JP2007259867A - 静電搬送活用のハイブリダイゼーション方法及びその装置 - Google Patents

Abstract

【課題】 迅速、かつ容易に判別を行うことができる静電搬送活用のハイブリダイゼーション方法及びその装置を提供する。
【解決手段】 静電搬送活用のハイブリダイゼーション方法において、静電搬送電極基板１０２を化学的に不活性な液体で覆い、そこに既知の一本鎖ＤＮＡと蛍光試薬を含む液滴１０６をアレイ状に配置しておき、続いて未知の一本鎖ＤＮＡサンプルを含む液滴１０５を静電気により移動させ、前記既知の一本鎖ＤＮＡと蛍光試薬を含む液滴１０６と結合させハイブリダイゼーションを行い、両者が一致したときには前記蛍光試薬がインターカレートされ、しかも合致の状況に応じて蛍光強度変化が現れることを利用して、ハイブリダイゼーション状況を判別する。
【選択図】 図２

Description

本発明は、静電搬送活用のハイブリダイゼーション方法及びその装置に関するものである。

従来、このような技術分野の文献として、例えば、以下のようなものがある。
なし 「分子生物学イラストレイテッド」 編集 田村隆明 山本雅 羊土社発行 ｐｐ．１６８−１８０ 「バイオ実験イラストレイテッド」 著者 中山広樹 秀潤社発行 ｐｐ．１４−４６ 「分子生物学プロトコール」 編集 小池克郎 関谷剛男 近藤寿人 南江堂発行 ｐｐ．２１７−２２４ 昨今、バイオの技術分野において、簡便で、的確に操作を行うことができるポスト・ゲノム・アプリケーション（Ｐｏｓｔ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）に用いる試験用のデバイスが要請されている。

図１に示すように、二重螺旋ＤＮＡを形成する水素結合は、高温やアルカリ条件下で壊れ、ＤＮＡは変性して一本鎖となる。相補的な塩基配列をもつ一本鎖ＤＮＡやＲＮＡは、適当な条件下でアニールして二重鎖となる。これをハイブリダイゼーションと呼ぶ。

従来のハイブリダイゼーション方法では、主に、ＤＮＡチップ中で、既知の一本鎖ＤＮＡと未知の一本鎖ＤＮＡサンプルを混合させて、その反応を見ることにより、ハイブリダイゼーション状況を判別するようにしている。

従来のＤＮＡチップでは、サンプルとの接触面積が小さいため検出感度が低いという問題があり、接触面積を増やすために、微小なビーズ表面にｃＤＮＡ（相補的デオキシリボ核酸）等を修飾するなどの方法も考えられている。また、ハイブリダイゼーション方法は手作業が主であり、煩雑であるとともに、的確でなく、時間を要するものであった。

本発明は、上記状況に鑑みて、迅速、かつ容易に判別を行うことができる静電搬送活用のハイブリダイゼーション方法及びその装置を提供することを目的とする。

本発明は、上記目的を達成するために、
〔１〕静電搬送活用のハイブリダイゼーション方法において、静電搬送電極基板を化学的に不活性な液体で覆い、そこに既知の一本鎖ＤＮＡと蛍光試薬を含む液滴をアレイ状に配置しておき、続いて未知の一本鎖ＤＮＡサンプルを含む液滴を静電気により移動させ、前記既知の一本鎖ＤＮＡと蛍光試薬を含む液滴と結合させハイブリダイゼーションを行い、両者が一致したときには前記蛍光試薬がインターカレートされ、しかも合致の状況に応じて蛍光強度変化が現れることを利用して、ハイブリダイゼーション状況を判別することを特徴とする。

〔２〕静電搬送活用のハイブリダイゼーション装置において、化学的に不活性な液層を満たした静電搬送電極基板と、この静電搬送電極基板上にアレイ状に配置される、既知の一本鎖ＤＮＡと蛍光試薬を含む液滴と、前記静電搬送電極基板の電極の駆動により移動される未知の一本鎖ＤＮＡサンプルを含む液滴と、前記既知の一本鎖ＤＮＡと蛍光試薬を含む液滴に前記未知の一本鎖ＤＮＡサンプルを含む液滴とを作用させて、そのハイブリダイゼーション状況を判別する手段とを具備することを特徴とする。

