JP2003334082A - 波形生成プライマー、該プライマーを使用した核酸増幅方法及び核酸同定方法 - Google Patents
波形生成プライマー、該プライマーを使用した核酸増幅方法及び核酸同定方法Info
- Publication number
- JP2003334082A JP2003334082A JP2002143709A JP2002143709A JP2003334082A JP 2003334082 A JP2003334082 A JP 2003334082A JP 2002143709 A JP2002143709 A JP 2002143709A JP 2002143709 A JP2002143709 A JP 2002143709A JP 2003334082 A JP2003334082 A JP 2003334082A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nucleic acid
- primer
- region
- waveform
- nucleotide chain
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Abstract
(57)【要約】
【課題】 容易且つ効果的に核酸を増幅し、増幅された
核酸を同定する。 【解決手段】 核酸増幅方法に用いられる一方向性波形
生成プライマーは、核酸上の任意の特定あるいは不特定
領域に相補的なヌクレオチド鎖に、該領域に相補性を有
す可能性のあるヌクレオチド鎖が結合されることにより
該領域に対する特異性が低められており、該領域と相似
性のある複数の領域に同時にアニールすることができ
る。これにより、複数の領域を鋳型として１本鎖核酸が
増幅される。得られた増幅産物は、インターカレーター
の存在下で高次構造形成及び夾雑物形成など種々の相互
干渉を形成し、該核酸増幅産物の加熱による解離、変性
に際して得られる解離曲線の波形パターンが観察され
る。鋳型となる核酸の種類によって種々の波形パターン
が得られるため、波形パターンを解析することで核酸の
同定が可能となる。
核酸を同定する。 【解決手段】 核酸増幅方法に用いられる一方向性波形
生成プライマーは、核酸上の任意の特定あるいは不特定
領域に相補的なヌクレオチド鎖に、該領域に相補性を有
す可能性のあるヌクレオチド鎖が結合されることにより
該領域に対する特異性が低められており、該領域と相似
性のある複数の領域に同時にアニールすることができ
る。これにより、複数の領域を鋳型として１本鎖核酸が
増幅される。得られた増幅産物は、インターカレーター
の存在下で高次構造形成及び夾雑物形成など種々の相互
干渉を形成し、該核酸増幅産物の加熱による解離、変性
に際して得られる解離曲線の波形パターンが観察され
る。鋳型となる核酸の種類によって種々の波形パターン
が得られるため、波形パターンを解析することで核酸の
同定が可能となる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、核酸を増幅させる
ための任意の特定あるいは不特定領域に相補性を有する
ヌクレオチド鎖及び相補可能性を有するヌクレオチド鎖
を有するプライマー、該プライマーを使用して核酸を増
幅する方法及び増幅された核酸を同定する核酸同定方法
に関する。
ための任意の特定あるいは不特定領域に相補性を有する
ヌクレオチド鎖及び相補可能性を有するヌクレオチド鎖
を有するプライマー、該プライマーを使用して核酸を増
幅する方法及び増幅された核酸を同定する核酸同定方法
に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来、核酸を増幅する方法としては、酵
素ＤＮＡポリメラーゼを触媒として２本鎖ＤＮＡの特定
の部位の一方の鎖の一端と他方の鎖の他端とを結合する
相補的な特異プライマーを使用して目的核酸を増幅させ
るポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ法）が広く用いられ
ている。このＰＣＲ法では、プライマーの鋳型ＤＮＡに
対する特異性を高め、全ＤＮＡ中の特定の部位のみを認
識するために、１つのＰＣＲ産物のみが増幅される。な
お、このＰＣＲ法については、特公平４−６７９５７号
公報等に詳細に記載されている。
素ＤＮＡポリメラーゼを触媒として２本鎖ＤＮＡの特定
の部位の一方の鎖の一端と他方の鎖の他端とを結合する
相補的な特異プライマーを使用して目的核酸を増幅させ
るポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ法）が広く用いられ
ている。このＰＣＲ法では、プライマーの鋳型ＤＮＡに
対する特異性を高め、全ＤＮＡ中の特定の部位のみを認
識するために、１つのＰＣＲ産物のみが増幅される。な
お、このＰＣＲ法については、特公平４−６７９５７号
公報等に詳細に記載されている。
【０００３】また、特公平４−６７９６０号公報には、
遺伝性疾患、癌性疾患或いは伝染性疾患等の遺伝子診断
の用途で核酸中の特定配列の存在を検出するために、標
的核酸の塩基配列に相補的プライマーを用いて、僅かし
か含まれていない核酸配列を増幅して検出する技術が記
載されている。
遺伝性疾患、癌性疾患或いは伝染性疾患等の遺伝子診断
の用途で核酸中の特定配列の存在を検出するために、標
的核酸の塩基配列に相補的プライマーを用いて、僅かし
か含まれていない核酸配列を増幅して検出する技術が記
載されている。
【０００４】また、２本鎖核酸又はＰＣＲ法で増幅され
た２本鎖の増幅産物に温度をかけていくと各々１本鎖に
解離するが、この急激に解離する温度点をＴｍ（Meltin
g Temperature）という。本件発明者は、先に提案した
特願２００１−３４９４５７の明細書及び図面におい
て、核酸にサイバーグリーン等のインターカレーター色
素を添加して核酸増幅を行い、このＴｍ値と該Ｔｍ値を
観察した溶解曲線（Melt Curve）、或いは該溶解曲線を
微分して得られた解離曲線（Dissociation Curve）等の
解離パターンとから核酸を同定する技術を提案してい
る。
た２本鎖の増幅産物に温度をかけていくと各々１本鎖に
解離するが、この急激に解離する温度点をＴｍ（Meltin
g Temperature）という。本件発明者は、先に提案した
特願２００１−３４９４５７の明細書及び図面におい
て、核酸にサイバーグリーン等のインターカレーター色
素を添加して核酸増幅を行い、このＴｍ値と該Ｔｍ値を
観察した溶解曲線（Melt Curve）、或いは該溶解曲線を
微分して得られた解離曲線（Dissociation Curve）等の
解離パターンとから核酸を同定する技術を提案してい
る。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】ところで、上述したＰ
ＣＲ法は、複数の相補的なプライマーを用いて増幅部分
の両端を規定して増幅反応を行うため、得られた増幅産
物の鎖長は設計したプライマーに依存する。増幅産物の
鎖長が長くなると、目的核酸の塩基配列を同定する場合
に、制限部位に相補的な制限酵素を用いて生成物を開裂
させ、開裂した生成物を開裂していない生成物から分離
することが必要であった。
ＣＲ法は、複数の相補的なプライマーを用いて増幅部分
の両端を規定して増幅反応を行うため、得られた増幅産
物の鎖長は設計したプライマーに依存する。増幅産物の
鎖長が長くなると、目的核酸の塩基配列を同定する場合
に、制限部位に相補的な制限酵素を用いて生成物を開裂
させ、開裂した生成物を開裂していない生成物から分離
することが必要であった。
【０００６】また、上述した特願２００１−３４９４５
７の明細書及び図面に記載された技術では、１対のプラ
イマーに対して１種類のＴｍ値或いは解離曲線が得られ
るのみであるため、相同性の高い核酸を同定するために
は、数種類のプライマー対を使用してＴｍ値或いは解離
曲線を求める必要があった。
７の明細書及び図面に記載された技術では、１対のプラ
イマーに対して１種類のＴｍ値或いは解離曲線が得られ
るのみであるため、相同性の高い核酸を同定するために
は、数種類のプライマー対を使用してＴｍ値或いは解離
曲線を求める必要があった。
【０００７】本発明は、このような従来の実情に鑑みて
提案されたものであり、容易且つ効果的に核酸を増幅す
る請求項１に記載の波形生成用プライマーと、該プライ
マーを使用して核酸を増幅させる増幅方法及び増幅され
