣＣｍｅｃの一部として）ために、この結論は正確でない可能性がある。従って、ｍｅｃＡ遺伝子及びブドウ球菌の両方を含むサンプルが、実際にはＭＲＳＡを含まない可能性があり；その代わりに、非ＭＲＳＡである黄色ブドウ球菌、及び異なる菌又はｍｅｃＡ遺伝子を含む遊離の遺伝学的要素を含む可能性がある。この状況は、従って、サンプル中のＭＲＳＡの偽陽性の同定を生み出し得る。

本明細書において提供される方法及び組成物は、上記の問題に取り組み、及び黄色ブドウ球菌染色体（及び従って、真のＭＲＳＡ）中の、ｍｅｃＡ遺伝子を同定するための方法及び組成物を提供する。

黄色ブドウ球菌染色体中の、ｍｅｃＡ遺伝子を同定するための、可能性のある１つのアプローチは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を遂行することであり、前記ＰＣＲ反応は、ＭＲＳＡ菌、又はＭＲＳＡ遺伝物質を含み得るサンプルを含み、及び前記ＰＣＲ反応のためのプライマーの１つは、ｍｅｃＡ遺伝子の一部にアニールし、及び前記ＰＣＲ反応のための他のプライマーは、黄色ブドウ球菌染色体の一部にアニールするものであろう。そのようなＰＣＲ反応が、反応生成物を産生する場合、黄色ブドウ球菌染色体からのｍｅｃＡ遺伝子、及び遺伝物質の両方が、同じ鎖からのものである（及び従って、前記サンプルが真のＭＲＳＡ菌を含む）ことを示すであろう。しかしながら、典型的には、殆どのＭＲＳＡ菌において、ｍｅｃＡ遺伝子は、黄色ブドウ球菌染色体の遺伝物質から数千ヌクレオチド離れているために、このアプローチは効果的ではない。ＭＲＳＡでは、ｍｅｃＡ遺伝子は、ＳＣＣｍｅｃの一部として黄色ブドウ球菌染色体中に統合化され、及びｍｅｃＡ遺伝子は、典型的にはＳＣＣｍｅｃの内部部分であり、その両側がＳＣＣｍｅｃ挿入物の、数千もの追加的核酸により、包囲されているという事実に起因する。従来のＰＣＲ及び多くの他の核酸増幅技法は、比較的長いヌクレオチド配列の増幅においてあまり効果的ではないために、ほとんどのＭＲＳＡ菌株において、ｍｅｃＡ遺伝子及び黄色ブドウ球菌染色体の間の比較的大きなヌクレオチド距離は、一般的に、上述された従来のＰＣＲ反応の不良な成績をもたらす（例えば、１つのプライマーがｍｅｃＡ遺伝子の一部にアニーリングし、及び他のプライマーが黄色ブドウ球菌染色体の一部分にアニーリングすることが生じて）。

複数の異なるタイプのＳＣＣｍｅｃが同定される。例えば、ｍｅｃＡ遺伝子の位置は異なるＳＣＣｍｅｃタイプの間で異なることができ；ＳＣＣｍｅｃ要素の内容物は異なるＳＣＣｍｅｃタイプの間で異なることができ、及びＳＣＣｍｅｃが挿入される黄色ブドウ球菌染色体の場所（例えば、ａｔｔＬ及びａｔｔＲ）は異なるＳＣＣｍｅｃタイプの間で異なることができる。黄色ブドウ球菌染色体中にｍｅｃＡ遺伝子が存在する場合には、典型的には、ブドウ球菌遺伝物質からは数千、又はさらには数万ヌクレオチド離れている。

本明細書において提供されるものは、黄色ブドウ球菌染色体中のｍｅｃＡ遺伝子（従って、真のＭＲＳＡ）を同定するための改善された方法及び組成物である。

実施形態では、本明細書において提供される方法は、少なくとも２つのステップを含む：１）その鎖の中でｍｅｃＡ遺伝子の少なくとも一部分、及び黄色ブドウ球菌染色体が、互いに物理的に近接している、核酸鎖を生成するためのステップ；及び２）少なくとも第一のプライマー、第二のプライマー及び前記ステップ１）の核酸鎖を用いる核酸増幅方法を遂行するステップであって、前記第一のプライマーは、ｍｅｃＡ遺伝子の部分にアニールし、及び前記第二のプライマー黄色ブドウ球菌染色体の一部にアニールし、及びｍｅｃＡ遺伝子及び黄色ブドウ球菌染色体の両方の部分を含む増幅生成物が生成される。