なお、本発明においては、既知の一本鎖ＤＮＡにはｃＤＮＡを含むものと定義する。

本発明によれば、以下のような効果を奏することができる。

（Ａ）ハイブリダイゼーションの判別を迅速、かつ容易に行うことができる。

（Ｂ）実験に用いるサンプルを液滴化して用いるため、サンプル量は極微量で済む。また、ハイブリダイゼーションに要する時間も極僅かであるため、現行のＤＮＡチップによる判別法に比べて優れた特徴がある。

本発明の静電搬送活用のハイブリダイゼーション方法は、静電搬送電極基板を化学的に不活性な液体で覆い、そこに既知の一本鎖ＤＮＡと蛍光試薬を含む液滴をアレイ状に配置しておき、続いて未知の一本鎖ＤＮＡサンプルを含む液滴を静電気により移動させ、前記既知の一本鎖ＤＮＡと蛍光試薬を含む液滴と結合させハイブリダイゼーションを行い、両者が一致したときには前記蛍光試薬がインターカレートされ、しかも合致の状況に応じて蛍光強度変化が現れることを利用して、ハイブリダイゼーション状況を判別する。

以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。

本発明では、液体を満たした静電搬送基板上に、既知の一本鎖ＤＮＡを保持し、未知の一本鎖ＤＮＡサンプルを静電気により移動・反応させ、発光状況からハイブリダイゼーション状況を判別する静電搬送活用のハイブリダイゼーション方法およびその装置を提供する。

図２は本発明の実施例を示す静電搬送活用のハイブリダイゼーション装置の模式図である。

この図において、１０１は静電搬送活用のハイブリダイゼーション装置、１０２は静電搬送用電極基板、１０３は静電搬送用電極、１０４は液層、１０５は未知の一本鎖ＤＮＡサンプルを含む液滴、１０６は塩基配列が分かっている一本鎖ＤＮＡと蛍光試薬を含む液滴（ＤＮＡ１１，ＤＮＡ１２，…，ＤＮＡ４１，ＤＮＡ４２，…）、１０７は電圧制御機器であり、この電圧制御機器１０７は静電搬送用電極基板１０２の全般にわたる静電搬送用電極１０３に接続されている。

そこで、塩基配列が分かっている一本鎖ＤＮＡと蛍光試薬を含む液滴１０６を静電搬送用電極基板１０２上にアレイ状に配置する。そして、未知の一本鎖ＤＮＡを含む液滴１０５を静電搬送により移動させて、塩基配列が分かっている一本鎖ＤＮＡと蛍光試薬を含む液滴１０６と合体させる。

合体により、蛍光が発生するメカニズムを図３に示す。図３（ａ）は塩基配列が分かっている一本鎖ＤＮＡの一本鎖を示し、図３（ｂ）は未知の一本鎖ＤＮＡと塩基配列が分かっている一本鎖ＤＮＡが完全に一致した場合、図３（ｃ）は一部のみ合致した場合、図３（ｄ）は全く合致しなかった場合を示している。

図３に示すように、未知の一本鎖ＤＮＡと塩基配列が分かっている一本鎖ＤＮＡとの塩基配列が完全に合致した場合〔図３（ｂ）〕だけ、蛍光が強く発せられる。

本発明は、液体中にある一本鎖ＤＮＡを含む液滴を静電気により移動・反応させて、遺伝子の存在を判別するＤＮＡチップの機能を有する。

ＤＮＡとは反応しない液体中に既知の各種一本鎖ＤＮＡおよび蛍光試薬が入った液滴をアレイ状に配置する。続いて、液体中に配置された未知の一本鎖ＤＮＡの液滴を静電気により移動させて、既知の一本鎖ＤＮＡを含む液滴と結合させて、ハイブリダイゼーションを行う。既知の一本鎖ＤＮＡとサンプルが一致すれば、すべてハイブリダイゼーションするため、蛍光試薬がインターカレートされて蛍光を発する。もし、一致しない場合は、図３（ｄ）に示すように、蛍光試薬がインターカレートされないため蛍光を発しない。

一般に遺伝子の塩基配列はプライマ（塩基対２０ｂａｓｅ前後）で決定されるため、一本鎖ＤＮＡとして塩基対２０ｂａｓｅを用いることにより、サンプル中に一本鎖ＤＮＡによって決定される塩基配列を持つ遺伝子が含まれるかどうかの判別が出来る（一般のＤＮＡチップも同じ）。