た核酸を同定する核酸同定方法を提供することを目的と
する。
提案されたものであり、容易且つ効果的に核酸を増幅す
る請求項１に記載の波形生成用プライマーと、該プライ
マーを使用して核酸を増幅させる増幅方法及び増幅され
た核酸を同定する核酸同定方法を提供することを目的と
する。
【０００８】
【課題を解決するための手段】上述した目的を達成する
ために、本発明に係る請求項１に記載の波形生成用プラ
イマーと、該プライマーを使用した核酸増幅方法及び核
酸同定方法は、核酸の一部塩基配列を増幅する方法であ
って、上記核酸上の任意の特定あるいは不特定領域を選
択する工程と、上記任意の特定あるいは不特定領域に相
補性を有するヌクレオチド鎖及び相補可能性を有するヌ
クレオチド鎖とからなる上述の波形生成用プライマーを
と、上記核酸上の少なくとも上記該領域を含む複数の領
域に上記プライマーをアニールさせる工程と、上記プラ
イマー及びポリメラーゼの存在下、上記複数の領域を鋳
型としてヌクレオチド鎖合成反応を行う工程とを有す
る。
ために、本発明に係る請求項１に記載の波形生成用プラ
イマーと、該プライマーを使用した核酸増幅方法及び核
酸同定方法は、核酸の一部塩基配列を増幅する方法であ
って、上記核酸上の任意の特定あるいは不特定領域を選
択する工程と、上記任意の特定あるいは不特定領域に相
補性を有するヌクレオチド鎖及び相補可能性を有するヌ
クレオチド鎖とからなる上述の波形生成用プライマーを
と、上記核酸上の少なくとも上記該領域を含む複数の領
域に上記プライマーをアニールさせる工程と、上記プラ
イマー及びポリメラーゼの存在下、上記複数の領域を鋳
型としてヌクレオチド鎖合成反応を行う工程とを有す
る。
【０００９】また、上述した目的を達成するために、本
発明に係る核酸同定方法は、核酸の一部塩基配列を増幅
して核酸を同定する核酸同定方法であって、上記核酸上
の任意の特定あるいは不特定領域を選択する工程と、上
記任意の特定あるいは不特定領域に相補的なヌクレオチ
ド鎖と相補可能性を有するヌクレオチド鎖とからなる上
述の波形生成用プライマーと、上記核酸上の少なくとも
上記該領域を含む複数の領域に上記プライマーをアニー
ルさせる工程と、上記プライマー及びポリメラーゼの存
在下、上記複数の領域を鋳型としてヌクレオチド鎖合成
反応を行う工程と、得られる複数の増幅産物に種々の相
互干渉を形成させる工程と、上記相互干渉の解離、変性
に由来する解離曲線の波形パターンに基づいて核酸を同
定する工程とを有する。
発明に係る核酸同定方法は、核酸の一部塩基配列を増幅
して核酸を同定する核酸同定方法であって、上記核酸上
の任意の特定あるいは不特定領域を選択する工程と、上
記任意の特定あるいは不特定領域に相補的なヌクレオチ
ド鎖と相補可能性を有するヌクレオチド鎖とからなる上
述の波形生成用プライマーと、上記核酸上の少なくとも
上記該領域を含む複数の領域に上記プライマーをアニー
ルさせる工程と、上記プライマー及びポリメラーゼの存
在下、上記複数の領域を鋳型としてヌクレオチド鎖合成
反応を行う工程と、得られる複数の増幅産物に種々の相
互干渉を形成させる工程と、上記相互干渉の解離、変性
に由来する解離曲線の波形パターンに基づいて核酸を同
定する工程とを有する。
【００１０】
【発明の実施の形態】以下、本発明を適用した具体的な
実施の形態について、図面を参照しながら詳細に説明す
る。この実施の形態は、対象２本鎖核酸と一方向に反応
して１本鎖のみを増幅する一方向性のプライマーについ
て、特定塩基配列に対する特異性を低めることにより、
このプライマーを該特定塩基配列と相似性のある複数箇
所に同時にアニールさせて増幅させることが可能な波形
生成用プライマーとし、該プライマーを利用して塩基配
列の異なる複数の核酸を増幅させ、各核酸における増幅
産物の解離曲線を比較することにより、核酸を同定する
核酸同定方法とについて説明するものである。ここで
「アニール」とは、ヌクレオチド鎖が、ワトソン−クリ
ックの法則に基づく塩基対結合によって２本鎖構造を形
成することをいう。
実施の形態について、図面を参照しながら詳細に説明す
る。この実施の形態は、対象２本鎖核酸と一方向に反応
して１本鎖のみを増幅する一方向性のプライマーについ
て、特定塩基配列に対する特異性を低めることにより、
このプライマーを該特定塩基配列と相似性のある複数箇
所に同時にアニールさせて増幅させることが可能な波形
生成用プライマーとし、該プライマーを利用して塩基配
列の異なる複数の核酸を増幅させ、各核酸における増幅
産物の解離曲線を比較することにより、核酸を同定する
核酸同定方法とについて説明するものである。ここで
「アニール」とは、ヌクレオチド鎖が、ワトソン−クリ
ックの法則に基づく塩基対結合によって２本鎖構造を形
成することをいう。
【００１１】（１）本発明の原理
先ず本発明の実施形態の原理について説明する。本発明
では、通常のＰＣＲプライマーのうち、センスプライマ
ー又はアンチセンスプライマーの一方のみを用いて増幅
反応が行われる。該増幅反応では、請求項６に記載の様
に核酸のセンス鎖あるいはアンチセンス鎖のどちらか１
本鎖のみを増幅し、同時に増幅した核酸を以後の増幅工
程で鋳型として再利用しない。このように、本発明で
は、センスプライマー、アンチセンスプライマーのうち
一方のみを用いるために増幅末端が規定されないが、増
幅産物の鎖長は、酵素ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反
応時間で決定することができる。すなわち、伸長反応時
間を長くすれば増幅産物の鎖長を長くすることができ
る。
では、通常のＰＣＲプライマーのうち、センスプライマ
ー又はアンチセンスプライマーの一方のみを用いて増幅
反応が行われる。該増幅反応では、請求項６に記載の様
に核酸のセンス鎖あるいはアンチセンス鎖のどちらか１
本鎖のみを増幅し、同時に増幅した核酸を以後の増幅工
程で鋳型として再利用しない。このように、本発明で
は、センスプライマー、アンチセンスプライマーのうち
一方のみを用いるために増幅末端が規定されないが、増
幅産物の鎖長は、酵素ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反
応時間で決定することができる。すなわち、伸長反応時
間を長くすれば増幅産物の鎖長を長くすることができ
る。
【００１２】また、このプライマーは、特定塩基配列に
対する特異性を低めており、該特定塩基配列と相似性の
ある複数箇所に同時にアニールし、増幅することができ
る。すなわち、図１（Ａ）に模式的に示すように、特定
塩基配列であるターゲットＡに対する特異性を低めるこ
とにより、ターゲットＡの他にも、ターゲットＡ'、タ
ーゲットＡ''、ターゲットＡ'''など、ターゲットＡと
相似性のある複数箇所に同時にアニールさせ、１本鎖核
酸を増幅することができる。
対する特異性を低めており、該特定塩基配列と相似性の
ある複数箇所に同時にアニールし、増幅することができ
る。すなわち、図１（Ａ）に模式的に示すように、特定
塩基配列であるターゲットＡに対する特異性を低めるこ
とにより、ターゲットＡの他にも、ターゲットＡ'、タ
ーゲットＡ''、ターゲットＡ'''など、ターゲットＡと
相似性のある複数箇所に同時にアニールさせ、１本鎖核
酸を増幅することができる。
【００１３】以下の表１を用いて、本発明の実施の形態
と従来のＰＣＲ法とを比較する。
と従来のＰＣＲ法とを比較する。
【００１４】
【表１】
【００１５】ここで、本発明で増幅された増幅産物は、
複数種類の１本鎖核酸からなり、この増幅産物が互いに
干渉して図１（Ｂ）に模式的に示すような高次構造や夾
雑物を形成する。この際に例えばサイバーグリーン等の
２本鎖特異インターカレーターを共存させておくと、１
本鎖核酸の各塩基が水素結合により引き合って２本鎖構
造を形成する部分にインターカレーターが挿入され、励
起光に応じて蛍光を発する。この相互干渉構造は、加熱
により解離、変性し、再度１本鎖核酸に戻るが、この際
にインターカレーターが放出され、蛍光を発しなくな
る。なお、この解離状況は、鋳型核酸の種類によって多
様な変化を示すものである。
複数種類の１本鎖核酸からなり、この増幅産物が互いに
干渉して図１（Ｂ）に模式的に示すような高次構造や夾
雑物を形成する。この際に例えばサイバーグリーン等の
２本鎖特異インターカレーターを共存させておくと、１
本鎖核酸の各塩基が水素結合により引き合って２本鎖構