システム及び本明細書において提供される方法の実施形態においては、ｍｅｃＡ遺伝子を含むＳＣＣｍｅｃカセットを含む、黄色ブドウ球菌染色体又はその一部分２００が提供され得る（“ＭＲＳＡ染色体”と称される）。このＭＲＳＡ染色体２００は、第一のプライマー及び第二のプライマーとインキュベートされることができ、前記第一のプライマーは、ｍｅｃＡ遺伝子の一部（又は随意的に、ＳＣＣｍｅｃカセットの他の要素）に相補的であり、及び前記第二のプライマーは、黄色ブドウ球菌染色体の一部に相補的である。加えて、プライマーの１つ又は両方の５’末端がリン酸化される。ＭＲＳＡ染色体は、第一のＤＮＡ増幅反応において、高い処理能力を有するＤＮＡポリメラーゼとインキュベートされる。例示的な高い処理能力を有するＤＮＡポリメラーゼは、ｐｈｉ２９ポリメラーゼである。前記第一のＤＮＡ増幅反応は、例えば、等温方法であり得る。高い処理能力を有するＤＮＡポリメラーゼの使用により、少なくとも少量の増幅生成物２０２が生成されることができる。この反応からの増幅生成物２０２は、黄色ブドウ球菌、及びｍｅｃＡ遺伝物質の両方を含むが、典型的には、少量の増幅された物質２０２だけが生成される。この増幅された物質２０２は、少量しか生成されないために、一般的には検出が困難である。従って、前記増幅された物質２０２は、次いで増幅生成物２０２を、前記増幅反応のために用いられた前記プライマーの５’末端のリン酸基により連結できるＤＮＡリガーゼとインキュベートされる。前記増幅された物質２０２とリガーゼのインキュベーションは、以下の２つの一般的なタイプの連結生成物を生じ得る：ａ）２つ以上の増幅生成物２０２の末端対末端の連結により形成されるコンカテマー２０４；又はｂ）増幅生成物２０２の１つの末端と、同じ増幅生成物２０２の他の末端との連結により形成される、環状化された生成物２０６。両方のタイプの連結生成物（２０４及び２０６）により、ｍｅｃＡ遺伝子は、ブドウ球菌遺伝物質の物理的な近傍にもたらされる（例えば、ａｔｔＲ、ｏｒｆＸ）。従って、連結生成物の両方のタイプは、比較的小さな増幅に対する増幅において、最も効果的な核酸増幅方法に対する、適切なテンプレートである（例えば、２０００ヌクレオチド以下）。従って、本明細書において提供される方法の次のステップは、第二の核酸増幅ステップに対して、前記連結生成物を用いることを含む。この第二の核酸増幅ステップは、少なくとも、ｍｅｃＡ遺伝子の一部分（又は随意的に、ＳＣＣｍｅｃカセットの別の部分）にアニールする第一のプライマー、及びブドウ球菌遺伝物質にアニールする第二のプライマーを用いる。ＰＣＲ、又はその全体が参照により全ての目的で本明細書に組み込まれる、２０１４年９月１７日に出願された、ＰＣＴ／ＵＳ１４／５６１５１に記載される増幅方法等の、様々な核酸増幅方法を、前記第二の核酸増幅ステップに用い得る。実施形態では、前記第二の核酸増幅ステップの第一のプライマー及び第二のプライマーは、前記第一の核酸増幅ステップ（生成物２０２を生成した）の第一のプライマー、及び第二のプライマーとは異なる。実施形態では、前記第二の核酸増幅ステップの第一のプライマー及び第二のプライマーは、前記第一の核酸増幅ステップの第一のプライマー及び第二のプライマーと比較して反対の配向を有する。実施形態では、前記第二の核酸増幅ステップの第一のプライマー及び第二のプライマーは、前記第一の核酸増幅ステップの前記第一のプライマー及び第二のプライマーと同一である。

図６は、本明細書において提供される方法で用い得る、例示的なプライマー配列を提供する。

実施形態では、本明細書において提供される方法のステップのすべてが、同じ容器内で同時に生じることが許容され得る（例えば、本明細書において提供される方法のための試薬のすべてが、同じ容器中に同時に提供され得る）。