本発明によれば、実験に用いるサンプルを液滴化して用いるため、サンプル量は極微量で済む。また、ハイブリダイゼーションに要する時間も極僅かであるため、現行のＤＮＡチップによる判別法に比べて優れた特徴がある。

図４は左より蛍光試薬のみ、蛍光試薬と合致しない一本鎖ＤＮＡ、蛍光試薬と一部のみ合致するＤＮＡ、蛍光試薬と完全に合致するＤＮＡとの結合状態における蛍光強度を示す。

この図に示すように、完全に配列が一致した場合のみ強い蛍光が生じることが分かる。また、一部のみ合致した場合には僅かな蛍光が生じる。ここで、基本となるＤＮＡ配列は、２０ｂａｓｅで、配列はＡＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＧＴである。一部のみ合致とは１０ｂａｓｅだけ合致していることを示す。

図５は図４におけるハイブリダイゼーションの蛍光強度の撮影装置の模式図である。

この図において、１１０は基台、１１１は静電搬送用電極基板、１１２は液層、１１３はＤＮＡを含む液滴、１１５は下部より紫外線を照射する紫外線光源、１１６はカメラ（撮像装置）である。

図６は本発明の他の実施例を示すハイブリダイゼーションの蛍光強度の撮影装置を示す図である。

この図において、１２０は基台、１２１は静電搬送用電極基板、１２２は液層、１２３はＤＮＡを含む液滴、１２４はガラスカバー、１２５は斜め上方より紫外線を照射する紫外線光源、１２６はカメラ（撮像装置）である。なお、ガラスカバー１２４は不用の場合もある。

このようにして、液層中のＤＮＡを含む液滴のハイブリダイゼーション状況をカメラ（撮像装置）によって撮像することができる。

なお、本発明に関する基礎技術として、本発明者らは不活性な液体中にある液体微小粒子のハンドリングに関する特許を出願している（特許願２００１−４８０９６および特許願２００１−２３８６２４、「液体微粒子のハンドリング方法およびその装置」）。

なお、本発明は上記実施例に限定されるものではなく、本発明の趣旨に基づいて種々の変形が可能であり、これらを本発明の範囲から排除するものではない。

本発明は、静電搬送活用のハイブリダイゼーション装置として好適であり、簡便なチップを用いたバイオ試料の試験装置などに広範に利用可能である。

二重螺旋ＤＮＡの変性と再生の模式図である。 本発明の実施例を示す静電搬送活用のハイブリダイゼーション装置の模式図である。 蛍光が発生するメカニズムを示す模式図である。 本発明の実施例を示す静電搬送活用のハイブリダイゼーション装置による蛍光強度を示す図である。 図４におけるハイブリダイゼーションの蛍光強度の撮影装置の模式図である。 本発明の他の実施例を示すハイブリダイゼーションの蛍光強度の撮影装置を示す図である。

Claims (2)

1. 静電搬送電極基板を化学的に不活性な液体で覆い、そこに既知の一本鎖ＤＮＡと蛍光試薬を含む液滴をアレイ状に配置しておき、続いて未知の一本鎖ＤＮＡサンプルを含む液滴を静電気により移動させ、前記既知の一本鎖ＤＮＡと蛍光試薬を含む液滴と結合させハイブリダイゼーションを行い、両者が一致したときには前記蛍光試薬がインターカレートされ、しかも合致の状況に応じて蛍光強度変化が現れることを利用して、ハイブリダイゼーション状況を判別することを特徴とする静電搬送活用のハイブリダイゼーション方法。
2. （ａ）化学的に不活性な液層を満たした静電搬送電極基板と、
   （ｂ）該静電搬送電極基板上にアレイ状に配置される、既知の一本鎖ＤＮＡと蛍光試薬を含む液滴と、
   （ｃ）前記静電搬送電極基板の電極の駆動により移動される未知の一本鎖ＤＮＡサンプルを含む液滴と、
   （ｄ）前記既知の一本鎖ＤＮＡと蛍光試薬を含む液滴に前記未知の一本鎖ＤＮＡサンプルを含む液滴とを作用させて、そのハイブリダイゼーション状況を判別する手段とを具備することを特徴とする静電搬送活用のハイブリダイゼーション装置。