造を形成する部分にインターカレーターが挿入され、励
起光に応じて蛍光を発する。この相互干渉構造は、加熱
により解離、変性し、再度１本鎖核酸に戻るが、この際
にインターカレーターが放出され、蛍光を発しなくな
る。なお、この解離状況は、鋳型核酸の種類によって多
様な変化を示すものである。
【００１６】そこで、この解離状況を加熱に対する蛍光
強度の減弱をプロットした解離曲線のパターンとして観
察することにより、核酸の同定が可能となる。特に本発
明では、複数箇所で増幅した複数種類の１本鎖核酸が相
互干渉構造を形成するため、ＰＣＲ法と比較して多彩な
解離曲線が観察され、より確実に核酸を同定することが
できる。
強度の減弱をプロットした解離曲線のパターンとして観
察することにより、核酸の同定が可能となる。特に本発
明では、複数箇所で増幅した複数種類の１本鎖核酸が相
互干渉構造を形成するため、ＰＣＲ法と比較して多彩な
解離曲線が観察され、より確実に核酸を同定することが
できる。
【００１７】（２）プライマーの構造及び反応条件
上述したように、本発明における波形生成用の一方向性
プライマーは、特定塩基配列に対する特異性を低めた構
造とされている。具体的には、図２にその概念図を示す
ように、骨格として３'末端側に１塩基配置塩基配列を
有し、５'末端側に複数塩基配置塩基配列を有してい
る。このように５'末端側に非特異的塩基配列を有する
ことにより、特定塩基配列のみならず、これに類似する
ような相似性のある配列にもアニールすることができ
る。なお、実際にこの一方向性波形生成プライマーを用
いる際には、目的に応じて、以下の（ａ）〜（ｅ）に示
す内容を調整する必要がある。
プライマーは、特定塩基配列に対する特異性を低めた構
造とされている。具体的には、図２にその概念図を示す
ように、骨格として３'末端側に１塩基配置塩基配列を
有し、５'末端側に複数塩基配置塩基配列を有してい
る。このように５'末端側に非特異的塩基配列を有する
ことにより、特定塩基配列のみならず、これに類似する
ような相似性のある配列にもアニールすることができ
る。なお、実際にこの一方向性波形生成プライマーを用
いる際には、目的に応じて、以下の（ａ）〜（ｅ）に示
す内容を調整する必要がある。
【００１８】（ａ）プライマー長
（ｂ）１塩基配置（特異）部分の配列
（ｃ）複数塩基配置（非特異）部分の配列
（ｄ）プライマー量
（ｅ）アニーリング温度
そこで、以下では、この波形解析用の一方向性波形生成
プライマーの構造及び反応条件について、上述した
（ａ）〜（ｅ）の項目を順に説明する。
プライマーの構造及び反応条件について、上述した
（ａ）〜（ｅ）の項目を順に説明する。
【００１９】（ａ）プライマー長の調整
先ず、プライマー全長が増幅効率に与える影響を検討す
るため、特異部分と非特異部分とが１：１であるプライ
マーについて、９８℃／２秒、４０℃／２０秒、７２℃
／２０秒のプロトコルを５０サイクル実施して増幅反応
を行った。この結果、プライマー全長が２４〜３０ｍｅ
ｒでは、プライマーの特異性或いは安定性が高くなる反
面、得られる解離曲線の波形の多様性が低下した。ま
た、特異性が高まることにより、特定塩基配列と相似性
のある未知配列を検出する作用が低下した。また、プラ
イマー全長が１６〜２４ｍｅｒでは、プライマーの特異
性或いは安定性と、波形多様性或いは未知配列検出性が
同程度となり、プライマー全長が１０〜１６ｍｅｒで
は、波形多様性或いは未知配列検出性が高くなる反面、
プライマーの特異性或いは安定性が低下した。プライマ
ー全長が９ｍｅｒ以下では、増幅反応が起こらなかっ
た。本発明ではプライマー長としては、１０〜３０ｍｅ
ｒの範囲で使用できるが、好ましくは１６〜２４ｍｅｒ
である。
るため、特異部分と非特異部分とが１：１であるプライ
マーについて、９８℃／２秒、４０℃／２０秒、７２℃
／２０秒のプロトコルを５０サイクル実施して増幅反応
を行った。この結果、プライマー全長が２４〜３０ｍｅ
ｒでは、プライマーの特異性或いは安定性が高くなる反
面、得られる解離曲線の波形の多様性が低下した。ま
た、特異性が高まることにより、特定塩基配列と相似性
のある未知配列を検出する作用が低下した。また、プラ
イマー全長が１６〜２４ｍｅｒでは、プライマーの特異
性或いは安定性と、波形多様性或いは未知配列検出性が
同程度となり、プライマー全長が１０〜１６ｍｅｒで
は、波形多様性或いは未知配列検出性が高くなる反面、
プライマーの特異性或いは安定性が低下した。プライマ
ー全長が９ｍｅｒ以下では、増幅反応が起こらなかっ
た。本発明ではプライマー長としては、１０〜３０ｍｅ
ｒの範囲で使用できるが、好ましくは１６〜２４ｍｅｒ
である。
【００２０】次に、プライマー全長に占める特異部分／
非特異部分の割合を検討した。この結果、プライマー全
長に占める非特異部分の割合が０．５５〜０．８８、例
えば非特異部分が１４〜２５ｍｅｒ、且つ特異部分が４
〜７ｍｅｒでは、波形多様性或いは未知配列検出性が高
くなる反面、プライマーの特異性或いは安定性が低下し
た。また、プライマー全長に占める非特異部分の割合が
０．３３〜０．５５、例えば非特異部分及び特異部分が
共に８〜１３ｍｅｒでは、プライマーの特異性或いは安
定性と、波形多様性或いは未知配列検出性が同程度であ
った。また、プライマー全長に占める非特異部分の割合
が０．１２〜０．３３、例えば非特異部分が４〜７ｍｅ
ｒ、且つ特異部分が１４〜２５ｍｅｒでは、プライマー
の特異性或いは安定性が高くなる反面、得られる解離曲
線の波形の多様性が低下した。
非特異部分の割合を検討した。この結果、プライマー全
長に占める非特異部分の割合が０．５５〜０．８８、例
えば非特異部分が１４〜２５ｍｅｒ、且つ特異部分が４
〜７ｍｅｒでは、波形多様性或いは未知配列検出性が高
くなる反面、プライマーの特異性或いは安定性が低下し
た。また、プライマー全長に占める非特異部分の割合が
０．３３〜０．５５、例えば非特異部分及び特異部分が
共に８〜１３ｍｅｒでは、プライマーの特異性或いは安
定性と、波形多様性或いは未知配列検出性が同程度であ
った。また、プライマー全長に占める非特異部分の割合
が０．１２〜０．３３、例えば非特異部分が４〜７ｍｅ
ｒ、且つ特異部分が１４〜２５ｍｅｒでは、プライマー
の特異性或いは安定性が高くなる反面、得られる解離曲
線の波形の多様性が低下した。
【００２１】ここで、プライマー全長に占める非特異部
分の割合が０．８９以上、例えば非特異部分が２５ｍｅ
ｒ以上、且つ特異部分が３ｍｅｒ以下では、いわゆるラ
ンダムプライマーとなり、正常な増幅反応が起こらなか
った。また、プライマー全長に占める非特異部分の割合
が０．１１以下、例えば非特異部分が３ｍｅｒ以下、且
つ特異部分が２５ｍｅｒ以上では、通常のＰＣＲプライ
マーと同じような増幅反応を示した。
分の割合が０．８９以上、例えば非特異部分が２５ｍｅ
ｒ以上、且つ特異部分が３ｍｅｒ以下では、いわゆるラ
ンダムプライマーとなり、正常な増幅反応が起こらなか
った。また、プライマー全長に占める非特異部分の割合
が０．１１以下、例えば非特異部分が３ｍｅｒ以下、且
つ特異部分が２５ｍｅｒ以上では、通常のＰＣＲプライ
マーと同じような増幅反応を示した。
【００２２】なお、以下ではプライマー全長に占める非
特異部分の割合を０．３３〜０．５５とするものとして
説明するが、これに限定されるものではなく、例えば特
定塩基配列と相同性のある未知配列を検出する目的のた
めには、非特異部分の割合をこれよりも高くすることが
好ましい。
特異部分の割合を０．３３〜０．５５とするものとして
説明するが、これに限定されるものではなく、例えば特
定塩基配列と相同性のある未知配列を検出する目的のた
めには、非特異部分の割合をこれよりも高くすることが
好ましい。
【００２３】（ｂ）特異部分の配列
特異部分は、標的となる塩基配列に相補的であり、例え
ば図３に示すような配列を有する。この特異部分は、
３'末端側から５'側にかけて同程度の特異性或いは安定
性を有する。特異部分の長さは、プライマー全長が１６
〜２４ｍｅｒであるときに８〜１３ｍｅｒであることが
好ましい。また、３'末端の５塩基中におけるＧ（グア
ニン）又はＣ（シトシン）が占める割合であるＧＣ％
は、５０％以上が必要である。さらに、３'末端の安定
性は、−５．５〜−９．５Ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上が必要
である。
ば図３に示すような配列を有する。この特異部分は、