真のＭＲＳＡ菌の検出のために用いられることに加えて、本明細書において提供される方法は、例えば、その中に、共通の核酸鎖上又は共通の分子の一部分上に存在し得る、２つ以上の遺伝学的要素があるが、それらの要素が大きなヌクレオチド距離により互いに分離されている、他の種又は分子中の他の遺伝学的要素の検出のためにも用いられ得る。本明細書において提供される一般的なアプローチ（即ち、第一の増幅反応、次いで連結反応、続いて第二の増幅反応を遂行すること）は、同様の構造的問題を示す広範囲の遺伝学的要素に対して用い得る。

加えて、実施形態では、目的の遺伝学的要素を含む分子の複数のコピーがすでに存在し、及びそのような分子が、互いに連結されて、目的の要素が、例えば、ＰＣＲ又はＰＣＴ／ＵＳ１４／５６１５１において記載される増幅方法により、容易に増幅する構造を形成できる場合には、本明細書において提供される、第一の増幅反応は省かれることができる。

実施例４ ＳＮＰ検出

Ｃ型肝炎遺伝子型１ａでは、プロテアーゼ遺伝子ＮＳ３中に、プロテアーゼ阻害剤ボセプレビル（ｂｏｃｅｐｒｅｖｉｒ）による治療の失敗に関係する多型部位Ｑ８０Ｋが存在する。多型部位がない場合には、プロテアーゼ阻害剤ボセプレビルは、このウイルス中でのペプチドの成熟を阻害するために有効であり得る。サブタイプ１ａを有する患者の、ＮＳ３遺伝子中のＱ８０多型を評価することは、治療計画の策定の一部として重要であり得る。

従って、Ｑ８０多型を評価するための、改善された試薬及び方法が必要とされる。加えて、他のＳＮＰを評価するための、改善された試薬及び方法が必要とされる。

本明細書において提供されるものは、ＳＮＰを評価するためのシステム及び方法である。本明細書に記載される様々な特徴が、以下に説明される特定の実施形態のすべて又はＳＮＰ評価のための若しくはＳＮＰ評価を含む他のタイプのシステムのすべてに適用され得る。本明細書に記載されるシステム及び方法は、スタンドアロンのシステム又は方法、又は統合化されたシステム又は方法の一部として適用され得る。開示されたシステム及び方法の異なる態様が、個別に、集合的に、又は互いの組み合わせとして評価され得ることが理解されよう。

実施形態では、本明細書において提供されるものは、標的配列中のＳＮＰ、変異、又は他の目的のヌクレオチドを評価するための組成物及び方法である。ある場合には、標的配列は、目的のヌクレオチドの位置を取り囲む複数の異なる多型を有し得る。例えば、この目的のヌクレオチドは、１５０ヌクレオチドの標的配列の第６０番目の位置のヌクレオチドに位置することができる（最も５’側のヌクレオチドが第１番目の位置で、最も５’側のヌクレオチドの隣のヌクレオチドが第２番目の位置である等）。

実施形態では、目的のヌクレオチドは、参照により、その全体が全ての目的で本出願に組み込まれる、２０１４年９月１７日に出願された、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１４／５６１５１号中に提供される、ＳＮＰ検出のための方法の使用により評価され得る。そのような方法では、プライマーのペアーが、目的のヌクレオチドを含む標的核酸を増幅するために用いられ、それぞれのプライマーが、テール／第一の領域、及びテンプレート結合／第二の領域を含む。実施形態では、前記プライマーのペアーの、第二のプライマーの第一の領域／テールは、目的のヌクレオチドを含む標的核酸の一部に対して相補的である。ＰＣＴ／ＵＳ１４／５６１５１において開示される方法では、例えば、前記第一プライマーのテール領域においてわずかに異なるヌクレオチド配列（典型的にはプライマーペアーの間で、ただ１つのヌクレオチド分の違い）を有する、１つ以上のプライマーペアーによる、目的のヌクレオチドを含む標的核酸の増幅の速度、又は量の比較により、目的のヌクレオチドの同定が決定されることができる。

しかしながら、ある状況では、標的核酸の中で目的のヌクレオチドの近くの１つ以上の位置に、多くの配列バリアンスがある場合には、ＰＣＴ／ＵＳ１４／５６１５１において提供される、ＳＮＰ検出法を遂行することは困難であり得る。そのような位置は、例えば、前記第一の及び／又は第二のプライマーのテンプレート結合領域に対応する領域中にあり得る。ＰＣＴ／ＵＳ１４／５６１５１に記載されるＳＮＰ検出のためのプライマーが、容易に標的核酸配列に結合できない場合には、その中に開示されている方法はＳＮＰ検出のためには効果的ではない。