３'末端側から５'側にかけて同程度の特異性或いは安定
性を有する。特異部分の長さは、プライマー全長が１６
〜２４ｍｅｒであるときに８〜１３ｍｅｒであることが
好ましい。また、３'末端の５塩基中におけるＧ（グア
ニン）又はＣ（シトシン）が占める割合であるＧＣ％
は、５０％以上が必要である。さらに、３'末端の安定
性は、−５．５〜−９．５Ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上が必要
である。
【００２４】なお、３'末端側の３塩基以外において５
０％以内のミスマッチがある場合にもアニール可能であ
る。この際、ミスマッチ部分の安定性が−１２．０Ｋｃ
ａｌ／ｍｏｌ以下であれば、増幅効率の低下は無視し得
る。
０％以内のミスマッチがある場合にもアニール可能であ
る。この際、ミスマッチ部分の安定性が−１２．０Ｋｃ
ａｌ／ｍｏｌ以下であれば、増幅効率の低下は無視し得
る。
【００２５】（ｃ）非特異部分の配列
非特異部分は、標的となる塩基配列に対する特異性を低
める共にプライマーの安定性を高めるためのものであ
り、以下の表２に示すAmbiguity Codeで表記される複数
の核酸で構成される、例えば図４に示すような配列を有
する。非特異部分の長さは、プライマー全長が１６〜２
４ｍｅｒであるときに８〜１３ｍｅｒであることが好ま
しい。
める共にプライマーの安定性を高めるためのものであ
り、以下の表２に示すAmbiguity Codeで表記される複数
の核酸で構成される、例えば図４に示すような配列を有
する。非特異部分の長さは、プライマー全長が１６〜２
４ｍｅｒであるときに８〜１３ｍｅｒであることが好ま
しい。
【００２６】
【表２】
【００２７】図４に示すように、この非特異部分は、
５'末端側から３'側にかけて段階的に特異性が高まると
共に、段階的に安定性が低くなるような配列とされる。
すなわち、５'末端側には、Ａ（アデニン），Ｃ（シト
シン），Ｇ（グアニン），Ｔ（チミン）の何れかを示す
Ambiguity CodeであるＮで構成されるＮ領域が存在す
る。そのＮ領域に続いて、Ａ，Ｃ，Ｇ，Ｔの何れか３つ
を示すAmbiguity Codeで構成される３Ambiguity Region
（３ＡＲ）が存在し、３'側には、Ａ，Ｃ，Ｇ，Ｔの何
れか２つを示すAmbiguity Codeで構成される２Ambiguit
y Region（２ＡＲ）が存在する。図４の例では、５'末
端側の２つのＮがＮ領域を構成し、続くＶ，Ｈ，Ｄ，Ｂ
の４塩基が３ＡＲを構成する。そして、３'側の２つの
Ｓが２ＡＲを構成する。
５'末端側から３'側にかけて段階的に特異性が高まると
共に、段階的に安定性が低くなるような配列とされる。
すなわち、５'末端側には、Ａ（アデニン），Ｃ（シト
シン），Ｇ（グアニン），Ｔ（チミン）の何れかを示す
Ambiguity CodeであるＮで構成されるＮ領域が存在す
る。そのＮ領域に続いて、Ａ，Ｃ，Ｇ，Ｔの何れか３つ
を示すAmbiguity Codeで構成される３Ambiguity Region
（３ＡＲ）が存在し、３'側には、Ａ，Ｃ，Ｇ，Ｔの何
れか２つを示すAmbiguity Codeで構成される２Ambiguit
y Region（２ＡＲ）が存在する。図４の例では、５'末
端側の２つのＮがＮ領域を構成し、続くＶ，Ｈ，Ｄ，Ｂ
の４塩基が３ＡＲを構成する。そして、３'側の２つの
Ｓが２ＡＲを構成する。
【００２８】ここで、Ｎ領域の塩基数が５塩基以上にな
ると、ダイマー、ループ等のプライマー相互干渉が出現
しやすくなるため、Ｎ領域は、２〜４塩基が好ましい。
また、３ＡＲの配列は、ＤＨＶＢ、ＨＤＶＢ、ＶＨＤ
Ｂ、ＨＶＤＢの順に安定性が高い。このように、３'側
におけるＧ又はＣの割合を高めた方が安定性が高くなる
のは、特異部分の配列によるものである。また、２ＡＲ
の配列は、特異部分の配列を考慮して設計する必要があ
る。なお、Ｎ領域、３ＡＲ、２ＡＲの長さの比は、１：
２：１が好ましい。
ると、ダイマー、ループ等のプライマー相互干渉が出現
しやすくなるため、Ｎ領域は、２〜４塩基が好ましい。
また、３ＡＲの配列は、ＤＨＶＢ、ＨＤＶＢ、ＶＨＤ
Ｂ、ＨＶＤＢの順に安定性が高い。このように、３'側
におけるＧ又はＣの割合を高めた方が安定性が高くなる
のは、特異部分の配列によるものである。また、２ＡＲ
の配列は、特異部分の配列を考慮して設計する必要があ
る。なお、Ｎ領域、３ＡＲ、２ＡＲの長さの比は、１：
２：１が好ましい。
【００２９】（ｄ）プライマー量
上述した非特異部分は、Ambiguity Codeで表記される複
数の核酸で構成されるため、１つの２Ambiguity Codeが
含まれると、実際に鋳型核酸と反応する有効率は１／２
となる。例えば、Ｃ又はＧを示す２Ambiguity Codeであ
るＳが含まれたＳＡＴＴという配列では、ＣＡＴＴ又は
ＧＡＴＴとなるため、それぞれの有効プライマー量は１
／２となる。また、１つの３Ambiguity Codeが含まれる
と、実際に鋳型核酸と反応する有効プライマー量は１／
３となる。例えば、Ｃ、Ｇ又はＴを示す３Ambiguity Co
deであるＢが含まれたＢＡＴＴという配列では、ＣＡＴ
Ｔ、ＧＡＴＴ又はＴＡＴＴとなるため、それぞれの有効
プライマー量は１／３となる。同様に、１つの４Ambigu
ity Codeが含まれると、実際に鋳型核酸と反応する有効
プライマー量は１／４となる。
数の核酸で構成されるため、１つの２Ambiguity Codeが
含まれると、実際に鋳型核酸と反応する有効率は１／２
となる。例えば、Ｃ又はＧを示す２Ambiguity Codeであ
るＳが含まれたＳＡＴＴという配列では、ＣＡＴＴ又は
ＧＡＴＴとなるため、それぞれの有効プライマー量は１
／２となる。また、１つの３Ambiguity Codeが含まれる
と、実際に鋳型核酸と反応する有効プライマー量は１／
３となる。例えば、Ｃ、Ｇ又はＴを示す３Ambiguity Co
deであるＢが含まれたＢＡＴＴという配列では、ＣＡＴ
Ｔ、ＧＡＴＴ又はＴＡＴＴとなるため、それぞれの有効
プライマー量は１／３となる。同様に、１つの４Ambigu
ity Codeが含まれると、実際に鋳型核酸と反応する有効
プライマー量は１／４となる。
【００３０】したがって、実際にプライマー量を計算す
る際には、この有効プライマー量を考慮する必要があ
る。具体的には、最低プライマー量に有効プライマー量
の逆数を乗算し、これを非特異部分の塩基数とミスマッ
チ率である４とで除算する。図４の例では、２つの４Am
biguity Code、４つの３Ambiguity Code、そして２つの
２Ambiguity Codeを有するため、有効プライマー量は、
１／５１８４（＝（１／４）２×（１／３）４×（１／
２）２）となる。また、非特異部分の塩基数は８であ
る。これにより、最低プライマー量を１（ｐｍｏｌ／５
０μｌ）としたとき、実際に加えるべきプライマー量
は、１×５１８４÷８÷４＝１６２（ｐｍｏｌ／５０μ
ｌ）程度となる。なお、このプライマー量の算出方法は
一例であり、この方法に限定されるものではない。
る際には、この有効プライマー量を考慮する必要があ
る。具体的には、最低プライマー量に有効プライマー量
の逆数を乗算し、これを非特異部分の塩基数とミスマッ
チ率である４とで除算する。図４の例では、２つの４Am
biguity Code、４つの３Ambiguity Code、そして２つの
２Ambiguity Codeを有するため、有効プライマー量は、
１／５１８４（＝（１／４）２×（１／３）４×（１／
２）２）となる。また、非特異部分の塩基数は８であ
る。これにより、最低プライマー量を１（ｐｍｏｌ／５
０μｌ）としたとき、実際に加えるべきプライマー量
は、１×５１８４÷８÷４＝１６２（ｐｍｏｌ／５０μ
ｌ）程度となる。なお、このプライマー量の算出方法は
一例であり、この方法に限定されるものではない。
【００３１】（ｅ）アニーリング温度
アニーリング温度を検討するために、先ずプライマーの
Ｔｍ値を算出した。このＴｍ値とは、互いに相補的な塩
基配列を持つ核酸の５０％が塩基対結合した状態となる
温度をいう。具体的には、特異部分のＴｍ値を２（Ａ＋
Ｔ）＋４（Ｇ＋Ｃ）法で計算し、非特異部分の平均２
（Ａ＋Ｔ）＋４（Ｇ＋Ｃ）法で計算した。そして、これ
らを総合してプライマー全長のＴｍ値を計算した。
Ｔｍ値を算出した。このＴｍ値とは、互いに相補的な塩
基配列を持つ核酸の５０％が塩基対結合した状態となる
温度をいう。具体的には、特異部分のＴｍ値を２（Ａ＋
Ｔ）＋４（Ｇ＋Ｃ）法で計算し、非特異部分の平均２
（Ａ＋Ｔ）＋４（Ｇ＋Ｃ）法で計算した。そして、これ
らを総合してプライマー全長のＴｍ値を計算した。
【００３２】通常のＰＣＲ法におけるアニーリング温度
は、Ｔｍ値マイナス５℃程度であるが、本発明における
アニーリング温度は、非特異性を高めるために、Ｔｍ値
マイナス２０℃程度とすることが好ましい。実験的に
は、４０℃以下で非特異性が高まると共に解離曲線の波
形多様性が顕著となった。一方、１５℃以下ではランダ
ムプライミングのみとなり、殆ど増幅反応を示さない。
は、Ｔｍ値マイナス５℃程度であるが、本発明における
アニーリング温度は、非特異性を高めるために、Ｔｍ値
マイナス２０℃程度とすることが好ましい。実験的に
は、４０℃以下で非特異性が高まると共に解離曲線の波
形多様性が顕著となった。一方、１５℃以下ではランダ
ムプライミングのみとなり、殆ど増幅反応を示さない。
【００３３】（３）実施例
以下、実施例に基づいて本発明をさらに具体的に説明す
るが、本発明が以下の実施例に限定されるものないこと
は勿論であり、本発明の要旨を逸脱しない範囲において
種々の変更が可能である。
るが、本発明が以下の実施例に限定されるものないこと
は勿論であり、本発明の要旨を逸脱しない範囲において
種々の変更が可能である。
【００３４】（３−１）細菌遺伝子の増幅及び同定
細菌遺伝子のみを増幅し、且つ菌種間での解離曲線の波
形パターンの差異を強調するセンスプライマーであるＢ
ＡＵＰ６５プライマー（配列番号１）を作成し、核酸増
幅及び核酸同定に使用した。具体的には、細菌の１６Ｓ
リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）をコードするＤＮＡ配列
のうち、約３０００菌種で保存されている１１塩基を特
異部分の配列とし、これに８塩基長の非特異部分を結合
させてプライマーを設計した。これにより、図５に模式
的に示すように、１６Ｓ ｒＲＮＡをコードする配列以
外にも、２３Ｓ ｒＲＮＡ、８Ｓ ｒＲＮＡ等の１６Ｓ
ｒＲＮＡと相同性のある配列が同時に増幅されることが
期待される。
形パターンの差異を強調するセンスプライマーであるＢ
ＡＵＰ６５プライマー（配列番号１）を作成し、核酸増
幅及び核酸同定に使用した。具体的には、細菌の１６Ｓ
リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）をコードするＤＮＡ配列
のうち、約３０００菌種で保存されている１１塩基を特
異部分の配列とし、これに８塩基長の非特異部分を結合
させてプライマーを設計した。これにより、図５に模式
的に示すように、１６Ｓ ｒＲＮＡをコードする配列以
外にも、２３Ｓ ｒＲＮＡ、８Ｓ ｒＲＮＡ等の１６Ｓ
ｒＲＮＡと相同性のある配列が同時に増幅されることが
期待される。
【００３５】使用する細菌としては、カンピロバクタ
（C.jejuni）、インフルエンザ菌（H.Influenzae）及び
ネズミチフス菌（S.typhimurium）を選択し、ＩＳＯＧ
ＥＮ−ＬＳ（日本ジーン株式会社製）をマニュアルに従
って使用してＤＮＡを抽出した。この各検体ＤＮＡの増
幅は、以下の表３に示す組成の反応液を準備し、そのう
ち２５μｌを用いて行った。
（C.jejuni）、インフルエンザ菌（H.Influenzae）及び
ネズミチフス菌（S.typhimurium）を選択し、ＩＳＯＧ
ＥＮ−ＬＳ（日本ジーン株式会社製）をマニュアルに従
って使用してＤＮＡを抽出した。この各検体ＤＮＡの増
幅は、以下の表３に示す組成の反応液を準備し、そのう
ち２５μｌを用いて行った。
【００３６】
【表３】
【００３７】表３において、検体ＤＮＡ溶液について
は、ＤＮＡを１μｇ含有する量が用いられ、ｘμｌ＋ｙ
μｌ＝９．５μｌとなるように滅菌蒸留水を加えて調製
した。
は、ＤＮＡを１μｇ含有する量が用いられ、ｘμｌ＋ｙ
μｌ＝９．５μｌとなるように滅菌蒸留水を加えて調製
した。
【００３８】そして、Smart Cycler（宝酒造株式会社
製）を用いて９８℃／２秒、２５℃／４０秒、７２℃／
１０秒のプロトコルを７０サイクル実施して核酸を増幅
し、温度範囲７０〜９４℃、温度ステップ０．１℃の条
件で各温度で１秒間観察することにより、増幅産物の解
離曲線の波形を観察した。
製）を用いて９８℃／２秒、２５℃／４０秒、７２℃／
１０秒のプロトコルを７０サイクル実施して核酸を増幅
し、温度範囲７０〜９４℃、温度ステップ０．１℃の条
件で各温度で１秒間観察することにより、増幅産物の解
離曲線の波形を観察した。
【００３９】なお、比較例として、ＢＡＵＰ６５プライ
マー（配列番号１）の代わりに、１６Ｓ ｒＲＮＡの一
部をコードする配列を増幅させるセンスプライマー（配
列番号２）及びアンチセンスプライマー（配列番号３）
を用いて、通常のＰＣＲ法に従って検体ＤＮＡを増幅さ
せた。
マー（配列番号１）の代わりに、１６Ｓ ｒＲＮＡの一
部をコードする配列を増幅させるセンスプライマー（配
列番号２）及びアンチセンスプライマー（配列番号３）
を用いて、通常のＰＣＲ法に従って検体ＤＮＡを増幅さ
せた。
【００４０】本発明とＰＣＲ法とによる解離曲線の波形
パターンをそれぞれ図６（Ａ）、（Ｂ）に示す。ここ
で、図６において（１）はカンピロバクタ、（２）はイ
ンフルエンザ菌、（３）はネズミチフス菌である。図６
から分かるように、図６（Ｂ）に示す通常のＰＣＲ法で
は、センスプライマー（配列番号２）及びアンチセンス
プライマー（配列番号３）で規定される配列のみが増幅
されるため、菌種間で波形パターンの違いが殆ど観察さ
れなかった。これに対して、図６（Ａ）に示す本発明で
は、複数箇所の配列が増幅されるため、菌種毎に多様な
波形パターンが観察され、この波形パターンを調べるこ
とにより菌種の核酸同定が可能とされる。
パターンをそれぞれ図６（Ａ）、（Ｂ）に示す。ここ
で、図６において（１）はカンピロバクタ、（２）はイ
ンフルエンザ菌、（３）はネズミチフス菌である。図６
から分かるように、図６（Ｂ）に示す通常のＰＣＲ法で
は、センスプライマー（配列番号２）及びアンチセンス
プライマー（配列番号３）で規定される配列のみが増幅
されるため、菌種間で波形パターンの違いが殆ど観察さ
れなかった。これに対して、図６（Ａ）に示す本発明で
は、複数箇所の配列が増幅されるため、菌種毎に多様な
波形パターンが観察され、この波形パターンを調べるこ
とにより菌種の核酸同定が可能とされる。
【００４１】次に、核酸増幅反応終了後のサンプル１０
μｌに２μｌのローディングバッファを添加し、１．２
％アガロースゲルを使って、４５分間、５０Ｖで電気泳
動後、ゲルをエチジウムブロマイドで染色してヌクレオ
チド鎖を確認した。なお、分子サイズマーカとして、20
0bp ladder markerを使用した。
μｌに２μｌのローディングバッファを添加し、１．２
％アガロースゲルを使って、４５分間、５０Ｖで電気泳
動後、ゲルをエチジウムブロマイドで染色してヌクレオ
チド鎖を確認した。なお、分子サイズマーカとして、20
0bp ladder markerを使用した。
【００４２】また、比較例として、ＢＡＵＰ６５プライ
マー（配列番号１）の代わりに上述したセンスプライマ
ー（配列番号２）及びアンチセンスプライマー（配列番
号３）を用いた核酸増幅反応終了後のサンプル１０μｌ
を使用して同様に電気泳動を行い、ゲルをエチジウムブ
ロマイドで染色してヌクレオチド鎖を確認した。
マー（配列番号１）の代わりに上述したセンスプライマ
ー（配列番号２）及びアンチセンスプライマー（配列番
号３）を用いた核酸増幅反応終了後のサンプル１０μｌ
を使用して同様に電気泳動を行い、ゲルをエチジウムブ
ロマイドで染色してヌクレオチド鎖を確認した。
【００４３】本発明とＰＣＲ法とによる電気泳動写真を
それぞれ図７（Ａ）、（Ｂ）に示す。ここで図７におい
て、レーン１はカンピロバクタ、レーン２はインフルエ
ンザ菌、レーン３はネズミチフス菌である。図７から分
かるように、図７（Ｂ）に示す通常のＰＣＲ法では、セ
ンスプライマー（配列番号２）及びアンチセンスプライ
マー（配列番号３）で規定される配列のみが増幅される
ため、同サイズのバンドのみが観察された。これに対し
て、図７（Ａ）に示す本発明では、複数のバンドが観察
された。このことから、本発明では、複数箇所の配列が
増幅されることが確認された。
それぞれ図７（Ａ）、（Ｂ）に示す。ここで図７におい
て、レーン１はカンピロバクタ、レーン２はインフルエ