従って、本明細書において提供されるものは、ＳＮＰの同定を促進する組成物及び方法である。第一のステップでは、第一の増幅生成物を生成するために目的のヌクレオチドを含む標的核酸の領域が、第一の増幅反応（ＰＣＲ等）により増幅される。この第一の増幅反応では、比較的長いプライマーペアー（例えば、それぞれのプライマーが、少なくとも１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、８０、９０、又は１００ヌクレオチドを含む）が標的核酸を増幅するために用いられる。この長いプライマーは、前記テンプレート結合領域中の、比較的大量の配列多様性に耐えることができる（即ち、プライマーが長いために、複数のヌクレオチドが不一致であっても、それらは、標的配列にアニールできる）。重要なことには、前記第一の増幅反応では、どちらのプライマーも、ヌクレオチド／目的のＳＮＰの厳密な位置にはアニールしないものであることである（即ち、これらのプライマーは、目的のＳＮＰの近くの領域にだけアニールしなければならない）。このことは、本明細書において提供される方法によって、ヌクレオチド／目的のＳＮＰの身元を変更することは望ましくないためである（ヌクレオチド／目的のＳＮＰを同定することが望ましいため）。前記第一の増幅反応において、第一の増幅生成物が生成されると、前記第一の増幅生成物は、一般的に既知のヌクレオチド配列を有する（前記第一の増幅生成物を生成するために、前記第一の増幅反応で用いられたプライマーのヌクレオチド配列が、既知である結果）。しかしながら、前記第一の増幅反応で使われたプライマーのどちらも、ヌクレオチド／目的のＳＮＰの位置にはアニールしていないため、前記第一の増幅生成物中では、ヌクレオチド／目的のＳＮＰの身元は依然未知である。前記第一の増幅生成物は、次いでＰＣＴ／ＵＳ１４／５６１５１において提供される、ＳＮＰ検出のためのプライマーとインキュベートされ得る。これらのプライマーは、前記第一の増幅生成物が、既知の配列のプライマーの使用により生成されたという事実に基づいて、前記第一の増幅生成物中に存在することが知られる配列に、相補的な領域を持つように設計され得る。ＳＮＰ／目的のヌクレオチドの身元が、次いでＰＣＴ／ＵＳ１４／５６１５１に記載されるように決定され得る。

図７は、本明細書において提供される方法の一般的な概略図を提供する。標的核酸１０２を含む核酸鎖１００が提供されることができる。この標的核酸１０２は、複数の多型／バリアントヌクレオチド１０４を含み得る。この標的核酸１０２はヌクレオチド／目的のＳＮＰ１０６も含む。第一の増幅生成物１２０を生成するために、この標的核酸が、第一のプライマー１１２、及び第二のプライマー１１４とインキュベートされる。前記第一の増幅生成物１２０は、前記第一のプライマー１１２及び第二のプライマー１１４（既知のヌクレオチド配列を有する）により増幅されたために、一般的に既知のヌクレオチド配列を有する。前記第一の増幅生成物１２０を生成する過程の間に、前記複数の多型／バリアントヌクレオチド１０４は、前記第一のプライマー１１２、及び第二のプライマー１１４のヌクレオチドにより置換される。しかしながら、前記第一の増幅生成物１２０は、それでも未知のヌクレオチド／目的のＳＮＰ１０６を有している。前記第一の増幅生成物１２０は、次いでＳＮＰ検出のためのＰＣＴ／ＵＳ１４／５６１５１において記載される方法において用いられ得る。

実施形態では、本明細書において提供される方法は、Ｃ型肝炎プロテアーゼ遺伝子、ＮＳ３中の多型部位Ｑ８０ＫにおけるＳＮＰを評価するために用い得る。図８は、Ｑ８０Ｋ部位を評価するための方法の一部として用い得る例示的なプライマー配列を提供する。本明細書において提供される方法は、多くの異なる標的核酸でのＳＮＰの評価に用いることができ、その標的核酸は高度の配列可変性を有する。

図９は、本明細書に記載されるように方法のステップを遂行した結果を提供する。図１０は、図９の実験のために用いられたプライマー配列を提供する。加えて、図９の結果のためにも用いられたヌクレオチド配列は以下のとおりである：

実施形態では、本明細書において提供される方法のステップのすべてが、同じ容器内で同時に生じることが許容され得る（例えば、本明細書において提供される方法のための試薬のすべてが同じ容器中に同時に提供され得る）。