ンザ菌、レーン３はネズミチフス菌である。図７から分
かるように、図７（Ｂ）に示す通常のＰＣＲ法では、セ
ンスプライマー（配列番号２）及びアンチセンスプライ
マー（配列番号３）で規定される配列のみが増幅される
ため、同サイズのバンドのみが観察された。これに対し
て、図７（Ａ）に示す本発明では、複数のバンドが観察
された。このことから、本発明では、複数箇所の配列が
増幅されることが確認された。
【００４４】（３−２）アニーリング温度による解離曲
線の比較 アニーリング温度の違いによる解離曲線の波形パターン
の変化を確認するために、大腸菌（E.coli）と黄色ブド
ウ球菌（S.aureus）との２種の菌について、上述と同様
の手法で５５℃、４０℃、２５℃の３点で増幅反応を行
い、解離曲線の波形を観察した。大腸菌と黄色ブドウ球
菌とについて得られた波形パターンをそれぞれ図８、図
９に示す。図８、図９から分かるように、どちらの菌に
ついても、５５℃、４０℃、２５℃とアニーリング温度
が低くなるにつれて、すなわち非特異性が高まるにつれ
て、特徴的な波形が得られている。
線の比較 アニーリング温度の違いによる解離曲線の波形パターン
の変化を確認するために、大腸菌（E.coli）と黄色ブド
ウ球菌（S.aureus）との２種の菌について、上述と同様
の手法で５５℃、４０℃、２５℃の３点で増幅反応を行
い、解離曲線の波形を観察した。大腸菌と黄色ブドウ球
菌とについて得られた波形パターンをそれぞれ図８、図
９に示す。図８、図９から分かるように、どちらの菌に
ついても、５５℃、４０℃、２５℃とアニーリング温度
が低くなるにつれて、すなわち非特異性が高まるにつれ
て、特徴的な波形が得られている。
【００４５】（３−３）非特異部分の有無による解離曲
線の比較 非特異部分の有無による解離曲線の波形パターンの変化
を確認するために、黄色ブドウ球菌について、上述した
ＢＡＵＰ６５プライマー（配列番号１）と非特異部分を
除いたプライマー（５'−ＧＡＴＣＣＡＡＣＣＧＣ−
３'）とで増幅反応を行い、解離曲線の波形を観察し
た。ＢＡＵＰ６５プライマー（配列番号１）と非特異部
分を除いたプライマーとについて得られた波形パターン
をそれぞれ図１０（Ａ）、（Ｂ）に示す。図１０から分
かるように、非特異部分を有するＢＡＵＰ６５プライマ
ー（配列番号１）では、非特異部分を除いたプライマー
と比較して特徴的な波形が観察されている。このことか
ら、非特異部分を有することにより、より効果的に核酸
同定が行えることが確認された。
線の比較 非特異部分の有無による解離曲線の波形パターンの変化
を確認するために、黄色ブドウ球菌について、上述した
ＢＡＵＰ６５プライマー（配列番号１）と非特異部分を
除いたプライマー（５'−ＧＡＴＣＣＡＡＣＣＧＣ−
３'）とで増幅反応を行い、解離曲線の波形を観察し
た。ＢＡＵＰ６５プライマー（配列番号１）と非特異部
分を除いたプライマーとについて得られた波形パターン
をそれぞれ図１０（Ａ）、（Ｂ）に示す。図１０から分
かるように、非特異部分を有するＢＡＵＰ６５プライマ
ー（配列番号１）では、非特異部分を除いたプライマー
と比較して特徴的な波形が観察されている。このことか
ら、非特異部分を有することにより、より効果的に核酸
同定が行えることが確認された。
【００４６】
【発明の効果】以上詳細に説明したように本発明は、任
意の特定あるいは不特定領域に相補性を有するヌクレオ
チド鎖を３’末端に有し、相補可能性を有するヌクレオ
チド鎖を５’末端に有する一方性非特異プライマーであ
る波形生成用プライマーと、該プライマーを使用して核
酸の一部塩基配列を増幅して解離曲線の波形から核酸同
定を行う方法であって、上記核酸上の任意の特定あるい
は不特定領域を選択する工程と、上記該領域に相補性を
有するヌクレオチド鎖と相補可能性を有するヌクレオチ
ド鎖とからなる波形生成用プライマーと、上記核酸上の
少なくとも上記該領域を含む複数の領域に上記プライマ
ーをアニールさせる工程と、上記プライマー及びポリメ
ラーゼの存在下、上記複数の領域を鋳型としてヌクレオ
チド鎖合成反応を行う工程とを有する。
意の特定あるいは不特定領域に相補性を有するヌクレオ
チド鎖を３’末端に有し、相補可能性を有するヌクレオ
チド鎖を５’末端に有する一方性非特異プライマーであ
る波形生成用プライマーと、該プライマーを使用して核
酸の一部塩基配列を増幅して解離曲線の波形から核酸同
定を行う方法であって、上記核酸上の任意の特定あるい
は不特定領域を選択する工程と、上記該領域に相補性を
有するヌクレオチド鎖と相補可能性を有するヌクレオチ
ド鎖とからなる波形生成用プライマーと、上記核酸上の
少なくとも上記該領域を含む複数の領域に上記プライマ
ーをアニールさせる工程と、上記プライマー及びポリメ
ラーゼの存在下、上記複数の領域を鋳型としてヌクレオ
チド鎖合成反応を行う工程とを有する。
【００４７】このような核酸増幅方法に用いられるプラ
イマーは、非特異的なヌクレオチド鎖を有することによ
り特定領域に対する特異性が低められているため、該標
的領域と相似性のある複数の領域に同時にアニールす
る。これにより、複数の領域を鋳型として１本鎖核酸を
増幅することができる。この核酸増幅方法は、プライマ
ーを１種類しか使用しないため、通常のＰＣＲ法のよう
な指数関数的な増幅速度を期待し得ないが、複数箇所で
増幅反応が進行し、複数種類の増幅産物を１度の増幅反
応で得ることができるため、全体としてＰＣＲ法に近い
増幅核酸量ならびに波形解析のための充分な蛍光強度を
得ることができる。
イマーは、非特異的なヌクレオチド鎖を有することによ
り特定領域に対する特異性が低められているため、該標
的領域と相似性のある複数の領域に同時にアニールす
る。これにより、複数の領域を鋳型として１本鎖核酸を
増幅することができる。この核酸増幅方法は、プライマ
ーを１種類しか使用しないため、通常のＰＣＲ法のよう
な指数関数的な増幅速度を期待し得ないが、複数箇所で
増幅反応が進行し、複数種類の増幅産物を１度の増幅反
応で得ることができるため、全体としてＰＣＲ法に近い
増幅核酸量ならびに波形解析のための充分な蛍光強度を
得ることができる。
【００４８】また、本発明に係る核酸同定方法は、核酸
の一部塩基配列を増幅して核酸を同定する核酸同定方法
であって、上記核酸上の任意の特定あるいは不特定領域
を選択する工程と、上記該領域に相補性を有するヌクレ
オチド鎖と相補可能性を有するヌクレオチド鎖とから成
るプライマーを調整する工程と、上記核酸上の少なくと
も上記該領域を含む複数の領域に上記プライマーをアニ
ールさせる工程と、上記プライマー及びポリメラーゼの
存在下、上記複数の領域を鋳型としてヌクレオチド鎖合
成反応を行う工程と、得られる複数の増幅産物に種々の
干渉構造を形成させる工程と、上記相互干渉構造の解
離、変性に由来する解離曲線の波形パターンに基づいて
核酸を同定する工程とを有する。
の一部塩基配列を増幅して核酸を同定する核酸同定方法
であって、上記核酸上の任意の特定あるいは不特定領域
を選択する工程と、上記該領域に相補性を有するヌクレ
オチド鎖と相補可能性を有するヌクレオチド鎖とから成
るプライマーを調整する工程と、上記核酸上の少なくと
も上記該領域を含む複数の領域に上記プライマーをアニ
ールさせる工程と、上記プライマー及びポリメラーゼの
存在下、上記複数の領域を鋳型としてヌクレオチド鎖合
成反応を行う工程と、得られる複数の増幅産物に種々の
干渉構造を形成させる工程と、上記相互干渉構造の解
離、変性に由来する解離曲線の波形パターンに基づいて
核酸を同定する工程とを有する。
【００４９】このような核酸増幅方法に用いられるプラ
イマーは、非特異的なヌクレオチド鎖を有することによ
り特定領域に対する特異性が低められているため、該標
的領域と相似性のある複数の領域に同時にアニールす
る。これにより、複数の領域を鋳型として１本鎖核酸を
増幅することができる。得られた増幅産物は種々の相互
干渉構造を形成するため、相互干渉構造の解離、変性に
由来する解離曲線の波形パターンが観察される。そし
て、鋳型となる核酸の種類によって種々の波形パターン
が得られるため、波形パターンを解析することで核酸の
同定が可能となる。
イマーは、非特異的なヌクレオチド鎖を有することによ
り特定領域に対する特異性が低められているため、該標
的領域と相似性のある複数の領域に同時にアニールす
る。これにより、複数の領域を鋳型として１本鎖核酸を
増幅することができる。得られた増幅産物は種々の相互
干渉構造を形成するため、相互干渉構造の解離、変性に
由来する解離曲線の波形パターンが観察される。そし
て、鋳型となる核酸の種類によって種々の波形パターン
が得られるため、波形パターンを解析することで核酸の
同定が可能となる。
【００５０】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> 株式会社アドジーン
<120> 波形生成プライマー、該プライマーを使用した核酸増幅方法及び核酸同定
方法
<130>ＡDG020520
<160> 3
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificially synthesized primer sequence
<400> 1
nnvhdbssga tccaaccgc 19
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificially synthesized primer sequence
<400> 1
cagcagccgc ggtaatac 18
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificially synthesized primer sequence
<400> 1
acgacacgag ctgacgac 18
配列番号１：人工的に合成されたプライマー配列
配列番号２：人工的に合成されたプライマー配列
配列番号３：人工的に合成されたプライマー配列
【図１】本実施の形態における核酸増幅方法を模式的に
説明する図であり、同図（Ａ）は、本発明によって複数
の配列が増幅される様子を示し、同図（Ｂ）は、複数の
増幅産物が種々の相互干渉構造を形成する様子を示す。
説明する図であり、同図（Ａ）は、本発明によって複数
の配列が増幅される様子を示し、同図（Ｂ）は、複数の
増幅産物が種々の相互干渉構造を形成する様子を示す。
【図２】本発明で用いられる一方向性波形生成プライマ
ーの概念構成を説明する図である。
ーの概念構成を説明する図である。
【図３】同一方向性波形生成プライマーの特異部分の配
列の一例を説明する図である。
列の一例を説明する図である。
【図４】同一方向性波形生成プライマーの非特異部分の
配列の一例を説明する図である。
配列の一例を説明する図である。
【図５】本実施例における本発明を模式的に説明する図
である。
である。
【図６】解離曲線の波形パターンを説明する図であり、
同図（Ａ）は、本発明によって増幅した場合の波形パタ
ーンを示し、同図（Ｂ）は、ＰＣＲ法によって増幅した
場合の波形パターンを示す。
同図（Ａ）は、本発明によって増幅した場合の波形パタ
ーンを示し、同図（Ｂ）は、ＰＣＲ法によって増幅した
場合の波形パターンを示す。
【図７】増幅産物の電気泳動写真を説明する図であり、
同図（Ａ）は、本発明によって増幅した場合の電気泳動
写真を示し、同図（Ｂ）は、ＰＣＲ法によって増幅した
場合の電気泳動写真を示す。
同図（Ａ）は、本発明によって増幅した場合の電気泳動
写真を示し、同図（Ｂ）は、ＰＣＲ法によって増幅した
場合の電気泳動写真を示す。
【図８】アニーリング温度の違いによる解離曲線の波形
パターンの変化を説明する図であり、同図（Ａ）、
（Ｂ）、（Ｃ）は、大腸菌を用いてそれぞれ５５℃、４
０℃、２５℃でアニーリングした場合の波形パターンを
示す。
パターンの変化を説明する図であり、同図（Ａ）、
（Ｂ）、（Ｃ）は、大腸菌を用いてそれぞれ５５℃、４
０℃、２５℃でアニーリングした場合の波形パターンを
示す。
【図９】アニーリング温度の違いによる解離曲線の波形
パターンの変化を説明する図であり、同図（Ａ）、
（Ｂ）、（Ｃ）は、黄色ブドウ球菌を用いてそれぞれ５
５℃、４０℃、２５℃でアニーリングした場合の波形パ
ターンを示す。
パターンの変化を説明する図であり、同図（Ａ）、
（Ｂ）、（Ｃ）は、黄色ブドウ球菌を用いてそれぞれ５
５℃、４０℃、２５℃でアニーリングした場合の波形パ
ターンを示す。
【図１０】非特異部分の有無による解離曲線の波形パタ
ーンの変化を説明する図であり、同図（Ａ）は、非特異
部分を有する場合の波形パターンを示し、同図（Ｂ）
は、非特異部分を有さない場合の波形パターンを示す。
ーンの変化を説明する図であり、同図（Ａ）は、非特異
部分を有する場合の波形パターンを示し、同図（Ｂ）
は、非特異部分を有さない場合の波形パターンを示す。
Claims (7)
- 【請求項１】 核酸上の任意の特定あるいは不特定領域
に相補的な、各塩基鎖に１塩基を配置したヌクレオチド
鎖を３'末端に有し、該領域に相補性を有す可能性のあ
る、各塩基鎖に複数塩基を配置したヌクレオチド鎖を
５'末端に有して、該ヌクレオチド鎖は５'末端側から
３'側にかけて段階的に相補性が高まると共に、段階的
に安定性が低くなるような配列とされていることを特徴
とする波形生成用プライマー。 - 【請求項２】 上記プライマーのヌクレオチド鎖は、
５'末端側から順に、アデニン，シトシン，グアニン，
チミンを含む塩基の何れか４つを示すコードで構成され
る第１の領域、上記塩基の何れか３つを示すコードで構
成される第２の領域、及び上記塩基の何れか２つを示す
コードで構成される第３の領域を有し、それぞれ第１、
第２及び第３領域の塩基の長さは任意に設定されること
を特徴とする請求項１記載の波形生成用プライマー。 - 【請求項３】 上記プライマーは、１０乃至３０塩基か
らなり、プライマー全鎖長に対する相補可能性を有する
ヌクレオチド鎖の割合は、０．１２乃至０．８８である
ことを特徴とする請求項１記載の波形生成用プライマ
ー。 - 【請求項４】 核酸の一部塩基配列を増幅する核酸増幅
方法であって、 上記核酸上の任意の特定あるいは不特定領域を選択する
工程と、 上記領域に相補的なヌクレオチド鎖と相補可能性を有す
るヌクレオチド鎖とからなる請求項１に記載の波形生成
用プライマーと、 上記核酸上の少なくとも該領域を含む複数の領域に上記
プライマーをアニールさせる工程と、 上記プライマー及びポリメラーゼの存在下、上記複数の
領域を鋳型としてヌクレオチド鎖合成反応を行う工程
と、 を有することを特徴とする核酸増幅方法。 - 【請求項５】 核酸上の任意の特定あるいは不特定領域
に上記波形生成用プライマーをアニールさせる工程にお
いて、アニーリング温度を４９℃以下に設定してアニー
ルを行うことを特徴とする請求項４に記載の核酸増幅方
法。 - 【請求項６】 核酸上の任意の特定あるいは不特定領域
に上記波形生成用プライマーを用いて核酸増幅を行う工
程において、１種類のセンスプライマーあるいはアンチ
センスプライマーのみを用いて、核酸のセンス鎖あるい
はアンチセンス鎖のどちらか１本鎖のみを増幅し、同時
に増幅した核酸を以後の増幅工程における鋳型として再
利用しないことを特徴とする請求項４に記載の核酸増幅
方法。 - 【請求項７】 核酸の一部塩基配列を増幅して核酸を同
定する核酸同定方法であって、 上記核酸上の任意の特定あるいは不特定領域を選択する
工程と、 上記領域に相補的なヌクレオチド鎖と相補可能性を有す
るヌクレオチド鎖とからなる請求項１に記載の波形生成
用プライマーと、 上記核酸上の少なくとも該領域を含む複数の領域に上記
プライマーをアニールさせる工程と、 上記プライマー及びポリメラーゼの存在下、上記複数の
領域を鋳型としてヌクレオチド鎖合成反応を行う工程
と、 得られる複数の核酸増幅産物に高次構造形成及び夾雑物
形成などを含む種々の相互干渉を形成させる工程と、 上記相互干渉形成性核酸増幅産物を加熱し、該核酸増幅
産物の解離、変性に際して得られる解離曲線の波形パタ
ーンに基づいて核酸を同定する工程と、 を有することを特徴とする核酸同定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002143709A JP2003334082A (ja) | 2002-05-17 | 2002-05-17 | 波形生成プライマー、該プライマーを使用した核酸増幅方法及び核酸同定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002143709A JP2003334082A (ja) | 2002-05-17 | 2002-05-17 | 波形生成プライマー、該プライマーを使用した核酸増幅方法及び核酸同定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003334082A true JP2003334082A (ja) | 2003-11-25 |