本明細書において、本発明の好適な実施形態が示され、及び記載されるが、当業者にとってはそのような実施形態は、例としてのみ提供されていることが明白であろう。本発明を逸脱することなく、当業者は膨大な変形、変更、及び置換を思いつくであろう。本明細書に記載される本発明の実施形態に対するさまざまな代替物が、本発明の実施に使用できることを理解されたい。例えば、そのような組み合わせが、本明細書に記載されるか否かには関わらず、１つの実施形態の特徴は、別の実施形態の特徴と組み合わされることができる。本明細書において提供される発明が、本明細書において、便宜性の目的のために、限定された数の用語及び語句で記載されるが、本明細書において提供されていないが、本発明を正確に記載する用語、又は語句を用いても、記載され得るであろうことも理解されたい。

加えて、本明細書におけるいくつかの実施形態は、最初の熱サイクリングを“ＰＣＲ”プロセスと記載できるが、本明細書における多くの実施形態は、熱サイクリングのスタイルの処理のみを行うことができ、及び“ＰＣＲ”プロセスの間には、いかなるタイプの検出も行えない。実施形態では、増大した数のコピー数を提供する他のプロセスが、最初のサンプル富化のために用いられ得ることを理解されたい。本明細書の実施例において用いられる用語“最初の”は、それが第一のステップであることを、必ずしも示唆せず、それが単に、１つ以上の後に続く検出ステップの前に生じることを意味する。いくつかの実施形態は、これを前増殖ステップとしてみなし得る。いくつかの実施形態は、これをサンプル富化のステップとみなし得る。

実施形態では、最初の熱サイクリングのプロセスが、その中に複数の異なる位置（ｌｏｃｉ）に対して、複数の異なるバインダーのタイプ（エボラ、マラリア等）を持つ、サンプルのバルク部分、及び／又は共通の部分に対して行われることができ、ポスト熱サイクリングでは、そのプロセスは、限定されないが、ＤＮＡ増幅か、又は現在知られているか、若しくは将来開発され得る他の検出処理等の、より特異的な検出のために処理され得ることを理解されたい。サンプルを、複数の異なるバインダーによりバルク処理する、そのような実施形態では、最初のステージでの検出においては、特異的には除外されないが、そのような検出は、すぐに使用可能なデータを産生できるか又はできない、前記サンプル中の異なるバインダーの多様性ために、一般的には行われないことを理解されたい。実施形態では、ハイブリッドプロセスは、単一の共通の富化されたサンプルから、多くの標的を検出するために構成されることができ、これらの標的は少なくとも５個以上であり得る。実施形態では、前記プロセスは、単一のサンプルからの多くの標的を検出でき、これらの標的は少なくとも７個以上であり得る。実施形態では、前記プロセスは、単一のサンプルからの多くの標的を検出でき、これらの標的は少なくとも１０個以上であり得る。実施形態では、前記プロセスは、単一のサンプルからの多くの標的を検出でき、これらの標的は少なくとも２０個以上であり得る。

実施形態では、本明細書におけるハイブリッドプロセスは、最初の熱サイクリングからのコピー数における、増加に少なくとも部分的に起因して、等温プロセスの感度を改善することができるが、少なくとも部分的には２つの異なるプライマー（例えば、等温プロセスにおけるプライマー、及び熱サイクリングプロセスにおけるプライマー）の使用により、ＰＣＲ特異性よりも、より良い特異性も提供できる。実施形態では、最初のプロセスは、標的の富化のための熱サイクリングステップについては、より粗いくてよく、及び最初の処理の間の検出については、必ずしもそうではない。実施形態では、前記最初の処理は、非特異的生成物（標的物質の、より多くのコピーを生成することと共に）を生成することができ、及び後続するステップでの前記サンプルの処理は、望まれる標的であるが、最初のステップからの富化により、検出するためのより多くのコピーの利点を有する標的に対して、より特異的な検出の少なくとも第二の層を提供する（そのプロセスでいくらかの非特異的な生成物を生成したとしても）。実施形態では、ハイブリッドプロセスの第二次の、又は他のより後の検出プロセスは、配列特異的である終点の検出と見なされ得る。実施形態では、前記ハイブリッドプロセスは、ＰＣＲプロセス又は等温プロセスのいずれか単独よりも、感度及び特異性の点で、より優れ得る。