Family
ID=29703639
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002143709A Pending JP2003334082A (ja) | 2002-05-17 | 2002-05-17 | 波形生成プライマー、該プライマーを使用した核酸増幅方法及び核酸同定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2003334082A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005005664A1 (ja) * | 2003-07-15 | 2005-01-20 | G & G Science Co., Ltd. | 核酸の検出方法および同定方法 |
| WO2007028084A2 (en) | 2005-09-01 | 2007-03-08 | Canon U.S. Life Sciences, Inc. | Method and molecular diagnostic device for detection, analysis and identification of genomic dna |
| US7547514B2 (en) | 2004-07-28 | 2009-06-16 | Canon U.S. Life Sciences, Inc. | Methods for monitoring genomic DNA of organisms |
| US7604938B2 (en) | 2005-02-18 | 2009-10-20 | Canon U.S. Life Sciences, Inc. | Devices and methods for monitoring genomic DNA of organisms |
-
2002
- 2002-05-17 JP JP2002143709A patent/JP2003334082A/ja active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005005664A1 (ja) * | 2003-07-15 | 2005-01-20 | G & G Science Co., Ltd. | 核酸の検出方法および同定方法 |
| US7547514B2 (en) | 2004-07-28 | 2009-06-16 | Canon U.S. Life Sciences, Inc. | Methods for monitoring genomic DNA of organisms |
| US7604938B2 (en) | 2005-02-18 | 2009-10-20 | Canon U.S. Life Sciences, Inc. | Devices and methods for monitoring genomic DNA of organisms |
| US8841093B2 (en) | 2005-02-18 | 2014-09-23 | Canon U.S. Life Sciences, Inc. | Devices and methods for monitoring genomic DNA of organisms |
| WO2007028084A2 (en) | 2005-09-01 | 2007-03-08 | Canon U.S. Life Sciences, Inc. | Method and molecular diagnostic device for detection, analysis and identification of genomic dna |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2400538C2 (ru) | Олигонуклеотид с двойственной специфичностью и способы, в которых он используется | |
| JP2019533432A5 (ja) | ||
| JP5313157B2 (ja) | 核酸増幅法、それに用いる試薬及び試薬キット | |
| US20070020640A1 (en) | Molecular encoding of nucleic acid templates for PCR and other forms of sequence analysis | |
| US20040137458A1 (en) | Molecular tag code for monitoring a product and process using same | |
| JP3867926B2 (ja) | 核酸の増幅法 | |
| JP2005503802A5 (ja) | ||
| JP2022535584A (ja) | 核酸増幅及び／又は検出用方法及び試薬 | |
| CA2318371A1 (en) | Method for the detection of nucleic acid sequences | |
| CA2443999A1 (en) | Methods and compositions for nucleotide analysis | |
| JP2022024071A (ja) | 標的核酸を検出する方法 | |
| JP2020530270A (ja) | ゲノム再編成検出のための配列決定方法 | |
| US7763421B2 (en) | Methods for producing nucleic acid hybridization probes that amplify hybridization signal by promoting network formation | |
| JP2003334082A (ja) | 波形生成プライマー、該プライマーを使用した核酸増幅方法及び核酸同定方法 | |
| JP2019062815A (ja) | 虫由来ｄｎａの断片を増幅するためのプライマーセット、及び、それを用いた虫種の同定方法 | |
| JPWO2003040367A1 (ja) | 遺伝子増幅反応で合成されたオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法、自己集合体及び遺伝子の検出方法 | |
| KR101785687B1 (ko) | 다중 증폭 이중 시그널 증폭에 의한 타겟 핵산 서열의 검출 방법 | |
| US10066261B2 (en) | Method for amplifying nucleic acid | |
| US11299775B2 (en) | Method for designing primer, primer, primer set, DNA amplification method, and analysis method | |
| US10066262B2 (en) | Methods for amplification of nucleic acids utilizing hairpin loop or duplex primers | |
| JP2003274959A (ja) | ポリメラーゼ連鎖反応を応用した非特異核酸増幅法 | |
| JP6006814B2 (ja) | 核酸増幅用プライマーの設計方法、核酸増幅用プライマーの製造方法、核酸増幅用プライマー、プライマーセット、および核酸の増幅方法 | |
| CN100471952C (zh) | 具有多态性序列位点的核酸的鉴定方法 | |
| WO2005005664A1 (ja) | 核酸の検出方法および同定方法 | |
| JP2004041191A (ja) | 核酸同定方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20050516 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20080520 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20080717 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20080826 |