実施形態では、ある場合には並行トラック処理を用いることができ、その場合には、最初のサンプルの少なくとも一部分が、ハイブリッドプロセスを用いる１つのトラックに沿って処理され、及び少なくとも別の一部分は、限定はされないが、別のＰＣＲプロセス又は等温検出プロセス等の、少なくとも１つの他のトラック上で処理される。なぜならば、この場合には、前記サンプルが、前記サンプル中に標的の十分なコピー数を有するかどうかが不明であり、非ハイブリッド処理トラックの１つにおいて、検出が生じるために前増殖が必要ない状況、とりわけコピー数がサンプルの富化なしでも十分な状況が生じ得るためである。もし１つのトラックが、より早く信号を返したら、他の並行したトラックの１つに沿った検出を、継続する必要性を減少させるのに、十分な反応が、１つのトラックでより早く受け取られる場合には、そのプロセスはより早期に停止されることができる。実施形態では、サンプル処理機器は、少なくとも１つのサーマルサイクラー及び少なくとも１つの非サイクリングヒーターを含み得る。随意的に、いくつかの実施形態は複数のサーマルサイクラーを有することができ、その中の１つはサイクルしないように制御され得る。実施形態では、いくつかの実施形態は、後続する検出プロセスよりも、より少ない数の熱サイクリングのためのウエル、チェンバー、又は容器を持つサーマルサイクラーを有することができるが、しかし随意的には、それぞれが後続の検出方法のウエルよりも、大きな容積を保持するために構成され得る。従って、１つの実施形態は、熱サイクリングのために、１つ又は２つのウエル、チェンバー、又は容器、及び後続する検出のために、少なくとも１０以上のウエル、チェンバー、又は容器を有することができ、それぞれのウエル、チェンバー、又は容器は、特定の場所（ｌｏｃｉ）に対して、より特異的であることができる。そのような実施形態では、前記サンプルの、より小さな等分への分割が、サンプルを富化させる最初の熱サイクリングステップの後に生じ得る。一実施形態では、対照サンプルも、対照の意味で、熱サイクルされることができる。

本明細書の記載、以下の特許請求範囲の全体を通して用いられるように、「ａ（１つ）」「ａｎ（１つ）」「ｔｈｅ（前記の）」は、文脈において明白に示さない限り、複数の意味を含むことを理解されたい。例えば、“ａｎ ａｓｓａｙ”は単一の検定又は複数の検定を指し得る。更に、本明細書の記載、以下の特許請求範囲の全体を通して用いられるように、「ｉｎ（〜の中に）」の意味は、文脈で明白に示されない限り、「ｉｎ（〜の中に）」、及び「ｏｎ（〜の上に）」を含む。添付された所定の請求項に、「〜のための手段（ｍｅａｎｓ ｆｏｒ）」の語句を用いる制限が明確に言明されていない限り、添付された請求項は、手段プラス機能の限定を含むものとは解釈されない。本明細書の記載、以下の特許請求範囲の全体を通して用いられるように、第二の対象の“少なくとも一部分”を含むとして記載された、第一の対象は、第二の対象の全量／完全な第二の対象を含み得る。

本明細書の記載、以下の特許請求範囲の全体を通して用いられるように、用語“ｃｏｍｐｒｉｓｅ”、“ｉｎｃｌｕｄｅ”、及び“ｃｏｎｔａｉｎ”、並びに関係する時制は、包括的であり、及び制約が無く、及び追加的な、列挙されていない要素又は方法のステップを排除しない。更に、広げる言葉（ｂｒｏａｄｅｎｉｎｇ ｗｏｒｄ）及び“１つ以上の”、“少なくとも”、“限定はされないが”等の語句は、ある場合には、より狭いケースが意図されていると読まれるべきではなく、又はそのような広げる言葉がない例の中で、意図されるか若しくは要求されると読まれるべきではない。最後に、更に、本明細書の記載、及び以下の特許請求の範囲の全体を通して用いられる、「ｏｒ（又は）」の意味は、文脈で明白に示されない限り、接続詞及び離接的接続詞の両方を含む。従って、用語“ｏｒ（又は）”は文脈で明白に指示しない限り、“及び／又は”を含む。

この文書は著作権保護の対象になる資料を含む。それらが米国特許商標局の特許ファイル又は記録に現われるので、版権所有者（本明細書における特許申請人）は、特許文献及び開示の複製に反対しないが、そうでなければ、何であるかに関わらず、全て著作権を保有する。以下の注意が適用される：著作権２０１３〜１５年テラノス社

Claims (1)

1. 本明細書に記載に発明。